ANALISIS SENYAWA LIPID

OLEHI MADE JONI M.SC

JURUSAN FISIKA FMIPA UNIVERSITAS Padjadjaran

2007

1

ANALISIS SENYAWA LIPID

Lipid adalah senyawa organik berminyak atau berlemak yang tidak

larut dalam air, dapat diekstrak dari sel dan jaringan oleh pelarut

nonpolar, seperti kloroform dan eter. Asam lemak adalah komponen

unit pembangun pada hampir semua lipid. Asam lemak adalah asam

organik berantai panjang yang mempunyai atom karbon dari 4 sampai

24. Asam lemak memiliki gugus karboksil tunggal dan ekor

hidrokarbon nonpolar yang panjang. Hal ini membuat kebanyakan lipid

bersifat tidak larut dalam air dan tampak berminyak atau berlemak

(Lehninger 1982).

Lipid secara umum dapat dibagi ke dalam dua kelas besar, yaitu lipid

sederhana dan lipid kompleks. Yang termasuk lipid sederhana antara

lain adalah: 1) trigliserida dari lemak atau minyak seperti ester asam

lemak dan gliserol, contohnya adalah lemak babi, minyak jagung,

minyak biji kapas, dan butter, 2) lilin yang merupakan ester asam

lemak dari rantai panjang alkohol, contohnya adalah beeswax,

spermaceti, dan carnauba wax, dan 3) sterol yang didapat dari

hidrogenasi parsial atau menyeluruh fenantrena, contohnya adalah

kolesterol dan ergosterol (Scy Tech Encyclopedia 2008).

Lipid yang paling sederhana dan paling banyak mengandung asam

lemak sebagai unit penyusunnya adalah triasilgliserol, juga sering

disebut lemak, lemak netral, atau trigliserida. Jenis lipid ini merupakan

contoh lipid yang paling sering dijumpai baik pada manusia, hewan,

dan tumbuhan. Triasilgliserol adalah komponen utama dari lemak

penyimpan atau depot lemak pada sel tumbuhan dan hewan, tetapi

umumnya tidak dijumpai pada membran. Triasilgliserol adalah molekul

2

hidrofobik nonpolar, karena molekul ini tidak mengandung muatan

listrik atau gugus fungsional dengan polaritas tinggi (Lehninger 1982).

Triasilgliserol terakumulasi di dalam beberapa area, seperti jaringan

adiposa, dalam tubuh manusia dan biji tanaman, dan triasilgliserol ini

mewakili bentuk penyimpanan energi. Lipid yang lebih kompleks

berada dekat dan berhubungan dengan protein dalam membran sel dan

partikel subselular. Jaringan yang lebih aktif mengandung lipid

kompleks yang lebih banyak, contohnya adalah dalam otak, ginjal,

paru-paru, dan darah yang mengandung konsentrasi fosfatida dalam

jumlah tinggi pada mamalia (Scy Tech Encyclopedia 2008).

Terdapat berbagai macam uji yang berkaitan dengan lipid yang

meliputi analisis kualitatif maupun kuantitatif. Uji-uji kualitatif lipid

diantaranya adalah sebagai berikut:

1. Uji Kelarutan Lipid

Uji ini terdiri atas analisis kelarutan lipid maupun derivat lipid terdahap

berbagai macam pelarut. Dalam uji ini, kelarutan lipid ditentukan oleh

sifat kepolaran pelarut. Apabila lipid dilarutkan ke dalam pelarut polar

maka hasilnya lipid tersbut tidak akan larut. Hal tersebut karena lipid

memiliki sifat nonpolar sehingga hanya akan larut pada pelarut yang

sama-sama nonpolar.

3

2. Uji Akrolein

HC=O

HC + H2O

H2C

H2C-O-COOR1

HC-O-COOR2

H2C-O-COOR3

Uji kualitatif lipid lainnya adalah uji akrolein. Dalam uji ini terjadi dehidrasi gliserol dalam bentuk bebas atau dalam lemak/minyak menghasilkan aldehid akrilat atau akrolein. Menurut Scy Tech Encyclopedia (2008), uji akrolein digunakan untuk menguji keberadaan gliserin atau lemak. Ketika lemak dipanaskan setelah ditambahkan agen pendehidrasi (KHSO4) yang akan menarik air, maka bagian gliserol akan terdehidrasi ke dalam bentuk aldehid tidak jenuh atau dikenal sebagai akrolein (CH2=CHCHO) yang memiliki bau seperti lemak terbakar dan ditandai dengan asap putih. Berikut reaksi yang terjadi pada uji akrolein:

panas

KHSO4

Trigliserida Akrolein

3. Uji Ketidakjenuhan Lipid

Uji ketidakjenuhan digunakan untuk mengetahui asam lemak yang diuji

apakah termasuk asam lemak jenuh atau tidak jenuh dengan

menggunakan pereaksi Iod Hubl. Iod Hubl ini digunakan sebagai

indikator perubahan. Asam lemak yang diuji ditambah kloroform sama

banyaknya. Tabung dikocok sampai bahan larut. Setelah itu, tetes demi

tetes pereaksi Iod Hubl dimasukkan ke dalam tabung sambil dikocok

4

dan perubahan warna yang terjadi terhadap campuran diamati. Asam

lemak jenuh dapat dibedakan dari asam lemak tidak jenuh dengan cara

melihat strukturnya. Asam lemak tidak jenuh memiliki ikatan ganda

pada gugus hidrokarbonnya. Reaksi positif ketidakjenuhan asam lemak

ditandai dengan timbulnya warna merah ketika iod Hubl diteteskan ke

asam lemak, lalu warna kembali lagi ke warna awal kuning bening.

Warna merah yang kembali pudar menandakan bahwa terdapat banyak

ikatan rangkap pada rantai hidrokarbon asam lemak.

4. Uji Ketengikan

Uji kualitatif lipid lainnya adalah uji ketengikan. Dalam uji ini,

diidentifikasi lipid mana yang sudah tengik dengan yang belum tengik

yang disebabkan oleh oksidasi lipid. Minyak yang akan diuji

dicampurkan dengan HCl. Selanjutnya, sebuah kertas saring dicelupkan

ke larutan floroglusinol. Floroglusinol ini berfungsi sebagai penampak

bercak. Setelah itu, kertas digantungkan di dalam erlenmeyer yang

berisi minyak yang diuji. Serbuk CaCO3 dimasukkan ke dalam

erlenmeyer dan segera ditutup. HCl yang ditambahkan akan

menyumbangkan ion-ion hidrogennya yang dapat memecah unsur

lemak sehingga terbentuk lemak radikal bebas dan hidrogen radikal

bebas. Kedua bentuk radikal ini bersifat sangat reaktif dan pada tahap

akhir oksidasi akan dihasilkan peroksida (Syamsu 2007).

5. Uji Salkowski untuk kolesterol

Uji Salkowski merupakan uji kualitatif yang dilakukan untuk

mengidentifikasi keberadaan kolesterol. Kolesterol dilarutkan dengan

kloroform anhidrat lalu dengan volume yang sama ditambahkan asam

sulfat. Asam sulfat berfungsi sebagai pemutus ikatan ester lipid.

Apabila dalam sampel tersebut terdapat kolesterol, maka lapisan

5

kolesterol di bagian atas menjadi berwarna merah dan asam sulfat

terlihat berubah menjadi kuning dengan warna fluoresens hijau

(Pramarsh 2008).

6. Uji Lieberman Buchard

Uji Lieberman Buchard merupakan uji kuantitatif untuk kolesterol.

Prinsip uji ini adalah mengidentifikasi adanya kolesterol dengan

penambahan asam sulfat ke dalam campuran. Sebanyak 10 tetes asam

asetat dilarutkan ke dalam larutan kolesterol dan kloroform (dari

percobaan Salkowski). Setelah itu, asam sulfat pekat ditambahkan.

Tabung dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Mekanisme

yang terjadi dalam uji ini adalah ketika asam sulfat ditambahkan ke

dalam campuran yang berisi kolesterol, maka molekul air berpindah

dari gugus C3 kolesterol, kolesterol kemudian teroksidasi membentuk

3,5-kolestadiena. Produk ini dikonversi menjadi polimer yang

mengandung kromofor yang menghasilkan warna hijau. Warna hijau

ini menandakan hasil yang positif (WikiAnswers 2008). Reaksi positif

uji ini ditandai dengan adanya perubahan warna dari terbentuknya

warna pink kemudian menjadi biru-ungu dan akhirnya menjadi hijau

tua.

Uji Kuantitatif Lipid

Firestone dalam Schmidl dan Labuza (2000) dalam Fachri (2008)

menyebutkan bahwa untuk menganalisa kandungan lemak dalam

makanan dapat dilakukan dengan cara volumetris, gravimetris, dan

kromatografi. Kromatografi yang dapat dipakai seperti kromatografi

gas (CG), kromatografi lapisan tipis (TLC), kromatografi ekslusi

(SEC), kromatografi cairan (LC) dan kromatografi yang memiliki

unjuk kerja baik seperti HP-SEC dan HPLC.

6

Kromatografi gas digunakan untuk melarutkan dan menghitung lipida

seperti triasilgliserol dan turunan-turunan FAME. TLC sangat sesuai

untuk memisahkan ester kolestrol, mono, di, triacylglycerols, asam

lemak bebas, kolestrol, dan fospolipid. SEC dan HP-SEC digunakan

untuk memisahkan produk hidrolitik, oksidasi dan pemanasan lemak.

Sedangkan HPLC digunakan untuk memisahkan lipida non-volatil yang

memiliki berat molekul tinggi.

Untuk menentukan kadar lemak total dalam makanan, the Nutrition and

Labeling Education membutuhkan tahapan sebagai berikut, yaitu (1)

hidrolisis dengan asam atau basa; (2) ekstraksi dengan eter ; dan (3)

konversi asam lemak ke metil ester asam lemak (FAME) kemudian

menghitung kadar FAME dengan kromatografi gas. Artiss dkk (1988)

menentukan kandungan lipida dengan menggunakan TLC dan metode

enzimatis. Enzim yang digunakan adalah enzim hidrolase, oxidase dan

peroxidase dalam precursor chromogen. Metode ini sesuai untuk

menentukan fospolipida hewan, jaringan tissue manusia dan fluida

(Fachri 2008).

1. Metode Analisis Protein

Metode Kjeldahl

Metode Kjeldahl dalam analisis kimia adalah metode yang digunakan

untuk penentuan senyawa nitrogen secara kuantitatif dalam substansi

kimia. Metode ini dikembangkan oleh Johan Kjeldahl pada tahun 1883.

Saat ini, metode Kjeldahl digunakan untuk menentukan kandungan

pasti protein dalam makanan. Metode ini terdiri atas pemanasan

substansi dengan asam sulfat, dimana dekomposisi asam organik oleh

oksidasi akan membebaskan nitrogen yang tereduksi sebagai amonium

sulfat. Pada tahap ini kalium sulfat ditambahkan untuk meningkatkan

7

titik didih dari 169oC menjadi 189oC.Dekomposisi kimia sampel

menjadi lengkap ketika medium berubah menjadi bersih dan tidak

berwarna (sangat gelap).

Larutan kemudian disuling dengan natrium hidroksida (ditambahkan

dalam jumlah yang sedikit) yang mengubah garam amonium menjadi

amonia. Jumlah amonia yang muncul (jumlah nitrogen yang muncul

dalam sampel) ditentukan dengan cara titrasi balik. Produk akhir

kemudian dia bil dan dicampurkan bersama dengan asam borat.

Amonia bereaksi dengan asam dan setelah itu dititrasi dengan natrium

karbonat dan pH indikator yang digunakan adalah metil jingga. Metode

Kjeldahl yang berkembang saat ini sudah terotomatisasi dan

menggunakan katalis spesifik seperti merkuri oksida atau tembaga

sulfat untuk mempercepat dekomposisi. Reaksi yang terjadi adalah

sebagai berikut:

Degradasi: Protein + H2SO4 → (NH4)2SO4(aq) + CO2(g) + SO2(g) +

H2O(g)

Pembebasan amonia: (NH4)2SO4(aq) + 2NaOH → Na2SO4(aq) +

2H2O(l) +

2NH3(g)

Perolehan amonia: B(OH)3 + H2O + NH3 → NH4+ + B(OH)4

–

Titrasi Balik: B(OH)3 + H2O + Na2CO3 → NaHCO3(aq) +

NaB(OH)4(aq) + CO2(g) + H2O

Bromokresol

Bromokresol hijau adalah pencelup yang tergolong ke dalam

triarilmetana dan sering digunakan sebagai indikator pH dan pewarna

bagi jejak DNA pada elektroforesis gel agarose. Bromokresol dapat

digunakan dalam bentuk asam bebas (padatan coklat cerah) atau dalam

8

bentuk garam natrium (padatan hijau tua). Dalam larutan, kedua

padatan tersebut mengion dan memberikan bentuk monoanionik yang

berwarna kuning. Selanjutnya monoanionik dideprotonasi pada pH

tinggi untuk memberikan bentuk dianionik (biru) yang ditabilkan oleh

resonansi. Bromokresol juga bias digunakan sebagai inhibitor protein

transpor prostaglandin E2.

2. Metode Reduksi Karbohidrat

Metode Somogyi-Nelson

Metode Nelson/Somogyi merupakan yang terbaik bila

digunakan untuk uji aktivitas enzim karena memberikan respon

pewarnaan

stoikiometri dengan oligosakarida homolog dengan berbagai derajat

polimerisasi sehingga memberikan pengukuran yang benar dari ikatan-

ikatan

glikosida yang terpotong yang menunjukkan aktivitas enzimnya

Metode Follin Wu

Metode ini digunakan dalam analisis kuantitatif gula dalam darah.

Prinsip pengukuran kadar glukosa darah dengan metode Folin Wu

adalah ion kupri akan direduksi oleh gula dalam darah menjadi kupro

dan mengendap menjadi Cu2O. Penambahan pereaksi fosfomolibdat

akan melarutkan Cu2O dan warna larutan menjadi biru tua, karena ada

oksida Mo. Dengan demikian, banyaknya Cu2O yang terbentuk

berhubungan linier dengan banyaknya glukosa di dalam darah. Filtrat

yang berwarna biru tua yang terbentuk akibat melarutnya Cu2O karena

oksida Mo dapat diukur kadar glukosanya dengan menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm.

9

Fehling

Fehling adalah salah satu metode reduksi yang digunkana untuk

mengidentifikasi gula pereduksi. Gula reduksi adalah gula yang dapat

mereduksi Fehling menjadi tembaga oksida yang mengendap berwarna

merah merah (ion kupri tereduksi menjadi ion kupro). Larutan Fehling

A mengandung ionkupri CuSO4, sedangkan Fehling B mengandung

campuran alkali (NaOH dan KNaC4H4O6). Gula reduksi dengan alkali

(Fehling B) akan bereaksi membentuk enediol, kemudian enediol ini

dengan ion kupri (Fehling A) membentuk ion kupro dan campuran

asam-asam. Selanjutnya ion kupro dalam suasana basa akan

membentuk kupro hidroksidayang dalam keadaan panasa akan

mendidih dan mengendap menjadi endapan kupro oksida (Cu2O) yang

berwarna merah bata (Kuswurj 2009).

10

Daftar Pustaka

Fachri AB. 2008. Lemak dan minyak. http://boyarieffacgri.blogspot.com/the_nature_has_talked/Lemak_dan _minyak.htm [14 April 2009].

Kuswurj R. 2009. Penentuan kadar gula reduksi nira tebu.http://www.risvank.com/tag/lane-eynon. Htm [15 April 2009].

Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia Jilid I. Maggy Thenawijaya, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry.

Pramarsh. 2008. Test for cholesterol. [terhubung berkala]. http://www.planetayurveda.com/cholesterol_remedies. html. [1 Desember 2008].

Scy Tech Encyclopedia. 2008. Acrolein test. [terhubung berkala]. http://www.answers.com/topic/acrolein_test. html. [3 Desember 2008].

Scy Tech Encyclopedia. 2008. Lipid. [terhubung berkala]. http://www.answers.com/library/Sci%252DTech%20Encyclopedia-cid-47286. html. [1 Desember 2008].

Syamsu JA. 2007. Penyimpanan pakan ternak: tinjauan proses kimiawi dari mikrobiologi. [terhubung berkala]. http:jasmal.blogspot.com/2007_12_01_archive. html. [2 Desember 2008].

WikiAnswers. 2008. What are the reaction involved in Lieberman Buchard test. [terhubung berkala]. http://wiki.answers.com/Q/What_are_the_reaction involved_in_Lieberman_Buchard_test. html. [3 Desember 2008].

11