Post on 22-Feb-2023
UNIVERSIDADE PAULISTAINSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE BIOMEDICINA
APS – ATIVIDADE DE PRÁTICA SUPERVISIONADA
DISCIPLINA: BIOLOGIA MOLECULAR
AVANÇOS TECNOLÓGICOS EM HEMATOLOGIA LABORATORIAL E TÉCNICAS
DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS.
Nome: Beatriz Chagas e Silva Pinto
RA:B2041C-2
Camila Maira Azevedo
B51AGB-5
1
SÃO PAULO
2014
Beatriz Chagas e Camila Maira
AVANÇOS TECNOLÓGICOS EM HEMATOLOGIA LABORATORIAL E TÉCNICAS DE
BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS.
Trabalho apresentado para
avaliação na disciplina de
Biologia Molecular do curso de
Biomedicina, turno noturno da
Universidade Paulista – UNIP.
Orientador: Profº Carlos
Francischini
2
ntadoparaavaliação nadiscipli
São Paulo
2014
SUMÁRIO
RESUMO........................................................
.............................................................4
INTRODUÇÃO...................................................5
LISTA DE
TABELAS.................................................... . .6
HEMATOLOGIA
LABORATORIAL..................................................
.....................................7
AVANÇOS TECNOLÓGICOS EM HEMATOLOGIA
LABORATORIAL................. .......8
3
DIFERENCIAÇÃO CELULAR OU
CD............................................................
...... .......9
CITOCINAS.....................................................
..............................................................
...13 - 15
BIOLOGIA
MOLECULAR.....................................................
.........................................16 - 17
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS A ANÁLISES
CLÍNICAS.......17
Southern
blotting......................................................
.........................................................17 -
20
Reação em Cadeia da Polimerase –
PCR...........................................................
...............20 - 25
Hibridização "in situ" por fluorescência –
FISH..........................................................
.....25 - 26
USO DA GENOTIPAGEM DE GRUPOS SANGUÍNEOS NA ELUCIDAÇÃO DE CASOS
INCONCLUSIVOS NA FENOTIPAGEM
ERITROCITÁRIA...............................................27
APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR EM
HEMATOLOGIA ................................28
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS EM HEMOTERAPIA E
BANCO DE
4
SANGUE................................................................................................................28
- 30
CONSIDERAÇÕES
FINAIS........................................................
................................... 31 - 32
REFERÊNCIAS...................................................
............................................................
33 - 34
REFERÊNCIAS
ELETRÔNICAS...................................................
........................................35
RESUMO
Durante as últimas décadas observou-se uma grande evolução
tecnológica na realização de exames, e as técnicas manuais têm
sido substituídas por sistemas automatizados que apresentam maior
5
precisão nos resultados e em um menor intervalo de tempo. Essas
inovações mudaram a rotina dos laboratórios, tornando-os mais
eficientes e ágeis, além de apresentarem uma melhor qualidade nos
resultados. "A automatização assegura a confiabilidade dos testes
hematológicos em todas as fases, pois a padronização garante a
eficiência dos resultados"
A Biologia Molecular, apresenta especial preocupação com o
estudo das características genéticas passadas de geração em
geração. A chamada hereditariedade tem participação de uma série
de fatores como o DNA, os genes, cromossomos e ainda outros
fatores a serem considerados, a Biologia Molecular abre uma série
de possibilidades para tratamentos, fabricação de remédios e
ainda outras soluções para saúde. Estudar como funciona o sistema
de herança genética pode ajudar a descobrir doenças que uma
pessoa recém-nascida ou que ainda vai nascer tem mais
possibilidade de obter ao longo da vida. Sendo assim, essa pessoa
pode receber tratamento antes mesmo que a doença se manifeste ou
que a mesma seja atingida pela tal doença.
A prática das aplicações das técnicas de PCR e suas técnicas
derivadas em diagnósticos moleculares tem se mostrado de grande
efetividade, especialmente no diagnóstico de doenças cujo
diagnóstico precoce é crucial no sucesso do tratamento. A reação
de PCR constitui-se em um instrumento diagnóstico valioso,
notadamente no caso de doenças infecciosas graves, por exemplo,
devido à sua capacidade em detectar agentes infecciosos com maior
sensibilidade e especificidade ,sem necessidade de se encontrarem
parasitas viáveis na amostra biológica. A técnica de PCR
6
possibilita uma nova estratégia na análise dos genes, dispensando
todas as trabalhosas etapas de clonagem gênica. Ainda, há a
possibilidade de adaptações da técnica de PCR a fim de melhorar a
especificidade e a eficiência da reação.
Com relação ao Fish (hibridação in situ com
fluorescência) , essa técnica detecta DNA localizados dentro do
cromossomo, usa laminas de microscopia, cromossomos estão em
metáfase , anáfase e interfase , usa sondas de DNA específicos. E
sobre o Southern blot é uma técnica de biologia molecular
utilizada para conferir se uma determinada sequência de DNA
encontra-se ou não presente em uma amostra de DNA analisada. Isto
é realizado por meio de um realce da eletroforese em gel de
agarose.
INTRODUÇÃO
Os principais avanços científicos e tecnológicos são as
principais causas de mudanças na prática da Imuno-hematologia,
promovendo excepcional desenvolvimento no diagnóstico
laboratorial de diversas doenças hematológicas. O progresso
obtido através de aplicações das técnicas de biologia
molecular se tornam cada vez mais instrumentos laboratoriais
de grande definição no diagnóstico e na prevenção de doenças
hematológicas, notadamente aquelas de origem hereditária. O
crescimento das aplicações tecnológicas que resultaram na
automação dos laboratórios, além de produzir maior grau de
reprodutibilidade dos resultados de exames e rapidez nas suas
determinações, avançou para um grau de especificidade tal que7
deverá exigir dos médicos e dos profissionais de laboratórios
constantes atualizações.
O conhecimento das bases genéticas dos polimorfismos dos
grupos sanguíneos, adquirido nos últimos anos, permitiu o
desenvolvimento de diversos protocolos para deduzir o fenótipo
eritrocitário, usando técnicas de biologia molecular, com
aplicação na prática transfusional. Essas metodologias são
vantajosas, em muitos casos, em relação aos métodos
sorológicos utilizados na fenotipagem eritrocitária.
A determinação do perfil de antígenos eritrocitários em
doadores de sangue e pacientes que recebem transfusão
sanguínea é importante na prevenção de aloimunização.
Pacientes recentemente transfundidos ou com anemia hemolítica
autoimune nem sempre conseguem ser fenotipados, e para estes
casos a genotipagem vem se apresentando como uma ferramenta
auxiliar na tipagem sanguínea.
O uso da genotipagem também mostrou-se útil na identificação de
anticorpos irregulares. Por sua precisão, facilidade de execução e
viabilidade de custo, as técnicas para tipagem de DNA para sistemas
sanguíneos vêm sendo usadas na prática transfusional, contribuindo
para aumento da segurança dos pacientes cronicamente transfundidos
ou com anemia hemolítica autoimune, como, por exemplo, pacientes com
anemia falciforme. Além disso, ela vem permitindo o melhor uso de
unidades de sangue com fenótipos menos frequentes na nossa população
de doadores de sangue.
8
LISTA DE TABELAS
TABELA 1- Relação entre alguns antígenos CD, células e
funções...........................10
TABELA 2- Relação entre determinantes celulares - CD e
subpopulações de células
identificadas.................................................
..............................................................
.11
TABELA 3- Marcadores usados para auxiliar o diagnóstico das
leucemias agudas e
crônicas......................................................
..............................................................
..12
TABELA 4- Síntese e ação das
Interleucinas.................................................
..........14
9
HEMATOLOGIA LABORATORIAL
O Serviço de Hematologia Laboratorial é composto por duas
áreas distintas que se complementam, a área da morfologia
hematológica e a área da citometria de fluxo, cuja missão é a
realização de análises na área Laboratorial, incluídas nos
meios complementares de diagnóstico e terapêutica. Estas
tarefas são efetuadas segundo o estado de arte e em tempo
útil e adequado, tendo como destinatários todos os doentes em
regime de internamento e/ou ambulatório que estão em
tratamento da sua patologia oncológica.( 28)
10
Apesar dos avanços científicos e da sofisticação da
tecnologia laboratorial, o diagnóstico das doenças
hematológicas depende quase exclusivamente da correlação entre
a clínica e os aspectos morfológicos no esfregaço de sangue
periférico.
Na Unidade de Hematologia Laboratorial é efectuada a
análise qualitativa e quantitativa dos elementos figurados do
sangue (hemograma e medulograma), velocidade de sedimentação
eritrocitária, o estudo de populações linfocitárias e a
pesquisa e identificação de Malária (citometria e métodos
imunológicos) bem como de outras parasitoses do sangue e
medula, através da aplicação e desenvolvimento da tecnologia
disponível.
Todos os pedidos são, obrigatoriamente, acompanhados de
informação clínica que é correlacionada com os parâmetros
hematológicos, sendo a sua execução técnica e interpretação
efetuada por pessoal com formação específica e experiente.
Os estudos morfológicos das amostras de medula óssea são
efetuados pelo Hematologista responsável pelo doente.( 29)
11
AVANÇOS TECNOLÓGICOS EM HEMATOLOGIA LABORATORIAL
Os principais avanços científicos e tecnológicos são as
principais causas de mudanças na prática da moderna
hematologia, influindo especialmente no diagnóstico
laboratorial e nos procedimentos terapêuticos de algumas
patologias com destaques para anemia falciforme, hemofilias e
leucemias. O progresso obtido pela imunologia tem alavancado o
desenvolvimento do diagnóstico laboratorial de diversas
doenças hematológicas mielo e linfoproliferativas, bem como
determinando especificidades da fisiologia leucocitária diante
das toxicidades de proveniências bacterianas e virais. Essas
conquistas ultrapassaram as fronteiras das aplicações
laboratoriais e forneceram conhecimentos importantes nos
procedimentos terapêuticos (1, 5, 8).
O crescimento das aplicações tecnológicas que resultaram
na automação dos laboratórios, além de produzir maior grau de
reprodutibilidade dos resultados de exames e rapidez nas suas
determinações, avançou para um grau de especificidade tal que
deverá exigir dos médicos e dos profissionais de laboratórios
constantes atualizações. Os exemplos mais recentes se baseiam
na moderna imunohematologia direcionada à diferenciação das
células, em especial dos leucócitos, por meio da identificação
12
de seus antígenos conhecidos por "cluster of differentiation"
ou CD, bem como da caracterização funcional das citocinas. Por
outro lado, a biologia molecular se torna cada vez mais um
instrumento laboratorial de grande definição (9).
DIFERENCIAÇÃO CELULAR OU CD
Todas as células possuem em suas composições estruturais
de membranas proteínas específicas capazes de serem
reconhecidas por anticorpos sintetizados em laboratórios –
os anticorpos monoclonais. Para os anticorpos monoclonais as
proteínas de membrana de células blásticas, linfócitos,
monócitos, entre outras, são identificadas como "antígenos
celulares". Porém, observou-se que grupos de diferentes
anticorpos monoclonais reconheciam o mesmo antígeno celular
presente em mais de uma célula, quer fossem normais, malignas
13
ou células de linhagens evolutivas. Esses antígenos de
diferenciação celular reconhecidos por grupos de anticorpos
monoclonais foram denominados por grupo de diferenciação
celular ou CD (6, 7). Foram reconhecidos em experimentação
laboratorial perto de 170 diferentes tipos de CD, conhecidos
por CD1, CD2, CD3, CD4, etc., cujas relações entre as células
identificadas e suas funções específicas também foram
relacionadas. A tabela 1mostra a relação entre alguns
antígenos CD selecionados com distribuição celular e funções
específicas. Um dos exemplos mais conhecidos da aplicação de
marcadores CD se refere à avaliação laboratorial da
resistência imunológica em pacientes com AIDS por meio da
determinação dos linfócitos CD4 (auxiliar) e CD 8
(citotóxico). Da mesma forma, a determinação do marcador CD 34
tem sido importante na determinação da presença de células
progenitoras do sistema hematopoiético em sangue de medula
óssea (8). As figuras 1a e 1b mostram a expressão dos
antígenos de superfície durante a maturação dos linfócitos T e
B.
14
Entretanto, é com relação aos linfócitos e macrófagos que
é possível antever a importância da determinação dos CD para
diferenciar subpopulações das importantes células do nosso
sistema imunológico, conforme mostra a tabela 2 (3, 6).
16
Atualmente o uso de anticorpos monoclonais para
identificar antígenos de diferenciação celular está sendo
17
aplicado para investigar e caracterizar laboratorialmente a
maioria das leucemias agudas e crônicas de origens mielóide e
linfóide (Tabela 3)(9).
18
CITOCINAS
Citocinas é o termo genérico empregado para designar um
grupo muito extenso de moléculas envolvidas na emissão de
sinais entre as células durante o desencadeamento das
respostas imunes (figura 2). Todas as citocinas são pequenas
proteínas ou peptídeos, algumas contendo moléculas de açúcar
ligadas (glicoproteínas). As diferentes citocinas podem ser
enquadradas em diversas categorias: interferons (IFN),
interleucinas (IL), fator estimulador de colônias (CSF), fator
de necrose tumoral (TNFa e TNFb), e fator de transformação de
crescimento (TGF b).
Os interferons são moléculas proteicas particularmente
importantes na limitação da propagação de determinadas
infecções virais. Um grupo de interferons (IFN a e IFNb) é
produzido por células infectadas por vírus, e um outro grupo
(IFN g) é sintetizado por determinadas células ou linfócitos T
ativados. Os interferons induzem um estado de resistência
antiviral em células teciduais não infectadas. Os IFN são
produzidos na fase inicial da infecção e constituem a primeira
linha de resistência a muitas viroses (3, 4).
As interleucinas compõem um grande grupo de citocinas
denominadas por IL-1 a IL-15, produzidas principalmente por
células T, embora algumas sejam sintetizadas também por
macrófagos e células teciduais. As interleucinas possuem uma
19
variedade de funções, mas a maioria delas está envolvida na
indução da divisão de outras células. Cada interleucina atua
sobre um grupo limitado e específico de células que expressam
receptores adequados para cada interleucina (tabela 4). É
importante destacar que a hematopoiese é regulada por mais de
uma interleucina. As IL-1 e IL-6 estão envolvidas na ativação
do ciclo celular das células-tronco em repouso (ou
autorenováveis). A IL-3 está envolvida no crescimento dos
precursores das linhagens hemopoiéticas da mesma forma que o
fator estimulador de colônias de granulócitos/macrófagos (GM –
CSF). Na medida em que as células se diferenciam, citocinas
específicas de linhagens apresentam atividades importantes; a
eritropoietina para os eritrócitos, o fator estimulador de
colônias de macrófagos (M – CSF) para os macrófagos, o fator
estimulador de colônias de granulócitos (G – CSF) para os
granulócitos, entre outros (1, 6).
20
Os fatores estimuladores de colônias (CSF) estão
diretamente relacionados na divisão e diferenciação das
células-tronco na medula óssea, bem como dos precursores dos
leucócitos sanguíneos. A quantidade de diferentes CSF é
parcialmente responsável pelas proporções dos diferentes tipos
celulares que serão produzidos. Alguns CSF também promovem a
diferenciação extramedular de células (3, 8).
Finalmente outras citocinas além das acima citadas, como
são os casos do fator de necrose tumoral - TNFa e TNFb e
do fator de transformação de crescimento (TGF b) que, embora
22
possuem várias funções, são particularmente importantes nas
reações inflamatórias e citotóxicas (6).
Nesse contexto específico das citocinas, o futuro da
hematologia laboratorial certamente deverá estar direcionada
na monitoração quantitativa e na determinação qualitativa das
diferentes interleucinas, bem como nas respostas às reações
fisiopatológicas causadas por processos inflamatórios e
citotóxicos(9).
BIOLOGIA MOLECULAR
A Biologia Molecular tem como campo de estudo as
interações bioquímicas celulares envolvidas na duplicação do
material genético e na síntese protéica.
É uma área intimamente ligada à genética e à bioquímica. A
Biologia Molecular consiste principalmente em estudar as
interações entre os vários sistemas da célula, partindo da
relação entre o DNA, o RNA e a síntese de proteínas, e o modo
como essas interações são reguladas.
Assim, o cerne da Biologia Molecular compreende o estudo
dos processos de replicação, transcrição e tradução do
material genético e a regulação desses processos. (30)
Ao longo da história, os estudos de como cada parte de
nosso corpo funciona têm se intensificado. Biologia, Química,
Física e outras áreas de estudo como Biofísica, Genética,
23
Bioquímica, incluem, em alguma parte de seus estudos,
pesquisas que buscam desvendar mistérios do nosso corpo.
Uma dessas áreas é a Biologia Molecular, apontada por
muitos como tendo início no ano de 1953. Apresenta especial
preocupação com o estudo das características genéticas
passadas de geração em geração. A chamada hereditariedade tem
participação de uma série de fatores como o DNA, os genes,
cromossomos e ainda outros fatores a serem considerados. A
genética também estuda esses fenômenos, a diferença fica por
conta do nível em que se trabalha: a genética faz análises em
nível celular, por isso o nome biologia celular; enquanto a
Biologia Molecular, como o próprio nome fala, estuda esses
acontecimentos em nível molecular.
Essa área é, relativamente, nova. Antes, já havia outras
ciências que já trabalham com seu material de estudo, talvez
por isso, a Biologia Molecular esteja intimamente ligada a
outras áreas. Sua história se mistura com a de outras ciências
e mesmo hoje sua atuação tem a cooperação de ciências como
Bioquímica, Genética e outras.
Com a possibilidade de estudar essas características em
condições mais aprofundadas, a Biologia Molecular abre uma
série de possibilidades para tratamentos, fabricação de
remédios e ainda outras soluções para saúde. Estudar como
funciona o sistema de herança genética pode ajudar a descobrir
doenças que uma pessoa recém-nascida ou que ainda vai nascer
24
tem mais possibilidade de obter ao longo da vida. Sendo assim,
essa pessoa pode receber tratamento antes mesmo que a doença
se manifeste ou que a mesma seja atingida pela tal doença.
Pelo grande potencial que tem, a Biologia Molecular é uma
área vista como promissora num cenário científico de
tradicionais campos de pesquisas. Além do mais, qualquer
estudo que busque entender o funcionamento do corpo é válido e
merece atenção. (31)
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS EM ANÁLISES CLÍNICAS
A aplicação cada vez mais abrangente de técnicas de
biologia molecular em análises clínicas pode ser resumida por
meio do uso de três métodos cientificamente aprovados para
este fim: "Southern blotting", Reação em Cadeia da Polimerase
ou PCR, e Hibridização "In Situ" por Fluorescência ou FISH.
Southern blotting
Nesta metodologia, o DNA é extraído de células e tratado
com enzimas que rompem as ligações químicas entre determinadas
bases nitrogenadas da molécula de DNA. Essas enzimas,
extraídas de bactérias, são conhecidas por endonucleases de
restrição. Os fragmentos da molécula de DNA resultantes do
tratamento enzimático são separados (ou fracionados)
eletroforeticamente. Entretanto, a separação dos fragmentos de
DNA somente poderá ser revelada por meio das suas impressões
25
extraídas do gel de agarose da eletroforese para uma membrana
de náilon ou de nitrocelulose, como se fosse um "mata borrão"
ou "blotting" (em inglês) e reveladas por sondas radioativas.
Essa técnica foi descrita pelo pesquisador E. M. Southern em
1975, surgindo daí o "Southern blotting". O grande problema
atual deste método é o tempo consumido para a revelação dos
resultados que chega a ser de aproximadamente uma semana (1,
2, 5).
Southern blotting é então, a transferência de DNA
desnaturado de um gel de agarose para uma membrana (em geral
de nylon ou material semelhante), onde ele poderá ser
analisado com o uso de uma sonda de DNA ou de RNA.
As figuras abaixo resumem o processo que vai desde a
separação eletroforética do DNA fragmentado até a visualização
das bandas (fragmentos) reativos com a sonda.
Inicialmente o processo pede que o DNA do organismo em
estudo seja quebrado em pedaços que possam migrar na
eletroforese, isto pode ser feito mecanicamente (por
nebulização, por exemplo), ou com o uso de enzimas de
restrição).
O resultado será sempre um conjunto muito grande de
fragmentos com tamanhos diferentes, que formarão uma faixa
(mancha de arraste) borrada no gel, quando tentamos verificar
o resultado da corrida eletroforética. Em geral empregamos um
26
gel de agarose para isto. A cuba é horizontal e as amostras
são aplicadas em pequenos poços moldados no gel antes que ele
endureça com o auxílio de um pente adequado. Os fragmentos de
DNA, normalmente negativos, vão correr para o pólo positivo
(veja figura 1).
Figura 1: O gel de agarose (em vermelho) vai separar os fragmentos de DNA
aproximadamente de acordo com seus tamanhos. Ao ser aplicado um campo
elétrico entre um lado e o outro do gel, as amostras vão atravessar o gel.
Após a eletroforese o DNA é desnaturado (através da adição de NaOH ou de
outros produtos químicos adequados); o uso de um tampão 3M NaCl estabiliza
a desnaturação.
Uma vez separados os fragmentos e desnaturados com NaOH,
eles serão transferidos para uma membrana de nylon através de
um sistema baseado no arraste hidrodinâmico capilar,
exatamente da mesma forma como a tinta é absorvida por um
27
papel mata-borrão. Este processo é o blot, propriamente dito,
e está ilustrado na figura abaixo.
Figura 2: O gel é colocado sobre um papel de filtro Whatman, cujas pontas
estão imersas em tampão citrato/ NaCl 3M (chamado tampão de transferência).
Sobre o gel coloca-se a membrana de nylon e sobre ela uma pilha de papel
absorvente comum (papel toalha, por exemplo). Por fim coloca-se uma placa
de plástico resistente e um peso sobre tudo. O tampão que está em baixo do
gel será chupado por capilaridade através da membrana de nylon (que é
porosa) para a pilha de papel absorvente. Este movimento de líquido
transfere mecanicamente o DNA que está no gel para o filtro. A membrana de
nylon adere o DNA.
Por fim, o DNA na membrana tem que ser "sondado". Para tal
a membrana deve ser seca e o DNA fortemente ligado ao nylon, o
que é obtido com a exposição do material ao UV. Em seguida
coloca-se a membrana num saco para congelamento contendo a
solução de hibridização e a sonda marcada. Após várias horas
ou dias a membrana, já com a sonda aderida às regiões com
complementariedade, é retirada, lavada extensivamente e
cuidadosamente colocada em contato com um filme próprio (que
será exposto pela marcação da sonda: se a sonda for radiativa,
por exemplo, será um filme de raio X). Por fim, o filme é
28
retirado, revelado e as bandas observadas indicarão aa
posições no gel onde houve reconhecimento de sequências pelas
sonda.
Figura 3: Revelação do Southern blot. A membrana seca e com o DNA já
submetido ao cross linking com a membrana é colocada para hibridizar com a
sonda a -80 oC. Em seguida ela é acondicionada num cassete junto com o
filme que deve ser sensível à marcação da sonda e por fim o filme é
revelado.( 32) Reação em Cadeia da Polimerase – PCR
O processo de PCR foi descrito por Kary Mullis no final da
década de 1980, tendo-lhe sido posteriormente, em 1993,
atribuído o Prêmio Nobel de Química pelo seu trabalho. Em
29
1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporationpatentearam
este processo.
Princípios da Reação de PCR
A reação de polimerização em cadeia (“Polimerase chain
reaction”, PCR) é a técnica que permite a amplificação do DNA
ou cDNA in vitro, utilizando-se basicamente de uma reação
enzimática catalizada pela polimerase (enzima termoestável)
cuja atividade depende de ions Mg++
Ocorre em 3 etapas:
I) “Melting”(ou desnaturação que consiste na separação da
dupla fita do DNA a ser amplificado). Inicialmente é
necessário que as duas fitas de DNA a ser amplificado sejam
separadas. A elevação da temperatura entre 90 a 95 ºC promove
a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples. Muitas
vezes a temperatura de desnaturação é determinada
empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de
guanina e citosina (GC) do fragmento DNA alvo ou de interesse.
30
II) “annealing”( anelamento ou hibridização- ligação do
iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado). A polimerase
para anexar as bases complementares, transformando as fitas
simples em fitas duplas, necessita de um fragmento de DNA já
ligado na região previamente escolhida. Para isso adicionam-
se, à solução, os “primers” ou iniciadores que são pequenos
fragmentos sintéticos de DNA de fita simples,
oligonucleotídeos de 20 a 30 bases nitrogenadas de
comprimento, que são sintetizados in vitro baseado na
sequência do DNA a ser amplificado sendo eles complementares à
seqüência do segmento de DNA de interesse. Nas duas fitas
surgem, assim, um pequeno fragmento de DNA de dupla fita
intacta. A hibridização dos “primers” descrito como
“Annealing” (do inglês), deve ser feito a uma tempertura
inferior à da desnaturação (45 a 70°C).
31
III) “extension” (extensão ou seja a polimerização
propriamente dita). Quando os '' primers'' encontram e ligam-
se aos segmentos complementares, a DNA-Polimerase liga aos
nucleotídeos entre si, completando assim as fitas simples e
tornando-as duplas (extensão) A DNA-Polimerase não reconhece
apenas o bloco de início como também consegue diferenciar as
duas extremidades dos ''primers'' (3' e 5'). Ela inicia a
reação sempre pela extremidade 3’ do “primer”, completando a
fita simples daí em diante, portanto, sempre na direção do
fragmento procurado.
32
Automação da PCR
Um aparelho de PCR, ou um termociclador, repete o
correspondente a programa de temperaturas. O operador deve
apenas programar e dar início para que transcorra a
amplificação. Técnicamente muitas mudanças tem sido
introduzidas melhorando cada vez mais e ampliando a sua
utilização. Para cada situação experimental, novas
modificações têm de ser introduzidas, de tal forma que é
muito difícil descrever um único procedimento para um uso
generalizado. Por outro lado, é fundamental o conhecimento
33
básico das etapas envolvidas na técnica, para um desenho
experimental com sucesso.
Após cada ciclo, o número de fragmentos se duplica: de um
formando-se 2, e então novamente 4, 8, 16, 32, 64, 128... de
tal forma que pode ser definida matematicamente por:
N = número de moléculas amplificadas
No = número de moléculas iniciais
n = número de ciclos de amplificação
Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a partir dos
primers serve como molde para a síntese de uma nova fita. Isso
garante o aumento exponencial do
número de novas fitas.
Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR tem a
sequência dos primers na extremidade 5’ e a sequência
complementar aos primers na posição 3’.( 33)
34
O advento do PCR revolucionou a tecnologia molecular em
muitas especialidades médicas. Seu uso laboratorial teve
grande progresso devido à simplicidade técnica e à rapidez em
se obter os resultados. A técnica do PCR é um processo rápido
de replicação seletiva de um determinado trecho do DNA
genômico "in vitro". A replicação se faz por etapas, tal como
se segue:
a) Após a extração do DNA seleciona-se o trecho que se
deseja reproduzir ou amplificar até obter a quantidade
suficiente para análise;
35
b) Com drogas específicas desnatura-se a dupla hélice do
DNA, separando-a em duas fitas simples e correspondentes de
bases nitrogenadas;
c) Com o uso da DNA polimerase (obtido da bactéria Thermus
aquaticus – Taq polimerase) submetida a condições específicas de
tempo e temperatura (ou ciclos), cada fita simples se duplica
em duas novas moléculas de DNA; e este processo é repetido em
número suficiente de vezes para obter a quantidade necessária
para análise, cerca de um milhão de cópias do original.
Os produtos obtidos pela técnica do PCR podem ser
analisados por várias técnicas suplementares das quais a mais
comum é a eletroforese em gel de agarose. Uma variação do PCR
é o PCR-transcriptase reversa ou RT-PCR, que usa o RNA
extraído da amostra que se deseja analisar e dele se faz
cópias de DNA. O DNA copiado é posteriormente replicado
conforme exposição acima. O RT-PCR é particularmente usado
para análises de translocações cromossômicas (5).
36
Hibridização "in situ" por fluorescência – FISH
Esse método molecular usa sondas fluorescentes para
observar genes ou sequências de DNA em cromossomos.
Seres humanos normalmente têm 23 pares de cromossomos: 22
pares independentes do sexo (autossomos) e um par de
cromossomos sexuais (XX em mulheres e XY em homens). Os
cromossomos contêm DNA (ácido desoxirribonucleico) e proteínas
associadas. O DNA é uma sequência de quatro bases que se
repetem formando milhares de genes que dirigem a produção de
proteínas no corpo e determinam nossas características
físicas. Contem duas cadeias complementares que formam uma
hélice dupla, como uma escada em espiral.
37
No método FISH, uma amostra de células da pessoa é fixada
em uma lâmina de vidro, incluindo células do sangue, da medula
óssea, do líquido amniótico ou de tumores, dependendo da
indicação do exame. As lâminas são, então, aquecidas para
separar as duas cadeias do DNA das células. Sondas
fluorescentes que contêm sequências de DNA complementares à
que se deseja observar são adicionadas e se ligarão à
sequência pretendida nas células. Quando as lâminas são
examinadas em um microscópio de fluorescência, os genes
correspondentes às sondas podem ser observados como manchas
fluorescentes brilhantes contra um fundo escuro.
Esse método é usado para mostrar a presença de um excesso
de cópias de um gene (genes duplicados ou amplificados) e
sequências que estão em falta (deleções de genes) ou se
moveram (translocação de genes). Um aumento do número de
cromossomos, como na trissomia 21, ou síndrome de Down, também
pode ser diagnosticado com esse método. Diversas sequências de
DNA podem ser investigadas na mesma lâmina usando sondas com
corantes fluorescentes de cores diferentes.( 34)
Exemplo em
Hematologia:Leucemia A Figura mostra o
método FISH usado para pesquisar
a sequência BCR-ABL na leucemia
mieloide crônica. Essa sequência
anormal é formada pela translocação de uma parte do cromossomo 22 (BCR, em
verde) com uma parte do cromossomo 9 (ABL1, em vermelho). A mancha amarela
38
(mistura de vermelho e verde) mostra o gene formado pela fusão. O achado da
sequência BCR-ABL confirma o diagnóstico de leucemia mieloide crônica e
permite prever a resposta ao medicamento imatinib.(34)
A técnica de FISH se resume na detecção de sequências
específicas de DNA ou RNA diretamente nos cromossomos de
células previamente isoladas para este fim. A análise é
realizada em microscópio por meio da geração de um sinal
brilhante e colorido nos núcleos das células em metafase e
interfase. A FISH é particularmente útil na demonstração de
monossomias ou trissomias cromossômicas, bem como nas
translocações – notadamente para a identificação da leucemia
mielóide crônica – e também na detecção de deleções e
amplificações de genes específicos (4).
USO DA GENOTIPAGEM DE GRUPOS SANGUÍNEOS NA ELUCIDAÇÃO DE CASOS
INCONCLUSIVOS NA FENOTIPAGEM ERITROCITÁRIA
Os sistemas de grupos sanguíneos são caracterizados por
antígenos na membrana eritrocitária, com características
funcionais e polimórficas definidas. Atualmente, já foram
descritos 30 sistemas de grupos sanguíneos, de acordo com a
ISBT (International Society for Blood Transfusion)(10). Na
medicina transfusional, a compatibilidade para o sistema ABO e
para o antígeno D do sistema Rh é fundamental na prevenção de
reações hemolíticas, embora seja desejável que outros
antígenos sejam compatibilizados, especialmente C, c, E, e do
sistema Rh, assim como os principais antígenos dos sistemas
Kell, Kidd, Duffy e MNS(11,12,13). O conhecimento das bases
genéticas dos polimorfismos dos grupos sanguíneos, adquirido39
nos últimos anos, permitiu o desenvolvimento de diversos
protocolos para deduzir o fenótipo eritrocitário, usando
técnicas de biologia molecular, com aplicação na prática
transfusional(14,15). Essas metodologias são vantajosas, em
muitos casos, em relação aos métodos sorológicos utilizados na
fenotipagem eritrocitária, como: identificação do risco para a
doença hemolítica do recém-nascido, determinação dos grupos
sanguíneos quando os anticorpos (reagentes) não estão
disponíveis, identificação de variantes raras, auxílio na
identificação de anticorpos irregulares e, principalmente, na
conclusão do grupo sanguíneo em pacientes que receberam
transfusão recente ou apresentam resultado positivo no teste
direto de antiglobulina humana (TAD). Na hemoterapia, a
determinação correta do grupo sanguíneo é importante não
apenas para prevenir problemas devido a transfusões
incompatíveis, mas também para permitir um melhor uso das
unidades de hemocomponentes com fenótipos menos frequentes, já
que a frequência dos grupos sanguíneos depende da etinicidade
da população(16).
40
APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR EM HEMATOLOGIA
As aplicações da tecnologia molecular em hematologia
poderão elucidar o conhecimento das alterações moleculares de
doenças, tal como ocorre atualmente na caracterização das
lesões do gene da globina beta nas talassemias do tipo beta e
na identificação dos haplótipos da Hb S. Entre as técnicas de
biologia molecular, o PCR revolucionou as tendências de
aplicabilidade da biologia molecular, não somente pela sua
simplicidade, mas pelo rápido diagnóstico de doenças
infecciosas, na detecção de doença residual mínima em diversas
malignidades hematológicas onde se conhece o defeito
molecular, e notadamente na detecção de portadores e no
diagnóstico pré-natal de hemofilias e anemias hereditárias.
Finalmente, os objetivos mais profundos das aplicações dos
conhecimentos de biologia molecular se direcionam na clonagem
e sequenciamento de genes para identificar, caracterizar e
manipular os gene responsáveis por doenças e produtos tóxicos
específicos(1,5).
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS EM HEMOTERAPIA E
BANCO DE SANGUE
O conhecimento atual sobre genética dos grupos sanguíneos
tem permitido o uso das técnicas de biologia molecular como
uma importante ferramenta na prática hemoterápica. Além da
acurácia na determinação do fenótipo eritrocitário, a
genotipagem de grupos sanguíneos pode auxiliar na
41
identificação de anticorpos irregulares, bem como na economia
de unidades de sangue de fenótipos menos freqüentes na
população. Isto pode ser exemplificado em resultados
encontrados em pacientes portadores de anemia falciforme,
cujos fenótipos RhD eram indeterminados e puderam ser
concluídos como RhD positivo por genotipagem. Estes pacientes,
que antes recebiam transfusões com hemocomponentes RhD
negativo, passaram a receber sangue RhD positivo com
segurança(10).
A eficiência dos testes moleculares na genotipagem de
grupos sanguíneos deve considerar a complexidade dos sistemas,
em relação aos polimorfismos de seus alelos. A aloimunização é
comum em pacientes politransfundidos. Embora não obrigatória
pela legislação vigente, a frequência de aloimunização pode
ser diminuída com o uso da fenotipagem estendida para doadores
e pacientes, que pode ser auxiliada pela genotipagem.
A genotipagem de grupos sanguíneos já vem sendo utilizada
com êxito na medicina transfusional. Atualmente, muito se tem
falado sobre novas metodologias de genotipagem, especialmente
as que permitem sua utilização em larga escala(23,24). A
esperança é que esta metodologia permita a realização da
genotipagem de grupos sanguíneos em larga escala, de forma
automatizada, rápida e segura e que possa ser utilizada nas
rotinas dos bancos de sangue(27). Estudos demonstram que mesmo
as técnicas moleculares convencionais (PCR alelo-específica e
PCR-RFLP) podem ser usadas com sucesso em um banco de sangue
de grande porte, no esclarecimento de casos em que as técnicas
42
sorológicas são ineficazes para conclusão dos resultados. O
sucesso dessa metodologia reside principalmente na ausência da
necessidade de equipamentos especializados e de alta
tecnologia, o que frequentemente inviabiliza a aplicação de
determinadas técnicas. Ao contrário, a metodologia empregada
necessita apenas de equipamentos e insumos básicos de biologia
molecular. Além disso, os custos não são elevados, o que
permite seu uso rotineiro como metodologia auxiliar na
hemoterapia(10).
A utilização das ferramentas de biologia molecular tem
sido fundamental para a inserção de novas metodologias na
rotina laboratorial da Imuno-hematologia, aumentando a
segurança e eficácia transfusional de pacientes
politransfundidos. Isto pode ser facilmente visualizado
durante os procedimentos de genotipagem de grupos sanguíneos,
onde as técnicas moleculares suprem as deficiências das
técnicas de hemaglutinação, principalmente na fenotipagem de
pacientes com transfusão recente, quando há hemácias do doador
na circulação do receptor e em pacientes com autoanticorpos.
Estudos mostram que a presença de leucócitos nos produtos de
sangue transfundidos não interfere na genotipagem de grupos
sanguíneos. Assim, pacientes politransfundidos com transfusão
recente podem ser genotipados para a determinação do seu
perfil antigênico, possibilitando a utilização de transfusões
fenótipo compatível e maior segurança na investigação
sorológica e identificação do(s) anticorpo(s)(27).
43
A aplicação da biologia molecular em imuno-hematologia sem
dúvida terá um grande impacto na medicina transfusional. Os
problemas encontrados na rotina de doadores de sangue, como a
busca de hemácias antígeno-negativo e a identificação correta
de indivíduos RhD-negativo serão facilmente solucionados(27).
Na área da medicina transfusional, a possibilidade de
fornecer sangue fenótipo compatível para pacientes
politransfundidos abre uma nova perspectiva, podendo inclusive
reduzir o número de testes pré-transfusionais. Embora seja
pouco provável que a genotipagem molecular venha a substituir
totalmente a hemaglutinação nos próximos anos, estas técnicas
utilizadas em conjunto têm um valor potencial importante na
segurança transfusional e materno-fetal(27).
No Brasil, esta abordagem vem sendo introduzida aos poucos
em algumas instituições de reconhecida competência na
Hemoterapia, mas sua disponibilização deve tornar-se mais
generalizada, através da formação de centros de referência
para atendimento das diversas unidades hemoterápicas.
Mostrando que é possível implantar o aprimoramento tecnológico
para aplicação de novos métodos diagnósticos no atendimento
aos pacientes da rede SUS. Pelo nosso conhecimento, este é o
primeiro serviço público de saúde a usar técnicas de
genotipagem de grupos sangüíneos para atendimento a seus
pacientes(10).
44
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Biologia Molecular apresenta especial preocupação com o
estudo das características genéticas passadas de geração em
geração. Pelo grande potencial que tem, a Biologia Molecular é
uma área vista como promissora em um cenário científico de
tradicionais campos de pesquisas. Além do mais, qualquer
estudo que busque entender o funcionamento do corpo é válido e
merece atenção.
Das técnicas mencionadas no contexto, podemos notar que :
45
A reação em cadeia de polimerase (PCR) aumentou a acurácia
diagnóstica, mas as técnicas ainda não foram padronizadas e os
resultados variam entre os laboratórios Também tornou-se
possível determinar o genótipo do patógeno por método de
diagnóstico molecular em laboratórios clínicos, o que pode ser
útil em situações específicas. A disponibilidade de diferentes
testes viabiliza o diagnóstico precoce, minimizando o
potencial para disseminação da infecção e torna relevante a
discussão das indicações de cada teste a partir de sua
sensibilidade e especificidade.Há quase vinte anos após os
primeiros relatos do emprego da PCR para o diagnóstico
molecular terem sido publicados, tais testes ainda não foram
disponibilizados comercialmente e não são usados além do
ambiente de pesquisa. Além do custo, pode ser citada a
necessidade de sua execução em laboratórios com elevada
tecnologia e com espaço exclusivo para a sua realização, como
os principais fatores limitantes no que diz respeito ao
emprego do teste de PCR em situação ambulatorial ou
hospitalar, ou mesmo na rotina dos bancos de sangue. Diante
desta situação, existe a necessidade de padronização das
técnicas de PCR em diagnósticos por meio de mais estudos de
como devem ser os padrões-ouro, para depois ocorrer uma
padronização nas técnicas que culminem, inclusive, na sua
redução de custo, tornando-a disponível nos ambientes clínicos
e hospitalares. A FISH demonstra ser uma técnica com grande
potencialidade de uso rotineiro, pois associa agilidade de
execução, alta sensibilidade e especificidade e visualização
do agente infeccioso viável no tecido.
46
Em alguns casos, os patologistas são forçados a utilizar
métodos in situ, como a imunofluorescência , para detecção dos
micro-organismos, porém, o número de anticorpos disponíveis
comercialmente é restrito, e a aplicação desse método requer
uma suspeita etiológica prévia. A possibilidade de associar
lesões histológicas com análise molecular de genes que
abrangem domínios como “gêneros” atendem essa demanda. Outra
grande vantagem da técnica é a possibilidade de estudos
retrospectivos, pois a hibridização é feita em cortes
histológicos fixados em formalina e parafinizados, portanto,
materiais de arquivo ou museus representam um estoque único de
uma doença específica a ser confirmada.
47
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