UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Faculteit Diergeneeskunde
Laboratorium voor Chemische Analyse
Vakgroep Veterinaire Volksgezondheid en Voedselveiligheid
Academiejaar 2010-2011
OPTIMALISATIE VAN U-HPLC-MS/MS
ANALYSE VOOR
BERENGEURCOMPONENTEN
Sophie FRANÇOIS
Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor
Dr. L. Vanhaecke
Copromotor
K. Bekaert
Commissarissen
Prof. S. De Saeger
Prof. C. Van Peteghem
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Faculteit Diergeneeskunde
Laboratorium voor Chemische Analyse
Vakgroep Veterinaire Volksgezondheid en Voedselveiligheid
Academiejaar 2010-2011
OPTIMALISATIE VAN U-HPLC-MS/MS
ANALYSE VOOR
BERENGEURCOMPONENTEN
Sophie FRANÇOIS
Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor
Dr. L. Vanhaecke
Copromotor
K. Bekaert
Commissarissen
Prof. S. De Saeger
Prof. C. Van Peteghem
Deze pagina is niet beschikbaar omdat ze persoonsgegevens bevat.Universiteitsbibliotheek Gent, 2021.
This page is not available because it contains personal information.Ghent University, Library, 2021.
DANKWOORD
Deze thesis zou niet geworden zijn wat ze nu is, zonder de hulp van vele mensen. Daarom wil ik graag
enkele mensen bedanken.
* Mijn co-promotor Karen Bekaert: wat zou ik toch zonder jou geweest zijn?! Je hebt me, door al je
enthousiasme en vriendelijkheid, van in het begin warm gemaakt voor de wondere wereld van de
mannelijke varkentjes. Bedankt voor de sublieme begeleiding en de vele verbeteringen (waarschijnlijk
tot vervelens toe). Niets was je teveel gevraagd, steeds maakte je tijd voor me vrij en probeerde je met
veel engelengeduld en met handen en voeten uitleg te geven. Wanneer ik het wat minder zag zitten,
wist je me op te beuren door aanmoedigende woorden en troostende snoepjes. Ik kan je niet genoeg
bedanken voor deze drie leerrijke maanden!
* Mijn promotor Lynn Vanhaecke: bedankt voor de vele verbeteringen. Zelfs in het weekend en
s’avonds laat wist je mijn mails te beantwoorden. Hoe je het moederschap en het vele werk dat je hebt
weet te combineren, verdient grote bewondering. Ik heb nog nooit iemand ontmoet die zich zo, met
hart en ziel, voor zijn job weet in te zetten. Chapeau!
* Dirk, Lucie en Mieke: drie supervriendelijke mensen die steeds klaarstonden om me te helpen.
Zonder jullie zou ik nooit zo vlug mijn draai gevonden hebben in het labo. Dankzij jullie hebben de
vele kasten vol materiaal geen geheimen meer voor me!
* Julie K., Julie V., Lieven en Tijs: hoe maak je de koffie- en middagpauzes van een thesisstudent tot
een echt feest? Jullie weten hoe het moet! De Antwerpse, Oost- en West-Vlaamse leute zorgden ervoor
dat ik steeds naar deze vrije momenten uitkeek. De innoverende hersenspinsels van Lieven en Tijs
waren soms moeilijk te volgen, maar zorgden keer op keer voor pijnlijke lachspieren.
* Mama: ook jij bedankt voor de vele hulp en steun. Je wist wanneer je me beter even met rust liet,
maar ook wanneer je me moest verwennen met wat fruit of een lekker taartje. Bedankt ook om naar
mijn problemen, ergernissen en belevenissen te luisteren! Zonder jou had ik deze thesis nooit kunnen
maken, gezien je me de kans geeft om mijn studies op mijn eigen tempo te vervolledigen.
* Tante Mieke: bedankt voor de verbeteringen, de interesse en de aanmoedigingen. Je wist me perfect
te motiveren en ontelbare keren op het hart te drukken dat een thesis erg belangrijk is in het
studieproces van een student.
* And last but not least: Brecht: enorm bedankt voor het luisterend oor dat je de afgelopen periode
voor me was. De oppeppende woorden en knuffels zorgden er steeds voor dat ik de volgende dag met
frisse moed verder ging. Je luisterde steeds naar mijn problemen en verhalen niettegenstaande je zelf
zoveel werk en problemen had met je eigen thesis. Merci!
INHOUDSTAFEL
1. INLEIDING ................................................................................................................................ 1
1.1 PROBLEEMSTELLING ....................................................................................................... 1
1.2 COMPONENTEN ................................................................................................................. 2
1.2.1 Androstenon ................................................................................................................ 3
1.2.2 Skatol ........................................................................................................................... 4
1.2.3 Indol ............................................................................................................................. 5
1.2.4 Andere componenten .................................................................................................. 6
1.3 DETECTIE ............................................................................................................................ 6
1.3.1 Sensorieel ...................................................................................................................... 7
1.3.1.1 Expertenpanel .......................................................................................................... 7
1.3.1.2 Consumentenpanel ................................................................................................... 7
1.3.1.3 Soldeerboutmethode ................................................................................................. 7
1.3.1.4 Elektronische neus ................................................................................................... 8
1.3.2 Laboratoriumanalyse .................................................................................................... 8
1.3.2.1 Colorimetrisch .......................................................................................................... 8
1.3.2.2 Immunologisch......................................................................................................... 9
1.3.2.2.1 Radioimmunoassay (RIA) .................................................................................. 9
1.3.2.2.2 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) of Enzym Immunoassay
(EIA) ............................................................................................................................... 10
1.3.2.2.3 Fluoroimmunoassay (FIA) ............................................................................... 10
1.3.2.3 Gaschromatografie (GC) of vloeistofchromatografie (LC) gekoppelde
technieken........................................................................................................................... 11
1.3.2.3.1 Gaschromatografie (GC) .................................................................................. 11
1.3.2.3.2 Vloeistofchromatografie (LC) .......................................................................... 12
1.3.2.3.3 Massaspectrometrie (MS) ................................................................................ 13
A. Linear Ion Trap Quadrupole massa analysator .................................................... 14
B. Triple Stage Quadrupole massa analysator .......................................................... 15
C. Orbitrap massa analysator ................................................................................... 16
2. OBJECTIEVEN ....................................................................................................................... 17
3. MATERIAAL EN METHODEN ............................................................................................ 18
3.1 MATERIAAL ....................................................................................................................... 18
3.1.1 Algemeen ...................................................................................................................... 18
3.1.2 Reagentia en chemicaliën ............................................................................................ 18
3.1.3 Oplossingen .................................................................................................................. 19
3.2 METHODEN ........................................................................................................................ 20
3.2.1 Staalvoorbereiding ....................................................................................................... 20
3.2.1.1 Protocol staalvoorbereiding ................................................................................... 20
3.2.1.2 Geteste opzuiveringsstappen .................................................................................. 22
3.2.1.2.1 Vaste fase extractie (SPE) ................................................................................ 22
3.2.1.2.2 Amicon Filter ................................................................................................... 23
3.2.2 HPLC-MS/MS-analyse ................................................................................................ 23
3.2.2.1 HPLC ...................................................................................................................... 23
3.2.2.1.1 HPLC kolommen ............................................................................................. 23
3.2.2.1.2 HPLC Solventen .............................................................................................. 24
3.2.2.1.3 HPLC Gradiënt ................................................................................................ 24
3.2.2.2 Linear Ion Trap Quadrupole ................................................................................. 25
3.2.3 U-HPLC-MS/MS .......................................................................................................... 25
3.2.3.1 U-HPLC .................................................................................................................. 26
3.2.3.1.1 U-HPLC Instellingen ....................................................................................... 26
3.2.3.1.2 U-HPLC Kolommen ........................................................................................ 26
3.2.3.1.3 U-HPLC Solventen .......................................................................................... 26
3.2.3.1.4 U-HPLC Gradiënt ............................................................................................ 27
3.2.3.2 Triple Stage Quadrupole ........................................................................................ 27
3.2.3.2.1 TSQ optimalisatie ............................................................................................ 27
3.2.4 U-HPLC-HR-MS ......................................................................................................... 27
3.2.4.1 U-HPLC .................................................................................................................. 27
3.2.4.2 Orbitrap ExactiveTM ............................................................................................... 28
3.2.4.3 Prestatiecriteria ...................................................................................................... 29
4. RESULTATEN ......................................................................................................................... 30
4.1 STAALVOORBEREIDING ................................................................................................ 30
4.2 HPLC-MS/MS ...................................................................................................................... 33
4.2.1 HPLC ............................................................................................................................ 33
4.2.1.1 HPLC Kolommen ................................................................................................... 33
4.2.1.2 HPLC Solventen ..................................................................................................... 34
4.2.1.3 HPLC Gradiënt ...................................................................................................... 35
4.2.2. HPLC-MS/MS-analyse van berenvet ........................................................................ 35
4.3 U-HPLC-MS/MS .................................................................................................................. 36
4.3.1 U-HPLC ........................................................................................................................ 36
4.3.1.1 U-HPLC Instellingen ............................................................................................. 36
4.3.1.2 U-HPLC Kolommen ............................................................................................... 37
4.3.1.3 U-HPLC Solventen ................................................................................................ 37
4.3.1.4 U-HPLC Gradiënt .................................................................................................. 38
4.3.2 Triple Stage Quadrupole ............................................................................................. 38
4.3.2.1 TSQ optimalisatie ................................................................................................... 38
4.3.3 U-HPLC-MS/MS-analyse van berenvet ..................................................................... 39
4.4 U-HPLC-HR-MS .................................................................................................................. 40
4.4.1 Orbitrap ExactiveTM .................................................................................................... 40
4.4.2 U-HPLC-HR-MS-analyse van berenvet .................................................................... 42
4.4.3 Prestatiecriteria ............................................................................................................ 43
5. DISCUSSIE ............................................................................................................................... 45
6. CONCLUSIE ............................................................................................................................ 49
7. LITERATUURLIJST .............................................................................................................. 50
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
AA piekoppervlakte
ACN acetonitril
ADD androstadienedion
AGC Automatic Gain Control
AL antilichaam
ALCASDE Alternatives to Castration and Dehorning
APCI atmosferische druk chemische ionisatie
API atmosferische druk ionisatie
arb arbitraire eenheden
BG spike oplossing berengeur
cc milliliter (10-3
liter)
CID botsingsgeïnduceerde dissociatie
CO2 koolstofdioxide
C18 opeenvolging van 18 koolstofatomen
Da dalton of atomaire massa-eenheid
ECD elektronenvangstdetector
EFSA Europese autoriteit voor voedselveiligheid
EIA Enzym Immunoassay
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Enz enzym
EU Europese Unie
eV elektronvolt (eenheid van energie)
Exp. experiment
FFT snelle Fouriertransformatie
FIA fluoroimmunoassay
FID vlamionisatiedetector
FWHM full width at half maximum
g gram (eenheid van massa)
GAIA Global Action in the Interest of Animals
GC gaschromatografie
g/mol eenheid voor molaire massa
HAc azijnzuur
HCOOH mierenzuur
HPLC hoge druk vloeistofchromatografie
HPLC-MS/MS hoge druk vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem massaspectrometrie
HR-MS hoge resolutie massaspectrometrie
H2O gedemineraliseerd water
ID interne diameter
IS interne standaard
LC vloeistofchromatografie
LC/MS vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie
LLE vloeistof-vloeistof extractie
LTQ Linear Ion Trap Quadrupole
MeOH methanol
mg milligram (10-3
gram)
min-1
per minuut
mL milliliter (10-3
liter)
mm millimeter (10-3
meter)
mol eenheid voor hoeveelheid stof
m/z massa-over-lading verhouding
MS massaspectrometrie
n aantal
ng nanogram (10-9
gram)
NPLC normale fase vloeistofchromatografie
N2 stikstofgas
O2 zuurstofgas
pH zuurtegraad van een oplossing
PIGCAS Pig Castration
PIS Product Ion Scan
ppb parts per billion (microgram / kilogram)
ppm accurate massa
® merk dat in de VS in het merkenregister ingeschreven is
R² correlatiecoëfficiënt
RF radiofrequentie
RIA Radioimmunoassay
RP omgekeerde fase
RPLC omgekeerde fase vloeistofchromatografie
rpm rotaties per minuut
RP-SPE omgekeerde fase vaste fase extractie
RSD relatieve standaarddeviatie
RT retentietijd (in minuten)
S/N signaal-over-ruis verhouding
SIM Selected Ion Monitoring
SPE vaste fase extractie
TLC dunne laag chromatografie
TM „trade mark‟ teken (merk niet ingeschreven in het merkenregister van de VS)
TR-FIA Time Resolved Fluoroimmunoassay
TSQ Triple Stage Quadrupole
UK United Kingdom
U-HPLC ultrahoge druk vloeistofchromatografie
U-HPLC-HR-MS ultrahoge druk vloeistofchromatografie hoge resolutie massaspectrometrie
U-HPLC-MS/MS ultrahoge druk vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem
massaspectrometrie
UV ultraviolet
V volt (eenheid van elektrische spanning)
VS Verenigde Staten van Amerika
°C graden Celsius (eenheid van temperatuur)
µL microliter (10-6
liter)
µm micrometer (10-6
meter)
2-MID 2-methylindol
2nd
secundair
1
1. INLEIDING
1.1 PROBLEEMSTELLING
Deze thesis behandelt de problematiek van berengeur. Berengeur is de geur die
vrijkomt bij het verhitten, braden, bakken,... van varkensvlees en -vet afkomstig van beren
(niet gecastreerde mannelijke varkens). Deze geur wordt door een belangrijk aandeel van de
consument als onaangenaam en indringend ervaren en de smaak van het varkensvlees als
bitter (Babol & Squires, 1995; Bonneau, 1998). Hoewel berengeur niets verandert aan de
kwaliteit van het varkensvlees gaat de voorkeur van de consument toch uit naar ‟aanlokkelijk
vlees‟ (Lundström et al., 2009). Om dit te bekomen worden beren, meestal zonder verdoving,
gecastreerd. Dierenbeschermingsorganisaties zoals GAIA komen hier tegenop gezien castratie
zeer pijnlijk en stresserend is voor de biggen (Prunier et al., 2006; Kluivers-Poodt et al.,
2007; von Borell et al., 2009).
Volgens de EU Commission Directive (2001/93/EC) geldt: “Het castreren en het
couperen van de staart bij dieren die ouder zijn dan 7 dagen, zijn alleen toegestaan als de
ingrepen onder anesthesie en met aanvullende langdurige pijnbehandeling uitgevoerd worden
door een dierenarts”. In België is castratie op latere leeftijd mogelijk gezien het Koninklijk
Besluit van 17/02/2001, waarin staat dat varkenshouders biggen tot op de leeftijd van 4 weken
mogen castreren zonder verdoving, niet aangepast is aan de EU Commission Directive.
Verschillende Europese overkoepelende onderzoeksprojecten zoals PIGCAS en
ALCASDE en de Europese autoriteit voor voedselveiligheid (EFSA) verdiepen zich in de
problematiek van castratie en voeren onderzoek uit naar mogelijke alternatieven. Er zijn reeds
diverse alternatieven voorhanden. Zo wordt er in Ierland en de UK niet gecastreerd maar
worden de beren er op jonge leeftijd geslacht, alvorens seksuele volwassenheid intreedt
(Bonneau, 1998). In Nederland mag er sinds 2007, volgens de verklaring van Noordwijk,
geen enkele castratie meer gebeuren zonder verdoving (Baltussen et al., 2009). Het kan om
een algemene verdoving gaan met een mengsel van 70% CO2-gas en 30% O2-gas (Kohler et
al., 1998; Prunier et al., 2006; Van Sleuwen, 2007) of een plaatselijke verdoving (White et
al., 1995; Marx et al., 2003). Ook in Noorwegen geldt deze regel. Duitsland verkiest castratie,
maar wel in combinatie met pijnbestrijding via toediening van meloxicam (Hoste et al.,
2009).
2
Een ander alternatief, dat reeds toegepast wordt in Australië en Nieuw-Zeeland, is
immunocastratie. Hierbij wordt het varken gevaccineerd met eiwitten die de groei en functie
van de testes doen dalen door antilichaamvorming tegen het „Gonadotropine-Releasing
Hormone‟. De biggen worden twee keer ingeënt, op de leeftijd van 10 weken en op 14 à 16
weken. Als gevolg wordt er minder androstenon en skatol gevormd (Caraty & Bonneau,
1986; Meloen et al., 1994; Manns & Robbins, 1997).
Nog andere alternatieven zijn genetische selectie (Squires & Lou, 1995; Pedersen,
1998), het sexen van sperma (Johnson & Clark, 1998; Vasquez et al., 2009) of de productie
van intacte beren. De productie van intacte beren (ongecastreerde mannelijke varkens) wordt
vaak gezien als een alternatief op lange termijn. Hierbij probeert men berengeur te reduceren
aan de hand van managementsingrepen (Byrne et al., 2008). Het slachten van intacte beren
levert verschillende voordelen op. Zo hebben beren in vergelijking met bargen (gecastreerde
mannelijke varkens) een betere voederbenutting (Walstra et al., 1977; Plagge, 1988), leveren
ze een grotere hoeveelheid mager vlees (Lundström et al., 2009) en beschikken ze over een
betere gezondheid (Tielen, 1974). Andere voordelen zijn de lage mestproductie (Desmoulin et
al., 1974; Kempster, 1993), een betere groei (Xue & Dial, 1997) en minder arbeid en kosten
(de Roest et al., 2009).
Zowel voor de productie van intacte beren als voor de andere alternatieven is het
noodzakelijk dat er een methode bestaat om berengeur te kunnen detecteren. Zo kunnen
intacte beren met berengeur gedetecteerd worden en kan onderzocht worden of de alternatieve
methodes effectief de kans op berengeur verminderen. Op dit moment bestaan er
verschillende methodes om berengeur te detecteren maar is er geen standaardmethode en
daarnaast is er ook geen operationele definitie van berengeur.
1.2 COMPONENTEN
Androstenon en skatol (Patterson, 1968; Vold, 1970; Hannson et al., 1980) zijn de
twee belangrijkste componenten van berengeur die op dit moment gekend zijn. Er is echter
geen consensus over de relatieve verhouding waarin ze voor berengeur verantwoordelijk zijn.
Volgens sommige studies dragen androstenon en skatol in gelijke mate bij tot berengeur
(Lundström et al., 1980; Bonneau et al., 1992; Bonneau et al., 1994), terwijl andere studies
dit tegen spreken (Patterson, 1968; Vold, 1970; Claus et al., 1994). Ook componenten zoals
indol, maar ook 4-phenyl-3-buten-2-on,… zouden een rol spelen (Sole & Garcia-Regueiro,
2001).
3
1.2.1 Androstenon
Androstenon of 5-α-androst-16-en-3-on (Figuur 1.1, Tabel 1.1), is een C19-Δ16
steroïde, dat gekenmerkt wordt door een urineachtige geur (Patterson, 1968; Vold, 1970;
Babol & Squires, 1995; Rius & Garcia-Regueiro, 2001). Het is een feromoon dat onder
andere in het speeksel van beren voorkomt en een seksuele prikkeling bij het andere geslacht
uitlokt (Bonneau et al., 1982).
Tabel 1.1: Gegevens van androstenon
Figuur 1.1: Structuur van androstenon
Androstenon wordt, samen met andere steroïde hormonen zoals oestrogenen en
androgenen (bv. testosteron), vooral gevormd in de Leydigcellen die zich bevinden in de
testes van de beer (Ahmad & Gower, 1968; Gower, 1972). Het 5-α-androst-16-en-3-on is
lipofiel waardoor het in vetweefsel accumuleert (Brooks & Pearson, 1986) (Figuur 1.2). De
accumulatie in het vetweefsel is reversibel gezien de hoeveelheid androstenon in het
vetweefsel daalt na immunocastratie (Bonneau et al., 1982).
Katabolisatie van androstenon gebeurt in de testes en in de lever (Doran et al., 2002).
Hoge androstenongehaltes in het vetweefsel kunnen er onder andere komen door verminderde
afbraak door de lever wegens een verminderde enzymactiviteit.
Figuur 1.2: Verspreiding van androstenon in het varken
Klasse Polycyclisch: Steroïden:
Androstenen
Chemische formule C19H28O
Moleculair gewicht 272,43 g/mol
Kookpunt 275 °C
Smeltpunt 140 - 144 °C
4
Het is genetisch bepaald of androstenon wordt waargenomen of niet (Wysocki &
Beauchamp, 1984; Gilbert & Wysocki, 1987). Zo kunnen slechts 50% van de mensen het
ruiken. Tevens blijkt uit onderzoek dat vrouwen androstenon beter kunnen ruiken dan mannen
(Bekaert et al., 2011).
1.2.2 Skatol
Naast androstenon is ook skatol of 3-methylindol een belangrijke component bij
berengeur (Figuur 1.3, Tabel 1.2) (Vold, 1970). De geur die deze component veroorzaakt
wordt meestal beschreven als een fecale geur (Claus et al., 1994; Rius & Garcia-Regueiro,
2001).
Tabel 1.2: Gegevens van skatol
Figuur 1.3: Structuur van skatol
De productie van skatol gebeurt in het colon, tijdens de afbraak van het aminozuur L-
tryptofaan, door bacteriën zoals Lactobacillus en Clostridium (Claus et al., 1994; Jensen et
al., 1995; Deslandes et al., 2001; Lanthier et al., 2007). Net zoals bij androstenon zorgt het
lipofiel karakter van skatol ervoor dat het in vetweefsel geaccumuleerd wordt (Zamaratskaia
et al., 2004a; Zamaratskaia et al., 2004b). Skatol wordt ook in bargen, zeugen (zogende
varkens) en gelten (vrouwelijke varkens die nog geen biggen geworpen hebben)
geproduceerd, maar komt vooral in beren in hoge concentraties voor (Hannson et al., 1980;
Agergaard & Laue, 1993; Claus et al., 1994). Dit verschil zou te wijten kunnen zijn aan een
sterker anabool metabolisme bij beren.
Sekssteroïden zoals androstenon zouden ook een rol spelen in het ontstaan van hogere
skatolconcentraties. Hierrond bestaan er meerdere hypotheses, zo zouden androgenen
enerzijds de productie van skatol verhogen (Claus et al., 1994) of anderzijds de metabolisatie
van skatol inhiberen (Babol et al., 1997; Chen et al., 2006). De verspreiding van skatol in het
lichaam van het varken wordt weergegeven in Figuur 1.4.
Klasse Heterocyclisch: 2 ringen:
Indolen
Chemische formule C9H9N
Moleculair gewicht 131,17 g/mol
Kookpunt 265 - 266 °C
Smeltpunt 95 °C
5
Figuur 1.4: Verspreiding van skatol in het varken
De concentratie van skatol kan door vele factoren beïnvloed worden. Zo neemt de
incidentie van berengeur toe bij volwassenheid (Babol et al., 1998; Babol et al., 1999),
ouderdom (Claus & Hofmann, 1980) en gewichtsstijging (Bonneau et al., 1982). Een ander
ras (Zamaratskaia et al., 2004a; Zamaratskaia et al., 2004b) of een ander dieet (Jensen et al.,
1995) kan eveneens leiden tot andere skatolconcentraties.
Skatol wordt, in tegenstelling tot androstenon, door bijna iedereen (99%)
waargenomen (Matthews et al., 2000; Weiler et al., 2000).
1.2.3 Indol
Indol of 2,3-benzopyrol is een minder belangrijke component in berengeur gezien
deze vooral in lage concentraties voorkomt (Garcia-Regueiro & Diaz, 1989; Moss et al.,
1993; Zamaratskaia et al., 2004a; Zamaratskaia et al., 2004b). Net zoals skatol heeft indol
een fecale geur en kan deze door iedereen waargenomen worden (Weiler et al., 2000) (Figuur
1.5, Tabel 1.3).
Tabel 1.3: Gegevens van indol
Figuur 1.5: Structuur van indol
De biosynthese van indol gebeurt, gelijkaardig aan skatol, door bacteriële afbraak van
L-tryptofaan in het darmstelsel van varkens (Claus et al., 1993; Jensen et al., 1995).
Klasse Heterocyclisch: 2 ringen:
Indolen
Chemische formule C8H7N
Moleculair gewicht 117,15 g/mol
Kookpunt 254 °C
Smeltpunt 52 °C
6
1.2.4 Andere componenten
Naast androstenon, skatol en indol komen nog andere componenten voor in berengeur,
weliswaar in een veel lagere concentratie. Behalve androstenon zorgen ook andere C19-Δ16
steroïden voor een slechte geur en smaak van varkensvlees (Thompson et al., 1972; Le
Denmat et al., 1993). In vet met lage concentraties aan androstenon en skatol, zorgen
aldehyden en korteketen vetzuren voor hinder (Angels Ruis et al., 2005). Bij contaminatie
kunnen ook styreen en 1,4-dichlorobenzeen (Figuur 1.6) voor berengeur zorgen. 4-phenyl-3-
buten-2-on (Figuur 1.6) zorgt voor een verhoogde waarneming van androstenon en skatol
(Sole & Garcia-Regueiro, 2001). Verder kunnen ook nog, tot nu toe onbekende componenten
een rol spelen bij berengeur (Babol et al., 1996).
styreen 1,4-dichlorobenzeen 4-phenyl-3-buten-2-on
Figuur 1.6: Structuur van styreen, 1,4-dichlorobenzeen en 4-phenyl-3-buten-2-on
1.3 DETECTIE
Een mogelijk alternatief voor castratie is de productie van intacte beren, waarbij het
noodzakelijk is dat er een detectiemethode voor berengeur ontworpen wordt (Aluwé &
Bekaert, 2009). Deze detectiemethoden kunnen ook gebruikt worden om na te gaan of de
andere alternatieven voor castratie het gewenste resultaat bereiken.
Op dit moment wordt er gebruik gemaakt van sensoriële (expertenpanel,
consumentenpanel, soldeerboutmethode en elektronische neus) en laboratoriumanalyses
(colorimetrisch, immunologisch, chromatografisch). Het grote probleem hierbij is de
afwezigheid van een operationele definitie voor berengeur, maar ook van een standaard
detectiemethode.
De analyses kunnen ingedeeld worden in twee groepen: subjectieve en objectieve
analyses. Tot de subjectieve analyses behoren de panels (experten en consumenten) en de
soldeerboutmethode. Dit komt doordat het resultaat persoonsafhankelijk is en er dus een
grotere variabiliteit kan heersen. De elektronische neus, colorimetrische, immunologische en
chromatografische analyses behoren tot de objectieve analyses gezien de meting door een
7
toestel uitgevoerd wordt, waarbij enkel de drie gekende berengeurcomponenten waargenomen
worden en er minder variabiliteit is.
1.3.1 Sensorieel
1.3.1.1 Expertenpanel
De experten worden getraind om verschillende intensiteiten van berengeur te kunnen
beoordelen en andere ranzige geuren van berengeur te kunnen onderscheiden (Xue et al.,
1996b; Aldal et al., 2005; Byrne et al., 2008; Hansen et al., 2008). Personen die ongevoelig
zijn voor androstenon komen niet in aanmerking.
Een stuk subcutaan vet afkomstig van het varken wordt opgewarmd en beoordeeld
(Squires et al., 1991; Rius et al., 2005; Aluwé et al., 2009). De expert moet zijn bevindingen
weergeven op bv. een categorische schaal (1: neutraal 4: zeer sterk) (Annor-Frempong et
al., 1998). De interpretaties vertonen echter verschillen. Zo zouden de temperatuur van het
staal, het moment van de beoordeling (Dijksterhuis et al., 2000; De Kock et al., 2001) en de
bereiding van het vet een invloed hebben op de beoordeling. Ook verschillen in training
zouden mogelijk een verklaring kunnen geven voor het tekort aan overeenkomst tussen
verschillende studies.
1.3.1.2 Consumentenpanel
De consument is niet getraind in het opsporen van berengeur en zal daardoor
varkensvlees anders beoordelen (Bonneau et al., 2000). Zo ruiken sommige personen
androstenon niet en zullen deze berengeur minder sterk waarnemen (Furnols et al., 2003;
Claudi-Magnussen et al., 2006). De vleesstalen worden op verschillende manieren bereid en
aan de consumenten voorgeschoteld ter beoordeling. Ook hier zorgen verschillen voor een
andere interpretatie van berengeur. Via deze consumentenpanels kan de onderzoeker een zicht
krijgen op wat de invloed van berengeur is op de consumptie van het varkensvlees gezien er
een steekproef van de populatie genomen wordt (Malmfors & Lundström, 1983; Xue et Dial,
1997; Banon et al., 2004).
1.3.1.3 Soldeerboutmethode
Bij deze snelle en simpele methode wordt een stuk subcutaan vet, meestal afkomstig
van de nekregio, kort verwarmd door er de gloeiende punt van een soldeerbout tegen te
houden (Jarmoluk et al., 1970). De vrijgekomen damp wordt door een expert geroken en
beoordeeld op aan- of afwezigheid van berengeur en de intensiteit van deze geur. Hier wordt
8
er, net zoals bij het experten- en consumentenpanel, een subjectieve meting uitgevoerd. Zo
kunnen bv. genetische (Wysocki & Beauchamp, 1984; Furnols et al., 2003), culturele en
culinaire (Weiler et al., 2000; Claudi-Magnussen, 2006) verschillen voor een veranderlijke
interpretatie zorgen. Daarnaast is tot op heden geen wetenschappelijk onderzoek verricht in
verband met gewenning, herhaalbaarheid, gevoeligheid,… (Dijksterhuis et al., 2000; Rius et
al., 2005; Aluwé & Bekaert, 2009) Toch wordt deze methode reeds toegepast in Nederland.
Daar krijgt een beer waarbij, via de soldeerboutmethode, geen berengeur geroken werd, een
keurmerk.
1.3.1.4 Elektronische neus
De elektronische neus meet de geur van verhit varkensvlees en -vet en niet de
concentratie van de berengeurcomponenten (Vestergaard, 2006). Deze bootst de sensoriële
waarneming door de mens na, maar dan op een objectieve manier. Zo meet de gassensor enkel
de opgegeven componenten. Er is echter nog veel werk om een betrouwbaar en draagbaar
apparaat te maken dat zowel de componenten vluchtig kan maken, deze in vacuüm kan meten
en on-line data kan registreren. Snelle detectie door middel van gassensoren was wel al
succesvol bij geroosterde koffie (Talou et al., 1993) en essentiële oliën (Talou et al., 1994).
1.3.2 Laboratoriumanalyse
Bij het gebruik van laboratoriumanalyses wordt een objectief resultaat voor de
gekende componenten bekomen, wat een groot voordeel biedt ten opzichte van de sensoriële,
persoonsafhankelijke metingen. Deze analyses zijn vaak duur, tijdsrovend en arbeidsintensief
(Hansen-Møller & Andresen, 1994), waardoor ze moeilijk als on-line detectiemethode kunnen
gebruikt worden.
1.3.2.1 Colorimetrisch
Deze methode werd oorspronkelijk ontworpen voor de bepaling van skatol in
vetweefsel (Mortensen & Sørensen, 1984). Het gaat om een spectrometrische methode die
werkt op basis van elektromagnetische straling (bv. licht). Bij een bepaalde golflengte gaan
elektronen, door het opnemen van die straling, zich naar een hoger energieniveau verplaatsen,
wat excitatie genoemd wordt. De colorimeter meet de hoeveelheid geabsorbeerd licht
(extinctie), waaruit berekend kan worden in welke concentratie de gezochte component in het
staal aanwezig is. De colorimeter kan enkel de extinctie van gekleurde componenten meten
waardoor het staal eerst voorbereid moet worden (Brooks & Hastewood, 1961).
9
Een probleem bij colorimetrie is echter dat het geheel aan indolische componenten
gemeten wordt en er dus geen onderscheid wordt gemaakt tussen skatol en indol. Daarom
wordt het resultaat weergegeven als skatolequivalenten (Xue et al., 1996a; Babol et al., 2004;
Zamaratskaia et al., 2005; Chen et al., 2007), waarbij er steeds een overschatting van de
hoeveelheid skatol is (Xue et al., 1996a).
Squires (1990) ontwierp een protocol voor het bepalen van androstenon in vetweefsel
en speekselklieren. Er traden echter interferentieproblemen op door bv. cholesterol, die de
precursor van de androstenonsteroïden is. Hierdoor werd staalvoorbereiding zeer belangrijk,
vooral voor metingen in het vetweefsel. Bij metingen in de speekselklieren waren er minder
problemen. Bij bepaling van skatol uit vetweefsel moet er een ander protocol gevolgd worden
(Xue et al., 1996a).
1.3.2.2 Immunologisch
Bij immunologische analyses wordt er gebruik gemaakt van de specifieke binding
tussen antigenen en antilichamen (AL), om de concentratie aan antigenen te bepalen. De
antilichamen worden gemerkt met een radioisotoop (RIA), een enzym (ELISA/EIA) of een
fluorescent label (FIA).
1.3.2.2.1 Radioimmunoassay (RIA)
Deze techniek werd gebruikt voor de bepaling van androstenon in vetweefsel en in
bloedplasma (Claus, 1974; Andresen, 1975; Claus et al., 1988; Bonneau et al., 1992; Claus et
al., 1997). Een gestandaardiseerde hoeveelheid van androstenon wordt radioactief gemerkt
door middel van radioisotopen (Figuur 1.7).
Figuur 1.7: Radioimmunoassay
Wanneer het gemerkt androstenon toegevoegd wordt aan het staal treedt er competitie
op tussen het gemerkt androstenon en het androstenon aanwezig in het staal. Het gemerkt
10
androstenon wordt verdrongen van zijn antilichamen doordat deze binden met het niet
gemerkt androstenon. Bij dit proces komt er radioactiviteit vrij die gemeten kan worden en
waaruit de concentratie aan androstenon afgeleid kan worden (Bird & Gower, 1981). Een
probleem bij deze test is het ontstaan van kruisreactiviteit met 5-α-androst-16-en-3-α-ol en 5-
α-androst-16-en-3-β-ol. Wegens problemen met de beschikbaarheid van radioisotopen,
radioactiviteit, selectiviteit, sensitiviteit en complexiteit werd deze techniek verlaten (Claus et
al., 2008).
1.3.2.2.2 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) of Enzym Immunoassay (EIA)
ELISA of EIA is een immunochemische techniek die gebruikt wordt om te meten
hoeveel androstenon in het vetweefsel (Claus et al., 1988; Claus et al., 1997; Rius & Garcia-
Regueiro, 2001) of in het bloedplasma (Claus et al., 2008) aanwezig is. Deze techniek lijkt op
die van de RIA maar de antilichamen zijn nu gemerkt met een enzym (Figuur 1.8).
Er wordt een substraat en een geconjugeerd enzym (Enz) toegevoegd aan de wells van
een microtiterplaat, waardoor het staal aanwezig in de wells verkleurt. Nadat de reactie
gestopt wordt met zwavelzuur, wordt de intensiteit van de kleur gemeten met een
spectrofotometer (Walstra & Moermann, 1981). De concentratie aan androstenon is evenredig
met de intensiteit van de ontstane kleur. De specificiteit van de test is afhankelijk van de
gebruikte antilichamen. Wegens zijn excellente specificiteit wordt ELISA nog steeds gebruikt
voor de bepaling van androstenon.
Figuur 1.8: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
1.3.2.2.3 Fluoroimmunoassay (FIA)
„Time Resolved Fluoroimmunoassay‟ (TR-FIA) lijkt op RIA maar de antilichamen
worden met een fluorescent label gemerkt. Dit label is meestal europium, een lanthanide
chelaat. Deze techniek zorgt voor de vervanging van RIA aangezien er problemen waren met
11
radioactiviteit en de beschikbaarheid van radioisotopen. Via TR-FIA kan de concentratie aan
androstenon in vetweefsel (Tuomola et al., 1997; Hansen et al., 2006; Oskam et al., 2008), in
bloedplasma (Tuomola et al., 2002; Byrne et al., 2008) en in serum (Tuomola et al., 1997)
bepaald worden. Deze techniek kent veel succes wegens de eenvoudige staalvoorbereiding.
1.3.2.3 Gaschromatografie (GC) of vloeistofchromatografie (LC) gekoppelde technieken
Chromatografie is een analytische techniek die gebruikt wordt voor de fysische
scheiding van mengsels. Fractionatie of scheiding is nodig om componenten in een mengsel
individueel te kunnen analyseren.
Meestal wordt er gebruik gemaakt van kolomchromatografie waarbij een stationaire
(stilstaande) fase geïmmobiliseerd zit aan de binnenkant van een kolom. Het staal wordt in het
systeem gebracht en via een mobiele (lopende) fase langsheen de stationaire fase gevoerd. De
stationaire fase is een vaste stof (bv. silica). De opgeloste bestanddelen verdelen zich tussen
de twee fasen en vertragen (retentie) door interactie (bv. via waterstofbruggen) met de
stationaire fase. Door deze selectieve vertraging vloeit elke component met een verschillende
snelheid uit de kolom (elutie) en worden de componenten gescheiden. Het is dus noodzakelijk
dat de te analyseren componenten verschillende affiniteiten voor de fasen hebben. Voor de
bepaling van berengeur kan zowel gaschromatografie (inert gas als mobiele fase) als
vloeistofchromatografie (vloeistof als mobiele fase) gebruikt worden. Wanneer de
componenten uit de kolom elueren worden ze waargenomen door een detector. Deze meet een
specifieke fysische eigenschap die de eluerende componenten bezitten. De gemeten
eigenschap wordt omgezet in een elektrisch signaal, die dan bv. als een chromatogram
zichtbaar wordt (Baars et al., 1994).
1.3.2.3.1 Gaschromatografie (GC)
Alvorens te kunnen starten met GC dienen storende componenten verwijderd te
worden door middel van vloeistof-vloeistof extractie (LLE) (De Brabander & Verbeke, 1986;
Chen, 2007), stoomdestillatie of vaste fase extractie (SPE) (Hansen-Møller, 1994). Hierdoor
is er bij een snelle en eenvoudige GC geen directe gasmeting mogelijk.
Bij bepaling van androstenon in serum en testes wordt er gebruik gemaakt van
vloeistof-vloeistof extractie door middel van dichloromethaan en ethylacetaat, waarna het
staal opgelost wordt in methanol (Claus et al., 1971; Garcia-Regueiro, 1998). Vervolgens
wordt het staal gewassen, gedroogd, ingedampt onder stikstofgas en opgezuiverd door dunne
12
laag chromatografie (TLC). Androstenon moet gederivatiseerd worden vooraleer het staal op
het GC systeem kan gebracht worden (Hansen-Møller, 1994; Bonneau et al., 2000). Bij
bepaling in vet is er eerst homogenisatie nodig met natriumhydroxide. Na de
staalvoorbereiding wordt de GC gekoppeld aan een vlamionisatiedetector (FID) (Rius &
Garcia-Regueiro, 2001).
Androstenonbepaling uit vetweefsel kan ook door verzeping van het vetweefsel door
middel van tolueen en kaliumhydroxide. Na extractie wordt het staal gederivatiseerd met het
Florox reagens en gebeurt de detectie via GC gekoppeld aan een elektronenvangstdetector
(ECD) (De Brabander & Verbeke, 1986). Deze techniek zorgt voor een dalend verbruik van
organische solventen en er is een kleinere hoeveelheid van het staal nodig. Een andere
techniek is GC gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) in de „Selected Ion Monitoring‟
(SIM) modus (Berdagué et al., 1993).
GC werd in andere studies ook gebruikt voor de bepaling van skatol uit vetweefsel
(Garcia-Regueiro & Rius, 1998; Rius & Garcia-Regueiro, 2001). Bij de bepaling van indol
en skatol uit vetweefsel (Peleran & Bories, 1985) en uit serum (Bradley & Carlson, 1974)
wordt de extractie uitgevoerd door middel van methyleenchloride. GC wordt nog maar zelden
gebruikt gezien het om een dure en tijdsrovende techniek gaat (Tuomola et al., 1998).
1.3.2.3.2 Vloeistofchromatografie (LC)
Bij bepaling van berengeur wordt er gebruik gemaakt van omgekeerde fase
vloeistofchromatografie (RPLC) waarbij de mobiele fase meer polair is dan de stationaire fase
(Hansen-Møller, 1992; Hansen-Møller, 1994). Als stationaire fasen worden relatief apolaire
chemisch gemodificeerde stoffen gebruikt, terwijl de mobiele fasen een combinatie zijn van
water en (polaire) organische solventen.
Voor de bepaling van skatol en indol in bloedplasma, speeksel, vetweefsel,… wordt
het gehomogeniseerde staal voorbereid en ingevroren. Na centrifugatie wordt het supernatans
overgebracht in een HPLC vial en RPLC toegepast. Er wordt gradiëntelutie gebruikt omdat
hierdoor een vlottere en betere scheiding van de componenten bekomen wordt. Hierna worden
de analieten gekwantificeerd door middel van een fluorescentiedetector (Hansen-Møller,
1992; Garcia-Regueiro & Rius, 1998; Zamaratskaia et al., 2004a; Byrne et al., 2008).
Er kan ook normale fase vloeistofchromatografie (NPLC) gebruikt worden (Garcia-
Regueiro, 1989; Garcia-Regueiro, 1998; Rius & Garcia-Regueiro, 2001). Hierbij gebeurt de
13
extractie door middel van hexaan en is de mobiele fase hexaan/isopropanol. NPLC is
efficiënter voor hydrofobe substanties zoals skatol. Een groot voordeel van deze techniek is
dat er directe analyse van vetweefsel mogelijk is, zonder dat er een opzuivering nodig is, wat
zorgt voor tijdsbesparing.
Berengeur wordt echter niet alleen door skatol en indol veroorzaakt, maar ook door
androstenon. Hansen-Møller (1994) ontwierp een methode om het gehalte aan androstenon,
skatol en indol simultaan in vetweefsel te bepalen door middel van hoge druk
vloeistofchromatografie (HPLC). Nadat het vetweefsel gehomogeniseerd is, wordt het
gesmolten in een microgolfoven, gemengd met methanol (extractie), worden de interne
standaarden toegevoegd, geïncubeerd, in een ultrasoonbad geplaatst en ten slotte ingevroren.
Soms wordt er een tweede keer geëxtraheerd met methanol waarna het staal ingedampt wordt
onder stikstofgas en vervolgens in methanol terug wordt opgelost. Door deze
staalvoorbereiding zal het vet neerslaan en de berengeurcomponenten in het supernatans
achterblijven. Na centrifugatie wordt het supernatans overgebracht in een HPLC vial (Banon,
2003; Chen, 2006). Voor androstenonbepaling met HPLC is er geen derivatisatie nodig. Bij
de techniek van Hansen-Møller werd de fluorescentie door middel van een spectrofotometer
gemeten (Claus et al., 1997). Er wordt voorkeur gegeven aan meting van fluorescentie eerder
dan meting van ultraviolet licht (UV), gezien er minder organische solventen gebruikt worden
en de meting sneller, gevoeliger en selectiever gebeurt. Bij de bepaling van skatol en indol in
vetweefsel wordt een andere mobiele fase (methanol en 1% azijnzuur) gebruikt (Hansen-
Møller, 1994; Babol et al., 2004, Verheyden et al., 2007).
1.3.2.3.3 Massaspectrometrie (MS)
In tegenstelling tot vroeger wordt LC tegenwoordig gekoppeld aan MS (LC/MS). Bij
HPLC werden kolommen gebruikt bestaande uit pakkingsmateriaal met diameter 5 µm.
Gezien snellere analyses en een hogere capaciteit een must waren, werd ultrahoge druk
vloeistofchromatografie (U-HPLC) ontwikkeld (Wu & Clausen, 2007). Bij U-HPLC worden
kolommen gebruikt waarvan de deeltjesdiameter maximum 2 µm is. Hierdoor ontstonden er
kortere kolommen, kortere analysetijden en was er minder solvent nodig. Door de hoge druk
wordt een hogere resolutie en een snellere en betere scheiding bekomen.
De detectie van de componenten androstenon, skatol en indol in vetweefsel kan
gebeuren door middel van MS. Hierbij worden de componenten geïoniseerd zodat ze geladen
moleculen of moleculefragmenten vormen. Deze ionen kunnen gesorteerd en geïdentificeerd
14
worden op basis van hun massa-over-lading verhouding (m/z). Tevens kan ook de abundantie
van elke component gemeten worden (De Brabander et al., 2007).
Gezien de componenten geïoniseerd moeten worden is er nood aan een ionisatiebron.
Sinds enige tijd wordt er gebruik gemaakt van atmosferische druk ionisatie (API). Dit zorgt
ervoor dat een groter aantal componenten geanalyseerd kan worden met behulp van LC/MS.
De moleculen worden geïoniseerd bij atmosferische druk en de ionen worden mechanisch en
elektrostatisch gescheiden van de neutrale moleculen. Voor berengeur wordt specifiek gebruik
gemaakt van atmosferische druk chemische ionisatie (APCI) (Figuur 1.9). Het LC eluens
wordt door een verwarmde buis gebracht waardoor er gasvormige solventmoleculen (aërosol)
ontstaan. Tevens zorgt het aanwezige inerte stikstofgas (N2) voor extra verdamping. De
gevormde moleculen worden geïoniseerd door geladen elektronen afkomstig van een
coronanaald en door chemische reacties wordt ook het analiet geladen. Er wordt in positieve
modus gewerkt omdat kleine apolaire deeltjes, met grootte tussen 100 - 1000 Dalton (Da)
beter gescheiden worden (Willoughby et al., 2002).
Figuur 1.9: Schema van Atmosferische Druk Chemische Ionisatie (APCI)
Om de positief geladen moleculen te analyseren werden tijdens dit onderzoek drie
types van massa analysatoren gebruikt: een „linear ion trap quadrupole‟, een „triple stage
quadrupole‟ en een Orbitrap massa analysator.
A. Linear Ion Trap Quadrupole massa analysator
Een „linear ion trap quadrupole‟ of „quadrupole ion trap‟ massa analysator bestaat uit
drie hyperbolische elektroden: één ring elektrode en twee „end-cap‟ elektroden (Figuur 1.10).
Door spanningen aan te leggen tussen de elektroden vormen deze een holte waarin de ionen
opvangen worden in een stabiele oscillerende baan. De exacte beweging van de ionen is
15
afhankelijk van de aangelegde spanning en hun m/z. Wanneer de precursorionen gevangen
zitten heeft er een botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) plaats waarbij productionen
ontstaan die gedetecteerd kunnen worden. Detectie gebeurt door een „elektron multiplier‟
waarbij ionen tegen het oppervlak botsen en zorgen voor de vorming van secundaire
elektronen, die geëmitteerd worden. Deze secundaire ionen vormen een stroom die kan
waargenomen worden (March, 1997).
Figuur 1.10: Schema van een ‘linear ion trap quadrupole’ massa analysator
Een „linear ion trap quadrupole‟ massa analysator werd onlangs gebruikt bij de
ontwikkeling van een LC/MS procedure met gradiëntelutie die androstenon, skatol en indol
simultaan bepaalt (Verheyden et al., 2007). Het is van groot belang de drie componenten
simultaan te bepalen, gezien dit tijd- en kostensparend werkt. De extractie van de
componenten gebeurt door middel van methaan en de opzuivering bestaat uit afkoeling,
stikstofindamping, centrifugatie en filtratie. Als mobiele fasen worden methanol en 1%
azijnzuur gebruikt. De ionisatie gebeurt door middel van APCI en de MS staat in de „Product
Ion Scan‟ (PIS) modus. De methode, inclusief extractie, is echter niet robuust genoeg om in
routine analyse te kunnen gebruiken.
B. Triple Stage Quadrupole massa analysator
Een „triple stage quadrupole‟ massa analysator bestaat uit drie quadrupolen. Elke
quadrupool bestaat uit vier parallelle ijzeren staven rond een centrale as (Figuur 1.11). Tussen
elke set tegenoverstaande polen wordt een spanning aangelegd en er wordt ook een directe
spanning aangelegd waardoor een massafilter ontstaat. Enkel ionen die een bepaalde m/z
hebben kunnen deze filter passeren en zullen gedetecteerd worden. Ionen kunnen net zoals bij
een „linear ion trap quadrupole‟ massa analysator gefragmenteerd worden tijdens een CID.
Zoals reeds vermeld bestaat een „triple stage quadrupole‟ massa analysator uit drie
16
quadrupolen: één voor selectie van de m/z, één voor fragmentatie en één voor PIS. De detectie
gebeurt zoals bij een „linear ion trap quadrupole‟ massa analysator (Willoughby et al., 2002).
Figuur 1.11: Schema van een ‘triple stage quadrupole’ massa analysator
C. Orbitrap massa analysator
Bij deze massa analysator hangt het succes van de gehele analyse af van de
mogelijkheid om ionen te vangen en groepen van gevangen ionen in de Orbitrap te injecteren.
Dit gebeurt door een externe injectie waarbij de ionen gevangen worden in een
radiofrequentie-afhankelijk (RF) met gas gevulde gebogen quadrupool, de C-trap genaamd
(Figuur 1.12). In de Orbitrap worden de ionen elektrostatisch gevangen terwijl ze rond de
centrale elektrode draaien en een axiale oscillatie uitvoeren. De oscillerende ionen induceren
een stroom die kan gedetecteerd worden door een „elektron multiplier‟ (zie 1.3.2.3.3.A).
Daarna gebeurt er een snelle Fouriertransformatie (FFT), die de tijdsignalen van ionen met
verschillende massa‟s omzet in een frequentie waardoor hun m/z in een spectrum afgelezen
kunnen worden. Bij dit toestel kan enkel een niet-selectieve fragmentatie gebeuren, waarbij
niet meer geweten is van welk precursorion het verkregen production afkomstig is (Makarov
& Scigelova, 2010).
Figuur 1.12: Schema van de Orbitrap massa analysator
17
2. OBJECTIEVEN
Berengeur is een geur die kan vrijkomen wanneer vlees en/of vet afkomstig van beren
(mannelijke geslachtsrijpe varkens), verhit wordt. Gezien dit een indringende geur en een
bittere smaak van het varkensvlees met zich meebrengt, moet dit zoveel mogelijk vermeden
worden. Op dit moment zijn er reeds verschillende detectiemethoden voorhanden om
berengeur te meten, maar er bestaat nog geen internationale standaard detectiemethode. Twee
soorten methoden worden frequent aangewend: de sensoriële methoden, die eerder subjectief
zijn, en de laboratoriumanalyses, die als objectief kunnen beschouwd worden. Het grote
nadeel van de laboratoriumanalyses is echter dat deze vaak duur, arbeidsintensief en
tijdsrovend zijn en dat enkel de concentraties van gekende componenten gemeten worden.
Door Verheyden et al. (2007) werd een methode ontwikkeld die de drie
berengeurcomponenten simultaan bepaalt. Er werd echter vastgesteld dat de analytische
procedure niet voldoende robuust was, wat resulteerde in onvoldoende reproduceerbare
resultaten. Een oorzaak van dit probleem zou het gebrek aan staalvoorbereiding kunnen zijn,
maar dit vereist verder onderzoek.
Het doel van deze thesis bestond er daarom in een (U)-HPLC-MS(/MS) methode te
ontwikkelen die de drie berengeurcomponenten simultaan op een robuuste manier kan
bepalen. Tevens moet dit snel, goedkoop, accuraat en met zo weinig mogelijk arbeid bereikt
worden.
Voor de optimalisatie van deze methode waarbij HPLC analyse gekoppeld aan een
„linear ion trap quadrupole‟ massa analysator gebruikt wordt, werd er vertrokken van de
methode ontwikkeld door Verheyden et al. (2007). Voor de extractie van het staal werd er
vertrokken van de methode van Zamaratskaia et al. (2005). Vervolgens werden verschillende
opzuiveringsmethodes waaronder diverse soorten SPE en centrifugale filters geëvalueerd
teneinde de opzuivering te optimaliseren.
Nadat de staalvoorbereiding geoptimaliseerd werd, werd er overgegaan naar U-HPLC
analyse gekoppeld aan een „triple stage quadrupole‟ massa analysator en uiteindelijk een
Orbitrap massa analysator, om een kortere analysetijd, een betere selectiviteit en een betere
gevoeligheid te bekomen.
18
3. MATERIAAL EN METHODEN
3.1 MATERIAAL
3.1.1 Algemeen
Amicon Ultra – 0,5 mL Centrifugal Filters (Millipore, Massachusetts, VS)
Bargenvet (Slachthuis RIMA, Mechelen, België)
Kalibratie ionenoplossing (positief en negatief) (Sigma-Aldrich, St. Louis, VS)
Diepvries op -20 °C (PVBA Schatten, Brussel, België)
Erlenmeyers van 50 mL met NS hals en stop (VWR International, West Chester, VS)
Eppendorfcentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Duitsland)
Eppendorfs (Eppendorf, Hamburg, Duitsland)
HPLC vials met passende septa en doppen (Filterservice, Eupen, België)
Linear Ion Trap Quadrupole massaspectrometer (Finnigan LTQ, Thermo Fisher
Scientific, San José, VS)
Microgolfoven (Zanker, Zaventem, België)
Orbitrap massaspectrometer (ExactiveTM
, Thermo Fisher Scientific, San José, VS)
Plastiek proefbuizen van 15 mL (Meus Srl., Piove Di Sacco, Italië)
SPE Oasis HLB (30 µm – 3 cc – 60 mg) (Waters Corporation, Milford, VS)
Stikstofindamper Turbovap ® LV Evaporator (Zymark, Teralfene, België)
Triple Stage Quadrupole massaspectrometer (Quantum TSQ Vantage, Thermo Fisher
Scientific, San José, VS)
Ultrasoonbad Transsonic digital S (Elma GmbH & Co KG, Singen, Duitsland)
Vortex (Labworld Yellowline IKA, Boutersem, België)
Warmwaterbad (GFL, Burgwedel, Duitsland)
3.1.2 Reagentia en chemicaliën
Berengeurcomponenten:
Androstenon of 5-α-androst-16-en-3-on (Steraloids Inc, Newport, VS)
Indol of 2,3-benzopyrol (Merck, Darmstadt, Duitsland)
Skatol of 3-methylindol (Merck, Darmstadt, Duitsland)
19
Interne standaarden:
Androstadienedion of 1,4-androstadieen-3,17-dione (Sigma-Aldrich, St. Louis, VS)
2-methylindol (Merck, Darmstadt, Duitsland)
Opzuivering en analyse:
Aceton for analysis (Merck, Darmstadt, Duitsland)
Acetonitril Optima LC-MS (Fisher Scientific, Leichestershire, VS)
Azijnzuur (Merck, Darmstadt, Duitsland)
Methanol Optima LC-MS (Fisher Scientific, Leichestershire, VS)
Methanol pro analysis (Merck, Darmstadt, Duitsland)
Mierenzuur (Merck, Darmstadt, Duitsland)
Ultrapuurwater (Waterzuiveringstoestel Arium ® 611UV, VWR, Haasrode, België)
3.1.3 Oplossingen
Tabel 3.1: Oplossingen
Spike oplossing berengeur (BG)
10 ng/µL BG 100 ng/µL BG 1000 ng/µL MeOH
100 ng/µL BG 100 µL* 700 µL
50 ng/µL BG 500 µL 500 µL
10 ng/µL BG 100 µL 900 µL
1 ng/µL BG 100 µL 900 µL
* van elke component: indol, skatol en androstenon
Interne standaard oplossing (IS)
ADD
100 ng/µL
2-MID
100 ng/µL
10 ng/µL IS MeOH
50 ng/µL IS
10 ng/µL IS
1 ng/µL IS
500 µL
100 µL
500 µL
100 µL
100 µL
800 µL
900 µL
Solventen
Azijnzuur Mierenzuur Ultrapuurwater
1% azijnzuur 10 mL 990 mL
0,5% azijnzuur 5 mL 995 mL
0,2% mierenzuur 2 mL 998 mL
0,1% mierenzuur 1 mL 999 mL
0,05% mierenzuur 0,5 mL 999,5 mL
20
Vervolg Tabel 3.1: Oplossingen
Elutie-en wasvloeistoffen
Aceton MeOH Ultrapuurwater
Aceton/MeOH 80:20 800 mL 200 mL
Aceton/MeOH 50:50 500 mL 500 mL
50% MeOH 10 mL 10 mL
20% MeOH 4 mL 16 mL
10% MeOH 2 mL 18 mL
5% MeOH 1 mL 19 mL
Standaardoplossingen
Standaard 1 ng/µL BG 1 ng/µL IS MeOH Azijnzuur Mierenzuur (0,05%)
LTQ 100 µL 100 µL 400 µL 400 µL (1%)
TSQ 100 µL 100 µL 300 µL 500 µL
Orbitrap 100 µL 100 µL 300 µL 500 µL
3.2 METHODEN
3.2.1 Staalvoorbereiding
3.2.1.1 Protocol staalvoorbereiding
Vetstalen kunnen niet rechtstreeks door het HPLC toestel geanalyseerd worden. Er is
staalvoorbereiding nodig waarbij de verschillende stappen strikt dienen gevolgd te worden om
reproduceerbare resultaten te bekomen. Er werden verscheidene staalvoorbereidingen zoals de
vaste fase extractie (SPE) en het gebruik van amicon filters met verschillende poriëngroottes,
getest.
Tabel 3.2: Spikingvolumes per erlenmeyer
Aantal ppb Hoeveelheid (µL) van
spike oplossing BG
Concentratie spike
oplossing BG (ng/µL)
Hoeveelheid (µL) interne
standaard (50 ng/µL)
0 / / 20
100 20 10 20
250 50 10 20
500 20 50 20
750 30 50 20
1000 20 100 20
1500 30 100 20
2000 40 100 20
21
Vet afkomstig van de nekregio van bargen wordt vrij van androstenon geacht, bevat
een minieme hoeveelheid indol en skatol en kon daardoor als blanco matrix voor deze analyse
gebruikt worden. Na transport werd het vet van vlees- en huidresten ontdaan en diepgevroren
bij -20 °C. Er werd telkens 2g vet in kleine stukjes gesneden en in een erlenmeyer van 50 mL
gebracht. Vervolgens werd het vet gespiked. In Tabel 3.2 worden de specifieke
spikingvolumes per erlenmeyer aangegeven. Het gevolgde protocol wordt samengevat
weergegeven in Tabel 3.3.
Tabel 3.3: Protocol staalvoorbereiding
1. Bargenvet snijden en telkens 2g vet spiken
2. Vet laten smelten in de microgolfoven (3 minuten op 220 watt en 3 minuten wachten)
3. 150 µL vet pipetteren en in een eppendorf brengen
4. 750 µL MeOH toevoegen
5. Vortexen
6. 60 minuten in warmwaterbad op 60 °C (na 30 minuten eens opschudden)
7. Afkoelen gedurende 60 minuten in diepvries bij -20 °C
8. Zonder te laten ontdooien centrifugeren bij 14.000 rpm, 5 minuten en 4 °C in
eppendorfcentrifuge
9. Vaste fase extractie (SPE):
Conditionering: 2 mL MeOH
Equilibratie: 2 mL 5% MeOH
Belading: 500 µL extract gemengd met 9500 µL ultrapuurwater (H2O)
Wassen: 2 mL 20% MeOH
Elutie: 1 mL MeOH
Extract opvangen
10. HPLC vial: 500 µL extract + 500 µL 0,05% mierenzuur
22
3.2.1.2 Geteste opzuiveringsstappen
3.2.1.2.1 Vaste fase extractie (SPE)
Opzuivering via SPE heeft tot doel de berengeurcomponenten indol, skatol en
androstenon op de kolom vast te houden door interactie met het pakkingsmateriaal terwijl de
matrixcomponenten verwijderd worden. Op die manier worden na elutie enkel de gewenste
analieten bekomen. De scheiding gebeurt door een polaire mobiele fase over een apolaire
stationaire fase te laten lopen. Er werd gebruik gemaakt van een Oasis HLB kolom (30 µm –
3 cc – 60 mg). Deze kolom is relatief hydrofoob, kent een hoge retentie en bezit een hoge
scheidingscapaciteit. Bij de vetanalyse wordt gebruik gemaakt van de veel gebruikte
omgekeerde fase (RP)-SPE waarbij een apolaire vaste stof bestaande uit silica in de kolom
vast zit. De functionele groepen van de silica gaan door middel van Van der Waalse krachten
met de analieten binden. Dit wil zeggen dat er een interactie ontstaat tussen de aanwezige
koolstofketens en de actieve groepen op het pakkingsmateriaal. Bij RP-SPE worden vooral
hydrofobe componenten weerhouden, wat een voordeel is bij deze analyse gezien zowel
androstenon, skatol als indol hydrofoob zijn.
De kolom moet geconditioneerd en geëquilibreerd worden en vervolgens geladen
worden met extract. Door te conditioneren wordt de stationaire fase geactiveerd zodat
interactie met het staal mogelijk wordt. Om maximale retentie te bekomen is equilibratie
nodig waarbij een solvent zoals bv. methanol gebruikt wordt. Door de kolom te wassen en te
drogen worden ongewenste, storende componenten verwijderd. Uiteindelijk worden de
gewenste berengeurcomponenten geëlueerd. Hierbij worden de aanwezige Van der Waalse
krachten verstoord door elutie met methanol waardoor de analieten loskomen en elueren.
Er werden verschillende experimenten uitgevoerd. Zo werd er getest of een andere
was- of elutievloeistof betere resultaten gaf (Tabel 3.4). Er werd ook gespeeld met het tijdstip
van elutie en met het al dan niet toepassen van indamping onder stikstofgas (Tabel 3.5).
Tabel 3.4: SPE als staalvoorbereiding: effect van was- en elutievloeistof
Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4
Wassen 5% MeOH 10% MeOH 20% MeOH 50% MeOH
Elutie ACN: 1e mL ACN: 2
e mL Aceton/MeOH 50:50
2e mL
Aceton/MeOH 80:20
2e mL
23
Tabel 3.5: SPE als staalvoorbereiding: effect van elutie tijdstip en indamping
Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4
Conditionering: 2 mL MeOH X X X X
Equilibratie: 2 mL 5% MeOH
Belading: 500 µL extract + 9500 µL H2O
Wassen: 2 mL 20% MeOH
Elutie: 1 mL MeOH
Indamping: N2-gas
Heroplossen in MeOH
X
X
X
1e mL
-
-
X
X
X
1e mL
tot 100 µL
X
X
X
X
1e mL
alles
X
X
X
X
2e mL
-
-
3.2.1.2.2 Amicon Filter
Er werden testen uitgevoerd met een amicon filter met poriëngrootte 10.000 en 30.000
Dalton (Da) met als doel om op deze wijze een meer zuivere vloeistof te genereren.
3.2.2 HPLC-MS/MS-analyse
Voor de hoge druk vloeistofchromatografie gekoppeld met tandem
massaspectrometrie (HPLC-MS/MS)-analyse werd er gebruik gemaakt van een Surveyor
HPLC gekoppeld aan een „linear ion trap quadrupole‟ massaspectrometer (Finnigan LTQ,
Thermo Fisher Scientific, San José, VS) om de geëxtraheerde en opgezuiverde vetstalen te
kunnen analyseren.
3.2.2.1 HPLC
3.2.2.1.1 HPLC kolommen
Allereerst werd er gebruik gemaakt van een Symmetry ® C18 kolom (5 µm, 150 mm
x 2,1 mm ID, Waters Corporation, Milford, VS) waarbij een constant debiet van 300 µL min-1
over de kolom liep. Het gaat om een niet gemodificeerde silicakolom die door de
aanwezigheid van octadecylgroepen (C18H37) een hoge affiniteit heeft voor apolaire
componenten. Zo zullen de C18 ketens door middel van Van der Waalse krachten hydrofobe
interacties aangaan met de cyclische gedeelten van androstenon, indol en skatol.
24
Vervolgens werd ook een NUCLEODUR Hypercarb kolom getest (5 µm, 100 mm x
2,1 mm ID, Thermo Fisher Scientific, San José, VS). De selectiviteit van het
pakkingsmateriaal van de Hypercarb kolom is verschillend van die van de silicakolom waarbij
de Hypercarb beter geschikt is voor scheiding van sterk polaire componenten. Nog een
voordeel is de efficiëntere scheiding van structureel verwante componenten. Tevens is de
kolom bestand tegen hoge temperaturen en blijft hij stabiel bij extreme pH-waarden.
Als laatste kolomtype werd de NUCLEODUR Sphinx RP kolom gebruikt (5 µm,
250 mm x 4 mm ID, Macherey-Nagel, Dűren, Duitsland). Dit is een bifunctionele kolom die
propylfenylgroepen en C18 ketens bevat. De propylfenylgroepen binden polaire substanties
door middel van π-π interacties, terwijl de C18 ketens apolaire substanties vasthouden door
middel van hydrofobe interacties. Hierdoor is deze kolom zeer geschikt om aromatische
componenten te weerhouden. Deze kolom kent tevens een hoge specificiteit waardoor deze
gebruikt kan worden voor HPLC-MS/MS-analyse.
3.2.2.1.2 HPLC Solventen
Gezien het van belang is dat de berengeurcomponenten een goede affiniteit hebben
voor de solventen, werd er gezocht naar de ideale solventcombinatie. Zo werden er
experimenten met verschillende solventen uitgevoerd (Tabel 3.6).
Tabel 3.6: Solventen voor HPLC-MS/MS-analyse
Solvent A Solvent B Solvent C
Experiment 1 Acetonitril 1% azijnzuur /
Experiment 2 Methanol 1% azijnzuur Acetonitril
Experiment 3 Methanol 1% azijnzuur /
3.2.2.1.3 HPLC Gradiënt
Vertrekkende van de gradiënt die gebruikt werd in de methode van Verheyden et al.
(2007) werd er door de relatieve solventsamenstelling te variëren naar een optimale gradiënt
gezocht. Bij elke run werd er 10 µL staal geïnjecteerd. De geoptimaliseerde gradiënt voor de
HPLC-analyse wordt weergegeven in Tabel 4.1.
25
3.2.2.2 Linear Ion Trap Quadrupole
De algemene parameters voor de LTQ-analyse worden weergegeven in Tabel 3.7. Op
de „linear ion trap quadrupole‟ massaspectrometer werd een verwarmde APCI-bron bevestigd.
De drie-dimensionele positiecoördinaten van de APCI-bron waren: verticaal B-C en
horizontaal 0. De massaspectrometrische parameters geldig voor de detectie van de
berengeurcomponenten worden weergegeven in Tabel 3.8.
Tabel 3.7: Algemene parameters voor LTQ-analyse
Onderdeel Parameter Waarde
APCI-bron Sheath gasdebiet (arb) 50
Auxiliary gasdebiet (arb) 5
Ion sweep gasdebiet (arb) 5
Spray voltage (V) 5000
Temperatuur vernevelaar (°C)
Ionisatie modus
400
Positief
Capillair Temperatuur capillair (°C) 275
Capillair voltage (V) 1
Tube lens voltage (V) 65
Skimmer voltage (V) Automatisch
Tabel 3.8: Massaspectrometrische parameters voor LTQ-analyse (de meest abundante
productionen zijn onderstreept)
Analiet Precursorion (m/z) Production (m/z) Collisie-energie (eV)
Androstadienedion 285 267, 171, 147, 121 25
Androstenon 273 255, 199, 173, 159 25
Indol 118 100, 91, 86 70
Skatol 132 117, 100 70
2-methylindol 132 117, 100 70
3.2.3 U-HPLC-MS/MS
Na optimalisatie van de HPLC-MS/MS-analyse met de „linear ion trap quadrupole‟
massaspectrometer, werd er overgegaan naar ultrahoge druk vloeistofchromatografie
gekoppeld met tandem massaspectrometrie (U-HPLC-MS/MS)-analyse met een „triple stage
quadrupole‟ (Quantum TSQ Vantage, Thermo Fisher Scientific, San José, VS) als massa
analysator.
26
3.2.3.1 U-HPLC
Net zoals bij de HPLC-analyse moest ook deze techniek geoptimaliseerd worden. Dit
werd wederom gedaan door experimenten met verschillende kolommen, solventen en
gradiënten uit te voeren. Om de experimenten uit te voeren werd gestart van de waarden die
bekomen werden bij optimalisatie van de HPLC-analyse (4.2.1).
3.2.3.1.1 U-HPLC Instellingen
Bij elke run werd er 10 µL staal in het U-HPLC-MS/MS systeem geïnjecteerd en de
solventflow bedroeg 300 µL min-1
bij aanvang van de optimalisatie. Verschillende parameters
zoals de temperatuur van de kolomoven en het debiet werden geoptimaliseerd. Deze
parameters maken deel uit van de optimalisatie en kunnen daarom teruggevonden worden in
4.3.1.1.
3.2.3.1.2 U-HPLC Kolommen
Net zoals bij de HPLC-experimenten werd een NUCLEODUR Sphinx RP kolom
(1,8 µm, 100 mm x 2,1 mm ID, Macherey-Nagel, Düren, Duitsland) getest. Er werden ook
testen met de Hypersil Gold kolom (Thermo Fisher Scientific, San José, VS) gedaan. Deze
kolom bestaat uit pure silica die een goede C18 selectiviteit bezit. In vergelijking met de
gewone C18 kolommen, heeft deze kolom minder last van „tailing‟ en is de gevoeligheid
hoger. De Hypersil Gold (1,9 µm, 50 mm x 2,1 mm ID) en de Hypersil Gold (1,9 µm, 100
mm x 2,1 mm ID) kolommen werden eveneens uitgetest.
Als derde kolomtype werd een NUCLEODUR C18 Isis kolom (1,8 µm, 50 mm x 2
mm ID, Macherey-Nagel, Düren, Duitsland) gebruikt. Deze bestaat wederom uit pure silica,
maar hier is de silica gecrosslinked met apolaire, polymerische octadecylgroepen. Door deze
modificatie wordt een sterke sterische selectiviteit bekomen.
3.2.3.1.3 U-HPLC Solventen
Gezien azijnzuur in hoge concentraties (1%) op termijn schade kan berokken aan
zowel de kolom als het toestel, werd een lagere concentratie (0,5%) uitgeprobeerd. Hierdoor
kunnen het toestel en de kolom langer gebruikt worden, wat voor kostenverlaging zorgt. Het
tweede solvent bleef methanol. Er werden ook testen uitgevoerd met een ander zuur als
additief en dat in verschillende concentraties: 0,2% mierenzuur (HCOOH), 0,1% HCOOH en
27
0,05% HCOOH. Het tweede solvent bleef methanol. Mierenzuur heeft een hogere zuurtegraad
dan azijnzuur waardoor bij gebruik van mierenzuur als solvent een lagere concentratie kon
gebruikt worden.
3.2.3.1.4 U-HPLC Gradiënt
Vertrekkende van de gradiënt die bekomen werd voor de HPLC-analyse (Tabel 4.1)
werd terug via variërende waarden naar een optimale gradiënt gezocht. De gradiënt die
uiteindelijk als optimaal werd bevonden wordt weergegeven in Tabel 4.2.
3.2.3.2 Triple Stage Quadrupole
Een verwarmde APCI-bron werd op de „triple stage quadrupole‟ massa analysator
bevestigd. De drie-dimensionale positiecoördinaten van de APCI-bron waren dezelfde als die
gebruikt bij de LTQ.
3.2.3.2.1 TSQ optimalisatie
Net zoals bij de LTQ moest ook deze techniek geoptimaliseerd worden. Om de diverse
berengeurcomponenten te kunnen analyseren werd er per component naar de productionen
gekeken. De exacte massa‟s van deze productionen, de nodige collisie-energie en S-lens
voltage, waardoor de vorming en optimale detectie van deze productionen mogelijk werd,
werden bepaald. Dit werd bekomen door elke component individueel te infuseren in de TSQ.
De bekomen massaspectrometrische parameters voor TSQ-analyse worden weergegeven in
Tabel 4.3, aangezien deze deel uitmaken van de optimalisatie van de methode.
Verschillende waarden voor de algemene parameters van de TSQ-analyse, met name
voor de APCI-bron en het capillaire gedeelte, werden tevens uitgetest om een zo goed
mogelijk resultaat van de analyse te bekomen. Zo werd onder andere naar een optimale
waarde gezocht voor het sheath gasdebiet, het auxiliary gasdebiet en het ion sweep gasdebiet
(Tabel 4.4).
3.2.4 U-HPLC-HR-MS
3.2.4.1 U-HPLC
Na optimalisatie van de U-HPLC-MS/MS-analyse met de TSQ werd overgegaan naar
ultrahoge druk vloeistofchromatografie gekoppeld met hoge resolutie massaspectrometrie (U-
28
HPLC-HR-MS)-analyse met de Orbitrap (ExactiveTM
, Thermo Fisher Scientific, San José,
VS) als massaspectrometer. Voor deze analyse werd de methode, die gebruikt werd bij de U-
HPLC-MS/MS-analyse, beschreven in 3.2.3, overgedragen.
3.2.4.2 Orbitrap ExactiveTM
Op de Orbitrap ExactiveTM
massa analysator werd een verwarmde APCI-bron op
dezelfde manier bevestigd als bij de LTQ en de TSQ. De Orbitrap werd om de 24u
gekalibreerd met een positieve en een negatieve modus ionenoplossing.
Het gaat hier om hoge resolutie massaspectrometrie (HR-MS) waarbij de massa‟s heel
accuraat kunnen gedetecteerd worden. Gezien de Orbitrap ExactiveTM
dus met hoge
accuraatheid massa‟s kan waarnemen, tot vijf cijfers na de komma, werden de MS parameters
aangepast. Dit gebeurde door elke component individueel te infuseren in het toestel. De
bekomen massaspectrometrische parameters voor Orbitrap-analyse worden weergegeven in
Tabel 4.5, aangezien deze deel uitmaken van de optimalisatie van de methode. Gezien de
massa‟s binnen een bepaalde marge gedetecteerd worden, werd deze marge berekend via
formule 3.1. Voor elke component werd ook de accurate massa (ppm) berekend (formule 3.2).
Marge = berekende massa – waargenomen massa (3.1)
ppm = (marge / berekende massa) x 106 (3.2)
Vervolgens werden verschillende waarden voor de algemene parameters van de
analyse, met name voor het capillaire gedeelte geoptimaliseerd, teneinde een zo goed
mogelijk resultaat van de analyse te bekomen. Zo werd onder andere naar een optimale
waarde gezocht voor de voltage van het capillair, de voltage van de tube lens en de voltage
van de skimmer. Deze waarden konden niet manueel aangepast worden bij de TSQ.
Ook andere essentiële parameters zoals de resolutie en het „Automatic Gain Control‟ AGC
target werden geoptimaliseerd door middel van ijklijn analyse (Tabel 3.9). De parameters
maken deel uit van de optimalisatie en kunnen terug gevonden worden in Tabel 4.6.
Tabel 3.9: Resolutie en AGC target experimenten
Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4
Resolutie High High Ultrahigh Ultrahigh
AGC target
High dynamic
range
Ultimate mass
accuracy
High dynamic
range
Ultimate mass
accuracy
29
3.2.4.3 Prestatiecriteria
De ontwikkelde U-HPLC-HR-MS-analyse gekoppeld met de Orbitrap ExactiveTM
kan
gevalideerd worden volgens de criteria die beschreven worden in de EU Commission
Directive 2002/657/EC ter uitvoering van richtlijn 96/23/EC van de Raad voor analytische
residu methoden voor matrices afkomstig van dierlijke oorsprong. De methodeontwikkeling
werd op deze criteria gebaseerd aangezien voor de analyse van berengeur in varkensvet geen
strikte richtlijnen bestaan.
Wegens tijdsgebrek kon er geen volledige validatie uitgevoerd worden. Op basis van
de uitgevoerde experimenten kon echter wel reeds een beeld gevormd worden van enkele
parameters, die in de toekomst specifiek en in detail onderzocht zullen worden tijdens de
effectieve validatie.
De specificiteit en selectiviteit handelen over het vermogen van de methode om de te
bepalen analieten (indol, skatol en androstenon) te onderscheiden van nauw verwante stoffen.
De precisie van een methode kan onderzocht worden aan de hand van de
herhaalbaarheid en de intralaboratoriumreproduceerbaarheid. De herhaalbaarheid richt zich op
de resultaten die onafhankelijk van elkaar verkregen werden met behulp van dezelfde
methode bij identiek analysemateriaal in hetzelfde laboratorium door dezelfde laborant met
dezelfde apparatuur. Gezien het merendeel van de experimenten door dezelfde laborant
uitgevoerd werden, kon er een besluit over de herhaalbaarheid genomen worden. Gezien er bij
het laatste experiment telkens een ijklijn gemaakt werd door twee verschillende laboranten, op
twee verschillende dagen, maar met identiek analysemateriaal en dezelfde apparatuur, kon de
intralaboratoriumreproduceerbaarheid expliciet berekend worden. Om deze te berekenen werd
de gemiddelde concentratie, de standaardafwijking en de relatieve standaarddeviatie (RSD)
(in %) berekend voor de twee ijklijnen (Tabel 4.7). Wanneer de RSD beneden de 20% ligt kan
er over een goede intralaboratoriumreproduceerbaarheid gesproken worden (EU Commission
Directive, 2002).
De lineariteit kon onderzocht worden door de correlatiecoëfficiënten (R²) van de
verschillende ijklijnen na te gaan. Voor elke analysedag werd steeds een ijklijn gemaakt,
bestaande uit één blanco vetstaal en zeven vetstalen met verschillende spikingniveaus aan
berengeurcomponenten (100, 250, 500, 750, 1000, 1500 en 2000 ppb).
30
4. RESULTATEN
4.1 STAALVOORBEREIDING
Een belangrijke stap in de analyseprocedure is de staalvoorbereiding. Hierdoor worden
de stalen opgezuiverd en is er opconcentrering van de gewenste berengeurcomponenten
androstenon, indol en skatol. Vorig onderzoek wees reeds uit dat het protocol van
Zamaratskaia et al. (2005) het beste was om de optimalisatie van de staalvoorbereiding te
starten. Na voorbereiding van de vetstalen via bovenstaand protocol, werden deze aan SPE
onderworpen.
Hiertoe werden verschillende testen uitgevoerd waar het 1e mL eluaat zowel als
dusdanig werd geanalyseerd als ingedampt werd tot 100 µL of tot droog. Na het indampen
werd het droge staal heropgelost in methanol en 1% azijnzuur (50:50). Ook werd getest of
analyse van het 2e mL eluaat betere resultaten opleverde. Daarnaast werd ook de amicon filter
met poriëngrootte 10.000 Da en 30.000 Da als opzuiveringstechniek getest.
Na het bekijken van de piekoppervlakteverhoudingen van de vetstalen gespiked met
500 ppb aan interne standaard en 2000 ppb aan berengeurcomponenten, kwamen twee
technieken als beste naar voren: SPE waarbij de 1e mL aan eluaat geanalyseerd werd en de
SPE waarbij de 1e mL volledig ingedampt werd onder stikstofgas (Figuur 4.1).
Figuur 4.1: Resultaten staalvoorbereiding met SPE en amicon filter, waarbij de stalen gespiked
werden met 500 ppb interne standaard en 2000 ppb aan berengeurcomponenten
Legende: 1 = geen opzuivering; 2 = SPE 1e mL; 3 = SPE 1
e mL ingedampt tot 100 µL; 4 = SPE 1
e mL alles
ingedampt; 5 = SPE 2e mL; 6 = amicon filter 10.000 Da; 7 = amicon filter 30.000 Da
31
Hierbij en bij verdere experimenten werd vooral naar androstenon gekeken, gezien in
het verleden met deze component de meeste problemen opdoken. De
piekoppervlakteverhouding werd bekomen door de piekoppervlakte van de
berengeurcomponent uit te zetten op de piekoppervlakte van zijn interne standaard.
Om de beste methode te kunnen selecteren werden vervolgens 8-puntige ijklijnen in
vet geanalyseerd (0, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500 en 2000 ppb aan
berengeurcomponenten). Om de beste staalvoorbereiding te kiezen werd er gekeken naar
piekoppervlaktes (AA), retentietijden (RT), signaal-over-ruis verhoudingen (S/N) en
correlatiecoëfficiënten (R²) per berengeurcomponent. De SPE techniek waarbij de 1e mL aan
eluaat gebruikt werd voor analyse, bleek de beste te zijn (Figuur 4.2). De scheiding van skatol
en 2-methylindol (2-MID) was goed zichtbaar, de retentietijden lagen voor alle componenten
voor de 100% methanol en de S/N waarden waren bij deze staalvoorbereiding het hoogst.
Tevens waren de correlatiecoëfficiënten van deze ijklijnen voor alle componenten hoger dan
bij de andere staalvoorbereidingen.
Figuur 4.2: IJklijn staalvoorbereiding met SPE bij gebruik van het 1e mL eluaat
Vervolgens werden er testen uitgevoerd met verschillende concentraties methanol als
wasvloeistof (5%, 10%, 20% en 50%). Wanneer de piekoppervlakteverhoudingen van de
vetstalen, elk gespiked met 500 ppb interne standaard en 2000 ppb aan
berengeurcomponenten, vergeleken werden, konden echter geen significante verschillen
vastgesteld worden tussen de verschillende gebruikte wasvloeistoffen. Gezien de
correlatiecoëfficiënten het hoogst waren bij het gebruik van 20% methanol als wasvloeistof,
32
werd deze techniek verkozen (Figuur 4.3). Alle correlatiecoëfficiënten waren groter dan 0,98,
wat op statistisch juiste resultaten wijst.
Figuur 4.3: IJklijn voor SPE met 20% MeOH als wasvloeistof
Vervolgens werden verschillende elutievloeistoffen getest: 1 mL acetonitril (ACN)
voor elutie van het 1e en 2
e mL eluaat, 1 mL aceton/MeOH in verhouding 50:50 of 80:20 voor
elutie van het 2e mL eluaat en 1 mL MeOH voor elutie van de 1
e mL. Door de
correlatiecoëfficiënten van de ijklijnen te bekijken, bleek dat elutie met behulp van 1 mL
MeOH het beste resultaat opleverde (Figuur 4.4).
Figuur 4.4: IJklijn voor SPE met MeOH als elutievloeistof
33
4.2 HPLC-MS/MS
4.2.1 HPLC
4.2.1.1 HPLC Kolommen
Een geschikte kolom is van essentieel belang bij HPLC-analyse aangezien deze de
verschillende componenten van elkaar scheidt waardoor deze individueel waargenomen
kunnen worden door de massa analysator. Door analyse van berengeurstandaarden werden
verschillende kolommen uitgetest: de Symmetry C18, de Hypercarb en de Sphinx RP kolom
(Figuur 4.5).
Figuur 4.5: Chromatogram Symmetry C18 kolom (links) en Sphinx RP kolom (rechts)
34
Voor de evaluatie ervan werd er naar verscheidene factoren gekeken. Zo werd er
gestreefd naar een analyse met een hoge piekoppervlakte, een zo hoog mogelijke signaal-
over-ruis verhouding en een lage retentietijd. Omdat de componenten niet samen met de
solventpiek zouden elueren moeten te lage retentietijden (dood volume van de kolom)
vermeden worden. Ook de scheiding van de componenten skatol en 2-methylindol moet zo
goed mogelijk zijn (minstens op de basislijn gescheiden). Dit omdat deze twee componenten
dezelfde massa bezitten en dus enkel op basis van retentietijden door de massa analysator
kunnen onderscheiden worden.
De piekoppervlaktes en de S/N waarden lagen bij de Symmetry C18 kolom hoger dan
bij de andere kolommen. Bij de Symmetry C18 kolom elueerden tevens alle componenten voor
de 100% methanol bereikt werd. Dit is van belang gezien dan alles wat aanwezig was op de
kolom elueert en er dus grote kans is op meer interferentie. Tevens was ook de scheiding van
skatol en 2-MID het beste bij de Symmety C18 kolom. Door deze positieve resultaten werd de
Symmetry C18 kolom als beste kolom voor deze HPLC-analyse verkozen. De resultaten voor
de Hypercarb kolom worden niet weergegeven aangezien deze beduidend slechter waren dan
de Symmetry C18 en de Sphinx RP kolom.
4.2.1.2 HPLC Solventen
In de studie van Verheyden et al. (2007) werden, voor de analyse van vetstalen door
middel van HPLC gekoppeld aan een LTQ massaspectrometer, methanol en 1% azijnzuur als
solventen gebruikt. In deze studie werden er testen gedaan met verschillende
solventcombinaties, onder andere met acetonitril (ACN) en methanol. Ook een combinatie
van methanol, ACN en 1% azijnzuur werd uitgetest (Tabel 3.6). Het beste resultaat werd
verkregen bij het gebruik van methanol (MeOH) en 1% azijnzuur (HAc) als solventen (Figuur
4.6). Bovenstaand resultaat werd bevestigd door het lopen van ijklijnen, gespiked zoals bij
vorige ijklijnen. De correlatiecoëfficiënten lagen voor alle berengeurcomponenten boven de
0,99, wat terug op statistisch juiste resultaten wees.
35
Figuur 4.6: Resultaten analyse met verschillende solventcombinaties, waarbij elk staal gespiked
werd met 500 ppb interne standaard en 2000 ppb aan berengeurcomponenten
4.2.1.3 HPLC Gradiënt
Er werd vertrokken van de methode ontwikkeld door Verheyden et al. (2007). Deze
methode duurde echter 60 minuten per analyserun en androstenon elueerde pas bij 100%
methanol. Gezien alle componenten een retentietijd van minder dan 30 minuten hadden, werd
er geprobeerd een kortere methode te ontwikkelen. Als solventen werden 1% azijnzuur (A) en
methanol (B) gebruikt. Uiteindelijk werd met een methode van 35 minuten (Tabel 4.1) een
beter resultaat gerealiseerd dan bij de methode van Verheyden et al. (2007) gezien
androstenon nu wel voor de 100% methanol elueerde.
Tabel 4.1: Geoptimaliseerde gradiënt voor HPLC-analyse
Tijd (min) A (%) B (%) Debiet (µL min-1
)
0,00 60 40 300
1,00 60 40 300
1,10 55 45 300
7,00 55 45 300
8,00 5 95 300
25,00 0 100 300
25,01 0 100 300
30,00
35,00
60
60
40
40
300
300
4.2.2. HPLC-MS/MS-analyse van berenvet
In Figuur 4.7 wordt het chromatogram weergegeven voor een vetstaal gespiked met
500 ppb interne standaard en 500 ppb aan berengeurcomponenten, dat bekomen werd met de
36
ontwikkelde HPLC-MS/MS-analyse. Voor androstenon en androstadienedion is
matrixinterferentie echter zichtbaar.
Figuur 4.7: Chromatogram HPLC-MS/MS-analyse van berenvet
4.3 U-HPLC-MS/MS
Gezien bij analyse met een „linear ion trap quadrupole‟ massa analysator
matrixinterferentie werd waargenomen voor androstenon en androstadienedion, werd
geopteerd om naar een „triple stage quadrupole‟ systeem over te gaan. Hierbij werd tevens de
overgang gemaakt van klassieke HPLC naar ultra-performante (snelle) U-HPLC.
4.3.1 U-HPLC
4.3.1.1 U-HPLC Instellingen
Als ideale waarde voor de temperatuur van de kolomoven werd 30 °C gevonden.
Ondanks testen met hogere debieten zoals 400 en 500 µL min-1
bleek de waarde waarmee
gestart werd (300 µL min-1
) nog altijd de beste te zijn.
37
4.3.1.2 U-HPLC Kolommen
Net zoals voor de HPLC-analyse werd ook hier gezocht naar een geschikte kolom. Er
werden testen uitgevoerd met de Sphinx RP, C18 Isis, Hypersil Gold 50 mm en Hypersil Gold
100 mm kolom. Bij het bekijken van de chromatogrammen bleek de Hypersil Gold 50 mm
kolom het beste resultaat te geven. De piekoppervlaktes en de S/N waarden lagen hoger in
vergelijking met de andere kolommen, de retentietijden van alle componenten lagen voor de
100% methanol en skatol en 2-MID werden voldoende gescheiden (Figuur 4.8).
Figuur 4.8: Chromatogram Hypersil Gold 50 mm kolom
4.3.1.3 U-HPLC Solventen
Er werden testen uitgevoerd waarbij azijnzuur in concentratie verlaagd werd en
vervangen werd door mierenzuur in drie verschillende concentraties (0,2%; 0,1% en 0,05%).
Bij het bekijken van de chromatogrammen van een berengeurstandaard werden geen
38
significante verschillen vastgesteld. Voor de verschillende solventen werden ook ijklijnen
gelopen, gespiked zoals bij voorafgaande testen, waaruit bleek dat mierenzuur beter was. Dit
was te zien aan de hogere correlatiecoëfficiënten gevonden bij analyses waarbij mierenzuur in
plaats van azijnzuur als solvent werd gebruikt. Er werd voor de laagste concentratie
mierenzuur (0,05%) gekozen gezien dit beter is voor de kolom en het toestel.
4.3.1.4 U-HPLC Gradiënt
De gradiënt die uiteindelijk als optimaal werd bevonden, wordt weergegeven in Tabel
4.2. Als solventen werden 0,05% mierenzuur (A) en methanol (B) gebruikt.
Tabel 4.2: Geoptimaliseerde gradiënt U-HPLC-analyse
Tijd (min) A (%) B (%) Debiet (µL min-1
)
0,00 50 50 300
0,01 53 47 300
2,75 50 50 300
3,00 5 95 300
6,00
8,00
8,01
10,00
0
0
50
50
100
100
50
50
300
300
300
300
4.3.2 Triple Stage Quadrupole
4.3.2.1 TSQ optimalisatie
Door elke component afzonderlijk te infuseren werden het precursorion en de
productionen bepaald. Tevens werden specifieke massaspectrometrische parameters zoals
collisie-energie en S-lens voltage geoptimaliseerd. De bekomen resultaten worden
weergegeven in Tabel 4.3.
Tabel 4.3: Massaspectrometrische parameters voor TSQ-analyse
Analiet Precursorion
(m/z)
Production
(m/z)
Collisie-energie
(eV)
S-lens voltage (V)
Androstadienedion 285,2 77,0 49 70
91,0 38 70
121,0 23 70
147,0 18 70
Androstenon 273,2 77,0 50 74
91,0 39 74
93,0 30 74
255,2 13 74
39
Vervolg Tabel 4.3: Massaspectrometrische parameters voor TSQ-analyse
Analiet Precursorion
(m/z)
Production
(m/z)
Collisie-energie
(eV)
S-lens voltage (V)
Indol 118,1 38,9 48 66
65,0 32 66
91,0 22 66
117,3 22 66
Skatol 132,1 77,0 35 72
89,0 39 72
90,0 33 72
117,0 23 72
2-MID 132,1 63,0 55 74
77,0 36 74
89,0 40 74
117,0 22 74
De algemene, als best bevonden parameters voor de TSQ-analyse worden
weergegeven in Tabel 4.4.
Tabel 4.4: Algemene parameters voor TSQ-analyse
Onderdeel Parameter Waarde
APCI-bron Sheath gasdebiet (arb) 40
Auxiliary gasdebiet (arb) 10
Ion sweep gasdebiet (arb) 2
Spray voltage (V) 5000
Temperatuur vernevelaar (°C)
Ionisatie modus
250
Positief
Capillair Temperatuur capillair (°C) 270
Capillair voltage (V) Automatisch
Tube lens voltage (V) Automatisch
Skimmer voltage (V) Automatisch
4.3.3 U-HPLC-MS/MS-analyse van berenvet
In Figuur 4.9 wordt het chromatogram weergegeven voor een vetstaal gespiked met
500 ppb aan interne standaard en 2000 ppb aan berengeurcomponenten dat bekomen werd
met de ontwikkelde U-HPLC-MS/MS-analyse. Net zoals bij de LTQ werd ook hier
matrixinterferentie vastgesteld bij androstenon en androstadienedion.
40
Figuur 4.9: Chromatogram U-HPLC-MS/MS-analyse van berenvet
4.4 U-HPLC-HR-MS
Voor de U-HPLC-HR-MS-analyse door middel van een Orbitrap ExactiveTM
, werd de
U-HPLC methode die gebruikt werd bij de U-HPLC-MS/MS-analyse, beschreven in 4.3.1,
overgedragen.
4.4.1 Orbitrap ExactiveTM
Net zoals bij de TSQ werd ook voor de Orbitrap het MS gedeelte geoptimaliseerd
(Tabel 4.5). Door elke component apart te infuseren werd de exacte massa van het
precursorion bepaald. De Orbitrap massa analysator kan massa‟s zeer accuraat detecteren,
binnen een bepaalde marge. Deze marge werd berekend via formule 3.1, ook de accurate
massa (ppm) werd berekend (formule 3.2). Een waarde van minder dan 2 ppm betekent dat
een massaspectrometer massa‟s kan waarnemen tot vijf cijfers na de komma.
41
Tabel 4.5: Massaspectrometrische parameters voor Orbitrap-analyse
Analiet Massa + marge ppm Resolutie
Androstadienedion 285,18396 ± 0,00012 0,4208 38013
Androstenon 273,22032 ± 0,00020 0,7320 38613
Indol 118,06500 ± 0,00012 1,0160 47071
Skatol 132,08043 ± 0,00006 0,4543 55760
2-MID 132,08052 ± 0,00015 1,1360 55517
Voor optimalisatie van de APCI-bron en het capillaire gedeelte werden verschillende
experimenten uitgevoerd. Zo werd, door het uittesten van variërende waarden, de optimale
parameter voor de voltage van het capillair, de voltage van de tube lens en de voltage van de
skimmer gevonden. Hierbij werd telkens een berengeurstandaard geanalyseerd. Bij het
bekijken van de chromatogrammen werd voorkeur gegeven aan waarden waarbij de
piekoppervlakte groot was en de S/N waarde zo hoog mogelijk was. Gezien er verschillende
mogelijke combinaties als goed bevonden werden, werden er ijklijnen gelopen en
geanalyseerd. Door te kijken naar de hoogste correlatiecoëfficiënten werd er voor alle
componenten gekozen voor een capillair voltage van 70 V, een tube lens voltage van 90 V en
een skimmer voltage van 20 V. De R² voor indol was 0,9882, R² voor skatol = 0,9922 en R²
voor androstenon = 0,9930. Een overzicht van alle parameters wordt weergegeven in Tabel
4.6.
Tabel 4.6: Algemene parameters voor Orbitrap-analyse
Onderdeel Parameter Waarde
APCI-bron Sheath gasdebiet (arb) 40
Auxiliary gasdebiet (arb) 10
Ion sweep gasdebiet (arb) 2
Spray voltage (V) 5000
Temperatuur vernevelaar (°C)
Ionisatie modus
250
Positief
Capillair Temperatuur capillair (°C) 270
Capillair voltage (V) 70
Tube lens voltage (V) 90
Skimmer voltage (V) 20
Gezien de resolutie van een analyse zeer belangrijk is, werd voor deze analyse de
hoogste resolutie nagestreefd. Een resolutie van 100.000 „full width at half maximum‟
(FWHM) (Ultrahigh) werd niet ideaal bevonden gezien de gevoeligheid in matrix sterk
42
daalde. Tegelijkertijd werden ook verschillende waarden voor het AGC target uitgetest: „high
dynamic range‟ en „ultimate mass accuracy‟.
Bij het bekijken van de chromatogrammen werden de beste resultaten bekomen bij
gebruik van hoge resolutie (50.000 FWHM) en de „high dynamic range‟ AGC target. Om dit
resultaat te bevestigen werd voor elke combinatie een ijklijn, gelijkaardig gespiked aan vorige
testen, geanalyseerd. Het resultaat van de chromatogrammen werd bevestigd gezien de R²
voor dit experiment het hoogst waren. R² voor indol was 0,9886, voor skatol 0,9867 en voor
androstenon 0,9874. De piekoppervlaktes en de S/N waarden lagen bij deze parameters tevens
het hoogst.
4.4.2 U-HPLC-HR-MS-analyse van berenvet
In Figuur 4.10 wordt het chromatogam weergegeven voor een vetstaal gespiked zoals
bij 4.3.3, dat bekomen werd met de ontwikkelde U-HPLC-HR-MS-analyse. Er werd, net zoals
bij vorige analyses enige matrixinterferentie vastgesteld bij androstenon en androstadienedion
maar echter in een veel mindere mate. Hierdoor konden de berengeurcomponenten tot op een
zeer lage concentratie (100 ppb) waargenomen worden. Tevens lagen de S/N waarden veel
hoger dan bij vorige resultaten.
Figuur 4.10: Chromatogram U-HPLC-HR-MS-analyse van berenvet
43
4.4.3 Prestatiecriteria
Bij de ontwikkelde U-HPLC-HR-MS-analyse kan over een goede specificiteit en
selectiviteit gesproken worden aangezien de Orbitrap massaspectrometer massa‟s tot op vijf
cijfers na de komma nauwkeurig kan meten. Ook werd nauwelijks matrixinterferentie
waargenomen, zoals te zien in het chromatogram dat wordt weergegeven in Figuur 4.10.
Om de intralaboratoriumreproduceerbaarheid te berekenen werd de relatieve
standdeviatie (RSD) (in %) berekend voor een ijklijn in matrix, gespiked zoals vorige
ijklijnen, uitgevoerd door twee verschillende laboranten (n = 2) op twee verschillende dagen
(Tabel 4.7).
Tabel 4.7: Intralaboratoriumreproduceerbaarheid per component
Relatieve standaarddeviatie (%)
Component 100 ppb 250 ppb 500 ppb 750 ppb 1000 ppb 1500 ppb 2000 ppb
Androstenon 14,95 9,23 6,99 2,82 8,28 16,43 13,14
Indol 5,75 11,91 14,69 9,55 13,03 9,58 2,46
Skatol 19,52 7,10 11,29 1,44 12,41 7,55 0,63
De variatiecoëfficiënt ligt voor elke concentratie van de berengeurcomponenten onder
de 20% waardoor er over een goede intralaboratoriumreproduceerbaarheid kan gesproken
worden. Aangezien de RSDs telkens beantwoorden aan de vereiste 20%, kan verondersteld
worden dat ook de herhaalbaarheid voldoende zal zijn. Voor elke ijklijn werd per component
ook de vergelijking en de correlatiecoëfficiënt berekend (Figuur 4.11, 4.12). Een goede
herhaalbaarheid en intralaboratoriumreproduceerbaarheid impliceren een goede precisie.
Figuur 4.11 IJklijn U-HPLC-HR-MS-analyse uitgevoerd door laborant 1 op dag 1
44
Figuur 4.12: IJklijn U-HPLC-HR-MS-analyse uitgevoerd door laborant 2 op dag 2
Gezien er gedurende de optimalisatie van de U-HPLC-HR-MS-analyse gekoppeld aan
de Orbitrap massa analysator ijklijnen geanalyseerd werden waarvan de
correlatiecoëfficiënten boven de 0,98 lagen, kan er gesproken worden over een goede
lineariteit. Deze eerste evaluatie dient wel bevestigd te worden door een volledige validatie.
45
5. DISCUSSIE
Berengeur is de geur die vrijkomt bij verhitting van varkensvlees- en vet afkomstig
van beren (ongecastreerde mannelijke varkens). Gezien de onaangename smaak en geur van
het varkensvlees, moet dit zoveel mogelijk vermeden worden. Dit kan door castratie van
beren, maar gezien dit meestal zonder verdoving gebeurt, kent deze methode veel
tegenkanting. Er zijn reeds diverse alternatieven voorhanden. De productie van intacte beren
wordt als alternatief op lange termijn gezien, doordat deze productie vele voordelen met zich
meebrengt. Zowel voor deze productie als voor de andere alternatieven is het noodzakelijk dat
er een methode bestaat om berengeur te kunnen detecteren. Op dit moment is echter geen
standaardmethode voorhanden en bestaat er ook geen operationele definitie voor berengeur.
Tot op heden wordt berengeur opgespoord via sensoriële en laboratoriumanalyses. Bestaande
laboratoriumanalyses sporen enkel de indolische componenten (indol en skatol) of de
steroïden (androstenon) op. Ze worden dus niet simultaan bepaald. Een ander probleem is de
hoge kostprijs en de vele arbeid die een laboratoriumanalyse vergt. De methode van
Verheyden et al. (2007) is de enige vloeistofchromatografische (LC) methode waarbij de drie
berengeurcomponenten simultaan in vetweefsel bepaald worden. Deze gevalideerde methode
is gebaseerd op de methode ontwikkeld door Hansen-Møller (1994) waarbij gebruik gemaakt
werd van vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS). Het grote
probleem bij de methode van Verheyden et al. (2007) was echter het gebrek aan robuustheid.
Het doel van deze thesis bestond er dan ook in een robuuste methode voor de
simultane bepaling van de drie berengeurcomponenten te ontwikkelen. Allereerst werd de
staalvoorbereiding geoptimaliseerd waarbij vorig onderzoek aantoonde dat de
extractiemethode van Zamaratskaia et al. (2005) hiertoe het meest aangewezen bleek.
Vervolgens werden verscheidene staalopzuiveringen uitgetest, zoals de vaste fase extractie
(SPE) en de amicon filter. Evaluatie van beide opzuiveringstechnieken leidde tot selectie van
SPE waarbij het 1e mL eluaat geanalyseerd werd. Hierbij werd als wasvloeistof 20% methanol
als beste bevonden en voor elutie kreeg 1 mL methanol de voorkeur. Methanol was het beste
gezien deze de Van der Waalse krachten het best verbrak. De keuze voor SPE als bijkomende
staalopzuivering is niet verwonderlijk gezien in 80% van de staalvoorbereidingen SPE of
vloeistof-vloeistof extractie (LLE) gebruikt wordt (Wilson et al., 2004; Flores-Valverde et al.,
2008). Bij SPE moet wel opgelet worden voor verlies van belangrijke analieten, zoals
46
androstenon. Dit kan vermeden worden door onder andere een geschikte SPE kolom te
selecteren. De meest gebruikte kolom is een C18 kolom, die ook hier gebruikt werd.
Vervolgens werd de HPLC-MS/MS-analyse geoptimaliseerd. Hiervoor werd
vertrokken van de ontwikkelde methode van Verheyden et al. (2007) op een „linear ion trap
quadrupole‟ (LTQ). Via analyse van berengeurstandaarden en ijklijnen, werd er gezocht naar
een ideale kolom, solventcombinatie en gradiënt. Uiteindelijk werd een 35 minuten durende
analyse ontwikkeld, waarbij methanol en 1% azijnzuur als solventen gebruikt werden. Met de
ontwikkelde LTQ-analyse konden de drie berengeurcomponenten simultaan in vetweefsel
bepaald worden. Er traden echter wel problemen op bij het gebruik van deze analyse. Het
grootste probleem bij deze LTQ-analyse was de matrixinterferentie die heerste bij analyse van
androstenon en androstadienedion. Verder was de scheiding van skatol en 2-methylindol niet
optimaal, heerste er het probleem van „tailing‟, lagen de correlatiecoëfficiënten niet erg hoog
en duurde de analyse relatief lang.
Gezien er bij HPLC-MS/MS-analyse met de LTQ problemen optraden, werd er
overgestapt naar U-HPLC-MS/MS-analyse gekoppeld met een „triple stage quadrupole‟
(TSQ) als massaspectrometer. Hierbij werd de overgang gemaakt van HPLC naar U-HPLC.
U-HPLC kent kortere analysetijden, maar met behoud van hoge resolutie voor de
chromatografische pieken. Bij deze analyse wordt er gebruik gemaakt van kolommen die
bestaan uit pakkingsmateriaal waarvan de partikels een grootte van <1,9 µm hebben, wat
minder groot is dan de 3 µm partikels die gebruikt worden bij klassieke HPLC. Hierdoor en
mede door het gebruik van hoge druk wordt een betere resolutie bekomen in vergelijking met
de traditionele HPLC. De hogere resolutie bij U-HPLC is onder andere van belang voor
verhoging van de selectiviteit. Door het gebruik van hoge druk ontstaan er tevens smallere
pieken waardoor de componenten beter gescheiden worden. Andere voordelen zijn de hogere
piekcapaciteiten en hogere gevoeligheid en een betere en snellere analyse, wat wegens de
hoge kostprijs van de instrumenten en de solventen, een voordeel is (Stolker et al., 2007). De
gevoeligheid van een U-HPLC analyse ligt twee à drie keer hoger dan bij een HPLC analyse
(Swartz et al., 2005). Voor de massa analysator werd de overgang gemaakt van een LTQ ion
trap naar een TSQ triple quadrupole massaspectrometer. Door de verhoogde selectiviteit en
gevoeligheid werden verhoogde piekoppervlaktes, betere retentietijden en een betere
scheiding bekomen. Zowel de LTQ als de TSQ massaspectrometer kunnen gebruikt worden
voor kwalitatieve en kwantitatieve analyses. De LTQ heeft een betere gevoeligheid dan de
47
TSQ in full scan analyses, maar bij „Selected Reaction Monitoring‟ (SRM) geldt het
omgekeerde. Bij SRM of ook „Multiple Reaction Monitoring‟ (MRM) genoemd, worden
enkel de geselecteerde massa-over-lading verhoudingen (m/z) bekeken. Gezien dus enkel naar
die m/z waarden gezocht wordt, worden storende componenten met andere m/z waarden niet
gedetecteerd (De Brabander et al, 2007). Gezien vet een complexe matrix is, wordt door
gebruik van SRM of MRM al een groot deel matrixinterferentie vermeden. Met behulp van
deze U-HPLC-MS/MS-analyse werd uiteindelijk een 10 minuten durende analyse ontwikkeld.
Door de verhoogde selectiviteit was er een daling van de matrixinterferentie, maar deze bleef,
weliswaar in mindere mate, nog steeds bestaan. Tevens had de TSQ als belangrijkste
beperking het gebrek aan post-acquisitie opname van data. Dit is een groot nadeel bij analyse
van berengeurcomponenten gezien nog niet alle componenten die berengeur veroorzaken
gekend zijn. Hierdoor is het mogelijk dat wanneer er een nieuwe component ontdekt wordt,
deze niet kan bekeken worden in oude data. Er kan dus niet gescand worden op
ongeïdentificeerde, ongekende componenten (Nielen et al., 2007). Daarom werd de overgang
naar de Orbitrap HR-MS massaspectrometer gemaakt. Door de full scan analyse is het
mogelijk later onbekende componenten te bekijken, er is dus retrospectieve analyse mogelijk
zonder opnieuw te moeten analyseren, wat zorgt voor tijdwinst en kostendaling.
Bij HR-MS-analyse worden massa accuraatheden bekomen van minder dan 2 ppm,
wat betekent dat massa‟s tot vijf cijfers na de komma nauwkeurig kunnen gemeten worden.
Deze hoge massa accuraatheid wordt bekomen door het optimaliseren van het „Automatic
Gain Control‟ (AGC) target. De AGC bepaalt hoeveel ionen in de Orbitrap worden
opgevangen alvorens naar de detector te worden gestuurd (Makarov et al., 2006; De
Brabander et al., 2007). Tevens worden resoluties tot 100.000 „full width at half maximum‟
(FWHM) bekomen (Qizhi et al., 2005; Makarov et al., 2006; Nielen et al., 2007; Stolker et
al., 2007). Bij deze analyse werd als resolutie 50.000 FWHM gehanteerd terwijl als AGC
target de „high dynamic range‟ gekozen werd. De verhoogde resoluties zijn absoluut nodig bij
analyse van componenten die deel uitmaken van een complexe matrix, zoals vetweefsel. De
resolutie van een methode is een maat voor de scheiding van twee componenten. Bij een hoge
resolutie kan er met zekerheid besloten worden dat het om de gewenste component gaat en
niet om de combinatie van meerdere componenten. Door de koppeling van U-HPLC met HR-
MS is er een verhoogde selectiviteit, gevoeligheid en lineariteit (R²). Door al deze verbeterde
parameters is er snelle, robuuste, reproduceerbare en betrouwbare analyse mogelijk voor
meerdere componenten die in lage concentraties (ppb) in een complexe matrix voorkomen
48
(Nielen et al., 2007; Vanhaecke et al., 2009). In tegenstelling tot de LTQ en de TSQ werd bij
toepassing van deze methode maar een minieme matrixinterferentie waargenomen, wat een
groot voordeel biedt gezien de moeilijke analyse van de berengeurcomponenten in vetweefsel.
Het doel om een analytische methode te ontwikkelen die de drie
berengeurcomponenten indol, skatol en androstenon simultaan in vetweefsel afkomstig van
varkens kan analyseren, werd in deze thesis verwezenlijkt. Gezien de veelvuldigheid waarmee
de analyse uitgevoerd werd en de steeds terugkerende positieve resultaten, kan er gesproken
worden over een consistente analyse.
In de nabije toekomst kan de ontwikkelde U-HPLC-HR-MS-analyse gevalideerd
worden. De validatie zal uitgevoerd worden volgens de criteria die beschreven worden in de
EU Commission Directive 2002/657/EC ter uitvoering van richtlijn 96/23/EC van de Raad
voor analytische residu methoden voor matrices afkomstig van dierlijke oorsprong. Dit
gebeurde ondanks het feit dat er voor berengeurcomponenten geen maximale concentraties
vastgelegd zijn. In het algemeen gaat de validatie de gevoeligheid, robuustheid, precisie en de
lineariteit van de ontwikkelde analyse na. Wegens tijdsgebrek kon geen volledige validatie
uitgevoerd worden, maar op basis van de uitgevoerde experimenten kon er wel een beeld
gevormd worden van enkele parameters die expliciet zullen onderzocht worden tijdens de
volledige validatie. Zo werd vastgesteld dat de specificiteit en de selectiviteit van de analyse
goed waren gezien de Orbitrap massa analysator massa‟s accuraat kan detecteren. Doordat de
correlatiecoëfficiënten (R²) bij het merendeel van de uitgevoerde experimenten door dezelfde
laborant boven de 0,98 lagen, kan er gesproken worden over een goede lineariteit. Gezien bij
de laatste experimenten telkens één ijklijn door twee verschillende laboranten op twee
verschillende dagen voorbereid werd, kon er gekeken worden naar de
intralaboratoriumreproduceerbaarheid. Door het berekenen van de relatieve
standaarddeviaties (RSDs) van de ijklijnen werd vastgesteld dat er een goede
intralaboratoriumreproduceerbaarheid was. De resultaten impliceren een goede precisie. De
U-HPLC-HR-MS-analyse bleek niet alleen voor betere resultaten te zorgen maar de analyse
biedt ook voordelen ten opzichte van eerder ontwikkelde methodes. Zo duurt de
staalvoorbereiding minder lang waardoor er een daling van de arbeidsintensiteit en –duur en
er dus ook kostenverlaging is. Tijdens de analyse zelf wordt door de verkorte methode tevens
een minimum verbruik aan solventen nagestreefd, wat het milieu dan weer ten goede komt.
49
6. CONCLUSIE
In deze thesis werd een methode ontwikkeld en geoptimaliseerd voor de simultane
bepaling van de drie gekende berengeurcomponenten indol, skatol en androstenon in
vetweefsel, afkomstig van varkens. Alvorens met de analyse te kunnen starten diende er
staalvoorbereiding van de vetstalen te gebeuren. Voor de optimalisatie van staalvoorbereiding
werd gestart van Zamaratskaia et al. (2005). Na optimalisatie werd er uiteindelijk gekozen
voor een protocol met een SPE methode met 20% methanol als wasvloeistof en 1 mL
methanol als elutievloeistof, waarbij het 1e mL eluaat geanalyseerd werd. De analyse van het
vetstaal zelf gebeurde door een U-HPLC-HR-MS-analyse te koppelen aan een verwarmde
APCI-bron en als massa analysator werd een Orbitrap ExactiveTM
hoge resolutie
massaspectrometer gebruikt. Voor de optimalisatie van de analyse werd vertrokken van de
methode ontwikkeld door Verheyden et al. (2007). Uiteindelijk werd een 10 minuten durende
U-HPLC-HR-MS-analyse bekomen waarin de drie berengeurcomponenten simultaan
gedetecteerd werden.
In de nabije toekomst kan de ontwikkelde U-HPLC-HR-MS-analyse gevalideerd
worden volgens de criteria die beschreven worden in de EU Commission Directive
2002/657/EC. Er werd al een eerste indruk van enkele validatieparameters verkregen door de
uitgevoerde analyses te bekijken. Zo werd een goede specificiteit en selectiviteit vastgesteld
gezien de Orbitrap massa analysator in staat is massa‟s zeer accuraat te detecteren. Wanneer
de correlatiecoëfficiënten van de uitgevoerde experimenten berekend werden, werd
vastgesteld dat het merendeel boven de 0,98 lag, wat wijst op een goede lineariteit. Tijdens
het optimaliseren van de methode werden er bij het laatste experiment ijklijnen gelopen
waarbij de vetstalen voorbereid werden door twee verschillende laboranten op twee
verschillende dagen. Na het berekenen van de relatieve standaarddeviaties van deze ijklijnen
kon besloten worden dat de intralaboratoriumreproduceerbaarheid goed was, gezien ze voor
alle componenten, in alle concentraties beneden de 20% lagen. Er wordt tevens een goede
herhaalbaarheid verwacht, waardoor deze resultaten een goede precisie impliceren.
De ontwikkelde U-HPLC-HR-MS-analyse is een stap vooruit in het onderzoek naar
berengeur en heeft vele voordelen. Zo zorgt de verkorte methode voor een daling aan arbeid
en dus ook kosten. De kosten dalen ook doordat de kolommen en het toestel langer gebruikt
kunnen worden. Ook wordt met de ontwikkelde analyse aan het milieu gedacht door het
minimaal nodige aan solventen te gebruiken.
50
7. LITERATUURLIJST
Agergaard, N.; Laue, A. (1993). Absorption from the gastrointestinal tract and liver turnover of skatole. In:
Measurement and Prevention of Boar taint in Entire Male Pigs, Bonneau, M. (Ed.), INRA Editions, Parijs,
Frankrijk, pp. 107-111.
Ahmad, N.; Gower, D. B. (1968). The biosynthesis of some androst-16-enes from C21 and C19 steroids in boar
testicular and adrenal tissue. Biochemical Journal, 108, 233-241.
Aldal, I.; Andresen, O.; Egeli, A. K.; Haugen, J. E.; Grodum, A.; Fjetland, O.; Eikaas, J. L. H. (2005). Levels of
androstenone and skatole and the occurrence of boar taint in fat from young boars. Livestock Production Science,
95, 121-129.
Aluwé, M.; Bekaert, K. (2009). Vroegtijdige en betrouwbare detectie van berengeur en van de genetische aanleg
ervan. ILVO-DIER, Melle, België.
Aluwé, M.; Millet, S.; Nijs, G.; Tuyttens, F. A. M.; Verheyden, K.; De Brabander, H. F.; De Brabander, D. L.;
Van Oeckel, M. J. (2009). Absence of an effect of dietary fibre or clinoptilolite on boar taint in entire male pigs
fed practical diets. Meat Science, 82, 346-352.
Andresen, O. (1975). Radioimmunoassay for 5-alpha-androst-16-en-3-one in porcine adipose tissue. Acta
Endocrologica, 79, 619-624.
Angels Rius, M.; Hortos, M.; Garcia-Regueiro, J. A. (2005). Influence of volatile compounds on the
development of off-flavours in pig back fat samples classified with boar taint by a test panel. Meat Science, 71,
595-602.
Annor-Frempong, I. E.; Nute, G. R.; Wood, J. D.; Whittington, F. W.; West, A. (1998). The measurement of the
responses to different odour intensities of „boar taint‟ using a sensory panel and an electronic nose. Meat
Science, 50, 139-151.
Baars, B.; van den Berg, J.; Janssen, H. G.; Schoenmakers, P.; Tijssen, R.; Vonk, N. (1999). Chromatografie in
de praktijk: Vloeistofchromatografie. Ten Hagen & Stam b.v., Den Haag, Nederland.
Babol, J.; Squires, E. J. (1995). Quality of Meat from Entire Male Pigs. Food Research International, 28, 201-
212.
Babol, J.; Squires, E. J.; Gullett, E. A. (1996). Investigation of factors responsible for the development of boar
taint. Food Research International, 28, 573-581.
Babol, J.; Squires, E. J.; Lundström, K. (1997). Relationship between metabolism of androstenone and skatole.
In: Boar Taint in Entire Male Pigs, Bonneau, M.; Lundström, K.; Malmfors, B. (Eds.), EAAP Publication, 92,
pp. 62-65.
Babol, J.; Squires, E. J.; Lundström, K. (1998). Hepatic metabolism of skatole in pigs by cytochrome P4502E1.
Journal of Animal Science, 76, 822-828.
Babol, J.; Squires, E. J.; Lundström, K., (1999). Relationship between metabolism of skatole and androstenone
in intact male pigs. Journal of Animal Science, 77, 84-92.
Babol, J.; Zamaratskaia, G.; Juneja, R. K.; Lundström, K. (2004). The effect of age on distribution of skatole and
indole levels in entire male pigs in four breeds: Yorkshire, Landrace, Hampshire and Duroc. Meat Science, 67,
351-358.
Baltussen, W. H. M.; de Winter, M. A.; Kluivers-Poodt, M. (2009). Verdoofd castreren – Evaluatie van de
Verklaring van Noordwijk, LEI Wageningen UR, Den Haag. Rapport 2009-079, november 2009.
Banon, S.; Costa, E.; Gil, M. D.; Garrido, M. D. (2003). A comparative study of boar taint in cooked and dry-
cured meat. Meat Science, 63, 381-388.
51
Banon, S.; Andreu, C.; Laencina, J.; Garrido, M. D. (2004). Fresh and eating pork quality from entire versus
castrate heavy males. Food Quality and Preference, 15, 293-300.
Bekaert, K. M.; Tuyttens, F. A. M.; Duchateau, L.; De Brabander, H. F.; Aluwé, M.; Millet, S.;
Vandendriessche, F.; Vanhaecke, L. (2011). The sensitivity of Flemish citizens to androstenone: Influence of
gender, age, location and smoking habits. Meat Science, 88, 548-552.
Berdagué, J. L.; Viallon, C.; Bonneau, M.; Le Denmat, M. (1993). Indirect Evaluation of Boar Taint with Gas-
Chromatographic Mass-Spectrometric Measurement of Head Space Volatiles. Colloques de l’INRA, 60, 49-52.
Bird, S.; Gower, D. B. (1981). The validation and use of a radioimmunoassay for 5a-androst-16-en-3-one in
human axillary collections. Journal of Steroid Biochemistry, 14, 213-219.
Bonneau, M. (1982). Compounds Responsible for Boar Taint, with Special Emphasis on Androstenone – A
Review. Livestock Production Science, 9, 687-705.
Bonneau, M., Meusy-Dessolle, N., Leglise, P. C.; Claus, R., (1982). Relationship between fat and plasma
androstenone and plasma testosterone in fatty and lean young boars during growth and after hCG stimulation.
Acta Endocrinologica, 101, 119-128.
Bonneau, M.; Le Denmat, M.; Vaudelet, J. C.; Nunes, J. R. V.; Mortensen, A. B.; Mortensen, H. P. (1992).
Contributions of Fat Androstenone and Skatole to Boar Taint: I. Sensory Attributes of Fat and Pork Meat.
Livestock Production Science, 32, 63-80.
Bonneau, M.; Dufour, R.; Chouvet, C.; Roulet, C.; Meadus, W.; Squires, E. J. (1994). The effects of
immunization against luteinizing hormone-releasing hormone on performance, sexual development, and levels of
boar taint-related compounds in intact male pigs. Journal of Animal Science, 72, 14-20.
Bonneau, M. (1998). Use of Entire Males for Pig Meat in the European Union. Meat Science, 49 (Suppl 1),
S257-272.
Bonneau, M.; Walstra, P.; Claudi-Magnussen, C.; Kempster, A. J.; Tornberg, E.; Fischer, K.; Diestre, A.; Siret,
F.; Chevillon, P.; Claus, R.; Dijksterhuis, G.; Punter, P.; Matthews, K. R.; Agerhem, H.; Beague, M. P.; Oliver,
M. A.; Gispert, M.; Weiler, U.; von Seth, G.; Leask, H.; Furnols, M. F. I.; Homer, D. B.; Cook, G. L. (2000). An
international study on the importance of androstenone and skatole for boar taint: IV. Simulation studies on
consumer dissatisfaction with entire male pork and the effect of sorting carcasses on the slaughter line, main
conclusions and recommendations. Meat Science, 54, 285-295.
Bradley, B. J.; Carlson, J. R. (1974). A gas-liquid chromatographic procedure for the determination of indole and
3-methylindole in bovine plasma. Analytical Biochemistry, 59, 214-219.
Brooks, B. W. L.; Hastewood, G. A. D. (1961). The estimation of androst-16-en-3alfa-ol in human urine.
Journal of Biochemistry, 80, 488-496.
Brooks, R. I.; Pearson, A. M. (1986). Steroid-Hormone Pathways in the Pig, with Special Emphasis on Boar
Taint Odor – A Review. Journal of Animal Science, 62, 632-645.
Byrne, D. V.; Thamsborg, S. M.; Hansen, L. L. (2008). A sensory description of boar taint and the effects of
crude and dried chicory roots (Cichorium intybus L.) and inulin feeding in male and female pork. Meat Science,
79, 252-269.
Caraty, A.; Bonneau, M. (1986). Immunisation active du porc mâle contre la gonadolibérine: effets sur la
secrétion hormones gonadotropes et sur la teneur en 5a-androst-16ène-3-one du tissu adipeux. Comptes Rendus
des Séances de l’Académie des Sciences de Paris, Série D, Sciences Naturelles, 303, 673-676.
Chen, G.; Zamaratskaia, G.; Madej, E.; Lundström, K. (2006). Effect of hCG administration on the relationship
between testicular steroids and indolic compounds in fat and plasma in entire male pigs. Meat Science, 72, 339-
347.
52
Chen, G.; Zamaratskaia, G.; Andersson, H. K.; Lundström, K. (2007). Effects of raw potato starch and live
weight on fat and plasma skatole, indole and androstenone levels measured by different methods in entire male
pigs. Food Chemistry, 101, 439-448.
Claudi-Magnussen, C. (2006). The consumers‟ view/reaction. Acta Veterinaria Scandinavica, 48 (Suppl 1), S4.
Claus, R.; Hofmann, B.; Karg, H. (1971). Determination of 5-alpha-androst-16-en-3-one, a boar taint steroid in
pigs, with reference to relationships to testosterone. Journal of Animal Science, 33, 1293-1297.
Claus, R. (1974). Dosage radioimmunologique du 5-alpha-androst-16-en-3-one, steroide responable de l‟odeur
de verrat dans le tissu adipeux porcs. Comptes Rendus des Séances de l’Académie des Sciences Série D, Sciences
Naturelles, 278, 299-302.
Claus, R.; Hofmann, B. (1980). Oestrogens, compared to other steroids of testicular origin, in blood plasma of
boars. Acta Endocrinologica, 94, 404-411.
Claus, R.; Mahler, G.; Munster, E. (1988). Determination of the Boar Taint Steroid 5-Alpha-Androst-16-En-3-
One in Adipose-Tissue of Pigs with A Rapid Microtitre Plate Enzyme-Immunoassay (Mte). Archiv fűr
Lebensmittelhygiene, 39, 87-90.
Claus, R.; Dehnhard, M.; Herzog, A.; Bernal-Barragan, H.; Gimenez, T. (1993). Parallel measurements of indole
and skatole (3-methylindole) in faeces and blood plasma of pigs by HPLC. Livestock Production Science, 34,
115-126.
Claus, R.; Weiler, U.; Herzog, A. (1994). Physiological-Aspects of Androstenone and Skatole Formation in the
Boar – A Review with Experimental Data. Meat Science, 38, 289-305.
Claus, R.; Herbert, E.; Dehnhard, M. (1997). Comparative determination of the boar taint steroid androstenone in
pig adipose tissue by a rapid enzyme immunoassay and an HPLC-method. Archiv für Lebensmittelhygiene, 48,
25-48.
Claus, R.; Lacorn, M.; Ostertag, C. (2008). An improved microtitre enzyme immunoassay to measure the boar
taint steroid 5-alpha-androst-16-en-3-one in blood plasma of pigs. Meat Science, 80, 934-938.
De Brabander, H. F.; Verbeke, R. (1986). Quantitative determination of androstenone in pig adipose tissue.
Journal of Chromatography, 363, 293-302.
De Brabander, H. F.; Le Bizec, B.; Pinel, G.; Antignac, J. P., Verheyden, K.; Mortier, V.; Courtheyn, D.; Noppe,
K. (2007). Past, present and future of mass spectrometry in the analysis of banned substances in meat-producing
animals. Journal of Mass Spectrometry, 42, 983-998.
de Kock, H. L.; Heinze, P. H.; Potgieter, C. M.; Dijksterhuis, G. B.; Minnaar, A. (2001). Temporal aspects
related to the perception of skatole and androstenone, the major boar compounds. Meat Science, 54, 61-70.
de Roest, K.; Montanari, C.; Fowler, T.; Baltussen, W. (2009). Resource efficiency and economic implications
of alternatives to surgical castration without anaesthesia. Animal, 3, 1522-1531.
Deslandes, B.; Gariépy, C.; Houde, A. (2001). Review of microbiological and biochemical effects of skatole on
animal production. Livestock Production Science, 71, 193-200.
Desmoulin, B.; Bonneau, M.; Bourdon, D. (1974). Etude en bilan azoté et composition corporelle des porcs
mâles entiers ou castrés de race Large White. Journées de la Recherche Porcine en France, 6, 247-255.
Dijksterhuis, G. B.; Engel, B.; Walstra, P.; Furnols, M.; Agerhem, H.; Fisher, K.; Oliver, M. A.; Claudi-
Magnussen, C.; Siret, F.; Bqague, M. P.; Homer, D. B.; Bonneau, M. (2000). An international study on the
importance of androstenon and skatole for boar taint: II. Sensory evaluation by trained panels in seven European
countries. Meat Science, 54, 261-269.
Doran, E.; Whittington, F. M.; Wood, J. D.; McGivan, J. D. (2002). The relationship between adipose tissue
skatole levels, rates of hepatic microsomal skatole metabolism and hepatic cytochrome P450IIE1 expression in
two breeds of pig. Animal Science, 74, 461-468.
53
European Community (2001). Commission Directive 2001/93/EC. Official Journal of the European
Communities, L 316, 36-38.
European Community (2002). Commission Directive 2002/657/EC. Official Journal of the European
Communities, L 221, 8-36.
Flores-Valverde, A. M.; Hill, E. M. (2008). Methodology for Profiling the Steroid Metabolome in Animal
Tissues Using Ultraperformance Liquid Chromatography – Electrospray-Time-of-Flight Mass Spextrometry.
Analytical Chemistry, 80, 8771-8779.
Furnols, M. F. I.; Gispert, M.; Diestre, A.; Oliver, M. A. (2003). Acceptability of boar meat by consumers
depending on their age, gender, culinary habits, and sensitivity and appreciation of androstenone odour. Meat
Science, 64, 433-440.
Garcia-Regueiro, J. A.; Diaz, I. (1989). Evaluation of the contribution of skatole, indole, androstenone and
androstenols to boar-taint in back fat of pigs by HPLC and capillary gas chromatography (CGC). Meat Science,
25, 307-316.
Garcia-Regueiro, J. A.; Rius, M. A. (1998). Rapid determination of skatole and indole in pig back fat by normal-
phase liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 809, 246-251.
Gilbert, A. N.; Wysocki, C. J. (1987). The smell survey: Results. National Geographics, 172, 514-525.
Gower, D. B. (1972). 16-Unsaturated C19 steroids. A review of their chemistry, biochemistry and possible
physiological role. Journal of Steroid Biochemistry, 3, 45-103.
Hannson, K. E.; Lundström, K.; Fjelkner-Modig, S.; Persson, J. (1980). The importance of androstenone and
skatole for boar taint. Swedish Journal of Agricultural Research, 10, 167-173.
Hansen, L. L.; Mejer, H.; Thamsborg, S. M.; Byrne, D. V.; Roepstorff, A.; Karlsson, A. H.; Hansen-Møller, J.;
Jensen, M. T.; Tuomola, M. (2006). Influence of chicory roots (Cichorium intybus L.) on boar taint in entire
male and female pigs. Animal Science, 82, 359-368.
Hansen, L. L.; Stolzenbach, S.; Jensen, J. A.; Henckel, P.; Hansen-Møller, J.; Syriopoulos, K.; Byrne, D. V.
(2008). Effect of feeding fermentable fibre-rich feedstuffs on meat quality with emphasis on chemical and
sensory boar taint in entire male pigs and female pigs. Meat Science, 80, 1165-1173.
Hansen-Møller, J. (1992). Determination of Indolic Compounds in Pig Back Fat by Solid-Phase Extraction and
Gradient High-Performance Liquid-Chromatography with Special Emphasis on the Boar Taint Compound
Skatole. Journal of Chromatography A, 624, 479-490.
Hansen-Møller, J. (1994). Rapid High-Performance Liquid-Chromatography Method for Simultaneous
Determination of Androstenone, Skatole and Indole in Back Fat from Pigs. Journal of Chromatography B:
Biomedical Applications, 661, 219-230.
Hansen-Møller, J; Andresen, J. R. (1994). Boar Taint – Analytical Alternatives. Fleischwirtschaft, 74, 1005-
1009.
Hoste, M.; Baltussen, W. H. M.; Oosterkamp, E. B. (2009). Vleesafzet van biologische beren: Een opiniepeiling
in Duitsland en het Verenigd Koninkrijk. LEI Wageningen UR, Den Haag. Rapport 2009-064, oktober 2009.
Hu, Q.; Noll, R. J.; Li, H.; Makarov, A.; Hardman, M.; Cooks, R. G. (2005). The Orbitrap: a new mass
spectrometer. Journal of Mass Spectrometry, 40, 430-443.
Jarmoluk, L.; Martin, A. H.; Fredeen, H. T. (1970). Detection of Taint (Sex Odor) in Pork. Canadian Journal of
Animal Science, 50, 750-752.
Jensen, M. T.; Cox, R. P.; Jensen, B. B. (1995). Microbial-Production of Skatole in the Hind Gut of Pigs Given
Different Diets and Its Relation to Skatole Deposition in Backfat. Animal Science, 61, 293-304.
54
Johnson, L. A.; Clark, R. N. (1998). Flow sorting X- and Y-chromosome-bearing mammalian sperm: Activation
and pronuclear development of sorted bull, boar and ram sperm microinjected into hamster oocytes. Gamete
Research, 21, 335-343.
Kempster, A. J.; Lowe, D. B. (1993). Meat production with entire males. 44th
Annual meeting of the E.A.A.P, 16-
19 Augustus, Aarhus, Denemarken.
Kluivers-Poodt, M.; Hopster, H.; Spoolder, H. A. M. (2007). Verdoofd castreren in de varkenshouderij. Animal
Sciences Group, Wageningen UR, Rapport 73, oktober 2007.
Kohler, I.; Moens, Y.; Busato, A.; Blum, J.; Schatzmann, U. (1998). Inhalation anaesthesia for the castration of
piglets: CO2 compared to halothane. Zentralblatt fűr Veterinärmedizin Reihe A, 45, 625-633.
Lanthier, F.; Lou, Y.; Squires, E. J. (2007). Skatole metabolism in the intact prepubescent male pig: The
relationship between hepatic enzyme activity and skatole concentrations in plasma and fat. Livestock Science,
106, 145-153.
Le Denmat, M.; Hervo, N.; Vaudelet, J. C.; Bonneau, M. (1993). The effect of slaughter weight on fat
androstenone and skatole levels and on the assessment of boar taint in entire male pigs. In: Measurement and
prevention of boar taint in entire male pigs, Bonneau, M. (Ed.), INRA Editions, Parijs, Frankrijk, Colloques nr.
60.
Lundström, K.; Hansson, K. E.; Fjelkner-Modig, S.; Persson, J. (1980). Skatole - another contributor to boar
taint. Proceedings European Meat Research Workers, 26, 300-303.
Lundström, K.; Matthews, K. R.; Haugen, J. E. (2009). Pig meat quality from entire males. Animal, 3, 1497-
1507.
Makarov, A.; Denisov, E.; Kholomeev, A.; Balschun, W.; Lange, O.; Strupat, K.; Horning, S. (2006).
Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap / Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry, 78,
2113-2120.
Makarov, A.; Scigelova, M. (2010). Coupling Liquid Chromatography to Orbitrap massa spectrometry. Journal
of Chromatography A, 1217, 3938-3945.
Malmfors, B.; Lundström, K. (1983). Consumer reactions to boar meat - a review. Livestock Production Science,
10, 187-196.
Manns, J. G.; Robbins, S. R. (1997). Prevention of boar taint with a recombinant based GnRH vaccine. In: Boar
Taint in Entire Male Pigs, Bonneau, M.; Lundström, K.; Malmfors, B. (Eds.), EAAP Publication, 92, pp. 137-
140.
March, R. E. (1997). An introduction to quadrupole ion trap massa spectrometry. Journal of Mass Spectrometry,
32, 351-369.
Marx, G.; Horn, T.; Thielebein, J.; Knubel, B.; von Borell, E. (2003). Analysis of pain-related vocalization in
young pigs. Journal of Sound and Vibration, 266, 687-698.
Matthews, K. R.; Homer, D. B.; Thies, F.; Calder, P. C. (2000). Effect of whole linseed (Linum usitatissimum)
in the diet of finishing pigs on growth performance and on the quality and fatty acid composition of various
tissues. British Journal of Nutrition, 83, 637-643.
Meloen, R. H.; Turkstra, J. A.; Lankhof, H.; Puijk, W. C.; Schaaper, W. M. M.; Dijkstra, G.; Wensing, C. J. G.;
Oonk, R. B. (1994). Efficient immunocastration of male piglets by immunoneutralization of GnRH, using a new
GnRH-like peptide. Vaccine, 12, 741-746.
Mortensen, A. B.; Sørensen, S. E. (1984). Relationship between boar taint and skatole determination with a new
analysis method. In: Proceedings of 30th European Meeting Meat Research Workers, Bristol, UK, pp. 394-396.
Moss, B. W.; Hawe, S. M.; Walker, N. (1993). Sensory thresholds for skatole and indole. In: Measurement and
Prevention of Boar Taint in Entire Male Pigs, Bonneau, M. (Ed.), INRA Editions, Parijs, Frankrijk, pp. 63-68.
55
Nielen, M. W. F.; van Engelen, M. C.; Zuiderent, R.; Ramaker, R. (2007). Screening and confirmation criteria
for hormone residue analysis using liquid chromatography accurate mass time-of-flight, Fourier transform ion
cyclotron resonance and orbitrap mass spectrometry techniques. Analytica chimica acta, 586, 122-129.
Oskam, I. C.; Ropstad, E.; Berg, K. A.; Fredriksen, B.; Larsen, S.; Dahl, E.; Andresen, O. (2008). Testicular
germ cell development in relation to 5-alpha-androstenone levels in pubertal entire male pigs. Theriogenology,
69, 967-976.
Patterson, R. L. S. (1968). 5-androst-16-en-3-one, compound responsible for taint in boar fat. Journal of the
Science of Food and Agriculture, 19, 31-38.
Pedersen, B. (1998). Heritability of skatole in back fat. In: Skatole and boar taint, Jensen, W. K. (Ed.), Danish
Meat Research Institute, Roskilde, Denemarken, pp. 129-136.
Peleran, J. C.; Bories, G. F. (1985). Gas chromatographic determination and mass spectrometric confirmation of
traces of indole and 3-methylindole (skatole) in pig back fat. Journal of Chromatography A, 324, 469-474.
Plagge, J. G. (1988). Opfok- en mesterijresultaten van beren en borgen. Proefverslag P 1.24, Varkensproefbedrijf
“Noord- en Oost-Nederland”.
Prunier, A.; Bonneau, M.; von Borell, E. H.; Cinotti, S.; Gunn, M.; Fredriksen, B.; Giersing, M.; Morton, D. B.;
Tuyttens, F. A. M; Velarde, A. (2006). A review of the welfare consequences of surgical castration in piglets and
the evaluation of non-surgical methods. Animal welfare, 15, 277-289.
Rius, M. A.; Garcia-Regueiro, J. A. (2001). Skatole and indole concentrations in Longissimus dorsi and fat
samples of pigs. Meat Science, 59, 285-291.
Rius, M. A.; Hortos, M.; Garcia-Regueiro, J. A. (2005). Influence of volatile compounds on the development of
off-flavours in pig back fat samples classified with boar taint by a test panel. Meat Science, 71, 595-602.
Sole, M. A. R.; Regueiro, J. A. G. (2001). Role of 4-phenyl-3-buten-2-one in boar taint: Identification of new
compounds related to sensorial descriptors in pig fat. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 5303-
5309.
Squires, E. J. (1990). Studies on the Suitability of A Colorimetric Test for Androst-16-Ene Steroids in the
Submaxillary-Gland and Fat of Pigs As A Simple Chemical-Test for Boar Taint. Canadian Journal of Animal
Science, 70, 1029-1040.
Squires, E. J.; Gullett, E. A.; Fisher, K. R. S.; Partflow, G. D. (1991). Comparison of Androst-16-Ene Steroid-
Levels Determined by A Colorimetric Assay with Boar Taint Estimated by A Trained Sensory Panel. Journal of
Animal Science, 69, 1092-1100.
Squires, E. J.; Lou, Y. (1995). Levels of boar taint in purebred entire male pigs in Ontario. OAC Publication,
University of Guelph, Guelph, Canada.
Stolker, A. A. M.; Zuidema, T.; Nielen, M. W. F. (2007). Residue analysis of veterinary drugs and growth-
promoting agents. Trends in Analytical Chemistry, 26, 967-979.
Swartz, M. E. (2005). Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC): An Introduction.
http://chromatographyonline.findanalytichem.com/lcgc/data/articlestandard//lcgc/242005/164646/article.pdf (26-
05-2011).
Talou, T.; Bourrounet, B.; Gaset, A. (1993). Interest of multi gas sensors apparatus for quality control
applications: Odorimeter. 12ème Journées Internationales Huiles Essentielles, Digne, Frankrijk.
Talou, T.; Bourrounet, B.; Gaset, A. (1994). Interest of multigas sensors apparatus for quality control of essential
oils. 25th
International Symposium Essential Oils, Grasse, Frankrijk.
Thompson, R. H.; Pearson, A. M.; Banks, K. A. (1972). Identification of some C19-∆16
steroids contributing to
sex odor in pork. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 20, 185-189.
56
Tielen, M. J. M. (1974). De frekwentie en de zoötechnische preventie van long- en leveraandoeningen bij
varkens. Proefschrift, Landbouwhogeschool, Wageningen, Nederland.
Tuomola, M.; Harpio, R.; Knuuttila, P.; Mikola, H.; Lövgren, T. (1997). Time-Resolved fluoroimmunoassay for
the measurement of androstenone in porcine serum and fat samples. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 45, 3529-3534.
Tuomola, M.; Hakala, M.; Manninen, P. (1998). Determination of androstenone in pig fat using packed column
supercritical fluid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 719, 25-30.
Tuomola, M; Harpio, R.; Wirta, E. R.; Lövgren, T. (2002). Monitoring androstenone levels in boars by direct
immunochemical analysis of serum samples. Meat Science, 61, 193-197.
Vanhaecke, L.; Verheyden, K.; Vanden Bussche, J.; Schoutsen, F.; De Brabander, H. F. (2009). UHPLC
Coupled with Fourier Transform Orbitrap for Residue Analysis. LC-GC Europe, 20, 364-374.
Van Sleuwen, M. (2007). Piglet anaesthetics: pros & cons. Pig Progress, 23, 24-25.
Vasquez, J. M.; Parrilla, I.; Roca, J.; Gil, M. A.; Cuello, C.; Vasquez, J. L.; Martinez, E. A. (2009). Sex-sorting
sperm by flow cytometry in pigs: Issues and perspectives. Theriogenology, 71, 80-88.
Verheyden, K.; Noppe, H.; Aluwé, M.; Millet, S.; Vanden Bussche, J. V.; De Brabander, H. F. (2007).
Development and validation of a method for simultaneous analysis of the boar taint compounds indole, skatole
and androstenone in pig fat using liquid chromatography-multiple mass spectrometry. Journal of
Chromatography A, 1174, 132-137.
Vestergaard, J. S.; Haugen, J. E.; Byrne, D. V. (2006). Application of an electronic nose for measurements of
boar taint in entire male pigs. Meat Science, 74, 564-577.
Vold, E. (1970). Fleischproduktionseigenschaften bei Ebern und Kastraten. IV. Organoleptische und
gaschromatografische Untersuchungen wasserdampfflüchtiger Stoffe des Rückenspeckes von Ebern. Meldinger
fra Norges Landbrukshøgskole, 49, 1-25.
von Borell, E.; Baumgartner, J.; Giersing, M.; Jaggin, N.; Prunier, A.; Tuyttens, F. A. M.; Edwards, S. A. (2009).
Animal welfare implications of surgical castration and its alternatives in pigs. Animal, 3, 1488-1496.
Walstra, P.; Buiting, G. A. J.; Mateman, G. (1997). Het mesten van beren: 1. Invloed van castratie en
voedermethode op groei, voederconversie en slachtkwaliteit. IVO-Rapport B-128.
Walstra, P.; Moermann, P. C. (1981). Ist es gerechtfertigt, Eber zu masten, un was sind die Perspektiven.
Tierzuchter, 33, 465.
Weiler, U.; Furnols, M. F. I.; Fisher, K.; Kemmer, H.; Oliver, M. A.; Gispert, M.; Dobrowolski, A.; Claus, R.
(2000). Influence of differences in sensitivity of Spanish and German consumers to perceive androstenon on the
acceptance of boar meat differing in skatole and androstenon concentrations. Meat Science, 54, 297-304.
White, R. G.; DeShazer, J. A.; Tressler, C. J.; Borcher, G. M.; Davey, S.; Waninge, A.; Parkhurst, A. M.;
Milanuk, M. J.; Clemens, E. T. (1995). Vocalization and physiological response of pigs during castration with or
without a local anesthetic. Journal of Animal Science, 73, 381-386.
Willoughby, R.; Sheehan, E.; Mitrovich, S. (2002). Is LC-MS right for you? In: A global view of LC-MS, 2nd
edition, Global View Publishing, Pittsburgh, Pennsylvania, USA, pp. 44-89.
Wilson, I. D.; Plumb, R.; Granger, J.; Major, H.; Williams, R.; Lenz, E. M. (2005). HPLC-MS-based methods
for the study of metabonomics. Journal of Chromatography B, 817, 67-76.
Wu, N.; Clausen, A. M. (2007). Fundamental and practical aspects of ultrahigh pressure liquid chromatography
for fast separation. Journal of Separation Sciences, 30, 1167-1182.
Wysocki C. J.; Beauchamp G. K. (1984). The ability to smell androstenone is genetically determined.
Proceedings of the Natural Academy of Sciences of the United States of America, 81, 4899-4902.
57
Xue, J. L.; Dial, G. D.; Holton, E. E.; Vickers, Z.; Squires, E. J.; Loy, Y. P.; Godbout, D.; Morel, N. (1996a).
Breed differences in boar taint: Relationship between tissue levels of boar taint compounds and sensory analysis
of taint. Journal of Animal Science, 74, 2170-2177.
Xue, J. L.; Dial, G. D.; Morrison, R. B. (1996b). Comparison of the accuracies of chemical and sensory test for
detecting taint in pork. Livestock Production Science, 46, 203-211.
Xue, J. L.; Dial, G. D. (1997). Raising intact male pigs for meat: Detecting and preventing boar taint. Swine
Health and Production, 5, 151-158.
Zamaratskaia, G.; Babol, J.; Andersson, H.; Lundström, K. (2004a). Plasma skatole and androstenone levels in
entire male pigs and relationship between boar taint compounds, sex steroids and thyroxine at various ages.
Livestock Production Science, 87, 91-98.
Zamaratskaia, G.; Babol, J.; Madej, A.; Squires, A. J.; Lundström, K. (2004b). Age-related Variation of Plasma
Concentrations of Skatole, Androstenone, Testosterone, Oestradiol-17β, Oestrone Sulphate,
Dehydroepiandrosterone Sulphate, Triiodothyronine and IGF-1 in Six Entire Male Pigs. Reproduction in
Domestic Animals, 39, 168-172.
Zamaratskaia, G.; Madej, A.; Babol, J.; Squires, E. J.; Lundström, K. (2005). Free oestrone in adipose tissue and
its relation to androstenone and skatole in entire male pigs. Reproduction in Domestic Animals, 40, 156-160.
Top Related