Prinsip dan Teknik Isolasi danPurifikasi Protein

Teknik isolasi dan purifikasi

• Merupakan proses hilir dalam bioteknologi

• Tidak kurang penting dibanding proses hulu –rekayasa genetik, teknik fermentasi

• Yang diolah – produk dari proses terdahulu

• Protein – produk dari rekayasa genetika

• Yang paling banyak – isolasi / purifikasi proteindari tumbuhan, hewan, mikroorganisme

Teknik isolasi / purifikasi – dapat dalam• skala laboratorium• skala industri

Sebelum melakukan isolasi – pentingdiperhatikan sumber produk yang akandiisolasi• Hewan• Tumbuhan• Mikroorganisme

< tahun 1970 an – digunakan sumber dari• hewan

- tripsin, lipase, rennin- mahal, sumber terbatas

• tumbuhan- papain, bromelain, amilase, lipoksigenase- dipengaruhi cuaca, politik

Sumber dari mikroorganisme- banyak digunakan setelah perkembangan

teknologi fermentasi- relatif lebih murah

ISOLASI

Metode isolasi tergantung• Sumber produk• Skala produksi (lab / industri)• Stabilitas produk• Bentuk murni / tidak murni

Proses isolasi dimulai dengan mengetahui letak / lokasiproduk yang akan disolasi• Intrasel• Ekstrasel• Terikat membran

• Protein larut intrasel dari tumbuhan –teknik isolasi tidak rumit – karena jaringanlunak, mudah dihancurkan dengan tissuehomogenizer

• Protein intrasel dari mikroorganisme –lebih liat – perlu metode lebih kuat

• Protein terikat membran – masalahtersendiri – tidak tergantung sumber

Metode penghancuran (lisis) sel

1. Abrasif- dengan blender laboratorium dengan butiran gelas(glass beads)

2. Liquid shear- suspensi sel dilewatkan dengan tekanan tinggi melalui

lubang kecil ke dalam ruang dengan tekanan atmosfir- karena perbedaan tekanan mendadak – sel pecah- untuk dinding sel bakteri yang tidak terlalu keras –misal bakteri Gram negatif

3. Osmotic shock- sel disuspensikan di dalam akuades / larutan hipotoniksehingga sel lisis

- protein dilepaskan dari sel yang lisis- tidak efektif untuk sel bakteri dan tumbuhan

4. Penambahan alkali- metode paling sederhana untuk melisis sel- sebagian besar sel pecah pada pH 11,5 – 12,5- protein yang diisolasi harus stabil selama 20 – 30 menitpada pH tinggi tsb

5. Penambahan deterjen.- selain lisis sel, sebagian besar protein sel mengalamidenaturasi

- untuk isolasi protein terikat membran

6. Solid shear- dengan membekukan sel - 20oC, dipaksa melalui lubangkecil pada tekanan tinggi

7. Penambahan lisozim dan EDTA- cocok untuk skala kecil karena mahal- efektif untuk sel bakteri

8. Pelarut organik- toluen dan aseton – untuk melisis berbagai sel- tidak untuk skala besar – toksik, mahal, mudah terbakar

9. Sonikasi- lisis sel dengan getaran ultrasonik- untuk skala kecil

PURIFIKASI (PROTEIN)

Pada waktu lisis sel – seluruh isi sel keluar –banyak kontaminan oleh karena itu harusdisingkirkan, antara lain asam nukleat

Asam nukleat – meyebabkan viskositastinggi – pada tahap awal harus disingkirkan• Presipitasi – penambahan polikation BM

(protamin, streptomisin, polietileneimin) – mahal• Digesti – dengan nuklease – mudah, murah

Setelah asam nukleat disingkirkan – sisa selyang tidak larut (dinding sel, proteinmembran, bagian sel yang hancur) harusdisingkirkan dengan• Sentrifugasi – sangat baik untuk solid

yang bersifat licin (slimmy or gelatinoussolids)

• Filtrasi

Sentrifugasi• Kecepatan mulai 100 x g sampai 600.000

xg• Dapat memisahkan organel sel

berdasarkan massa dan densitasnya- 3000 g = sel dan nukleus- 12.000 g = mitokondria / kloroplas- 100.000 g = mikrosom, ribosom

Penyingkiran asam nukleat + debris sel (=presipitat, pelet) - menghasilkan supernatanyang mengandung

- protein yang diinginkan- kontaminan (protein yang tidak diinginkan,

molekul organik dan inorganik)

Penyingkiran kontaminan – presipitasi dengan

• Amonium sulfat dengan berbagai konsentrasi- protein yang tidak diinginkan diendapkan terlebih

dahulu, baru protein yang diinginkan diendapkandengan konsentrasi yang lebih tinggi

- paling banyak digunakan- pada skala besar – masalah penanganan danpembuangan – korosif

• Natrium sulfat- tidak bersifat korosif- kelarutan rendah, perlu suhu > 35 oC untuk fraksinasi

• Pelarut organik- skala lab, jarang skala industri karena mudahterbakar

• Polimer- polietilen glikol (PEG)

- tidak toksik- tidak mudah terbakar- penggunaan terbatas karena meningkatkanviskositas larutan

- polyacrylic acid- non toksik

• Presipitasi pada titik isoelektrik (pI)

Lisis sel

sentrifugasi

presipitat

kontaminan

supernatan

Am. sulfat

presipitat

supernatan presipitat

supernatanAm. sulfat

Fraksinasi

Pemisahan selanjutnya (fraksinasi) – melibatkan 3komponen

1. Fasa solid / stasioner- berupa film, kolom, gel atau membran

2. Pelarut- fasa mobil pada kromatografi

3. Solut- molekul yang harus dipisahkan

Teknik

Dialisis

Filtrasi gel

Krom. Adsorpsi

Krom. Partisi

Krom. Pertkrion

Krom. Afinitas

Elektr sel. Aset

PAGE

Dasar pemisahan

Uk / btk molekul

Uk / btk molekul

Adsorpsi

Solubilitas

Ionisasi

Interaksi ligan

Muatan listrik

Muatan listr + uk mol

Fasa solid

Gel

Adsorben

Innert support

Mtrks + ggsterionisasiMatriks + ligan

Innert support

Innert supportberpori

Pelarut

Mbr semipermabel Air

Bufer

Nonpolar

Polar – nonpolar

Bufer

Bufer

Bufer

Bufer

Pada dasarnya pemisahan molekul protein dapat berdasarkan

SifatMuatan

Polaritas

Ukuran molekul

Spesifisitas

Prosedur- kromatografi pertukaran ion- elektroforesis

- kromatografi adsorpsi- kromatografi kertas

- dialisis dan ultrafiltrasi- gel elektroforesis- kromatografi gel filtrasi- ultrasentrifugasi

- kromatografi afinitas

Dialisis• Untuk memisahkan protein (molekul besar) dari garam

(molekul kecil) dan kontaminan berukuran kecil

• Protein dimasukkan ke dalam kantong selofan yang berporikecil

• Kantong dimasukkan ke dalam wadah yang mengandungakuades / bufer, sambil di putar dengan pemutar magnetiksemalaman dengan penggantian akuades / bufer beberapakali dalam wadah

• Pori memungkinkan molekul kecil berdifusi keluar, molekulbesar tertahan di dalam kantong

• Dapat untuk memekatkan larutan – dengan meletakkankantong dialisis dalam polimer desikan , misal polietilen glikol

Dialisisis

Kantong selofanberisi larutan yangakan dimurnikan

Magnetic stirrer

Kromatografi

Pemisahan molekul berdasarkan perbedaanstruktur dan atau sifat fisik pada saat berinteraksidengan• fasa mobil• fasa stasioner (matriks)

- kertas saring ( krom. kertas)- lapis tipis selulosa / silika / alumina –

kromatografi lapis tipis

Kromatografi Kertas

• Beberapa tetes larutan yang mengandung komponenyang akan dipisahkan diteteskan pada sepotong kertas –dibiarkan kering

• Ujung kertas dicelupkan ke dalam pelarut yang terdiridari campuran pelarut polar dan nonpolar

• Komponen polar akan terikat pada kertas membentukfasa stasioner, sedangkan komponen nonpolar bergerakmembentuk fasa mobil

• Berbagai komponen dalam larutan akan terpisahkanberdasarkan perbedaan kelarutan dalam fasa stasioneratau fasa mobil – koefisien partisi

• Setelah bergerak dalam jarak tertentu –kromatogram diangkat dan dikeringkan

• Dideteksi dengan- radioaktif- sinar UV- pewarnaan dengan zat warna

• Kecepatan migrasi – Rf (rate of fractionation)– perbandingan jarak yang ditempuh solutdengan jarak yang ditempuh solven

Kromatografikertas - duadimensi

Kromatografi kolom

• Fasa stasioner – kolom butiran kecil selulosa / akrilamid/ silika

• Fasa stasioner berinteraksi dengan protein berdasarkan- muatan- interaksi hidrofobik- interaksi ligan

• Campuran protein dimasukkan ke dalam kolom,kemudian di luruhkan dengan fasa mobil (eluen)

• Fasa mobil yang keluar (eluat) ditampung dalam fraksi-fraksi dengan volume tertentu

Matriks yang digunakan

••••••

Cross-linked dextran (Sephadex)Agarosa (Sepharose, Biogel)Cross-linked agarosa (Sepharose CL)Poliakrilamid (Biogel P)Porous glass (Bio-glass)Polistiren (Bio-beads)

Kromatografi kolom

Kromatografi kolom

Kromatografi Partisi

• Pemisahan dengan kromatografi kolom berdasarkanafinitas relatif berbagai protein terhadap fasa mobil danfasa stasioner

• Protein yang lebih kuat berinteraksi dengan matriks akantertahan

• Lamanya waktu protein berinteraksi dengan matrikstergantung dari komposisi fasa stasioner dan fasa mobil

• Pemisahan protein optimal – diperoleh denganmanipulasi komposisi fasa stasioner dan mobil

Kromatografi Berdasarkan Ukuran Molekul(Filtrasi Gel, Size Exclusion Chromatography)

• Pemisahan protein berdasarkan perbedaan ukuranmolekul dan melewatkannya melalui kolom gel yangtelah mengembang

• Yang paling banyak dipakai – Sephadex – partikel kecilhidrofilik, tidak larut karena cross-linking dekstranmembentuk jaringan 3 dimensi

• Molekul >> keluar lebih dahulu, molekul << tertahankarena masuk ke dalam butiran gel

• = Molecular sieving

• Dapat memperkirakan BM suatu sampel

Size exclusionchromatography

Size exclusionchromatography

Size exclusion chromatography

Kromatografi adsorpsi

• Teknik kromatografi paling tua – I x digunakan olehTswett untuk memisahkan pigmen tumbuhan

• Senyawa diadsorpsi ke dalam kolom – terjadikeseimbangan antara molekul yang terikat pada matriksdengan yang terdapat di dalam pelarut

• Derajat pengikatan ditentukan oleh muatan, ikatan vander Waals, interaksi ionik, ikatan hidrogen, struktursenyawa yang dipisahkan

• Adsorben – alumina, kieselguhr, sukrosa, silika gel

• Eluen – kloroform, heksan, etil eter, campuran pelarutorganik

Kromatografi pertukaran ion

• >> digunakan untuk purifikasi protein, molekul kecil

• Matriks – bahan inert dengan gugus terionisasi – DEAEselulosa, CM selulosa

• Atom N dari DEAE pada pH < 9 – mengikat molekulbermuatan negatif – disebut penukar anion (anionexchanger)

• CM selulosa – penukar kation (cathion exchanger)

• Peluruhan protein – berdasarkan muatan ataukonsentrasi garam dalam bufer

• Penting diperhatikan – resin yang dipakai, pH, ionicstrength larutan bufer

Kromatografi afinitas

• Ligan – terikat secara kovalen pada matriks porous yanginert

• Ligan- spesifik – substrat, analog, inhibitor- umum – AMP, hidrokarbon, zat warna

• Dalam skala besar jarang digunakan – mahal,keterbatasan kapasitas, tidak stabil

• Resolusi tinggi, proses purifikasi berlangsung cepat

Kromatografi afinitas

Kromatografi afinitas

Kromatografi lapis tipis

• Pemisahan senyawa pada lempeng tipis

• Dasar – adsorpsi, pertukaran ion, partisi, filtrasi gel

• Berlangsung cepat

• Dapat memisahkan beberapa pemisahan sekaligus

• Bercak yang timbul diwarnai dengan pewarnaan tertentu– diukur kadarnya secara spektrofotometri

Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

• Separasi berdasarkan – adsorpsi, pertukaran ion ataufiltrasi

• Sampel diuapkan dan dimasukkan ke dalam kolomdengan tekanan tinggi (sp 5000 psi)

• Eluat dideteksi dengan mengukur serapan padagelombang UV

• Resolusi tinggi, cepat, sensitivitas >> - dapat mengukursampai ng

• Sering digunakan untuk steroid, vitamin

Prinsip HPLC

Elektroforesis

• Merupakan teknik pemisahan protein yang paling seringdigunakan di lab

• Berdasarkan pergerakan molekul bermuatan dalammedan listrik

• Pada pH > pI, protein bermuatan negatif – bergerak keanoda; pada pH < pI, protein bermuatan positif – bergerakke katoda; pada pH = pI, protein tidak bergerak

• Matriks yang digunakan – membran selulosa asetat,starch gel, akrilamid, agarosa

Elektroforesis

SDS-PAGE (Polyacrylamide GelElectrophoresis)

• SDS = Sodium dodecyl sulphate

• Akrilamid berpolimerisasi dan cross-linked – membentukmatriks yang porous

• SDS – membuat protein bermuatan negatif, sehinggapemisahan terjadi berdasarkan kecepatan bergerakdalam medan listrik yang dipengaruhi oleh besar molekul

• Molekul besar lebih tertahan pergerakannya dibandingmolekul kecil

• Protein yang terpisah divisualisasi dengan zat warna –Coomassie blue

Pada tiap tahap purifikasi harus dilakukan• Pengukuran volume sampel• Penetapan kadar protein Mulai dari tahap awal sampai tahap akhir

penetapan – untuk mengetahui seberapajauh terjadi pemurnian produk

Bila pada elektroforesis diperoleh 1 puncaksetelah melalui berbagai tahap purifikasi –presipitasi, krom pertukaran ion, filtrasi gel, kromafinitas – dapat dikatakan protein telah murni

Bila mungkin – protein murni disimpan dalambentuk kristal

IDENTIFIKASI & PENGHITUNGAN KADAR PROTEINDALAM BAHAN UJI PADA TAHAP PURIFIKASI- secara spektrofotometri

- serapan pada 280 nm (sinar UV)- serapan protein setelah diwarnai dengan pewarna yangbereaksi dengan asam amino / protein- ninhidrin ( biru ) kromatografi lapis tipis- biuret (lembayung)- Bradford (biru)- fluoresamin

Dibandingkan terhadap serapan larutan standar yangdiketahui kadarnya

Untuk enzim – dihitung aktivitas danaktivitas spesifik pada setiap tahappurifikasi

• Aktivitas (Unit) enzim = jumlah proteinyang dapat mengubah 1 mol substratmenjadi produk per menit pada suhu 25oC pada pH optimum

• Aktivitas Spesifik = Unit per mg protein

Homogenat

supernatanpresipitat

Am. sulfat

Krom. Pert. Ion

Gel filtrasi

Krom. Afinitas

Vol, kdr protein, Akt, AS

Volume, kadar protein,Akt, AS

Fraksinasi

Vol, kdr protein, Akt, AS – pilih fraksi dengan AS paling

Vol, kdr protein, Akt, AS – pilih fraksi dengan AS paling

Vol, kdr protein, Akt, AS – pilih fraksi dengan AS paling

1 pita Enzim murni

Elektroforesis

Contoh purifikasi enzim X

Tahap

Homogenat

Presipitat

Krom Pert Ion

Filtrasi gel

Krom Afinitas

Vol fraksi (mL)

1.400

280

90

80

6

Prot total (mg)

10.000

3.000

400

100

3

Aktivitas (U)

100.000

96.000

80.000

60.000

45.000

Akt Spesifik(U/mg prot)

10

32

200

600

15.000

Contoh Tabel Purifikasi Enzim X