PEMERIKSAAN PEMERIKSAAN HITUNG LEKOSITHITUNG LEKOSIT

1

Pendahuluan Pendahuluan

2

LEKOSITinflamasi

stress

Lain-lain

shock

Infeksi

obat

Perubahan hormonal

3

PEMERIKSAAN HITUNG LEKOSIT

Manual

Impedans optikal

Otomatik

Hapusan darah

Kamar hitung

(hemositometer)

Penghitungan Manual Penghitungan Manual dengan Kamar Penghitung dengan Kamar Penghitung

(Hemocytometer)(Hemocytometer)PrinsipDarah EDTA diencerkan dengan

pengencer yang sesuaiDarah yang telah diencerkan

disuspensikan ke dalam kamar hitung lekosit

Lekosit dihitung dari pengkalian dengan faktor dilusi dan dilaporkan sebagai jumlah sel per mikroliter (μL) darah

4

Alat dan bahanAlat dan bahan1. Kamar Penghitung

(Improved Neubauer)

5

2. Pipet thoma lekosit

3. Larutan pengencer turk berisi gentian violet, asam asetat (CH3COOH) 3% dan 0.1 N HCl

4. Mikroskop

Volume : 0.1mmVolume : 0.1mm33

1 mm

1 mm

0.1 mm

Prosedur Prosedur

7

1. Siapkan alat-alat

2. Ambil darah kapiler/darah EDTA dengan pipet thoma sampai tanda 0,5.

8

3. Hisap larutan Turk hingga tanda 11.

4. Campur baik-2 dengan mengocok di

bagian perut pipet thoma.

Dilution factor (DF) = 20

5. Buang 4-5 tetes larutan pengencer untuk membuang 0,5 ml cairan pelarut yang tidak mengandung darah.

9

6. Masukkan larutan darah kedalam kamar penghitung melalui tepi gelas-penutup sampai tepat mengisi daerah penghitungan.

10

7. Lihat kamar-hitung dibawah mikroskop, baca dengan perbesaran obyektif 10x dan hitung lekosit pada 4 kotak lekosit.

6. Biarkan kamar penghitung beberapa saat agar sel-sel darah mengendap pada dasar area-penghitungan dengan meletakkannya pada petri dish berisi tissue basah.

Distibusi sel-sel dalam kamar penghitung harus merata.

11

12

PenghitunganPenghitunganWBC = sel yang terhitung x faktor dilusi

volume yang dihitung (mm3)

Sel yang terhitung= AFaktor dilusi= 20 xVolume yang dihitung= 4x0.1 = 0.4 mm3

Maka jumlah sel / mm3 darah :

Lekosit = A x 20 = 50 A/mm30,4

13

Faktor-faktor yang dapat Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi hitung lekositmempengaruhi hitung lekosit

Pra analitik

- teknik sampling darah

- obat-obatan

- penggunaan antikoagulan Analitik

- Sel-sel yang dihitung relatif sedikit.

- Debu dan kotoran yang dapat mengganggu pemeriksaan.

- Distribusi lekosit di kamar hitung yang kurang merata.

- Adanya NRBC yang menyebabkan tingginya hasil hitung lekosit

Pasca analitik

-pelaporan hasil

14

Hanya dapat memperkirakan jumlah lekosit secara kasar.

Dapat digunakan untuk mengkoreksi hitung lekosit bila dicurigai adanya NRBC yang terbaca sebagai lekosit.

hitung lekosit =

Penghitungan lekosit tergantung dari jenis mikroskop yg digunakan (FN-nya)

15

HHitung Lekosit dengan Hitung Lekosit dengan Hapusan Darah apusan Darah Tepi Tepi

100 x jumlah lekosit terhitung100 + jumlah NRBC per 100 lekosit

Untuk memperkirakan jumlah sel :(obyektif 10x)

Untuk FN-18 : ∑ leko/mm3 = ∑ rata-rata lekosit/lp x 300

normal : bila didapatkan 15-35 leko/lp

Untuk FN-22 :

∑ leko/mm3 = ∑ rata-rata lekosit/lp x 200

normal : bila didapatkan 22-55 lekosit / lp

16

17

Manual Mesin hitung sel darah

Vol. Sampel darah minimal > 20 ml 50 µl

Vol. Darah yang diencerkan 20-50 ml 6 µl

Pengenceran (P) 20 x(Thoma) 500 x (KX-21)

Vol. Campuran yang dianalisis(V) 0,4 ml 500 µl(KX-21)

Obyek yang dihitung (N) Inti sel Semua partikel

Kalkulasi N x P

V

50N N

CV Leko N/↑ : 6,5 %

↓ : 15 %

1-3 %

Tinggi Palsu Normoblas (+) Normoblas/ Eri tak lisis

Agregat trombosit

Bekuan fibrin

Cryofibrinogen

Cryoglobulin.

Perbandingan Penghitungan Lekosit cara manual dan mesin hitung

18

Metode Otomatik

Contoh Alat Hematology Contoh Alat Hematology AnalyzerAnalyzer

MetodeMetode Contoh Contoh AlatAlat

ImpedansImpedans Coulter (DC) Coulter (DC)

Sysmex NE-8000 Sysmex NE-8000 (DC&RF)(DC&RF)

Light scatterLight scatter Cell-Dyn 3200Cell-Dyn 3200

Light ScatterLight Scatter & & AbsorbsiAbsorbsi

Sysmex XE 2100Sysmex XE 2100

Advia 2120Advia 2120

19

prinsip : larutan sel darah dialirkan melalui apertura yg punya 2 elektroda pada kedua sisinya, sehingga sel dlm larutan yg bersifat konduktor akan memberikan pulsa resistensi saat me lalui apertura tsb.

Jumlah pulsa = jumlah sel yg lewat apertura ; Tinggi pulsa = volume sel .

20

Metode Resistensi Metode Resistensi Elektronik/ Elektronik/ Impedans/Tahanan ListrikImpedans/Tahanan Listrik

21

Sampel darah diencerkan dengan larutan elektrolit. Untuk lekosit digunakan reagen pelisis mengerutkan membran & sitoplasma sel inti yang diselubungi sitoplasma dlm jumlah minimal & membran sel

22

Suspensi sel-sel dialirkan melalui suatu celah (apertura) ke tabung yang vakum.

Dapat terjadi coincidence error : lebih dari 1 sel melewati apertura bersamaan.

Coincidence error dikurangi dengan - mengurangi ukuran apertura

- mengurangi konsentrasi sel

Metode lain untuk mengurangi coincidence error yaitu hydrodynamic focusing system,

sel digerakkan dalam satu garis aliran sel tersebut satu persatu masuk apertura.

23

Metode OptikalMetode Optikal Light Scatter Light Scatter & Absorbsi - fluoresensi - sitokimia

24

Sinar laser dipencarkan ke berbagai arah karena sel menghalangi jalannya sinar.

Sinar-sinar yang dipencarkan ditangkap photodetector & dianalisis dikonversikan

26

Pengukuran Pengukuran scatter lightscatter light 4 sudut 4 sudut ((multi angle polarized scatter multi angle polarized scatter

separation/MAPPS)separation/MAPPS)

27

The Optical detectors mengukur pancaran sinar ke 4 sudut:

Size 0°: 1° to 3° Complexity 10°: 3° to 10° Lobularity 90°: 60° to 120° vertically

polarized after scattering.Granularity 90°D (Depolarized): : 60° to

120°. horizontal polarization during scattering.

28

29

Prinsip Reaksi Prinsip Reaksi

30

Channel BasofilChannel Basofil (WBC/BASO (WBC/BASO Scattergram)Scattergram)

Sumbu X : intensitas lateral scatter lightSumbu Y : intensitas forward scatter lightMemisahkan basofil dari lekosit lainnyaMenggunakan reagen pelisis (Stromatolyser FB)

31

Terima Kasih

32

33

Scattergram leukositScattergram leukosit

34

Memisahkan Lekosit dari Memisahkan Lekosit dari NRBCNRBC

Sulit untuk membedakan NRBC dari lekosit

NRBC mempengaruhi perhitungan lekosit

Untuk mengatasi masalah tersebut digunakan pewarnaan polymethine & suatu diluent bersifat asam-hipoosmotk yang mengandung surface active agent (STROMATOLYSER NR)

35

Memisahkan Lekosit dari Memisahkan Lekosit dari NRBCNRBC STROMATOLYZER NR mempengaruhi membran lipid terbentuk lubang

pada sel NRBC meningkatkan

permiabilitas pewarnaan

Kurang mewarnai asam nukleat, organel

& inti

36

Memisahkan Lekosit dari Memisahkan Lekosit dari NRBCNRBC

37

Scattergram NRBCScattergram NRBC

Sumbu X : intensitas lateral fluorecent light

Sumbu Y : intensitas forward scatter light

38

PERBANDINGAN HITUNG JENIS LEKOSIT PERBANDINGAN HITUNG JENIS LEKOSIT SECARA MANUAL DAN OTOMATIKSECARA MANUAL DAN OTOMATIK

CARACARA KEUNTUNGANKEUNTUNGAN KERUGIANKERUGIAN

MANUALMANUAL Dapat melihat Dapat melihat morfologi morfologi sel-sel dgn lebih jelassel-sel dgn lebih jelasDapat membedakan 6 Dapat membedakan 6 populasipopulasi

memakan waktumemakan waktu kurang realibilitas kurang realibilitas tergantung tergantung kemampu-kemampu- an pemeriksaan pemeriksa

OTOMATIKOTOMATIK Lebih cepat & Lebih cepat & ekonomisekonomis jumlah sampel besar, jumlah sampel besar, realibilitas dan realibilitas dan akurasiakurasi lebih tinggilebih tinggi digunakan sebagai digunakan sebagai skriningskrining

belum bisa meng- belum bisa meng- gambarkan gambarkan morfologi morfologi selsel perlu konfirmasi perlu konfirmasi manual manual belum bisa meng-belum bisa meng- gambarkan stab & gambarkan stab & segmen netrofilsegmen netrofil

39

Scatergram Scatergram metode metode impedansimpedans

40

Sheath fluid berfungsi : - mencegah flow cell terlapisi

oleh bahan yang akan membelokkan sinar, - membuat aliran yang laminar, - membuat hydrodinamic

focusing

41

42

43

44

45

DISADVANTAGES OF MANUAL CELLCOUNTING:• Cell identification errors in manual counting:– mostly associated with distinguishing lymphocytes from monocytes,bands from segmented forms and abnormal cells (variantlymphocytes from blasts)– lymphocytes overestimated, monocytes underestimated• Slide cell distribution error:– increased cell concentration along edges and in the feather edge, alsobigger cells found there i.e. monocytes, eosinophils, and neutrophils• Statistical sampling error

46

ADVANTAGES OF AUTOMATED CELLCOUNTERS•Objective (no inter-observer variability)•No slide distribution error•Eliminate statistical variations associated withmanual count based on high number of cells counted•Many parameters not available from a manual count,e.g. MCV, RDW…•More efficient and cost effective than manual method:– Some cell counters can process 120-150 samplesper hour– CAP assumes 11 minutes for a manual cell count

Impedansi elektrikImpedansi elektrik

47

Electronic Resistance Electronic Resistance (Impedance)(Impedance) Cell counting and sizing is based on

the detection and measurement of changes in electrical

impedance (resistance) produced by a particle as it passes through a small aperture

• Particles such as blood cells are nonconductive but

are suspended in an electrically conductive diluent

Technologies

ABX

Interfering substancesInterfering substancesCold AgglutininsCryoglobulinsLipemiaPlatelet ClumpsRBC fragmentsNRBCs

Interferences Cont.Interferences Cont. All Parameters:

WBC:

Clotted specimen. Inspect every specimen for clots

Unusual RBC abnormalities that resist lysing

malarial parasites giant platelets, platelet clumps, NRBCs fragmented white cells, agglutinated white

cells, lyse-resistant red cells, cryoglobulin, some extremely elevate

proteins, unlysed particles greater than 35 fL in size

Light scatteringLight scatteringCells counted as passed through focused beam of

light( LASER) Sum of diffraction(bending around corners),

refraction (bending due to change in speed) and reflection (light rays turned back by obstruction).

Multi angle polarized scatter separation (M.A.P.S.S)

◦0° : indicator of cell size◦10° : indicator of cell structure and complexity

◦90° polarized: indicates nuclear lobularity◦90° depolarized: differentiate eosinophils