UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Faculdade de Odontologia de Araraquara

LUANA CARLA PIRES

MATRIZES TRIDIMENSIONAIS A BASE DE POLI (3-

HIDROXIBUTIRATO) PRODUZIDAS POR SINTERIZAÇÃO

SELETIVA A LASER E FUNCIONALIZADAS COM FIBROÍNA DA

SEDA, HIDROXIAPATITA E PEPTÍDEO OSTEOGÊNICO.

AVALIAÇÕES FÍSICO-QUÍMICA E BIOLÓGICA

Araraquara

2015

UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Faculdade de Odontologia de Araraquara

LUANA CARLA PIRES

MATRIZES TRIDIMENSIONAIS A BASE DE POLI (3-

HIDROXIBUTIRATO) PRODUZIDAS POR SINTERIZAÇÃO

SELETIVA A LASER E FUNCIONALIZADAS COM FIBROÍNA DA

SEDA, HIDROXIAPATITA E PEPTÍDEO OSTEOGÊNICO.

AVALIAÇÕES FÍSICO-QUÍMICA E BIOLÓGICA

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Área de Implantodontia, da Faculdade de Odontologia de Araraquara, Universidade Estadual Paulista, para título de Doutor em Odontologia.

Orientador: Prof. Dr. Joni Augusto Cirelli

Co-orientadora: Dra. Sybele Saska

Specian

Araraquara

2015

Pires, Luana Carla Matrizes tridimensionais a base de poli (3-hidroxibutirato)

produzidas por sinterização seletiva a laser e funcionalizadas com fibroína da seda, hidroxiapatita e peptídeo osteogênico. Avaliações físico-química e biológica / Luana Carla Pires .-- Araraquara: [s.n.], 2015.

167 f. ; 30 cm. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista,

Faculdade de Odontologia Orientador: Prof. Dr. Joni Augusto Cirelli Co-orientadora: Dra. Sybele Saska Specian

1. Engenharia tecidual 2. Bioimpressão 3. Polímeros 4. Fibroína 5. Apatitas I. Título

Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marley C. Chiusoli Montagnoli, CRB-8/5646

Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de Araraquara / UNESP

LUANA CARLA PIRES

MATRIZES TRIDIMENSIONAIS A BASE DE POLI (3-

HIDROXIBUTIRATO) PRODUZIDAS POR SINTERIZAÇÃO

SELETIVA A LASER E FUNCIONALIZADAS COM FIBROÍNA DA

SEDA, HIDROXIAPATITA E PEPTÍDEO OSTEOGÊNICO.

AVALIAÇÕES FÍSICO-QUÍMICA E BIOLÓGICA

COMISSÃO JULGADORA

TESE PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR

Presidente e Orientador: Prof. Dr. Joni Augusto Cirelli

2º Examinador: Profa. Dra. Ana Paula Faloni de Souza

3º Examinador: Prof. Dr. Paulo Tambasco de Oliveira

4º Examinador; Prof. Dr. Roberto Henrique Barbeiro

5º Examinador: Prof. Dr. Elcio Marcantonio Junior

Araraquara, 06 de março de 2015.

DADOS CURRICULARES

LUANA CARLA PIRES

NASCIMENTO: 25/03/1985 - Ubiratã - Paraná

FILIAÇÃO: Maria Sueli do Nascimento Pires e José Vicente Pires

2003 / 2007: Graduação em Odontologia Universidade Estadual de Maringá - UEM

2009 / 2011: Especialização em Periodontia Faculdade de Odontologia de Araraquara – FOAr – UNESP

2011 / 2013: Especialização em Implantodontia Faculdade de Odontologia de Araraquara – FOAr – UNESP

2011 / 2015: Curso de pós-graduação em Odontologia, área de

concentração Implantodontia, nível Doutorado. Faculdade de Odontologia de Araraquara – FOAr – UNESP

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho aos amores da minha vida: mamãe, papai, Like e Mario.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por me proporcionar esse momento,

tendo me abençoado com uma família maravilhosa que sempre me apoiou e

incentivou profissionalmente.

Aos meus pais, os quais eu amo incondicionalmente, que sempre

estiveram ao meu lado nessa jornada, me apoiando nos bons e maus

momentos. Agradeço pelos pais maravilhosos que são. Tudo que sou e tudo

que conquistei com toda certeza devo a vocês. Muito obrigada!

A minha irmã Luara, minha companheira e melhor amiga, minha

confidente, obrigada por compartilhar e ter contribuído com esse momento.

Ao meu amor Mario, com certeza o que de melhor me aconteceu nesse

doutorado. Agradeço por toda cumplicidade, amizade e amor. Agradeço pela

força nos momentos difíceis, pela conversa, por abrir meus olhos quando

necessário, por ser meu porto seguro, minha calma... Hoje sou uma pessoa

melhor e devo isso a você.

Aos meus familiares, avós, tios e primos, pelo apoio, por terem me

ensinados tantos valores, por me ensinarem o amor à família e ao próximo, e

por entenderem a minha ausência em tantos momentos. É um prazer imenso

conviver com vocês.

Ao meu orientador, Prof. Joni Cirelli, por todo ensinamento e paciência.

Mas principalmente, por ser um exemplo de como ser um educador, um

pesquisador e um ser humano melhor. A minha co-orientadora Dra Sybele

Saska por todo trabalho e ensinamento.

A família do meu noivo, meus sogros, cunhados e sobrinhos, um

presente que ganhei ao longo dos últimos anos. Agradeço tê-los por perto,

sempre com muito carinho. Muito obrigada pela amizade e carinho.

A todos que colaboraram com esse trabalho, muito obrigada, sem vocês

esse trabalho não seria possível. Em especial ao meu grupo de convivência,

Mariana Cominotte, Fernanda Florian, Profa Ana Paula Faloni, Profa Silvana

Orrico, Leslie Fiori, Tamara Beraldo, Andressa Vilas Boas e Guilherme Oliveira,

obrigada pelo trabalho e companheirismo, foi maravilhoso trabalhar com vocês.

Aos colegas dos biotérios da FOAr e da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas, muito obrigada por toda ajuda e colaboração. Em especial

Celso, responsável por cuidar dos nossos coelhos, muito obrigada por toda

dedicação e colaboração.

Aos amigos que conheci em Araraquara, muito obrigada pelo

companheirismo desses últimos anos. Espero poder conviver com vocês

durante muito tempo ainda. Em especial quero agradecer a Andressa, Giovana

Marcell, Fabiana e Suzane, vocês são pessoas mais que especiais e não tenho

palavras para agradecer tudo que fizeram por mim. Espero tê-los para sempre

em minha vida.

Aos meus amigos de sempre, agradeço a Deus todos os dias ter me

concedido a honra de conhecer pessoas tão maravilhosas e de ter tido a

possibilidade de criar laços tão fortes de amizade verdadeira. Em especial

minhas amadas Vanessa, Deisy, Simone, Alessandra e Fernanda obrigada por

tudo. São caminhos tão diferentes os percorridos por cada uma de nós,

entretanto uma coisa nunca mudou, nossa amizade.

Aos professores da FOAr-Unesp, por todo ensinamento e exemplo. Em

especial Prof. Elcio Marcantonio Jr, Profa Adriana Marcantonio, Prof. José

Eduardo Sampaio, Profa Silvana Orrico e Prof. Roberto Barbeiro, muito

obrigada por tudo, e principalmente por todo carinho que sempre tiveram

comigo.

Aos funcionários da FOAr-Unesp, sem vocês nada disso seria possível.

Obrigada por fazerem parte de nossas vidas. Em especial Isa, Leandro,

Claudinha, Zezé, D. Maria, Regina Lúcia, Mara, Neuza, Nilton e Luana,

pessoas maravilhosas que conheci nesse caminho e as quais sou grata por

toda ajuda.

Aos professores da minha graduação na Universidade Estadual de

Maringá, pessoas que me inspiraram muito a ser a profissional que sou hoje.

Em especial Prof. Roberto Hayacibara que me ensinou a amar a Periodontia e

em quem sempre me inspirarei como professor e profissional, Profa Evelyn

Gonçalves, com que eu dei meus primeiros passos em direção a área

acadêmica e Prof. Liogi Iwaki Filho, meu orientador de iniciação científica com

quem tive a honra de conviver.

Aos membros da banca examinadora Prof. Dr. Paulo Tambasco de

Oliveira, Profa. Dra. Roberta Okamoto, Prof. Dr. Elcio Marcantonio Jr, Prof. Dr.

Roberto Barbeiro, Profa. Dra. Daniela Zandim, Prof. Dr. Roberto Hayacibara e

Prof. Dr. Sérgio Scombatti Souza, agradeço a disponibilidade e contribuições

ao nosso trabalho.

Pires LC. Matrizes tridimensionais a base de poli (3-hidroxibutirato) produzidas

por sinterização seletiva a laser e funcionalizadas com fibroína da seda,

hidroxiapatita e peptídeo osteogênico. Avaliações físico-química e biológica

[Tese de Doutorado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2015.

RESUMO Estruturas tridimensionais (scaffolds) construídas por técnicas de

impressão tridimensional vêm ganhando espaço em reconstrução e

regeneração de tecidos, pois permitem a fabricação de scaffolds com formas

complexas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar físico-química e

biologicamente matrizes de poli (3-hidroxibutirato) (PHB), confeccionadas por

impressão tridimensional via sinterização seletiva a laser (selective laser sinterization - SLS), funcionalizadas com fibroína da seda (FB), apatitas (HA)

e/ou peptídeo de crescimento osteogênico (osteogenic growth peptide - OGP),

com finalidade de regeneração óssea. Os resultados de caracterização

demonstraram que a impressão via SLS produziu scaffolds de PHB com

percentual de porosidade de 55,8±0,7% e com poros regulares de 500-700 µm.

A adição de FB e HA mantiveram resultados de porosidade semelhantes e

aumentaram a taxa de absorção de água do PHB no período inicial de 2 h. A

incorporação de FB melhorou a resistência à compressão e o módulo de

elasticidade, sendo este também melhorado por FB-HA. Nos ensaios in vitro

observou-se uma boa adesão, espraiamento e proliferação celular em todos os

grupos. Na avaliação indireta da precipitação de cálcio sobre as amostras,

observou-se um melhor resultado no grupo FB-HA, principalmente em 3 dias.

In vivo, os grupos experimentais falharam em estimular a osteogênese de

contato, entretanto mantiveram a espessura da área de implantação, o que não

ocorreu no grupo controle coágulo. Conclui-se que os scaffolds avaliados

possuem algumas propriedades favoráveis a aplicação em regeneração óssea,

entretanto alguns mecanismos de funcionamento dos mesmos in vivo,

principalmente em longo prazo, ainda precisam ser entendidos e melhorados.

Palavras-chave: Engenharia tecidual, Bioimpressão, Polímeros, Fibroína,

Apatitas

Pires LC. Three-dimensinal poli (3-hydroxybutirate) scaffolds manufactured by

selective laser sintering and functionalized with silk fibroin, hydroxyapatite and

osteogenic peptide. Physicochemical and biological evaluation [Tese de

Doutorado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2015.

ABSTRACT Three-dimensional structures (scaffolds) fabricated by three-dimensional

printing techniques (3DP), have been widely used in tissues reconstruction and

regeneration. The main advantage of that technique is the possibility of

manufacturing scaffolds with complex shapes. The aim of this study was to

perform physicochemical and biological characterization of three-dimensional

matrices of poly (3-hydroxybutyrate) (PHB), made by 3DP via selective laser

sintering (SLS), functionalized with silk fibroin (FB), apatites (HA) and / or

osteogenic growth peptide (OGP), to favor bone regeneration. The results

demonstrated that SLS 3DP produced PHB scaffolds with porosity percentage

of 55.8 ± 0.7% with regular pores of 500-700 µm. The addition of HA and FB

results in similar porosity and enhanced PHB water absorption rate, at the 2h

timepoint. The incorporation of FB improved compressive strength and elastic

modulus, which was also improved by FB-HA. In vitro tests showed good cell

adhesion, spreading and proliferation in all. In the indirect evaluation of calcium

precipitation a better result was observed in FB-HA group mainly in 3 days. In vivo experimental groups failed to stimulate contact osteogenesis. However, the

scaffolds preserved the thickness of implantation area, which did not occur in

the control clot group. It was concluded that the scaffolds evaluated in this study

have some favorable properties for bone regeneration. However some of their

action mechanisms in vivo, especially in long-term periods, still have to be

better understood.

Keywords: tissue engineering, bioprinting, polymers, fibroin, apatites

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO...................................................................................................11

OBJETIVOS.......................................................................................................21

MATERIAL E MÉTODO.....................................................................................23

CAPÍTULO 1......................................................................................................44

CAPÍTULO 2......................................................................................................71

CAPÍTULO 3....................................................................................................114

RESULTADOS COMPLEMENTARES............................................................150

CONCLUSÃO..................................................................................................154

REFERÊNCIAS...............................................................................................156

ANEXO 1.........................................................................................................164

ANEXO 2.........................................................................................................166

11

Introdução

12 INTRODUÇÃO O aumento de expectativa de vida tem estimulado o desenvolvimento de

novos biomateriais para diversas aplicações clínicas. Neste sentido, a

engenharia tecidual tem proporcionado grandes avanços no desenvolvimento

de biomateriais tridimensionais (3D) para reconstrução de tecidos, como o

tecido ósseo, com destaque para sua associação com células-tronco61.

Contudo, os autoenxertos ósseos ainda são considerados “padrão ouro” para

reconstrução de defeitos ósseos relacionados a enfermidades congênitas,

traumas ou lesões oncológicas. Isso se deve ao fato de possuírem

propriedades biológicas favoráveis como: osteocondução, osteogênese e

osteoindução12. Além disso, este tipo de enxerto não induz rejeição

imunológica. Entretanto a utilização de autoenxertos resulta em algumas

desvantagens como: 1) quantidade óssea e áreas doadoras limitadas; 2) o

potencial de morbidade da área doadora; 3) considerável reabsorção; 4)

viabilidade limitada por causa da escassez de vascularização em caso de

enxertos não vascularizados; 5) tempo cirúrgico adicional12.

Uma alternativa aos autoenxertos é a utilização dos homo e aloenxertos.

Porém, os mesmos necessitam de cuidados especiais para que haja a redução

dos riscos de transmissão de infecção e de ativação do sistema imunológico do

hospedeiro e, consequentemente, a rejeição do enxerto devido à

incompatibilidade biológica23.

Os materiais sintéticos podem interagir fracamente com o hospedeiro e

falhar ao longo do tempo devido a desgaste e fadiga, além de poderem

promover reação de corpo estranho31. Além disso, as desvantagens dos

autoenxertos, homoenxertos e aloenxertos tem levado a engenharia tecidual e

a biotecnologia a desenvolverem novos biomateriais e métodos promissores

para reparação dos tecidos. Tratando-se do tecido ósseo, para a obtenção de

um processo cirúrgico e regenerador com menor morbidade, os substitutos

ósseos sintéticos e/ou processados biotecnologicamente tornaram-se

biomateriais potenciais para aplicações clínicas em regeneração óssea.

13 Matrizes tridimensionais para Engenharia Tecidual

A engenharia tecidual combina princípios de engenharia e biologia, e se

baseia em três pilares: a terapia celular, materiais porosos bioativos e

sinalização molecular, física ou mecânica38.

As matrizes tridimensionais, também denominadas “scaffolds”, na engenharia tecidual podem ser classificadas como sintética ou natural em sua

origem. Independentemente da origem, tais scaffolds destinam-se a apoiar a

fixação, manutenção, proliferação, e, em algumas situações, a diferenciação de

populações celulares selecionadas. Além disso, o scaffold deve possuir forma

adequada e funcionar como um suporte estrutural para a região anatômica a

ser reconstruída. Quando reabsorvível, o mesmo deve ser substituído pela

neoformação tecidual38.

Os scaffolds utilizados para a formação óssea servem como um

arcabouço para a interação celular e formação da matriz extracelular, provendo

suporte estrutural para o novo tecido formado, ou seja, agindo como um

osteocondutor40. Além disso, essas matrizes devem atender a alguns critérios

para desempenhar esta função, incluindo propriedades mecânicas

semelhantes às do tecido a ser reparado, biocompatibilidade e reabsorção em

um ritmo compatível com a remodelação28.

Além da osteocondutividade, os scaffolds podem servir como veículos

para a administração de moléculas bioativas, tais como as proteínas

morfogenéticas ósseas (BMPs), fatores de crescimento semelhantes à insulina

(IGFs) e fatores de crescimento transformantes (TGFs) que estimulam células

precursoras do hospedeiro a se diferenciarem em células produtoras de matriz

óssea28, proporcionando assim, osteoindução. Finalmente, a osteogênese pode

ser obtida semeando nos scaffolds células que irão estabelecer novos centros

de formação óssea, como osteoblastos e células mesenquimais com o

potencial de se diferenciar em uma linhagem osteoblástica33.

Alguns fatores inerentes às características dos scaffolds também são

determinantes na regeneração óssea. Segundo Karageorgiou, Kaplan34, a

formação óssea no interior dos scaffolds tanto in vitro quanto in vivo é

influenciada por duas características: porosidade e tamanho dos poros. Nas

análises in vitro se consegue simular a osteogênese com uma superfície

14 menos porosa. Em contraste, para análises in vivo existe a necessidade de se

ter uma superfície com grande quantidade de poros, implicando numa

porosidade uniforme, e com tamanho de poros maiores interconectados para

ocorrer o crescimento ósseo. Portanto, o conhecimento da porosidade e

tamanho dos poros do scaffold utilizado é de suma importância para que haja

uma boa vascularização e neoformação óssea, evitando-se condições de

hipóxia e indução de formação osteocondral antes da osteogênese.

Especificamente para formação óssea, a literatura relata um tamanho mínimo

de cerca de 100 μm dos poros, recomendando-se também poros maiores que

300 μm para aumento da formação de novo osso e formação de capilares34.

Muitos métodos têm sido desenvolvidos para a fabricação de matrizes

porosas tridimensionais a partir de polímeros bioabsorvíveis. Em geral, espera-

se desenvolver um método de fabricação prático e capaz de formar,

simultaneamente, uma estrutura interna de poros interligados e uma externa,

que dê forma anatômica às matrizes61. Suprindo essas expectativas, a

impressão tridimensional (3D), encontra-se como uma opção promissora na

produção de scaffolds31.

Impressão tridimensional (3D)

A tecnologia de impressão 3D é baseada na construção de um modelo

virtual por um sistema de desenho auxiliado por computador (computer-aided

design - CAD), fatiado em seções transversais digitais que são transformadas

em arquivos STL (Stereolithography). Estas fatias são reproduzidas fisicamente

por um processo físico-químico, controlado por um computador e um material,

que pode estar na forma de pó, folha, líquido ou fio, conforme a tecnologia de

impressão 3D empregada9.

A impressão 3D é um processo de produção que utiliza um grande

número de processos aditivos como sinterização seletiva a laser (SLS),

estereolitografia (SLA) e modelagem por deposição de material fundido (FDM)

para transformar um modelo virtual em uma forma física. Essas técnicas se

diferenciam entre si no tipo de material que pode ser utilizado e em como as

camadas são depositadas para reproduzirem o modelo39.

15 A tecnologia SLS é umas das principais utilizadas na impressão 3D. Ela

utiliza um laser de CO2 associado à matéria prima em pó para impressão das

camadas. A interação do laser com o pó aumenta sua temperatura, levando o

pó ao ponto de fusão, permitindo a sinterização de um agregado de partículas

para formar uma forma sólida39. As técnicas que utilizam pó como matéria

prima possuem a vantagem de poderem produzir scaffolds com alto grau de

porosidade45.

Uma característica distintiva do processo de construção camada por

camada é que podem ser construídas peças de alta complexidade, não

possíveis de serem construídas por qualquer outro método convencional de

fabricação. Outra característica importante é que essas peças complexas

podem ser construídas de forma relativamente rápida44. Os scaffolds podem

então, ter a forma anatômica do órgão/estrutura a ser reconstruída/substituída,

o que faz com que a impressão 3D contribua com o diferencial tecnológico na

engenharia tecidual. Além disso, na regeneração do tecido ósseo

especificamente, a técnica permite a produção de scaffolds com alto controle

na geometria dos poros e permite que os mesmos sejam interconectados, fator

importante para a utilização em tecido ósseo34, 47.

Os scaffolds basicamente são fabricados a partir de duas classes de

materiais, os polímeros e as cerâmicas. Dentre os materiais poliméricos

estudados e utilizados pela engenharia tecidual estão: colágeno, poli (ácido

láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), poli (ε-caprolactona) (PCL), poli (3-

hidroxibutirato) (PHB) e a fibroína da seda, bem como a associação desses

materiais18.

Poli (3-hidroxibutirato) - PHB

O PHB é um biopolímero termoplástico da família dos poli

(hidroxialcanoatos) (PHA), poliésteres naturais e biodegradáveis, os quais

podem sofrer degradação hidrolítica ou enzimática1. O PHB é produzido por

meio de fermentação bacteriana, com predominância de utilização da bactéria

Ralstonia eutropha. É um polímero biocompatível e reabsorvível com inúmeras

aplicações médicas30.

16 A biossíntese deste polímero permite um processo cíclico sustentável

por meio de fontes renováveis, substituindo tecnologias de ponta ligadas à

produção e ao uso de materiais poliméricos sintéticos de fonte petroquímica.

Além disso, vem para substituir materiais como o polipropileno, poliestireno,

polietileno e poli (cloreto de vinila) geradores de problemas ambientais devido

ao tempo necessário para que ocorra degradação e a utilização de recursos

não renováveis derivados do petróleo11.

Contudo, o PHB apresenta algumas desvantagens que limitam sua

aplicação como, alto grau de cristalinidade, baixa resistência mecânica e

propriedade hidrofóbica4, 8.

Muitos métodos têm sido desenvolvidos para modificar a superfície e as

propriedades físico-químicas dos scaffolds a base de PHB para melhorar suas

propriedades tanto mecânica quanto de biocompatibilidade, além do tempo de

reabsorção. Dentre estes métodos se destaca a adição de fases inorgânicas a

este polímero, a base de fosfatos de cálcio, como a hidroxiapatita13, 14, 20, 21, 62,

bem como também a incorporação de colágeno, celulose bacteriana e a

fibroína da seda (FB)2, 8, 14.

Fibroína da seda (FB)

A fibroína da seda é proveniente do casulo fabricado pelo bicho-da-seda,

principalmente pelo gênero Bombyx mori. As fibras de fibroína possuem

aproximadamente 10-25 μm e consiste em duas cadeias proteicas: uma cadeia

leve (26KDa) e a pesada (390 kDa) ligadas por uma simples ligação de

dissulfeto. Essas cadeias são revestidas por uma proteína hidrofílica chamada

sericina. A fibroína da seda pode ser purificada pelo aquecimento dos casulos

em uma solução alcalina. A cadeia primária da fibroína consiste praticamente

em glicina (43%), alanina (30%) e serina (12%)59.

A proteína da seda possui uma estabilidade conformacional maior em

condições fisiológicas em comparação com proteínas globulares, esta

característica é atribuída devido a um maior número de interações fracas como

as ligações de hidrogênio, a natureza hidrofóbica na maior parte da proteína, e

da significativa cristalinidade da estrutura proteica. A seda é insolúvel a maioria

17 dos solventes, incluindo água, ácido diluído e agentes alcalinos. Entretanto,

existe uma clara evidência na literatura de que a seda, como uma proteína, é

susceptível a degradação proteolítica in vivo e, durante períodos mais longos, é

lentamente absorvida2.

A fibroína extraída da seda possui propriedades desejáveis, como alta

resistência mecânica, biocompatibilidade com baixa resposta inflamatória e

imunogênica35, 36, 42. Sua estrutura única de conformação em folhas-β

(cristalina) confere elevada rigidez e resistência aos biomateriais, tornando-a

um biopolímero útil para aplicações em engenharia tecidual óssea3. A fibroína

tem obtido nos EUA a aprovação da agência Food and Drug Administration

(FDA) para alguns dispositivos médicos. Além disso, devido às características

anfifílicas pós-processamento da seda, é possível sintetizá-la com

propriedades absorvíveis para aplicações em engenharia tecidual obtendo

diversos formatos para materiais, incluindo filmes, scaffolds, fibras, hidrogéis e

esponjas46, 60.

Desta forma, a fibroína tem grande potencial para ser empregada no

revestimento das superfícies de estruturas 3D, dando-lhes funcionalidade

biológica inerente a esta proteína, bem como, podendo agregar um aumento na

resistência mecânica.

Apatitas

Durante a produção dos scaffolds para regeneração tecidual óssea, um

fator que pode auxiliar na melhora das respostas do tecido hospedeiro é a

incorporação de apatitas aos mesmos. A incorporação de íons Ca2+ e P 3- na

superfície dos scaffolds torna essa superfície bioativa, o que pode promover

um contato direto osso-material, com ausência de tecido conjuntivo nesta

interface, levando a uma adequada fixação biomecânica55.

As apatitas são compostos minerais a base de cálcio e fosfato,

presentes nos tecidos minerais do corpo. A hidroxiapatita, Ca10(PO4)6(OH)2, é

um dos materiais capazes de formar uma ligação direta e forte entre o material

e o tecido ósseo55. A forma sintética da hidroxiapatita tem sido amplamente

18 investigada, devido à composição química semelhante à da matriz mineral do

osso. Os recobrimentos com hidroxiapatita, ou fases de hidroxiapatitas não

estequiométricas, são considerados bioativos55.

As apatitas têm sido amplamente utilizadas em aplicações médicas,

ortopédicas e odontológicas, como recobrimentos ou materiais de

preenchimento e/ou reconstrução para a reparação do tecido ósseo. Uma

diversidade de métodos é utilizada na produção de revestimentos bioativos

sobre materiais como scaffolds e implantes, incluindo pulverização de íons,

ablação por laser, plasma spray, sol-gel, a deposição eletroforética, métodos

hidrotérmicos e métodos biomiméticos17.

Os recentes esforços das pesquisas concentram-se em combinar as

melhores características da hidroxiapatita e dos polímeros para criar um

material a ser utilizado para substituição de tecido ósseo18. Usando o método

biomimético, a hidroxiapatita pode ser adicionada aos polímeros sintéticos para

desenvolver compósitos biomiméticos para regeneração óssea.

Consequentemente, esses compósitos, híbridos ou não, podem atuar como um

osso artificial exibindo bioatividade e desempenho mecânico semelhante aos

dos ossos naturais17.

Peptídeo de crescimento osteogênico (Osteogenic growth peptide – OGP)

Outro atributo estudado para os scaffolds produzidos por impressão 3D

é a capacidade destes em liberar controladamente drogas e fatores de

crescimento. Dentre as vantagens da liberação local, destacam-se o uso de

doses reduzidas, o controle do padrão de liberação e significativa redução nos

efeitos colaterais quando comparado a vias sistêmicas de administração9, 61.

Dentre os fatores de crescimento importantes na engenharia de tecidos ósseos

que tem sido investigado para este propósito, destacam-se o fator de

crescimento do endotélio vascular (VEGF), fator de crescimento de fibroblastos

(FGF) e proteínas morfogenéticas ósseas (BMP) são importantes na

engenharia de tecidos ósseos9. Mais recentemente, o peptídeo de crescimento

osteogênico (OGP) tem atraído considerável interesse clínico por possuir

propriedades anabólicas para o tecido ósseo e estimuladora da hematopoiese5.

19 O peptídeo de crescimento osteogênico (OGP), NH2-

HALKRQGRTLYGFGG-OH, foi descoberto no início dos anos 90, e trata-se de

um peptídeo de ocorrência natural cuja estrutura primária é idêntica à

sequência C-terminal da histona H4. Está presente fisiologicamente no soro

humano, de ratos, e aparentemente de outras espécies de mamíferos em

concentração micromolar6. A maioria (cerca de 90%) do OGP sérico encontra-

se especialmente na forma de um complexo de proteínas OGPBP-OGP

(OGPBP=OGP binding protein)6. O OGP pode se ligar não covalentemente à

α2-macroglobulina (α2-M) do soro, na forma nativa da proteína ou quando se

encontra no estado instável.

A concentração do OGP sérico é aumentada transitoriamente durante

uma injúria local ao tecido ósseo, medula óssea ou em reações osteogênicas

sistêmicas, e também quando baixas doses de OGP exógeno são requeridas

para a estimulação da formação óssea, o que sugere uma função auto-

regulativa para os complexos OGPBPs6, 27, 29. Este mecanismo, aparentemente

está presente em muitas, se não em todas, as células, podendo desempenhar

uma função crucial no circuito de feedback positivo do OGP, controlando a

proliferação e diferenciação celular.

A clivagem proteolítica do OGP gera o pentapeptídeo OGP (10-14). As

principais funções tanto do OGP quanto deste seu derivado, são atuar na

proliferação e diferenciação de células progenitoras ósseas e hematopoiéticas,

favorecendo a regeneração de ambos os tecidos5, 15, 32.

In vitro os peptídeos, OGP e OGP(10-14), possuem excelente potencial

mitogênico para células de linhagem osteoblástica e fibroblásticas6, 7, 25,

favorecem o aumento da atividade da fosfatase alcalina (ALP) e da

mineralização da matriz óssea5, 50. Além disso, o OGP demonstrou ter uma

maior atividade da ALP quando comparado ao hormônio de crescimento (GH) e

ao FGF50. Tanto o OGP quanto o OGP(10-14) regulam diretamente a

diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos favorecendo assim a

neoformação óssea16, 58.

In vivo, o OGP regula a expressão dos fatores de crescimento de

transformação TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3, fator de crescimento fibroblástico

FGF-2, fator de crescimento insulínico IGF-1 e do colágeno tipo I10. Outros

estudos in vivo demonstraram que a administração diária via sistêmica do OGP

20 estimulou a ossificação endocondral em locais de fratura tanto em ratos quanto

em coelhos, reduzindo o tempo de reparação óssea10, 24, 57. Além disso,

aumentou a densidade trabecular óssea e estimulou a remodelação óssea de

osso imaturo para osso lamelar6, 26.

Defeitos ósseos tratados com scaffolds de PLGA com OGP sintético

adsorvido foram reparados em um menor tempo em relação aos animais que

receberam o OGP por via sistêmica. Este estudo apontou um importante

resultado na via de administração deste peptídeo, revelando um efeito

terapêutico mais eficaz quando aplicado localmente54.

Desta forma, este peptídeo apresenta um grande potencial para ser

utilizado na medicina regenerativa, e por isso, foi escolhido para ser

empregado na funcionalização dos biomateriais a serem desenvolvidos neste

estudo.

Apesar dos avanços conquistados no desenvolvimento de novos

biomateriais para engenharia tecidual, ainda busca-se um biomaterial com

propriedades físico-químicas e mecânicas capazes de mimetizar estruturas

similares ao autoenxerto na engenharia tecidual óssea. É com base nesta

necessidade, que os materiais utilizados nesse trabalho foram desenvolvidos

no Centro de Tecnologia da Informação Renato Archer (Campinas, Brasil) 44, 45,

47 e funcionalizados no Instituto de Química de Araraquara (UNESP) sob a

orientação da pesquisadora Dra. Sybele Saska Specian. O desenvolvimento

dos scaffolds consiste na confecção de estruturas 3D a partir da impressão por

SLS, utilizando PHB, funcionalização das mesmas com fibroína e apatitas e

avaliação de seu potencial de liberação controlada de OGP, visando conferir

melhores propriedades mecânicas e biológicas ao polímero PHB.

21

objetivos

22

OBJETIVOS OBJETIVO GERAL

x Avaliar físico-química e biologicamente matrizes tridimensionais de poli

(3-hidroxibutirato) produzidas com a tecnologia de impressão 3D por

SLS, funcionalizadas com fibroína da seda, apatitas e/ou peptídeo

osteogênico OGP.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS x Realizar caracterizações físico-químicas para melhor compreensão da

estrutura 3D à base de PHB confeccionada por impressão 3D via SLS,

bem como sua interação com a fibroína, apatitas e/ou OGP;

x Analisar in vitro os materiais PHB, PHB-OGP, PHB-OGP(10-14),

PHB/FB, PHB/(FB-HA)-OGP, e seus efeitos na morfologia, viabilidade e

proliferação de células mesenquimais de ossos longos, bem como

avaliar seu potencial para formação óssea;

x Analisar in vivo a biocompatibilidade e a eficiência das modificações com

FB, HA e OGP no processo de regeneração óssea.

23

material e

método

24 MATERIAL E MÉTODO

Para realização desse estudo optou-se pela utilização de scaffolds a

base de PHB, modificados por FB, HA, e/ou OGP e OGP(10-14) pós-

processamento das peças 3D, divididos nos seguintes grupos: PHB (sem

modificações); PHB-OGP (PHB com incorporação de OGP); PHB-OGP(10-14)

(PHB com incorporação de OGP(10-14)); PHB/FB (PHB revestido com FB);

PHB/FB-OGP (PHB revestido com FB e incorporação de OGP); e PHB/(FB-

HA)-OGP (PHB revestido com FB e HA e incorporação de OGP). No ensaio de

resistência mecânica foram utilizadas amostras de PHB somente e associadas

à FB e HA.

1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS

1.1 Confecção dos scaffolds de PHB

As amostras 3D foram confeccionadas pela tecnologia de impressão 3D

Selective Laser Sintering (SLS) empregando a máquina SinterStation 2000

(DTM Corporation) no Centro de Tecnologia da Informação – Renato Archer

(CTI, Campinas, SP). Primeiramente foram gerados modelos geométricos

virtuais com poros regulares e interconectados estabelecendo a melhor forma,

tamanho, espessura tanto para os estudos in vitro e in vivo. Para desenvolver

estes modelos geométricos virtuais foi empregado o programa SolidWorks CAD

3D (Dassault Systèmes SolidWorks Corp., França). A partir destes modelos

virtuais foram gerados os modelos físicos.

Para confecção das peças foi utilizado PHB com tamanho de partículas

entre 10-100 µm (Biocycle®, PHB Industrial S/A, Brasil). No processo de

fabricação dos scaffolds foi utilizado o equipamento de SLS com laser de CO2

nos seguintes parâmetros: potência = 8 W; velocidade de varredura = 2000

mm/s; ponto do feixe = 450 μm; espessura da camada = 0,18 mm e

espaçamento de varredura = 0,15 mm. A temperatura do alimentador de

matéria-prima foi utilizada a 50 °C e do leito de construção a 100 °C. Os

scaffolds foram produzidos nas dimensões de 10 mm de diâmetro, 2 mm de

25 espessura e poros de 700 µm (Figura 1A). Para os corpos de provas dos

ensaios de resistência mecânica, os scaffolds foram confeccionados nas

dimensões de 35 × 20 mm, com poros de 700 µm (Figura 1B).

Figura 1 - Modelos virtuais 3D dos scaffolds de PHB. A= Modelo de 10mm x

2mm; B= Modelo de 20mm x 35mm.

Após a confecção das amostras por manufatura aditiva as mesmas

foram limpas com ar de nitrogênio para remoção dos grânulos de PHB não

sinterizados no interior dos poros.

1.2 Confecção das amostras PHB/FB

Preparação da solução de fibroína da seda

A preparação da solução de fibroína foi baseada em metodologias

previamente descritas por Rockwood et al.51 e Nogueira et al.43. A fibroína foi

extraída a partir de casulos de bicho-da-seda fornecidos pela Fiação Bratac

(Bastos, São Paulo). Para a sua extração, os casulos foram cortados em

pedaços menores em formato de filetes. Esses pedaços foram então colocados

em uma solução de Na2CO3 a 0,02 mol.L-1 (5 g de casulos: 2 L de solução de

Na2CO3) a 100 °C por exatos 30 min para remoção da sericina das fibras de

fibroína. Após esse tempo, a fibroína foi retirada com auxílio de uma espátula,

e lavada em 1 L de água ultrapura por três vezes por 20 min cada lavagem. A

700 µm

2 mm700 µm

10 mm

700 µmhaste

haste

poro

20 m

m

Tamnho do poro: 700µmTamanho da haste: 700µm

A B

26 proteína foi colocada em uma folha de alumínio limpa e mantida por algumas

horas em estufa a 37 °C para secagem51.

Para a solubilização das fibras de fibroína da seda, a cada 10 g de

fibroína seca foram adicionados 100 mL de solução ternária de

CaCl2:CH3CH2OH:H2O em proporção molar de 1:2:8. A suspensão obtida foi

mantida aquecida em banho termostatizado, a aproximadamente 80 °C, até a

completa solubilização43.

A fibroína solubilizada foi dialisada contra água ultrapura a temperatura

ambiente (25 ± 2 °C), para remoção do CaCl2. Alíquotas de 15 mL da solução

de FB foram colocadas em membranas de diálise (Membrana de celulose 3000 Adrich – 25 mm) e deixadas em 1 L de água ultrapura sob agitação constante,

com trocas de água após 1 e 4 h, depois a cada 12 h, totalizando 48 h.

A solução resultante foi centrifugada duas vezes a 20.000 r.p.m., a 4 °C,

por 30 min, para remoção de impurezas51. Estes processos permitem a

produção de soluções de fibroína de seda em água a 4% (m/v). As soluções de

FB são armazenadas a 4 °C por pelo menos uma semana. Esta solução final

foi então utilizada para a funcionalização dos scaffolds de PHB.

O revestimento das estruturas 3D com FB foi realizado por meio de

imersão destas peças 3D em solução de fibroína a 4%, a 10 °C, por 72 h. Após

a incorporação de FB aos scaffolds, as amostras foram secas a 37 °C por 24 h.

1.3 Confecção das amostras PHB/(FB-HA)

A hidroxiapatita (HA) foi incorporada às peças 3D já revestidas com FB

segundo a metodologia de Saska et al.52. As peças foram imersas

primeiramente em solução de CaCl2 0,05 mol.L-1 por 24 h, e depois em solução

de Na2HPO4 0,1 mol.L-1 a temperatura ambiente (TA) por mais 24 h. Após o fim

da incorporação, as amostras foram retiradas da solução e secas a 37 °C

durante 24 h.

27 1.4 Incorporação dos peptídeos OGP e OGP(10-14) às amostras

Os peptídeos OGP e OGP(10-14) utilizados neste estudo foram

peptídeos sintetizados pela metodologia de síntese em fase sólida adquirido

pela Empresa AminoTech (São Paulo, Brasil). A incorporação dos peptídeos

OGP e OGP(10-14) aos scaffolds foi realizada por adsorção.

A partir do perfil de liberação obtido em um teste de liberação

controlada, realizado com base em artigos prévios52, 53, foi determinado para

ambos os peptídeos, OGP e OGP(10-14), a concentração ideal de 10-5 mol L-1

a ser incorporada aos scaffolds. Estudos prévios na literatura demonstraram

que concentrações maiores que 10-14 mol.L-1 acentuaram a proliferação celular,

e que a concentração de 10-9 mol.L-1 promoveu uma melhor atividade da

fosfatase alcalina e maior formação e mineralização de nódulos de osso

neoformado 6, 56.

As soluções peptídicas foram preparadas em solução aquosa contendo

10 % (v/v) de etanol absoluto (Synthes, Brasil), na respectiva concentração de

10-5 mol.L-1 para os peptídeos OGP e OGP(10-14). A incorporação do peptídeo

OGP por adsorção, foi realizada imergindo cada amostra, PHB, PHB/FB e

PHB/(FB-HA), em 2 mL da solução peptídica por 72 h, a 10 °C. Após a

incorporação, as amostras foram secas a 37 °C por 24 h. A incorporação do

OGP(10-14) foi somente nos scaffolds de PHB, realizada da mesma maneira

que o descrito acima.

1.5 Esterilização

Após a secagem, as peças para os ensaios in vitro e in vivo foram

acondicionadas em envelopes apropriados, e foram encaminhadas para serem

esterilizadas com radiação gama a 20 kGy pela Embrarad (Cotia, Brasil).

28 2 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA 2.1 Caracterização das estruturas 3D

As caracterizações foram realizadas para os materiais

tridimensionalmente estruturados por impressão 3D e funcionalizados por

fibroína e pelo compósito FB-HA. A morfologia dos scaffolds foi analisada por

microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura (MEV).

Adicionalmente, foram avaliadas a resistência mecânica à compressão, a taxa

de intumescimento e a porosidade desses respectivos scaffolds.

2.1.1 Microscopia óptica (MO) As imagens de MO foram obtidas em um microscópio (Leica) acoplado a

uma câmera digital (Leica DFC425). A captura das imagens foi realizada

usando o programa Leica Application Suite. O programa ImageJ 1.48v foi

usado para mensurar o tamanho dos poros dos scaffolds sinterizados

2.1.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) As micrografias das amostras foram realizadas para a análise

morfológica de superfície e verificação da estrutura fina dos scaffolds. As

amostras foram recobertas por uma camada de ouro de espessura de 6 nm

(20 s, tensão de 3 Kv e corrente de 15 mA). As micrografias foram obtidas em

um microscópio eletrônico da marca FEI, modelo Magellan 400L (Laboratório de Caracterização Estrutural da Universidade Federal de São Carlos, SP). O

tamanho das partículas de apatita precipitada na amostra PHB/(FB-HA) foi

mensurado pelo programa ImageJ 1.48v.

2.1.3 Ensaio mecânico de resistência à compressão

As propriedades mecânicas de limite de resistência à compressão e

módulo de elasticidade foram realizadas em uma máquina universal de ensaios

mecânicos modelo Instron 5569 (Laboratório de Ensaios Mecânicos do CCDM – DEMa/UFSCar) utilizando uma célula de carga de 500 N e uma velocidade

constante de 0,5 mm.min-1. Os testes foram realizados com os scaffolds de

29 PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA). Os corpos de prova foram confeccionados

segundo as normas da ASTM D1621:10 e F2150:07. Três amostras de cada

tipo de scaffold (n = 03) foram utilizadas para os ensaios mecânicos.

A resistência à compressão ou tensão à compressão (σc) foi calculada

de acordo com a Equação (1). Em que: F = força máxima de carregamento

aplicada (Newton); e A= área da secção transversal do corpo de prova antes

do ensaio (mm2).

A resistência mecânica também foi mensurada antes e após a imersão

das amostras em solução SBF37, por 30 min, a temperatura ambiente, para

simular a resistência à compressão das mesmas nas condições após

implantação cirúrgica. Decorrido os 30 min, o excesso de SBF foi rapidamente

removido com papel de filtro, e em seguida as amostras foram colocadas nos

dispositivos acoplados à máquina de ensaios.

2.1.4 Taxa de intumescimento

As amostras PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) foram imersas

separadamente em água deionizada por 24 h à temperatura ambiente. Os

scaffolds foram removidos em tempos determinados, inicialmente 30 e 60 min,

seguida de medidas a cada 60 min até totalizarem 8 h, e depois medidas foram

realizadas após 24 h da medida inicial. O excesso de água superficial foi

rapidamente removido com papel de filtro levemente umedecido e em seguida

os scaffolds foram pesados. A taxa de intumescimento das amostras foi

realizada em triplicata.

O conteúdo de água nos scaffolds intumescidos foi calculado pela

Equação 2, onde Ms é o peso da amostra seca e Mi é o peso da amostra

intumescida:

(2)

(1)

30 2.1.5 Determinação da porcentagem de porosidade

A porosidade dos scaffolds foi determinada usando um aparato de

mensurar densidade e uma balança eletrônica baseado no Princípio de Arquimedes34. Nesta análise foi usados scaffolds com as dimensões de 11 mm

de diâmetro e 2 mm de espessura. Inicialmente foi aferido o valor da massa do

scaffold seco (m) e calculado seu volume. Posteriormente, o scaffold foi imerso

em 5 mL de água por 30 min a temperatura ambiente para que todos os poros

fossem preenchidos com água (conforme dados obtidos no teste de

intumescimento). A Equação (3) usada para calcular a porosidade (Φ) está

mostrada abaixo:

Φ

(3)

onde ρap e ρr são referentes a densidade aparente e a densidade real

do scaffold, respectivamente. Os valores de ρap e ρr foram calculados usando

as equações (4 e 5) após pesar os scaffolds em ar, imersos em água e

intumescidos, respectivamente.

(4)

(5)

onde ms , mim e mi são referentes ao peso dos scaffolds mensurados

secos, imersos em água e intumescidos, respectivamente. ρH2O é a densidade

da água na temperatura da hora do teste. Três amostras de cada scaffold

foram mensuradas para obtenção das médias e desvio padrão da porosidade.

A porosidade do modelo virtual foi calculado obtendo o valor do volume

total (Vtot) e do volume real (Vr) pelo programa Magics®18.2, Equação 6.

Φ (6)

31 3 ÁNALISES IN VITRO

Para a análise in vitro foram utilizadas células primárias mesenquimais

de ossos longos de ratos (Rat bone marrow stem cell - RBMSC), obtidas

através da técnica de extração do conteúdo interno da medula óssea de ossos

longos, tíbia e fêmur bilateral, seguindo uma adaptação da técnica descrita em

Maniatopoulos41 1988 (Processo CEUA - FOAr - UNESP nº 32/2014 - Anexo

1).

Foram utilizados ratos Rattus Norvegicus Holtzman, de 15 a 21 dias,

com peso inicial de aproximadamente 50 gramas. Após anestesia com

Ketamina (0,08 mL. 100 g-1) e Xilazina (0,04 mL. 100 g-1), os animais foram

eutanasiados por aprofundamento anestésico. Para extração das células,

inicialmente é feita a dissecção de fêmur e tíbia bilateral, seguido de um corte

das epífises e lavagem da parte medular dos ossos com meio de cultura celular

alfa-MEM (αMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 100 U.mL-1 de

penicilina e 100 µg.mL-1 de estreptomicina (P/S). O conteúdo da medula óssea

é então centrifugado a 200 g por 5 min em temperatura ambiente. As células

são ressuspendidas em 10 ml do mesmo meio de cultura para cada osso

longo, semeadas em placas de cultura de 100 mm e cultivadas a 37°C, em

atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico. Após 24

h é feita a troca do meio de cultura para remoção das células não aderidas

intercalando-se, após isso, a troca do meio de 3 em 3 dias, até que as células

cheguem a uma confluência em torno de 80%, onde são congeladas em FBS

com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).

Para as análises in vitro, as células foram utilizadas até a terceira

passagem e foram plaqueadas em uma concentração de 2×105 sobre os

scaffolds. cultivo foi feito em αMEM com 10% de FBS, 100 U.mL-1 de

penicilina e 100 µg.mL-1 de estreptomicina, suplementado com 50 µg.mL-1 de

ácido ascórbico e 10 mmol.L-1 de β-glicerofosfato, para estímulo da

diferenciação osteoblástica, em placas para cultura de células de 24 poços, a

37°C, em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico.

Antes de iniciar os experimentos com os materiais, com o intuito de

avaliar a eficácia da técnica utilizada em extrair células capazes de se

32 diferenciarem em osteoblastos após estímulo, uma avaliação de produção de

fosfatase alcalina, quantificação de cálcio e formação de nódulos minerais foi

realizada. 2×104 e 5×104 células foram plaqueadas para a avaliação de

produção de fosfatase alcalina e quantificação de cálcio no sobrenadante da

cultura em placas de 6 poços com um n=3. Para avaliação de produção de

nódulos minerais, foram utilizadas 5×104 células em placas de 35 mm com um

n=3.

A produção de fosfatase alcalina foi avaliada após 3, 7, 10 e 14 dias de

cultura. As proteínas foram extraídas inicialmente de cada poço adicionando-se

1 mL/poço de Triton-X 100 a 0,1% (Sigma®) e ciclos de congelamento e

aquecimento. Para mensuração da fosfatase alcalina foi utilizado o kit

Fosfatase Alcalina seguindo as orientações do fabricante (Labtest Diagnostica, Brasil). Para mensuração da quantidade de cálcio no sobrenadante da cultura

foi utilizado a metodologia descrita abaixo (ver em tópico 3.3 Quantificação de

cálcio, página 33) nos períodos de 3, 7, 11, 14 e 21 dias de cultura, utilizando o

meio sem células como controle negativo (C-).

A formação de nódulos minerais foi avaliada pela coloração vermelho de

Alizarina nos períodos de 7, 11, 14 e 21 dias. Primeiramente as células foram

fixadas com álcool a 70% e depois coradas com uma solução de vermelho de

Alizarina, ph 4,2 por 15 min. O excesso de corante foi então retirado e as

placas fotografadas para avaliação.

Os resultados obtidos são observados na Figura 2. Tendo em vista a

eficiência da técnica em isolar células capazes de se diferenciarem em

osteoblastos, como observado nos resultados deu-se segmento aos

experimentos com os scaffolds.

33 Figura 2 - Resultados da avaliação de diferenciação osteoblástica das células

RBMSC. A= Produção de fosfatase alcalina; B= Quantificação de cálcio; e C=

Formação de nódulos minerais por Vermelho de Alizarina. C-: controle

negativo.

Plaqueamento das células mesenquimais sobre os scaffolds Para todas as análises in vitro, foram utilizadas amostras dos grupos

PHB, PHB-OGP, PHB-OGP(10-14), PHB/FB, PHB/FB-OGP e PHB/(FB-HA)-

OGP. As amostras foram colocadas em placas para cultura de células de 24

poços, presas ao fundo da placa por vaselina estéril. As células foram então

semeadas sobre as estruturas 3D em 50 µL de meio de cultura e após 2 h esse

volume foi completado para 1 mL/poço. Os experimentos foram mantidos em

34 incubadoras a 37°C, em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 e 95% de

ar atmosférico.

Para avaliação da resposta das células mesenquimais aos scaffolds, foram realizados os seguintes testes: análise de morfologia celular por

microscopia eletrônica de varredura (MEV); viabilidade e proliferação por

alamarBlue (Molecular probes, EUA); e avaliação indireta da formação de

nódulos minerais por quantificação de cálcio no sobrenadante da cultura.

3.1 Morfologia Os efeitos dos diferentes materiais na morfologia e espraiamento celular

foram avaliados através da MEV nos períodos de 1 e 3 dias. Os estágios de

adesão e espraiamento foram determinados de acordo com o proposto por

Rajaraman et al.49, 1974.

Para a MEV, as células foram cultivadas sobre os scaffolds, e então

fixadas com as soluções de glutaraldeído a 2 % (Sigma, EUA) em αMEM puro (Gibco) e glutaraldeído a 2% (Sigma, EUA) em tampão cacodilato 0,1M (Sigma, EUA), lavadas em PBS (phosphate buffered saline) e desidratadas em

concentrações crescentes de álcool etílico. Após secagem em dissecador a

vácuo as amostras receberam deposição de uma camada de 6 nm ouro para

análise em MEV. Cinco micrografias de cada amostra foram utilizadas para a

análise.

3.2 Análise de viabilidade e proliferação celular A proliferação e viabilidade celular foram avaliadas após 3, 9, 15, 18 e

21 dias de incubação utilizando o teste alamarBlue (Molecular Probes, EUA).

Neste ensaio, uma reação de redução ocorre nas mitocôndrias celulares,

reação essa que converte o produto resazurina (de coloração azul) para sua

forma reduzida resofurina (de coloração rósea). Este então é transportado para

fora das células e já no sobrenadante é quantificado espectrofotometricamente.

Os scaffolds foram incubados em uma placa de 24 poços, contento 1 mL

da solução de trabalho do alamarBlue (α-MEM com 10% de FBS, 1% de P/S e

10% de alamarBlue). Foram utilizadas como controle negativo a solução de

trabalho do alamarBlue. Após o tempo de incubação de 4 h, alíquotas de 150

35 µL foram coletadas de cada amostra foram transferidas para uma placa de 96

poços e lidas em um espectrofotômetro em comprimentos de onda de 570 e

600 nm. O número de células viáveis está relacionado com o nível de redução

de corante e é expresso em percentual de redução do alamarBlue, de acordo

com o protocolo do fabricante.

3.3 Quantificação de cálcio

Para avaliação indireta da preciptação de cálcio sobre os scaffolds, foi

utilizado o teste para quantificação do cálcio presente no sobrenadante da

cultura com o uso do kit Cálcio (Labtest Diagnóstica, Brasil), segundo

orientação do fabricante, nos períodos de 3, 9, 15, 18 e 21 dias. Os

sobrenadantes coletados durante o experimento foram armazenados a -20° C e

após todas as coletas, a mensuração foi realizada com o kit.

Devido à possibilidade de alguns grupos de materiais liberarem cálcio,

utilizou-se como controle negativo o meio de cultura em contato com cada

material, para cada grupo. Como controle positivo, foram utilizadas células

cultivadas no plástico, e seu controle negativo somente o meio de cultura. Para

essa análise interpreta-se que quanto menor a quantidade de cálcio presente

no meio de cultura maior a precipitação do mesmo sobre as amostras.

4 ÁNALISES IN VIVO

O experimento foi realizado baseado nos padrões estabelecidos na

norma ASTM F981-0 “Standard Practice for Assessment of Compatibility of Biomaterials for Surgical Implants with Respect to Effect of Materials on Muscle and Bone”. Este trabalho foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética no

Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP

(Processo nº 17/2013 - Anexo 2)

Os grupos avaliados in vivo foram: Coágulo, utilizado como controle;

PHB; PHB-OGP; PHB/FB; PHB/FB-OGP; e PHB/(FB-HA)-OGP. O protocolo

experimental foi composto por 90 coelhos (Grupo Genético Botucatu), machos,

36 na idade de 5 meses e com peso médio de 3 a 3,5 kg. Em um mesmo animal

foram realizados dois defeitos críticos no osso parietal. Portanto, cada animal

foi utilizado para dois grupos distintos. Para a análise histológica cada grupo

experimental possuiu 6 animais e os períodos de análise foram 15 e 60 dias.

Para a microtomografia computadorizada (µ-CT) foram utilizados 6 animais por

grupo, para os períodos de análise de 15, 60 e 120 dias, totalizando 54

animais. Para análise de expressão gênica cada grupo experimental possui 4

animais e os períodos de análise foram 07, 15 e 30 dias, num total de 36

animais.

Etapa cirúrgica

Os animais foram anestesiados por meio de administração intramuscular

de cloridrato de ketamina (35 mg.kg-1) e de cloridrato de xilazina (10 mg.kg-1),

dosagem esta suficiente para 30 minutos de anestesia. Uma dose de 5 mg/kg

do analgésico cloridrato de tramadol (Tramal) e uma dose de 1 mg.kg-1 de

pentabiótico foram administradas, via intramuscular, em dose única no pré-

operatório. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob rigoroso

protocolo asséptico. Após a anestesia e tricotomia da região parietal, uma

assepsia foi realizada na área com iodopolvidine. Os animais foram

acomodados em posição dorsal e uma incisão em dois planos sobre a sutura

sagital foi realizada, seguida de descolamento e rebatimento dos tecidos

contendo epiderme, tecido muscular e periósteo, até a exposição do osso

parietal.

Os defeitos ósseos críticos foram realizados com o auxílio de uma trefina

de 11 mm de diâmetro e sob irrigação constante de soro fisiológico 0,9%. A

confecção dos defeitos se deu pela perfuração total do osso parietal mantendo-

se a integridade da dura-máter. Foram realizadas ostectomias bilaterais no

osso parietal. Após a confecção dos defeitos, uma marcação a 3 mm da borda

foi realizada com inserção de guta-percha em pequenos orifícios,

bilateralmente ao defeito, para orientação da remoção dos blocos e realização

das análises (Figura 3). Cada defeito recebeu tratamento distinto, seguido por

sutura dos planos por meio de pontos simples e contínuos com fio reabsorvível

de poliglactina Vicryl 4-0 (Ethicon, Johnson & Johnson, EUA).

37 Figura 3 - Desenho esquemático da disposição dos defeitos, marcações de

guta percha e área de remoção da peça (em vermelho).

A eutanásia dos animais foi realizada nos respectivos períodos de

análise descritos. Após anestesia geral com a administração intramuscular de

cloridrato de ketamina (35 mg.kg-1) e de cloridrato de xilazina (10 mg.kg-1) foi

realizada a remoção dos ossos parietais, seguida do aprofundamento

anestésico.

A progressão da reparação dos defeitos ósseos foi avaliada por µCT. A

avaliação da resposta biológica aos diferentes revestimentos do scaffolds de

PHB foi avaliada por análise histológica descritiva, e a expressão e produção

de proteínas envolvidas no processo de regeneração óssea por reação de

polimerase em cadeia - PCR em tempo real e imunohistoquímica,

respectivamente.

4.1 Análise histológica

Processamento Histológico Decorridos os períodos experimentais de 15 e 60 dias, as peças foram

removidas e imediatamente imersas em formaldeído 4% (preparado a partir do

paraformaldeído), tamponado com fosfato de sódio 0,1 mol.L-1, pH 7,2. Após 48

h de fixação, as peças foram transferidas para solução de álcool a 70% para

escaneamento em microtomógrafo. Em seguida, foram descalcificadas em

E.D.T.A. 7% (Ácido Etileno Diamino Tetracético), tamponado com fosfato de

38 sódio 0,1mol.L-1, pH 7,2, desidratadas em gradações crescentes de álcool

etílico (70O, 80O, 90O e 100O G), diafanizadas em xilol, infiltradas e incluídas em

parafina. Posteriormente, foram obtidos cortes sagitais medianos de 4 µm de

espessura.

4.1.1 Análises Morfológica e da Resposta Tecidual Os cortes semi-seriados das porções de calota craniana foram aderidos

a lâminas de vidro e corados com Hematoxilina & Eosina (H&E), sendo

utilizados para a descrição morfológica, bem como para análise da resposta

tecidual nas regiões adjacentes ao material implantado. Nestas análises, foi

avaliada a presença de células inflamatórias mononucleadas e células gigantes

multinucleadas, além de partículas dos biomateriais.

Para a avaliação semi-quantitativa da resposta tecidual dos diferentes

grupos e períodos, imagens das regiões de defeitos ósseos presentes em

cortes corados com H&E foram obtidas utilizando-se um microscópio de luz

Leica DM2500. Observando-se estas imagens, foram estabelecidos escores de

intensidade da reação inflamatória com base na ISO 10993-6: 2007 (Biological Evaluations for medical devices – Part 6: Tests for local effects after implantation), conforme ilustra a Tabela 1. Foram consideradas nesta análise

células mononucleadas (polimorfonucleares, linfócitos, plasmócitos e

macrófagos), bem como células multinucleadas contendo 3 ou mais núcleos

(células gigantes multinucleadas do tipo corpo estranho). Para cada animal

foram obtidas 4 diferentes imagens do mesmo defeito, considerando-se regiões

de centro e bordas do defeito. Foi avaliado um total de 6 animais por grupo,

considerando-se os períodos de 15 e 60 dias. Todas as análises foram

executadas por um examinador cego e previamente treinado.

39 Tabela 1 - Sistema de avaliação histológica considerando-se o tipo de resposta

ou o número de células inflamatórias por campo microscópico. Aumento incial:

400×. Adaptado de ISO 10993-6: 2007 (Biological Evaluations for medical devices – Part 6: Tests for local effects after implantation).

4.1.2 Análise imuno-histoquímica Para detecção e localização da expressão de Colágeno tipo I e

Osteocalcina foi utilizado o método do complexo avidina-biotina-peroxidase

(ABC) com a utilização do kit Immuno Cruz mouse ABC staining system

(Sc:2017, Santra Cruz Biotechnology) segundo as instruções do fabricante.

Previamente foi realizada a recuperação antigênica em tampão citrato 10

mmol.L-1/ pH 6,0, a 90°C, por 20 min. As lâminas foram resfriadas e então, a

atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com solução de peróxido de

hidrogênio 1% em água destilada. Em seguida, as lâminas foram lavadas em

PBS três vezes e o bloqueio de ligações não específicas realizado com a

solução Blocking serum fornecida pelo kit. A incubação com o anticorpo

primário para as proteínas em análise (Anti-Collagen I antibody (ab6308,

Abcam) em diluição 1:800; e Anti-Osteocalcin antibody (ab13418, Abcam) em

diluição 1:400) foi feita overnight em câmara úmida à 4 °C. Como controle

negativo, o anticorpo primário foi omitido e substituído por PBS.

Após repetidas lavagens das peças em PBS, os cortes foram incubados

com anticorpo secundário biotinilado por 30 min, seguido de incubação por 30

Escores

Tipo de Célula/Resposta 0 1

(Raro/Leve) 2

(Moderado) 3

(Intenso) 4

(Muito intenso)

Infiltrado Inflamatório Mononuclear

Ausente 1-5 células/campo

11-20 células/campo

Muitas células

inflamatórias

Campo coberto por

células inflamatórias

Células Gigantes Ausente 1-2

células/campo 3-5

células/campo

Muitas células

gigantes

Campo coberto de

células gigantes

40 min com o reagente enzimático AB, e na sequência com o substrato de

peroxidase por 45 seg, à temperatura ambiente. Todas essas soluções fazem

parte do kit Immuno Cruz mouse ABC staining system. Os cortes por último

contra-corados com Hematoxilina de Carrazi por 45 seg. Posteriormente, as

lâminas foram lavadas em água corrente, desidratadas e montadas com

Permount.

Para a avaliação das imunomarcações também foram atribuídos escores

(análise qualitativa ordinal das imunomarcações). Foram empregados os

seguintes escores: negativo (-), positivo (+), superpositivo (++) ou hiperpositivo

(+++). Para realização da análise estática, os escores foram convertidos em

porcentagens: 0%, 20% (10 a 30%), 60% (50 a 70%) e 90% (80 a 100%)19, 22,

48. A intensidade da coloração foi registrada por um examinador cego.

4.2 Microtomografia computadorizada – µCT

As peças foram removidas após 15, 60 e 120 dias e imediatamente

imersas em formaldeído 4% (preparado a partir do paraformaldeído),

tamponado com fosfato de sódio 0,1mol.L-1, pH 7,2. Após de 48 h de fixação,

as mesmas foram lavadas em água corrente por 24 h e depois armazenadas

em uma solução de álcool 70% em temperatura ambiente. Os espécimes foram

escaneados utilizando o sistema de microtomografia computadorizada Skyscan

1176 (Aartselaar, Belgium). Essas peças posteriormente foram descalcificadas

e utilizadas nas análises histológicas.

Método de escaneamento: Os parâmetros utilizados na tomografia

computadorizada foram um gerador de RX operado a 50 kV com corrente do

feixe de 496 uA. Foi utilizado um filtro de 0,5 mm de alumínio e as imagens

obtidas numa resolução de 18 µm. As imagens tridimensionais foram

reconstruídas utilizando o software de reconstrução NRecon 1.6.1.5 (SkyScan N. V. Belgium).

Análise Volumétrica (3D): A mensuração volumétrica foi realizada

utilizando o software CT Analyser 1.10.1.0 - (SkyScan, Belgium), seguindo a

seleção de uma área de interesse (ROI – region of interest) tridimensional, no

formato cilíndrico com 1,2 mm de diâmetro e espessura envolvendo os 100

41 cortes radiográficos mais centrais (Figura 4). O examinador foi guiado pelas

marcações com guta-percha para o correto posicionamento da ROI. As

análises foram realizadas por um examinador treinado e cego para os grupos

experimentais.

Figura 4 - Ilustração do posicionamento utilizado da região de interesse (ROI)

para as análises de microtomografia computadorizada. A= imagem

radiográfica; B= imagem tomográfica; C= posicionamento da ROI de 1,2 mm de

diâmetro centralizada em relação à guta-percha (setas brancas).

4.3 Análise da expressão gênica - PCR tempo real Foram utilizados 4 animais por grupo para a análise da expressão

gênica nos períodos de 7, 15 e 30 dias. O tecido retirado do animal foi

rapidamente transferido para um tubo em nitrogênio líquido, e posteriormente

para um freezer a -80°C, para conservação da integridade do RNA.

O tecido coletado foi macerado em nitrogênio líquido, e em seguida o

RNA total dos tecidos coletados foi extraído com Trizol (Ambion, EUA). A

concentração do RNA extraído de cada amostra foi medida por densidade

óptica por meio do espectrofotômetro Nanovue (GE).

A síntese de cDNA foi realizada subsequentemente em termociclador

(MyCycler - Bio-Rad), utilizando o kit TaqMan Reverse Transcription Reagents

(Applied Biosystems), de acordo com as instruções do fabricante.

A B C

1,2 mm

42

Dois microlitros de cDNA foi utilizado num volume total de reação de

PCR de 25 μL. Este volume incluiu, além do cDNA, 9,25 μL água livre de

nucleases, 12,5 μL TaqMan Fast gene expression master mix e 1,25 μL TaqMan gene expression assays (Applied Biosystems, EUA) para os genes

alvo: Osterix (assay ID: Pn4331348AIFATAS), Colágeno tipo I (assay ID: Oc03396073_g1), Fosfatase alcalina (assay ID: Pn4331348AICSWYC) e

Osteocalcin (assay ID: Pn4331348AID1U4K). As condições de ciclagem

utilizadas foram: 50°C por 2 min, 95°C por 10 min e 40 ciclos de 95°C por 15

seg e 60°C por 1 min.

O PCR em tempo real foi realizado em um equipamento Step One Plus

(Applied Biosystems, EUA). Os resultados foram analisados usando o método

de comparação de cycle threshold (Ct), utilizando a GAPDH (Applied Biosystems, EUA, assay ID: Oc03823402_g1) como gene normalizador.

5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As análises estatísticas foram feitas no programa GraphPad Prism v.5. O

teste D’Agostino e Pearson foi aplicado para verificação da normalidade das

amostras e verificou-se que, para todos os experimentos desse estudo, as

amostras não tinham distribuição normal. Portanto, para comparações de três

ou mais grupos foi utilizado o teste para dados não paramétricos, Kruskal-

Wallis com pós-teste de Dunn; e para as comparações entre dois grupos foi

utilizado o teste para dados não paramétricos Mann-Whitney. O nível de

significância adotado foi de 5%.

A apresentação dos resultados e discussão foi dividida em três capítulos

em formato de artigos. O capítulo 1, aborda os resultados de caracterização

físico-química e a avaliação in vitro dos scaffolds PHB e PHB associado aos

peptídeos OGP e OGP(10-14). O capítulo 2, aborda os resultados de

caracterização físico-química e a avaliação in vitro dos scaffolds PHB, PHB/FB,

PHB/FB-OGP e PHB/(FB-HA)-OGP. Esses dois primeiros artigos foram

43 redigidos com os resultados obtidos nesta tese de doutorado e no projeto de

pós-doutoramento da co-orientadora Dra. Sybele Saska Specian. Portanto

algumas metodologias presente nos artigos (Espectroscopia de ressonância

magnética nuclear no estado sólido do núcleo 31P, Análise termogravimétrica,

Calorimetria exploratória diferencial, Deterimação da liberação do peptídeo

OGP e Avaliação da bioatividade dos scaffolds in vitro) não fazem parte desta

tese. O capítulo 3 aborda a resposta in vivo dos materiais supracitados.

44

capítulo 1

Artigo submetido para publicação na revista Biofabrication e aqui apresentado nas normas de submissão da revista.

45

Three-dimensional printing by selective laser sintering of poly(3-hydroxybutyrate) scaffolds associated to osteogenic growth peptide

Luana C. Pires1, Mariana A. Cominotte1, Larissa S. Mendes2, Marcelo F. de Oliveira3, Izaque A. Maia3, Jorge Vicente L. da Silva3, Sidney J. L. Ribeiro2, Joni A. Cirelli1, Sybele Saska2*

1Dental School, Univ. Estadual Paulista – UNESP, Department of Periodontology, Rua Humaitá, 1680, Zip Code 14.801-903 – Araraquara – São Paulo, Brazil. E-mail: luanacp@yahoo.com.br, marianaacominott@foar.unesp.br, cirelli@foar.unesp.br 2Institute of Chemistry, Univ. Estadual Paulista – UNESP, Postal Code 355, Araraquara – São Paulo, Brazil. E-mail: la_mendes@hotmail.com, sidney@iq.unesp.br, sybele_saska@yahoo.com.br 3Information Technology Center Renato Archer (CTI), Division of Three-dimensional Technologies, Rod. Dom Pedro I, Km 143.6, Campinas – SP, Brazil. E-mail:marcelo.oliveira@cti.gov.br, izaque.maia@cti.gov.br, jorge.silva@cti.gov.br

*Corresponding Author E-mail:sybele_saska@yahoo.com.br. Telephone: 55 16 3301-9631 Address: Institute of Chemistry, Univ. Estadual Paulista – UNESP, Postal Code 355, Araraquara – São Paulo, Brazil

46

Three-dimensional printing by selective laser sintering of poly(3-hydroxybutyrate) scaffolds associated to osteogenic growth peptide

Abstract

Three-dimensional printing (3DP) is a technology which allows

manufacturing scaffolds with complexes structures. Among the techniques

available to 3DP, the selective laser sintering (SLS) is used to construct

scaffolds with higher porosity and controlled-pore size. The aims of this study

were to develop and characterize poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) scaffolds via

SLS and functionalized with osteogenic growth peptide (OGP) and its C-

terminal sequence, OGP(10-14). The results showed high porous scaffolds with

pore size range of 500-700 µm and porosity of 55,8±0,7%. Thermal properties

of PHB polymer were not changed by the SLS process. The compressive

strength and Young’s modulus for dry and wet scaffolds were 0,73±0,05 MPa/

4,98±0,37 MPa and 0,51±0,01 MPa/3,50±0,11 MPa, respectively. Furthermore,

the OGP release profile showed PHB scaffold promoted a controlled release

above 72h. In vitro assays using rat bone marrow stem cells showed similar

cellular proliferation in all the PHB scaffolds. . Scanning electronic microscopy

images showed an apparently better morphological differentiation in the groups

containing peptides. Thus, the SLS process promoted the sintering of a

hierarchical structure with interconnected pores and intrinsic porosity, which are

important factors for cell adhesion and proliferation. This was confirmed with

good proliferation and morphological differentiation of cells in all scaffolds.

Keywords: additive manufacturing, three-dimensional printing, polymer,

peptide, bone tissue engineering, in vitro.

47

1. Introduction

Additive manufacturing (AM) or three-dimensional printing (3DP) is a

current technology to construct three-dimensional physical objects, layer-by-

layer, from a digital model. This technology is a promising option for the

production of scaffolds particularly for bone substitutes. This technique consists

in constructing structures of different shapes by a tool for direct digital

fabrication that selectively prints a respective material (layer-by-layer) into/onto

a bed, whose shape is given by a computer aided design (CAD) file [1, 2].

Furthermore, 3DP allows a better control of porosity and pore size than in

traditional methods [1]. Because of this versatility, this technology has been

recently used in the biomedical area to manufacturing scaffolds for replacement

or reconstruction of complexes tissues or organs, including bone regeneration

[3, 4].

Nevertheless, the principles of 3D printing consist firstly in elaboration of

a virtual model, from a CAD or an animation modeling software, whose virtual

model is sliced into digital cross-sections and converted in STF files, to be used

as a guideline for printing. In this second step, the successive layers are printed

using liquid, powder, or some other material to build the physical model [5]. A

distinctive feature of this layer-by-layer printing process, is the printing of

structures with high geometric complexity and well-defined architecture as well

as patient-specific implant designs, which are not possible to be constructed by

any other manufacturing method [1]

Different additive processes may be used in 3D printing including

selective laser sintering (SLS), stereolithography (STA) and fused deposition

modeling (FDM). They differ from each other by the materials that can be used

and by the way the layers are deposited to create parts. In the SLS process the

slices are written by a CO2 laser beam layer-by-layer with powder addiction

over a powder bed and resolution depends on laser beam diameter. The

interaction of the laser beam with the powder increases the temperature to the

melting point and fuses the particles to form a solid mass. In the final stage the

printed object is removed from the powder environment and it is cleaned from

the remaining powder [5, 6].

48

The technologies that process powder, as SLS, have the advantage of

manufacturing scaffolds with greater controlled porosity and porous size in

regarding to the other processes [6]. These and other architectural features,

e.g. permeability, play a significant role in biological delivery and tissue

regeneration [7]. In bone tissue engineering, the advantage of this process is

given by providing the control of fine features including interconnected porosity

and no contamination issues related to any second material for support

structures [4].

In the SLS process, one of the printing materials used are thermoplastic

polymers. Among different polymers, poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) has

attracted attention for application in biomedical areas as scaffolds due to its

biocompatibility and biodegradability [8]. PHB is a thermoplastic polyester

classified as biopolymer, which is produced by microorganisms, as the bacteria

Ralstonia eutropha, under imbalanced growth conditions [8]. This biopolymer

has been widely used for biomedical applications, such as bone plates, sutures,

rivets, staples, screws, orthopedic pins, bone marrow scaffolds and meniscus

regeneration devices [9]. Previous studies described the manufacture of PHB

scaffolds by SLS process, whose results showed 3D-printed scaffolds with high

porosity and controlled pore size, which are important factors for cell growth

support [2].

Indeed, an ideal bone substitute (BS) material should provide a variety of

shapes and sizes with suitable mechanical properties for being used in sites

where there are impact loading. Thus, 3D printing is an important technology

that provides all these features. Moreover, the materials used for bone tissue

engineering should be biocompatible, osteoconductive, preferably being

resorbable and replaced by new bone formation. In general, resorbable BS

materials are preferred, since these materials are expected to preserve the

increased bone volume during the reconstruction and simultaneously are

gradually replaced by newly formed bone [10].

Furthermore, numerous physicochemical features of scaffolds, such as

surface chemistry, surface roughness, topography, mechanical properties and

interfacial free energy (hydrophobic/hydrophilic balance) are important for cell

attachment, proliferation and differentiation. These factors are also critically

49

important to the overall biocompatibility and bioactivity of a particular material

[11-13].

3D printed scaffolds have also been used for incorporating of growth

factor and of drug delivery systems to stimulate bone growth in the area of

scaffold implantation. The advantages of localized delivery are reduced

therapeutic dose, controlled release pattern and negligible side effects

compared with systemic drug delivery [14]. Growth factors such as vascular

endothelial growth factor (VEGF), fibroblast growth factors (FGF) and bone

morphogenetic proteins (BMP) are important in bone tissue engineering [4]. The

osteogenic growth peptide (OGP) has attracted considerable clinical interest as

a bone anabolic agent and hematopoietic stimulator [15].

OGP peptide is an identical sequence to the C-terminus of histone H4,

which is physiologically present in the human and rodent serum in micromolar

concentration, mainly as an OGP-OGP binding protein complex (OGP-OGPBP)

and is highly and transiently increased during systemic osteogenic remodeling

and phase of post-ablation bone marrow regeneration [16]. The primary

sequence of this peptide contains a highly conserved 14-amino acid motif (H2N-

ALKRQGRTLYGFGG-OH). The endogenous OGP is proteolytically cleaved

after the dissociation of the OGP-OGPBP complexes, thus generating the C-

terminal pentapeptide (NH2-YGFGG-OH), named OGP(10-14). OGP(10-14) is

the proteolytic cleavage product from OGP [17, 18], whose sequence has been

suggested as the physiologically active form of OGP peptide [19-21], inasmuch

as this pentapeptide activates the signaling pathway of the cytoplasmic OGP

[19, 22].

Gabet et al. [23] demonstrated that the systemic administration of

synthetic OGP (10–14) in rats and mice increases bone formation, trabecular

bone density and stimulates fracture healing. Brager et al. [24] observed in vivo

the regulation in the expression of type I collagen, transforming growth factors

(TGF), FGF, insulin-like growth factor (IGF) and aggrecan. Furthermore, OGP

and OGP(10–14) enhance hematopoiesis, which increases engraftment of bone

marrow transplant and stimulate hematopoietic regeneration after ablative

chemotherapy [25, 26].

In this study, PHB scaffolds were manufactured by 3D printing via SLS

for bone tissue engineering. Based on previous results of our research group

50

[27, 28], OGP and OGP(10-14) peptides were incorporated to PHB scaffolds

and the release of the OGP peptide was evaluated. Characterization of the

scaffolds was conducted in terms of scaffold morphology, porosity, thermal

analysis and mechanical properties. Moreover, in vitro assays were performed

using mesenchymal rat bone marrow stem cells to evaluate the effect of those

scaffolds with or without peptides on cellular adhesion and proliferation stages.

2. Materials and Methods

2.1 Materials The poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) was supplied by PHB Industrial S/A

(Biocycle®, São Paulo, Brazil) in powder form with particle size distribution in

the 10-100 μm range, an average molecular weight of 600,000 Da and density

of 1.22 g cm-3, data reported by the PHB’s supplier. The OGP and OGP(10-14)

peptides were purchased from AminoTech© (São Paulo, Brazil). The OGP-5,6-

carboxyfluorescein (OGP-CF) peptide was supplied by Synthesis, Structure,

Application Laboratory of Peptides and Proteins (Institute of Chemistry - UNESP, Araraquara, Brazil).

2.2 Design and fabrication of 3D scaffolds

Cylindrical scaffolds model with a 3D orthogonal-projection porous

architecture were designed using SolidWorks® software (Dassault Systèmes SolidWorks Corp., France). Therefore, CAD models for in vitro assays and

mechanical tests were designed in the dimensions: 1) 11 mm in diameter and 2

mm height; and 2) 20 mm in diameter and 35 mm height, respectively. Struts

and pores were designed in size of 700 µm, which provided a porous structure

with interconnected pores, as shown in Figure 1.

The CAD models were then exported into STL format and transferred to

a computer of the SLS machine. The 3D scaffolds were printed in a

Sinterstation® 2000 SLS machine (3D Systems, Valencia, CA), which

selectively sintered the PHB power into scaffolds using CO2 laser. SLS process

parameters for scaffold manufacturing were defined by: laser power = 8 W;

51

laser beam spot = 450 μm; laser beam speed = 2000 mm/s; part bed

temperature = 100 °C; scan spacing = 0.15 mm; layer thickness = 0.18 mm.

The removal of powder attached to the scaffolds was performed by blowing with

compressed air.

Figure 1: The scaffold models designed using SolidWorks®. A= 3D model for in vitro assays; B= 3D model for mechanical tests.

2.3 Incorporation of peptides Incorporation of the peptides, OGP and OGP(10–14), was performed by

adsorption. This methodology promotes the interaction between the peptide and

functional groups from PHB by hydrogen bonding, and the drug delivery occurs

by increasing the solution ion force (biological conditions). For release

evaluation of OGP peptide, this peptide was labeled with carboxyfluorescein

(OGP-CF, 10-5 mol.L-1) according to previous methodology described by Saska

et al. 2012 [27]. In the scaffolds prepared for in vitro assays, the concentration

of peptides OGP and OGP(10-14) was 10-9 mol.L-1, based on previous studies

that considered this concentration optimal to promote a better ALP activity, as

well as a higher formation and mineralization of bone nodules [16, 29]

Therefore, the peptide solutions were prepared containing absolute

ethanol/deionized water (1:9; v/v). The PHB scaffolds were immersed in 2 mL of

respective peptide solution, OGP or OGP(10–14), for 72 h at 10 °C. Each

sample was then dried at 37 °C. Afterwards, the PHB, PHB-OGP and PHB-

OGP(10–14) scaffolds were sterilized by gamma radiation (20 kGy) to in vitro

assays.

700 µm

2 mm700 µm

11 mm

700 µmstrut

strut

pore

20 m

m

Pore size: 700µmStrut size: 700µm

A B

52

2.4 Characterization of PHB scaffolds The morphology of the PHB scaffolds was analyzed using optical (OM)

and scanning electron microscopy (SEM). OM images were observed in a

microscope (Leica) coupled to a digital camera (Leica DFC425). The capture of

the images was performed using the Leica Application Suite software. ImageJ

1.48v software was used for measuring pores size. SEM images of the PHB

scaffolds were investigated using a field emission gun scanning electron

microscope (FEG-SEM; JEOL, model 7500F). The samples were previously

sputter coated with a 1 nm thick gold layer for 60 s (3 kV and 9.5 mA). The

morphology was observed at an accelerating voltage of 2 kV.

Thermogravimetric (TGA) measurements were performed to study the

thermal degradation of PHB. The equipment used was TA SDT 2960 from TA

Instruments Co. The samples were heated in open α-alumina pans from 25 to

600 °C under a nitrogen atmosphere (flow rate: 50 mL.min-1) at a heating rate of

10 °C.min-1. Differential scanning calorimetric (DSC) analysis of PHB powder

and scaffold was performed using a in a Q100 TA Instruments differential

scanning calorimeter, under nitrogen atmosphere (flow rate: 50 mL.min-1) at a

heating rate of 10 °C.min-1. Both first and second heating cycles were

performed in the same heating conditions, from -10 °C to 190 °C. The first cycle

was followed by a cooling at a rate of 10 °C.min-1 until -10 °C. This first cycle

was performed for thermal history of the polymer. The thermal transitions and

the enthalpy of fusion were obtained from DSC curves in the second heating

and temperatures were taken at the peak maximum. Thus, the crystallization

temperature (Tc), the melting temperatures (Tm) and degree of crystallinity (Xc)

of the samples were determined. The crystallinity was calculated according to

the Equation 1, where, ∆Hm is the melting enthalpy and ∆Hm0 is the theoretical

enthalpy of 100% crystalline PHB (∆Hm0 PHB = 146 J g-1) [30].

The porosity of PHB scaffolds was measured using a density kit and an

electronic balance based on Archimedes’ principle [31, 32] according to the

Equation 2, where, ρapp and ρtr are the apparent density and true density of the

(1)

53

(4)

(5)

scaffold, respectively. PHB scaffolds with a size of 11 mm in diameter and 2

mm in height were used for the measurement and distilled water was used as

liquid medium.

ρapp and ρtr were calculated using the following Equations 3 and 4 after

weighing the scaffold in air (dry weight, wd), suspended in water (ws) and in

saturated in water (wsat), respectively, and ρH2O is the density of water at the test

temperature.

First, the dry weight of PHB scaffold was measured and calculated the

respective volume. Then, PHB scaffold was previously immersed in 5 mL

distilled water for 30 min at room temperature. This time was required for filling

of all the pores of scaffold with water, and for obtaining 100% swelling in

relation to their dry weight. The measurements were performed in triplicate.

The porosity of the designed scaffold model was calculated by obtaining

the value of the total volume (Vtot) and the true volume (Vtr) through

Magics®18.2 software, Equation 5.

Compressive tests were performed using an Instron 5569 (Instron Inc., Carton, MA, USA) with a 500 N load cell and a crosshead speed of 0.5

mm.min−1. The cylindrical samples were manufactured and tested according to

ASTM F2150 and D1621, respectively. The scaffolds were tested in dry and wet

conditions, where the wet condition the scaffolds were immersed in SBF

solution (simulated body fluid, Kokubo’s solution) [33]. The samples were

soaked in SBF solution for 10 min at room temperature for simulating the

compressive strength of the scaffolds under conditions post surgical

(2)

(3)

54

implantation. Then, the samples were laid on filter paper for removal of excess

superficial water before performing the mechanical tests. At least three samples

for each condition were tested. Data were expressed as mean ± standard

deviation (SD).

2.5 OGP-CF peptide release in SBF solution The release of labeled peptide (OGP-CF) from PHB scaffolds was

monitored by fluorescence spectroscopy. The release profile was obtained by

immersion of these scaffolds in 30 mL of SBF solution (pH 7.4) at 37 °C under

stirring at 100 rpm and continuous flux maintained by a peristaltic pump for 72

h. Fluorescence measurements were performed on a Varian Cary Eclipse

fluorescence spectrophotometer coupled to the system using a 400-μL flow-

through cell with 10 × 4 mm light path employing λexc at 492 nm and λem at 520

nm; slit widths were set for a 5-nm band-pass for all measurements. The

concentration of peptide was obtained from the standard curve of free labeled

peptide in SBF solution. Triplicate experiments were carried out.

2.6 In vitro assays Primary mesenchymal cells from rat long bones (rat bone marrow stem

cell - RBMSC) were used for all in vitro assays. Cells were extracted from the

internal contents of the bone marrow of long bones, tibia and femur bilateral,

following an adaptation of the protocol described by Maniatopoulos 1988 [34].

All the procedures and experiments were submitted to Ethics Committee on the

use of animals of Araraquara´s Dental School (CEUA - FOAr - UNESP), and

approved with the process number 32/2014. 2×105 cells up to the third passage

were plated over the scaffolds and cultivated in alpha-mininum essential

medium (αMEM) supplemented with 10% of fetal bovine serum (FBS), 100

U.mL-1 of penicillin and 100 µg.mL-1 of streptomycin, 50 µg.mL-1 of ascorbic acid

and 10mmol.L-1 of β-glycerophosphate. The culture was maintained in

humidified atmosphere with 5% of CO2.

Cell morphology - Scanning Electron Microscopy (SEM)

Cell morphology and spreading were evaluated by SEM. After 1 and 3

days the medium was removed and the cells were fixed, dehydrated in gradual

55

(6)

series of alcohol and air vacuum dried. Five images were taken from a FEI

Magellan 400L microscope (FEI, USA). A descriptive analysis was made and

stages of cell adhesion and spread described by Rajaraman et al. [35] were

used in morphological analysis.

Cell proliferation assay

Cell proliferation was assessed using the alamarBlue kit (Life Technologies, USA). Briefly, at 3, 9, 15, 18 and 21 days after seeding, the

medium was aspirated and 1 ml of dye solution (10% alamarBlue and 90%

culture medium) was added to each well, and cells were incubated at 37 °C for

4 h. Subsequently, 100 μL of solubilization was added into 96-well plates (TPP, USA) and the absorbance of each well was measured at 570 nm and 600 nm

wavelengths with an automatic microplate (ELISA) reader (Molecular Devices, USA). The dye solution was used as negative control.

The percent reduction of alamarBlue was calculated using the formula

suggested by the kit manufacturer represented in equation 6, where: εox600 =

molar extinction coefficient of oxidized form of alamarBlue in 600 nm

wavelength = 117,216; εox570 = molar extinction coefficient of oxidized form of

alamarBlue in 570 nm wavelength = 80,586; εred600 = molar extinction

coefficient of reduced form of alamarBlue in 600 nm wavelength = 14,652;

εred570 = molar extinction coefficient of oxidized form of alamarBlue in 570 nm

wavelength = 155,677; AT600 = absorbance of test in 600 nm wavelength;

AT570 = absorbance of test in 570 nm wavelength; AC600 = absorbance of

negative control in 600 nm wavelength; and AC570 = absorbance of negative

control in 570 nm wavelength.

Indirect calcium preciptation assay

To assess the potential of the PHB scaffolds associated or not with OGP

or OGP(10-14) to favor bone regeneration, calcium precipitation over scaffolds

56

was indirectly evaluated by calcium quantification into culture supernatant with

Cálcio Kit (Labtest Diagnóstica, Brazil). Following the manufacturer’s guideline,

the supernatant was collected after 3, 9, 15, 18 and 21 days and the calcium

concentration was measured in a plate reader at a wavelength of 570 nm. Cells

cultured in plastic plates were used as positive control and culture media was

used as negative control. To interpret this assay, calcium precipitation in the

scaffolds was considered inversely proportional to the concentration of calcium

available in the supernatant.

2.7 Statistic analysis

Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 5.0 software.

Non-parametric Kruskal-Wallis with Dunn’s post-hoc test was used in

comparisons among three or more groups, and Mann-Whitney was used to

compare two groups. Differences were considered statistically significant when

p<0.05.

3. Results and Discussion

3.1 Fabrication and characterization of the scaffolds Porous 3D scaffolds have been developed by variety of conventional

methods from alloplastic materials, such as particle/salt leaching, chemical/gas

foaming, fiber bonding, solvent casting, melting molding, phase separation and

freeze drying [4, 36]. However, these methods present some limitations due to

their lack of the controlled formation of pores and do not produce

interconnected structures for favoring cell growth inside the structure. For

overcome these disadvantages, additive manufacturing (AM), has become a

promising option for the production of scaffolds particularly for bone substitutes

[4].

Currently, 3D printed scaffolds have been widely used for bone tissue

engineering. Among them we can mainly highlight the use of this 3D printed

bone substitutes based on bioceramics for vertical bone augmentation as onlay

57

graft. The results shown by these studies are promising and efficient as bone

graft compared to autografts [37-39].

However, this study aimed to use a technology of AM for powder

processing, as SLS; since this technology can provide a higher intrinsic porosity

when compared with other AM technologies, such as fused deposition modeling

(FDM) and stereolitrography (SL) [1, 6]. Although, scaffolds manufactured via

SLS might have a lower mechanical strength compared with other AM

techniques.

The results of this study revealed PHB powder is an optimal polymer for

processing via SLS. Figure 2 shows PHB scaffold printed for mechanical tests

and OM image obtained of the PHB scaffold. OM image shows scaffold pores

decreased in size regarding to the CAD model, due to polymer concentration

after processing. Pores observed with irregular shapes and size in the 500 –

700 µm range.

The surface morphology of the PHB scaffolds is shown in Figure 3. SEM

images of this samples revealed that printing via SLS promoted the formation of

an ideal intrinsic porosity for cell adhesion and spreading. Moreover, the

morphology of struts were well preserved and the pores can be identified and

compared with the CAD model. Additionally, intact particles of polymer attached

to the struts were observed without complete fusion, as is shown Figure 3B.

This fact could be explained by the interaction of these particles to the struts

due to a small amount of melting promoted by the heat generated during the

SLS process [40].

Figure 2: A= 3D scaffold printed via SLS for mechanical tests. B= OM image

shows extrinsic pores produced by processing of the PHB scaffolds.

A B

58

Figure 3: SEM images of sintered PHB scaffolds. A= magnification 50×; B=

magnification 100×. White arrows indicate intact PHB particles after

sinterization.

The value measured to the apparent porosity of the sintered scaffolds

was 55.8±0.7%, which was higher than the theoretical value of 40.7%,

calculated by Magics®18.2 software from the designed scaffold model. This

higher apparent porosity value than the theoretical value is due to the presence

of micropores on the surface, and also interconnect micropores into scaffold.

The apparent porosity values have been reported from sintered scaffolds

via SLS process based on poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) (PHBV)

and Ca-P/PHBV of 64.6±2.0% and around 61.8-62.6±1.2%, respectively,

regarding to the its theoretical value, approximately 53% [32, 41]. The

difference of apparent porosity observed in this study was lower than the values

from the literature data. Nevertheless, this value is related to the designed CAD

model, since the proportion of the printed-scaffold porosity increased in relation

to the theoretical porosity, similarly to the literature data [32, 41, 42].

The literature has demonstrated that osteogenesis in vitro is not affected

by pore size, but can be enhanced by scaffolds with lower porosity. However, in vivo, higher porosity and pore size of at least 100 μm are required, due to cell

size, migration requirements and transport of nutrients. Pores > 300 μm are

recommended to promote the new bone formation and the formation of

capillaries [31]. Therefore, the PHB scaffolds obtained in this study by the SLS

process seems to provide optimal features of porosity and pore size for in vivo

application and bone regeneration.

B A

59

Thermal properties of polymers are important to be investigated, mainly

when polymers or even proteins are used to printing processes; whereas, some

additive manufacturing technologies require high temperatures for processing

the 3D models. Thus, the TGA curves for PHB powder and scaffold are shown

in Figure 4. Thermogravimetric analysis was carried out to estimate the thermal

stability and degradation profiles of the PHB powder and printed scaffold via

SLS. The respective TGA curves only revealed an important weight loss around

245 - 315 °C with decomposition temperature (Tonset) at 279 °C. Both the TGA

curves showed a similar degradation profile, i.e., PHB did not show difference in

the thermal stability before and after the SLS process.

Figure 4: Typical TG curves for the PHB powder and scaffold.

100 200 300 400 500 600

0

20

40

60

80

100

Wei

ght l

oss

(%)

Temperature (°C)

___ PHB powder___ PHB scaffold

Thermal properties and degree of crystallinity PHB powder and scaffold

were summarized in Table 1. The results showed no significant change in the

thermal properties, as well as, in the degree of crystallinity between PHB

powder and printed scaffold. These data showed the parameters used in the

SLS process maintained the thermal characteristics of PHB polymer, whose

results corroborate with other previous study of our research group [2]. Pereira

et al. 2012 [2] reported that the PHB powder has already been processed, until

32.5 hours, can be used in another printing processes by SLS; since, the

thermal properties of PHB polymer are not changed when is used controlled

parameters of printing during the SLS process.

60

Table 1: Thermal properties and degree of crystallinity of the PHB powder and

scaffold.

Tm (°C) Tc (°C) ΔHm (J/g) Xc (%) PHB powder 176.4 116.6 64.7 44.3

PHB scaffold 173.9 111.9 66.5 45.6

The mechanical properties as the compressive strength and Young's

modulus of the PHB scaffolds are shown in table 2. The compressive properties were considered because they are important for bone tissue engineered

scaffolds and should ideally match those of living bone. Although, the values

measured to the compressive strength of the PHB scaffolds were very lower

than human cancellous bone (~10 MPa) [43], these values were higher than the

values obtained from other printed scaffolds by the SLS process [40, 41]. The

scaffolds developed in this study even after in immersion in SBF solution

presented values higher than the literature data. Duan et al. [40] developed

PHBV and Ca-P/PHBV scaffolds via SLS process using a designed model with

1-mm pore size and 0.5-mm strut, whose values measured to the compressive

strength were 0.19±0.02 and 0.24±0.02 MPa, respectively.

Table 2: Mechanical properties of the PHB scaffolds in dry and wet conditions.

Compressive strenght Young's modulus

(MPa) (MPa) PHB 0.73±0.05 4.98±0.37 PHBim 0.51±0.01 3.50±0.11 The tests were obtained in dry and wet material condition. im: after immersion in SBF solution for 30 min. The values indicated represent mean±standard deviation, where n=3. No statistical differences (p>0.05, Mann-Whitney test).

Compressive strength of printed scaffolds via the SLS process is

determined by material and mainly 3D-model geometry. Strut thickness, pore

size and porosity percentage directly influences in compressive strength.

Therefore, designed 3D model for this study with 0.7-mm pore size and 0.7-mm

strut diameter, allowed to develop printed scaffolds with a high compressive

strength compared with the literature data [40, 41].

61

This designed model was based on limitation of SLS technique, whose

technique has limits in relation to the increase of strut size and the decrease of

pore size. Therefore, this relation strut/pore directly influences in the formation

of intrinsic porosity, without interconnected large pores in scaffolds.

Furthermore, pore size should be enough for migration/proliferation of

osteoblastic cells, in this case, minimum pore size might be 300 µm [31].

Thus, sintered scaffolds in this study could be potentially used for bone

regeneration in regions with low load incidence, such as calvaria or in regions

with high load incidence, but without function of load-bearing, such as bone

defects in femur and for spine implants; whereas, the cancellous bone

microstructure has a limit to compressive strength around 0.32 to 2.25 MPa

[44].

3.2 Determination of OGP-CF peptide release from PHB scaffolds Release measurement to the PHB/OGP-CF was performed without to

know the adsorption kinetic of OGP-CF peptide, i.e., adsorbed maximum

concentration was not determined. Therefore, the used parameter started from

the total theoretical value of incorporation of 10-5 mol.L-1. Although, the value of

adsorbed maximum concentration was not determined, the behavior of OGP-CF

release profile can be observed and can also estimate the necessary

concentration to be incorporated into scaffolds for a more efficient release.

The cumulative release profile versus time from the PHB/OGP-CF

scaffolds is shown in Figure 5. PHB/OGP-CF scaffolds exhibited a steady

continued release pattern with a certain amount of initial burst release and a

sustained release in the following time. This burst release observed in the first

hour of experiment can be attributed to the presence of OGP-CF on the surface

of the scaffolds, which can result in overestimated values in the first moments of

the release test, due to swelling of the PHB scaffold within of this period. At 10

h, the release was in the range of 3.45×10-6 g. After this period, a steady

continued release pattern was observed until 72 h and a release around

4.87×10-6 g; and a plateau phase was not observed in this release profile.

Therefore, this release profile suggests that the PHB scaffold promotes a

controlled release in a greater time, above 72 h. According to the literature, this

release behavior can be attributed to tridimensional structure [45].

62

This release behavior is typical of a controlled release system, in which

the peptide is homogeneously adsorbed on the porous surface of the material.

The release occurs by diffusion of the peptide through the pores of the matrix

and the diffusion rate is reduced since the diffusion distance becomes greater.

The faster initial release can be explained by the fact of the OGP-CF fraction to

interact with polymeric surface by weak interactions or by slight solubility of

peptide, which can readily favor the release of the superficial molecules [45,

46]. The initial behavior follow by a slow release is due to molecules that can

strongly interact with polymer or are incorporated into intrinsic pores of 3D

structure providing a sustained effect of release [45, 47]. Furthermore, this

release profile showed the OGP-CF incorporation to the PHB scaffold and

release were more efficient in relation to the incorporation and release of OGP-

CF from bacterial cellulose membranes, as observed in previous study [27];

however, this result was similar when compared with another study, where

OGP-CF was incorporated to the mesoporous silica nanoparticles [28].

Figure 5: OGP-CF release behavior from the PHB scaffold. Data are reported

as mean ± SD for triplicate experiment.

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 45000.0

1.0x10-6

2.0x10-6

3.0x10-6

4.0x10-6

5.0x10-6

Rel

ease

d M

ass

(g)

Time (min)

63

3.3 In vitro assays Factors as chemical surface, porosity, pore size and mechanical

strength are critical to define scaffolds performance [4]. In this study, the SEM

images showed that osteoblasts are well spread and present filopodias in all

groups and periods. However, in the groups containing OGP and OGP(10-14),

the number of cells seems to be higher, mainly at 3 days, with some areas in

almost linear confluence (Figure 6).

Rajaraman et al [35] classified the stages of adhesion and spreading in:

stage 1 - round cells; 2 - round cells with filopodia, 3 - cells with cytoplasmic

webbing, and 4 - well flattened cells. Based on this classification, it is possible

to see at SEM in 1 day of culture, cells in stage 3 for all groups of scaffolds. At 3

days, cells in stage 3 and 4 were found in scaffolds with OGP and OGP(10-14),

but only in stage 3 for PHB scaffolds.

Figure 6: SEM of cells cultivated on the PHB scaffolds manufactured by SLS;

magnification 1000×.

The results of morphology analysis by SEM showed a good cell spread

under PHB scaffolds. Previous results demonstrated rounded osteoblast shape

due to reduced spreading under PHB films [48]. Our results suggest that the

scaffold morphology resulted from SLS 3D printing may have improved cellular

64

response and enhanced their shape differentiation. It is well recognized that

surface topography influences in cellular response, osteoblast specifically,

seem to adhere, proliferate and differentiate better in rougher surfaces [31].

The alamarBlue results represent the percentual of alamarBlue reduction

in the culture medium. In the inter-groups comparison, similar results were

found for all groups. A tendency to greater response was observed in the PHB-

OGP(10-14) compared with others groups at 21 days, but no statistical

significance was observed (Figure 7). These results corroborate with SEM

images demonstrating viability and good proliferation into PHB scaffolds.

Figure 7: Percentual reduction of alamarBlue at 3, 9, 15, 18 e 21 days of

RBMSC in PHB scaffolds with and without OGP and OGP(10-14).

alamarBlue

0

50

100

1503 days9 days15 days

21 days18 days

* **

*p<0,05

PHB PHB-OGP PHB-OGP(10-14)

% re

duct

ion

The indirect evaluation of calcium precipitation is presented in Figure 8.

The PHB scaffolds with or without OGPs revealed no differences compared to

positive control. This result suggests no interference of PHB in mineralization

process in vitro. The OGPs seems to fail in enhancing this process.

65

Figure 8: Indirect evaluation of calcium precipitation over different experimental

groups in 3, 9, 15, 18 e 21 days. Date normalized with negative control. No

statistical differences.

Calcium quantification

0.0

0.5

1.0

1.5

9 days3 days

15 days18 days21 days

PHB PHB-OGP PHB-OGP(10-14)

+C

Fold

cha

nge

The concentration of peptide incorporated to the PHB scaffolds seems

not to influence the cell proliferation and activity. Therefore, the quantity or time

of OGP release were not enough to change cell proliferation response. Further

experiments will be necessary to confirm these results and better understand

the OGP and OGP(10-14) incorporation and action, since our research group

showed that those peptides influenced osteogenic cell proliferation, and the

OGP peptide favored the mineralization process when they were incorporated

to bacterial cellulose [27].

Conclusions

PHB scaffolds with a controllable architecture and pore size were

successfully produced by SLS technology. The sintered 3D models showed

geometrical and dimensional features very close to the designed 3D model.

Additionally, this SLS process promoted the sintering of a hierarchical structure

with interconnected pores and intrinsic porosity, which are important factors for

cell adhesion and proliferation. Compression tests under dry and wet conditions

showed that the mechanical properties were higher than other sintered 3D

66

scaffolds containing PHB. The release of the labeled OGP peptide from the

PHB scaffolds occurred in a controlled manner, which indicates that these

printed 3D scaffolds via SLS process are potential structures for drug delivery.

Based on in vitro results, fabrication of PHB scaffolds by SLS technology is

successful in allow RBMSC growth and proliferation, observed by SEM and

alamarBlue tests. However, the incorporation of OGP and OGP(10-14) does not

seem to influence the cellular adhesion and proliferation stages.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the Brazilian agencies FAPESP

(scholarship, process number: 2011/07947-8) and CNPq (grant no.

550414/2012-6). The authors would like to thank Prof. Dr. Reinaldo Marchetto

(Institute of Chemistry - UNESP, Brazil) by supplying of OGP-5,6-

carboxyfluorescein (OGP-CF) peptide; and the LMA-IQ for FEG-SEM facilities.

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Structural alterations of adhesion mediating components in cells cultured on poly-beta-

hydroxy butyric acid. Biomaterials 2001 Sep;22(17):2425-2434.

71

capítulo 2

Artigo apresentado nas normas da Faculdade de Odontologia de Araraquara

72

Caracterização e avaliação in vitro de matrizes tridimensionais a base de poli (3-hidroxibutirato) produzidas por sinterização seletiva a laser, associadas à fibroína da seda, apatitas e peptídeo de crescimento osteogênico Sybele Saska*, Luana C. Pires*, Larissa S. Mendes, Silva H. Santagneli, Marcelo F. de

Oliveira, Izaque A. Maia, Jorge Vicente L. da Silva, Carlos Rossa Jr, Sidney J. L.

Ribeiro, Joni A. Cirelli

* Estas duas autoras contribuíram igualmente para este artigo.

Resumo O objetivo deste estudo foi desenvolver scaffolds produzidos por

sinterização seletiva a laser (SLS) a base de poli(hidroxibutirato) (PHB),

funcionalizá-los pós-processamento com fibroína (FB), apatita (HA) e peptídeo

osteogênico (OGP), e caracterizá-los físico-química e biologicamente. O

processo SLS permitiu desenvolver scaffolds de PHB com uma arquitetura

porosa com poros interconectados e de tamanho controlado. Os scaffolds

funcionalizados apresentaram-se mais hidrofílicos em relação ao PHB. As

propriedades térmicas do PHB não se alteraram durante o processo de

impressão por SLS e nem pela incorporação de fibroína ao scaffold de PHB.

No entanto, a incorporação de apatita reduziu a temperatura de decomposição

do PHB. As fases de apatita precipitadas nos scaffolds foram DCPD, OCP e β-

TCP. Além disso, os scaffolds PHB/(FB-HA) mostraram-se ser mais bioativos

em relação às outras amostras, PHB e PHB/FB. Os valores mensurados para

resistência à compressão para os scaffolds PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA)

foram 0,73±0,05; 0,86±0,03; e 0,66±0,06 MPa, respectivamente.O perfil de

liberação do peptídeo OGP dos respectivos scaffolds, PHB, PHB/FB e

PHB/(FB-HA) foi de modo controlado e permitiu uma liberação acima de 24 h.

Nos ensaios in vitro observou-se uma boa proliferação celular sobre os

diferentes scaffolds, sem diferença entre os grupos, com uma diferenciação

morfológica aparentemente mais avançada para os scaffolds de PHB e

PHB/FB-OGP. A adição de apatitas aos scaffolds aumentou o acúmulo de

cálcio na superfície dos scaffolds, principalmente em 3 dias (p<0,05). Os

resultados mostraram que os scaffolds de PHB associado ou não à fibroína e

apatitas tem um potencial para aplicação em regeneração óssea. Porém,

73

outros ensaios in vitro são necessários para avaliar, confirmar e melhor

entender os scaffolds de PHB e suas modificações.

Palavras-chave: manufatura aditiva, scaffold, polímero, peptídeo, regeneração

óssea

1 Introdução

Na regeneração tecidual óssea, as matrizes tridimensionais (scaffolds)

são utilizadas para ancorar a adesão, proliferação e diferenciação celular,

proporcionando a formação do tecido. Durante a fabricação dos scaffolds a

escolha da matéria-prima e o tipo de processamento são de suma importância

para o resultado esperado. O scaffold deve não somente servir de guia para a

formação óssea, mas também mimetizar ao máximo a matriz extracelular do

tecido a ser reconstruído39. Tendo isso em foco, a busca em desenvolver

materiais com resistência mecânica apropriada e superfície química específica

que se aproxime da matriz extracelular, inclusive tridimensionalmente, tem sido

o foco de muitas pesquisas em regeneração óssea8.

O processo de manufatura aditiva, também conhecido como impressão

tridimensional (3D) tem recebido destaque na confecção dos scaffolds. Esta

tecnologia permite a reprodução de modelos virtuais com alta complexidade

geométrica e arquitetura bem definida para a forma física ou modelo impresso.

Esta tecnologia permite a construção do modelo físico fatia-a-fatia a partir de

um modelo desenhado pelo sistema de desenho assistido por computador

(Computer-Aided Design - CAD) ou similar, o qual é “fatiado” em diversas

imagens, que são convertidas para a forma de arquivos STL (Standard

Template Library) e então, estes arquivos são carregados para a impressora

3D52.

Um dos sistemas mais utilizados para a impressão dos modelos 3D é o

de sinterização seletiva a laser (selective laser sintering - SLS). A tecnologia

SLS utiliza um laser de CO2 para sinterizar um material na forma de pó

transformando-o em uma forma física sólida. Dentre os materiais utilizados na

74

SLS estão polímeros, cerâmicas, metais e ligas. Além do controle de

reprodutibilidade das formas físicas, outra vantagem dos sistemas que utilizam

pó é o controle de porosidade e tamanho dos poros, essenciais na engenharia

de tecidos, incluindo a regeneração óssea8, 43, 52.

Dentre os polímeros de possível aplicação para impressão de scaffolds

está o PHB - poli(3-hidroxibutirato). O PHB é um poliéster natural encontrado

em muitas bactérias como recurso energético e é produzido em condições não

balanceadas de crescimento45. PHB é um polímero biocompatível e absorvível,

cujas propriedades biológicas o tornam cada vez mais atrativo para aplicações

biomédicas37. Em estudos prévios deste grupo de pesquisa53 e capítulo 1, a

utilização do PHB associado à técnica de impressão 3D por SLS para a

fabricação de scaffolds foi eficiente em reproduzir, com alta fidelidade, o

modelo virtual proposto. Além disso, proporcionou uma matriz com alta

porosidade e tamanho de poros controláveis, podendo ser aplicados para

regeneração óssea.

Na avaliação de respostas celulares aos scaffolds 3D de PHB

produzidos por SLS (capítulo 1), observou-se biocompatibilidade e boa

proliferação celular sobre os mesmos. Entretanto, no quesito resistência

mecânica, os scaffolds apresentaram baixa resistência à compressão (~0,73

MPa) tendo em vista a aplicação para regeneração óssea. Porém, resistência à

compressão mensurada foi superior quando comparado a outro trabalho na

literatura empregando poli(hidroxibutirato-co-valerato) (PHBV), cujo valor obtido

para scaffold de PHBV foi em torno de 0,19 MPa14.

Visando melhorar as propriedades mecânicas e biológicas desses

scaffolds, optou-se nesse estudo por incorporar fibroína da seda e apatita. A

fibroína (FB) extraída da seda possui propriedades desejáveis, como alta

resistência mecânica, biocompatibilidade com baixa resposta inflamatória e

imunogênica27, 29, 42. Sua estrutura única de conformação em folhas-β

(cristalina) confere elevada rigidez e resistência aos biomateriais, tornando-a

um biopolímero útil para aplicações em engenharia tecidual óssea2.

As apatitas (HA) são compostos minerais à base de cálcio e fosfato,

presentes nos tecidos minerais do corpo. A hidroxiapatita, Ca10(PO4)6(OH)2, é

um dos materiais capazes de formar uma ligação direta e forte entre os

biomateriais e o tecido ósseo61. A forma sintética da hidroxiapatita tem sido

75

amplamente investigada, devido à composição química semelhante à da matriz

mineral do osso. Os recobrimentos com hidroxiapatita, ou fases de

hidroxiapatitas não estequiométricas, são considerados bioativos, pois

promovem um contato direto osso-material com ausência de tecido conjuntivo

nesta interface, levando a uma adequada fixação biomecânica61.

Para que um scaffold mimetize a função da matriz extracelular na

regeneração tecidual óssea, é necessário ter em mente que, além de servir

como suporte para a mineralização, a matriz extracelular possui uma série de

fatores de crescimento que guiam o processo de formação óssea35, 64. Os

fatores de crescimento podem estimular atividades celulares como migração,

proliferação e diferenciação para reparar ou regenerar o tecido lesado35.

O peptídeo de crescimento osteogênico (osteogenic growth peptide -

OGP) vem atraindo interesse nas pesquisas por promover a neoformação

óssea. Esse peptídeo foi primeiramente isolado do sangue durante a

remodelação óssea e regeneração medular pós-ablação5. Estudos anteriores

demonstraram que o OGP estimulou em linhagem de células osteoblásticas

proliferação, diferenciação e um aumento na atividade da fosfatase alcalina e

na formação de nódulos minerais5, 11.

Portanto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e avaliar físico-

quimica e biologicamente scaffolds 3D de PHB produzidos por SLS e

modificados pós-processamento por fibroína da seda, apatita e peptídeo

osteogênico OGP.

2 Material e método 2.1 Materiais

O polímero poli(hidroxibutirato) (PHB) foi fornecido pela empresa PHB

Industrial S/A (Biocycle®, São Paulo, Brasil) na forma de pó com tamanho de

partículas na faixa de 10-100 μm, peso molecular de 600.000 Da e densidade

de 1,22 g.cm-3. Os peptídeos OGP e OGP(10-14) foram comprados da

empresa AminoTech© (São Paulo, Brasil). O peptídeo OGP-carboxifluoresceína

(OGP-CF) foi fornecido pelo laboratório da Unidade de Síntese, Estrutura e

76

Aplicações de Peptídeos e Proteínas do IQ-UNESP sob a responsabilidade do

Prof. Dr. Reinaldo Marchetto.

2.2 Design e fabricação dos scaffolds 3D Os scaffolds 3D foram produzidos pela tecnologia de impressão 3D

Selective Laser Sintering (SLS) empregando a máquina SinterStation 2000

(DTM Corporation) no Centro de Tecnologia da Informação – Renato Archer

(CTI, Campinas, SP). Primeiramente, os scaffolds 3D cilíndricos foram gerados

no programa SolidWorks® CAD 3D (Dassault Systèmes SolidWorks Corp., França). A partir destes modelos virtuais foram gerados os modelos físicos.

Assim, os modelos 3D virtuais tanto para os estudos in vitro quanto para os

ensaios de resistência à compressão foram desenhados nas dimensões: 1) 11

mm de diâmetro com 2 mm de altura; 2) 20 mm de diâmetro e 35 mm de altura,

respectivamente. O tamanho de hastes e de poros foi projetado com 700 µm,

cujas dimensões permitiram gerar uma estrutura porosa com poros

interconectados. No processo de fabricação dos scaffolds o pó de PHB foi

sinterizado empregando um laser de CO2. Os parâmetros do processo SLS

usados foram: potência do laser = 8 W; varredura do laser = 0,15 mm; ponto do

feixe do laser = 450 μm; velocidade do feixe do laser = 2000 mm/s; espessura

da camada = 0,18 mm; temperaturas do alimentador de matéria-prima a 50 °C

e do leito de construção a 100 °C.

2.3 Preparação dos scaffolds PHB-FB Primeiramente foi preparada uma solução de fibroína baseada em

metodologias previamente descritas por Rockwood et al.55 e Nogueira et al.50.

A fibroína foi extraída a partir de casulos de bicho-da-seda fornecidos pela

Fiação Bratac (Bastos, São Paulo). Para a sua extração, os casulos foram

cortados em pequenos pedaços. Estes foram então colocados em uma solução

de Na2CO3 a 0,02 mol.L-1. Após essa etapa,,a fibroína foi lavada em água

ultrapura por três vezes por 20 min cada lavagem. A proteína foi colocada em

uma folha de alumínio limpa e mantida por 12 h em estufa a 37 °C para

secagem55.

77

Para a solubilização das fibras de fibroína da seda foi adicionado a

solução ternária de CaCl2:CH3CH2OH:H2O. A suspensão obtida foi mantida a

80 °C, até a completa solubilização50. A fibroína solubilizada foi dialisada contra

água ultrapura a temperatura ambiente (25 ± 2 °C), para remoção do CaCl2.

Alíquotas da solução de FB foram colocadas em membranas de diálise

(Membrana de celulose 3000 Adrich – 25 mm) e deixadas em água ultrapura

sob agitação constante, com trocas de água periódicas. A solução resultante foi

centrifugada para remoção de impurezas55. Estes processos permitem a

produção de soluções de fibroína de seda em água a 4% (m/v), utilizada para a

funcionalização dos scaffolds de PHB.

O revestimento das estruturas 3D com FB foi realizado por meio de

imersão destes scaffolds 3D em solução de fibroína a 4%, a 10 °C, por 72 h.

Após a incorporação de FB aos scaffolds, as amostras foram secas a 37 °C por

24 h.

2.4 Preparação dos scaffolds PHB/(FB-HA) A hidroxiapatita (HA) foi incorporada in situ ao scaffolds PHB-FB

segundo a metodologia previamente descrita por Saska et al.59. Os scaffolds de

PHB-FB foram imersos primeiramente em solução de CaCl2 0,05 mol.L-1, e

depois em solução de Na2HPO4 0,1 mol.L-1 a temperatura ambiente por 24 h

cada imersão. Após o fim da incorporação, as amostras foram retiradas da

solução e secas a 37 °C por 24 h.

2.5 Incorporação dos peptídeos OGP e OGP-CF aos scaffolds Para a avaliação da liberação do peptídeo OGP, este peptídeo foi

marcada com 5,6 carboxifluoresceína (OGP-CF) de acordo com metodologia

prévia descrita por Saska et al.60 2012. A incorporação dos peptídeos OGP e

OGP-CF aos scaffolds foi realizada por adsorção. Portanto, a concentração de

OGP-CF incorporado aos scaffolds 3D foi de 10-5 mol.L-1, cuja concentração é

suficiente para realizar as medidas de liberação do respectivo peptídeo44, 60.

A partir do perfil de liberação do OGP-CF foi determinado para o

peptídeo OGP a concentração ideal de 10-5 mol.L-1 a ser incorporada aos

scaffolds. Uma vez que, estudos prévios na literatura demonstraram que

concentrações maiores que 10-14 mol.L-1 acentuaram a proliferação celular, e

78

que a concentração de 10-9 mol.L-1 promoveu uma melhor atividade da

fosfatase alcalina e maior formação e mineralização de nódulos de osso

neoformado5, 63, a concentração de 10-9 mol.L-1 foi utilizada para adsorção nos

scaffolds.

As soluções peptídicas foram preparadas em solução aquosa contendo

10 % (v/v) de etanol absoluto (Synthes, Brasil), nas respectivas concentrações

de 10-9 mol.L-1 e 10-5 mol.L-1 para os peptídeos OGP e OGP-CF. A

incorporação dos peptídeos por adsorção, tanto OGP quanto OGP-CF, foi

realizada colocando cada amostra, PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA), imersa em 2

mL da solução peptídica por 72 h, a 10 °C. Após a incorporação, as amostras

foram secas a 37 °C por 24 h. As amostras contendo OGP-CF foram somente

utilizadas para estudo da liberação controlada.

Todos os scaffolds produzidos para os ensaios in vitro foram

acondicionados em envelopes apropriados, e encaminhados para serem

esterilizados com radiação gama a 20 kGy pela Embrarad (Cotia, Brasil).

2.6 Caracterização dos scaffolds Os materiais impressos e funcionalizados com fibroína e pelo compósito

FB-HA, foram caracterizados por microscopia eletrônica de varredura (MEV),

análise termogravimétrica (TGA), calorimetria exploratória diferencial (DSC),

ressonância magnética nuclear (RMN) no estado sólido do 31P, e resistência

mecânica à compressão. Adicionalmente, a determinação da taxa de

intumescimento, de porosidade e da bioatividade desses respectivos scaffolds

foram avaliadas. A bioatividade foi caracterizada por MEV e TGA.

2.6.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) As micrografias das amostras foram realizadas para a análise

morfológica de superfície e verificação da estrutura fina dos scaffolds. As

amostras foram recobertas por uma camada de ouro de espessura de 6 nm. As

micrografias foram obtidas em um microscópio eletrônico da marca FEI,

modelo Magellan 400L (Laboratório de Caracterização Estrutural da

79

Universidade Federal de São Carlos, SP). O tamanho das partículas de apatita

precipitada na amostra PHB/(FB-HA) foi mensurado pelo programa ImageJ

1.48v.

2.6.2 Análise termogravimétrica (TGA) As curvas de TGA foram obtidas utilizando-se um equipamento TA-

Instruments usando uma célula SDT. As amostras foram aquecidas em cadinho

de alumina de 25 °C a 600 °C sob atmosfera de nitrogênio com fluxo contínuo

de 70 mL.min-1 com razão de aquecimento de 10 °C.min-1.

2.6.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) As curvas DSC das amostras foram obtidas utilizando-se um DSC

modelo Q100 TA Instruments. As medidas foram realizadas em recipientes de

alumínio herméticos, sob as seguintes condições: atmosfera de nitrogênio com

fluxo contínuo de 50 mL.min-1 e razão de aquecimento de 10 °C.min-1. Foram

realizadas 2 medidas para cada amostra separadamente. Uma medida com

aquecimento de um ciclo a partir de -10 a 350 °C, e outra de dois ciclos de

aquecimento, no qual as amostras foram primeiramente aquecidas a partir de -

10 °C a 190 °C e em seguida resfriadas à temperatura ambiente e

imediatamente aquecidas a 190 °C. Como referência utilizou-se recipientes de

alumínio vazios. Os valores do grau de cristalinidade das amostras foram

calculados utilizando a equação 1, onde ΔHf é a entalpia de fusão da amostra e

ΔHf0 é a entalpia de fusão do PHB 100% cristalino (∆Hf

0 PHB = 146,0 J/g)56.

(1)

2.6.4 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) no estado sólido do núcleo 31P

Esta técnica foi empregada para elucidar a composição da fase

inorgânica do compósito obtido FB-HA nos scaffolds de PHB. Para esta

análise, foi utilizado a técnica MAS (rotação em torno do ângulo mágico) para o

monitoramento da formação e/ou interação das fases de HA nas amostras FB-

HA. Todas as medidas foram realizadas em temperatura ambiente no

80

espectrômetro de 500 MHz, Varian Unity INOVA. Para a realização das

medidas foi utilizado uma sonda de 4 mm MAS e para a deconvolução dos

espectros obtidos foi utilizado o programa DMFIT41.

2.6.5 Ensaio mecânico de resistência à compressão As propriedades mecânicas de limite de resistência à compressão e

módulo de elasticidade foram realizadas em uma máquina universal de ensaios

mecânicos modelo Instron 5569 (Laboratório de Ensaios Mecânicos do CCDM – DEMa/UFSCar) utilizando uma célula de carga de 500 N e uma velocidade

constante de 0,5 mm.min-1. Os testes foram realizados com os scaffolds de

PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA). Os corpos de prova e os testes mecânicos

foram feitos segundo as normas da ASTM D1621:10 e F2150:07. Três

amostras de cada tipo de scaffold (n = 03) foram utilizadas para os ensaios

mecânicos.

A resistência à compressão ou tensão à compressão (σc) foi calculada

de acordo com a equação (2). Em que: F = força máxima de carregamento

aplicada (Newton); e A= área da secção transversal do corpo de prova antes

do ensaio (mm2).

(2)

A resistência mecânica foi mensurada antes e após a imersão das

amostras em solução SBF (simulated body fluid: solução de Kokubo)32, por 30

min, a temperatura ambiente, para simular a resistência à compressão das

mesmas nas condições após implantação cirúrgica. Decorrido os 30 min, o

excesso de SBF foi rapidamente removido e as amostras colocadas nos

dispositivos acoplados à máquina de ensaios.

2.6.6 Taxa de intumescimento As amostras PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) foram imersas e removidos

em tempos determinados, inicialmente 30 e 60 min, seguida de medidas a cada

60 min até totalizarem 8 h, e depois medidas foram realizadas após 24 h da

medida inicial. O excesso de água superficial foi rapidamente removido e em

seguida os scaffolds foram pesados. O teste foi realizado em triplicata e o

81

conteúdo de água nos scaffolds intumescidos foi calculado pela equação 3,

onde Ms é o peso da amostra seca e Mi é o peso da amostra intumescida.

(3)

2.6.7 Determinação da porcentagem de porosidade

A porosidade dos scaffolds foi determinada usando um aparato de

mensurar densidade e uma balança eletrônica baseado no Princípio de Arquimedes26. Nesta análise foi usados scaffolds com as dimensões de 11 mm

de diâmetro e 2 mm de espessura. Inicialmente foi aferido o valor da massa do

scaffold seco (m) e calculado seu volume. Posteriormente, o scaffold foi imerso

água por 30 min a temperatura ambiente para que todos os poros fossem

preenchidos com água. A equação (4) usada para calcular a porosidade (Φ)

está mostrada abaixo:

Φ

(4)

onde ρap e ρr são referentes a densidade aparente e a densidade real

do scaffold, respectivamente. Os valores de ρap e ρr foram calculados usando

as equações (5 e 6) após pesar os scaffolds em ar, imersos em água e

intumescidos, respectivamente.

(5)

(6)

onde ms , mim e mi são referentes ao peso dos scaffolds mensurados

secos, imersos em água e intumescidos, respectivamente. ρH2O é a densidade

da água na temperatura da hora do teste. O teste foi realizado em triplicata.

82

A porosidade do modelo virtual foi calculado obtendo o valor do volume

total (Vtot) e do volume real (Vr) pelo programa Magics®18.2, equação 7.

Φ (7)

2.6.8 Avaliação da bioatividade in vitro

A bioatividade das amostras PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) foi avaliada

por meio da imersão dos scaffolds (11 mm x 2 mm) em solução de SBF a 37 °C

por 7, 14, 21 e 28 dias, onde a razão área de superfície/volume foi 0,1 cm-1 25, 33

e a solução foi renovada a cada 24 h. Após esses períodos, as amostras foram

secas a temperatura ambiente. A superfície das amostras foi analisada por

MEV e TGA.

2.7 Determinação da liberação do peptídeo OGP A mensuração da concentração liberada de peptídeo OGP-CF dos

scaffolds foi realizada por espectroscopia de fluorescência. Para análise de

liberação controlada, cada amostra dos grupos PHB-OGP-CF, PHB/FB-OGP-

CF e PHB/(FB-HA)-OGP-CF, foi imersa em solução de SBF (SBF – simulated body fluid, pH 7,4)32 a 37 °C sob agitação, usando um aparato de dissolução

modificado. As aquisições dos dados da concentração de peptídeo liberada

foram realizadas em um espectrofotômetro de fluorescência (Varian Cary Eclipse - Analysis Package Software). Os comprimentos de onda de excitação

e de emissão utilizados foram de 492 e 520 nm, respectivamente. O tempo de

aquisição dos dados foi até 72 h. As medidas foram realizadas em triplicata.

2.8 Estudo in vitro Para a análise in vitro foram utilizadas células primárias mesenquimais

de ossos longos de ratos (Rat bone marrow stem cell - RBMSC), obtidas

através da técnica de extração do conteúdo interno da medula óssea de ossos

longos, tíbia e fêmur bilateral, seguindo uma adaptação da técnica descrita em

Maniatopoulos 1988 (15) (Processo CEUA - FOAr - UNESP nº 32/2014). Foram

83

utilizados ratos Rattus Norvegicus Holtzman, de 15 a 21 dias, com peso inicial

de aproximadamente 50 gramas.

As células utilizadas nos experimentos, até a terceira passagem, foram

plaqueadas em uma concentração de 2×105 sobre os scaffolds. O cultivo foi

feito em α-MEM com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U.mL-1 de penicilina

e 100 µg.mL-1 de estreptomicina (P/S), suplementado com 50 µg.mL-1 de

ácido ascórbico e 10 mmol.L-1 de β-glicerofosfato, para estímulo da

diferenciação osteoblástica, em placas para cultura de células de 24 poços, a

37°C, em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico.

O meio de cultura foi trocado a cada 3 dias.

2.8.1 Morfologia celular - Microscopia eletrônica de varredura (MEV) Aos 3 dias, a morfologia das células cultivadas sobre os scaffolds foi

avaliada por MEV. Após o período experimental as células foram fixadas,

lavadas em PBS (phosphate-buffered saline) e desidratadas em concentrações

crescentes de álcool etílico. Após secagem em dissecador a vácuo as

amostras foram divididas ao meio e receberam deposição de uma camada de 6

nm de ouro. As imagens foram obtidas das observações transversais em um

microscópio Inspec 350 (FEI, EUA) e uma análise descritiva foi realizada,

segundo a classificação dos estágios de adesão e proliferação proposto por

Rajamaram54. Cinco fotos por espécime foram utilizados para análise.

2.8.2 Proliferação celular - alamarBlue

A proliferação foi avaliada após 3, 9, 15, 18 e 21 dias de incubação

utilizando o teste alamarBlue (Molecular Probes, EUA). Neste ensaio, uma

reação de redução ocorre nas mitocôndrias celulares, cuja reação consiste na

redução do reagente resazurina (de coloração azul) em resofurina (de

coloração rósea). Os scaffolds foram incubados em uma placa de 24 poços,

contento 1 mL da solução de trabalho do alamarBlue (α-MEM com 10% de

FBS, 1% de P/S e 10% de alamarBlue). A solução de trabalho sem células foi

utilizada como controle negativo. Após o tempo de incubação de 4 h, alíquotas

de 150 µL foram coletadas de cada amostra e transferidas para uma placa de

96 poços e lidas em um espectrofotômetro utilizando comprimentos de onda de

84

570 e 600 nm. O número de células viáveis está relacionado ao nível de

redução de corante, o qual foi expresso em percentual de redução do

alamarBlue comparado ao controle negativo, de acordo com o protocolo do

fabricante.

2.8.3 Quantificação de cálcio

Para avaliação indireta do processo de mineralização in vitro, foi

utilizado o teste de quantificação do cálcio presente no sobrenadante da cultura

com o uso do kit Cálcio (Labtest Diagnóstica, Brasil), segundo orientação do

fabricante, nos períodos de 3, 9, 15 e 18 dias. Foram utilizados como controle

positivo células plaqueadas no plástico e, como controles negativos, o meio de

cultura com os diferentes scaffolds, porém sem células, para cada grupo, e

somente o meio de cultura, para o controle positivo. Os sobrenadantes

coletados durante o experimento foram armazenados e posteriormente a

mensuração do cálcio foi realizada com o kit, segundo orientação do fabricante.

Para essa análise interpretou-se que quanto menor a quantidade de cálcio

presente no meio de cultura maior a precipitação do mesmo sobre as amostras.

Os dados foram apresentados normalizados com os valores dos controles

negativos de cada grupo.

2.9 Análise estatística A análise estatística dos dados mensurados foi realizada empregando o

programa GraphPad Prism v.5. Para análise de dados com três ou mais grupos

foi utilizado o teste não paramétrico Kruskall-Wallis com pós-teste de Dunn.

Para dados provenientes de dois grupos foi utilizado o teste não paramétrico

Mann-Whitney. O nível de significância adotado foi de 5%.

85

3 Resultado e Discussão

3.1 Caracterizações dos scaffolds As tecnologias de manufatura aditiva que processam pó, como a SLS,

possuem uma vantagem intrínseca em relação às demais tecnologias de

manufatura aditiva na confecção de scaffolds que é a porosidade (Figura 1).

Entretanto, as peças produzidas por essas técnicas podem apresentar uma

menor resistência mecânica em relação às outras técnicas, como “Fused Deposition Modeling” (FDM), “stereolitrography” (SL) and “Three-dimensional Printing” (3DP)52, 70. Por esse motivo, busca-se desenvolver novas técnicas de

pós-processos para impressão 3D no intuito de melhorar tanto as propriedades

mecânicas quanto as propriedades biológicas dos modelos impressos

tridimensionalmente.

Figura 1 - A: Modelo 3D virtual dos corpos de prova dos respectivos scaffolds;

B: Scaffold de PHB produzido por SLS.

As micrografias de MEV referente à superfície dos scaffolds de PHB e

PHB/FB estão demonstradas na Figura 2. As micrografias de MEV da

superfície destes scaffolds revelaram que a fibroína recobre as partículas de

PHB e penetra nos poros intrínsecos do scaffolds preenchendo os, e

consequentemente diminuindo esta porosidade intrínseca, característica do

scaffold de PHB (Figura 2B). A presença de partículas intactas aderidas à

estrutura foi observada. Isto pode ser explicado pela interação destas

partículas à estrutura devido à pequena fusão promovida pelo calor gerado

durante o processo SLS14.

20 m

m

Poros: 700µmHaste: 700µm

A B

86

A formação do compósito de FB-HA no scaffold de PHB estão

demonstradas nas Figuras 2C e 2D. As micrografias de MEV desta amostra

revelaram cristais de HA recobrindo o filme de FB e grânulos de PHB de forma

heterogênea de ordem submicrométrica. Típicos cristais de apatita foram

observados de forma aglomerados. Estes aglomerados são compostos de

cristalitos de HA com morfologia tipo agulha ou globular, com tamanho médio

dos cristalitos de 202 nm ± 0,03 e 120 nm ± 0,04, respectivamente (Figura 2D).

Essa morfologia pode ser considerada característica da fase fosfato de

octacálcio (OCP) ou de fosfato de cálcio amorfo (ACP) ou carbonato-apatita22,

24, 49. Porém, nas respectivas amostras os cristais aparecem de forma mais

arredondada do que um cristal de OCP puro. Estes aspectos morfológicos

podem indicar que estes cristais de apatita estão fornecendo sítios para uma

nucleação secundária de formação de apatita adicional, formando assim

partículas interconectadas24.

Figura 2 - Micrografias de MEV de superfície dos scaffolds PHB, PHB/FB e

PHB/(FB-HA). A: scaffold de PHB; B: scaffold de PHB/FB e C-D: scaffold de

PHB/(FB-HA).

A B

C D

87

A substituição dos íons PO43- por íons CO3

2- no processo de deposição

resulta na diminuição do tamanho do cristal e também altera a morfologia do

cristal, de forma de agulha para “rods”. Nesta amostra PHB/(FB-HA) a

morfologia dos cristais observados correspondem tanto para um OCP quanto

para uma carbonato-apatita22, 24, 49.

Estudos prévios têm constatado que grupos funcionais, tais como,

hidroxilas, fosfatos e carboxílicos propiciam a nucleação de fases de apatitas21,

49, 72. Materiais com repetitivos padrões de grupos aniônicos e concentrados

catiônicos promovem a orientação de nucleação de cristais in vivo21. Desta

forma, a estrutura molecular da fibroína e do PHB pode ter contribuído para

deposição dos cristais de apatita. Os grupos hidroxilas promovem a ligação dos

cátions Ca2+ livres da solução de CaCl2, formando ligações coordenadas, e

assim os íons PO43- ligam-se ao cálcio formando o núcleo inicial para formar as

fases precursoras de apatita23, 24. Desta forma, observou-se que a composição

da superfície e estrutura dos scaffolds afetam diretamente o processo de

formação da apatita. Além disso, observou-se que a maioria dos cristais

formados pode ser a fase OCP ou sua fase precursora.

A Figura 3 mostra as curvas das análises termogravimétricas para as

PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA). Os valores de temperatura de decomposição

(Tonset) dos scaffolds PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) foram 279, 279 e 234 °C,

respectivamente. As curvas TGA para as amostras de PHB em pó ou scaffold

sinterizado também revelaram apenas uma perda de massa, iniciando em torno

de 245 °C até 315 °C, Tonset em 279 °C. A porcentagem de massa residual

observada para as amostras foram 1 e 4%, respectivamente.

As curvas TGA para as amostras de PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA)

(Figura 3) mostram dois eventos de perda de massa. O primeiro evento

observado para as respectivas amostras PHB e PHB/FB ocorre entre 25 a 220

°C, devido a uma pequena perda de massa, em torno de 2%, relacionada à

perda de água superficial. Para a amostra PHB/(FB-HA) este primeiro evento

ocorre na faixa entre 25 a 175 °C, relacionado a uma perda de massa em torno

de 4%. O segundo evento de perda de massa para a amostra PHB/FB é

observado iniciando em torno de 245 °C até 315 °C, Tonset em 279 °C, perfil

similar ao do scaffold de PHB, ou seja, a incorporação de fibroína não alterou a

estabilidade térmica do scaffold de PHB. O conteúdo de massa residual

88

observada para as amostras de PHB e PHB/FB foi de 4 e 9%, respectivamente,

sugerindo que em torno de 5% de FB foi incorporada ao scaffold. Contudo, a

amostra PHB/(FB-HA) apresentou uma diminuição na estabilidade térmica

após a precipitação da fase inorgânica ao scaffold PHB/FB. A temperatura

Tonset mensurada foi de 234 °C, cujo segundo evento de perda de massa

observado para esta amostra foi na faixa de 190 a 265 °C.

Figura 3 - Curvas termogravimétricas para os scaffolds PHB e PHB/FB. A:

Comparação das curvas TGA para o PHB em pó e para o scaffold de PHB; B:

scaffolds PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA).

100 200 300 400 500 600

0

20

40

60

80

100

Per

da d

e m

assa

(%)

Temperatura (°C)

___ PHB em pó___ Scaffold de PHB

A

90 180 270 360 450 5400

20

40

60

80

100

Per

da d

e m

assa

(%)

Temperatura (oC)

___PHB___PHB/FB___PHB/(FB-HA)

B

A estabilidade térmica é um fator importante a ser investigado para o

processo de fabricação de scaffolds poliméricos e bioabsorvíveis,

principalmente para os processos de manufatura aditiva que empregam

elevadas temperaturas no processo de fabricação das peças 3D. Além disso,

89

outro fator importante é devido aos estudos de degradação e de cultura de

células que empregam uma temperatura constante aproximadamente 37 °C por

longos períodos. No entanto, durante o processamento ou manipulação do

material a quente, a degradação térmica pode gerar moléculas menores, bem

como produtos e subprodutos de degradação que podem interferir na

composição química do material e alterar a sua citotoxicidade e

biocompatibilidade6.

As curvas de DSC para as amostras PHB, PHB/FB, PHB/(FB-HA) estão

apresentadas na Figura 6. Estas curvas revelaram 2 eventos endotérmicos, os

quais se referem ao de ponto de fusão e à decomposição do polímero (Figura

4). O primeiro evento relacionado ao ponto de fusão ocorre em torno de 173

°C para as 3 amostras. O segundo evento endotérmico relacionado à

decomposição polimérica ocorre em 296, 292 e 257 °C, respectivamente para

as amostras de PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA). A incorporação de fibroína e

fase inorgânica ao scaffold de PHB não altera o seu ponto de fusão, porém

diminui ligeiramente a temperatura de decomposição do polímero para a

amostra PHB/FB e reduz acentuadamente para a amostra PHB/(FB-HA). A

Tabela 1 resume as propriedades térmicas e o grau de cristalinidade obtidos

destas amostras.

Figura 4 - Curvas de DSC para os scaffolds PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA).

0 50 100 150 200 250 300 350

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

Flux

o de

cal

or (m

W/m

g)

Temperatura (°C)

___PHB___PHB/FB___PHB/(FB-HA)

endo

90

Os resultados mostram que não houve uma variação significativa nas

temperaturas de transições bem como no grau de cristalinidade entre o PHB

em pó e o scaffold de PHB impresso. Estes resultados sugerem que o PHB não

degrada durante o processo de impressão por SLS, cujos resultados obtidos

corroboram com os dados da literatura53.

Tabela 1 - Propriedades térmicas e grau de cristalinidade das amostras PHB

em pó e dos scaffolds de PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA).

Propriedades térmicas e grau de cristalinidade

PHB pó PHB PHB/FB PHB/

(FB-HA) Ponto de fusão, °C (Tf) 176.4 173.9 173.5 173.1

Temperatura de cristalização, °C (Tc) 116.6 111.9 104.4 97.2

Entalpia de fusão, J/g (ΔHf) 64.7 66.5 47.1 53.3

Grau de cristalinidade, % (Xc) 44.35 45.6 32.3 36.5

No entanto, estes resultados confirmam que a incorporação da apatita

ao PHB/FB altera a estabilidade térmica do PHB diminuindo a temperatura de

decomposição, como visto na curva TGA. Este comportamento pode estar

associado com a quebra de ligações de hidrogênio intermoleculares e com a

redução da cristalinidade do PHB pela incorporação da fibroína associada à

precipitação da apatita como observado na Tabela 1. Adicionalmente, a

incorporação de fibroína e apatita também promovem a redução da

temperatura de cristalização do PHB, cuja redução pode estar sendo afetada

pelo rompimento de forças intermoleculares10.

De acordo com a literatura, geralmente a estabilidade térmica é

aumentada com a adição de uma fase mineral à fase orgânica, e esse

comportamento pode ser analisado em função da temperatura de

decomposição, a qual caracteriza a estabilidade térmica dos materiais66. No

entanto, para amostra contendo apatita foi observado um efeito inverso, devido

a uma diminuição na cristalinidade da amostra e consequentemente uma

diminuição nos valores da temperatura de decomposição19.

91

Os dados de RMN-MAS do 31P do compósito PHB/(FB-HA) elucidaram

os tipos de fases de apatita foi precipitado no respectivo compósito. A Figura 5

mostra o espectro de RMN-MAS do 31P obtido para a amostra PHB/(FB-HA), o

qual se observou a presença de dois picos largos assimétricos indicando a

formação de mais de uma fase cristalina e com baixa cristalinidade e com

deposição da fase inorgânica de forma heterogênea como observado na MEV.

A partir dos dados obtidos da deconvolução observamos a presença de quatro

(4) sítios de fósforo, os quais são categorizados dentro de dois grupos PO43- e

HPO42- 67.

O primeiro sítio, centrado em 1,27 ppm (14,86%) pode ser atribuído a

fase fosfato de dicálcio dihidratado (DCPD-brushita)36, o segundo sítio em 3,63

ppm (12,03%) pode ser atribuído aos grupos fosfato do fosfato de octacálcio

(OCP), pois um OCP impuro ou amorfo revela um sinal em 3,4±0,3 ppm57.

Adicionalmente, o pico observado em 7,27 ppm (42,82%) também pode ser

atribuído a fase de OCP, devido ao tempo de contato usado em 1ms pode

promover um deslocamento químico desta fase nesta região57.

Figura 5 - Espectro do 31P-MAS da amostra PHB/(FB-HA), obtido @14kHz.

12 10 8 6 4 2 0 -2 -4

G (31P)/ppm

Os cristais de fosfato de cálcio presentes tanto no OCP quanto na

brushita são semelhantes estruturalmente, e há especulações que a formação

de uma mistura intra-cristalina de OCP e brushita pode ocorrer pela

1.26

3.63

5.22 7,27

92

precipitação direta ou pela hidrólise do OCP. As reações de hidrólises dos íons

PO43- e HPO4

2- são o ponto chave para reação química da fase OCP para

HA67.

Além disso, a presença de fibroína pode favorecer a transformação de

OCP em HA, ou então, pode mudar a cinética da reação e ocorrer o processo

de precipitação de fase OCP pela presença de aminoácidos aniônicos68. Outras

hipóteses estudadas, na literatura, são que tanto resíduos de aminoácidos

ácidos quanto básicos são igualmente importantes na interação com os

componentes catiônicos ou aniônicos, respectivamente, da fase inorgânica do

tecido ósseo18. Essas hipóteses podem justificar a presença de OCP neste

compósito.

O pico observado em 5,22 ppm (30,29%) pode ser atribuído a fase β-

fosfato de tricálcio (β-TCP), de acordo com dados da literatura espectros de

RMN-MAS de 31P para β-TCP contêm múltiplos picos numa faixa de 0 a 6 ppm,

revelando um pico característico em 4,8 ppm36, 51, 69.

Estes resultados podem confirmar as hipóteses estudadas previamente

que mostraram que o OCP é a fase precursora tanto de apatita biológica

quanto de hidroxipatitas (HA) sintéticas4, 7, 9. Esta transição de fases se dá

primeiro pela precipitação de fosfato de cálcio amorfo (ACP) e posteriormente

se transforma em OCP, cuja fase é subsequentemente hidrolisada em apatita.

As fases de ACP também podem servir como intermediárias durante o

envelhecimento do fosfato de cálcio precipitado em temperatura ambiente,

levando a formação de nanocristais de β-TCP ou correspondente do OCP

amorfo13.

Os resultados de resistência à compressão e módulo de elasticidade dos

scaffolds PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) estão representados na Tabela 2. Os

valores mensurados para estes scaffolds foram 0,73±0,05, 0,86±0,03 e

0,66±0,06 MPa, respectivamente, antes da imersão em solução de SBF. Estes

resultados mostram que incorporação da fibroína ao scaffold de PHB, formando

o compósito PHB/FB foi eficiente, promovendo um aumento de 18% da

resistência à compressão em relação ao scaffold de PHB somente e aumento

consideravelmente o módulo de elasticidade (Tabela 2). Adicionalmente, a

incorporação de apatita ao scaffold PHB/FB promoveu uma redução na

resistência à compressão de 23% em relação a esta mesma amostra sem

93

precipitação de apatita e, de 10% comparando ao scaffold PHB. Esta

diminuição da resistência mecânica era esperada, visto que a incorporação de

biocerâmica aos polímeros promove uma diminuição da resistência mecânica,

devido a estas fases inorgânicas apresentarem baixo módulo de elasticidade12,

38.

No entanto, quando estas amostras foram imersas em solução de SBF,

todas apresentaram uma redução na resistência à compressão, minimizando

as diferenças entre as mesmas. Porém, é importante salientar que todos os

valores mensurados tanto para tensão à compressão quanto para o módulo de

elasticidade para corpos de prova, PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA), antes e após

imersão não apresentaram diferença estatisticamente significante entre eles,

pelos testes estatísticos realizados (p>0,05) (Tabela 2).

Tabela 2 - Valores mensurados para tensão à compressão e módulo de

elasticidade para as amostras PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) antes e após

imersão em solução de SBF.

Tensão à

compressão (MPa)

Módulo de Elasticidade

(MPa)

PHB 0,73±0,05 4,98±0,37

PHBim 0,51±0,01 3,50±0,11

PHB/FB 0,86±0,03 7,74±0,59

PHB/FBim 0,42±0,04 3,87±0,25

PHB(FB-HA) 0,66±0,06 7,13±0,85

PHB(FB-HA)im 0,44±0,03 3,96±0,21 im: após imersão em SBF por 30 min. Sem diferenças estatísticas (p<0,05).

Comparações inter grupos: Kruskal-Wallis com pós-teste Dunn; Comparações intra-

grupos; Mann-Whitey.

Apesar dos resultados obtidos para resistência à compressão serem

muito aquém quando comparados ao osso trabecular humano (~10 MPa)40,

esses valores foram superiores quando comparado aos dados da literatura em

relação a outros tipos de scaffolds impressos pela técnica SLS. Duan et al.14

em 2011, desenvolveram scaffolds de Ca-P/PHBV e de PHBV por meio da

técnica SLS com modelos de dimensões de 1 mm de tamanho de poros e de

94

0,5 mm de haste, onde obtiveram valores para resistência a compressão

0,24±0,02 e 0,19±0,02 MPa, respectivamente.

Os valores de resistência à compressão dos scaffolds confeccionados

pela técnica SLS são influenciados pela geometria do modelo 3D, ou seja,

espessura de haste, tamanho dos poros e porcentagem de porosidade

intrínseca (arquitetura/estrutura do scaffold). Desta forma, observa-se que a

forma do modelo gerado para os corpos de prova, espessura de haste e

tamanho dos poros de 0,7 mm, deste estudo permitiu desenvolver scaffolds

com uma resistência mecânica superior comparada com dados da literatura, os

quais desenvolveram scaffolds com haste menos espessas de 0,5 mm e com

os poros maiores de 0,8 mm a 1 mm14, 17.

As dimensões dos scaffolds deste estudo basearam-se na limitação da

técnica por SLS. Esta técnica tem limites para aumentar o tamanho da haste e

reduzir o tamanho dos poros, pois esta relação haste/poros influencia

diretamente na formação de somente porosidade intrínseca, sem poros

maiores interconectados nos scaffolds. Além disso, o tamanho do poro deve

ser suficiente para promover a migração de células osteoblásticas, neste caso,

no mínimo de 300 µm26.

Desta forma, os scaffolds sinterizados neste estudo, com as respectivas

propriedades mecânicas poderão ser potencialmente usados para regeneração

de osso cortical e esponjoso em áreas com baixa incidência de carga, como

reconstrução de calvária ou em áreas com alta incidência de carga, neste caso

somente sem a função de suporte de carga, tais como defeitos ósseos críticos

no fêmur; ou ainda, região da coluna vertebral, pois dependendo da

microestrutura do osso trabecular a resistência mecânica deste tipo de osso

possui um limite de resistência à compressão entre 0,32 a 2,25 MPa48.

A avaliação se a modificação dos scaffolds de PHB tanto com fibroína

quanto fibroína/apatita alterou o caráter hidrofóbico dos scaffolds de PHB foi

realizada pelo experimento de taxa de intumescimento. Esta é uma

propriedade fundamental a ser estudada quando se objetiva desenvolver

materiais a serem empregados para engenharia tecidual/ medicina

regenerativa, pois superfícies ou materiais com hidrofilicidade intermediária

favorecem a absorção de fluídos biológicos e a adesão e espraiamento

celular58.

95

Os resultados de porcentagem de água absorvida para as amostras

PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) estão representados na Figura 6. Após de 24 h,

a taxa de intumescimento mensurado para as amostras PHB, PHB/FB e

PHB/(FB-HA) foi 203±9%, 195±6,3% e 185±2,4%, respectivamente. Os

resultados mostraram que a incorporação de fibroína e de apatita aos scaffolds

de PHB alterou o caráter hidrofóbico do polímero, favorecendo uma maior taxa

de absorção de água nas primeiras 2 h de experimento em relação os scaffolds

de PHB. A porcentagem de intumescimento para as amostras modificadas

aumentou consideravelmente, cujos valores mensurados nos primeiros 30 min

para as amostras PHB/FB e PHB/(FB-HA) foram de 209 e 182%,

respectivamente, sendo que para os scaffolds de PHB foi mensurado um valor

de 100% em relação ao seu peso seco neste mesmo período. A redução da

hidrofobicidade do polímero PHB, nos scaffolds com modificação da superfície

por fibroína ou fibroína/apatita, pode ser aferido pelo aumento de cargas

relacionadas aos grupos aminos livres e carboxílicos da fibroína e dos grupos

hidroxilas da apatita na amostra PHB/(FB-HA). Adicionalmente, observou-se

que a amostra PHB/(FB-HA) atingiu seu máximo de absorção de água em 30

min mantendo-se com algumas variações ao longo da medida, porém após 24

h apresentou a mesma porcentagem de intumescimento.

96

Figura 6 - A: Curvas de taxa de intumescimento PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA)

durante um período de 24 h. B: Porcentagem de intumescimento dos scaffolds

em 24 h representado em gráfico de colunas. Barras verticais mostram desvio

padrão.

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

A

bsor

ção

de á

gua

(%)

Tempo (min)

PHB PHB/FB PHB/(FB-HA)

A

PHB PHB/FB PHB/(FB-HA)0

50

100

150

200

250

Intu

mes

cim

ento

(%)

B

A porosidade aberta mensurada para os scaffolds PHB, PHB/FB e

PHB/(FB-HA) foi de 55,8±0,7%, 48,9±6.2% e 54,7±1.1%, cujo valor aumentou

em relação ao valor teórico determinado pelo programa Magics®18.2 de 40,7%

para o scaffold PHB. Os valores mensurados para os scaffolds modificados

com FB revelam que a fibroína diminui a porosidade pela sua deposição em

forma de filme como observado nas imagens de MEV, porém apresentam um

97

desvio padrão elevado revelando que há uma deposição fibroína não

homogênea. No entanto, os valores obtidos para os scaffolds PHB/(FB-HA)

revelam que a porosidade dos scaffolds aumentam em relação ao scaffold

PHB/FB devido a presença dos cristais de apatita e possível reorganização do

filme de fibroína na estrutura dos scaffolds.

Os valores de porosidade obtidos na literatura empregando a técnica

SLS e como matéria prima poli(hidroxibutirato-co-valerato) (PHBV) (64,6±2,0%;

porosidade teórica 53%) ou Ca-P/PHBV (62,6±1,2%) ou PLLA (69,5±1,3%),

estão acima dos valores obtidos neste trabalho. Esta diferença na porosidade

encontrada pode ser sugerida ao desenho do scaffold projetado, uma vez que

a proporção entre a porosidade do scaffold impresso e a porosidade teórica

aumentou similarmente aos dados encontrados na literatura15-17.

A bioatividade das superfícies de materiais aloplásticos é um importante

fator a ser determinado, principalmente quando estes materiais são

desenvolvidos para reparação/reconstrução de tecido ósseo. Pois, a reação

natural do organismo frente a um corpo estranho, no caso material implantado,

é de encapsulá-lo por tecido conjuntivo fibroso. Entretanto, quando estes

materiais são bioativos esta cápsula de tecido conjuntivo fibroso não se forma75

Materiais bioativos são materiais a base de biocerâmicas, como por

exemplo, cerâmicas a base de fosfato de cálcio (hidroxiapatita, β-fosfato

tricálcico, entre outros), vitro-cerâmicas e vidros bioativos, os quais são

capazes de se ligarem ao tecido ósseo por meio de uma camada de apatita

formada na interface do material e tecido adjacente ao implante. Esta formação

de apatita in vivo na interface material/tecido inicialmente ocorre por reações

iônicas principalmente entre íons Ca2+ e PO presentes tanto na superfície

dos materiais quanto no plasma sanguíneo31; concomitante a formação desta

camada de apatita, os osteoblastos regulam a expressão gênica das proteínas

da matriz óssea neoformada (matriz osteóide) na interface material/tecido,

promovendo um equilíbrio dinâmico de trocas iônicas principalmente de íons

Ca2+ e PO-, iniciando uma nucleação secundária dos cristais de apatita

tanto na interface material/tecido quanto na matriz osteóide3.

Para determinar a bioatividade in vitro de superfícies de materiais

aloplásticos bioativos usualmente é empregada a solução de SBF, cuja

concentração iônica desta solução é próxima ou igual ao plasma sanguíneo

98

humano 30. Adicionalmente, esta solução foi padronizada pela International Organization for Standardization (ISO) para avaliação da habilidade de

precipitação de apatita em materiais implantáveis25, 30.

Nas imagens de MEV das amostras PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) pôde-

se observar que somente após 21 dias de imersão em SBF foi possível

observar a formação de cristais de apatita sobre as superfícies dos scaffolds

PHB e PHB/FB e de nucleação secundária mais efetiva dos cristais de apatita

da amostra PHB/(FB-HA) (Figura 7). De acordo com as imagens de MEV

observadas para as superfícies das amostras, PHB, PHB/FB, PHB/(FB-HA),

sugere-se que os materiais possuem bioatividade após 21 e 28 dias de

avaliação na seguinte ordem: PHB/FB<PHB<PHB/(FB-HA) (Figura 7).

A superfície da amostra PHB/(FB-HA) mostrou-se ser mais bioativa em

relação as outras amostras, PHB e PHB/FB. Este resultado era esperado

devido ao fato da amostra conter os precursores, como DPCD, OCP e β-TCP,

necessários para nucleação secundária de fases de apatita, como confirmado

por MEV e RMN do núcleo 31P. Desta forma, a camada de apatita precipitada

na superfície do scaffold PHB/(FB-HA) revelou cristais com uma morfologia de

agregados globulares formado microestruturalmente por nanocristais lamelares

apresentando certa porosidade (Figura 7E); estrutura similar a observada para

scaffolds a base de CDHA/OCP/β-TCP após 14 dias de imersão em SBF47.

Com o aumento tempo de imersão (28 dias), as lamelas cresceram em

tamanho e uma nova formação de cristais, em forma de agulhas aglomeradas

em pequenas esferas, foi observada sobre estas lamelas (Figura 7F). Estas

imagens revelam a transformação in vitro tanto das fases precursoras de HA

(DPCD e OCP) do scaffold quanto da camada de apatita precipitada em HA ou

em CDHA47, 65.

O scaffold de PHB, apesar de não ser um material bioativo, após 21 dias

de imersão em SBF apresentaram capacidade de promover a precipitação de

uma camada de apatita sobre a superfície do polímero. No entanto, esta

camada de apatita apresentou morfologias heterogêneas desde bastonetes a

grânulos esféricos sem porosidade em sua microestrutura (Figura 7A). Após 28

dias, em algumas regiões pôde-se observar o crescimento desses cristais em

formas agulha ou lamelares, morfologia típica para cristais de HA (Figura 7B).

Contudo, o scaffold PHB/FB não apresentou deposição de apatita após 21 dias

99

de experimento. Somente após 28 dias, grânulos esféricos de ordem

nanométrica (90±10 nm) precipitados homogeneamente foram observados

sobre a superfície do scaffold (Figuras 7C e 7D).

Figura 7 - Imagens de MEV para bioatividade superficial in vitro após 21 e 28

dias. Imagens de 21 dias: A. PHB; C.PHB/FB; e E. PHB/(FB-HA); imagens de

28 dias: B. PHB; D. PHB/FB; e F. PHB/(FB-HA).

3.2 Determinação da liberação do peptídeo OGP-CF dos scaffolds Embora, a concentração máxima de peptídeo adsorvida nos scaffolds

não tem sido determinada, foi possível observar o comportamento das curvas

A

C

E

B

D

F

100

de liberação e estimar a concentração necessária a ser incorporado nos

scaffolds para uma liberação mais eficaz e controlada.

A liberação do peptídeo OGP-CF dos scaffolds PHB, PHB/FB e

PHB/(FB-HA) está mostrada na Figura 8. O perfil de liberação observado pode

ser atribuído ao intumescimento dos respectivos scaffolds, ou seja, pela difusão

do meio aquoso pela rede do scaffold e consequentemente relaxamento das

cadeias. Estes resultados podem ser comprovados, pois não houve liberação

nos primeiros 30 min de ensaio ou a liberação começou a acontecer após os

primeiros 30 min paras todas as amostras, menos o scaffold PHB/(FB-HA). A

funcionalização FB-HA pode estar funcionando como uma barreira para que o

peptídeo não adsorvesse nos poros mais internos da rede polimérica, ficando

mais a superfície e liberado mais rapidamente.

Para os scaffolds de PHB, o peptídeo foi liberado de forma crescente de

maneira linear até 24 h, cuja liberação foi constante após este período. Nos

scaffolds PHB/(FB-HA) a liberação foi mais intensa nos primeiros 300 min e

isso pode estar associado a interação superficial da moléculas de fibroína e

apatita. Após esse período a taxa de liberação é menor, cuja taxa de liberação

é dependente da difusão do meio aquoso pela rede do polímero e ficando

constante após 48 h. Entretanto, o perfil de liberação observado para o scaffold PHB/FB sugere que o recobrimento com FB promove uma liberação mais

prolongada do peptídeo acima de 72 h chegando numa constante após 5 dias

de ensaio.

Esse comportamento é típico de um sistema de liberação controlada

podendo a liberação inicial, mais acelerada, ser explicada pelo fato do

intumescimento do scaffold favorecer a liberação de uma fração do OGP-CF

que interage mais superficialmente com o polímero por interações mais fracas,

ou então, pela ligeira solubilidade do peptídeo, que faz as moléculas mais

superficiais sejam rapidamente liberadas28, 62. O comportamento inicial seguido

por uma liberação lenta corresponde às moléculas do peptídeo que interagem

mais fortemente à estrutura do polímero ou que estão incorporados dentro dos

poros intrínsecos da estrutura 3D, proporcionando um efeito prolongado à

liberação28, 34.

Este perfil da curva de liberação mostra que a incorporação do OGP-CF

livre ao scaffold de PHB foi mais eficaz com relação à membrana de CB

101

observado em estudo prévio60, e similar, quando o peptídeo OGP-CF foi

incorporado a nanopartículas de sílica mesoporosas 44.

Saska et al.60 demonstraram que mesmo uma concentração menor de

peptídeo livre incorporado à celulose bacteriana, no valor de 10-6 mol.L-1, pela

mesma metodologia aqui descrita, foi capaz de desenvolver uma ação

osteoindutiva considerável in vitro. Isso mostra que o aumento da concentração

de OGP carreado pelos sistemas de liberação e o prolongamento da sua

liberação decorrente desses sistemas pode aumentar ainda mais a capacidade

osteoindutiva tanto in vitro quanto in vivo, levando a avanços benéficos na

terapia de regeneração óssea.

Figura 8 - Perfil de liberação cumulativa do OGP-CF a partir dos scaffolds de

PHB, PHB/FB e PHB/(PHB-HA).

0 2000 4000 6000 8000 100000.0

2.0x10-6

4.0x10-6

6.0x10-6

8.0x10-6

1.0x10-5

1.2x10-5

Libe

raça

o A

cum

ulat

iva

- OG

P (g

)

Tempo (min)

0 100 200 300 400 500 6000.00

2.50x10-6

5.00x10-6

7.50x10-6

1.00x10-5

PHB PHB-FB PHB-HA

3.3 Estudo in vitro Nas fases iniciais de desenvolvimento dos materiais, a avaliação da

resposta celular aos mesmos é de suma importância. Na avaliação da

morfologia celular, aos 3 dias pode-se observar na MEV um espraiamento

celular em todos os materiais avaliados (Figura 9). Rajaraman et al.54, em

1974, dividiu os estágios de adesão e proliferação em quatro: 1. Adesão das

células no ponto de contato com o substrato - células arredondadas; 2.

102

Crescimento centrífugo das filopodias - células arredondadas com filopodias; 3.

Cinto citoplasmático - células em início de expansão lateral do citoplasma; e 4.

Achatamento da massa central - células bem planas com aumento na

espessura das filopodias. Avaliando a morfologia das células em cada material

baseando-se nesses estágios, observam-se células nos estágios 3 e 4

principalmente nos scaffolds de PHB (Figura 9A) e PHB/FB-OGP (Figura 9C), e

no estágio 3 nos scaffolds de PHB/FB (Figura 9B) e PHB/(FB-HA)-OGP (Figura

9D). Esse resultado sugere um estágio de diferenciação morfológica mais

avançada para as células nos grupos PHB e PHB/FB-OGP.

Figura 9 - MEV dos scaffolds de PHB (A); PHB/FB (B); PHB/FB-OGP(C); e

PHB/(FB-HA)-OGP. Aumento de 500×. Setas brancas = filopodias; Setas

amarelas = espraiamento linear das células.

A B

D C

103

Ao se avaliar materiais para regeneração de tecido ósseo in vitro, é

necessário que as células ósseas ou progenitoras adiram e se proliferem sobre

o material para que ele possa exercer a função de osteocondução ou

osteoindução. No caso específico das células ósseas as características de

rugosidade do material, são de suma importância para que isso ocorra26.

A técnica de produção de scaffolds de PHB por SLS conferiu rugosidade

ao material, o que proporcionou a proliferação das células RBMSC (Capítulo 1).

Com adição da fibroína, apesar da mesma se apresentar microscopicamente

como um revestimento das estruturas de PHB (Figura 2B), essa característica

não interferiu na proliferação celular sobre os scaffolds.

Avaliando a proliferação celular, pode-se observar para todos os grupos

uma proliferação crescente ao longo dos períodos, o que demonstra a

capacidade do material em permitir o crescimento celular, ou seja, o material

não se apresentou citotóxico (Figura 10). Com esse resultado pode-se concluir

que a adição da fibroína aos scaffolds permitiu um aumento na resistência

mecânica sem prejudicar a resposta biológica aos mesmos, já que os

resultados de proliferação obtidos foram semelhantes ao grupo dos scaffolds

de PHB puro. É claro na literatura que a fibroína da seda, desde que

corretamente isolada, é biologicamente compatível1. Diversos estudos tem

avaliado a aplicação da fibroína na fabricação de scaffolds para regeneração

tecidual1, 2, 71, 73, inclusive para aplicação em regeneração óssea46, 74. A adição

de apatitas e do OGP as amostras pareceu não interferir na proliferação

celular.

104

Figura 10 - Avaliação do efeito de adição de fibroína da seda (FB), apatitas

(HA) e peptídeo de crescimento osteogênico (OGP), associados a scaffolds de

poli (3-hidroxibutirato) na proliferação celular, por percentual de redução do

reagente alamarBlue nos períodos de 3, 9, 15, 18 e 21 dias. *p<0,05 Kruskall-

Wallis pós-teste Dunn.

alamarBlue

0

20

40

60

80

1003 dias9 dias15 dias18 dias21 dias

PHB PHBFB

PHBFB

OGP

PHBFBHA

OGP

**

*p<0,05

**

% re

duçã

o

Para avaliar o potencial em acelerar a precipitação de cálcio sobre os

scaffolds in vitro das modificações propostas aos scaffolds de PHB, com

fibroína, apatitas e OGP, utilizou-se a metodologia indireta de quantificação de

cálcio do sobrenadante das células em cultura sobre os scaffolds. As células

RBMSC cultivadas sobre esses scaffolds, quando diferenciadas em

osteoblastos, tem a capacidade de formar matrizes minerais in vitro com a

utilização do cálcio presente no meio de cultura. Além disso, a própria

composição química dos materiais avaliados, como por exemplo, do grupo das

apatitas, podem liberar ou captar cálcio do meio através de reações químicas20.

Nesta análise considerou-se que, quanto menor a quantidade de cálcio

no sobrenadante, maior a precipitação sobre as amostras. Como observado na

Figura 11, o grupo PHB/FB teve uma diminuição da quantidade de cálcio no

sobrenadante ao longo dos períodos avaliados, o que sugere uma precipitação

de cálcio aumentando gradativamente sobre as amostras. Esse aumento pode

ser atribuído a um possível aumento na diferenciação celular neste grupo,

105

porém essa hipótese deve ser confirmada em estudos complementares de

avaliação de outros marcadores de mineralização óssea.

Figura 11 - Quantificação de cálcio no sobrenadante do meio de cultura, nos

diferentes grupos, nos períodos de 3, 9, 15 e 18 dias. Controle positivo: Células

cultivadas no plástico; Controle negativo (C-): meio de cultura em contato com

os materiais. Resultados de concentração normalizados pelos resultados dos

controles negativos. *p<0,05 Kruskall-Wallis pós-teste Dunn.

Quantificação de Cálcio

0.0

0.5

1.0

1.5

15 dias18 dias

3 dias9 dias

PHB PHBFB

PHBFB

OGP

PHBFBHA

OGP

C+

*

*

*p<0,05

C-Fold

cha

nge

Além disso, pode-se observar que, mesmo com o cálcio presente na

composição das amostras de HA, o mesmo não foi encontrado diluído no

sobrenadante desse grupo. Ao contrário, a presença dele nas amostras parece

ter estimulado a precipitação sobre as amostras, já que para esse grupo um

resultado menor de quantificação foi observado comparado ao grupo PHB aos

3 dias (p=0,0439). Esse resultado é compatível com o da avaliação de

bioatividade, na qual verificou-se que esta superfície foi mais bioativa que as

demais.

Os resultados in vitro demonstram a possibilidade de utilização para

regeneração óssea dos scaffolds estudados. Mais estudos precisam ser

realizados visando confirmar esses resultados in vitro e entender melhor o

mecanismo de atuação desses materiais.

106

4 Conclusão

O processo de manufatura aditiva empregado neste estudo, SLS,

permitiu desenvolver scaffolds de PHB com uma arquitetura e tamanho de

poros controlados, muito próximos ao modelo virtual projetado. Os scaffolds 3D

de PHB sinterizados e após a funcionalização com fibroína e apatita revelaram

uma porosidade intrínseca com poros interconectados. Além disso, os scaffolds

funcionalizados apresentaram-se mais hidrofílicos em relação ao PHB, cujas

características são primordiais para a adesão e proliferação celular. As

propriedades térmicas do PHB não se alteraram com os parâmetros

empregados durante o processo de impressão por SLS e nem pela

incorporação de fibroína ao scaffold de PHB. No entanto, a incorporação de

apatita altera a estabilidade térmica do PHB diminuindo a sua temperatura de

decomposição. A metodologia usada para incorporação in situ da apatita

proporcionou a precipitação das fases DCPD, OCP e β-TCP nos scaffolds.

Além disso, os scaffolds PHB/(FB-HA) mostraram-se ser mais bioativos

em relação as outras amostras, PHB e PHB/FB. Esta maior bioatividade para o

scaffold PHB/(FB-HA) era esperada devido ao fato da amostra conter os

precursores de hidroxiapatita, como DPCD, OCP e β-TCP. Os ensaios de

resistência à compressão mostraram que os scaffolds sinterizados neste

estudo poderão ser usados para regeneração de osso cortical e esponjoso em

áreas com baixa incidência de carga. O perfil de liberação do peptídeo OGP

dos respectivos scaffolds, PHB, PHB/FB e PHB/(FB-HA) foi de modo

controlado, o que indica que estes scaffolds impressos e modificados pós-

processamento são estruturas em potencial para serem empregadas em

liberação de drogas.

Nos ensaios in vitro observou-se uma boa proliferação celular sobre os

diferentes scaffolds com uma aparente diferenciação morfológica mais

avançada para os scaffolds de PHB e PHB/FB-OGP no período de 3 dias. A

adição de apatitas aos scaffolds aumentou o acúmulo de cálcio na superfície

dos scaffolds, principalmente em 3 dias (p<0,05) corroborando aos resultados

de bioatividade para este scaffold. Entretanto, a incorporação do OGP não

favoreceu uma maior proliferação celular, porém outros ensaios in vitro são

necessários para avaliar o efeito deste peptídeo nos scaffolds. Contudo,os

107

resultados mostraram que os scaffolds de PHB e associado a FB e apatitas

tem um potencial para aplicação em regeneração óssea.

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Elsevier; 2014. p. 441-73.

114

capítulo 3

Artigo apresentado nas normas da Faculdade de Odontologia de Araraquara

115

Resposta in vivo a matrizes tridimensionais de poli(3-hidroxibutirato) produzidas por sinterização seletiva a laser e modificadas por fibroína, apatitas e/ou peptídeo de crescimento osteogênico Luana C. Pires, Mario H. A. Verzola, Ana Paula de S. Faloni, Mariana A. Cominotte,

Silvana R. P. Orrico, Marcelo F. de Oliveira, Izaque A. Maia, Jorge Vicente L. da Silva,

Sidney J. L. Ribeiro, Sybele S. Saska, Joni A. Cirelli

Resumo A impressão tridimensional (3DP) vem ganhando espaço na produção

de matrizes tridimensionais (scaffolds) para regeneração óssea. Dentre as

técnicas utilizadas, está a sinterização seletiva a laser (SLS), capaz de produzir

scaffolds de formas complexas, com alto controle de porosidade e tamanho dos

poros. O objetivo desse estudo foi avaliar o potencial regenerador ósseo in vivo

de scaffolds produzidos por 3DP via SLS a base de poli(3-hidroxibutirato)

(PHB) e associado á fibroína da seda (FB), apatitas (HA) e/ou peptídeo de

crescimento osteogênico (OGP). Foram utilizados para avaliação defeitos de

11mm de diâmetro em calota de coelhos. O processo de formação óssea foi

avaliado por microtomografia computadorizada (µCT), análises morfológica e

imuno-histoquímica, em 15 e 60 dias e, a expressão de genes relacionados a

osteogênese por PCR tempo real em 7, 15 e 30 dias. Os resultados de µCT

demonstraram um percentual de volume ósseo semelhante entre os grupos

experimentais e o grupo controle coágulo. Na análise histológica um infiltrado

inflamatório de leve a moderado foi descrito para os grupos experimentais, com

ausência de formação óssea de contato. Entretanto, o material foi eficiente em

manter o volume da área do defeito. Na ánalise de imuno-histoquímica não se

verificou diferença expressiva na imuno-marcação de colágeno tipo 1a1 e

osteocalcina nos grupos experimentais. Resultado semelhante obteve-se na

análise de expressão gênica dos genes osterix, colágeno 1a1, fosfatase

alcalina e osteocalcina. Os scaffolds avaliados nesse estudo falharam em

estimular a osteogênese de contato, entretanto mantiveram a espessura do

defeito. Avaliações em longo prazo são necessárias para observar a total

degradação do material e o caminho de resolução na cicatrização do defeito.

116

Palavras-chave: impressão tridimensional, regeneração óssea, sinterização

seletiva a laser, poli(3-hidroxibutirato), fibroína, apatitas, in vivo.

1 Introdução

A capacidade do tecido ósseo de se auto-reparar ou regenerar é

bastante conhecida e envolve uma série de eventos complexos nos quais

diferentes células, proteínas e fatores sistêmicos, locais e ambientais

participam24. Entretanto, o organismo é incapaz de recuperar defeitos ósseos

extensos17 e, em grande parte destes casos, uma intervenção externa é

necessária para recuperação do tecido perdido6. Entre as diferentes opções de

tratamento estão os enxertos autógenos, alógenos e xenógenos, e a

engenharia tecidual óssea. Os bons resultados da engenharia de tecidos tem

permitido que essa especialidade ganhe espaço nessa área, já que evita os

transtornos e limitações das outras opções de tratamento6.

As matrizes tridimensionais (scaffolds) tem um envolvimento significativo

na regeneração tecidual óssea, pois, podem preservar o volume tecidual na

área a ser reparada, prover uma função mecânica temporária e, liberar

biofatores que favoreçam a formação óssea16. Além disso, é necessário que o

scaffold sirva como base para a migração e a adesão celular e permita a

neovascularização16. Especificamente em regeneração tecidual óssea,

algumas características como porosidade e tamanho de poros, são essenciais

nos scaffolds para permitir que isso ocorra18.

As técnicas de impressão tridimensional de scaffolds, principalmente as

que utilizam pó como matéria prima, permitem a confecção de matrizes com

alto grau de porosidade e alto controle na geometria dos poros26. Dentre essas

técnicas encontra-se a sinterização seletiva a laser (SLS - selective laser sintering) que utiliza um laser de CO2 para sinterizar um material em pó e

transformá-lo em uma forma física baseada em um modelo virtual pré-

confeccionado26. Essa técnica permite a construção de modelos virtuais

complexos que se encaixem perfeitamente ao local de implantação25.

117

Dentre os materiais disponíveis para utilização na técnica de SLS

encontra-se o poli (3-hidroxibutirato), um polímero membro na família dos

polihidroxialcatanos com alto potencial para aplicação como material

biodegradável para implantação12. O PHB é produto da fermentação de

algumas bactérias como a Ralstonia Eutropha, é biocompatível e reabsorvível,

permitindoinúmeras aplicações médicas15, como na regeneração óssea de

defeitos críticos7, 14, 21.

A produção de scaffolds à base de PHB pela técnica de SLS vem sendo

desenvolvida25, 26. Algumas modificações nesses scaffolds visando a aplicação

em regeneração óssea têm sido propostas por nosso grupo de estudo,

buscando a melhoria mecânica e biológica dessas matrizes (capítulos 1 e 2),

como a incorporação de fibroína da seda (FB), apatitas (HA) e fator de

crescimento osteogênico (OGP).aos scaffolds

A fibroína da seda é uma proteína extraída do casulo do bicho-da-seda,

o Bombyx mori, e possui propriedades desejáveis, como alta resistência

mecânica, biocompatibilidade com baixa resposta inflamatória e imunogênica19,

20, 22. Sua estrutura de conformação em folhas-β (cristalina) confere elevada

rigidez e resistência aos biomateriais, tornando-a um biopolímero útil para

aplicações em engenharia tecidual óssea1

As apatitas quando adicionadas aos scaffolds conferem aos mesmos a

característica de bioativação. Por estarem presentes naturalmente no tecido

ósseo, elas possibilitam a ligação direta osso-material29. Os recentes esforços

das pesquisas concentram-se em combinar as melhores características da

hidroxiapatita e dos polímeros para criar um material a ser utilizado para

substituição de tecido ósseo8.

Uma outra aplicação dos scaffolds é a liberação controlada de drogas e

fatores de crescimento. Durante o processo de formação óssea uma série de

fatores de crescimento estão envolvidos, tais como as proteínas

morfogenéticas ósseas (BMPs), o fator de crescimento endotelial vascular

(VEGF), entre outros6. Dentre esses fatores, recentemente o peptídeo de

crescimento osteogênico (OGP) foi descrito integrante desse mecanismo

atuando como agente anabólico ósseo e estimulador da hematopoiese4.

O objetivo desse estudo foi avaliar in vivo a resposta tecidual e a

regeneração óssea em defeitos ósseos críticos de calvária de coelhos tratados

118

com scaffolds de PHB produzidos por SLS e modificados por FB, HAe/ou pelo

peptídeo OGP.

2 Material e método

Foram utilizados para avaliação da resposta in vivo scaffolds de PHB

produzidos por SLS de 11 mm de diâmetro e 2 mm de espessura associado a

modificações com FB, HA e/ou OGP e divididos nos seguinte grupos PHB;

PHB-OGP; PHB/FB; PHB/FB-OGP; e PHB/(FB-HA)-OGP. O coágulo foi

utilizado como controle. A metodologia usada na produção desses scaffolds

seguiu o descrito no capitulo 2. Todos os scaffolds produzidos foram

acondicionados em envelopes apropriados, e encaminhados para serem

esterilizados com radiação gama a 20 kGy pela Embrarad (Cotia, Brasil).

2.1 Estudo in vivo Para análise de respostas dos materiais estudados foram utilizados

coelhos (Grupo Genético Botucatu) machos, de 5 meses de vida e com peso

médio de 3 a 3,5 kg no momento da cirurgia. A metodologia foi aprovada pelo

Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Odontologia de

Araraquara - UNESP (Processo nº 17/2013 - Anexo 2).

Para a cirurgia os animais foram anestesiados por meio de

administração intramuscular de cloridrato de ketamina (35 mg.kg-1) e de

cloridrato de xilazina (10 mg.kg-1). Em cada animal dois defeitos de 11 mm de

diâmetro foram confeccionados nos ossos parietais com uma trefina, sob

irrigação constante. Os defeitos foram delimitados nas regiões anterior e

posterior com um ponto de guta percha posicionado a 3 mm de cada uma das

margens. Cada defeito recebeu biomaterial de um grupo experimental distinto.

Os animais foram sacrificados após 7, 15 e 30 dias para análise de expressão

gênica de marcadores relacionados à formação óssea e, após 15 e 60 dias

para análises de microtomografia computadorizada (μCT), morfologia, resposta

tecidual e imuno-histoquímica.

119

2.1.1 PCR em tempo real Taqman Para a análise de expressão gênica, após o sacrifício, as peças foram

removidas e armazenadas primeiramente em nitrogênio líquido e depois

mantidas a -80° C. No procedimento de extração de RNA, as amostras ósseas

foram trituradas em nitrogênio líquido e homogeneizadas com Trizol (Ambion,

EUA). O RNA total foi isolado seguindo protocolo do fabricante. Um total de 1

μg de RNA foi transcrito utilizando o kit High capacity cDNA reverse

transcriptional kit (Applied Biosystems, EUA). Os genes de escolha para

avaliação quantitativa de expressão foram Osterix (OSX - assay ID: Pn4331348AIFATAS), Colágeno tipo 1a1 (COL I - assay ID: Oc03396073_g1),

Fosfatase alcalina (ALP - assay ID: Pn4331348AICSWYC) e Osteocalcin (OSC

- assay ID: Pn4331348AID1U4K). Foram utilizados primers do sistema Taqman

e a cicladora de PCR tempo real Step One plus (Applied Biosystems, EUA). Os

níveis relativos da expressão dos genes foram calculados de acordo com as

instruções da Applied Biosystems, utilizando a GAPDH (assay ID: Oc03823402_g1) como gene normalizador.

2.1.2 Microtomografia computadorizada (μCT) As peças foram removidas após 15 e 60 dias e imediatamente imersas

em formaldeído 4% tamponado com fosfato de sódio 0,1 mol.L-1, pH 7,2. Após

48 horas de fixação, as mesmas foram lavadas em água corrente por 24 horas

e depois armazenadas em uma solução de álcool 70% em temperatura

ambiente. Os espécimes foram escaneados utilizando o sistema de

microtomografia computadorizada Skyscan 1176 (Aartselaar, Belgium).

x Método de escaneamento: gerador de RX operado a 50 kV com corrente

do feixe de 496 uA, filtro de 0,5 mm de alumínio, e imagens obtidas

numa resolução de 18 µm. As imagens tridimensionais foram

reconstruídas utilizando o software de reconstrução NRecon 1.6.1.5

(SkyScan N. V. Belgium).

x Análise Volumétrica (3D): A mensuração volumétrica foi realizada

utilizando o software CT Analyser 1.10.1.0 - (SkyScan, Belgium),

seguindo a seleção de uma área de interesse (ROI – region of interest) tridimensional, no formato cilíndrico com 1,2 mm de diâmetro e

120

espessura envolvendo os 100 cortes radiográficos mais centrais). O

examinador foi guiado pelas marcações com guta-percha para o correto

posicionamento da ROI. As análises foram realizadas por um

examinador cego e treinado.

2.1.3 Análises morfológica e de resposta tecidual As peças, previamente armazenadas em álcool 70°, foram

descalcificadas em E.D.T.A. 7% (Ácido Etileno Diamino Tetracético e

processadas para inclusão em parafina e obtenção de cortes sagitais medianos

de 4 µm de espessura.

Os cortes semi-seriados foram corados com Hematoxilina & Eosina

(H&E) e utilizados para a descrição morfológica, bem como para análise da

resposta tecidual nas regiões adjacentes ao material implantado. Para a

avaliação semi-quantitativa da resposta tecidual aos diferentes tipos de

biomateriais, imagens das regiões de defeitos ósseos foram obtidas utilizando-

se um microscópio de luz com câmera acoplada (Leica DM2500). Observando-

se essas imagens, foram estabelecidos escores de intensidade da reação

inflamatória com base na ISO 10993-6: 2007 (Biological Evaluations for medical devices – Part 6: Tests for local effects after implantation), conforme ilustra o

Quadro 1. Foram consideradas nessa análise células mononucleadas

(polimorfonucleares, linfócitos, plasmócitos e macrófagos), bem como células

multinucleadas contendo 3 ou mais núcleos (células gigantes multinucleadas

do tipo corpo estranho). Todas as análises foram executadas por um

examinador cego e treinado.

121

Quadro 1 - Sistema de avaliação histológica considerando-se o tipo de

resposta ou o número de células inflamatórias por campo microscópico.

Aumento inicial: 400x. Adaptado de ISO 10993-6: 2007 (Biological Evaluations for medical devices – Part 6: Tests for local effects after implantation).

2.1.4 Análise imuno-histoquímica

Para detecção e localização da expressão de Colágeno tipo I e de

Osteocalcina foi utilizado o método do complexo avidina-biotina-peroxidase

(ABC) com a utilização do kit Immuno Cruz mouse ABC staining system

(Sc:2017, Santra Cruz Biotechnology) segundo as instruções do fabricante.

Previamente foi realizada a recuperação antigênica em Tampão citrato 10mM,

pH 6,0. Os anticorpos primários para as proteínas em análise foram Anti-Collagen I antibody (ab6308, Abcam) em diluição 1:800; e Anti-Osteocalcin antibody (ab13418, Abcam) em diluição 1:400. Como controle negativo, o

anticorpo primário foi omitido e substituído por PBS (phosphate-buffered saline).

Para a avaliação das imuno-marcações também foram atribuídos

escores (análise qualitativa ordinal das imuno-marcações). Foram empregados

os seguintes escores: negativo (-), positivo (+), superpositivo (++) ou

hiperpositivo (+++). Para realização da análise estática, os escores foram

convertidos em porcentagens: 0%, 20% (10 a 30%), 60% (50 a 70%) e 90% (80

Escores

Tipo de Célula/Resposta 0 1

(Raro/Leve) 2

(Moderado) 3

(Intenso) 4

(Muito intenso)

Infiltrado Inflamatório Mononuclear

Ausente 1-5 células/campo

11-20 células/campo

Muitas células

inflamatórias

Campo coberto por

células inflamatórias

Células Gigantes Ausente 1-2

células/campo 3-5

células/campo

Muitas células

gigantes

Campo coberto de

células gigantes

122

a 100%)9, 11, 27. A intensidade de imuno-marcação foi registrada por um

examinador cego e treinado.

2.2 Análise estatística

As análises estatísticas foram feitas no programa GraphPad Prism v.5.

Para comparações dos resultados foram utilizados os testes não paramétricos

Kruskal-Wallis seguido do pós-teste de Dunn para as comparações inter-grupo

e, para as comparações intra-grupo Mann-Whitney. O nível de significância

adotado foi de 5%.

3 Resultado e Discussão

Microtomografia computadorizada (μCT) Avaliando-se o percentual de formação óssea por microtomografia

computadorizada observou-se um aumento significativo na formação de 15

para 60 dias nos grupos PHB e PHB/FB. Nos períodos de 15 e 60 dias não

houve diferença no percentual de formação óssea comparando-se os

diferentes grupos avaliados, incluindo o controle (Figura 1). A representação

tridimensional dos grupos avaliados por μCT encontram-se na Figura 2.

123

Figura 1 - Percentual de volume ósseo formado no interior dos defeitos tratados

com os diferentes scaffolds mensurado por microtomografia computadorizada

em 15 e 60 dias. *p<0,05.

Percentual de volume ósseo

0

5

10

15

2015 dias60 dias

Coágulo PHB PHBOGP

PHBFB

PHBFB

OGP

PHBFBHA

OGP

*p<0,05

*

*

%

Figura 2 - Vista coronal da reconstrução tridimensional dos defeitos avaliados

no diferentes grupos no período de 15 e 60 dias por microtomografia

computadorizada.

124

Análises morfológica e da resposta tecidual

Por meio de análise morfológica, em menor aumento foi possível

observar menor volume tecidual na região do defeito ósseo preenchido apenas

com coágulo, aos 15 (Figura 3A) e 60 dias (Figura 4A) em comparação a

grupos em que o defeito foi preenchido com diferentes variações do PHB como

ilustram as figuras 3B (PHB/FB-OGP) e 4B [PHB/(FB-HA)-OGP], referentes aos

períodos de 15 e 60 dias, respectivamente. Além disso, aspectos associados à

resposta tecidual aos diferentes materiais investigados em comparação ao

grupo coágulo, foram observados [Figuras 3C-H (15 dias) e 4C-H (60 dias)].

No período de 15 dias, no grupo Coágulo, a inflamação apresentava-se

praticamente ausente, observando-se tecido conjuntivo contendo fibroblastos e

fibras colágenas. Porções de tecido ósseo neoformado foram encontradas em

algumas regiões do defeito (Figura 3C). Porém, apesar da ausência de

inflamação na região do defeito ósseo, o volume tecidual não se encontrava

preservado, apresentando-se bastante reduzido em relação ao volume do osso

do leito receptor e em comparação aos grupos experimentais (Figuras 3A e

3B).

Aos 60 dias, no grupo Coágulo, células inflamatórias estavam ausentes,

observando-se formação de tecido ósseo aparentemente a partir do leito

receptor. O tecido conjuntivo exibia diversos fibroblastos entre feixes de fibras

colágenas exibindo distribuição ainda mais ordenada (Figura 4C). Porções de

tecido ósseo neoformado foram encontradas nas regiões mais centrais do

defeito (Figuras 4A).

Em maiores aumentos, nos grupos experimentais, em que diferentes

variações de biomaterial foram empregadas, foram observadas imagens

sugestivas de diapedese e moderado infiltrado inflamatório mono

(polimorfonucleares, linfócitos, plasmócitos e macrófagos) (Figuras 5A-C) e

multinuclear (células gigantes do tipo corpo estranho), principalmente nas

proximidades do material (Figuras 5B-H). Muitas células mononucleadas com

morfologia indicativa de macrófago encontravam-se próximas entre si (Figura

5C), sugerindo uma tendência à fusão. Fibroblastos e fibras colágenas também

foram observados, porém, em quantidades mais abundantes nas regiões mais

distantes dos materiais (Figuras 5B, 5C, 5E-H). Aos 60 dias, houve uma

125

tendência à redução do infiltrado inflamatório de moderado para leve, nos

grupos experimentais, Porém, uma inflamação crônica intensa parecia persistir,

com aumento do número de núcleos e volume das células gigantes de corpo

estranho (Figuras 5E e 5H).

Por meio da análise estatística foi observada tendência de redução da

intensidade do infiltrado inflamatório mononuclear do período de 15 para 60

dias, em todos os grupos investigados, observados na distribuição de

frequência apresentada na Figura 6. Aos 15 dias, o grupo Coágulo apresentou

menos infiltrado inflamatório (inflamação praticamente ausente) que os demais

grupos, observando-se diferenças estatísticas quando comparado aos grupos

PHB/FB, PHB/FB-OGP e PHB/(FB-HA)-OGP (p<0,01). Aos 60 dias, o grupo

Coágulo também apresentou menos infiltrado inflamatório que PHB-FB

(p<0,01). Na avaliação da inflamação baseada na contagem de células

gigantes, em todos os períodos, os grupos experimentais exibiram grande

quantidade de células, atribuindo-se às regiões analisadas o escore intenso,

enquanto no grupo Coágulo, essas células estavam ausentes.

126

Figura 3 - Fotomicrografias de defeitos ósseos confeccionados em calota

craniana de coelhos, preenchidos apenas com coágulo (A e C) ou com

diferentes tipos de biomateriais (B, D-H), após 15 dias. Coloração:

Hematoxilina e Eosina.

A e B: Em menor aumento, é possível observar reduzido volume

tecidual (colchete) na região do defeito ósseo preenchido com coágulo (Fig. A)

em comparação a grupos em que o defeito foi preenchido com biomaterial (B),

como ilustra a figura B (PHB/FB-OGP). CO: Cortical óssea. Asterisco (*):

Tecido ósseo neoformado. Barras: 4000 µm.

C: No detalhe (retângulo), em maior aumento, observa-se uma célula

inflamatória (seta), que exibe morfologia arredondada, fibroblastos (F-círculo),

com formato fusiforme, além de inúmeras estruturas acidófilas (cor rósea) do

tecido conjuntivo (TC).

D-H: aspectos associados à resposta tecidual aos biomateriais (B)

investigados, no que diz respeito à presença e intensidade de infiltrado

inflamatório em comparação ao grupo Coágulo. Nos grupos em que foram

empregados os biomateriais (B), observa-se maior quantidade de células

inflamatórias em comparação ao coágulo, além de algumas células gigantes

(CG). Barras: 100 µm.

127

B

C

PHB

PHB-OGP PHB/FB

PHB/FB-OGP PHB/(FB-HA)-OGP

Coágulo

PHB/FB-OGP

A

B

D

E F

G H

Coágulo

CO

CO

CO

CO

B

B

B

B

B

B

B

B B

TC

F

F

B

CG

CG

CG

* *

128

Figura 4 - Fotomicrografias de defeitos ósseos confeccionados em calota

craniana de coelhos, preenchidos apenas com coágulo (A e C) ou com

diferentes tipos de biomateriais (B, D-H), após 60 dias. Coloração:

Hematoxilina e Eosina.

A e B: Em menor aumento, também é possível observar reduzido

volume tecidual (colchete) na região do defeito ósseo preenchido apenas com

coágulo (Fig. A) em comparação a grupos em que o defeito foi preenchido com

biomaterial (B), como ilustra a figura B [PHB/(FB-HA)-OGP]. CO: Cortical

óssea. Asterisco (*): Tecido ósseo neoformado. Barras: 4000 µm. D-H: aspectos associados à resposta tecidual aos materiais investigados em

comparação ao grupo Coágulo (figura C). Em todos os grupos, aparentemente

há redução do infiltrado inflamatório em comparação ao período de 15 dias.

Nos grupos em que foram empregados os biomateriais (B), observa-se maior

quantidade de células inflamatórias em comparação ao coágulo. No grupo

coágulo, as células inflamatórias parecem estar ausentes. Nos grupos que

receberam biomateriais, destacam-se células gigantes (CG) exibindo inúmeros

núcleos e citoplasma bastante volumoso. Barras: 100 µm.

129

B

PHB/(FB-HA)-OGP

CO PHB

PHB-OGP PHB/FB

PHB/FB-OGP PHB/(FB-HA)-OGP

C

F E

D

G H

Coágulo

A

B

B

B

B

B

B

B

B

B B

CG

CG

CG

CG

* * *

130

Figura 5 - Fotomicrografias de porções de defeitos ósseos confeccionados em

calota craniana de coelhos e preenchidos com coágulo ou com diferentes tipos

de biomateriais, após 15 (A-D) e 60 dias (E-H). Coloração: Hematoxilina e

Eosina.

A: Ao redor do biomaterial (B), observa-se infiltrado inflamatório moderado, que

exibe células mononucleadas (seta vazada branca).

B: Células mononucleadas apresentam-se em íntimo contato com a parede de

vasos sanguíneos (VS), bem como, nas proximidades dos mesmos (seta

branca vazada) – imagens indicativas de diapedese (setas pretas). Células

gigantes de corpo estranho (CG) parecem estar tentando envolver porções de

biomaterial (B). Infiltrado inflamatório leve é observado.

C: Inúmeras células mononucleadas encontram-se justapostas (seta vazada

branca) e em contato com células gigantes (CG) que parecem envolver o

biomaterial (B).

D: Infiltrado inflamatório moderado tendendo à leve, está envolvendo células

gigantes (CG). Apesar de apenas alguns núcleos serem visualizados no interior

destas células (CG), elas parecem englobar (setas pretas) todas as porções

remanescentes de biomaterial (B).

E e F: Em regiões em que o infiltrado inflamatório encontra-se bastante

reduzido ou ausente, observa-se maior quantidade de tecido conjuntivo (TC)

constituído por fibras colágenas acidófilas com disposição ordenada,

entremeadas por fibroblastos exibindo morfologia fusiforme característica (seta

preta). Células gigantes (CG) exibindo diversos núcleos estão englobando o

biomaterial (B).

G-H: Células gigantes de corpo estranho (CG) com volume e número de

núcleos aumentados envolvem o biomaterial (B) remanescente, que apresenta

superfície irregular. Barras: 100µm. No detalhe da figura H (retângulo), em

maior aumento, é possível observar que o citoplasma da célula gigante (CG)

exibe estruturas com aparência vesicular/vacuolar. Barra: 50 µm.

131

B

CG

B B

B

TC

CG

TC

CG

B

B

B

B B

B

TC CG

CG CG

B

B

TC

CG CG

C D

E F

G H

B B

B

A

PHB-OGP - 15d

VS

VS

B

CG

CG

TC

B

PHB-OGP - 60d

PHB/FB - 15d PHB - 15d

PHB/FB - 60d

PHB/FB - 60d

CG

CG

PHB-OGP - 15d

PHB/FB - 60d

132

Figura 6 - Representação da frequência dos escores de inflamação baseado no

infiltrado de células mononucleares nos diferentes grupos avaliados em 15 e 60

dias. Escores de intensidade de inflamação: 0: ausente; 1: raro/ leve; 2:

moderado; 3: intenso; e 4: muito intenso

Inflamação

Coágulo

PHB

PHB-OGP

PHB/FB

PHB/FB-OGP

PHB/(FB-H

A)-OGP

Coágulo

PHB

PHB-OGP

PHB/FB

PHB/FB-OGP

PHB/(FB-H

A)-OGP

0

1

2

3

4

5

6

01234

15 dias 60 dias

Escores:

Freq

uênc

ia

Após a implantação de um biomaterial na maioria dos casos um

processo inflamatório ocorre. A resposta pode variar de uma inflamação aguda

ou crônica, formação de tecido de granulação, reação de corpo estranho e

desenvolvimento de cápsula fibrosa3. A duração e intensidade do processo

inflamatório, previamente ao encapsulamento, dependem da extensão da

injúria no local de implantação do material, composição química do material,

energia livre de superfície, carga da superfície, porosidade, rugosidade e seu

tamanho e forma2.

Nos scaffolds avaliados nesse estudo, a formação de células gigantes é

esperada, já que é a ação desse tipo celular que propicia a degradação do

material. A fusão de macrófagos a fim de formar células gigantes é influenciada

pelo tamanho das partículas a serem fagocitadas/ degradadas3, 23. Ao serem

observados microscopicamente, os materiais apresentavam-se com alto grau

de rugosidade, com estruturas que variam muito em tamanho, podendo ter

133

mais de 100 μm (capítulos 1 e 2), induzindo portanto a formação de células

gigantes.

A observação de fibroblastos nos grupos experimentais sugere a

formação de um tecido de granulação. Entretanto a evolução desta cicatrização

não é possível de ser determinada com os resultados obtidos até 60 dias. Uma

observação mais a longo prazo seria necessária. Doyle et al10 demonstraram

que materiais à base de PHB produziram uma resposta favorável de adaptação

no tecido ósseo sem evidencias de uma inflamação crônica indesejável após

períodos de implantação superiores a 12 meses. Entretanto, não podemos

extrapolar esses resultados para todos os materiais a base de PHB já que as

características individuais geradas do processo de fabricação de cada scaffold

podem modificar essa resposta.

Um dos requisitos necessários dos scaffolds é a capacidade de

manterem o volume do tecido a ser regenerado durante este processo16. Tendo

em vista os resultados observados na análise morfológica percebe-se que os

grupos experimentais foram eficientes nesse quesito. Apesar das modificações

nos scaffolds não terem sido eficientes em induzir a formação óssea à

distância, observa-se que, por não haver diferença no percentual de formação

óssea avaliada por μCT, esses materiais parecem permitir a neoformação

óssea oriunda das bordas e do periósteo mantendo o volume na área a ser

reparada, enquanto que no grupo coágulo, a formação óssea avança para o

centro do defeito com uma maior velocidade, porém, à custa de uma

significativa perda de espessura na área.

PCR em tempo real Durante o processo de osteogênese e mineralização óssea uma série de

biosinalizadores são produzidos para que isso aconteça. Nesse estudo

optamos por avaliar a influência dos materiais estudados na expressão gênica

de Osterix (OSX), fator de transcrição osteoblástica; Colágeno tipo 1a1 (COL I),

proteína mais abundante da matriz orgânica óssea; fosfatase alcalina (ALP),

marcador do início da mineralização; e a osteocalcina (OSC), marcador de

osteoblastos maduros.

Na avaliação da expressão gênica dos marcadores relacionados a

osteogênese e mineralização óssea OSX, COL I, ALP e OSC (Figura 7),

134

observou-se que para a maioria deles, a expressão foi maior no período de 7

dias comparados aos demais períodos, e comparando-se os diferentes grupos

não houve diferenças estatísticas nos genes avaliados nesse período. No

período de 15 dias a expressão de OSC nos grupos coágulo e PHB foram

estatisticamente maiores comparadas ao grupo PHB/FB-OGP. Para o grupo

coágulo, no período de 30 dias, a expressão de OSX e COL I foi maior

comparado ao grupo PHB-OGP, e a expressão de OSC maior comparado ao

grupo PHB/FB. Esses resultados demonstram que a utilização do PHB, bem

como de suas modificações, parece não ter interferido na expressão gênica

dos fatores relacionados à formação óssea.

Figura 7 - Expressão gênica avaliada por PCR em tempo real - Sistema

Taqman - dos genes: A: Fosfatase Alcalina (ALP); B: Colágeno tipo 1a1 (COL

I); C: Osteocalcina (OSC); e D: Osterix (OSX). *p<0,05.

135

Análise imuno-histoquímica Imuno-marcações para a proteína colágeno do tipo I foram encontradas

em todos os grupos e em toda a extensão dos defeitos, ou seja, tanto nas

regiões de paredes ósseas, onde se observa a cortical óssea e pequenas

porções de tecido conjuntivo (TC) (Figuras 8A, D, G, J, M e P; e 9A, D, G, J, M

e P), quanto nas regiões centrais, em que se observa tecido conjuntivo (TC) e

biomaterial (B) (Figuras 8B, E, H, K, M, N e Q e 9C, F, I, L, O e R). O colágeno

do tipo I é componente da matriz extracelular do tecido ósseo e também do

tecido conjuntivo. As imuno-marcações variaram de positivas à hiperpositivas

(Figuras 8A-R e 9A-R). Exceto nos grupos PHB (3D) e PHB-OGP (3E), que

apresentaram maior intensidade de imuno-marcação aos 15 dias, nos demais

grupos houve uma tendência de aumento da imuno-positividade de 15 (Figuras

8A-R) para 60 dias (Figuras 9A-R). Este resultado reforça os achados da

análise morfológica que mostraram fibras mais regulares e ordenadas aos 60

dias. Além disso, na maioria dos grupos, de 15 para 60 dias há aumento tanto

da imuno-marcação para colágeno, quanto do volume ósseo, o que demonstra

coerência dos resultados obtidos por meio de diferentes análises.

Na análise estatística, o grupo PHB-OGP apresentou as imuno-

marcações mais intensas para o colágeno I, principalmente aos 15 dias,

período em que estas marcações foram significativamente maiores que as dos

grupos PHB/FB-OGP (p<0,05) e PHB/(FB-HA)-OGP (p<0,01) (Figura 12).

Os resultados obtidos para a expressão do colágeno I no grupo PHB-

OGP são compatíveis com o resultado de expressão gênica. A incorporação do

peptídeo OGP nessas amostras pode ter contribuído para uma aceleração na

expressão e produção dessa proteína nos períodos iniciais. A diminuição de

influência ao longo do período nesse grupo pode ser atribuído a uma liberação

muito precoce do peptídeo no ambiente de implantação como observado no

perfil de liberação do peptídeo OGP no capítulo 2. As curvas de liberação do

peptídeo OGP observadas no capítulo 2, dos respectivos scaffolds, revelaram

que tanto a funcionalização com FB e/ou apatita promovem uma liberação do

peptídeo mais prolongada, porém menos acentuada nas primeiras horas em

relação ao scaffold PHB. Entretanto, esta liberação mais prolongada pode não

ter revertido num efeito benéfico para uma estimulação de uma neoformação

óssea mais precoce, uma vez que, o OGP endógeno é requerido nos primeiros

136

momentos da injúria e no decorrer da reparação óssea este peptídeo deixa de

ser requerido5, o que pode justificar os resultados encontrados obtidos neste

estudo.

Em relação à osteocalcina (OSC), foram observadas imuno-marcações

em osteoblastos, osteócitos e nas regiões de matriz óssea presentes nas

bordas dos defeitos. Em geral, as marcações foram ausentes, positivas ou

superpositivas (Figuras 10A-R e 11A-R). Apesar de não terem sido

encontradas diferenças estatisticamente significantes na expressão da OSC, as

imuno-marcações foram mais intensas no grupo coágulo tanto aos 15 (Figuras

10A e 10B), quanto aos 60 dias (Figuras 11A e 11B). Aos 60 dias, em alguns

animais, as raras porções de tecido ósseo presentes nas regiões mais centrais

de defeito exibiam imuno-positividade. Com exceção do grupo PHB/FB-OGP,

nos demais grupos experimentais, houve pequena tendência de aumento da

imuno-positividade de 15 (Figuras 10M-O) para 60 dias (Figuras 11M-O).

137

Figura 8 - Fotomicrografias de porções de defeitos ósseos confeccionados em

calota craniana de coelhos e preenchidos apenas com coágulo ou com

diferentes tipos de biomateriais, após 15 dias. Imuno-histoquímica para

detecção de colágeno tipo I e contra-coloração com Hematoxilina de Carazzi.

Barras: 100 µm.

La: parede do defeito ósseo (A, D, G, J, M e P). Ce: centro do defeito (B, E, H, K, M, N e Q). C-: controle negativo (C, F, I, L, O e R). As imuno-marcações para colágeno I foram encontradas em todos os grupos e

em toda a extensão dos defeitos, ou seja, tanto nas regiões de paredes

ósseas, onde se observa a cortical óssea (CO) e pequenas porções de tecido

conjuntivo (TC), quanto nas regiões centrais, em que se observa tecido

conjuntivo (TC) e biomaterial (B). A intensidade das marcações varia de

positiva (cor amarela) à hiperpositiva (cor marrom). Nos grupos PHB (D e E) e

PHB-OGP (G e H), foi observada tendência de maior intensidade de imuno-

marcação. Asterisco (*): fibras colágenas imuno-positivas.

138

139

Figura 9 - Fotomicrografias de porções de defeitos ósseos confeccionados em

calota craniana de coelhos e preenchidos apenas com coágulo ou com

diferentes tipos de biomateriais, após 60 dias. Imuno-histoquímica para

detecção de colágeno tipo I + contra-coloração com Hematoxilina de Carazzi.

Barras: 100 µm.

La: parede do defeito ósseo (A, D, G, J, M e P). Ce: centro do defeito (B, E, H, K, M, N e Q). C-: controle negativo (C, F, I, L, O e R). As imuno-marcações para colágeno I foram encontradas em todos os grupos e

em toda a extensão dos defeitos, ou seja, tanto nas regiões de paredes

ósseas, onde se observar a cortical óssea (CO) e pequenas porções de tecido

conjuntivo (TC), quanto nas regiões centrais, em que se observa tecido

conjuntivo (TC) e biomaterial (B). Embora a intensidade das marcações

também varie de positiva (cor amarela) à hiperpositiva (cor dourado-marrom),

exceto para os grupos PHB (D e E) e PHB-OGP (G e H), observa-se maior

intensidade de marcação neste período, em comparação ao período de 15

dias. Asterisco (*): fibras colágenas imuno-positivas.

140

141

Figura 10 - Fotomicrografias de porções de defeitos ósseos confeccionados em

calota craniana de coelhos e preenchidos apenas com coágulo ou com

diferentes tipos de biomateriais, após 15 dias. Imuno-histoquímica para

detecção de osteocalcina + contra-coloração com Hematoxilina de Carazzi.

Barras: 100 µm.

La: parede do defeito ósseo (A, D, G, J, M e P). Ce: região central do defeito (B, E, H, K, M, N e Q). C-: controle negativo (C, F, I, L, O e R). As imuno-marcações para osteocalcina variam entre ausentes, positivas

(amarelo) e superpositivas (amarelo intenso-dourado), sendo mais intensas no

grupo coágulo. O: Tecido ósseo neoformado. B: Biomaterial.

142

143

Figura 11 - Fotomicrografias de porções de defeitos ósseos confeccionados em

calota craniana de coelhos e preenchidos apenas com coágulo ou com

diferentes tipos de biomateriais, após 60 dias. Imuno-histoquímica para

detecção de osteocalcina + contra-coloração com Hematoxilina de Carazzi.

Barras: 100 µm.

La: parede do defeito ósseo (A, D, G, J, M e P). Ce: região central do defeito (B, E, H, K, M, N e Q). C-: controle negativo (C, F, I, L, O e R). As imuno-marcações para osteocalcina variam entre ausentes, positivas

(amarelo) e superpositivas (amarelo intenso-dourado), sendo mais intensas no

grupo coágulo. Com exceção do grupo PHB/FB-OGP (M e N), nos demais

grupos experimentais, houve pequena tendência de aumento da imuno-

positividade de 15 para 60 dias. B: Biomaterial.

144

145

Figura 12 - Percentual de imuno-marcação nos diferentes grupos avaliados em

15 e 60 dias. A: Colágeno 1a1 (COL I); e B: Osteocalcina (OSC). *p<0,05.

A resolução ou reparo da injuria na área de implantação do material

pode ocorrer por duas vias distintas: 1) regeneração com a restituição da

estrutura normal do tecido; ou 2) reorganização e substituição do tecido lesado

por um tecido conjuntivo fibrovascular neoformado. Esses processos são

ambos controlados pela capacidade proliferativa das células presente no tecido

receptor do material23, frente a presença do biomaterial.

Tendo isso em mente, associado à resposta celular favorável de

fibroblastos28 e osteoblastos (capítulos 1 e 2) ao PHB, o uso em regeneração

óssea dos scaffolds de PHB com ou sem modificações, que necessitam de

degradação, talvez tenham um melhor resultado in vivo em longo prazo se

associados a algum tipo de barreira que permita a diferenciação e/ou seleção

de células osteoblásticas sobre os mesmos.

O tempo de degradação das matrizes também interfere nos resultados

finais de formação dos tecidos3. O PHB possui um tempo de degradação in

vivo bastante controverso na literatura. Isso porque as amostras utilizadas são

fabricadas por diversas tecnologias, com diferentes formas e descritas em

modelos animais e de implantação diversos12. Ensaios de degradação in vivo

em ratos demonstraram uma perda de 57% do total inicial de PHB após 6

meses de implantação13. No presente estudo após 60 dias ainda foi possível

observar uma grande quantidade de material nos grupos experimentais.

146

Os resultados das diferentes avaliações realizadas demonstram que o

scaffold de PHB, bem como suas modificações, não foram eficientes em

estimular a formação óssea de contato, nos períodos avaliados. As

funcionalizações utilizadas neste estudo com fibroína e apatita não

promoveram uma superfície mais osteocondutiva para os scaffolds de PHB

para este modelo experimental, inferindo que simplesmente o scaffold de PHB

contendo ou não peptídeo podem ser um material a ser mais explorado e

investigado em estudo futuros com intuito de melhorar o controle e

concentração de peptídeos incorporados a ele.

Para tanto, novos estudos são necessários, em períodos mais longos

para que se possa explorar melhor os possíveis benefícios destes materiais.

Estudos complementares in vitro com cultura celular que avaliem expressão de

proteínas relacionada à osteogênese e mineralização também são importantes

para melhor entender se a incorporação destes produtos interferem nos

mecanismos moleculares envolvidos nestes processos.

4 Conclusão A utilização dos scaffolds tridimensionais de PHB foram eficientes em

manter a espessura do defeito tratado. Entretanto, as modificações com FB,

HA e/ou OGP utilizadas não foram eficazes em estimular a formação óssea de

contato. Estudos posteriores são necessário para compreensão do mecanismo

de ação dos materiais utilizados, principalmente em longo prazo, com a total

reabsorção do material.

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150

resultados

complementares

151

RESULTADOS COMPLEMENTARES

Avaliação in vivo dos scaffolds de PHB, PHB-OGP, PHB/FB, PHB/FB-OGP, e PHB/(FB-HA)-OGP por microtomografia computadorizada em 120 dias

Figura 5 - Percentual de volume ósseo neoformado no interior dos defeitos

crítico em calotas cranianas de coelhos, avaliado por microtomografia

computadorizada para os diferentes grupos, nos períodos de15, 60 e 120 dias.

(p>0.05 para análise intra e inter-grupos, colocar o nome do teste).

Percentual de volume ósseo

0

5

10

15

20

60 dias120 dias

15 dias

Coágulo PHB PHBOGP

PHBFB

PHBFB

OGP

PHBFBHA

OGP

%

152

Figura 6 - Vista coronal das reconstruções tridimensionais obtidas por

Microtomografia computadorizada, dos defeitos ósseos dos diferentes grupos

avaliados em 15, 60 e 120 dias.

153

Os resultados de percentual de formação óssea avaliados por

microtomografia computadorizada demonstram uma crescente formação ao

longo dos períodos em todos os grupos. Entretanto quando comparados os

diferentes grupos nos diferentes períodos não há diferença estatística (Teste

Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn, p<0,05) (Figura 5). As imagens obtidas

na reconstrução tridimensional dos defeitos nos diferentes grupos avaliados

(Figura 6) sugerem um maior fechamento do defeito no grupo coágulo.

Entretanto, quantitativamente essa diferença também não é significativa

comparada aos demais grupos (Figura 5).

Baseado nos resultados histológicos apresentados no capítulo 3, essa

aparente diferença visual pode-se dever ao fato de que no grupo coágulo

ocorrer uma formação óssea mais rápida em direção ao centro do defeito,

porém com uma espessura diminuída em relação às bordas. Isso justificaria o

fato das taxas de formação terem sido numericamente semelhantes nos

diferentes grupos, sugerindo que nos grupos experimentais a formação óssea

esteja ocorrendo de forma diferenciada do controle, mantendo a espessura

tecidual original. Esses resultados só poderão ser confirmados após análise

histológica dos espécimes de 120 dias.

154

conclusão

155

CONCLUSÃO

Baseado nos estudos in vitro e in vivo realizados e apresentados nesta

tese podemos concluir que:

1) A utilização da sinterização seletiva a laser no presente estudo foi eficaz

em produzir matrizes tridimensionais (scaffolds) de poli(3-hidroxibutirato)

porosas com alto controle de tamanho de poros.

2) As associações dos scaffolds de PHB com FB, HA e/ou OGP conferiram

aos mesmos características físico-químicas favoráveis ao reparo ósseo,

com boa adesão e proliferação celular. Nas avaliações in vivo esses

materiais falharam em estimular a formação óssea de contato.

Entretanto, foi eficiente em manter a espessura do defeito.

3) Para melhor entendimento da ação desses scaffolds, mais avaliações,

principalmente em logo prazo, são necessárias, tendo em vista que a

total degradação desse material não foi observada no período de 120

dias. Essas avaliações possibilitarão a proposição de mudanças na

fabricação desses materiais, se necessário for.

156

referências

157 REFERÊNCIAS*

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164

anexo 1

166

anexo 2

Não autorizo a reprodução deste trabalho até 06/03/2017

(Direitos de publicação reservado ao autor)

Araraquara, 06 de março de 2015.

LUANA CARLA PIRES