OPTIMALISATIE VAN U-HPLC-MS/MS ANALYSE VOOR ...

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Faculteit Diergeneeskunde

Laboratorium voor Chemische Analyse

Vakgroep Veterinaire Volksgezondheid en Voedselveiligheid

Academiejaar 2010-2011

OPTIMALISATIE VAN U-HPLC-MS/MS

ANALYSE VOOR

BERENGEURCOMPONENTEN

Sophie FRANÇOIS

Eerste Master in de Farmaceutische Zorg

Promotor

Dr. L. Vanhaecke

Copromotor

K. Bekaert

Commissarissen

Prof. S. De Saeger

Prof. C. Van Peteghem

Deze pagina is niet beschikbaar omdat ze persoonsgegevens bevat.Universiteitsbibliotheek Gent, 2021.

This page is not available because it contains personal information.Ghent University, Library, 2021.

DANKWOORD

Deze thesis zou niet geworden zijn wat ze nu is, zonder de hulp van vele mensen. Daarom wil ik graag

enkele mensen bedanken.

* Mijn co-promotor Karen Bekaert: wat zou ik toch zonder jou geweest zijn?! Je hebt me, door al je

enthousiasme en vriendelijkheid, van in het begin warm gemaakt voor de wondere wereld van de

mannelijke varkentjes. Bedankt voor de sublieme begeleiding en de vele verbeteringen (waarschijnlijk

tot vervelens toe). Niets was je teveel gevraagd, steeds maakte je tijd voor me vrij en probeerde je met

veel engelengeduld en met handen en voeten uitleg te geven. Wanneer ik het wat minder zag zitten,

wist je me op te beuren door aanmoedigende woorden en troostende snoepjes. Ik kan je niet genoeg

bedanken voor deze drie leerrijke maanden!

* Mijn promotor Lynn Vanhaecke: bedankt voor de vele verbeteringen. Zelfs in het weekend en

s’avonds laat wist je mijn mails te beantwoorden. Hoe je het moederschap en het vele werk dat je hebt

weet te combineren, verdient grote bewondering. Ik heb nog nooit iemand ontmoet die zich zo, met

hart en ziel, voor zijn job weet in te zetten. Chapeau!

* Dirk, Lucie en Mieke: drie supervriendelijke mensen die steeds klaarstonden om me te helpen.

Zonder jullie zou ik nooit zo vlug mijn draai gevonden hebben in het labo. Dankzij jullie hebben de

vele kasten vol materiaal geen geheimen meer voor me!

* Julie K., Julie V., Lieven en Tijs: hoe maak je de koffie- en middagpauzes van een thesisstudent tot

een echt feest? Jullie weten hoe het moet! De Antwerpse, Oost- en West-Vlaamse leute zorgden ervoor

dat ik steeds naar deze vrije momenten uitkeek. De innoverende hersenspinsels van Lieven en Tijs

waren soms moeilijk te volgen, maar zorgden keer op keer voor pijnlijke lachspieren.

* Mama: ook jij bedankt voor de vele hulp en steun. Je wist wanneer je me beter even met rust liet,

maar ook wanneer je me moest verwennen met wat fruit of een lekker taartje. Bedankt ook om naar

mijn problemen, ergernissen en belevenissen te luisteren! Zonder jou had ik deze thesis nooit kunnen

maken, gezien je me de kans geeft om mijn studies op mijn eigen tempo te vervolledigen.

* Tante Mieke: bedankt voor de verbeteringen, de interesse en de aanmoedigingen. Je wist me perfect

te motiveren en ontelbare keren op het hart te drukken dat een thesis erg belangrijk is in het

studieproces van een student.

* And last but not least: Brecht: enorm bedankt voor het luisterend oor dat je de afgelopen periode

voor me was. De oppeppende woorden en knuffels zorgden er steeds voor dat ik de volgende dag met

frisse moed verder ging. Je luisterde steeds naar mijn problemen en verhalen niettegenstaande je zelf

zoveel werk en problemen had met je eigen thesis. Merci!

INHOUDSTAFEL

1. INLEIDING ................................................................................................................................ 1

1.1 PROBLEEMSTELLING ....................................................................................................... 1

1.2 COMPONENTEN ................................................................................................................. 2

1.2.1 Androstenon ................................................................................................................ 3

1.2.2 Skatol ........................................................................................................................... 4

1.2.3 Indol ............................................................................................................................. 5

1.2.4 Andere componenten .................................................................................................. 6

1.3 DETECTIE ............................................................................................................................ 6

1.3.1 Sensorieel ...................................................................................................................... 7

1.3.1.1 Expertenpanel .......................................................................................................... 7

1.3.1.2 Consumentenpanel ................................................................................................... 7

1.3.1.3 Soldeerboutmethode ................................................................................................. 7

1.3.1.4 Elektronische neus ................................................................................................... 8

1.3.2 Laboratoriumanalyse .................................................................................................... 8

1.3.2.1 Colorimetrisch .......................................................................................................... 8

1.3.2.2 Immunologisch......................................................................................................... 9

1.3.2.2.1 Radioimmunoassay (RIA) .................................................................................. 9

1.3.2.2.2 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) of Enzym Immunoassay

(EIA) ............................................................................................................................... 10

1.3.2.2.3 Fluoroimmunoassay (FIA) ............................................................................... 10

1.3.2.3 Gaschromatografie (GC) of vloeistofchromatografie (LC) gekoppelde

technieken........................................................................................................................... 11

1.3.2.3.1 Gaschromatografie (GC) .................................................................................. 11

1.3.2.3.2 Vloeistofchromatografie (LC) .......................................................................... 12

1.3.2.3.3 Massaspectrometrie (MS) ................................................................................ 13

A. Linear Ion Trap Quadrupole massa analysator .................................................... 14

B. Triple Stage Quadrupole massa analysator .......................................................... 15

C. Orbitrap massa analysator ................................................................................... 16

2. OBJECTIEVEN ....................................................................................................................... 17

3. MATERIAAL EN METHODEN ............................................................................................ 18

3.1 MATERIAAL ....................................................................................................................... 18

3.1.1 Algemeen ...................................................................................................................... 18

3.1.2 Reagentia en chemicaliën ............................................................................................ 18

3.1.3 Oplossingen .................................................................................................................. 19

3.2 METHODEN ........................................................................................................................ 20

3.2.1 Staalvoorbereiding ....................................................................................................... 20

3.2.1.1 Protocol staalvoorbereiding ................................................................................... 20

3.2.1.2 Geteste opzuiveringsstappen .................................................................................. 22

3.2.1.2.1 Vaste fase extractie (SPE) ................................................................................ 22

3.2.1.2.2 Amicon Filter ................................................................................................... 23

3.2.2 HPLC-MS/MS-analyse ................................................................................................ 23

3.2.2.1 HPLC ...................................................................................................................... 23

3.2.2.1.1 HPLC kolommen ............................................................................................. 23

3.2.2.1.2 HPLC Solventen .............................................................................................. 24

3.2.2.1.3 HPLC Gradiënt ................................................................................................ 24

3.2.2.2 Linear Ion Trap Quadrupole ................................................................................. 25

3.2.3 U-HPLC-MS/MS .......................................................................................................... 25

3.2.3.1 U-HPLC .................................................................................................................. 26

3.2.3.1.1 U-HPLC Instellingen ....................................................................................... 26

3.2.3.1.2 U-HPLC Kolommen ........................................................................................ 26

3.2.3.1.3 U-HPLC Solventen .......................................................................................... 26

3.2.3.1.4 U-HPLC Gradiënt ............................................................................................ 27

3.2.3.2 Triple Stage Quadrupole ........................................................................................ 27

3.2.3.2.1 TSQ optimalisatie ............................................................................................ 27

3.2.4 U-HPLC-HR-MS ......................................................................................................... 27

3.2.4.1 U-HPLC .................................................................................................................. 27

3.2.4.2 Orbitrap ExactiveTM ............................................................................................... 28

3.2.4.3 Prestatiecriteria ...................................................................................................... 29

4. RESULTATEN ......................................................................................................................... 30

4.1 STAALVOORBEREIDING ................................................................................................ 30

4.2 HPLC-MS/MS ...................................................................................................................... 33

4.2.1 HPLC ............................................................................................................................ 33

4.2.1.1 HPLC Kolommen ................................................................................................... 33

4.2.1.2 HPLC Solventen ..................................................................................................... 34

4.2.1.3 HPLC Gradiënt ...................................................................................................... 35

4.2.2. HPLC-MS/MS-analyse van berenvet ........................................................................ 35

4.3 U-HPLC-MS/MS .................................................................................................................. 36

4.3.1 U-HPLC ........................................................................................................................ 36

4.3.1.1 U-HPLC Instellingen ............................................................................................. 36

4.3.1.2 U-HPLC Kolommen ............................................................................................... 37

4.3.1.3 U-HPLC Solventen ................................................................................................ 37

4.3.1.4 U-HPLC Gradiënt .................................................................................................. 38

4.3.2 Triple Stage Quadrupole ............................................................................................. 38

4.3.2.1 TSQ optimalisatie ................................................................................................... 38

4.3.3 U-HPLC-MS/MS-analyse van berenvet ..................................................................... 39

4.4 U-HPLC-HR-MS .................................................................................................................. 40

4.4.1 Orbitrap ExactiveTM .................................................................................................... 40

4.4.2 U-HPLC-HR-MS-analyse van berenvet .................................................................... 42

4.4.3 Prestatiecriteria ............................................................................................................ 43

5. DISCUSSIE ............................................................................................................................... 45

6. CONCLUSIE ............................................................................................................................ 49

7. LITERATUURLIJST .............................................................................................................. 50

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

AA piekoppervlakte

ACN acetonitril

ADD androstadienedion

AGC Automatic Gain Control

AL antilichaam

ALCASDE Alternatives to Castration and Dehorning

APCI atmosferische druk chemische ionisatie

API atmosferische druk ionisatie

arb arbitraire eenheden

BG spike oplossing berengeur

cc milliliter (10-3

liter)

CID botsingsgeïnduceerde dissociatie

CO2 koolstofdioxide

C18 opeenvolging van 18 koolstofatomen

Da dalton of atomaire massa-eenheid

ECD elektronenvangstdetector

EFSA Europese autoriteit voor voedselveiligheid

EIA Enzym Immunoassay

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Enz enzym

EU Europese Unie

eV elektronvolt (eenheid van energie)

Exp. experiment

FFT snelle Fouriertransformatie

FIA fluoroimmunoassay

FID vlamionisatiedetector

FWHM full width at half maximum

g gram (eenheid van massa)

GAIA Global Action in the Interest of Animals

GC gaschromatografie

g/mol eenheid voor molaire massa

HAc azijnzuur

HCOOH mierenzuur

HPLC hoge druk vloeistofchromatografie

HPLC-MS/MS hoge druk vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem massaspectrometrie

HR-MS hoge resolutie massaspectrometrie

H2O gedemineraliseerd water

ID interne diameter

IS interne standaard

LC vloeistofchromatografie

LC/MS vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie

LLE vloeistof-vloeistof extractie

LTQ Linear Ion Trap Quadrupole

MeOH methanol

mg milligram (10-3

gram)

min-1

per minuut

mL milliliter (10-3

liter)

mm millimeter (10-3

meter)

mol eenheid voor hoeveelheid stof

m/z massa-over-lading verhouding

MS massaspectrometrie

n aantal

ng nanogram (10-9

gram)

NPLC normale fase vloeistofchromatografie

N2 stikstofgas

O2 zuurstofgas

pH zuurtegraad van een oplossing

PIGCAS Pig Castration

PIS Product Ion Scan

ppb parts per billion (microgram / kilogram)

ppm accurate massa

® merk dat in de VS in het merkenregister ingeschreven is

R² correlatiecoëfficiënt

RF radiofrequentie

RIA Radioimmunoassay

RP omgekeerde fase

RPLC omgekeerde fase vloeistofchromatografie

rpm rotaties per minuut

RP-SPE omgekeerde fase vaste fase extractie

RSD relatieve standaarddeviatie

RT retentietijd (in minuten)

S/N signaal-over-ruis verhouding

SIM Selected Ion Monitoring

SPE vaste fase extractie

TLC dunne laag chromatografie

TM „trade mark‟ teken (merk niet ingeschreven in het merkenregister van de VS)

TR-FIA Time Resolved Fluoroimmunoassay

TSQ Triple Stage Quadrupole

UK United Kingdom

U-HPLC ultrahoge druk vloeistofchromatografie

U-HPLC-HR-MS ultrahoge druk vloeistofchromatografie hoge resolutie massaspectrometrie

U-HPLC-MS/MS ultrahoge druk vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem

massaspectrometrie

UV ultraviolet

V volt (eenheid van elektrische spanning)

VS Verenigde Staten van Amerika

°C graden Celsius (eenheid van temperatuur)

µL microliter (10-6

liter)

µm micrometer (10-6

meter)

2-MID 2-methylindol

2nd

secundair

1

1. INLEIDING

1.1 PROBLEEMSTELLING

Deze thesis behandelt de problematiek van berengeur. Berengeur is de geur die

vrijkomt bij het verhitten, braden, bakken,... van varkensvlees en -vet afkomstig van beren

(niet gecastreerde mannelijke varkens). Deze geur wordt door een belangrijk aandeel van de

consument als onaangenaam en indringend ervaren en de smaak van het varkensvlees als

bitter (Babol & Squires, 1995; Bonneau, 1998). Hoewel berengeur niets verandert aan de

kwaliteit van het varkensvlees gaat de voorkeur van de consument toch uit naar ‟aanlokkelijk

vlees‟ (Lundström et al., 2009). Om dit te bekomen worden beren, meestal zonder verdoving,

gecastreerd. Dierenbeschermingsorganisaties zoals GAIA komen hier tegenop gezien castratie

zeer pijnlijk en stresserend is voor de biggen (Prunier et al., 2006; Kluivers-Poodt et al.,

2007; von Borell et al., 2009).

Volgens de EU Commission Directive (2001/93/EC) geldt: “Het castreren en het

couperen van de staart bij dieren die ouder zijn dan 7 dagen, zijn alleen toegestaan als de

ingrepen onder anesthesie en met aanvullende langdurige pijnbehandeling uitgevoerd worden

door een dierenarts”. In België is castratie op latere leeftijd mogelijk gezien het Koninklijk

Besluit van 17/02/2001, waarin staat dat varkenshouders biggen tot op de leeftijd van 4 weken

mogen castreren zonder verdoving, niet aangepast is aan de EU Commission Directive.

Verschillende Europese overkoepelende onderzoeksprojecten zoals PIGCAS en

ALCASDE en de Europese autoriteit voor voedselveiligheid (EFSA) verdiepen zich in de

problematiek van castratie en voeren onderzoek uit naar mogelijke alternatieven. Er zijn reeds

diverse alternatieven voorhanden. Zo wordt er in Ierland en de UK niet gecastreerd maar

worden de beren er op jonge leeftijd geslacht, alvorens seksuele volwassenheid intreedt

(Bonneau, 1998). In Nederland mag er sinds 2007, volgens de verklaring van Noordwijk,

geen enkele castratie meer gebeuren zonder verdoving (Baltussen et al., 2009). Het kan om

een algemene verdoving gaan met een mengsel van 70% CO2-gas en 30% O2-gas (Kohler et

al., 1998; Prunier et al., 2006; Van Sleuwen, 2007) of een plaatselijke verdoving (White et

al., 1995; Marx et al., 2003). Ook in Noorwegen geldt deze regel. Duitsland verkiest castratie,

maar wel in combinatie met pijnbestrijding via toediening van meloxicam (Hoste et al.,

2009).

2

Een ander alternatief, dat reeds toegepast wordt in Australië en Nieuw-Zeeland, is

immunocastratie. Hierbij wordt het varken gevaccineerd met eiwitten die de groei en functie

van de testes doen dalen door antilichaamvorming tegen het „Gonadotropine-Releasing

Hormone‟. De biggen worden twee keer ingeënt, op de leeftijd van 10 weken en op 14 à 16

weken. Als gevolg wordt er minder androstenon en skatol gevormd (Caraty & Bonneau,

1986; Meloen et al., 1994; Manns & Robbins, 1997).

Nog andere alternatieven zijn genetische selectie (Squires & Lou, 1995; Pedersen,

1998), het sexen van sperma (Johnson & Clark, 1998; Vasquez et al., 2009) of de productie

van intacte beren. De productie van intacte beren (ongecastreerde mannelijke varkens) wordt

vaak gezien als een alternatief op lange termijn. Hierbij probeert men berengeur te reduceren

aan de hand van managementsingrepen (Byrne et al., 2008). Het slachten van intacte beren

levert verschillende voordelen op. Zo hebben beren in vergelijking met bargen (gecastreerde

mannelijke varkens) een betere voederbenutting (Walstra et al., 1977; Plagge, 1988), leveren

ze een grotere hoeveelheid mager vlees (Lundström et al., 2009) en beschikken ze over een

betere gezondheid (Tielen, 1974). Andere voordelen zijn de lage mestproductie (Desmoulin et

al., 1974; Kempster, 1993), een betere groei (Xue & Dial, 1997) en minder arbeid en kosten

(de Roest et al., 2009).

Zowel voor de productie van intacte beren als voor de andere alternatieven is het

noodzakelijk dat er een methode bestaat om berengeur te kunnen detecteren. Zo kunnen

intacte beren met berengeur gedetecteerd worden en kan onderzocht worden of de alternatieve

methodes effectief de kans op berengeur verminderen. Op dit moment bestaan er

verschillende methodes om berengeur te detecteren maar is er geen standaardmethode en

daarnaast is er ook geen operationele definitie van berengeur.

1.2 COMPONENTEN

Androstenon en skatol (Patterson, 1968; Vold, 1970; Hannson et al., 1980) zijn de

twee belangrijkste componenten van berengeur die op dit moment gekend zijn. Er is echter

geen consensus over de relatieve verhouding waarin ze voor berengeur verantwoordelijk zijn.

Volgens sommige studies dragen androstenon en skatol in gelijke mate bij tot berengeur

(Lundström et al., 1980; Bonneau et al., 1992; Bonneau et al., 1994), terwijl andere studies

dit tegen spreken (Patterson, 1968; Vold, 1970; Claus et al., 1994). Ook componenten zoals

indol, maar ook 4-phenyl-3-buten-2-on,… zouden een rol spelen (Sole & Garcia-Regueiro,

2001).

3

1.2.1 Androstenon

Androstenon of 5-α-androst-16-en-3-on (Figuur 1.1, Tabel 1.1), is een C19-Δ16

steroïde, dat gekenmerkt wordt door een urineachtige geur (Patterson, 1968; Vold, 1970;

Babol & Squires, 1995; Rius & Garcia-Regueiro, 2001). Het is een feromoon dat onder

andere in het speeksel van beren voorkomt en een seksuele prikkeling bij het andere geslacht

uitlokt (Bonneau et al., 1982).

Tabel 1.1: Gegevens van androstenon

Figuur 1.1: Structuur van androstenon

Androstenon wordt, samen met andere steroïde hormonen zoals oestrogenen en

androgenen (bv. testosteron), vooral gevormd in de Leydigcellen die zich bevinden in de

testes van de beer (Ahmad & Gower, 1968; Gower, 1972). Het 5-α-androst-16-en-3-on is

lipofiel waardoor het in vetweefsel accumuleert (Brooks & Pearson, 1986) (Figuur 1.2). De

accumulatie in het vetweefsel is reversibel gezien de hoeveelheid androstenon in het

vetweefsel daalt na immunocastratie (Bonneau et al., 1982).

Katabolisatie van androstenon gebeurt in de testes en in de lever (Doran et al., 2002).

Hoge androstenongehaltes in het vetweefsel kunnen er onder andere komen door verminderde

afbraak door de lever wegens een verminderde enzymactiviteit.

Figuur 1.2: Verspreiding van androstenon in het varken

Klasse Polycyclisch: Steroïden:

Androstenen

Chemische formule C19H28O

Moleculair gewicht 272,43 g/mol

Kookpunt 275 °C

Smeltpunt 140 - 144 °C

4

Het is genetisch bepaald of androstenon wordt waargenomen of niet (Wysocki &

Beauchamp, 1984; Gilbert & Wysocki, 1987). Zo kunnen slechts 50% van de mensen het

ruiken. Tevens blijkt uit onderzoek dat vrouwen androstenon beter kunnen ruiken dan mannen

(Bekaert et al., 2011).

1.2.2 Skatol

Naast androstenon is ook skatol of 3-methylindol een belangrijke component bij

berengeur (Figuur 1.3, Tabel 1.2) (Vold, 1970). De geur die deze component veroorzaakt

wordt meestal beschreven als een fecale geur (Claus et al., 1994; Rius & Garcia-Regueiro,

2001).

Tabel 1.2: Gegevens van skatol

Figuur 1.3: Structuur van skatol

De productie van skatol gebeurt in het colon, tijdens de afbraak van het aminozuur L-

tryptofaan, door bacteriën zoals Lactobacillus en Clostridium (Claus et al., 1994; Jensen et

al., 1995; Deslandes et al., 2001; Lanthier et al., 2007). Net zoals bij androstenon zorgt het

lipofiel karakter van skatol ervoor dat het in vetweefsel geaccumuleerd wordt (Zamaratskaia

et al., 2004a; Zamaratskaia et al., 2004b). Skatol wordt ook in bargen, zeugen (zogende

varkens) en gelten (vrouwelijke varkens die nog geen biggen geworpen hebben)

geproduceerd, maar komt vooral in beren in hoge concentraties voor (Hannson et al., 1980;

Agergaard & Laue, 1993; Claus et al., 1994). Dit verschil zou te wijten kunnen zijn aan een

sterker anabool metabolisme bij beren.

Sekssteroïden zoals androstenon zouden ook een rol spelen in het ontstaan van hogere

skatolconcentraties. Hierrond bestaan er meerdere hypotheses, zo zouden androgenen

enerzijds de productie van skatol verhogen (Claus et al., 1994) of anderzijds de metabolisatie

van skatol inhiberen (Babol et al., 1997; Chen et al., 2006). De verspreiding van skatol in het

lichaam van het varken wordt weergegeven in Figuur 1.4.

Klasse Heterocyclisch: 2 ringen:

Indolen

Chemische formule C9H9N


Kookpunt 265 - 266 °C

Smeltpunt 95 °C

5

Figuur 1.4: Verspreiding van skatol in het varken

De concentratie van skatol kan door vele factoren beïnvloed worden. Zo neemt de

incidentie van berengeur toe bij volwassenheid (Babol et al., 1998; Babol et al., 1999),

ouderdom (Claus & Hofmann, 1980) en gewichtsstijging (Bonneau et al., 1982). Een ander

ras (Zamaratskaia et al., 2004a; Zamaratskaia et al., 2004b) of een ander dieet (Jensen et al.,

1995) kan eveneens leiden tot andere skatolconcentraties.

Skatol wordt, in tegenstelling tot androstenon, door bijna iedereen (99%)

waargenomen (Matthews et al., 2000; Weiler et al., 2000).

1.2.3 Indol

Indol of 2,3-benzopyrol is een minder belangrijke component in berengeur gezien

deze vooral in lage concentraties voorkomt (Garcia-Regueiro & Diaz, 1989; Moss et al.,

1993; Zamaratskaia et al., 2004a; Zamaratskaia et al., 2004b). Net zoals skatol heeft indol

een fecale geur en kan deze door iedereen waargenomen worden (Weiler et al., 2000) (Figuur

1.5, Tabel 1.3).

Tabel 1.3: Gegevens van indol

Figuur 1.5: Structuur van indol

De biosynthese van indol gebeurt, gelijkaardig aan skatol, door bacteriële afbraak van

L-tryptofaan in het darmstelsel van varkens (Claus et al., 1993; Jensen et al., 1995).

Klasse Heterocyclisch: 2 ringen:

Indolen

Chemische formule C8H7N


Kookpunt 254 °C

Smeltpunt 52 °C

6

1.2.4 Andere componenten

Naast androstenon, skatol en indol komen nog andere componenten voor in berengeur,

weliswaar in een veel lagere concentratie. Behalve androstenon zorgen ook andere C19-Δ16

steroïden voor een slechte geur en smaak van varkensvlees (Thompson et al., 1972; Le

Denmat et al., 1993). In vet met lage concentraties aan androstenon en skatol, zorgen

aldehyden en korteketen vetzuren voor hinder (Angels Ruis et al., 2005). Bij contaminatie

kunnen ook styreen en 1,4-dichlorobenzeen (Figuur 1.6) voor berengeur zorgen. 4-phenyl-3-

buten-2-on (Figuur 1.6) zorgt voor een verhoogde waarneming van androstenon en skatol

(Sole & Garcia-Regueiro, 2001). Verder kunnen ook nog, tot nu toe onbekende componenten

een rol spelen bij berengeur (Babol et al., 1996).

styreen 1,4-dichlorobenzeen 4-phenyl-3-buten-2-on

Figuur 1.6: Structuur van styreen, 1,4-dichlorobenzeen en 4-phenyl-3-buten-2-on

1.3 DETECTIE

Een mogelijk alternatief voor castratie is de productie van intacte beren, waarbij het

noodzakelijk is dat er een detectiemethode voor berengeur ontworpen wordt (Aluwé &

Bekaert, 2009). Deze detectiemethoden kunnen ook gebruikt worden om na te gaan of de

andere alternatieven voor castratie het gewenste resultaat bereiken.

Op dit moment wordt er gebruik gemaakt van sensoriële (expertenpanel,

consumentenpanel, soldeerboutmethode en elektronische neus) en laboratoriumanalyses

(colorimetrisch, immunologisch, chromatografisch). Het grote probleem hierbij is de

afwezigheid van een operationele definitie voor berengeur, maar ook van een standaard

detectiemethode.

De analyses kunnen ingedeeld worden in twee groepen: subjectieve en objectieve

analyses. Tot de subjectieve analyses behoren de panels (experten en consumenten) en de

soldeerboutmethode. Dit komt doordat het resultaat persoonsafhankelijk is en er dus een

grotere variabiliteit kan heersen. De elektronische neus, colorimetrische, immunologische en

chromatografische analyses behoren tot de objectieve analyses gezien de meting door een

7

toestel uitgevoerd wordt, waarbij enkel de drie gekende berengeurcomponenten waargenomen

worden en er minder variabiliteit is.

1.3.1 Sensorieel

1.3.1.1 Expertenpanel

De experten worden getraind om verschillende intensiteiten van berengeur te kunnen

beoordelen en andere ranzige geuren van berengeur te kunnen onderscheiden (Xue et al.,

1996b; Aldal et al., 2005; Byrne et al., 2008; Hansen et al., 2008). Personen die ongevoelig

zijn voor androstenon komen niet in aanmerking.

Een stuk subcutaan vet afkomstig van het varken wordt opgewarmd en beoordeeld

(Squires et al., 1991; Rius et al., 2005; Aluwé et al., 2009). De expert moet zijn bevindingen

weergeven op bv. een categorische schaal (1: neutraal 4: zeer sterk) (Annor-Frempong et

al., 1998). De interpretaties vertonen echter verschillen. Zo zouden de temperatuur van het

staal, het moment van de beoordeling (Dijksterhuis et al., 2000; De Kock et al., 2001) en de

bereiding van het vet een invloed hebben op de beoordeling. Ook verschillen in training

zouden mogelijk een verklaring kunnen geven voor het tekort aan overeenkomst tussen

verschillende studies.

1.3.1.2 Consumentenpanel

De consument is niet getraind in het opsporen van berengeur en zal daardoor

varkensvlees anders beoordelen (Bonneau et al., 2000). Zo ruiken sommige personen

androstenon niet en zullen deze berengeur minder sterk waarnemen (Furnols et al., 2003;

Claudi-Magnussen et al., 2006). De vleesstalen worden op verschillende manieren bereid en

aan de consumenten voorgeschoteld ter beoordeling. Ook hier zorgen verschillen voor een

andere interpretatie van berengeur. Via deze consumentenpanels kan de onderzoeker een zicht

krijgen op wat de invloed van berengeur is op de consumptie van het varkensvlees gezien er

een steekproef van de populatie genomen wordt (Malmfors & Lundström, 1983; Xue et Dial,

1997; Banon et al., 2004).

1.3.1.3 Soldeerboutmethode

Bij deze snelle en simpele methode wordt een stuk subcutaan vet, meestal afkomstig

van de nekregio, kort verwarmd door er de gloeiende punt van een soldeerbout tegen te

houden (Jarmoluk et al., 1970). De vrijgekomen damp wordt door een expert geroken en

beoordeeld op aan- of afwezigheid van berengeur en de intensiteit van deze geur. Hier wordt

8

er, net zoals bij het experten- en consumentenpanel, een subjectieve meting uitgevoerd. Zo

kunnen bv. genetische (Wysocki & Beauchamp, 1984; Furnols et al., 2003), culturele en

culinaire (Weiler et al., 2000; Claudi-Magnussen, 2006) verschillen voor een veranderlijke

interpretatie zorgen. Daarnaast is tot op heden geen wetenschappelijk onderzoek verricht in

verband met gewenning, herhaalbaarheid, gevoeligheid,… (Dijksterhuis et al., 2000; Rius et

al., 2005; Aluwé & Bekaert, 2009) Toch wordt deze methode reeds toegepast in Nederland.

Daar krijgt een beer waarbij, via de soldeerboutmethode, geen berengeur geroken werd, een

keurmerk.

1.3.1.4 Elektronische neus

De elektronische neus meet de geur van verhit varkensvlees en -vet en niet de

concentratie van de berengeurcomponenten (Vestergaard, 2006). Deze bootst de sensoriële

waarneming door de mens na, maar dan op een objectieve manier. Zo meet de gassensor enkel

de opgegeven componenten. Er is echter nog veel werk om een betrouwbaar en draagbaar

apparaat te maken dat zowel de componenten vluchtig kan maken, deze in vacuüm kan meten

en on-line data kan registreren. Snelle detectie door middel van gassensoren was wel al

succesvol bij geroosterde koffie (Talou et al., 1993) en essentiële oliën (Talou et al., 1994).

1.3.2 Laboratoriumanalyse

Bij het gebruik van laboratoriumanalyses wordt een objectief resultaat voor de

gekende componenten bekomen, wat een groot voordeel biedt ten opzichte van de sensoriële,

persoonsafhankelijke metingen. Deze analyses zijn vaak duur, tijdsrovend en arbeidsintensief

(Hansen-Møller & Andresen, 1994), waardoor ze moeilijk als on-line detectiemethode kunnen

gebruikt worden.

1.3.2.1 Colorimetrisch

Deze methode werd oorspronkelijk ontworpen voor de bepaling van skatol in

vetweefsel (Mortensen & Sørensen, 1984). Het gaat om een spectrometrische methode die

werkt op basis van elektromagnetische straling (bv. licht). Bij een bepaalde golflengte gaan

elektronen, door het opnemen van die straling, zich naar een hoger energieniveau verplaatsen,

wat excitatie genoemd wordt. De colorimeter meet de hoeveelheid geabsorbeerd licht

(extinctie), waaruit berekend kan worden in welke concentratie de gezochte component in het

staal aanwezig is. De colorimeter kan enkel de extinctie van gekleurde componenten meten

waardoor het staal eerst voorbereid moet worden (Brooks & Hastewood, 1961).

9

Een probleem bij colorimetrie is echter dat het geheel aan indolische componenten

gemeten wordt en er dus geen onderscheid wordt gemaakt tussen skatol en indol. Daarom

wordt het resultaat weergegeven als skatolequivalenten (Xue et al., 1996a; Babol et al., 2004;

Zamaratskaia et al., 2005; Chen et al., 2007), waarbij er steeds een overschatting van de

hoeveelheid skatol is (Xue et al., 1996a).

Squires (1990) ontwierp een protocol voor het bepalen van androstenon in vetweefsel

en speekselklieren. Er traden echter interferentieproblemen op door bv. cholesterol, die de

precursor van de androstenonsteroïden is. Hierdoor werd staalvoorbereiding zeer belangrijk,

vooral voor metingen in het vetweefsel. Bij metingen in de speekselklieren waren er minder

problemen. Bij bepaling van skatol uit vetweefsel moet er een ander protocol gevolgd worden

(Xue et al., 1996a).

1.3.2.2 Immunologisch

Bij immunologische analyses wordt er gebruik gemaakt van de specifieke binding

tussen antigenen en antilichamen (AL), om de concentratie aan antigenen te bepalen. De

antilichamen worden gemerkt met een radioisotoop (RIA), een enzym (ELISA/EIA) of een

fluorescent label (FIA).

1.3.2.2.1 Radioimmunoassay (RIA)

Deze techniek werd gebruikt voor de bepaling van androstenon in vetweefsel en in

bloedplasma (Claus, 1974; Andresen, 1975; Claus et al., 1988; Bonneau et al., 1992; Claus et

al., 1997). Een gestandaardiseerde hoeveelheid van androstenon wordt radioactief gemerkt

door middel van radioisotopen (Figuur 1.7).

Figuur 1.7: Radioimmunoassay

Wanneer het gemerkt androstenon toegevoegd wordt aan het staal treedt er competitie

op tussen het gemerkt androstenon en het androstenon aanwezig in het staal. Het gemerkt

10

androstenon wordt verdrongen van zijn antilichamen doordat deze binden met het niet

gemerkt androstenon. Bij dit proces komt er radioactiviteit vrij die gemeten kan worden en

waaruit de concentratie aan androstenon afgeleid kan worden (Bird & Gower, 1981). Een

probleem bij deze test is het ontstaan van kruisreactiviteit met 5-α-androst-16-en-3-α-ol en 5-

α-androst-16-en-3-β-ol. Wegens problemen met de beschikbaarheid van radioisotopen,

radioactiviteit, selectiviteit, sensitiviteit en complexiteit werd deze techniek verlaten (Claus et

al., 2008).

1.3.2.2.2 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) of Enzym Immunoassay (EIA)

ELISA of EIA is een immunochemische techniek die gebruikt wordt om te meten

hoeveel androstenon in het vetweefsel (Claus et al., 1988; Claus et al., 1997; Rius & Garcia-

Regueiro, 2001) of in het bloedplasma (Claus et al., 2008) aanwezig is. Deze techniek lijkt op

die van de RIA maar de antilichamen zijn nu gemerkt met een enzym (Figuur 1.8).

Er wordt een substraat en een geconjugeerd enzym (Enz) toegevoegd aan de wells van

een microtiterplaat, waardoor het staal aanwezig in de wells verkleurt. Nadat de reactie

gestopt wordt met zwavelzuur, wordt de intensiteit van de kleur gemeten met een

spectrofotometer (Walstra & Moermann, 1981). De concentratie aan androstenon is evenredig

met de intensiteit van de ontstane kleur. De specificiteit van de test is afhankelijk van de

gebruikte antilichamen. Wegens zijn excellente specificiteit wordt ELISA nog steeds gebruikt

voor de bepaling van androstenon.

Figuur 1.8: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

1.3.2.2.3 Fluoroimmunoassay (FIA)

„Time Resolved Fluoroimmunoassay‟ (TR-FIA) lijkt op RIA maar de antilichamen

worden met een fluorescent label gemerkt. Dit label is meestal europium, een lanthanide

chelaat. Deze techniek zorgt voor de vervanging van RIA aangezien er problemen waren met

11

radioactiviteit en de beschikbaarheid van radioisotopen. Via TR-FIA kan de concentratie aan

androstenon in vetweefsel (Tuomola et al., 1997; Hansen et al., 2006; Oskam et al., 2008), in

bloedplasma (Tuomola et al., 2002; Byrne et al., 2008) en in serum (Tuomola et al., 1997)

bepaald worden. Deze techniek kent veel succes wegens de eenvoudige staalvoorbereiding.

1.3.2.3 Gaschromatografie (GC) of vloeistofchromatografie (LC) gekoppelde technieken

Chromatografie is een analytische techniek die gebruikt wordt voor de fysische

scheiding van mengsels. Fractionatie of scheiding is nodig om componenten in een mengsel

individueel te kunnen analyseren.

Meestal wordt er gebruik gemaakt van kolomchromatografie waarbij een stationaire

(stilstaande) fase geïmmobiliseerd zit aan de binnenkant van een kolom. Het staal wordt in het

systeem gebracht en via een mobiele (lopende) fase langsheen de stationaire fase gevoerd. De

stationaire fase is een vaste stof (bv. silica). De opgeloste bestanddelen verdelen zich tussen

de twee fasen en vertragen (retentie) door interactie (bv. via waterstofbruggen) met de

stationaire fase. Door deze selectieve vertraging vloeit elke component met een verschillende

snelheid uit de kolom (elutie) en worden de componenten gescheiden. Het is dus noodzakelijk

dat de te analyseren componenten verschillende affiniteiten voor de fasen hebben. Voor de

bepaling van berengeur kan zowel gaschromatografie (inert gas als mobiele fase) als

vloeistofchromatografie (vloeistof als mobiele fase) gebruikt worden. Wanneer de

componenten uit de kolom elueren worden ze waargenomen door een detector. Deze meet een

specifieke fysische eigenschap die de eluerende componenten bezitten. De gemeten

eigenschap wordt omgezet in een elektrisch signaal, die dan bv. als een chromatogram

zichtbaar wordt (Baars et al., 1994).

1.3.2.3.1 Gaschromatografie (GC)

Alvorens te kunnen starten met GC dienen storende componenten verwijderd te

worden door middel van vloeistof-vloeistof extractie (LLE) (De Brabander & Verbeke, 1986;

Chen, 2007), stoomdestillatie of vaste fase extractie (SPE) (Hansen-Møller, 1994). Hierdoor

is er bij een snelle en eenvoudige GC geen directe gasmeting mogelijk.

Bij bepaling van androstenon in serum en testes wordt er gebruik gemaakt van

vloeistof-vloeistof extractie door middel van dichloromethaan en ethylacetaat, waarna het

staal opgelost wordt in methanol (Claus et al., 1971; Garcia-Regueiro, 1998). Vervolgens

wordt het staal gewassen, gedroogd, ingedampt onder stikstofgas en opgezuiverd door dunne

12

laag chromatografie (TLC). Androstenon moet gederivatiseerd worden vooraleer het staal op

het GC systeem kan gebracht worden (Hansen-Møller, 1994; Bonneau et al., 2000). Bij

bepaling in vet is er eerst homogenisatie nodig met natriumhydroxide. Na de

staalvoorbereiding wordt de GC gekoppeld aan een vlamionisatiedetector (FID) (Rius &

Garcia-Regueiro, 2001).

Androstenonbepaling uit vetweefsel kan ook door verzeping van het vetweefsel door

middel van tolueen en kaliumhydroxide. Na extractie wordt het staal gederivatiseerd met het

Florox reagens en gebeurt de detectie via GC gekoppeld aan een elektronenvangstdetector

(ECD) (De Brabander & Verbeke, 1986). Deze techniek zorgt voor een dalend verbruik van

organische solventen en er is een kleinere hoeveelheid van het staal nodig. Een andere

techniek is GC gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) in de „Selected Ion Monitoring‟

(SIM) modus (Berdagué et al., 1993).

GC werd in andere studies ook gebruikt voor de bepaling van skatol uit vetweefsel

(Garcia-Regueiro & Rius, 1998; Rius & Garcia-Regueiro, 2001). Bij de bepaling van indol

en skatol uit vetweefsel (Peleran & Bories, 1985) en uit serum (Bradley & Carlson, 1974)

wordt de extractie uitgevoerd door middel van methyleenchloride. GC wordt nog maar zelden

gebruikt gezien het om een dure en tijdsrovende techniek gaat (Tuomola et al., 1998).

1.3.2.3.2 Vloeistofchromatografie (LC)

Bij bepaling van berengeur wordt er gebruik gemaakt van omgekeerde fase

vloeistofchromatografie (RPLC) waarbij de mobiele fase meer polair is dan de stationaire fase

(Hansen-Møller, 1992; Hansen-Møller, 1994). Als stationaire fasen worden relatief apolaire

chemisch gemodificeerde stoffen gebruikt, terwijl de mobiele fasen een combinatie zijn van

water en (polaire) organische solventen.

Voor de bepaling van skatol en indol in bloedplasma, speeksel, vetweefsel,… wordt

het gehomogeniseerde staal voorbereid en ingevroren. Na centrifugatie wordt het supernatans

overgebracht in een HPLC vial en RPLC toegepast. Er wordt gradiëntelutie gebruikt omdat

hierdoor een vlottere en betere scheiding van de componenten bekomen wordt. Hierna worden

de analieten gekwantificeerd door middel van een fluorescentiedetector (Hansen-Møller,

1992; Garcia-Regueiro & Rius, 1998; Zamaratskaia et al., 2004a; Byrne et al., 2008).

Er kan ook normale fase vloeistofchromatografie (NPLC) gebruikt worden (Garcia-

Regueiro, 1989; Garcia-Regueiro, 1998; Rius & Garcia-Regueiro, 2001). Hierbij gebeurt de

13

extractie door middel van hexaan en is de mobiele fase hexaan/isopropanol. NPLC is

efficiënter voor hydrofobe substanties zoals skatol. Een groot voordeel van deze techniek is

dat er directe analyse van vetweefsel mogelijk is, zonder dat er een opzuivering nodig is, wat

zorgt voor tijdsbesparing.

Berengeur wordt echter niet alleen door skatol en indol veroorzaakt, maar ook door

androstenon. Hansen-Møller (1994) ontwierp een methode om het gehalte aan androstenon,

skatol en indol simultaan in vetweefsel te bepalen door middel van hoge druk

vloeistofchromatografie (HPLC). Nadat het vetweefsel gehomogeniseerd is, wordt het

gesmolten in een microgolfoven, gemengd met methanol (extractie), worden de interne

standaarden toegevoegd, geïncubeerd, in een ultrasoonbad geplaatst en ten slotte ingevroren.

Soms wordt er een tweede keer geëxtraheerd met methanol waarna het staal ingedampt wordt

onder stikstofgas en vervolgens in methanol terug wordt opgelost. Door deze

staalvoorbereiding zal het vet neerslaan en de berengeurcomponenten in het supernatans

achterblijven. Na centrifugatie wordt het supernatans overgebracht in een HPLC vial (Banon,

2003; Chen, 2006). Voor androstenonbepaling met HPLC is er geen derivatisatie nodig. Bij

de techniek van Hansen-Møller werd de fluorescentie door middel van een spectrofotometer

gemeten (Claus et al., 1997). Er wordt voorkeur gegeven aan meting van fluorescentie eerder

dan meting van ultraviolet licht (UV), gezien er minder organische solventen gebruikt worden

en de meting sneller, gevoeliger en selectiever gebeurt. Bij de bepaling van skatol en indol in

vetweefsel wordt een andere mobiele fase (methanol en 1% azijnzuur) gebruikt (Hansen-

Møller, 1994; Babol et al., 2004, Verheyden et al., 2007).

1.3.2.3.3 Massaspectrometrie (MS)

In tegenstelling tot vroeger wordt LC tegenwoordig gekoppeld aan MS (LC/MS). Bij

HPLC werden kolommen gebruikt bestaande uit pakkingsmateriaal met diameter 5 µm.

Gezien snellere analyses en een hogere capaciteit een must waren, werd ultrahoge druk

vloeistofchromatografie (U-HPLC) ontwikkeld (Wu & Clausen, 2007). Bij U-HPLC worden

kolommen gebruikt waarvan de deeltjesdiameter maximum 2 µm is. Hierdoor ontstonden er

kortere kolommen, kortere analysetijden en was er minder solvent nodig. Door de hoge druk

wordt een hogere resolutie en een snellere en betere scheiding bekomen.

De detectie van de componenten androstenon, skatol en indol in vetweefsel kan

gebeuren door middel van MS. Hierbij worden de componenten geïoniseerd zodat ze geladen

moleculen of moleculefragmenten vormen. Deze ionen kunnen gesorteerd en geïdentificeerd

14

worden op basis van hun massa-over-lading verhouding (m/z). Tevens kan ook de abundantie

van elke component gemeten worden (De Brabander et al., 2007).

Gezien de componenten geïoniseerd moeten worden is er nood aan een ionisatiebron.

Sinds enige tijd wordt er gebruik gemaakt van atmosferische druk ionisatie (API). Dit zorgt

ervoor dat een groter aantal componenten geanalyseerd kan worden met behulp van LC/MS.

De moleculen worden geïoniseerd bij atmosferische druk en de ionen worden mechanisch en

elektrostatisch gescheiden van de neutrale moleculen. Voor berengeur wordt specifiek gebruik

gemaakt van atmosferische druk chemische ionisatie (APCI) (Figuur 1.9). Het LC eluens

wordt door een verwarmde buis gebracht waardoor er gasvormige solventmoleculen (aërosol)

ontstaan. Tevens zorgt het aanwezige inerte stikstofgas (N2) voor extra verdamping. De

gevormde moleculen worden geïoniseerd door geladen elektronen afkomstig van een

coronanaald en door chemische reacties wordt ook het analiet geladen. Er wordt in positieve

modus gewerkt omdat kleine apolaire deeltjes, met grootte tussen 100 - 1000 Dalton (Da)

beter gescheiden worden (Willoughby et al., 2002).

Figuur 1.9: Schema van Atmosferische Druk Chemische Ionisatie (APCI)

Om de positief geladen moleculen te analyseren werden tijdens dit onderzoek drie

types van massa analysatoren gebruikt: een „linear ion trap quadrupole‟, een „triple stage

quadrupole‟ en een Orbitrap massa analysator.

A. Linear Ion Trap Quadrupole massa analysator

Een „linear ion trap quadrupole‟ of „quadrupole ion trap‟ massa analysator bestaat uit

drie hyperbolische elektroden: één ring elektrode en twee „end-cap‟ elektroden (Figuur 1.10).

Door spanningen aan te leggen tussen de elektroden vormen deze een holte waarin de ionen

opvangen worden in een stabiele oscillerende baan. De exacte beweging van de ionen is

15

afhankelijk van de aangelegde spanning en hun m/z. Wanneer de precursorionen gevangen

zitten heeft er een botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) plaats waarbij productionen

ontstaan die gedetecteerd kunnen worden. Detectie gebeurt door een „elektron multiplier‟

waarbij ionen tegen het oppervlak botsen en zorgen voor de vorming van secundaire

elektronen, die geëmitteerd worden. Deze secundaire ionen vormen een stroom die kan

waargenomen worden (March, 1997).

Figuur 1.10: Schema van een ‘linear ion trap quadrupole’ massa analysator

Een „linear ion trap quadrupole‟ massa analysator werd onlangs gebruikt bij de

ontwikkeling van een LC/MS procedure met gradiëntelutie die androstenon, skatol en indol

simultaan bepaalt (Verheyden et al., 2007). Het is van groot belang de drie componenten

simultaan te bepalen, gezien dit tijd- en kostensparend werkt. De extractie van de

componenten gebeurt door middel van methaan en de opzuivering bestaat uit afkoeling,

stikstofindamping, centrifugatie en filtratie. Als mobiele fasen worden methanol en 1%

azijnzuur gebruikt. De ionisatie gebeurt door middel van APCI en de MS staat in de „Product

Ion Scan‟ (PIS) modus. De methode, inclusief extractie, is echter niet robuust genoeg om in

routine analyse te kunnen gebruiken.

B. Triple Stage Quadrupole massa analysator

Een „triple stage quadrupole‟ massa analysator bestaat uit drie quadrupolen. Elke

quadrupool bestaat uit vier parallelle ijzeren staven rond een centrale as (Figuur 1.11). Tussen

elke set tegenoverstaande polen wordt een spanning aangelegd en er wordt ook een directe

spanning aangelegd waardoor een massafilter ontstaat. Enkel ionen die een bepaalde m/z

hebben kunnen deze filter passeren en zullen gedetecteerd worden. Ionen kunnen net zoals bij

een „linear ion trap quadrupole‟ massa analysator gefragmenteerd worden tijdens een CID.

Zoals reeds vermeld bestaat een „triple stage quadrupole‟ massa analysator uit drie

16

quadrupolen: één voor selectie van de m/z, één voor fragmentatie en één voor PIS. De detectie

gebeurt zoals bij een „linear ion trap quadrupole‟ massa analysator (Willoughby et al., 2002).

Figuur 1.11: Schema van een ‘triple stage quadrupole’ massa analysator

C. Orbitrap massa analysator

Bij deze massa analysator hangt het succes van de gehele analyse af van de

mogelijkheid om ionen te vangen en groepen van gevangen ionen in de Orbitrap te injecteren.

Dit gebeurt door een externe injectie waarbij de ionen gevangen worden in een

radiofrequentie-afhankelijk (RF) met gas gevulde gebogen quadrupool, de C-trap genaamd

(Figuur 1.12). In de Orbitrap worden de ionen elektrostatisch gevangen terwijl ze rond de

centrale elektrode draaien en een axiale oscillatie uitvoeren. De oscillerende ionen induceren

een stroom die kan gedetecteerd worden door een „elektron multiplier‟ (zie 1.3.2.3.3.A).

Daarna gebeurt er een snelle Fouriertransformatie (FFT), die de tijdsignalen van ionen met

verschillende massa‟s omzet in een frequentie waardoor hun m/z in een spectrum afgelezen

kunnen worden. Bij dit toestel kan enkel een niet-selectieve fragmentatie gebeuren, waarbij

niet meer geweten is van welk precursorion het verkregen production afkomstig is (Makarov

& Scigelova, 2010).

Figuur 1.12: Schema van de Orbitrap massa analysator

17

2. OBJECTIEVEN

Berengeur is een geur die kan vrijkomen wanneer vlees en/of vet afkomstig van beren

(mannelijke geslachtsrijpe varkens), verhit wordt. Gezien dit een indringende geur en een

bittere smaak van het varkensvlees met zich meebrengt, moet dit zoveel mogelijk vermeden

worden. Op dit moment zijn er reeds verschillende detectiemethoden voorhanden om

berengeur te meten, maar er bestaat nog geen internationale standaard detectiemethode. Twee

soorten methoden worden frequent aangewend: de sensoriële methoden, die eerder subjectief

zijn, en de laboratoriumanalyses, die als objectief kunnen beschouwd worden. Het grote

nadeel van de laboratoriumanalyses is echter dat deze vaak duur, arbeidsintensief en

tijdsrovend zijn en dat enkel de concentraties van gekende componenten gemeten worden.

Door Verheyden et al. (2007) werd een methode ontwikkeld die de drie

berengeurcomponenten simultaan bepaalt. Er werd echter vastgesteld dat de analytische

procedure niet voldoende robuust was, wat resulteerde in onvoldoende reproduceerbare

resultaten. Een oorzaak van dit probleem zou het gebrek aan staalvoorbereiding kunnen zijn,

maar dit vereist verder onderzoek.

Het doel van deze thesis bestond er daarom in een (U)-HPLC-MS(/MS) methode te

ontwikkelen die de drie berengeurcomponenten simultaan op een robuuste manier kan

bepalen. Tevens moet dit snel, goedkoop, accuraat en met zo weinig mogelijk arbeid bereikt

worden.

Voor de optimalisatie van deze methode waarbij HPLC analyse gekoppeld aan een

„linear ion trap quadrupole‟ massa analysator gebruikt wordt, werd er vertrokken van de

methode ontwikkeld door Verheyden et al. (2007). Voor de extractie van het staal werd er

vertrokken van de methode van Zamaratskaia et al. (2005). Vervolgens werden verschillende

opzuiveringsmethodes waaronder diverse soorten SPE en centrifugale filters geëvalueerd

teneinde de opzuivering te optimaliseren.

Nadat de staalvoorbereiding geoptimaliseerd werd, werd er overgegaan naar U-HPLC

analyse gekoppeld aan een „triple stage quadrupole‟ massa analysator en uiteindelijk een

Orbitrap massa analysator, om een kortere analysetijd, een betere selectiviteit en een betere

gevoeligheid te bekomen.

18

3. MATERIAAL EN METHODEN

3.1 MATERIAAL

3.1.1 Algemeen

Amicon Ultra – 0,5 mL Centrifugal Filters (Millipore, Massachusetts, VS)

Bargenvet (Slachthuis RIMA, Mechelen, België)

Kalibratie ionenoplossing (positief en negatief) (Sigma-Aldrich, St. Louis, VS)

Diepvries op -20 °C (PVBA Schatten, Brussel, België)

Erlenmeyers van 50 mL met NS hals en stop (VWR International, West Chester, VS)

Eppendorfcentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Duitsland)

Eppendorfs (Eppendorf, Hamburg, Duitsland)

HPLC vials met passende septa en doppen (Filterservice, Eupen, België)

Linear Ion Trap Quadrupole massaspectrometer (Finnigan LTQ, Thermo Fisher

Scientific, San José, VS)

Microgolfoven (Zanker, Zaventem, België)

Orbitrap massaspectrometer (ExactiveTM

, Thermo Fisher Scientific, San José, VS)

Plastiek proefbuizen van 15 mL (Meus Srl., Piove Di Sacco, Italië)

SPE Oasis HLB (30 µm – 3 cc – 60 mg) (Waters Corporation, Milford, VS)

Stikstofindamper Turbovap ® LV Evaporator (Zymark, Teralfene, België)

Triple Stage Quadrupole massaspectrometer (Quantum TSQ Vantage, Thermo Fisher

Scientific, San José, VS)

Ultrasoonbad Transsonic digital S (Elma GmbH & Co KG, Singen, Duitsland)

Vortex (Labworld Yellowline IKA, Boutersem, België)

Warmwaterbad (GFL, Burgwedel, Duitsland)

3.1.2 Reagentia en chemicaliën

Berengeurcomponenten:

Androstenon of 5-α-androst-16-en-3-on (Steraloids Inc, Newport, VS)

Indol of 2,3-benzopyrol (Merck, Darmstadt, Duitsland)

Skatol of 3-methylindol (Merck, Darmstadt, Duitsland)

19

Interne standaarden:

Androstadienedion of 1,4-androstadieen-3,17-dione (Sigma-Aldrich, St. Louis, VS)

2-methylindol (Merck, Darmstadt, Duitsland)

Opzuivering en analyse:

Aceton for analysis (Merck, Darmstadt, Duitsland)

Acetonitril Optima LC-MS (Fisher Scientific, Leichestershire, VS)

Azijnzuur (Merck, Darmstadt, Duitsland)

Methanol Optima LC-MS (Fisher Scientific, Leichestershire, VS)

Methanol pro analysis (Merck, Darmstadt, Duitsland)

Mierenzuur (Merck, Darmstadt, Duitsland)

Ultrapuurwater (Waterzuiveringstoestel Arium ® 611UV, VWR, Haasrode, België)

3.1.3 Oplossingen

Tabel 3.1: Oplossingen

Spike oplossing berengeur (BG)

10 ng/µL BG 100 ng/µL BG 1000 ng/µL MeOH

100 ng/µL BG 100 µL* 700 µL

50 ng/µL BG 500 µL 500 µL



* van elke component: indol, skatol en androstenon

Interne standaard oplossing (IS)

ADD

100 ng/µL

2-MID

100 ng/µL

10 ng/µL IS MeOH

50 ng/µL IS

10 ng/µL IS

1 ng/µL IS

500 µL

100 µL

500 µL

100 µL

100 µL

800 µL

900 µL

Solventen

Azijnzuur Mierenzuur Ultrapuurwater

1% azijnzuur 10 mL 990 mL

0,5% azijnzuur 5 mL 995 mL

0,2% mierenzuur 2 mL 998 mL

0,1% mierenzuur 1 mL 999 mL

0,05% mierenzuur 0,5 mL 999,5 mL

20

Vervolg Tabel 3.1: Oplossingen

Elutie-en wasvloeistoffen

Aceton MeOH Ultrapuurwater

Aceton/MeOH 80:20 800 mL 200 mL

Aceton/MeOH 50:50 500 mL 500 mL

50% MeOH 10 mL 10 mL

20% MeOH 4 mL 16 mL

10% MeOH 2 mL 18 mL

5% MeOH 1 mL 19 mL

Standaardoplossingen

Standaard 1 ng/µL BG 1 ng/µL IS MeOH Azijnzuur Mierenzuur (0,05%)

LTQ 100 µL 100 µL 400 µL 400 µL (1%)

TSQ 100 µL 100 µL 300 µL 500 µL

Orbitrap 100 µL 100 µL 300 µL 500 µL

3.2 METHODEN

3.2.1 Staalvoorbereiding

3.2.1.1 Protocol staalvoorbereiding

Vetstalen kunnen niet rechtstreeks door het HPLC toestel geanalyseerd worden. Er is

staalvoorbereiding nodig waarbij de verschillende stappen strikt dienen gevolgd te worden om

reproduceerbare resultaten te bekomen. Er werden verscheidene staalvoorbereidingen zoals de

vaste fase extractie (SPE) en het gebruik van amicon filters met verschillende poriëngroottes,

getest.

Tabel 3.2: Spikingvolumes per erlenmeyer

Aantal ppb Hoeveelheid (µL) van

spike oplossing BG

Concentratie spike

oplossing BG (ng/µL)

Hoeveelheid (µL) interne

standaard (50 ng/µL)

0 / / 20

100 20 10 20

250 50 10 20

500 20 50 20

750 30 50 20

1000 20 100 20

1500 30 100 20

2000 40 100 20

21

Vet afkomstig van de nekregio van bargen wordt vrij van androstenon geacht, bevat

een minieme hoeveelheid indol en skatol en kon daardoor als blanco matrix voor deze analyse

gebruikt worden. Na transport werd het vet van vlees- en huidresten ontdaan en diepgevroren

bij -20 °C. Er werd telkens 2g vet in kleine stukjes gesneden en in een erlenmeyer van 50 mL

gebracht. Vervolgens werd het vet gespiked. In Tabel 3.2 worden de specifieke

spikingvolumes per erlenmeyer aangegeven. Het gevolgde protocol wordt samengevat

weergegeven in Tabel 3.3.

Tabel 3.3: Protocol staalvoorbereiding

1. Bargenvet snijden en telkens 2g vet spiken

2. Vet laten smelten in de microgolfoven (3 minuten op 220 watt en 3 minuten wachten)

3. 150 µL vet pipetteren en in een eppendorf brengen

4. 750 µL MeOH toevoegen

5. Vortexen

6. 60 minuten in warmwaterbad op 60 °C (na 30 minuten eens opschudden)

7. Afkoelen gedurende 60 minuten in diepvries bij -20 °C

8. Zonder te laten ontdooien centrifugeren bij 14.000 rpm, 5 minuten en 4 °C in

eppendorfcentrifuge

9. Vaste fase extractie (SPE):

Conditionering: 2 mL MeOH

Equilibratie: 2 mL 5% MeOH

Belading: 500 µL extract gemengd met 9500 µL ultrapuurwater (H2O)

Wassen: 2 mL 20% MeOH

Elutie: 1 mL MeOH

Extract opvangen

10. HPLC vial: 500 µL extract + 500 µL 0,05% mierenzuur

22

3.2.1.2 Geteste opzuiveringsstappen

3.2.1.2.1 Vaste fase extractie (SPE)

Opzuivering via SPE heeft tot doel de berengeurcomponenten indol, skatol en

androstenon op de kolom vast te houden door interactie met het pakkingsmateriaal terwijl de

matrixcomponenten verwijderd worden. Op die manier worden na elutie enkel de gewenste

analieten bekomen. De scheiding gebeurt door een polaire mobiele fase over een apolaire

stationaire fase te laten lopen. Er werd gebruik gemaakt van een Oasis HLB kolom (30 µm –

3 cc – 60 mg). Deze kolom is relatief hydrofoob, kent een hoge retentie en bezit een hoge

scheidingscapaciteit. Bij de vetanalyse wordt gebruik gemaakt van de veel gebruikte

omgekeerde fase (RP)-SPE waarbij een apolaire vaste stof bestaande uit silica in de kolom

vast zit. De functionele groepen van de silica gaan door middel van Van der Waalse krachten

met de analieten binden. Dit wil zeggen dat er een interactie ontstaat tussen de aanwezige

koolstofketens en de actieve groepen op het pakkingsmateriaal. Bij RP-SPE worden vooral

hydrofobe componenten weerhouden, wat een voordeel is bij deze analyse gezien zowel

androstenon, skatol als indol hydrofoob zijn.

De kolom moet geconditioneerd en geëquilibreerd worden en vervolgens geladen

worden met extract. Door te conditioneren wordt de stationaire fase geactiveerd zodat

interactie met het staal mogelijk wordt. Om maximale retentie te bekomen is equilibratie

nodig waarbij een solvent zoals bv. methanol gebruikt wordt. Door de kolom te wassen en te

drogen worden ongewenste, storende componenten verwijderd. Uiteindelijk worden de

gewenste berengeurcomponenten geëlueerd. Hierbij worden de aanwezige Van der Waalse

krachten verstoord door elutie met methanol waardoor de analieten loskomen en elueren.

Er werden verschillende experimenten uitgevoerd. Zo werd er getest of een andere

was- of elutievloeistof betere resultaten gaf (Tabel 3.4). Er werd ook gespeeld met het tijdstip

van elutie en met het al dan niet toepassen van indamping onder stikstofgas (Tabel 3.5).

Tabel 3.4: SPE als staalvoorbereiding: effect van was- en elutievloeistof

Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4

Wassen 5% MeOH 10% MeOH 20% MeOH 50% MeOH

Elutie ACN: 1e mL ACN: 2

e mL Aceton/MeOH 50:50

2e mL

Aceton/MeOH 80:20

2e mL

23

Tabel 3.5: SPE als staalvoorbereiding: effect van elutie tijdstip en indamping


Conditionering: 2 mL MeOH X X X X

Equilibratie: 2 mL 5% MeOH

Belading: 500 µL extract + 9500 µL H2O

Wassen: 2 mL 20% MeOH

Elutie: 1 mL MeOH

Indamping: N2-gas

Heroplossen in MeOH

X

X

X

1e mL

-

-

X

X

X

1e mL

tot 100 µL

X

X

X

X

1e mL

alles

X

X

X

X

2e mL

-

-

3.2.1.2.2 Amicon Filter

Er werden testen uitgevoerd met een amicon filter met poriëngrootte 10.000 en 30.000

Dalton (Da) met als doel om op deze wijze een meer zuivere vloeistof te genereren.

3.2.2 HPLC-MS/MS-analyse

Voor de hoge druk vloeistofchromatografie gekoppeld met tandem

massaspectrometrie (HPLC-MS/MS)-analyse werd er gebruik gemaakt van een Surveyor

HPLC gekoppeld aan een „linear ion trap quadrupole‟ massaspectrometer (Finnigan LTQ,

Thermo Fisher Scientific, San José, VS) om de geëxtraheerde en opgezuiverde vetstalen te

kunnen analyseren.

3.2.2.1 HPLC

3.2.2.1.1 HPLC kolommen

Allereerst werd er gebruik gemaakt van een Symmetry ® C18 kolom (5 µm, 150 mm

x 2,1 mm ID, Waters Corporation, Milford, VS) waarbij een constant debiet van 300 µL min-1

over de kolom liep. Het gaat om een niet gemodificeerde silicakolom die door de

aanwezigheid van octadecylgroepen (C18H37) een hoge affiniteit heeft voor apolaire

componenten. Zo zullen de C18 ketens door middel van Van der Waalse krachten hydrofobe

interacties aangaan met de cyclische gedeelten van androstenon, indol en skatol.

24

Vervolgens werd ook een NUCLEODUR Hypercarb kolom getest (5 µm, 100 mm x

2,1 mm ID, Thermo Fisher Scientific, San José, VS). De selectiviteit van het

pakkingsmateriaal van de Hypercarb kolom is verschillend van die van de silicakolom waarbij

de Hypercarb beter geschikt is voor scheiding van sterk polaire componenten. Nog een

voordeel is de efficiëntere scheiding van structureel verwante componenten. Tevens is de

kolom bestand tegen hoge temperaturen en blijft hij stabiel bij extreme pH-waarden.

Als laatste kolomtype werd de NUCLEODUR Sphinx RP kolom gebruikt (5 µm,

250 mm x 4 mm ID, Macherey-Nagel, Dűren, Duitsland). Dit is een bifunctionele kolom die

propylfenylgroepen en C18 ketens bevat. De propylfenylgroepen binden polaire substanties

door middel van π-π interacties, terwijl de C18 ketens apolaire substanties vasthouden door

middel van hydrofobe interacties. Hierdoor is deze kolom zeer geschikt om aromatische

componenten te weerhouden. Deze kolom kent tevens een hoge specificiteit waardoor deze

gebruikt kan worden voor HPLC-MS/MS-analyse.

3.2.2.1.2 HPLC Solventen

Gezien het van belang is dat de berengeurcomponenten een goede affiniteit hebben

voor de solventen, werd er gezocht naar de ideale solventcombinatie. Zo werden er

experimenten met verschillende solventen uitgevoerd (Tabel 3.6).

Tabel 3.6: Solventen voor HPLC-MS/MS-analyse

Solvent A Solvent B Solvent C

Experiment 1 Acetonitril 1% azijnzuur /

Experiment 2 Methanol 1% azijnzuur Acetonitril

Experiment 3 Methanol 1% azijnzuur /

3.2.2.1.3 HPLC Gradiënt

Vertrekkende van de gradiënt die gebruikt werd in de methode van Verheyden et al.

(2007) werd er door de relatieve solventsamenstelling te variëren naar een optimale gradiënt

gezocht. Bij elke run werd er 10 µL staal geïnjecteerd. De geoptimaliseerde gradiënt voor de

HPLC-analyse wordt weergegeven in Tabel 4.1.

25

3.2.2.2 Linear Ion Trap Quadrupole

De algemene parameters voor de LTQ-analyse worden weergegeven in Tabel 3.7. Op

de „linear ion trap quadrupole‟ massaspectrometer werd een verwarmde APCI-bron bevestigd.

De drie-dimensionele positiecoördinaten van de APCI-bron waren: verticaal B-C en

horizontaal 0. De massaspectrometrische parameters geldig voor de detectie van de

berengeurcomponenten worden weergegeven in Tabel 3.8.

Tabel 3.7: Algemene parameters voor LTQ-analyse

Onderdeel Parameter Waarde

APCI-bron Sheath gasdebiet (arb) 50

Auxiliary gasdebiet (arb) 5

Ion sweep gasdebiet (arb) 5

Spray voltage (V) 5000

Temperatuur vernevelaar (°C)

Ionisatie modus

400

Positief

Capillair Temperatuur capillair (°C) 275

Capillair voltage (V) 1

Tube lens voltage (V) 65

Skimmer voltage (V) Automatisch

Tabel 3.8: Massaspectrometrische parameters voor LTQ-analyse (de meest abundante

productionen zijn onderstreept)

Analiet Precursorion (m/z) Production (m/z) Collisie-energie (eV)

Androstadienedion 285 267, 171, 147, 121 25

Androstenon 273 255, 199, 173, 159 25

Indol 118 100, 91, 86 70

Skatol 132 117, 100 70

2-methylindol 132 117, 100 70

3.2.3 U-HPLC-MS/MS

Na optimalisatie van de HPLC-MS/MS-analyse met de „linear ion trap quadrupole‟

massaspectrometer, werd er overgegaan naar ultrahoge druk vloeistofchromatografie

gekoppeld met tandem massaspectrometrie (U-HPLC-MS/MS)-analyse met een „triple stage

quadrupole‟ (Quantum TSQ Vantage, Thermo Fisher Scientific, San José, VS) als massa

analysator.

26

3.2.3.1 U-HPLC

Net zoals bij de HPLC-analyse moest ook deze techniek geoptimaliseerd worden. Dit

werd wederom gedaan door experimenten met verschillende kolommen, solventen en

gradiënten uit te voeren. Om de experimenten uit te voeren werd gestart van de waarden die

bekomen werden bij optimalisatie van de HPLC-analyse (4.2.1).

3.2.3.1.1 U-HPLC Instellingen

Bij elke run werd er 10 µL staal in het U-HPLC-MS/MS systeem geïnjecteerd en de

solventflow bedroeg 300 µL min-1

bij aanvang van de optimalisatie. Verschillende parameters

zoals de temperatuur van de kolomoven en het debiet werden geoptimaliseerd. Deze

parameters maken deel uit van de optimalisatie en kunnen daarom teruggevonden worden in

4.3.1.1.

3.2.3.1.2 U-HPLC Kolommen

Net zoals bij de HPLC-experimenten werd een NUCLEODUR Sphinx RP kolom

(1,8 µm, 100 mm x 2,1 mm ID, Macherey-Nagel, Düren, Duitsland) getest. Er werden ook

testen met de Hypersil Gold kolom (Thermo Fisher Scientific, San José, VS) gedaan. Deze

kolom bestaat uit pure silica die een goede C18 selectiviteit bezit. In vergelijking met de

gewone C18 kolommen, heeft deze kolom minder last van „tailing‟ en is de gevoeligheid

hoger. De Hypersil Gold (1,9 µm, 50 mm x 2,1 mm ID) en de Hypersil Gold (1,9 µm, 100

mm x 2,1 mm ID) kolommen werden eveneens uitgetest.

Als derde kolomtype werd een NUCLEODUR C18 Isis kolom (1,8 µm, 50 mm x 2

mm ID, Macherey-Nagel, Düren, Duitsland) gebruikt. Deze bestaat wederom uit pure silica,

maar hier is de silica gecrosslinked met apolaire, polymerische octadecylgroepen. Door deze

modificatie wordt een sterke sterische selectiviteit bekomen.

3.2.3.1.3 U-HPLC Solventen

Gezien azijnzuur in hoge concentraties (1%) op termijn schade kan berokken aan

zowel de kolom als het toestel, werd een lagere concentratie (0,5%) uitgeprobeerd. Hierdoor

kunnen het toestel en de kolom langer gebruikt worden, wat voor kostenverlaging zorgt. Het

tweede solvent bleef methanol. Er werden ook testen uitgevoerd met een ander zuur als

additief en dat in verschillende concentraties: 0,2% mierenzuur (HCOOH), 0,1% HCOOH en

27

0,05% HCOOH. Het tweede solvent bleef methanol. Mierenzuur heeft een hogere zuurtegraad

dan azijnzuur waardoor bij gebruik van mierenzuur als solvent een lagere concentratie kon

gebruikt worden.

3.2.3.1.4 U-HPLC Gradiënt

Vertrekkende van de gradiënt die bekomen werd voor de HPLC-analyse (Tabel 4.1)

werd terug via variërende waarden naar een optimale gradiënt gezocht. De gradiënt die

uiteindelijk als optimaal werd bevonden wordt weergegeven in Tabel 4.2.

3.2.3.2 Triple Stage Quadrupole

Een verwarmde APCI-bron werd op de „triple stage quadrupole‟ massa analysator

bevestigd. De drie-dimensionale positiecoördinaten van de APCI-bron waren dezelfde als die

gebruikt bij de LTQ.

3.2.3.2.1 TSQ optimalisatie

Net zoals bij de LTQ moest ook deze techniek geoptimaliseerd worden. Om de diverse

berengeurcomponenten te kunnen analyseren werd er per component naar de productionen

gekeken. De exacte massa‟s van deze productionen, de nodige collisie-energie en S-lens

voltage, waardoor de vorming en optimale detectie van deze productionen mogelijk werd,

werden bepaald. Dit werd bekomen door elke component individueel te infuseren in de TSQ.

De bekomen massaspectrometrische parameters voor TSQ-analyse worden weergegeven in

Tabel 4.3, aangezien deze deel uitmaken van de optimalisatie van de methode.

Verschillende waarden voor de algemene parameters van de TSQ-analyse, met name

voor de APCI-bron en het capillaire gedeelte, werden tevens uitgetest om een zo goed

mogelijk resultaat van de analyse te bekomen. Zo werd onder andere naar een optimale

waarde gezocht voor het sheath gasdebiet, het auxiliary gasdebiet en het ion sweep gasdebiet

(Tabel 4.4).

3.2.4 U-HPLC-HR-MS

3.2.4.1 U-HPLC

Na optimalisatie van de U-HPLC-MS/MS-analyse met de TSQ werd overgegaan naar

ultrahoge druk vloeistofchromatografie gekoppeld met hoge resolutie massaspectrometrie (U-

28

HPLC-HR-MS)-analyse met de Orbitrap (ExactiveTM

, Thermo Fisher Scientific, San José,

VS) als massaspectrometer. Voor deze analyse werd de methode, die gebruikt werd bij de U-

HPLC-MS/MS-analyse, beschreven in 3.2.3, overgedragen.

3.2.4.2 Orbitrap ExactiveTM

Op de Orbitrap ExactiveTM

massa analysator werd een verwarmde APCI-bron op

dezelfde manier bevestigd als bij de LTQ en de TSQ. De Orbitrap werd om de 24u

gekalibreerd met een positieve en een negatieve modus ionenoplossing.

Het gaat hier om hoge resolutie massaspectrometrie (HR-MS) waarbij de massa‟s heel

accuraat kunnen gedetecteerd worden. Gezien de Orbitrap ExactiveTM

dus met hoge

accuraatheid massa‟s kan waarnemen, tot vijf cijfers na de komma, werden de MS parameters

aangepast. Dit gebeurde door elke component individueel te infuseren in het toestel. De

bekomen massaspectrometrische parameters voor Orbitrap-analyse worden weergegeven in

Tabel 4.5, aangezien deze deel uitmaken van de optimalisatie van de methode. Gezien de

massa‟s binnen een bepaalde marge gedetecteerd worden, werd deze marge berekend via

formule 3.1. Voor elke component werd ook de accurate massa (ppm) berekend (formule 3.2).

Marge = berekende massa – waargenomen massa (3.1)

ppm = (marge / berekende massa) x 106 (3.2)

Vervolgens werden verschillende waarden voor de algemene parameters van de

analyse, met name voor het capillaire gedeelte geoptimaliseerd, teneinde een zo goed

mogelijk resultaat van de analyse te bekomen. Zo werd onder andere naar een optimale

waarde gezocht voor de voltage van het capillair, de voltage van de tube lens en de voltage

van de skimmer. Deze waarden konden niet manueel aangepast worden bij de TSQ.

Ook andere essentiële parameters zoals de resolutie en het „Automatic Gain Control‟ AGC

target werden geoptimaliseerd door middel van ijklijn analyse (Tabel 3.9). De parameters

maken deel uit van de optimalisatie en kunnen terug gevonden worden in Tabel 4.6.

Tabel 3.9: Resolutie en AGC target experimenten


Resolutie High High Ultrahigh Ultrahigh

AGC target

High dynamic

range

Ultimate mass

accuracy

High dynamic

range

Ultimate mass

accuracy

29

3.2.4.3 Prestatiecriteria

De ontwikkelde U-HPLC-HR-MS-analyse gekoppeld met de Orbitrap ExactiveTM

kan

gevalideerd worden volgens de criteria die beschreven worden in de EU Commission

Directive 2002/657/EC ter uitvoering van richtlijn 96/23/EC van de Raad voor analytische

residu methoden voor matrices afkomstig van dierlijke oorsprong. De methodeontwikkeling

werd op deze criteria gebaseerd aangezien voor de analyse van berengeur in varkensvet geen

strikte richtlijnen bestaan.

Wegens tijdsgebrek kon er geen volledige validatie uitgevoerd worden. Op basis van

de uitgevoerde experimenten kon echter wel reeds een beeld gevormd worden van enkele

parameters, die in de toekomst specifiek en in detail onderzocht zullen worden tijdens de

effectieve validatie.

De specificiteit en selectiviteit handelen over het vermogen van de methode om de te

bepalen analieten (indol, skatol en androstenon) te onderscheiden van nauw verwante stoffen.

De precisie van een methode kan onderzocht worden aan de hand van de

herhaalbaarheid en de intralaboratoriumreproduceerbaarheid. De herhaalbaarheid richt zich op

de resultaten die onafhankelijk van elkaar verkregen werden met behulp van dezelfde

methode bij identiek analysemateriaal in hetzelfde laboratorium door dezelfde laborant met

dezelfde apparatuur. Gezien het merendeel van de experimenten door dezelfde laborant

uitgevoerd werden, kon er een besluit over de herhaalbaarheid genomen worden. Gezien er bij

het laatste experiment telkens een ijklijn gemaakt werd door twee verschillende laboranten, op

twee verschillende dagen, maar met identiek analysemateriaal en dezelfde apparatuur, kon de

intralaboratoriumreproduceerbaarheid expliciet berekend worden. Om deze te berekenen werd

de gemiddelde concentratie, de standaardafwijking en de relatieve standaarddeviatie (RSD)

(in %) berekend voor de twee ijklijnen (Tabel 4.7). Wanneer de RSD beneden de 20% ligt kan

er over een goede intralaboratoriumreproduceerbaarheid gesproken worden (EU Commission

Directive, 2002).

De lineariteit kon onderzocht worden door de correlatiecoëfficiënten (R²) van de

verschillende ijklijnen na te gaan. Voor elke analysedag werd steeds een ijklijn gemaakt,

bestaande uit één blanco vetstaal en zeven vetstalen met verschillende spikingniveaus aan

berengeurcomponenten (100, 250, 500, 750, 1000, 1500 en 2000 ppb).

30

4. RESULTATEN

4.1 STAALVOORBEREIDING

Een belangrijke stap in de analyseprocedure is de staalvoorbereiding. Hierdoor worden

de stalen opgezuiverd en is er opconcentrering van de gewenste berengeurcomponenten

androstenon, indol en skatol. Vorig onderzoek wees reeds uit dat het protocol van

Zamaratskaia et al. (2005) het beste was om de optimalisatie van de staalvoorbereiding te

starten. Na voorbereiding van de vetstalen via bovenstaand protocol, werden deze aan SPE

onderworpen.

Hiertoe werden verschillende testen uitgevoerd waar het 1e mL eluaat zowel als

dusdanig werd geanalyseerd als ingedampt werd tot 100 µL of tot droog. Na het indampen

werd het droge staal heropgelost in methanol en 1% azijnzuur (50:50). Ook werd getest of

analyse van het 2e mL eluaat betere resultaten opleverde. Daarnaast werd ook de amicon filter

met poriëngrootte 10.000 Da en 30.000 Da als opzuiveringstechniek getest.

Na het bekijken van de piekoppervlakteverhoudingen van de vetstalen gespiked met

500 ppb aan interne standaard en 2000 ppb aan berengeurcomponenten, kwamen twee

technieken als beste naar voren: SPE waarbij de 1e mL aan eluaat geanalyseerd werd en de

SPE waarbij de 1e mL volledig ingedampt werd onder stikstofgas (Figuur 4.1).

Figuur 4.1: Resultaten staalvoorbereiding met SPE en amicon filter, waarbij de stalen gespiked

werden met 500 ppb interne standaard en 2000 ppb aan berengeurcomponenten

Legende: 1 = geen opzuivering; 2 = SPE 1e mL; 3 = SPE 1

e mL ingedampt tot 100 µL; 4 = SPE 1

e mL alles

ingedampt; 5 = SPE 2e mL; 6 = amicon filter 10.000 Da; 7 = amicon filter 30.000 Da

31

Hierbij en bij verdere experimenten werd vooral naar androstenon gekeken, gezien in

het verleden met deze component de meeste problemen opdoken. De

piekoppervlakteverhouding werd bekomen door de piekoppervlakte van de

berengeurcomponent uit te zetten op de piekoppervlakte van zijn interne standaard.

Om de beste methode te kunnen selecteren werden vervolgens 8-puntige ijklijnen in

vet geanalyseerd (0, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500 en 2000 ppb aan

berengeurcomponenten). Om de beste staalvoorbereiding te kiezen werd er gekeken naar

piekoppervlaktes (AA), retentietijden (RT), signaal-over-ruis verhoudingen (S/N) en

correlatiecoëfficiënten (R²) per berengeurcomponent. De SPE techniek waarbij de 1e mL aan

eluaat gebruikt werd voor analyse, bleek de beste te zijn (Figuur 4.2). De scheiding van skatol

en 2-methylindol (2-MID) was goed zichtbaar, de retentietijden lagen voor alle componenten

voor de 100% methanol en de S/N waarden waren bij deze staalvoorbereiding het hoogst.

Tevens waren de correlatiecoëfficiënten van deze ijklijnen voor alle componenten hoger dan

bij de andere staalvoorbereidingen.

Figuur 4.2: IJklijn staalvoorbereiding met SPE bij gebruik van het 1e mL eluaat

Vervolgens werden er testen uitgevoerd met verschillende concentraties methanol als

wasvloeistof (5%, 10%, 20% en 50%). Wanneer de piekoppervlakteverhoudingen van de

vetstalen, elk gespiked met 500 ppb interne standaard en 2000 ppb aan

berengeurcomponenten, vergeleken werden, konden echter geen significante verschillen

vastgesteld worden tussen de verschillende gebruikte wasvloeistoffen. Gezien de

correlatiecoëfficiënten het hoogst waren bij het gebruik van 20% methanol als wasvloeistof,

32

werd deze techniek verkozen (Figuur 4.3). Alle correlatiecoëfficiënten waren groter dan 0,98,

wat op statistisch juiste resultaten wijst.

Figuur 4.3: IJklijn voor SPE met 20% MeOH als wasvloeistof

Vervolgens werden verschillende elutievloeistoffen getest: 1 mL acetonitril (ACN)

voor elutie van het 1e en 2

e mL eluaat, 1 mL aceton/MeOH in verhouding 50:50 of 80:20 voor

elutie van het 2e mL eluaat en 1 mL MeOH voor elutie van de 1

e mL. Door de

correlatiecoëfficiënten van de ijklijnen te bekijken, bleek dat elutie met behulp van 1 mL

MeOH het beste resultaat opleverde (Figuur 4.4).

Figuur 4.4: IJklijn voor SPE met MeOH als elutievloeistof

33

4.2 HPLC-MS/MS

4.2.1 HPLC

4.2.1.1 HPLC Kolommen

Een geschikte kolom is van essentieel belang bij HPLC-analyse aangezien deze de

verschillende componenten van elkaar scheidt waardoor deze individueel waargenomen

kunnen worden door de massa analysator. Door analyse van berengeurstandaarden werden

verschillende kolommen uitgetest: de Symmetry C18, de Hypercarb en de Sphinx RP kolom

(Figuur 4.5).

Figuur 4.5: Chromatogram Symmetry C18 kolom (links) en Sphinx RP kolom (rechts)

34

Voor de evaluatie ervan werd er naar verscheidene factoren gekeken. Zo werd er

gestreefd naar een analyse met een hoge piekoppervlakte, een zo hoog mogelijke signaal-

over-ruis verhouding en een lage retentietijd. Omdat de componenten niet samen met de

solventpiek zouden elueren moeten te lage retentietijden (dood volume van de kolom)

vermeden worden. Ook de scheiding van de componenten skatol en 2-methylindol moet zo

goed mogelijk zijn (minstens op de basislijn gescheiden). Dit omdat deze twee componenten

dezelfde massa bezitten en dus enkel op basis van retentietijden door de massa analysator

kunnen onderscheiden worden.

De piekoppervlaktes en de S/N waarden lagen bij de Symmetry C18 kolom hoger dan

bij de andere kolommen. Bij de Symmetry C18 kolom elueerden tevens alle componenten voor

de 100% methanol bereikt werd. Dit is van belang gezien dan alles wat aanwezig was op de

kolom elueert en er dus grote kans is op meer interferentie. Tevens was ook de scheiding van

skatol en 2-MID het beste bij de Symmety C18 kolom. Door deze positieve resultaten werd de

Symmetry C18 kolom als beste kolom voor deze HPLC-analyse verkozen. De resultaten voor

de Hypercarb kolom worden niet weergegeven aangezien deze beduidend slechter waren dan

de Symmetry C18 en de Sphinx RP kolom.

4.2.1.2 HPLC Solventen

In de studie van Verheyden et al. (2007) werden, voor de analyse van vetstalen door

middel van HPLC gekoppeld aan een LTQ massaspectrometer, methanol en 1% azijnzuur als

solventen gebruikt. In deze studie werden er testen gedaan met verschillende

solventcombinaties, onder andere met acetonitril (ACN) en methanol. Ook een combinatie

van methanol, ACN en 1% azijnzuur werd uitgetest (Tabel 3.6). Het beste resultaat werd

verkregen bij het gebruik van methanol (MeOH) en 1% azijnzuur (HAc) als solventen (Figuur

4.6). Bovenstaand resultaat werd bevestigd door het lopen van ijklijnen, gespiked zoals bij

vorige ijklijnen. De correlatiecoëfficiënten lagen voor alle berengeurcomponenten boven de

0,99, wat terug op statistisch juiste resultaten wees.

35

Figuur 4.6: Resultaten analyse met verschillende solventcombinaties, waarbij elk staal gespiked

werd met 500 ppb interne standaard en 2000 ppb aan berengeurcomponenten

4.2.1.3 HPLC Gradiënt

Er werd vertrokken van de methode ontwikkeld door Verheyden et al. (2007). Deze

methode duurde echter 60 minuten per analyserun en androstenon elueerde pas bij 100%

methanol. Gezien alle componenten een retentietijd van minder dan 30 minuten hadden, werd

er geprobeerd een kortere methode te ontwikkelen. Als solventen werden 1% azijnzuur (A) en

methanol (B) gebruikt. Uiteindelijk werd met een methode van 35 minuten (Tabel 4.1) een

beter resultaat gerealiseerd dan bij de methode van Verheyden et al. (2007) gezien

androstenon nu wel voor de 100% methanol elueerde.

Tabel 4.1: Geoptimaliseerde gradiënt voor HPLC-analyse

Tijd (min) A (%) B (%) Debiet (µL min-1

)

0,00 60 40 300

1,00 60 40 300

1,10 55 45 300

7,00 55 45 300

8,00 5 95 300

25,00 0 100 300

25,01 0 100 300

30,00

35,00

60

60

40

40

300

300

4.2.2. HPLC-MS/MS-analyse van berenvet

In Figuur 4.7 wordt het chromatogram weergegeven voor een vetstaal gespiked met

500 ppb interne standaard en 500 ppb aan berengeurcomponenten, dat bekomen werd met de

36

ontwikkelde HPLC-MS/MS-analyse. Voor androstenon en androstadienedion is

matrixinterferentie echter zichtbaar.

Figuur 4.7: Chromatogram HPLC-MS/MS-analyse van berenvet

4.3 U-HPLC-MS/MS

Gezien bij analyse met een „linear ion trap quadrupole‟ massa analysator

matrixinterferentie werd waargenomen voor androstenon en androstadienedion, werd

geopteerd om naar een „triple stage quadrupole‟ systeem over te gaan. Hierbij werd tevens de

overgang gemaakt van klassieke HPLC naar ultra-performante (snelle) U-HPLC.

4.3.1 U-HPLC

4.3.1.1 U-HPLC Instellingen

Als ideale waarde voor de temperatuur van de kolomoven werd 30 °C gevonden.

Ondanks testen met hogere debieten zoals 400 en 500 µL min-1

bleek de waarde waarmee

gestart werd (300 µL min-1

) nog altijd de beste te zijn.

37

4.3.1.2 U-HPLC Kolommen

Net zoals voor de HPLC-analyse werd ook hier gezocht naar een geschikte kolom. Er

werden testen uitgevoerd met de Sphinx RP, C18 Isis, Hypersil Gold 50 mm en Hypersil Gold

100 mm kolom. Bij het bekijken van de chromatogrammen bleek de Hypersil Gold 50 mm

kolom het beste resultaat te geven. De piekoppervlaktes en de S/N waarden lagen hoger in

vergelijking met de andere kolommen, de retentietijden van alle componenten lagen voor de

100% methanol en skatol en 2-MID werden voldoende gescheiden (Figuur 4.8).

Figuur 4.8: Chromatogram Hypersil Gold 50 mm kolom

4.3.1.3 U-HPLC Solventen

Er werden testen uitgevoerd waarbij azijnzuur in concentratie verlaagd werd en

vervangen werd door mierenzuur in drie verschillende concentraties (0,2%; 0,1% en 0,05%).

Bij het bekijken van de chromatogrammen van een berengeurstandaard werden geen

38

significante verschillen vastgesteld. Voor de verschillende solventen werden ook ijklijnen

gelopen, gespiked zoals bij voorafgaande testen, waaruit bleek dat mierenzuur beter was. Dit

was te zien aan de hogere correlatiecoëfficiënten gevonden bij analyses waarbij mierenzuur in

plaats van azijnzuur als solvent werd gebruikt. Er werd voor de laagste concentratie

mierenzuur (0,05%) gekozen gezien dit beter is voor de kolom en het toestel.

4.3.1.4 U-HPLC Gradiënt

De gradiënt die uiteindelijk als optimaal werd bevonden, wordt weergegeven in Tabel

4.2. Als solventen werden 0,05% mierenzuur (A) en methanol (B) gebruikt.

Tabel 4.2: Geoptimaliseerde gradiënt U-HPLC-analyse

Tijd (min) A (%) B (%) Debiet (µL min-1

)

0,00 50 50 300

0,01 53 47 300

2,75 50 50 300

3,00 5 95 300

6,00

8,00

8,01

10,00

0

0

50

50

100

100

50

50

300

300

300

300

4.3.2 Triple Stage Quadrupole

4.3.2.1 TSQ optimalisatie

Door elke component afzonderlijk te infuseren werden het precursorion en de

productionen bepaald. Tevens werden specifieke massaspectrometrische parameters zoals

collisie-energie en S-lens voltage geoptimaliseerd. De bekomen resultaten worden


Tabel 4.3: Massaspectrometrische parameters voor TSQ-analyse

Analiet Precursorion

(m/z)

Production

(m/z)

Collisie-energie

(eV)

S-lens voltage (V)

Androstadienedion 285,2 77,0 49 70

91,0 38 70

121,0 23 70

147,0 18 70

Androstenon 273,2 77,0 50 74

91,0 39 74

93,0 30 74

255,2 13 74

39

Vervolg Tabel 4.3: Massaspectrometrische parameters voor TSQ-analyse

Analiet Precursorion

(m/z)

Production

(m/z)

Collisie-energie

(eV)

S-lens voltage (V)

Indol 118,1 38,9 48 66

65,0 32 66

91,0 22 66

117,3 22 66

Skatol 132,1 77,0 35 72

89,0 39 72

90,0 33 72

117,0 23 72

2-MID 132,1 63,0 55 74

77,0 36 74

89,0 40 74

117,0 22 74

De algemene, als best bevonden parameters voor de TSQ-analyse worden


Tabel 4.4: Algemene parameters voor TSQ-analyse







Ionisatie modus

250

Positief


Capillair voltage (V) Automatisch

Tube lens voltage (V) Automatisch

Skimmer voltage (V) Automatisch

4.3.3 U-HPLC-MS/MS-analyse van berenvet

In Figuur 4.9 wordt het chromatogram weergegeven voor een vetstaal gespiked met

500 ppb aan interne standaard en 2000 ppb aan berengeurcomponenten dat bekomen werd

met de ontwikkelde U-HPLC-MS/MS-analyse. Net zoals bij de LTQ werd ook hier

matrixinterferentie vastgesteld bij androstenon en androstadienedion.

40

Figuur 4.9: Chromatogram U-HPLC-MS/MS-analyse van berenvet

4.4 U-HPLC-HR-MS

Voor de U-HPLC-HR-MS-analyse door middel van een Orbitrap ExactiveTM

, werd de

U-HPLC methode die gebruikt werd bij de U-HPLC-MS/MS-analyse, beschreven in 4.3.1,

overgedragen.

4.4.1 Orbitrap ExactiveTM

Net zoals bij de TSQ werd ook voor de Orbitrap het MS gedeelte geoptimaliseerd

(Tabel 4.5). Door elke component apart te infuseren werd de exacte massa van het

precursorion bepaald. De Orbitrap massa analysator kan massa‟s zeer accuraat detecteren,

binnen een bepaalde marge. Deze marge werd berekend via formule 3.1, ook de accurate

massa (ppm) werd berekend (formule 3.2). Een waarde van minder dan 2 ppm betekent dat

een massaspectrometer massa‟s kan waarnemen tot vijf cijfers na de komma.

41

Tabel 4.5: Massaspectrometrische parameters voor Orbitrap-analyse

Analiet Massa + marge ppm Resolutie

Androstadienedion 285,18396 ± 0,00012 0,4208 38013

Androstenon 273,22032 ± 0,00020 0,7320 38613

Indol 118,06500 ± 0,00012 1,0160 47071

Skatol 132,08043 ± 0,00006 0,4543 55760

2-MID 132,08052 ± 0,00015 1,1360 55517

Voor optimalisatie van de APCI-bron en het capillaire gedeelte werden verschillende

experimenten uitgevoerd. Zo werd, door het uittesten van variërende waarden, de optimale

parameter voor de voltage van het capillair, de voltage van de tube lens en de voltage van de

skimmer gevonden. Hierbij werd telkens een berengeurstandaard geanalyseerd. Bij het

bekijken van de chromatogrammen werd voorkeur gegeven aan waarden waarbij de

piekoppervlakte groot was en de S/N waarde zo hoog mogelijk was. Gezien er verschillende

mogelijke combinaties als goed bevonden werden, werden er ijklijnen gelopen en

geanalyseerd. Door te kijken naar de hoogste correlatiecoëfficiënten werd er voor alle

componenten gekozen voor een capillair voltage van 70 V, een tube lens voltage van 90 V en

een skimmer voltage van 20 V. De R² voor indol was 0,9882, R² voor skatol = 0,9922 en R²

voor androstenon = 0,9930. Een overzicht van alle parameters wordt weergegeven in Tabel

4.6.

Tabel 4.6: Algemene parameters voor Orbitrap-analyse







Ionisatie modus

250

Positief


Capillair voltage (V) 70

Tube lens voltage (V) 90

Skimmer voltage (V) 20

Gezien de resolutie van een analyse zeer belangrijk is, werd voor deze analyse de

hoogste resolutie nagestreefd. Een resolutie van 100.000 „full width at half maximum‟

(FWHM) (Ultrahigh) werd niet ideaal bevonden gezien de gevoeligheid in matrix sterk

42

daalde. Tegelijkertijd werden ook verschillende waarden voor het AGC target uitgetest: „high

dynamic range‟ en „ultimate mass accuracy‟.

Bij het bekijken van de chromatogrammen werden de beste resultaten bekomen bij

gebruik van hoge resolutie (50.000 FWHM) en de „high dynamic range‟ AGC target. Om dit

resultaat te bevestigen werd voor elke combinatie een ijklijn, gelijkaardig gespiked aan vorige

testen, geanalyseerd. Het resultaat van de chromatogrammen werd bevestigd gezien de R²

voor dit experiment het hoogst waren. R² voor indol was 0,9886, voor skatol 0,9867 en voor

androstenon 0,9874. De piekoppervlaktes en de S/N waarden lagen bij deze parameters tevens

het hoogst.

4.4.2 U-HPLC-HR-MS-analyse van berenvet

In Figuur 4.10 wordt het chromatogam weergegeven voor een vetstaal gespiked zoals

bij 4.3.3, dat bekomen werd met de ontwikkelde U-HPLC-HR-MS-analyse. Er werd, net zoals

bij vorige analyses enige matrixinterferentie vastgesteld bij androstenon en androstadienedion

maar echter in een veel mindere mate. Hierdoor konden de berengeurcomponenten tot op een

zeer lage concentratie (100 ppb) waargenomen worden. Tevens lagen de S/N waarden veel

hoger dan bij vorige resultaten.

Figuur 4.10: Chromatogram U-HPLC-HR-MS-analyse van berenvet

43

4.4.3 Prestatiecriteria

Bij de ontwikkelde U-HPLC-HR-MS-analyse kan over een goede specificiteit en

selectiviteit gesproken worden aangezien de Orbitrap massaspectrometer massa‟s tot op vijf

cijfers na de komma nauwkeurig kan meten. Ook werd nauwelijks matrixinterferentie

waargenomen, zoals te zien in het chromatogram dat wordt weergegeven in Figuur 4.10.

Om de intralaboratoriumreproduceerbaarheid te berekenen werd de relatieve

standdeviatie (RSD) (in %) berekend voor een ijklijn in matrix, gespiked zoals vorige

ijklijnen, uitgevoerd door twee verschillende laboranten (n = 2) op twee verschillende dagen

(Tabel 4.7).

Tabel 4.7: Intralaboratoriumreproduceerbaarheid per component

Relatieve standaarddeviatie (%)

Component 100 ppb 250 ppb 500 ppb 750 ppb 1000 ppb 1500 ppb 2000 ppb

Androstenon 14,95 9,23 6,99 2,82 8,28 16,43 13,14

Indol 5,75 11,91 14,69 9,55 13,03 9,58 2,46

Skatol 19,52 7,10 11,29 1,44 12,41 7,55 0,63

De variatiecoëfficiënt ligt voor elke concentratie van de berengeurcomponenten onder

de 20% waardoor er over een goede intralaboratoriumreproduceerbaarheid kan gesproken

worden. Aangezien de RSDs telkens beantwoorden aan de vereiste 20%, kan verondersteld

worden dat ook de herhaalbaarheid voldoende zal zijn. Voor elke ijklijn werd per component

ook de vergelijking en de correlatiecoëfficiënt berekend (Figuur 4.11, 4.12). Een goede

herhaalbaarheid en intralaboratoriumreproduceerbaarheid impliceren een goede precisie.

Figuur 4.11 IJklijn U-HPLC-HR-MS-analyse uitgevoerd door laborant 1 op dag 1

44

Figuur 4.12: IJklijn U-HPLC-HR-MS-analyse uitgevoerd door laborant 2 op dag 2

Gezien er gedurende de optimalisatie van de U-HPLC-HR-MS-analyse gekoppeld aan

de Orbitrap massa analysator ijklijnen geanalyseerd werden waarvan de

correlatiecoëfficiënten boven de 0,98 lagen, kan er gesproken worden over een goede

lineariteit. Deze eerste evaluatie dient wel bevestigd te worden door een volledige validatie.

45

5. DISCUSSIE

Berengeur is de geur die vrijkomt bij verhitting van varkensvlees- en vet afkomstig

van beren (ongecastreerde mannelijke varkens). Gezien de onaangename smaak en geur van

het varkensvlees, moet dit zoveel mogelijk vermeden worden. Dit kan door castratie van

beren, maar gezien dit meestal zonder verdoving gebeurt, kent deze methode veel

tegenkanting. Er zijn reeds diverse alternatieven voorhanden. De productie van intacte beren

wordt als alternatief op lange termijn gezien, doordat deze productie vele voordelen met zich

meebrengt. Zowel voor deze productie als voor de andere alternatieven is het noodzakelijk dat

er een methode bestaat om berengeur te kunnen detecteren. Op dit moment is echter geen

standaardmethode voorhanden en bestaat er ook geen operationele definitie voor berengeur.

Tot op heden wordt berengeur opgespoord via sensoriële en laboratoriumanalyses. Bestaande

laboratoriumanalyses sporen enkel de indolische componenten (indol en skatol) of de

steroïden (androstenon) op. Ze worden dus niet simultaan bepaald. Een ander probleem is de

hoge kostprijs en de vele arbeid die een laboratoriumanalyse vergt. De methode van

Verheyden et al. (2007) is de enige vloeistofchromatografische (LC) methode waarbij de drie

berengeurcomponenten simultaan in vetweefsel bepaald worden. Deze gevalideerde methode

is gebaseerd op de methode ontwikkeld door Hansen-Møller (1994) waarbij gebruik gemaakt

werd van vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS). Het grote

probleem bij de methode van Verheyden et al. (2007) was echter het gebrek aan robuustheid.

Het doel van deze thesis bestond er dan ook in een robuuste methode voor de

simultane bepaling van de drie berengeurcomponenten te ontwikkelen. Allereerst werd de

staalvoorbereiding geoptimaliseerd waarbij vorig onderzoek aantoonde dat de

extractiemethode van Zamaratskaia et al. (2005) hiertoe het meest aangewezen bleek.

Vervolgens werden verscheidene staalopzuiveringen uitgetest, zoals de vaste fase extractie

(SPE) en de amicon filter. Evaluatie van beide opzuiveringstechnieken leidde tot selectie van

SPE waarbij het 1e mL eluaat geanalyseerd werd. Hierbij werd als wasvloeistof 20% methanol

als beste bevonden en voor elutie kreeg 1 mL methanol de voorkeur. Methanol was het beste

gezien deze de Van der Waalse krachten het best verbrak. De keuze voor SPE als bijkomende

staalopzuivering is niet verwonderlijk gezien in 80% van de staalvoorbereidingen SPE of

vloeistof-vloeistof extractie (LLE) gebruikt wordt (Wilson et al., 2004; Flores-Valverde et al.,

2008). Bij SPE moet wel opgelet worden voor verlies van belangrijke analieten, zoals

46

androstenon. Dit kan vermeden worden door onder andere een geschikte SPE kolom te

selecteren. De meest gebruikte kolom is een C18 kolom, die ook hier gebruikt werd.

Vervolgens werd de HPLC-MS/MS-analyse geoptimaliseerd. Hiervoor werd

vertrokken van de ontwikkelde methode van Verheyden et al. (2007) op een „linear ion trap

quadrupole‟ (LTQ). Via analyse van berengeurstandaarden en ijklijnen, werd er gezocht naar

een ideale kolom, solventcombinatie en gradiënt. Uiteindelijk werd een 35 minuten durende

analyse ontwikkeld, waarbij methanol en 1% azijnzuur als solventen gebruikt werden. Met de

ontwikkelde LTQ-analyse konden de drie berengeurcomponenten simultaan in vetweefsel

bepaald worden. Er traden echter wel problemen op bij het gebruik van deze analyse. Het

grootste probleem bij deze LTQ-analyse was de matrixinterferentie die heerste bij analyse van

androstenon en androstadienedion. Verder was de scheiding van skatol en 2-methylindol niet

optimaal, heerste er het probleem van „tailing‟, lagen de correlatiecoëfficiënten niet erg hoog

en duurde de analyse relatief lang.

Gezien er bij HPLC-MS/MS-analyse met de LTQ problemen optraden, werd er

overgestapt naar U-HPLC-MS/MS-analyse gekoppeld met een „triple stage quadrupole‟

(TSQ) als massaspectrometer. Hierbij werd de overgang gemaakt van HPLC naar U-HPLC.

U-HPLC kent kortere analysetijden, maar met behoud van hoge resolutie voor de

chromatografische pieken. Bij deze analyse wordt er gebruik gemaakt van kolommen die

bestaan uit pakkingsmateriaal waarvan de partikels een grootte van <1,9 µm hebben, wat

minder groot is dan de 3 µm partikels die gebruikt worden bij klassieke HPLC. Hierdoor en

mede door het gebruik van hoge druk wordt een betere resolutie bekomen in vergelijking met

de traditionele HPLC. De hogere resolutie bij U-HPLC is onder andere van belang voor

verhoging van de selectiviteit. Door het gebruik van hoge druk ontstaan er tevens smallere

pieken waardoor de componenten beter gescheiden worden. Andere voordelen zijn de hogere

piekcapaciteiten en hogere gevoeligheid en een betere en snellere analyse, wat wegens de

hoge kostprijs van de instrumenten en de solventen, een voordeel is (Stolker et al., 2007). De

gevoeligheid van een U-HPLC analyse ligt twee à drie keer hoger dan bij een HPLC analyse

(Swartz et al., 2005). Voor de massa analysator werd de overgang gemaakt van een LTQ ion

trap naar een TSQ triple quadrupole massaspectrometer. Door de verhoogde selectiviteit en

gevoeligheid werden verhoogde piekoppervlaktes, betere retentietijden en een betere

scheiding bekomen. Zowel de LTQ als de TSQ massaspectrometer kunnen gebruikt worden

voor kwalitatieve en kwantitatieve analyses. De LTQ heeft een betere gevoeligheid dan de

47

TSQ in full scan analyses, maar bij „Selected Reaction Monitoring‟ (SRM) geldt het

omgekeerde. Bij SRM of ook „Multiple Reaction Monitoring‟ (MRM) genoemd, worden

enkel de geselecteerde massa-over-lading verhoudingen (m/z) bekeken. Gezien dus enkel naar

die m/z waarden gezocht wordt, worden storende componenten met andere m/z waarden niet

gedetecteerd (De Brabander et al, 2007). Gezien vet een complexe matrix is, wordt door

gebruik van SRM of MRM al een groot deel matrixinterferentie vermeden. Met behulp van

deze U-HPLC-MS/MS-analyse werd uiteindelijk een 10 minuten durende analyse ontwikkeld.

Door de verhoogde selectiviteit was er een daling van de matrixinterferentie, maar deze bleef,

weliswaar in mindere mate, nog steeds bestaan. Tevens had de TSQ als belangrijkste

beperking het gebrek aan post-acquisitie opname van data. Dit is een groot nadeel bij analyse

van berengeurcomponenten gezien nog niet alle componenten die berengeur veroorzaken

gekend zijn. Hierdoor is het mogelijk dat wanneer er een nieuwe component ontdekt wordt,

deze niet kan bekeken worden in oude data. Er kan dus niet gescand worden op

ongeïdentificeerde, ongekende componenten (Nielen et al., 2007). Daarom werd de overgang

naar de Orbitrap HR-MS massaspectrometer gemaakt. Door de full scan analyse is het

mogelijk later onbekende componenten te bekijken, er is dus retrospectieve analyse mogelijk

zonder opnieuw te moeten analyseren, wat zorgt voor tijdwinst en kostendaling.

Bij HR-MS-analyse worden massa accuraatheden bekomen van minder dan 2 ppm,

wat betekent dat massa‟s tot vijf cijfers na de komma nauwkeurig kunnen gemeten worden.

Deze hoge massa accuraatheid wordt bekomen door het optimaliseren van het „Automatic

Gain Control‟ (AGC) target. De AGC bepaalt hoeveel ionen in de Orbitrap worden

opgevangen alvorens naar de detector te worden gestuurd (Makarov et al., 2006; De

Brabander et al., 2007). Tevens worden resoluties tot 100.000 „full width at half maximum‟

(FWHM) bekomen (Qizhi et al., 2005; Makarov et al., 2006; Nielen et al., 2007; Stolker et

al., 2007). Bij deze analyse werd als resolutie 50.000 FWHM gehanteerd terwijl als AGC

target de „high dynamic range‟ gekozen werd. De verhoogde resoluties zijn absoluut nodig bij

analyse van componenten die deel uitmaken van een complexe matrix, zoals vetweefsel. De

resolutie van een methode is een maat voor de scheiding van twee componenten. Bij een hoge

resolutie kan er met zekerheid besloten worden dat het om de gewenste component gaat en

niet om de combinatie van meerdere componenten. Door de koppeling van U-HPLC met HR-

MS is er een verhoogde selectiviteit, gevoeligheid en lineariteit (R²). Door al deze verbeterde

parameters is er snelle, robuuste, reproduceerbare en betrouwbare analyse mogelijk voor

meerdere componenten die in lage concentraties (ppb) in een complexe matrix voorkomen

48

(Nielen et al., 2007; Vanhaecke et al., 2009). In tegenstelling tot de LTQ en de TSQ werd bij

toepassing van deze methode maar een minieme matrixinterferentie waargenomen, wat een

groot voordeel biedt gezien de moeilijke analyse van de berengeurcomponenten in vetweefsel.

Het doel om een analytische methode te ontwikkelen die de drie

berengeurcomponenten indol, skatol en androstenon simultaan in vetweefsel afkomstig van

varkens kan analyseren, werd in deze thesis verwezenlijkt. Gezien de veelvuldigheid waarmee

de analyse uitgevoerd werd en de steeds terugkerende positieve resultaten, kan er gesproken

worden over een consistente analyse.

In de nabije toekomst kan de ontwikkelde U-HPLC-HR-MS-analyse gevalideerd

worden. De validatie zal uitgevoerd worden volgens de criteria die beschreven worden in de

EU Commission Directive 2002/657/EC ter uitvoering van richtlijn 96/23/EC van de Raad

voor analytische residu methoden voor matrices afkomstig van dierlijke oorsprong. Dit

gebeurde ondanks het feit dat er voor berengeurcomponenten geen maximale concentraties

vastgelegd zijn. In het algemeen gaat de validatie de gevoeligheid, robuustheid, precisie en de

lineariteit van de ontwikkelde analyse na. Wegens tijdsgebrek kon geen volledige validatie

uitgevoerd worden, maar op basis van de uitgevoerde experimenten kon er wel een beeld

gevormd worden van enkele parameters die expliciet zullen onderzocht worden tijdens de

volledige validatie. Zo werd vastgesteld dat de specificiteit en de selectiviteit van de analyse

goed waren gezien de Orbitrap massa analysator massa‟s accuraat kan detecteren. Doordat de

correlatiecoëfficiënten (R²) bij het merendeel van de uitgevoerde experimenten door dezelfde

laborant boven de 0,98 lagen, kan er gesproken worden over een goede lineariteit. Gezien bij

de laatste experimenten telkens één ijklijn door twee verschillende laboranten op twee

verschillende dagen voorbereid werd, kon er gekeken worden naar de

intralaboratoriumreproduceerbaarheid. Door het berekenen van de relatieve

standaarddeviaties (RSDs) van de ijklijnen werd vastgesteld dat er een goede

intralaboratoriumreproduceerbaarheid was. De resultaten impliceren een goede precisie. De

U-HPLC-HR-MS-analyse bleek niet alleen voor betere resultaten te zorgen maar de analyse

biedt ook voordelen ten opzichte van eerder ontwikkelde methodes. Zo duurt de

staalvoorbereiding minder lang waardoor er een daling van de arbeidsintensiteit en –duur en

er dus ook kostenverlaging is. Tijdens de analyse zelf wordt door de verkorte methode tevens

een minimum verbruik aan solventen nagestreefd, wat het milieu dan weer ten goede komt.

49

6. CONCLUSIE

In deze thesis werd een methode ontwikkeld en geoptimaliseerd voor de simultane

bepaling van de drie gekende berengeurcomponenten indol, skatol en androstenon in

vetweefsel, afkomstig van varkens. Alvorens met de analyse te kunnen starten diende er

staalvoorbereiding van de vetstalen te gebeuren. Voor de optimalisatie van staalvoorbereiding

werd gestart van Zamaratskaia et al. (2005). Na optimalisatie werd er uiteindelijk gekozen

voor een protocol met een SPE methode met 20% methanol als wasvloeistof en 1 mL

methanol als elutievloeistof, waarbij het 1e mL eluaat geanalyseerd werd. De analyse van het

vetstaal zelf gebeurde door een U-HPLC-HR-MS-analyse te koppelen aan een verwarmde

APCI-bron en als massa analysator werd een Orbitrap ExactiveTM

hoge resolutie

massaspectrometer gebruikt. Voor de optimalisatie van de analyse werd vertrokken van de

methode ontwikkeld door Verheyden et al. (2007). Uiteindelijk werd een 10 minuten durende

U-HPLC-HR-MS-analyse bekomen waarin de drie berengeurcomponenten simultaan

gedetecteerd werden.

In de nabije toekomst kan de ontwikkelde U-HPLC-HR-MS-analyse gevalideerd

worden volgens de criteria die beschreven worden in de EU Commission Directive

2002/657/EC. Er werd al een eerste indruk van enkele validatieparameters verkregen door de

uitgevoerde analyses te bekijken. Zo werd een goede specificiteit en selectiviteit vastgesteld

gezien de Orbitrap massa analysator in staat is massa‟s zeer accuraat te detecteren. Wanneer

de correlatiecoëfficiënten van de uitgevoerde experimenten berekend werden, werd

vastgesteld dat het merendeel boven de 0,98 lag, wat wijst op een goede lineariteit. Tijdens

het optimaliseren van de methode werden er bij het laatste experiment ijklijnen gelopen

waarbij de vetstalen voorbereid werden door twee verschillende laboranten op twee

verschillende dagen. Na het berekenen van de relatieve standaarddeviaties van deze ijklijnen

kon besloten worden dat de intralaboratoriumreproduceerbaarheid goed was, gezien ze voor

alle componenten, in alle concentraties beneden de 20% lagen. Er wordt tevens een goede

herhaalbaarheid verwacht, waardoor deze resultaten een goede precisie impliceren.

De ontwikkelde U-HPLC-HR-MS-analyse is een stap vooruit in het onderzoek naar

berengeur en heeft vele voordelen. Zo zorgt de verkorte methode voor een daling aan arbeid

en dus ook kosten. De kosten dalen ook doordat de kolommen en het toestel langer gebruikt

kunnen worden. Ook wordt met de ontwikkelde analyse aan het milieu gedacht door het

minimaal nodige aan solventen te gebruiken.

50

7. LITERATUURLIJST

Agergaard, N.; Laue, A. (1993). Absorption from the gastrointestinal tract and liver turnover of skatole. In:

Measurement and Prevention of Boar taint in Entire Male Pigs, Bonneau, M. (Ed.), INRA Editions, Parijs,

Frankrijk, pp. 107-111.

Ahmad, N.; Gower, D. B. (1968). The biosynthesis of some androst-16-enes from C21 and C19 steroids in boar

testicular and adrenal tissue. Biochemical Journal, 108, 233-241.

Aldal, I.; Andresen, O.; Egeli, A. K.; Haugen, J. E.; Grodum, A.; Fjetland, O.; Eikaas, J. L. H. (2005). Levels of

androstenone and skatole and the occurrence of boar taint in fat from young boars. Livestock Production Science,

95, 121-129.

Aluwé, M.; Bekaert, K. (2009). Vroegtijdige en betrouwbare detectie van berengeur en van de genetische aanleg

ervan. ILVO-DIER, Melle, België.

Aluwé, M.; Millet, S.; Nijs, G.; Tuyttens, F. A. M.; Verheyden, K.; De Brabander, H. F.; De Brabander, D. L.;

Van Oeckel, M. J. (2009). Absence of an effect of dietary fibre or clinoptilolite on boar taint in entire male pigs

fed practical diets. Meat Science, 82, 346-352.

Andresen, O. (1975). Radioimmunoassay for 5-alpha-androst-16-en-3-one in porcine adipose tissue. Acta

Endocrologica, 79, 619-624.

Angels Rius, M.; Hortos, M.; Garcia-Regueiro, J. A. (2005). Influence of volatile compounds on the

development of off-flavours in pig back fat samples classified with boar taint by a test panel. Meat Science, 71,

595-602.

Annor-Frempong, I. E.; Nute, G. R.; Wood, J. D.; Whittington, F. W.; West, A. (1998). The measurement of the

responses to different odour intensities of „boar taint‟ using a sensory panel and an electronic nose. Meat

Science, 50, 139-151.

Baars, B.; van den Berg, J.; Janssen, H. G.; Schoenmakers, P.; Tijssen, R.; Vonk, N. (1999). Chromatografie in

de praktijk: Vloeistofchromatografie. Ten Hagen & Stam b.v., Den Haag, Nederland.

Babol, J.; Squires, E. J. (1995). Quality of Meat from Entire Male Pigs. Food Research International, 28, 201-

212.

Babol, J.; Squires, E. J.; Gullett, E. A. (1996). Investigation of factors responsible for the development of boar

taint. Food Research International, 28, 573-581.

Babol, J.; Squires, E. J.; Lundström, K. (1997). Relationship between metabolism of androstenone and skatole.

In: Boar Taint in Entire Male Pigs, Bonneau, M.; Lundström, K.; Malmfors, B. (Eds.), EAAP Publication, 92,

pp. 62-65.

Babol, J.; Squires, E. J.; Lundström, K. (1998). Hepatic metabolism of skatole in pigs by cytochrome P4502E1.

Journal of Animal Science, 76, 822-828.

Babol, J.; Squires, E. J.; Lundström, K., (1999). Relationship between metabolism of skatole and androstenone

in intact male pigs. Journal of Animal Science, 77, 84-92.

Babol, J.; Zamaratskaia, G.; Juneja, R. K.; Lundström, K. (2004). The effect of age on distribution of skatole and

indole levels in entire male pigs in four breeds: Yorkshire, Landrace, Hampshire and Duroc. Meat Science, 67,

351-358.

Baltussen, W. H. M.; de Winter, M. A.; Kluivers-Poodt, M. (2009). Verdoofd castreren – Evaluatie van de

Verklaring van Noordwijk, LEI Wageningen UR, Den Haag. Rapport 2009-079, november 2009.

Banon, S.; Costa, E.; Gil, M. D.; Garrido, M. D. (2003). A comparative study of boar taint in cooked and dry-

cured meat. Meat Science, 63, 381-388.

51

Banon, S.; Andreu, C.; Laencina, J.; Garrido, M. D. (2004). Fresh and eating pork quality from entire versus

castrate heavy males. Food Quality and Preference, 15, 293-300.

Bekaert, K. M.; Tuyttens, F. A. M.; Duchateau, L.; De Brabander, H. F.; Aluwé, M.; Millet, S.;

Vandendriessche, F.; Vanhaecke, L. (2011). The sensitivity of Flemish citizens to androstenone: Influence of

gender, age, location and smoking habits. Meat Science, 88, 548-552.

Berdagué, J. L.; Viallon, C.; Bonneau, M.; Le Denmat, M. (1993). Indirect Evaluation of Boar Taint with Gas-

Chromatographic Mass-Spectrometric Measurement of Head Space Volatiles. Colloques de l’INRA, 60, 49-52.

Bird, S.; Gower, D. B. (1981). The validation and use of a radioimmunoassay for 5a-androst-16-en-3-one in

human axillary collections. Journal of Steroid Biochemistry, 14, 213-219.

Bonneau, M. (1982). Compounds Responsible for Boar Taint, with Special Emphasis on Androstenone – A

Review. Livestock Production Science, 9, 687-705.

Bonneau, M., Meusy-Dessolle, N., Leglise, P. C.; Claus, R., (1982). Relationship between fat and plasma

androstenone and plasma testosterone in fatty and lean young boars during growth and after hCG stimulation.

Acta Endocrinologica, 101, 119-128.

Bonneau, M.; Le Denmat, M.; Vaudelet, J. C.; Nunes, J. R. V.; Mortensen, A. B.; Mortensen, H. P. (1992).

Contributions of Fat Androstenone and Skatole to Boar Taint: I. Sensory Attributes of Fat and Pork Meat.

Livestock Production Science, 32, 63-80.

Bonneau, M.; Dufour, R.; Chouvet, C.; Roulet, C.; Meadus, W.; Squires, E. J. (1994). The effects of

immunization against luteinizing hormone-releasing hormone on performance, sexual development, and levels of

boar taint-related compounds in intact male pigs. Journal of Animal Science, 72, 14-20.

Bonneau, M. (1998). Use of Entire Males for Pig Meat in the European Union. Meat Science, 49 (Suppl 1),

S257-272.

Bonneau, M.; Walstra, P.; Claudi-Magnussen, C.; Kempster, A. J.; Tornberg, E.; Fischer, K.; Diestre, A.; Siret,

F.; Chevillon, P.; Claus, R.; Dijksterhuis, G.; Punter, P.; Matthews, K. R.; Agerhem, H.; Beague, M. P.; Oliver,

M. A.; Gispert, M.; Weiler, U.; von Seth, G.; Leask, H.; Furnols, M. F. I.; Homer, D. B.; Cook, G. L. (2000). An

international study on the importance of androstenone and skatole for boar taint: IV. Simulation studies on

consumer dissatisfaction with entire male pork and the effect of sorting carcasses on the slaughter line, main

conclusions and recommendations. Meat Science, 54, 285-295.

Bradley, B. J.; Carlson, J. R. (1974). A gas-liquid chromatographic procedure for the determination of indole and

3-methylindole in bovine plasma. Analytical Biochemistry, 59, 214-219.

Brooks, B. W. L.; Hastewood, G. A. D. (1961). The estimation of androst-16-en-3alfa-ol in human urine.

Journal of Biochemistry, 80, 488-496.

Brooks, R. I.; Pearson, A. M. (1986). Steroid-Hormone Pathways in the Pig, with Special Emphasis on Boar

Taint Odor – A Review. Journal of Animal Science, 62, 632-645.

Byrne, D. V.; Thamsborg, S. M.; Hansen, L. L. (2008). A sensory description of boar taint and the effects of

crude and dried chicory roots (Cichorium intybus L.) and inulin feeding in male and female pork. Meat Science,

79, 252-269.

Caraty, A.; Bonneau, M. (1986). Immunisation active du porc mâle contre la gonadolibérine: effets sur la

secrétion hormones gonadotropes et sur la teneur en 5a-androst-16ène-3-one du tissu adipeux. Comptes Rendus

des Séances de l’Académie des Sciences de Paris, Série D, Sciences Naturelles, 303, 673-676.

Chen, G.; Zamaratskaia, G.; Madej, E.; Lundström, K. (2006). Effect of hCG administration on the relationship

between testicular steroids and indolic compounds in fat and plasma in entire male pigs. Meat Science, 72, 339-

347.

52

Chen, G.; Zamaratskaia, G.; Andersson, H. K.; Lundström, K. (2007). Effects of raw potato starch and live

weight on fat and plasma skatole, indole and androstenone levels measured by different methods in entire male

pigs. Food Chemistry, 101, 439-448.

Claudi-Magnussen, C. (2006). The consumers‟ view/reaction. Acta Veterinaria Scandinavica, 48 (Suppl 1), S4.

Claus, R.; Hofmann, B.; Karg, H. (1971). Determination of 5-alpha-androst-16-en-3-one, a boar taint steroid in

pigs, with reference to relationships to testosterone. Journal of Animal Science, 33, 1293-1297.

Claus, R. (1974). Dosage radioimmunologique du 5-alpha-androst-16-en-3-one, steroide responable de l‟odeur

de verrat dans le tissu adipeux porcs. Comptes Rendus des Séances de l’Académie des Sciences Série D, Sciences

Naturelles, 278, 299-302.

Claus, R.; Hofmann, B. (1980). Oestrogens, compared to other steroids of testicular origin, in blood plasma of

boars. Acta Endocrinologica, 94, 404-411.

Claus, R.; Mahler, G.; Munster, E. (1988). Determination of the Boar Taint Steroid 5-Alpha-Androst-16-En-3-

One in Adipose-Tissue of Pigs with A Rapid Microtitre Plate Enzyme-Immunoassay (Mte). Archiv fűr

Lebensmittelhygiene, 39, 87-90.

Claus, R.; Dehnhard, M.; Herzog, A.; Bernal-Barragan, H.; Gimenez, T. (1993). Parallel measurements of indole

and skatole (3-methylindole) in faeces and blood plasma of pigs by HPLC. Livestock Production Science, 34,

115-126.

Claus, R.; Weiler, U.; Herzog, A. (1994). Physiological-Aspects of Androstenone and Skatole Formation in the

Boar – A Review with Experimental Data. Meat Science, 38, 289-305.

Claus, R.; Herbert, E.; Dehnhard, M. (1997). Comparative determination of the boar taint steroid androstenone in

pig adipose tissue by a rapid enzyme immunoassay and an HPLC-method. Archiv für Lebensmittelhygiene, 48,

25-48.

Claus, R.; Lacorn, M.; Ostertag, C. (2008). An improved microtitre enzyme immunoassay to measure the boar

taint steroid 5-alpha-androst-16-en-3-one in blood plasma of pigs. Meat Science, 80, 934-938.

De Brabander, H. F.; Verbeke, R. (1986). Quantitative determination of androstenone in pig adipose tissue.

Journal of Chromatography, 363, 293-302.

De Brabander, H. F.; Le Bizec, B.; Pinel, G.; Antignac, J. P., Verheyden, K.; Mortier, V.; Courtheyn, D.; Noppe,

K. (2007). Past, present and future of mass spectrometry in the analysis of banned substances in meat-producing

animals. Journal of Mass Spectrometry, 42, 983-998.

de Kock, H. L.; Heinze, P. H.; Potgieter, C. M.; Dijksterhuis, G. B.; Minnaar, A. (2001). Temporal aspects

related to the perception of skatole and androstenone, the major boar compounds. Meat Science, 54, 61-70.

de Roest, K.; Montanari, C.; Fowler, T.; Baltussen, W. (2009). Resource efficiency and economic implications

of alternatives to surgical castration without anaesthesia. Animal, 3, 1522-1531.

Deslandes, B.; Gariépy, C.; Houde, A. (2001). Review of microbiological and biochemical effects of skatole on

animal production. Livestock Production Science, 71, 193-200.

Desmoulin, B.; Bonneau, M.; Bourdon, D. (1974). Etude en bilan azoté et composition corporelle des porcs

mâles entiers ou castrés de race Large White. Journées de la Recherche Porcine en France, 6, 247-255.

Dijksterhuis, G. B.; Engel, B.; Walstra, P.; Furnols, M.; Agerhem, H.; Fisher, K.; Oliver, M. A.; Claudi-

Magnussen, C.; Siret, F.; Bqague, M. P.; Homer, D. B.; Bonneau, M. (2000). An international study on the

importance of androstenon and skatole for boar taint: II. Sensory evaluation by trained panels in seven European

countries. Meat Science, 54, 261-269.

Doran, E.; Whittington, F. M.; Wood, J. D.; McGivan, J. D. (2002). The relationship between adipose tissue

skatole levels, rates of hepatic microsomal skatole metabolism and hepatic cytochrome P450IIE1 expression in

two breeds of pig. Animal Science, 74, 461-468.

53

European Community (2001). Commission Directive 2001/93/EC. Official Journal of the European

Communities, L 316, 36-38.

European Community (2002). Commission Directive 2002/657/EC. Official Journal of the European

Communities, L 221, 8-36.

Flores-Valverde, A. M.; Hill, E. M. (2008). Methodology for Profiling the Steroid Metabolome in Animal

Tissues Using Ultraperformance Liquid Chromatography – Electrospray-Time-of-Flight Mass Spextrometry.

Analytical Chemistry, 80, 8771-8779.

Furnols, M. F. I.; Gispert, M.; Diestre, A.; Oliver, M. A. (2003). Acceptability of boar meat by consumers

depending on their age, gender, culinary habits, and sensitivity and appreciation of androstenone odour. Meat

Science, 64, 433-440.

Garcia-Regueiro, J. A.; Diaz, I. (1989). Evaluation of the contribution of skatole, indole, androstenone and

androstenols to boar-taint in back fat of pigs by HPLC and capillary gas chromatography (CGC). Meat Science,

25, 307-316.

Garcia-Regueiro, J. A.; Rius, M. A. (1998). Rapid determination of skatole and indole in pig back fat by normal-

phase liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 809, 246-251.

Gilbert, A. N.; Wysocki, C. J. (1987). The smell survey: Results. National Geographics, 172, 514-525.

Gower, D. B. (1972). 16-Unsaturated C19 steroids. A review of their chemistry, biochemistry and possible

physiological role. Journal of Steroid Biochemistry, 3, 45-103.

Hannson, K. E.; Lundström, K.; Fjelkner-Modig, S.; Persson, J. (1980). The importance of androstenone and

skatole for boar taint. Swedish Journal of Agricultural Research, 10, 167-173.

Hansen, L. L.; Mejer, H.; Thamsborg, S. M.; Byrne, D. V.; Roepstorff, A.; Karlsson, A. H.; Hansen-Møller, J.;

Jensen, M. T.; Tuomola, M. (2006). Influence of chicory roots (Cichorium intybus L.) on boar taint in entire

male and female pigs. Animal Science, 82, 359-368.

Hansen, L. L.; Stolzenbach, S.; Jensen, J. A.; Henckel, P.; Hansen-Møller, J.; Syriopoulos, K.; Byrne, D. V.

(2008). Effect of feeding fermentable fibre-rich feedstuffs on meat quality with emphasis on chemical and

sensory boar taint in entire male pigs and female pigs. Meat Science, 80, 1165-1173.

Hansen-Møller, J. (1992). Determination of Indolic Compounds in Pig Back Fat by Solid-Phase Extraction and

Gradient High-Performance Liquid-Chromatography with Special Emphasis on the Boar Taint Compound

Skatole. Journal of Chromatography A, 624, 479-490.

Hansen-Møller, J. (1994). Rapid High-Performance Liquid-Chromatography Method for Simultaneous

Determination of Androstenone, Skatole and Indole in Back Fat from Pigs. Journal of Chromatography B:

Biomedical Applications, 661, 219-230.

Hansen-Møller, J; Andresen, J. R. (1994). Boar Taint – Analytical Alternatives. Fleischwirtschaft, 74, 1005-

1009.

Hoste, M.; Baltussen, W. H. M.; Oosterkamp, E. B. (2009). Vleesafzet van biologische beren: Een opiniepeiling

in Duitsland en het Verenigd Koninkrijk. LEI Wageningen UR, Den Haag. Rapport 2009-064, oktober 2009.

Hu, Q.; Noll, R. J.; Li, H.; Makarov, A.; Hardman, M.; Cooks, R. G. (2005). The Orbitrap: a new mass

spectrometer. Journal of Mass Spectrometry, 40, 430-443.

Jarmoluk, L.; Martin, A. H.; Fredeen, H. T. (1970). Detection of Taint (Sex Odor) in Pork. Canadian Journal of

Animal Science, 50, 750-752.

Jensen, M. T.; Cox, R. P.; Jensen, B. B. (1995). Microbial-Production of Skatole in the Hind Gut of Pigs Given

Different Diets and Its Relation to Skatole Deposition in Backfat. Animal Science, 61, 293-304.

54

Johnson, L. A.; Clark, R. N. (1998). Flow sorting X- and Y-chromosome-bearing mammalian sperm: Activation

and pronuclear development of sorted bull, boar and ram sperm microinjected into hamster oocytes. Gamete

Research, 21, 335-343.

Kempster, A. J.; Lowe, D. B. (1993). Meat production with entire males. 44th

Annual meeting of the E.A.A.P, 16-

19 Augustus, Aarhus, Denemarken.

Kluivers-Poodt, M.; Hopster, H.; Spoolder, H. A. M. (2007). Verdoofd castreren in de varkenshouderij. Animal

Sciences Group, Wageningen UR, Rapport 73, oktober 2007.

Kohler, I.; Moens, Y.; Busato, A.; Blum, J.; Schatzmann, U. (1998). Inhalation anaesthesia for the castration of

piglets: CO2 compared to halothane. Zentralblatt fűr Veterinärmedizin Reihe A, 45, 625-633.

Lanthier, F.; Lou, Y.; Squires, E. J. (2007). Skatole metabolism in the intact prepubescent male pig: The

relationship between hepatic enzyme activity and skatole concentrations in plasma and fat. Livestock Science,

106, 145-153.

Le Denmat, M.; Hervo, N.; Vaudelet, J. C.; Bonneau, M. (1993). The effect of slaughter weight on fat

androstenone and skatole levels and on the assessment of boar taint in entire male pigs. In: Measurement and

prevention of boar taint in entire male pigs, Bonneau, M. (Ed.), INRA Editions, Parijs, Frankrijk, Colloques nr.

60.

Lundström, K.; Hansson, K. E.; Fjelkner-Modig, S.; Persson, J. (1980). Skatole - another contributor to boar

taint. Proceedings European Meat Research Workers, 26, 300-303.

Lundström, K.; Matthews, K. R.; Haugen, J. E. (2009). Pig meat quality from entire males. Animal, 3, 1497-

1507.

Makarov, A.; Denisov, E.; Kholomeev, A.; Balschun, W.; Lange, O.; Strupat, K.; Horning, S. (2006).

Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap / Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry, 78,

2113-2120.

Makarov, A.; Scigelova, M. (2010). Coupling Liquid Chromatography to Orbitrap massa spectrometry. Journal

of Chromatography A, 1217, 3938-3945.

Malmfors, B.; Lundström, K. (1983). Consumer reactions to boar meat - a review. Livestock Production Science,

10, 187-196.

Manns, J. G.; Robbins, S. R. (1997). Prevention of boar taint with a recombinant based GnRH vaccine. In: Boar

Taint in Entire Male Pigs, Bonneau, M.; Lundström, K.; Malmfors, B. (Eds.), EAAP Publication, 92, pp. 137-

140.

March, R. E. (1997). An introduction to quadrupole ion trap massa spectrometry. Journal of Mass Spectrometry,

32, 351-369.

Marx, G.; Horn, T.; Thielebein, J.; Knubel, B.; von Borell, E. (2003). Analysis of pain-related vocalization in

young pigs. Journal of Sound and Vibration, 266, 687-698.

Matthews, K. R.; Homer, D. B.; Thies, F.; Calder, P. C. (2000). Effect of whole linseed (Linum usitatissimum)

in the diet of finishing pigs on growth performance and on the quality and fatty acid composition of various

tissues. British Journal of Nutrition, 83, 637-643.

Meloen, R. H.; Turkstra, J. A.; Lankhof, H.; Puijk, W. C.; Schaaper, W. M. M.; Dijkstra, G.; Wensing, C. J. G.;

Oonk, R. B. (1994). Efficient immunocastration of male piglets by immunoneutralization of GnRH, using a new

GnRH-like peptide. Vaccine, 12, 741-746.

Mortensen, A. B.; Sørensen, S. E. (1984). Relationship between boar taint and skatole determination with a new

analysis method. In: Proceedings of 30th European Meeting Meat Research Workers, Bristol, UK, pp. 394-396.

Moss, B. W.; Hawe, S. M.; Walker, N. (1993). Sensory thresholds for skatole and indole. In: Measurement and

Prevention of Boar Taint in Entire Male Pigs, Bonneau, M. (Ed.), INRA Editions, Parijs, Frankrijk, pp. 63-68.

55

Nielen, M. W. F.; van Engelen, M. C.; Zuiderent, R.; Ramaker, R. (2007). Screening and confirmation criteria

for hormone residue analysis using liquid chromatography accurate mass time-of-flight, Fourier transform ion

cyclotron resonance and orbitrap mass spectrometry techniques. Analytica chimica acta, 586, 122-129.

Oskam, I. C.; Ropstad, E.; Berg, K. A.; Fredriksen, B.; Larsen, S.; Dahl, E.; Andresen, O. (2008). Testicular

germ cell development in relation to 5-alpha-androstenone levels in pubertal entire male pigs. Theriogenology,

69, 967-976.

Patterson, R. L. S. (1968). 5-androst-16-en-3-one, compound responsible for taint in boar fat. Journal of the

Science of Food and Agriculture, 19, 31-38.

Pedersen, B. (1998). Heritability of skatole in back fat. In: Skatole and boar taint, Jensen, W. K. (Ed.), Danish

Meat Research Institute, Roskilde, Denemarken, pp. 129-136.

Peleran, J. C.; Bories, G. F. (1985). Gas chromatographic determination and mass spectrometric confirmation of

traces of indole and 3-methylindole (skatole) in pig back fat. Journal of Chromatography A, 324, 469-474.

Plagge, J. G. (1988). Opfok- en mesterijresultaten van beren en borgen. Proefverslag P 1.24, Varkensproefbedrijf

“Noord- en Oost-Nederland”.

Prunier, A.; Bonneau, M.; von Borell, E. H.; Cinotti, S.; Gunn, M.; Fredriksen, B.; Giersing, M.; Morton, D. B.;

Tuyttens, F. A. M; Velarde, A. (2006). A review of the welfare consequences of surgical castration in piglets and

the evaluation of non-surgical methods. Animal welfare, 15, 277-289.

Rius, M. A.; Garcia-Regueiro, J. A. (2001). Skatole and indole concentrations in Longissimus dorsi and fat

samples of pigs. Meat Science, 59, 285-291.

Rius, M. A.; Hortos, M.; Garcia-Regueiro, J. A. (2005). Influence of volatile compounds on the development of

off-flavours in pig back fat samples classified with boar taint by a test panel. Meat Science, 71, 595-602.

Sole, M. A. R.; Regueiro, J. A. G. (2001). Role of 4-phenyl-3-buten-2-one in boar taint: Identification of new

compounds related to sensorial descriptors in pig fat. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 5303-

5309.

Squires, E. J. (1990). Studies on the Suitability of A Colorimetric Test for Androst-16-Ene Steroids in the

Submaxillary-Gland and Fat of Pigs As A Simple Chemical-Test for Boar Taint. Canadian Journal of Animal

Science, 70, 1029-1040.

Squires, E. J.; Gullett, E. A.; Fisher, K. R. S.; Partflow, G. D. (1991). Comparison of Androst-16-Ene Steroid-

Levels Determined by A Colorimetric Assay with Boar Taint Estimated by A Trained Sensory Panel. Journal of

Animal Science, 69, 1092-1100.

Squires, E. J.; Lou, Y. (1995). Levels of boar taint in purebred entire male pigs in Ontario. OAC Publication,

University of Guelph, Guelph, Canada.

Stolker, A. A. M.; Zuidema, T.; Nielen, M. W. F. (2007). Residue analysis of veterinary drugs and growth-

promoting agents. Trends in Analytical Chemistry, 26, 967-979.

Swartz, M. E. (2005). Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC): An Introduction.

http://chromatographyonline.findanalytichem.com/lcgc/data/articlestandard//lcgc/242005/164646/article.pdf (26-

05-2011).

Talou, T.; Bourrounet, B.; Gaset, A. (1993). Interest of multi gas sensors apparatus for quality control

applications: Odorimeter. 12ème Journées Internationales Huiles Essentielles, Digne, Frankrijk.

Talou, T.; Bourrounet, B.; Gaset, A. (1994). Interest of multigas sensors apparatus for quality control of essential

oils. 25th

International Symposium Essential Oils, Grasse, Frankrijk.

Thompson, R. H.; Pearson, A. M.; Banks, K. A. (1972). Identification of some C19-∆16

steroids contributing to

sex odor in pork. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 20, 185-189.

http://chromatographyonline.findanalytichem.com/lcgc/data/articlestandard/lcgc/242005/164646/article.pdf

56

Tielen, M. J. M. (1974). De frekwentie en de zoötechnische preventie van long- en leveraandoeningen bij

varkens. Proefschrift, Landbouwhogeschool, Wageningen, Nederland.

Tuomola, M.; Harpio, R.; Knuuttila, P.; Mikola, H.; Lövgren, T. (1997). Time-Resolved fluoroimmunoassay for

the measurement of androstenone in porcine serum and fat samples. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 45, 3529-3534.

Tuomola, M.; Hakala, M.; Manninen, P. (1998). Determination of androstenone in pig fat using packed column

supercritical fluid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 719, 25-30.

Tuomola, M; Harpio, R.; Wirta, E. R.; Lövgren, T. (2002). Monitoring androstenone levels in boars by direct

immunochemical analysis of serum samples. Meat Science, 61, 193-197.

Vanhaecke, L.; Verheyden, K.; Vanden Bussche, J.; Schoutsen, F.; De Brabander, H. F. (2009). UHPLC

Coupled with Fourier Transform Orbitrap for Residue Analysis. LC-GC Europe, 20, 364-374.

Van Sleuwen, M. (2007). Piglet anaesthetics: pros & cons. Pig Progress, 23, 24-25.

Vasquez, J. M.; Parrilla, I.; Roca, J.; Gil, M. A.; Cuello, C.; Vasquez, J. L.; Martinez, E. A. (2009). Sex-sorting

sperm by flow cytometry in pigs: Issues and perspectives. Theriogenology, 71, 80-88.

Verheyden, K.; Noppe, H.; Aluwé, M.; Millet, S.; Vanden Bussche, J. V.; De Brabander, H. F. (2007).

Development and validation of a method for simultaneous analysis of the boar taint compounds indole, skatole

and androstenone in pig fat using liquid chromatography-multiple mass spectrometry. Journal of

Chromatography A, 1174, 132-137.

Vestergaard, J. S.; Haugen, J. E.; Byrne, D. V. (2006). Application of an electronic nose for measurements of

boar taint in entire male pigs. Meat Science, 74, 564-577.

Vold, E. (1970). Fleischproduktionseigenschaften bei Ebern und Kastraten. IV. Organoleptische und

gaschromatografische Untersuchungen wasserdampfflüchtiger Stoffe des Rückenspeckes von Ebern. Meldinger

fra Norges Landbrukshøgskole, 49, 1-25.

von Borell, E.; Baumgartner, J.; Giersing, M.; Jaggin, N.; Prunier, A.; Tuyttens, F. A. M.; Edwards, S. A. (2009).

Animal welfare implications of surgical castration and its alternatives in pigs. Animal, 3, 1488-1496.

Walstra, P.; Buiting, G. A. J.; Mateman, G. (1997). Het mesten van beren: 1. Invloed van castratie en

voedermethode op groei, voederconversie en slachtkwaliteit. IVO-Rapport B-128.

Walstra, P.; Moermann, P. C. (1981). Ist es gerechtfertigt, Eber zu masten, un was sind die Perspektiven.

Tierzuchter, 33, 465.

Weiler, U.; Furnols, M. F. I.; Fisher, K.; Kemmer, H.; Oliver, M. A.; Gispert, M.; Dobrowolski, A.; Claus, R.

(2000). Influence of differences in sensitivity of Spanish and German consumers to perceive androstenon on the

acceptance of boar meat differing in skatole and androstenon concentrations. Meat Science, 54, 297-304.

White, R. G.; DeShazer, J. A.; Tressler, C. J.; Borcher, G. M.; Davey, S.; Waninge, A.; Parkhurst, A. M.;

Milanuk, M. J.; Clemens, E. T. (1995). Vocalization and physiological response of pigs during castration with or

without a local anesthetic. Journal of Animal Science, 73, 381-386.

Willoughby, R.; Sheehan, E.; Mitrovich, S. (2002). Is LC-MS right for you? In: A global view of LC-MS, 2nd

edition, Global View Publishing, Pittsburgh, Pennsylvania, USA, pp. 44-89.

Wilson, I. D.; Plumb, R.; Granger, J.; Major, H.; Williams, R.; Lenz, E. M. (2005). HPLC-MS-based methods

for the study of metabonomics. Journal of Chromatography B, 817, 67-76.

Wu, N.; Clausen, A. M. (2007). Fundamental and practical aspects of ultrahigh pressure liquid chromatography

for fast separation. Journal of Separation Sciences, 30, 1167-1182.

Wysocki C. J.; Beauchamp G. K. (1984). The ability to smell androstenone is genetically determined.

Proceedings of the Natural Academy of Sciences of the United States of America, 81, 4899-4902.

57

Xue, J. L.; Dial, G. D.; Holton, E. E.; Vickers, Z.; Squires, E. J.; Loy, Y. P.; Godbout, D.; Morel, N. (1996a).

Breed differences in boar taint: Relationship between tissue levels of boar taint compounds and sensory analysis

of taint. Journal of Animal Science, 74, 2170-2177.

Xue, J. L.; Dial, G. D.; Morrison, R. B. (1996b). Comparison of the accuracies of chemical and sensory test for

detecting taint in pork. Livestock Production Science, 46, 203-211.

Xue, J. L.; Dial, G. D. (1997). Raising intact male pigs for meat: Detecting and preventing boar taint. Swine

Health and Production, 5, 151-158.

Zamaratskaia, G.; Babol, J.; Andersson, H.; Lundström, K. (2004a). Plasma skatole and androstenone levels in

entire male pigs and relationship between boar taint compounds, sex steroids and thyroxine at various ages.

Livestock Production Science, 87, 91-98.

Zamaratskaia, G.; Babol, J.; Madej, A.; Squires, A. J.; Lundström, K. (2004b). Age-related Variation of Plasma

Concentrations of Skatole, Androstenone, Testosterone, Oestradiol-17β, Oestrone Sulphate,

Dehydroepiandrosterone Sulphate, Triiodothyronine and IGF-1 in Six Entire Male Pigs. Reproduction in

Domestic Animals, 39, 168-172.

Zamaratskaia, G.; Madej, A.; Babol, J.; Squires, E. J.; Lundström, K. (2005). Free oestrone in adipose tissue and

its relation to androstenone and skatole in entire male pigs. Reproduction in Domestic Animals, 40, 156-160.

OPTIMALISATIE VAN U-HPLC-MS/MS ANALYSE VOOR ...

Documents

Transcript of OPTIMALISATIE VAN U-HPLC-MS/MS ANALYSE VOOR ...