Post on 19-Feb-2016
description
KROMATOGRAFI BIDANG
MAKALAHUNTUK MEMENUHI TUGAS MATAKULIAH
Analisis Instrumen Iyang dibina oleh
Ibu Dr. Dra. Endang Budiasih, M.S
OlehKelompok 2
1. Ahmat Saifudin Zuhri (120331402687)2. Arina Diana Fatma (120331420950)3. Atika Qorina (120331420928)4. Indri Budi Fitriani (120331402679)5. Yeny Merinda (120331402682)
UNIVERSITAS NEGERI MALANGFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIANOPEMBER 2014
Bab 6
KROMATOGRAFI BIDANG6-1 Pendahuluan
Noda setetes cairan pada selembar kertas atau baju berada dalam pola
melingkar, dan jika cairan berisi zat pewarna, terbentuk cincin konsentris yang
lebih mudah diamati. Teknik analitik sederhana digunakan oleh bangsa Roma
kuno untuk melakukan uji pigmen dan pewarna. Kira-kira 100 tahun yang lalu,
seorang ahli kimia Jerman, Ringe Schoenbein dan Goppelsroeder melakukan hal
yang serupa namun dari hal yang sama dibuatkan sebuah metode sehingga dapat
diulang. Hanya dalam 30 tahun terakhir, kromatografi kertas telah diterima
sebagai metode yang dapat diandalkan. A.J.P Martin, yang juga merupakan
perintis dalam kromatografi cair dan gas, dan rekan kerjanya, Consden dan
Gordon, mendeskripsikan partisi dalam kromatografi kertas di mana kelembaban
pada kertas bertindak sebagai fase diam. Dalam beberapa tahun, skema analisis
sederhana ini membantu perkembangan penelitian dalam biokimia.
Baru-baru ini, kromatografi lapis tipis (TLC) yang diciptakan Stahl telah
digunakan secara luas. Selapis tipis dari adsorben yang diletakkan dalam pelat
kaca atau plastik, sehingga dapat digunakan seperti selembar kertas pada
kromatografi kertas. TLC lebih sering digunakan karena lebih berguna dan
reprodusibel. TLC menggantikan penggunaan PC di laboratorium.
Sebagai tambahan yang lebih jelas dan sederhana, PC dan TLC digunakan
hanya pada jumlah sampel yang sedikit. Kromatografi permukaan bidang dengan
kolom menawarkan keuntungan yang khusus dari operasi dua dimensi. Jadi sifat
selektif dari dua pelarut yang berbeda bisa digunakan dalam mengembangkan
kromatogram tunggal.
Prinsip Teoritis
Umumnya prinsip teoritis dalam menjelaskan kromatografi kolom dapat
juga digunakan untuk menjelaskan kromatografi bidang. Konsep “piring teoritis”
mungkin sulit untuk digambarkan pada selembar kertas, tapi itu jelas bahwa
pemisahan terjadi dengan kesetimbangan berkesinambungan (successive
equilibration) dari komponen sampel antara dua fase, yaitu fase diam dan fase
gerak. Demikian juga beberapa proses nonideal harus dapat mengakibatkan zona
pemisahan pada permukaan bidang seperti pada kolom.
Waktu retensi pada kromatografi bidang biasanya ditunjukkan sebagai
faktor retardasi, Rf :
R f=jarak pergerakan zat terlarut
jarak pergerakan pelarut
Pergerakan pelarut pada titik tertentu bisa diukur.Jarak pergerakan sampel diukur
dari pusat noda, atau titik dengan kerapatan maksimum. Kita mungkin juga
menetapkan koefisien distribusi, K, yang didefinisikan sebagai konsentrasi zat
terlarut pada fase gerak, CM dan di fase diam, CS :
K=CS
CM
Ada hubungan sederhana antara nilai K dan Rf . Jarak rata-rata pergerakan
molekul zat terlarut proporsional dengan kecepatannya; yang sebenarnya juga
sama dengan kecepatan pelarut bergerak dikalikan dengan waktu yang dihabiskan
senyawa zat terlarut berada di dalam fase gerak. Ekspresi dari jumlah molekul di
tiap fase, atau kesetimbangan distribusi zat terlarut antara dua fase:
Rf=¿
jumlah mol zat terlarut di fase gerakjumlahmol zar terlarut pada keduafase =
CM A M
C M A M+CS AS¿
dimana AM dan AS mewakili luas area melintang dari dua fase (tegak lurus dengan
bidang pada kertas).
R f=AM
A M+ AS CS/CM=
AM
AM+K AS
Luas area melintang dari lapisan tipis atau kertas sulit untuk ditentukan, sehingga
persamaan di atas jarang digunakan, tapi itu menunjukkan bahwa Rf dapat diubah
dalam sistem kesetimbangan konstan, dan nilai Rf dapat dianggap tergantung
pada beberapa jenis parameter seperti pengukuran waktu retensi lainnya yang
umumnya digunakan dalam metode kromatografi kolom. Nilai Rf dipengaruhi
oleh jenis kertas, metode, dan arah pengembangan, ukuran dan konsentrasi
sampel, dan jarak tempuh noda. Karena hal itu, lebih nyaman da akurat digunakan
nilai Rf relatif atau Rstd, , untuk senyawa standar ditambahkan pada sampel (atau
ukuran pemisahan dibawah kondisi ideal). Nilai Rstd adalah perbandingan jarak
pergerakan oleh dua noda pada pengembangan dalam waktu yang sama.
6-2 KROMATOGRAFI KERTAS
Sifat kertas
Kertas yang umum digunakan terdiri dari selulosa yang sangat murni.
Selulosa sebagai bahan dasar kertas merupakan polimer dari glukosa. Dengan
adanya banyak gugus hidroksil di permukaan maka selulosa mempunyai afinitas
sangat besar terhadap air dan pelarut-pelarut organik lainnya karena adanya ikatan
hidrogen. Pelarut dapat masuk ke dalam jaringan benang-benang selulosa dan
menyebabkan kertas sedikit mengembang. Dalam air, selulosa sangat polar dan
menjadi elektronegatif. Selain itu, kertas juga mempunyai sifat penukar ion
meskipun lemah.
Banyak cara dilakukan untuk membuat kertas yang mampu memberikan
harga Rf berbeda dengan pelarut yang berbeda. Modifikasi bahan dasar kertas juga
telah dilakukan, antara lain dengan menambahkan sedikit gel silika atau gel
alumia bahkan resin penukar ion.
Peralatan
Peralatan yang diperlukan pada kromatografi kertas terdiri dari dukungan
untuk kertas, palung pelarut, dan bak udara-sempit di mana untuk
mengembangkan kromatogram. Penutup bak diperlukan untuk mencegah
penguapan pelarut yang mudah menguap. Ukuran bak mungkin berbeda dari
tabung biasa tergantung pada ukuran kertas. Jika banyak kromatografi kertas yang
harus dilakukan, akan lebih mudah untuk mengontrol suhu seluruh ruangan,
kurang lebih 18oC. Komponen dasar yang diilustrasikan pada Gambar 6-1 sudah
cukup untuk kromatografi kertas sederhana.
Development
Elusi kromatografi bidang dapat dilakukan di bak tertutup maupun
terbuka. Ada dua jenis elusi yang sering digunakan untuk kromatografi kertas,
yaitu ascending development dan descending development.
Ascending Development
Teknik ini adalah yang paling sederhana dan paling populer. Teknik naik,
disebut juga dengan pengembangan vertikal. Pelarut diletakkan di dasar sebuah
kamar gas, kertas atau kaca pembawa lapis tipis dicelupkan, dan pelarut dibiarkan
naik melalui fase diamnya sambil membawa komponen analit yang sudah
ditotolkan di garis awal. Pelarut akan naik lebih cepat dan komponen campuran
yang terpisahkan akan terserap di suatu daerah pada kertas semetara pelarutnya
akan naik sampai proses dihentikan.
Descending Development
Teknik turun juga sering digunakan di mana tempat pelarut diletakkan di
bagian atas kamar elusi dan kertas yang telah diberi sampel dielusi dari atas, arah
aliran ke bawah. Untuk mencegah penyedotan cepat, kertas dilipat menjadi bentuk
U dengan kenaikan awal pendek dari tangki pelarut. Meskipun alat ini lebih rumit,
metode ini jauh lebih cepat dari yang sebelumnya, potongan kertas dapat
digunakan lagi, dan sebagian besar pelarut dapat digunakan jika diperlukan.
Two-Dimensional Development
Teknik lain yang sangat menguntungkan pengguna kromatografi bidang
adalah teknik elusi dua dimensi. Dalam hal ini, elusi dilakukan dua kali dengan
dua buah pelarut pengembang atau campurannya dengan cara yang sama dan
singkat. Pengembangan dilakukan kembali dengan arah yang berbeda 90o. Hasil
yang didapat juga menguntungkan karena komponen-komponen yang belum
terlalu terpisah akan lebih terpisah dengan pengembang berbeda. Efek pemisahan
ganda dialami oleh kromatografi dua dimensi ini sehingga data analisisnya
mendukung satu sama lain. Gambar 2 menunjukkan kromatogram dua dimensi
untuk campuran dengan lima komponen. Pada elusi pertama dengan pengembang
Gambar 1. Peralatan dasar untuk kromatografi kertas: (a) teknik naik; (b) teknik turun
fenol ada bagian yang tidak terpisah dan akan terlihat jelas terpisah setelah elusi
kedua dengan pelarut pengembang collidine. Elusi kedua dilakukan setelah pelat
kromatogram dikeringkan. Pola yang berbeda untuk kedua elusi bisa saja terjadi
jika kepolaran kedua pengembang berbeda jauh.
Dalam teknik dua dimensi, komponen-komponen senyawa akan bergerak
dengan laju migrasi berbeda karena sifat dari eluen baru pasti tidk sama efeknya
terhadap tiap komponen. Dengan demikian, harga Rf akan berbeda satu sama lain.
Karen perbedaan ini pula metode dua dimensi akan memberikan kelebihan dalam
pemisahan maupun dalam analisis akhirnya.
Radial Development. Dalam metode ini sampel berupa noda yang berada
di pusat horizontal dan ditempatkan pada sumbu piringan untuk mensuplai pelarut
dari titik terendah ke pusat. Komponen bergerak keluar membentuk lingkaran
dengan peningkatan diameter. Pita besar atau kecil ketajamannya menyebabkan
pelarut bergerak lebih cepat di ujung daripada di tepi sehingga dapat dilakukan
dengan cara menutup cawan petri, atau kertas diapit dengan dua piring kaca dan
lubang di tengah untuk pengenalan pelarut.
Untuk pengembangan cepat, seseorang dapat memutar piringan dengan
kecepatan tinggi sehingga pelarut mengalir dengan gaya sentrifugal atau
kapilaritas.
Pemilihan sistem pelarut. Fase yang lebih polar, Air diserap oleh kertas
pada fasa diam, sedangkan fase yang kurang polar berada diatasnya. Beberapa
keadaan yang diiingkan untuk menghilangkan air dari kertas dilakukan dengan
cara pengeringan dan menggunakan pelarut yang lebih polar seperti alkohol,
Gambar 2. Elusi dua dimensi pada kromatografi kertas. A. Hanya fenol; B. Fenol diikuti collidine
glikol, formamida sebagai fase diam dan pelarut yang nonpolar akan mengalir
sebagai fasa gerak . Jika air yang tidak dibutuhkan digunakan sebagai fase diam,
maka pelarut yang bergerak tidak dapat bercampur karena air tertahan oleh
kertas . Jika dibutuhkan, fasa air menjadi penyangga. Fasa gerak terdiri dari
campuran antara pelarut, misalnya, asam alkohol, keton, ester, amina, fenol,
hidrokarbon, dll sehingga mencapai pemisahan maksimum komponen sampel.
Selain pemisahan optimum, ada faktor lain yang harus dipertimbangkan
dalam memilih sistem pelarut. Semakin banyak komponen sistem pelarut,
semakin sulit untuk mempertahankan atmosfer yang memenuhi ruangan.
Penguapan parsial mengubah komposisi pelarut, maka akan mempengaruhi nilai
Rf. Perubahan suhu juga akan lebih kritis dalam sistem campuran. Sistem pelarut
tidak boleh mengganggu tata cara deteksi (atau harus siap dan benar-benar
menguap sehingga dapat dihilangkan sebelum deteksi)
Pertimbangan sangat penting, tetapi mudah mengabaikan menit pengotor
nonvolatile menghasilkan pelarut yang membingungkan dalam sampel atau dapat
mengganggu dalam metode deteksi
Idealnya, kita harus memilih sistem pelarut sehingga dua tahap yang
bercampur dan di mana komponen sampel memiliki kelarutan yang tinggi, tetapi
berbeda dalam dua tahap. Situasi ini akan menyebabkan pemisahan maksimum
dengan minimum penyebar dalam waktu singkat.
Kromatografi fase terbalik. Jika kertas dilapisi dengan zat hidrofobik,
seperti lateks, minyak mineral, atau minyak silikon dan fase polar digunakan
untuk mengelusi, kebalikan dari distribusi normal yang diperoleh. sistem tersebut
dapat menguntungkan untuk pemisahan asam lemak dan senyawa nonpolar yang
mungkin bergerak cepat karena kelarutan yang rendah dengan fase diam polar.
Kelebihan dan kelemahan. Kromatografi kertas biasanya digunakan
untuk analisis yang sulit, memakan waktu banyak, mahal dan menggunakan
metode konvensional. Meskipun beberapa prosedur memerlukan beberapa jam,
waktu operasi sangat kecil sangat cocok untuk sampel di wilayah mikrogram dan
campuran zat yang sangat erat kaitannya kimia.
Kelemahan, sampel yang kecil menjadi kerugian deteksi yaitu
membutuhkan teknik tambahan. Variabilitas kertas merupakan masalah yang
serius. Sebagian besar prosedur dengan cara empiris dan hampir tidak dapat
disebut kuantitatif.
Aplikasi. Kromatografi kertas telah berhasil diterapkan untuk masalah
dalam kimia anorganik dan organik serta dalam biokimia. Penambang
menggunakan untuk menentukan logam dalam sampel bijih. Kompleks logam
isomer dapat diselesaikan. Logam dengan sifat kimia yang mirip mudah
diselesaikan. Hampir semua campuran bahan kimia organik dapat dipisahkan dan
ahli kimia organik sering menggunakan sebagai pemeriksaan kemurnian atau
sebagai metode perintis untuk menentukan kondisi optimum dalam pemisahan
kolom kromatografi skala besar.
Metode ini membuat dampak terbesar dalam biokimia, tetapi dalam kimia
analitik sulit karena dilakukan pada sampel yang kecil. Perkembangan literatur :
kontrol kemurnian obat-obatan dan produk makanan, studi tentang kematangan
dan fermentasi, deteksi narkoba dan dosis pada hewan dan manusia, analisis
kosmetik, deteksi pencampuran dan pencemar dalam makanan, minuman dan
analisis campuran pada reaksi kimia.
6-3 Kromatografi Lapis Tipis
Prinsip kerja kromatografi lapis tipis sama dengan prinsip kerja
kromatografi kertas. Sebagai pengganti selembar kertas, digunakan lapisan tipis
halus sebagai penyerap seperti gelas atau piring plastik.
Sifat dari Lapis Tipis. Adsorben (fase diam) yang paling sering digunakan
adalah silika gel, alumina, tanah diatom, dan bubuk selulosa, tetapi bahan lain
seperti Sephadex, resin pertukaran ion, atau Anorganik telah digunakan untuk
tujuan khusus. Gel silika bersifat asam dan memiliki kapasitas besar dan sering
digunakan untuk kromatografi partisi dan adsorpsi. Alumina merupakan
komponen dasar yang digunakan untuk kromatografi adsorpsi dan bersifat basa.
Tanah diatom bersifat hampir netral yang digunakan sebagai pendukung partisi
untuk menggabungkannya dengan pengikat (perekat) seperti plester dari Paris
untuk membuat lapisan yang lebih kohesif.
Pembuatan Lapisan. Biasanya digunakan pelat/lapisan kaca datar dan
halus, atau memiliki dasar yang ringan atau bergerigi. Ukuran dan bentuk dapat
ditentukan menggunakan alat. Dalam hal apapun, permukaan kaca dibersihkan
secara hati-hati/teliti dengan deterjen atau pelarut organik untuk menghilangkan
lemak apapun. Ketebalan lapisan akan menentukan kapasitas sistem. Lapisan
0,15-2,0 mm adalah ketebalan yang baik. Sangat dianjurkan membuat lapisan
dengan ketebalan yang sama, hal ini dapat dicapai dengan berbagai teknik. Dalam
industri, teknik pembuatan lapis tipis telah teruji dengan baik. Teknik pencelupan,
pelapisan, sampai penyemprotan sering digunakan untuk memastikan ketebalan
lapis tipis. Kebanyakan lapisan tipis diproduksi dengan menyebarkan lapisan yang
terbuat dari bubur berair di atas seluruh permukaan adsorben. Bubur tidak boleh
terlalu tebal (kental) atau terlalu tipis. Bubur dibuat dengan Gel silika G yang
berisi 10 sampai 15% kemudian dikalsinasi dengan kalsium sulfat, dan dicampur
dengan ± dua kali berat air.
Kita dapat menerapkan pita di sepanjang tepi yang berlawanan dari kaca
dan menggunakan batang kaca untuk mengambilnya, kemudian dihasilkan lapisan
pita yang tebal. Untuk penggunaan sesekali, sepasang slide mikroskop atau lentera
dapat dicelupkan ke bubur yang tidak berair yang mengandung 35 g Gel Silika G
dalam 100 mL kloroform, kemudian mengangkatnya perlahan, dan dibiarkan
mengalir dan kering. Setelah menyebar atau mengalir, dibutuhkan waktu 30 menit
untuk proses pengikatan. Untuk kromatografi adsorpsi, lapisan diaktifkan dengan
cara pemanasan pada 110oC selama beberapa jam. Untuk kromatografi partisi,
diperlukan pengeringan dan sisa air bertindak sebagai fase diam. Bagian tepi
harus dibersihkan dan pelat disimpan dalam desikator atau alat lain yang sesuai.
Ingat bahwa pengaktifan lapisan akan menyerap uap air dan uap-uap lainnya dari
udara, hal ini membuat kondisi kromatografi mengalami perubahan drastis. Pelat
lapis tipis banyak tersedia, tetapi biasanya digunakan untuk kepentingan
laboratorium yang dapat dipergunakan berkali-kali. Untuk penggunaan sesekali,
mereka jauh lebih nyaman dan lebih memilih untuk membuatnya sendiri.
Metode Penggunaan/Kerja dan Deteksi. Pemilihan pelarut tergantung
pada faktor-faktor yang sama seperti yang sudah dibahas dalam bentuk lain dari
kromatografi cair, dan metode elusi yang sama seperti kromatografi kertas.
Prosedur harus dilakukan dalam ruang tertutup untuk mencegah penguapan.
Dalam mendeteksi bercak, uap yodium digunakan secara luas sebagai pelarut
"universal" untuk reagen senyawa organik. Bercak yodium menghilang secara
cepat tetapi dapat dibuat lebih permanen dengan cara menyemprotkan larutan
benzidin 0,5% dalam etanol absolut. Biasanya pendeteksian reagen lain dilakukan
dengan cara penyemprotan asam sulfat setelah sampel dipanaskan, dan dihasilkan
bercak hitam. Ada sejumlah reagen yang lebih spesifik yang tersedia, tentu saja
bercak dapat terkikis, dielusi, dan diselidiki oleh metode yang tersedia.
Keuntungan dan Aplikasi. Dibandingkan dengan kromatografi kertas,
lapis tipis lebih serbaguna (lebih luas fasa diam dan pelarut), lebih cepat, dan lebih
mudah dibuat. Hal ini sering digunakan sebagai teknik percontohan untuk melihat
kompleksitas campuran secara cepat atau sebagai bantuan dalam menetapkan
kondisi yang baik untuk kromatografi kolom skala besar. Karena kecepatan dan
kesederhanaan itu, sering digunakan untuk mengikuti jalannya reaksi atau untuk
memantau teknik pemisahan yang lebih rumit dan kompleks. Kromatogram Lapis
tipis sering digunakan untuk mengidentifikasi obat, ekstrak tanaman, dan
persiapan biokimia, atau untuk mendeteksi kontaminan atau pencampuran.
6-4 Zona Elektroforesis
Elektroforesis adalah metode
pemisahan partikel-partikel bermuatan
dalam medan listrik. Partikel-partikel
berupa ion, ion-ion makromolekul,
beberapa biokoloidal. Elektroforesis
bukaanlah sejenis kromatografi, namun
perbedaan kecepatan migrasi yang
menyediakan sarana yang baik untuk memisahkan biokoloidal berupa protein,
polisakarida, dan asam nukleat dengan baik sesuai karakterisasi senyawanya.
Meskipun elektroforesis dapat menempati media gas (alat pengukuran asap
elektrostatik), disini dibahas hanya perbedaan migrasi pada fase cair. Reaksi
elektrode harus terjadi untuk mempertahankan arus, tetapi reaksi per se tidak
penting untuk pemisahan dan tidak dibutuhkan pertimbangan.
Batas perpindahan elektroforesis. Pada fase cair sebuah larutan
berjumlah banyak dimasukkan kedalam tabung-U atau film yang tipis pada kertas.
Teknik sebelumnya telah dikenalkan oleh Anne Tiselius pada tahun 1937 untuk
analisis campuran protein. Dia meletakkan sampel di bagian tengah sebuah
Gambar 6-3
tabung-U yang tedapat elektrode diujungnya (Gambar 6-3). Pada bagian arus yang
memulai memindahkan spesies untuk bermigrasi menuju elektrode yang tepat.
Melengkapi pemisahan yang tidak terjadi, tetapi jika gangguan mekanik yang
terjadi perlahan dapat dihindari (tidak ada pencampuran), batas perpindahan dapat
diamati konsentrasinya tidak kontinyu
(perpindahan warna atau indeks refraksi).
Teknik ini membutuhkan cukup keahlian
percobaan dan lambat dan juga tidak sangat
sensitif, walaupun sangat penting pada
perkembangan awal kimia protein.
Zona elektroforesis. Dalam
elektroforesis, migrasi terdapat pada film tipis
cair yang dilapisi pada kertas atau bahan
berpori. Peralatannya terdiri dari filter strip
yang mendukung piring gelas horizontal
dengan diujungnya kertas yang
dicelupkan ke dalam penampung
larutan penyangga. Elektroda
ditempelkan pada dekat ujung kertas
dan sampel di totolkan dekat
pertengahan, yang ditunjukkan pada
gambar 6-4a. Pada aliran arus,
senyawa sampel berpindah dari satu
ke yang lain (Gambar 6-4b),
pembentukan totolan atau zona.
Membran selulosa asetat diganti kertas filter sebagai media pendukung.
Bermacam-macam bahan gel, resin, dan bubuk juga digunakan pada kasus
tertentu. Immunoelektroforesis ini dilakukan dengan lapisan gel agar ketebalan 1-
2 mm, dibentuk di sebuah slide mikroskopis. Setelah pemisahan elektroforesis
campuran protein, ‘trough’ dipotong sejajar dengan tepi piring (gambar 6-4c) dan
pengisian dengan sebuah antiserum yang cocok. Inkubasi 24-28 jam pada
atmosfer bumi memungkinkan untuk ‘trough’ agar berdifusi . ketika antiserum
Gambar 6-4
Gambar 6-5
diperoleh dengan totolan protein, tampak ‘arcs’ yang terbentuk sesuai pasangan
protein antigen-antibodi (Gambar 6-4d).
Aliran kontinyu elektroforesis.
Elektroforesis pada kertas (atau layar tipis) memungkinkan salah satu
bentuk kromatografi elusi yang kontinyu. Diagram alat ditunjukkan pada gambar
6-5. Sampel dimasukkan secara kontinyu dari sumbu di puncak kertas dan dielusi
ke arah bawah. Dengan tanpa arus listrik yang mengalir, sampel akan berjalan di
garis vertikal lurus dan muncul tak terpisah, meskipun masing-masing komponen
akan berjalan bergantung kecepatan yang berbeda pada koefisien distribusi.
Dengan arus listrik yang mengalir, meskipun partikel berubah akan berjalan ke
kanan atau ke kiri (horizontal) tergantung pada perubahan kecepatan. Arah
resultannya adalah jumlah vektor dari dua komponen tegak lurus. Sehingga
masing-masing komponen yang dibebankan harus muncul di tempat yang berbeda
di bagian bawah kertas, sementara yang bermuatan akan muncul langsung di
bawah titik aplikasi. Elektroforesis kontinyu memungkinkan peralatan yang relatif
jumlah banyak untuk zat yang dimurnikan pada waktu yang pendek.