Post on 01-Feb-2023
HEME SPIN RENDAH SITOKROM OKSIDASE C SEBAGAI
PENDORONG PROSES POMPA PROTON
Oleh:
Anne Carolina (20504011)
Eka Wulandari (20504012)
PROGRAM MAGISTER KIMIA
BIDANG KHUSUS BIOKIMIA
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2005
ABSTRAK
Sitokrom c oksidase mitokondria berperan pentingdalam respirasi seluler aerob, mereduksi oksigenmenghasilkan air, dalam proses kopling dengan pompahidrogen melewati membran mitokondria dalam. Residuaspartat, Asp-51, yang 0berlokasi dekat permukaanenzim, mengalami perubahan struktur dalam Sinar-X. Halini mengindikasikan bahwa residu ini berperan dalamproses pemompaan proton. Meskipun bukti keterlibatanmekanistik dan fungsional dari residu ini dalam prosespemompaan proton belum jelas diperoleh, mutasi Asp-52 Asn dari enzim hati memperlihatkan fungsi pompaproton tanpa mempengaruhi aktivitas reduksi dioksigen.Struktur Sinar-X (pada resolusi 1.8/1.9 Å dalam bentukteroksidasi dan reduksi penuh) menunjukkan bahwa muatanpositif total yang dibentuk selama oksidasi mendorongtransport proton aktif dari ruang mitokondria ke Asp-51melewati enzim lewat saluran air dan jaringan ikatanhidrogen, yang berlokasi di tandem. Selain itu reduksienzim menginduksi pengeluaran proton dari aspartat kemitokondria bagian luar. Ikatan peptida dalam jaringanikatan hidrogen menginhibisi transfer balik proton
melalui jaringan. Perubahan redoks dalam kapasitassaluran air, diinduksi oleh gugus hidroksi farnesiletil dari heme spin-rendah. Hal ini mengindikasikanbahwa fungsi saluran air sama efektifnya dengan daerahpengumpul proton. Hasil infrared mengindikasikan bahwakonformasi Asp-51 dikontrol hanya oleh bentuk oksidasiheme spin rendah. Hasil ini mengindikasikan bahwa hemespin rendah mendorong proses pompa proton.
BAB I
PENDAHULUAN
Sitokrom c oksidase yang berlokasi di bagian dalam
membran mitokondria merupakan enzim kunci pada rantai
respirasi organisme aerob. Enzim ini berfungsi dalam
katalisis transfer elektron dari sitokrom c ke oksigen
molekular, sehingga terjadi reduksi menjadi air. Reaksi
ini terjadi melalui proses transport, yaitu melalui
pemompaan empat proton melewati membran. Sitokrom c
oksidase memiliki empat kofaktor reaksi redoks yang
aktif, yaitu dua atom Cu pembentuk, dinamakan CuA,
suatu heme a spin rendah, serta pusat binuklir heme a3
dan Cu B. Cu A menerima elektron dari sitokrom c dan
elektron ditransfer melalui heme a ke pusat binuklir
tempat terjadinya reduksi oksigen.
Kesetimbangan elektron dicapai dari sitokrom c di
luar membran dalam mitokondria (ruang inter membran)
melalui sisi Cu A dan heme spin rendah (heme a) ke sisi
reduksi O2. Proton yang digunakan untuk pembentukan air
dari O2, ditransfer dari membran dalam mitokondria
(ruang matriks) melalui dua jaringan ikatan hidrogen
yang disebut jalur K dan D. Selain dalam proses pompa
proton, transfer proton dan elektron ke sisi reduksi
O2 menghasilkan perpindahan muatan positif ke ruang
intermembran, yang menghasilkan gaya proton motive yang
diperlukan untuk menggerakkan ATP sintase.
Mutasi residu asam amino di dalam jalur D dapat
menyebabkan penurunan dalam efesiensi pompa proton dan
penurunan aktivitas reduksi O2. Pengamatan menunjukkan
bahwa proses yang menyertai pompa proton terjadi
melalui jalur proton untuk membentuk air. Struktur
Sinar-X memperlihatkan bahwa sitokrom c oksidase dari
hati sapi dalam bentuk teroksidasi dan tereduksi penuh
pada resolusi 2.3 dan 2.35 Å, menunjukkan adanya
pergerakan Asp-51 dari subunit I (subunit paling besar
yang mengandung heme a dan sisi reduksi O2) dari
interior protein menuju permukaan inter membran melalui
reduksi enzim. Dalam bentuk teroksidasi, Asp-51
berkontak dengan ruang matriks melalui jaringan ikatan
hidrogen sehingga molekul air dapat melewati ruang
dalam matriks (jalur H). Struktur ini memberikan
gambaran bahwa proses pompa proton terjadi pada Asp-51.
Akan tetapi usulan mengenai hal ini belum banyak
diterima, karena enzim bakteri dan tumbuhan tidak
mempunyai residu analog Asp-51 (penomoran dalam sapi)
dan juga karena mutasi jalur D menyebabkan penurunan
efisiensi pompa proton dan aktivitas reduksi O2. selain
itu tidak ada mekanisme untuk penggerak pompa proton
pada Asp-51 yang menjelaskan. Mutasi Asp-51 memberikan
satu alternatif untuk menjelaskan fungsi Asp-51. Dalam
penelitian ini akan dijelaskan peranan jalur H melalui
sisi mutagenesis terarah, struktur Sinar-X dan
spektroskopi infra merah.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Semua tahap-tahap enzimatis pada degradasi
oksidatif karbohidrat, lemak dan asam amino didalam sel
aerobik menyatu menjadi tahap akhir respirasi sel.
Disini terjadi pengaliran electron dari senyawa organik
menuju oksigen, menghasilkan energi untuk membuat ATP
dari ADP dan fosfat. Rantai respirasi terdiri dari
serangkaian protein dengan gugus prostetik yang terikat
kuat dan mampu menerima dan memberikan elektron.
Pada sel eukariot, hampir semua dehidrogenase
spesifik yang diperlukan pada oksidasi piruvat dan
bahan bakar lain melalui siklus asam sitrat terletak
pada bagian sebelah dalam mitokondria yaitu matriks.
Molekul pemindah electron dari rantai respirasi dan
molekul enzim yang melakukan sintesa ATP dari ADP dan
fosfat terbenam dalam membran sebelah dalam. Bahan
bakar siklus asam sitrat seperti piruvat, harus
dipindahkan dari sitosol (tempat dilakukannya sintesis
molekul-molekul tersebut) melalui membran mitokondria
ke dalam bagian matriks disebelah dalam, sebagai tempat
aktivitas dehidrogenase.
Demikian pula, ADP yang dibentuk dari ATP selama
aktivitas yang memerlukan energi dari sitosol harus
dipindahkan ke dalam matriks mitokondria, untuk
mengikat fosfat kembali, menjadi ATP. ATP baru yang
dibentuk harus dikembalikan ke sitosol.
Jadi membran mitokondria sebelah dalam, merupakan
struktur komplek yang mengandung molekul pembawa
electron, sejumlah enzim dan beberapa system transport
membran.
Gambar Proses Fosforilasi Oksidatif dalam
Mitokondria
Beberapa jenis gugus pembawa elektron, semuanya
berikatan dengan protein. Golongannya antara lain
Nikotinamida adenin dinukleotida (NAD) yang aktif
dengan dehidrogenase; flavin mononukleotida (FMN) pada
NADH dehidrogenase;ubiquinon atau koenzim Q, suatu
senyawa kuinon isoprenoid yang larut dalam lemak, yang
berfungsi dalam bentuk ikatannya dengan satu atau lebih
protein; dua jenis protein yang mengandung pusat besi-
sulfur (Fe-S) sitokrom; dan tembaga pada sitokrom aa3.
Senyawa sitokrom adalah protein mengandung besi
pemindah elektron dan berwarna merah atau coklat, yang
bekerja secara berurutan untuk mengangkut elektron dari
ubikuinon ke molekul oksigen. Golongan ini merupakan
protein heme, dengan besi yang berada pada kompleks
porfirin-besi, atau heme, yang serupa dengan pada
hemoglobin.Terdapat tiga kelas sitokrom, a, b, dan c
yang berbeda dalam spektra absorbsi sinarnya. Setiap
jenis sitokrom dalam keadaaan tereduksinya atau ferro
memiliki tiga pita absorbsi yang jelas pada kisaran
sinar tampak.
Sitokrom pada rantai respirasi disusun dalam urutan b
c1 aa3. Sitokrom b berada dalam dua bentuk,
menerima elektron dari ubikuinon dan memindahkannya ke
sitokrom c1 yang selanjutnya memberikan elektron yang
diterima ke sitokrom c. Setiap sitokrom berada dalam
bentuk feri [Fe(III)] menerima satu elektron menjadi
bentuk fero [Fe(II)]. Pembawa elektron terakhir adalah
sitokrom aa3 atau oksidase sitokrom yang dapat
memberikan elektron langsung ke oksigen untuk
menyempurnakan proses transport elektron.
Sitokrom aa3 berbeda dengan sitokrom lain. Protein ini
mengandung dua molekul heme A yang terikat kuat, yang
berbeda dari protoheme oada hemoglobin, dalam cincin
porfirinnya, yang memiliki rantai sisi hidrokarbon yang
panjang. Lebih jauh lagi sitokrom aa3 juga mengandung
dua atom tembaga yang esensial. Setelah komponen
sitokrom a menerima elektron dari sitokrom c dab
tereduksi menjadi bentuk Fe(II), molekul ini memberikan
elektronnya ke sitokrom a3. Sitokrom a3 tereduksi lalu
memberikan elektron kepada molekul oksigen. Unsur yang
berpartisipasi dengan kedua gugus heme didalam proses
ini adalah kedua atom tembaga yang terikat, yang
mengalami perubahan redoks kupro-kupri [Cu(I)-Cu(II)]
dalam fungsinya. Ini adalah suatu tahap yang kompleks
dan penting di dalam transport elektron, karena ke
empat elektron harus diberikan hampir bersamaan kepada
O2 untuk menghasilkan dua H2O, dengan mengambil empat H+
dari medium cair. Dari semua anggota rantai transport
elektron, hanya sitokrom aa3 yang dapat bereaksi
langsung dengan oksigen.
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Mutagenesis Terarah (Site-directed Mutagenesis)
Jumlah sitokrom c pada mitokodria ditentukan
menggunakan western blot. Sejumlah sampel dijalankan
pada on 4–12% Mes NuPage gels (Novex) selama 42 menit
pada 200V dan 40C. Kemudian electrotransfer basah ke
membran nitroselulosa menggunakan sistem Novex dengan
5% metanol pada buffer transfer selama 1 jam pada 30V.
Efisiensi transfer dipertegas dengan noda transfer awal
pada gel dan membran menggunakan EasyStain (Novex) and
Ponceau S.
Membran residu noda dicuci menggunakan Tris-
buffer saline dengan 0.2% Tween- 20 (TBS-T),yang diblok
semalam menggunakan 1.5% susu bubuk pada TBS-T.
Sitokrom c ditandai menggunakan imunoglobulin antibodi
sitokrom c oksidasi dari tikus dengan pengenceran 1 :
2000 dengan TBS-T dengan 1,5% selama 1 hari. Inkubasi
selanjutnya menggunakan secondary anti tikus Ig
berikatan dengan horseradish peroxidase (Amersham) pada
pengenceran 1:2000 selama 40 menit, pitanya
divisualisasikan menggunakan reagen luminol dan film
sinar-x.
3.2 Pemurnian Sitokrom c Oksidase dari Hati Sapi dan
Kristalisasi
Penyiapan pemurnian enzim dengan rekristalisasi
berulang adalah pengkondisian kristalisasi enzim yang
sangat penting. Kristal dalam bentuk reduksi penuh dan
bentuk reduksi ikatan-CO dimulai dengan merendam bentuk
teroksidasi penuh dengan medium yang mengandung
askorbat dan sejumlah katalitik sitokrom c sebagai
sistem pereduksi dan polietilen glikol (PEG 4000) untuk
menstabilkan kristal dibawah atmosfer N2 dan CO.
Difraksi sinar-X dilakukan dengan cara menempatkan
kristal pada kapiler yang sesuai dengan medium
perendaman.
Keadaan teroksidasi dan keadaan pengikatan ligan
dari enzim dipertegas dengan spektra absorpsi
darikristal ini pada kondisi medium yang sama.
Bentuk azida disiapkan dengan merendam kristal pada
keadaan teroksidasi penuh ke dalam buffer yang
mengandung azida dan jumlah PEG 4000 yang sesuai pada
keadaan aerobik. Data intensitas diambil menggunakan
radiasi synchroton pada 1.0 Å Photon Factory, Tsukuba,
Japan, dengan modified Weissenberg camera untuk
makromolekul.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Mutagenesis Asp-51 dalam Subunit I Hati Sapi
Sitokrom c Oksidase
Subunit I Asp-51 digantikan oleh Asn melalui
metode pembentukan hibrid. Vektor ekspresi dibuat
untuk memproduksi, di dalam sitosol sel HeLa, yang
mengkode subunit I dari enzim sapi dengan signal targeting
mitokondria pada terminal N- dan ekor heksahistidin
pada terminal C-, untuk penentuan kuantitatif subunit I
yang terekspresi. Struktur Sinar-X menunjukkan bahwa
terminal C subunit I mempunyai ruang yang cukup untuk
menerima tag (ekor) His tanpa mempengaruhi konformasi
enzim.
Efisiensi produksi enzim hibrid sapi/manusia
dievaluasi dengan antibodi yang spesifik. Seperti yang
ditunjukkan oleh analisis western blot dari SDS
mitokondria hati sapi dan Sel HeLa. Antibodi Subunit I
sapi menunjukkan pita yang jelas tapi tidak pada
Subunit I manusia (Fig. 1A, garis 1 dan 2). Antibodi
untuk protein manusia hanya bereaksi dengan Subunit I
manusia tapi tidak dengan Subunit I sapi (Fig 1A, garis
3 dan 4).
Gambar 1A. Pengaruh mutasi sub unit I Asp-51 3 Asn(Asp51Asn) pada fungsi sitokrom c oksidase.Mitokondria dari hati sapi (jalur 1 dan 3) dansel HeLa (jalur 2 dan 4) diperlakukan 4% SDS3,5M urea dan difraksinasi menggunakan SDSPAGE. 70 gram sampel protein dimasukkankecuali untuk jalur 1 (20gram protein).Antibodi untuk subunit I sapi digunakan untukjalur 1 dan 2, antobodi sub unit 1 untukmanusia digunakan jalur 3 dan 4.
Dodesil maltosida melarutkan sitokrom c okidase
dari membran mitokondria tanpa mendenaturasi protein
dan menghasilkan pita 210 kDa dari Sitokrom c oksidase
dalam blue native PAGE. Antibodi sapi bereaksi dengan
fraksi 210 kDa dari mitokondria yang larut dalam
dodesil maltosida. Fraksi ini diisolasi dari sel HeLa
transfektan gen sapi wild-type (Fig 1B, garis 2).
Gambar 1B. Hasil gel elektroforesis di fraksinasidengan 1,4% dodesil maltosidesolubilizedmetokondria dari tiruan-transfektan sel HeLa(jalur 1,4 dan 6) dan dari sel HeLamenempatkan wild type (jalur 2 dan 5) dan subunit I gen mutan Asp51Asn (jalur 3 dan 7)dari sitokrom c oksidase. Pada jalur 1,2, dan3,180,90 dan 90 gram protein diberikan secaraberturut-turut. Pada jalur 4-7 ditambahkan 70gram protein. Anyibodi spesifik sub unit Iuntuk sapi digunakan jalur 1-3 atau manusiapada jalur 4-7.
Fraksi yang berhubungan diambil dari suatu sel
transfektan oleh vektor yang tidak membawa gen subunit
I (mock-transfected cell line) tidak menghasilkan pita yang
analog (Fig.1B, garis 1). Disamping itu antibodi
manusia bereaksi dengan fraksi dari mock-transfected cell line
(Fig 1B, garis 4 dan 6). Kemudian hasil menunjukkan
bahwa subunit I sapi tersusun oleh subunit manusia.
Keberadaan pita yang lemah dari fraksi 210 kDa
mitondria yang larut dari garis cell transfected gen sapi
wild-type (Fig. 1B, garis 5) menunjukkan bahwa subunit
I manusia tidak sempurna digantikan oleh subunit I
manusia dalam cell transfected. Jumlah residu dari
nonhibrid enzim ditentukan secara kuantitatif dengan
membandingkan intensitas pita dari pita 210 kDa dari
mock-transfected dan gen wild-type transfected cell seperti
dijelaskan dalam metode yaitu menjadi sekitar 20% (Fig.
1B, garis 4 dan 5). Pita yang ditunjukkan dalam Fig. 1B
yaitu pita blue native PAGE, tidak sejelas pita hasil
SDS PAGE. Spektrum sinar tampak dari mitokondria yang
larut dalam dodesil maltosida dan mitokondria tereduksi
penuh dari gen wild-type sel transfektan menunjukkan
suatu - pita pada 640 nm, yang karakteristik bagi
sitokrom c oksidase natif. Tidak ada komponen
mitokondria yang mempunyai absorbansi signifikan pada
604 nm selain sitokrom c oksidase.
Selanjutnya, preparasi enzim hibrid yang larut
memperlihatkan aktivitas enzim spesifik (laju oksidasi
ferositokrom c per molekul enzim) yang sama tinggi
dengan enzim preparasi yang larut dari sel transfektan
tiruan. Spektrum dan aktivitas enzim dari enzim hibrid
memberikan bukti kuat bahwa enzim hibrid membawa
konformasi natif. Sel transfektan dengan gen subunit I
yang termutasi Asp51Asn memperlihatkan efisiensi
produksi enzim hibrid yang sama, seperti halnya sel
transfektan gen wild-type pada garis diatas (Fig. 1B,
garis 2 dan 3). Spektrum absorpsi dan aktivitas
transfer elektron dari preparasi yang bersifat larut
juga sama identik dengan enzim hibrid wild-type. Hasil
ini menunjukkan bahwa mutasi Asp51Asn tidak mengganggu
struktur 3D enzim.
Aktivitas transfer elektron dan pompa proton dari
enzim hibrid dalam mitokondria ditentukan dengan
mengukur laju oksidasi sitokrom c dan pengeluaran
elektron oleh preparasi mitoplast dengan keberadaan
beberapa reagen pemblok aktivitas komponen mitokondria
lain, termasuk valimisin dan KCl untuk eliminasi
potensial membran. Reaksi dimulai dengan penambahan
ferrositokrom c. Oksidasi ferositokrom c ini kemudian
diinhibisi oleh 1mM sianida. Sampel mitoplast yang
mengandung subunit I sapi wild-type mengalami asidifikasi
awal diikuti dengan alkalinisasi yang menyebabkan
reduksi oksigen dan proses pemompaan proton (Fig. 1C,
WT).
Gambar 1C Pengeluaran proton oleh sampel mitoplast(44.7g protein) dari sel HeLa transfektandengan gen wild-type (WT) dan gen subunit Imutan Asp51Asn (D51N) setelah penambahan 8.1nmol ferositokrom c. perubahan konsentrasiproton dengan keberadaan 10nmol karbonilsianida p-trifluorometoksifenil hidrazon
(FCCP) per mg protein mitoplast yangditunjukkan dengan +FCCP
Kurva yang sama diperoleh dari sampel sel
transfektan tiruan (tidak ditunjukkan). Karbonil
sianida p-trifluorometoksi fenilhidrazon (FCCP)
memindahkan asidifikasi awal (Gambar 1C, WT + FCCP).
Adaptasi awal alkalinisasi dengan keberadaan FCCP
menunjukkan bahwa alkalinisasi karena reduksi O2
diabaikan dalam 4 detik pertama. Kemudian kecepatan
pengeluaran proton dapat ditentukan dari fase linear
dalam 4 detik pertama setelah inisiasi reaksi.
Perkiraan kuantitatif proton dan elektron yang
ditransfer dalam 5 detik pertama adalah 0.96 nmol
proton (Gambar 1C, WT) dan 1.17 nmol ekuivalen
electron. Hal ini berarti perbandingan H+/ e- adalah
sekitar 0.82. Tiga pengukuran lain menggunakan sampel
mitoplast, termasuk subunit I wild-type sapi dari garis
sel yang sama, memberikan perbandingan 0.83, 0.58, dan
0.79. Harga ini sama dengan hasil dari sampel mitoplast
yang dibuat dari garis sel trasnfektan tiruan (0.85 dan
0.82). Selain itu harga yang sama juga ditunjukkan oleh
enzim mamalia lain. Hasil ini juga menunjukkan bahwa
konformasi natif enzim ada pada enzim hibrid. Preparasi
mitoplast termasuk juga mutan Asp51Asn dari subunit I
sapi tidak menunjukkan adanya asidifikasi awal (Gambar.
1C, D51N). Asidifikasi juga tidak terlihat dengan
keberadaan FCCP (Fig.1C, D51N + FCCP). Mutan mitoplast
memperlihatkan oksidasi ferrositokrom yang sensitif
terhadap sianida pada laju yang lebih cepat sekitar 70%
dari wild-type. Kandungan residu enzim manusia (sekitar
20%) terlalu rendah untuk mendeteksi proses pompa
proton pada kondisi percobaan ini. Hasil ini dipertegas
oleh data yang diperoleh dari garis sel transfektan
gen wild-type dan tiga garis sel transfektan gen mutan
Asp51Asn yang berbeda.
Hipotesis endosimbiosis yang diterima secara luas
yaitu bahwa asal muasal organel menyebutkan gen asal
ditransfer ke inti selama evolusi. Subunit I dan
sitokrom b yang memiliki 12 dan 8 transmembran -
heliks, dikode oleh DNA mitokondria oleh semua
organisme eukariot. Pemindahan yang terlihat berhasil
dari subunit I ke mitokondria adalah bahwa daerah
hidrofobik merupakan alat yang mencegah subunit I dab
sitokrom b mengalami transfer dari genom mitokondria
selama evolusi. Pembentukan sistem ekspresi subunit I
tidak menggunakan metode pembentukan hibrid seperti
digunakan disini karena percobaan untuk pengangkutan
apositokrom b (yang lebih kecil dari subunit I) ke
mitokondria tidaklah berhasil.
4.2 Struktur Sinar-X dari Jalur H
Struktur sinar-X dari sitokrom c oksidase bentuk
teroksidasi dan tereduksi penuh pada resolusi 1.8 dan
1.9 Å memperlihatkan bahwa perubahan konformasional
yang besar dari Subunit I Asp-51 terjadi di dekat
permukaan sisi intermembran (Gambar 2A).
Gambar 2A Perubahan konformasional redoks berpasangandalam Asp-51. penggambaran Spektroskopijaringan ikatan hidrogen dalam bentukteroksidsi dan tereduksi penuh (strukturbiru)pada resolui 1.8 dan 1.9 Å, dilihat darisisi intermembran. Dua histidin terikat ke Fea
(besi heme a), tidak ditunjukkan.
Perubahan konformosional ini meliputi penyusunan
ulang interaksi ikatan hidrogen (Gambar 2B). Harga pKa
dari gugus karbonil dipengaruhi oleh lingkungannya.
Sebagai contoh, pKa asam asetat adalah 4.8 dalam air
dan 9.5 dalam methanol. Oleh karenanya lingkungan polar
yang non aqueous dari Asp-51 dalam bentuk teroksidasi
dihasilkan oleh gugus OH dari dua Ser- dan dua gugus
NH- peptida. Hal ini menunjukkan bahwa Asp-51 hampir
seluruhnya terprotonasi dalam bentuk tereduksi. Gugus
karboksil dari residu Asp-51 pada permukaan molekular
inter membran berada dalam aqueous, menunjukkan bahwa
gugus karboksil dalam bentuk deprotonasi.
Gambar 2B.Struktur Ikatan Hidrogen Asp-51 pada keadaanTeroksidasi (kiri) dan keadaan Tereduksi(kanan). Garis tebal menunjukkan permukaanmolecular dimana molekul air berada pada ruangintermembran dapat diakses.Perubahankonformasi diinduksi oleh reduksi dari enzimyang diperlihatkan dengan struktur berwarnabiru disebelah kanan. Bola berwarna biru (A)dan hitam (B) menggambarkan molekul air. Garisputus-putus menunjukkan ikatan hidrogen. Panahdua menunjukkan kemungkinan pergerakan molekulair dari Arg-38 ke Tyr-71.
Gugus karbonil dari ikatan peptida antara Tyr-440
dan Ser-441 dihubungkan dengan Arg-38 oleh jaringan
ikatan hydrogen yang terdiri dari Tyr-371 dan molekul
penarik air kedua (Fig. 2). Molewkul air yang terikat
dengan ikaan hidrohen ke Arg- 38 berlokasi sekitar 4 Å
dari Tyr-371. Jarak ini terlalu jauh untuk membentuk
ikatan hydrogen. Molekul air ini kemudian dapat
mendekati Tyr-371 untuk membentuk ikatan hydrogen
setelah berpindah dari Arg-38, yang diindikasikan oleh
tanda panah bertitik. Air yang terikat antara tyr-371
dan gugus karbonil peptida juga terhubung dengan
hydrogen ke gugus propionat dari heme a.
Transfer proton dimungkinkan terjadi melalui
ikatan peptida. Ketika proton ditambahkan ke gugus
kmarbonil peptida, akan terbentuk asam imidat [-
C(OH)=N+H-]. Jika gugus penerima proton berlokasi dekat
bagian =N+H-, proron akan diambil untuk membentuk enol
dari peptida [-C(OH)=N-]. Stabilitas yang lebih besar
ada pada bentuk keto (-CO-NH-) dibandingkan bentuk enol
[-C(OH)=N-]. Perubahan konformasi dari bentuk
ketoenol mengindikasikan pembalikan ke bentuk keto.
Peptida tidak memberikan arah yang karakteristik
transfer protonmelalui peptida yang menghalangi
transfer proton dari sisi intermembran.
Asp-51 dalam bentuk teroksidasi dihubungkan dengan
ikatan hydrogen ke Ser-441 pada permukaanmolekul. Pada
tempat itu bentuk reduksi dari jaringan ikatan hydrogen
termasuk air yang terikat antara Asp-51 dan Ser-205
menghubungkan Asp-51 dengan jaringan ikatan hydrogen
terbentang ke Arg-38 (Fig 2B). Kemudian Asp-51 dapat
dilalui melalui ikatan hydrogen ke kedua sisi molekul
bentuk oksidasi. Transfer proton kebalikan dihalangi
oleh ikatan peptida. Disamping itu struktur sebelumnya
pada resolusi 2.3/2.35Å menunjukkan bahwa Asp-51 dalam
bentuk teroksidasi dihubungkan ke ruang matriks oleh
jaringan ikatan hydrogen dan terkubur di dalam
permukaan inter membran. Sementara itu bentuk tereduksi
enzim, terdesosiasi dari jaringan ikatan hydrogen dan
terpapar ke ruang intermembran. Model terbaru ini
menunjukan bahwa proses pompa proton didorong oleh
perubahan pKadari Asp-51 dan transfer proton tak
berarah melalui ikatan peptida berbeda halnya dengan
usulan yang dijelaskan sebelumnya.
Besi heme a yang terikat ke enam nitrogen, (dua
dari histidin dan empat dari forfirin) keduanya dalam
bentuk teroksidasi. Dalam bentuk tereduksi , dua muatan
positif Fe2+ dinetralkan oleh dua muatan negatif
forfirin. Dalam bentuk teroksidasi, Fe3+ mempunyai satu
muatan positif yang belum ternetralkan. Relokasi muatan
positif ini melalui system electron -forfirin dapat
menyebabkan deprotonasi gugus bersifat asamyang
berlokasi dekat heme a. struktur terbaru Sinar-X
menunjukkan bahwa struktur heme a gugus formil adalah
coplanar dengan cincin forfirin dan dapat berkonjugasi
dengan system electron -forfirin dalam kedua bentuk
oksidasi. Hal ini konsisten denganbuktin resonansi
Raman yaitu pengaruh bentuk oksidasi besi pada karbonil
formil ditunjukkan oleh pergeseran vibrasional tarikan
C-O dari 1610-1650 cm-1dari oksidasi heme a. Karenanya
perubahan dalam bentuk oksidasi heme a dapat diharapkan
mempunyai pengaruh elektrostatik yang signifikan
terhadap Arg-38 yang terikat dengan ikatan hydrogen ke
gugus formil, walaupun tidak teradi perubahan
kopnformasional yang disebabkan oleh system Arg-38-
formil (Fig 2A). resolusi terbaru dari struktur Sinar-X
tidak cukup untuk meneliti perubahan konformasional
yang diinduksi oleh pengaruh elektrostatik Fea. gugus
propionat heme a yang terhubung dengan ikatan hydrogen
ke air yang terperangkap (Fig 2), dapat memicu transfer
proton melewati jaringan ikatan hydrogen, juga oleh
pengaruh elektrostatik dari oksidasi Fea.
Arg-38 yang terhubung dengan ikatan hydrogen ke
gugus formil heme a, dimana molekul air dalam ruang
matriks dapat masukmelalui saluran air. Saluran di
dekat ujung formil, secara skematik diperlihatkan
dengan garis putus dalam gambar 3A. ruang yang dapat
dilalui air pada saluran, ditentukan oleh perhitungan
permukaan molekul, menunjukkan bahwa saluran memilki 4
lubang, yang masing-masing cukup besar untuk
mengandungsatu sampai tiga molekul air (fg 3B dan ruang
bertitik merah dalam Fig 3A. gugus OH dari gugus
hidrofarnesiletil dari heme a terhubung dengan ikatan
hydrogen ke Ser-382 dekat saluran airdalam bentuk
oksidasi ( Fig. 3A, struktur merah). Selama reduksi
enzim, ikatan hydrogen OH…Ser-382 diputus ,
memungkinakn gugus OH dari gugus hidroksifarnesiletil
berotasi 120 dengan pergerakan dari rantai hidrokarbon
dekat gugus OH [-CH(OH)-CH2-CH2-CH=C(CH3)-] dan
memungkinkan rotasi 110 dari gugus OH Ser-382 (Fig.3A,
struktur biru), dipasangkan dengan perubahan
konformasional dalam pergantian heliks-X yang termasuk
Ser-382, Leu-381 dan Val-380 (Fig.3A, struktur asam
amino merah dan biru dlam Heliks-X). perubahan
kondformasiional ini menyebabkan terbentuknya lubang
baru antara gugus hidroksi farnesiletil dan Heliks-X
(Fig 3A, ruang bertitik biru dengan ruang yang tidak
ertitik merah dan Fig. 3B, oval biru). Perubahan
konformasional diatur olehbentuk oksidasi heme a
karena ikatan hydrogen OH…Ser-382 yang berlokasi dekat
system electron- forfirin heme a. posisi dan ukuran
empat lubang yang teramati dalam bentuk teroksidasi
tidak dipengaruhi secara signifikan selama reduksi
(Fig.3 ruang bertitik biru dan merah). Perubahan
konformasional redoks yang dipasngkan menunjukkan
perubahan kapasitas air dalam saluran, yang sepertinya
memberikan kontribusi terhadap kumpulan proton efektif
dari ruang matriks ke Arg-38.
Gambar 3A Struktur Sinar-X dari saluran air jalur H.perubahan konformasional redoks berpasangandari saluran air. Bagian atas saluranditunjukkan. Merah dan biru menunjukkanstruktur dalam bentuk teroksidasi dantereduksi. Permukaan bertitik merah dan birumenunjukkan lubang yang dideteksi dalambentuk teroksidasi dan tereduksi. Garis putus-putus menunjukkan jalur pengubung air kelubang. Garis bertitik menunjukkan ikatanhidrogen. Bola kecil menunjukkan posisimolekul air yang terikat. His-61 terikat keFea dari sisi yang berlawanan dengan hemetidak ditunjukkan.
Gambar 3B Representasi skematik dari perubahankonformasional redoks berpasangan dalamsaluran air. Daerah yang diberi kotak disebutdaerah A. Bola hitam dan biru menunjukkanmolekul air yang terikat. Struktur yangteramati hanya pada bentuk tereduksi yaituoleh warna biru.
4.3 Analisis FTIR Dari Perubahan Konformasi ReaksiRedoks Yang Berpasangan
FTIR digunakan untuk mengidentifikasi sisi logam
redoks-aktif yang mengatur konformasi Asp-51. Berbeda
dengan spektrum FTIR dari keadaan teroksidasi, enzim
keadaan tereduksi pada H2O, Asp-51 memberikan puncak
pada 1,738 cm-1 dan 1,585 cm-1, yang memberikan bukti
adanya uluran COO model dari COOH dan COO. Perbedaan
spektra pada redoks dengan adanya sianida dan CO yang
juga memberikan pita yang identik pada 1,738 cm-1 dan
1,585 cm-1. sianida menstabilkan heme a3 pada keadaan
teroksidasi. Jadi enzim tereduksi dengan adanya sianida
yang dimiliki oleh heme a3, CuA dan CuB pada keadaan
tereduksi dan heme a3 pada keadaan sianida terikat yang
berikatan. Sehingga spektrum yang berbeda antara enzim
teroksidasi pada sianida berikatan dan enzim tereduksi
yang mengikat sianida menghasilkan penjumlahan
perbedaan spektra redoks yang diinduksi oleh heme a,
CuA dan CuB. Dengan kata lain, Co menstabilkan CuB dan
heme a3 pada keadaan tereduksi memberikan spektra
redoks yang berbeda yang diinduksi oleh heme a, CuA.
Karena itu hasil ini mengindikasikan bahwa keadaan
terprotonasi dari Asp-51 dikendalikan oleh heme a dan
CuA.
Pada titrasi reduksi enzim sapi ini terdapat
sianida, dengan penurunan intensitas dua pita adalah
proporsional pada ekuivalen elektron yang ditambahkan.
Tiga elektron ekuivalen dibutuhkan untuk memenuhi
eliminasi dari dua pita pada spektrum yang berbeda.
Hasil ini mengindikasikan bahwa spektra infra
merahberubah karena single elektron ekuivalen.
Titrasi redukrif enzim sianida terikat, dimonitor
menggunakan keadaan oksidasi dari tempat logam redoks
aktif, heme a, CuA dan CuB. Sehingga jika dua atau tiga
elekron dibutuhkan untuk perubahan spektra infra merah,
maja perubahn spektra tidak akan terlihat dibawah satu
atau dua elektron secara ekuivalen. Karena itu COOH
dari Asp-51 dipisahkan selama reduksi hanya satu tempat
logam, selain heme a atau CuA.
Elektron equivalen dari sitokrom c ditransfer dari
CuA ke heme a kemudian dari heme a ke tempat reduksi
O2.jadi heme a dapat memberikan tanda sebagai tempat
kontrol logam pada konformasi Asp-51.
4.4 Mekanisme Proton-Pumping
Mekanisme keseluruhan berdasarkan hasil kesimpulan
adalah : ketika heme a berada pada keadaan teroksidasi,
Arg-38 terprotonasi pertama walaupun dibawah muatan
positif dari heme a, karena molekul air pada ruang
matriks accessible ke Arg-38 melalui terowongan
air.Asp-51 terkubur didalam protein dan terprotonasi.
Selama heme a mengalami reduksi, dimana kehilangan
muatan positif di heme a, Asp-51 keluar ke ruang
intermembran dan kapasitas terowongan air meningkat.
Karena itu molekul air akan bergerak ke ruang matriks,
ketika proton pada Asp-51 dilepaskan ke ruang
intermembran. Selama heme a mengalami oksidasi, Asp-51
bergerak ke belakang ke interior protein dan
memperlihatkan muatan positif pada heme a menurunkan
afinitas dari formil oksigen untuk membagi proton
dengan Arg-38. penurunan aktivitas promosi proton
transfer dari Arg-38 ke Asp-51. gugus propionat ikatan
hidrogen pada air juga mempercepat proton transfer
sepanjang jaringan ikatan hidrogen.
Gambar 4. Mekanisme Proton pumping yang diusulkan. Besi,porfirin dan gugus samping formil dari heme adiperlihatkandengan Fea, Pr dan OCHO.COOH pada Pr menunjukkan satu gugus propionatdari heme a.
Tanda kurung ([ ]1_and [ ]0) menunjukkanjumlah muatan dari enam koordinat heme Warnakotak yang lebih hitam menunjukkan keadaanstruktur yang stabil dan keadaan intermediet.
Panah tebal menunjukan pengaruh elektrostatikdari jumlah muatan positif heme a dan protontransfer selama heme a mengalami oksidasi. Garis putus-putus menunjukkan ikatan hidrogenyang menghubungkan Arg-38 dengan Asp-51,termasuk ikatan peptida yang menghalangireverse transfer dari sisi intermembran.
Hasil Arg-38 yang terprotonasi mengekstrak proton dari
molekul air pada terowongan air sebelum kapasitas
terowongan air menurun menjadi pemaksaan keluar OH-.
Keikutsertaan gugus formil heme a dan molekul air
disekitar proton pumping sebelumnya telah dianalisa
menggunakan resonansi raman.
KESIMPULAN
1. Mutasi Asp-51 Asn dari enzim hati memperlihatkan
fungsi pompa proton tanpa mempengaruhi aktivitas
reduksi dioksigen
2. Struktur Sinar-X (pada resolusi 1.8/1.9 Å dalam
bentuk teroksidasi dan reduksi penuh) menunjukkan
bahwa muatan positif total yang dibentuk selama
oksidasi mendorong transport proton aktif dari ruang
mitokondria ke Asp-51 melewati enzim lewat saluran
air dan jaringan ikatan hidrogen, yang berlokasi di
tandem.
3. Hasil infrared mengindikasikan bahwa konformasi Asp-
51 dikontrol hanya oleh bentuk oksidasi heme spin
rendah. Hasil ini mengindikasikan bahwa heme spin
rendah mendorong proses pompa proton.
DAFTAR PUSTAKA
Lehninger, L. 1991.Dasar-dasar Biokimia.Alih bahasa : DrMaggy Thenawidjaja. Edisi kedua.Penerbit Erlangga.Jakarta.
Michel H. 1998. The Mechanism of proton pumping bycytochrome c oxidase.PNAS 95, 12819-12824.
Tsukihara, T., Shimokata, K., Katayama, Y., Shimada H,Muromoto K, Aoyama H, Mochizuki M, Shinzawa K,Yamashita E, Yao M, Ishimura Y, Yoshikawa S.2003.The Low Spin Heme of Cytochrome c oxidase as the drivingelement of the proton pumping process.PNAS 100.15304-15309.
Yoshikawa, S., Shinzawa-Itoh, K., Nakashima, R., Yaono,R., Yamashita, E.,
Inoue, N., Yao, M., Fei, M. J., Libeu, C. P.,Mizushima, T., et al. (1998) Science 280, 1723–1729.