PERSONAL INFORMATION
NAMA :________________________________________________
_
NIM :___________________________________________
______
KELAS :___________________________________________
______
KELOMPOK :________________________________________________
_
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 2
NO. HP
:_________________________________________________
ALAMAT :___________________________________________
______
__________________________________________
TATA TERTIB PRAKTIKUM MIKROBIOLOGIUntuk menjaga keamanan
1. Praktikan harus telah mengenakan jas lab saat memasuki
laboratorium dan bekerja dengan peralatan di
laboratorium untuk menghindari kontaminasi dan terkena
khemikalia.
2. Dilarang keras makan, merokok dan minum di
laboratorium
3. Sebelum dan sesudah bekerja, meja praktikum
dibersihkan dengan desinfektan
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 3
4. Praktikan berambut panjang harus mengikat rambutnya
sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu kerja dan
menghindari dari hal-hal yang tidak diinginkan.
5. Pengambilan kultur cair atau suspensi dan khemikal harus
menggunakan pipet dengan bantuan filler atau menggunakan
mikropipet.
6. Dilarang membuang biakan sisa atau habis pakai dan
pewarna sisa disembarang tempat. Bahan tersebut harus
dibuang di tempat yang telah disediakan oleh asisten.
7. Laporkan segera jika terjadi kecelakaan seperti
kebakaran, biakan tumpah ada yang menelan bahan
kimia, atau biakan kepada asisten
8. Jika menggunakan jarum inokulum, ujung jarum dibakar
sampai memijar sesudah dan sebelum bekerja menggunakan
alat ini
9. Sebelum meninggalkan laboratorium disarankan untuk
mencuci tangan dengan seksama.
Untuk kelancaran praktikum
1. Praktikan diwajibkan memakai jas laboratorium sebelum
memasuki laboratorium dan dilepas di luar laboratorium.
2. Praktikan wajib memakai sepatu pada saat praktikum.
3. Praktikan dilarang berbicara yang tidak perlu dan
membuat gaduh
4. Memakai pakaian yang sopan pada saat praktikum (baju
berkrah untuk laki-laki)
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 4
5. Praktikan yang datang terlambat lebih dari 10 menit
mengganti di akhir acara.
6. Praktikan yang datang terlambat lebih dari 20 menit
maka wajib inhal.
7. Kuis akan dilaksanakan pada awal acara sebelum memulai
praktikum untuk mengetahui sejauh mana kompetensi yang
dicapai.
8. Inhal kuis akan diadakan satu kali dan nilai yang
diambil adalah nilai terbaik.
9. Bagi praktikan yang akan berpindah jadwal praktikum
harus seizin coordinator praktikum mikrodas dengan
menyerahkan surat pengantar paling lambat dua hari
berikutnya.
10. Praktikan yang tidak hadir praktikum (absen), maka
disarankan ikut inhal praktikum, di mana harus membayar
untuk mengganti biaya praktikum dan tenaga asisten
11. Praktikan akan dinilai keterampilannya selama praktikum
oleh asisten
12. Praktikan yang tidak mengikuti asistensi tanpa
keterangan tidak mendapatkan nilai pretest, tapi jika
ada izin tertulis maka dapat mengikuti pretest susulan.
13. Praktikan yang tidak mengikuti pengamatan harus
mengikuti pengamatan susulan.
14. Laporan harus dibawa saat masuk pada praktikum sebagai
syarat masuk.
15. Praktikan yang tidak membawa laporan karena tertinggal,
tetap diizinkan mengikuti praktikum tetapi harus
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 5
mengambil laporan yang tertinggal pada hari itu juga dan
menyerahkkannya ke asisten.
16. Aturan-aturan / tata tertib yang belum tercantum akan
diputuskan kemudian.
JUDUL PRAKTIKUM
1. MEDIA DAN STERILISASI
PJ : Rahmania
2. ISOLASI MIKROORGANISME
PJ : Amining, Chaerul, Vero
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 6
3. ENUMERASI
PJ : Rahmania, Rizky, Tia
4. PENGARUH LINGKUNGAN
PJ : Amining
5. KOLOM WINOGRADSKY
PJ : Chaerul
6. PEMBUATAN YOGURT
PJ : Vero
7. PEMBUATAN NATA
PJ : Vero
8. HIDROLISIS PATI DAN SKIM
PJ : Rizky
9. PEWARNAAN GRAM
PJ : Tia
JUDUL 1
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 7
MEDIA DAN STERILISASII. Tujuan :
1. Dapat membuat media pertumbuhan Nutrient Agar (NA),
Nutrient Broth (NB) dan Potato Dextrose Agar (PDA).
2. Dapat melakukan sterilisasi alat dan bahan menggunakan
autoklaf.
3. Melakukan pengamatan terhadap media yang sudah dibuat.
II. DASAR TEORI
A. MEDIA
Pengertian dan Fungsi
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang
terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang
diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya.
Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa
molekulmolekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen
sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat
mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi
komposisi media pertumbuhannya.
Bahan-bahan media pertumbuhan
1. Bahan dasar
air (H2O) sebagai pelarut
agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat
media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada
umumnya dan mencair pada suhu 45oC.
gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar.
Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 8
kolagen. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba
yang mampu menguraikannya dibanding agar.
Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat.
Fungsinya juga sebagai pemadat media. Silica gel khusus
digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme
autotrof obligat.
2. Nutrisi atau zat makanan
Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk
metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O,
N, P, unsur mikro seperti Fe, Mg dan unsur pelikan/trace
element.
Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa
senyawa organic atau anorganik esuai dengan sifat
mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon
organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan
asam organik.
Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa
bernitrogen lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan
sumber N anorganik seperti urea.
Vitamin-vitamin.
3. Bahan tambahan
Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke
medium dengan tujuan tertentu, misalnya phenol red
(indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator
perubahan pH akibat produksi asam organik hasil
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 9
metabolisme. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat
pertumbuhan mikroba nontarget/ kontaminan.
4. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media
Agar, agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan,
granula atau bubuk dan terbuat dari beberapa jenis
rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai pemadat (gelling)
yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse
untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin,
agar tidak akan larut. Untuk melarutkannya harus diasuk
dan dipanasi, pencairan dan pemadatan berkali-kali atau
sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan
agar, terutama pada pH yang asam
Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani
atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein,
lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya
tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara
memperolehnya.
Meat extract. Meat extract mengandung basa organik terbuat
dari otak, limpa, plasenta dan daging sapi.
Yeast extract. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti
atau pembuat alcohol. Yeast extract mengandung asam
amino yang lengkap & vitamin (B complex).
Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya
pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis
karbohidrat yang umumnya digunkan dalam amilum, glukosa,
fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll. Konsentrasi
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 10
yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-
1%.
Macam-Macam Media Pertumbuhan
1. Medium berdasarkan sifat fisik
Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15%
sehingga setelah dingin media menjadi padat.
Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar
0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat,
tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan
supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh
media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika
tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB
(Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk
cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika
media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah
hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan
difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi
anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme
nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata
diseluruh media.
Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar,
contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).
2. Medium berdasarkan komposisi
Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya
diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya
Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 11
Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian
komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato
Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak
kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat
mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa
penyusunnya.
Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan
komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan
biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya,
misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar,
Pancreatic Extract.
3. Medium berdasarkan tujuan
Media untuk isolasi. Media ini mengandung semua senyawa
esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth,
Blood Agar.
Media selektif/penghambat. Media yang selain mengandung
nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media
tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan
merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan.
Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah
Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan
menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth yang
ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang
toleran terhadap garam.
Media diperkaya (enrichment). Media diperkaya adalah media
yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 12
dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum,
kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif
untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam
media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana
untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen
kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar,
dll.
Media untuk peremajaan kultur. Media umum atau spesifik
yang digunakan untuk peremajaan kultur
Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik. Media
ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis
metabolism suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate
medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan
menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.
Media untuk karakterisasi bakteri. Media yang digunakan
untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba.
Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan
adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth,
Lactose Broth, Arginine Agar.
Media diferensial. Media ini bertujuan untuk
mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar
karakter spesifik yang ditunjukkan pada media
diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu
memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran
koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni.
B. STERILISASI
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 13
Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti membebaskan
tiap benda atau substansi dari semua kehidupan dalam bentuk
apapun. Untuk tujuan mikrobiologi dalam usaha mendapatkan
keadaan steril, mikroorganisme dapat dimatikan setempat (in
situ) oleh panas, gas-gas sperti formaldehyde,
etilenoksida, atau betapriolakton oleh bermacam-macam
larutan kimia, dan oleh sinar gamma. Mikrooganisme juga
dapat disingkirkan secara mekanik melalui sentrifugasi
kecepatan tinggi atau dengan filtrasi.
1. Sterilisasi secara fisik.
Selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan
berubah atau terurai akibat temperature tinggi dan tekanan
tinggi, selama itu sterilisasi secara fisik dapat
dilakukan. Cara sterilisasi ini dapat dilakukan dengan
menggunakan udara panas atau uap air panas dengan tekanan
tinggi.
Dengan udara panas, digunakan alat yang dinamakan
“bejana ruang panas” (oven) dengan temperature di dalamnya
antara 170-180ºC. Waktu yang digunakan selama 2 jam. Cara
ini umum digunakan untuk mensterilkan peralatan gelas
(tabung, labu, botol, dsb).
Sterilisasi dengan uap-air panas dan tekanan tinggi,
merupakan cara yang paling banyak digunakan, misalnya
dengan penggunaan alat yang sudah dikenal dengan nama
“autoklaf”. Bejana ini mempunyai temperature uap 121ºC
dengan tekanan 15lbs.
2. Sterilisasi secara kimia
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 14
Senyawa kimia yang banyak digunakan sebagai
desinfektan antara lain larutan CuSO4, AgNO3, HgCl2, ZnO dan
sebagainya serta larutan alcohol dan campurannya. Beberapa
larutan garam seperti NaCl (9%), KCl (11%), dan KNO3 (10%)
dapat dipergunakan untuk membunuh mikroba karena tekanan
osmotiknya, yaitu dengan jalan dehidrasi pada substrat.
Sedangkan asam kuat atau basa kuat dapat pula digunakan
karena bersifat menghidrolisis sel mikroba.
Larutan KMnO4 (1%), dan HCl (1,1%) ternyata merupakan
dseinfektan yang kuat karena dapat mengoksidasi substrat.
Sedang yang paling banyak digunakan adalah larutan HgCl2
(0,1%). Hanya sayangnya senyawa ini sangat beracun dan
sifatnya korosif, serta dapat merusak jaringan inang, dan
mengendapkan protein. Juga larutan garam Cu (dari CuSO4)
merupakan senyawa yang paling banyak digunakan sebagai
algisida (pembasmi alga). Khlor dan senyawa khlor lainnya
banyak dipergunakan sebagai desinfektan terutama pada
tempat penyimpanan air. Khlor mempunyai daya membunuh
mikroba dalam dua cara, yaitu:
a). Secara oksidasi (On)
b). Khlorinasi langsung terhadap protein sel
Prinsip cara kerja autoklaf Seperti yang telah dijelaskan sebagian pada bab
pengenalan alat, autoklaf adalah alat untuk memsterilkan
berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi
(2 atm) dan suhu 1210C. Untuk cara kerja penggunaan
autoklaf telah disampaikan di depan. Suhu dan tekanan
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 15
tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang
disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk
membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk
mesterilkan media digunakan suhu 1210C dan tekanan 15
lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan
suhu 1210C atau 249,8 0F adalah karena air mendidih pada
suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan
0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air
mendidih pada suhu 1000C, sedangkan untuk autoklaf yang
diletakkan di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi
maka air akan memdididh pada suhu 1210C. Ingat kejadian ini
hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak
pada ketinggian tertentu, maka pengaturan tekanan perlu
disetting ulang. Misalnya autoklaf diletakkan pada
ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20
psi supaya tercapai suhu 1210C untuk mendidihkan air. Semua
bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C
dan tekanan 15 psi selama 15 menit.
Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf
lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk
mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara
dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara
ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada
saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai., maka proses
sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur.
Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 16
dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi.
Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi.
Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan
sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat
termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus
stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara
komersial dalam bentuk spore strip. Kertas spore strip ini
dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah proses
sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media tetap
bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik.
Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan
autoklaf adalah :
Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin,
antibiotik, dan enzim
Paelarut organik, seperti fenol
Buffer engan kandungan detergen, seperti SDS
Untuk mencegah terjadinya presipitasi, pencoklatan (media
menjadi coklat) dan hancurnya substrat dapat dilakukan
pencegahan sbb :
Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone)
atau senyawa fosfat
Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino
(peptone) atau senyawa garam mineral lain.
Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar
Media yang memiliki pH > 7,5 jangan disterilkan dengan
autoklaf
Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6,0
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 17
Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum ¾ dari total
volumenya, sisa ruang dibirkan kosong. Jika mensterilkan
media 1L yang ditampung pada Erlenmeyer 2L maka sterilisasi
diatur dengan waktu 30 menit.
Saran-saran kerja aseptis :
1. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam
tabung/cawan/erlenmeyer sebaiknya bagian mulut (bagian
yang memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan
api terlebih dahulu.
2. Pinset, batang L, dll dapat disemprot dengan alkohol
terlebih dahulu lalu dibakar.
3. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus
ditunggu dingin dahulu atau dapat ditempelkan tutup
cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas
yang terjadi.
4. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi
steril didekatkan ke bagian api.
5. Jika kerja di Safety Cabinet tidak perlu memakai
pembakar bunsen tetapi jika di luar Safety Cabinet
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 18
Gambar 13. Prinsip Kerja Autoklaf
maka semakin banyak sumber api maka semakin terjamin
kondisi aseptisnya
III. ALAT DAN BAHANa. Alat
No Nama Jumlah1 Cawan petri 42 Tabung reaksi 63 Tabung ulir 14 Erlenmeyer 15 Gelas ukur 16 Pengaduk 17 Bunsen 18 Autoklaf 19 Magnetic stirrer 110 Rak tabung reaksi 111 Gelas beker 112 Pipet tetes 4
b. Bahan
No Nama Jumlah1 Serbuk NA Secukupnya2 Serbuk NB Secukupnya3 Serbuk PDA Secukupnya4 Alumunium foil Secukupnya5 Kapas Secukupnya6 Aquades Secukupnya7 Karet gelang Secukupnya8 Karet label Secukupnya9 Alcohol 70% Secukupnya10 Korek api Secukupnya11 Kertas pembungkus Secukupnya12 Plastic tahan panas Secukupnya13 Tissue Secukupnya
IV. CARA KERJAa. Pembuatan Nutrient Agar dan Nutrient Broth
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 19
Pembuatan Nutrient Agar1. Menimbang NA bubuk sebanyak 3,5 gr menggunakan
neraca analitis2. Melarutkan bubuk NA dengan akuades sampai hampir
memenuhi gelas beker besar3. Menghomogenkan larutan NA dengan menggunakan
magnetic stirrer4. Memindahkan larutan NA ke dalam beberapa Erlenmeyer
kemudian menutupnya dengan kapas dan alumunium foil5. Memasukkan Erlenmeyer tersebut ke dalam plastic
tahan panas dan diikat dengan karet gelang6. Mensterilkan media dengan autoklaf selama ½ jam.
Pembuatan Nutrient Broth
1. Menimbang NB bubuk sebanyak 7gr menggunakan neraca analitis
2. Melarutkan bubuk NB dengan akuades sampai hampir memenuhi gelas beker besar
3. Memindahkan larutan NB ke dalam beberapa Erlenmeyer kemudian menutupnya dengan kapas dan alumunium foil
4. Memasukkan Erlenmeyer tersebut ke dalam plastic tahan panas dan diikat dengan karet gelang
5. Mensterilkan media dengan autoklaf selama ½ jam
b. Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)
1. Menimbang PDA bubuk sebanyak 4 gr menggunakan neraca analitis
2. Melarutkan bubuk PDA dengan akuades sampai hampirmemenuhi gelas beker besar
3. Menghomogenkan larutan PDA dengan menggunakan magnetic stirrer
4. Memindahkan larutan PDA ke dalam beberapa Erlenmeyer kemudian menutupnya dengan kapas dan alumunium foil
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 20
5. Memasukkan Erlenmeyer tersebut ke dalam plastic tahan panas dan diikat dengan karet gelang
6. Mensterilkan media dengan autoklaf selama ½ jam.
c. Sterilisasi Alat
1. Menyiapkan alat dan bahan yang digunakan untuk
membuat media
2. Membungkus cawan petri dengan kertas buram lalu
memasukkan ke dalam plastic diikat dan diikat dengan
karet gelang
3. Menutup mulut tabung reaksi dengan kaps dan
alumunium foil serta diikat dengan karet gelang.
4. Semua alat-alat tersebut dimasukkan ke dalam plastic
tahan panas
5. Memasukkan ke dalam autoklaf dengan penataan yang
rapi
6. Mensterilkan alat dengan autoklaf selama 1 jam
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 21
7. Mengeluarkan alat dari autoklaf setelah suhu turun
ditandai dengan bunyi alarm.
d. Sterilisasi Bahan
1. Semua media NA, NB dan PDA dimasukkan dalam
Erlenmeyer dan disumbat dengan kapas, ditutup dengan
alumunium foil dan diikat dengan karet gelang.
2. Erlenmeyer dimasukkan dalam plastic tahan panas
3. Erlenmeyer dimasukkan ke dalam autoklaf dan ditata
rapi
4. Sterilisasi bahan di dalam autoklaf selama ½ jam
dengan prosedur kerja seperti sterilisasi alat.
e. Pengamatan media
Setelah 5 hari dilakukan pengamatan media. Pengamatan
dilakukan dengan tujuan untuk mengamati keadaan media
apakah rusak atau tidak dan terjadi kontaminasi atau
tidak. Mencatat hasill pengamatan ke dalam tabel data
pengamatan.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 22
VI. KESIMPULAN
VII. DAFTAR PUSTAKA
VIII. LAMPIRAN
SURAKARTA, ………………….
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 28
ASISTEN PRAKTIKAN
(……….……………) (……….……………)
JUDUL IIISOLASI MIKROORGANISME
I. TUJUAN:
1. Dapat mengisolasi untuk mendapatkan biakan murni dari
suatu campuran dengan menggunakan cawan gores
(penggoresan)
2. Mengamati dan membandingkan bakteri yang timbul dari
hasil isolasi
3. Mengetahui cara melakukan isolasi dengan teknik cawam
goresII. DASAR TEORI
Populasi mikroorganisme yang ada di alam sekitar kita
ini ssangatlah besar dan cukup kompleks. Beratus spesies
mikroba menguasai setiap bagian tubuh kita. Mereka terdapat
dalam jumlah yang cukup basar. Sebagai contoh, sekali kita
bersin dapat mnebarkan beribu- ribu mikroorganisme. Satu
gram tinja dapat mengandung jutaan bakteri. Alam di sekitar
kita, baik itu tanah, air, maupunudara juga dihuni oleh
kumpulan mikroorganisme.Penelitian yang layak mengenai
mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik
untuk memisahkan populasi campuran yang rumit ini, atau
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 29
yang biasanya dikenal dengan istilah biakan campuran,
menjadi spsies yang berbeda- beda yang bikenal dengan
istilah biakan murni. Biakan murni in teerdiri dari satu
populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk
(Pelczar, 1986).Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air,
tanah, udara, suubstrat yang berupa bahan pangan, tanaman
dan hewan. Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri,
khamir, kapng dan sebagainya. Populasi dari mikroba yang
ada di linkungan ini sangatlah beraneka ragam sehinga dalam
mengisolasi diperlukan beberapa tahap penanaman sehingga
berhasil diperoleh koloni yang tunggal. Koloni yang tunggal
ini kemudian yang akan diperbanyak untuk suatu tujuan
penelitian misalnya untuk menngisolasi DNA mikroba yang
dapat mendeteksi mikroba yang telah resisten terhadap suatu
antibiotik. Atau untuk mengetahui mikroba yang dipakai
untuk bioremediasi holokarbon (Ferdiaz, 1992).Pemindahan bakteri dari medium lama ke medium yang
baru atau yang dikenal dengan istilah inokulasi bakteri ini
memerluakn banyak ketelitian. Terlebih dahulu kita harus
mengusahakan agar semua alat- alat yang akan digunakan
untuk pengerjaan medium dan pengerjaan inokulasi benar-
benar steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya
kkontaminasi, yaitu masuknya mikrooba lain yang tidak
diinginkan sehingga biakan yang tumbuh di dalam medium
adalah benar- benar biakan murni (Dwidjoseputro, 1990).Di dalam keadaaan yang sebenarnya dapat dikatakan
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 30
bahwa tidak ada bakteri yang hidup secara tersendiri
terlepas dari spesies yang lainnya. Kerap kali bakteri
patogen kedapatan bersama- sama dengan bakteri saprob.
Untuk menyendirikan suatu spesies dikenal beberapa cara,
yaitu (Dwidjoseputro, 1990) :1. Degan pengenceran
Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister pada tahun
1865. Ia berhasil memelihara Streptococcus lactis
dalampiraan murni yang diisolasi dari sampel susu Yang
sudah masam.
Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran
bermacam- macam spesies diencerkan dalam suatu tabung
yang tersendiri. Dari hasil pengenceran ini kemudian di
ambil kira- kira 1 mL untuk diencerkan lebih lanjut.
Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 mL
untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan
besar kita akan mendapatkan beberapa koloni yang akan
tumbuh dalam mdium tersebut, akan tetapi mungkin juga
kita hanya akan memperoleh satu koloni saja. Dalam hal
yang demikian ini dapat kita jadikan piaraan murni. Jika
kita belum yakin, Bahwa koloni tunggal yang kita peroleh
tersebut merupakan koloni yang murni, maka kita dapat
mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini
sebagai sampel.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 31
Gambar 14 Metode pengenceran2. Dengan penuangan
Robert Koch (1843- 1905) mempunyai metode yang lain,
yaitu dengan mengambil sedikti sampel campuran bakteri
yang mudah diencerkan, dan sampel ini kemudian di sebar
di dalam suatu medium yang terbuat dari kaldu dan
gelatin encer. Dengan demikian dia memperoleh suatu
piaraan adukan. Setelah medium tersebut mengental maka
selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni- koloni
yang masing- masing dapat dianggap murni. Dengan
mengulang pekerjaan di atas, maka akhirnya akan
diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 32
Gambar 15. Metode TuangAda beberapa metode yang biasanya dilakukan untuk menanam
biakan di dalam medium diantaranya adalah (Lay, 1994) :1. Metode cawan gores
Metode ini mempunyai dua keuntungan yaitu menghemat
bahan dan waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik
diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya
diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang
dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan
terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam
kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak
memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya
untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme
menjafi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan
inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan
sel- sel yang digores
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 33
Gambar 15. Bentuk Alur Goresan pada Cawan Petri2. Metode cawan tuang
Cara lain untuk mempeeroleh biakan koloni murni dari
populasi campuran mikroorganisme ialah dengan
mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang telah
dicairkan dan didinginkan yang kemudian di cawankan.
Karena konsentrasi sel- sel mikroba di dalam eksperimen
pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka
pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga
sekurang- kurangnyya satu di antara cawan – cawan
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 34
tersebut mengandung koloni- koloni terpisah baik di atas
permukaan maupun di dalam agar. Metode ini memboroskan
waktu dan bahan namun tidak memerlukan keterampilan yang
terlalu tinggi.
Proses pemisahan/pemurnian dari mikroorganisme lain
perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis,
misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan
suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam
mikroorganisme saja. Teknik tersebut dikenal dengan
Isolasai Mikroba. Terdapat berbagai cara mengisolasi
mikroba, yaitu (Admin, 2008) :1) Isolasi pada agar cawanPrinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah
mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu
spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya.
Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan
tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal.
Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar
cawan, yaitu: Metode gores kuadran, dan metode agar
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 35
cawantuang.Metode gores kuadran. Bila metode ini
dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya
mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari
satusel.
Metode agar tuang. Berbeda dengan metode gores kuadran,
cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan
didinginkan (50oC), yang kemudian dicawankan. Pengenceran
tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir
mengandung koloni-koloni yang terpisah di atas
permukaan/di dalamcawan.2) Isolasi pada medium cairMetode isolasi pada medium cair dilakukan bila
mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium
padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair.
Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan
beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran
peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar.3) Isolasi sel tunggal
Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi
sel mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat
diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel
mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran
sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan
menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun
micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis.
III. ALAT DAN BAHAN
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 36
1. Alat
- cawan petri
– Bunsen
- Enkas
- Ikubator
- Ose
- Mikropipet
- Autoklaf
- Tabung reaksi
- Erlenmeyer
2. Bahan
Biakan Escherichia coli, Biakan Bacillus subtilis, Biakan
Aspergillus niger, medium nutrient agar padat, Medium NB
cair, Medium PDNA, Aquadest, Spiritus, alkohol, swab dan
korek api.
IV. CARA KERJAA.Isolasi mikroorganisme dari substrak cair
- Cawan petri yang berisi medium NA diberi label
masing- masing sesuai perlakuan. Lalu memasukkannya
kedalam enkas atau didekatkan Bunsen bersama dengan
Biakan Escherichia coli, Bacillus subtilis.
- Sebelum melakukan pengerjaan dalam enkas atau di
dekat bunsen, terlebih dahulu mensterilkan tangan
dengan mengunakan alkohol 70%.- Mengambil masing- masing biakan bakteri dengan
menggunakan mikropipet sebanyak 0,1 mL, lalu
diratakan pada permukaan medium dengan menggunakan
batang L atau digoyang halus.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 37
- Melidahapikan mulut/ pinggir cawan petri dengan
maksud agar bakteri yang melekat mati- Kemudian membungkus cawan petri dengan menggunakan
kertas lalu menginkubasi ke dalam inkubator selama
24- 48 jam. Mengamti koloni yang tumbuh.
B. Isolasi Bakteri dari Ekstrak Padat pada Agar miring- 4 buah tabung reaksi yang masinng- masing berisi 2
medium NA dan 2 Medium PDA agar miring disiapkan dan
dimasukkan ke dalam enkas atau diletakkan di dekat
Bunsen yang menyala, setelah diberi label.- Sebelum melakukan pengerjaan inokulasi, terlebih
dahulu mensterilkan tangan dengan mengunakan alkohol
70%.- Dengan menguunakan ose bulat, mengambil biakan
bakteri dan masing- masing digoreskan secara zig-
zag pada medium agar miring lalu di tututp- Membungkus tabung reaksi dengan kertas dan
menginkubasinya selama 24- 72 jam dan mengamati
masing- masing perbedaannya
C. Isolasi Bakteri dari Ekstrak Padat pada Agar cawan- 4 buah cawan petri yang masinng- masing berisi 2
medium NA dan 2 Medium PDA disiapkan dan dimasukkan
ke dalam enkas atau diletakkan di dekat Bunsen yang
menyala, setelah diberi label.- Sebelum melakukan pengerjaan inokulasi, terlebih
dahulu mensterilkan tangan dengan mengunakan alkohol
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 38
70%.- Dengan menguunakan ose bulat, mengambil biakan
bakteri dan masing- masing digoreskan secara zig-
zag pada medium agar cawan lalu di tututp
V. ANALISIS DATA
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 39
VIII. LAMPIRAN
SURAKARTA, ………………….
ASISTEN PRAKTIKAN
(……….……………) (……….……………)
JUDUL III
ENUMERASI
I. TUJUAN
1. Melakukan percobaan perhitungan jumlah sel melalui
metode Colony Unit Form (CFU)
2. Mengetahui enumerasi dengan cara pengenceran
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 41
3. Menghitung jumlah sel bakteri pada air sampel
4. Membandingkan jumlah sel bakteri pda setiap air sampel
5. Mengetahui air yang paling bersih dan yang paling
buruk dari air sampel.
II. DASAR TEORI
Penghitungan jumlah bakteri dengan metode Plate Count
(hitungan cawan)
Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa
setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh
menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media
pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi,
jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan
atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi
tersebut.
Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel
mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu
cenderung membentuk kelompok atau berantai. Berdasarkan hal
tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml.
koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh
menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang
ingin diketahui jumlah bakterinya.
Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai
berikut “
- Satu koloni dihitung 1 koloni.
- Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.
- Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 42
- Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan
dihitung 2 koloni.
- Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah
luas cawan) tidah dihitung.
- Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan
dihitung 1 koloni.
Cara menghitung sel relatif / CFU’s per ml
CFU’s / ml = jumlah koloni X faktor pengenceran
Misal : penanaman dilakukan dari tabung pengenceran 10 -6
dengan
metode Spread Plate dan Pour Plate.
Prosedur perhitungan jumlah bakteri dengan metode Plate Count.
Lakukan preparasi suspensi kepada sampel terlebih dahulu
(swab, maserasi dan rinse) (jika perlu).
Masukkan sampel ke tabung berisi 9 ml akuades untuk
pengenceran pertama, selanjutnya diencerkan sampai
tingkat pengenceran (misalnya sampai 10-8) tertentu.
Dari 3 pengenceran terakhir diplating (ditanam) ke media
NA (Nutrien Agar) atau PCA (Plate Count Agar) sebanyak dua
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 43
kali tiap pengenceran (duplo). Plating dapat secara
Spread Plate atau Pour Plate. Jika secara Spread Plate, dapat
digunakan batang L atau glass beads.
Inkubasi pada suhu 30º C selama 1-2 x 24 jam.
Setelah tumbuh, koloni dihitung dengan persyaratan yang
telah diuraikan di depan. Penghitungan koloni pada cawan
sebaiknya dibuat transek atau dibagi-bagi jika koloni
yang tumbuh terlalu banyak. Transek dibuat dengan
spidol/marker di bagian bawah cawan petri. Pola transek
dapat dibuat bervariasi, tergantung kebutuhan.
Penghitungan akan lebih mudah bila memakai Coloni Counter.
III. ALAT DAN BAHANa. Alat
Alat JumlahBunsen 1Gelas ukur 1Tabung reaksi 8Rak tabung reaksi 1Pipet mikro 1Cawan petri 4
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 44
Segitiga perata 1Incubator 1Lemari pendingin 1
b. Bahan
Bahan JumlahAlcohol 70% SecukupnyaKertas buram 4 lembarMedia NA 4 buah cawan petriKorek Api SecukupnyaKertas label SecukupnyaAir sampel 1 ml
IV. CARA KERJA1. Mensterilkan tempat praktikum dan kedua tangan
praktikan dengan alcohol 70%2. Menyiapkan air sampel yang digunakan serta media NA3. Mengencerkan air sampel sampai tingkat konsentrasi
mencapai 10-6 dan 10-8 dengan menggunakan aquades.4. Mengambil media NA yang telah disiapkan, kemudian
mendekatkan dengan bunsen dan diputar-putar.5. Mengambil 1 ml air sample dengan pipet mikro, kemudian
meneteskan ke dalam media NA dalam kondisi dekat dengan api bunsen
6. Meratakan dengan menggunakan segitiga perata yangs ebelumnya dimasukkan ke dalam alcohol 70% agar steril.
7. Melakukan hal yang sama untuk pengenceran 10-8,8. Membungkus cawan petri dengan menggunakan kertas buram
dan diberi label pada pembungkus kertas.9. Masukkan ke dalam incubator selama 24 jam10.Kemudian memasukkan ke dalam lemari pendingin dan
melakukan pengamatan menghitung jumlah koloni bakteri selama 4 hari berturut-turut.
11.Bandingkan sample terbaik dan terburuk.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 45
VII. DAFTAR PUSTAKA
VIII. LAMPIRAN
SURAKARTA, ………………….
ASISTEN PRAKTIKAN
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 47
(……….……………) (……….……………)
JUDUL IV
PENGARUH LINGKUNGAN TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROORGANISME
I. TUJUAN
1. Mengetahui pengaruh suhu terhadap pertumbuhan
mikroorganisme
2. Mengetahui pengaruh pH terhadap pertumbuhan
mikroorganisme
3. Mengetahui pengaruh pemberian antbiotik terhadap
pertumbuhan mikroorganisme
4. Membandingkan pertumbuhan koloni pada lingkungan yang
berbeda
II. DASAR TEORI
Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme
Berdasarkan suhu optimum untuk pertumbuhan maka dapat
dikelompokan menjadi 3 yaitu: 1. psikrofilik(0-200C),
2. mesofilik Mesofilik (20-300C),
3. termofilik (50-1000C).
Suhu merupakan faktor lingkungan yang sangat menentukan
kehidupan mikroorganisme, pengaruh suhu berhubungan dengan
aktivitas enzim. Suhu rendah menyebabkan aktiivtas enzim
menurun dan jika suhu terlalu tinggi dapat mendenaturasi
protein enzim.
Cara Kerja :
8x2 tabung yang berisi Nutrient Broth untuk
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 48
suhu inkubasi 50C, 250C, 370C, dan 500C dan
mikroorganisma yang berbeda (E.coli dan
Bacillus sp.) diberi label . Setelah diinokulasi
dengan bekteri yang berbeda, diinkubasi sesuai
suhu yang tertera
setelah ditumbuhkan selama 48 jam,
bandingkan derajat kekeruhannya.
Pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorgansime
pH berpengaruh terhadap sel dengan mempengaruhi
metabolisme, pada umumnya bakteri tumbuh dengan baik pada
pH netral (7,0). Berdasarkan nilai pH yang dibutuhkan untuk
kehidupannya dikenal 3 kelompok mikroorganisme yaitu :
1. Acidofilik,
2. Mesofilik/Neutrofilik dan
3. Basofilik
Cara Kerja :
Buatlah tabung reaksi berisi NB dan atur pH-nya (pH 3, 7
dan 9) masing-masing 2 tabung untuk tiap nilai pH
Labeli dengan nama bakteri yang akan diinokulasikan
Inokulasi tiap tabung dengan Bacillus sp dan E.coli lalu
diinkubasi pada suhu 370C selama 48 jam
Amati perbedaan kekeruhan pada tiap nilai pH
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 49
Pengaruh Antiobiotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme.
Zat antimikroba adalah senyawa yang dapat membunuh atau
menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Zat antimikroba dapat
bersifat membunuh mikroorganisme (microbicidal) atau menghambat
pertumbuhan mikroorganisme (microbiostatic). Disinfektan yaitu
suatu senyawa kimia yang dapat menekan pertumbuhan
mikroorganisme pada permukaan benda mati seperti meja,
lantai dan pisau bedah. Adapun antiseptik adalah senyawa
kimia yang digunakan untuk menekan pertumbuhan
mikroorganisme pada jaringan tubuh, misalnya kulit.
Efisiensi dan efektivitas disinfektan dipengaruhi oleh
beberapa faktor yaitu:
Konsentrasi
Waktu terpapar
Jenis mikroba
Kondisi lingkungan: temperatur, pH dan jenis tempat
mikroba hidup
Pengertian dan Jenis Antibiotik
Antibiotik adalah bahan yang dihasilkan oleh mikroorganisme
atau sintetis yang dalam jumlah kecil mampu menekan
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 50
menghambat atau membunuh mikroorganisme lainnya. Antibiotik
memiliki spektrum aktivitas antibiosis yang beragam.
Antibiotik dikelompokkan berdasarkan gugus aktifnya, misal
antibiotic macrolide, antimikroba peptida. Adapun
penamaannya biasanya berdasarkan gugus kimiawinya ataupun
mikroorganisma produsernya, misalnya:
ragam antibakteria:
Penicillin dan cephalosporin
Erythromycine
Sulfa drugs
Trimethoprim dan sulfamethoxazole
Polymyxin B
Quinolone
Tetracycline
Antifungi :
Nystatin
Azoles
Mekanisme kerja antibiotik antara lain : Menghambat dsintesis dinding sel Merusak permeabilitas membran sel. Menghambat sintesis RNA (proses transkripsi) Menghambat sintesis protein (proses translasi). Menghambat replikasi DNA.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 51
Prosedur difusi-kertas cakram-agar yang distandardisasikan
(metode Kirby-Bauer) merupakan cara untuk menentukan
sensitivitas antibiotik untuk bakteri. Sensitivitas suatu
bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter zona
hambat yang terbentuk. Semakin besar diameternya maka
semakin terhambat pertumbuhannya, sehingga diperlukan
standar acuan untuk menentukan apakah bakteri itu resisten
atau peka terhadap suatu antibiotik.
Faktor yang mempengaruhi metode Kirby-Bauer :
- Konsentrasi mikroba uji
- Konsentrasi antibiotik yang terdapat dalam cakram
- Jenis antibiotik.
- pH medium
Cara kerja pengujian antibiotik dengan metode Kirby-Bauer :
Celupkan cotton bud (cotton swab) dalam biakan bakteri
kemudian tekan kapas ke sisi tabung agar air tiris
Ulaskan pada seluruh permukaan cawan Mueller-Hinton Agar
secara merata
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 52
Biarkan cawan selama 5 menit
Kertas cakram dicelupkan dalam larutan antibiotik dengan
konsentrasi tertentu.
Angkat, biarkan sejenak agar tiris, selanjutnya letakkan
kertas cakram pada permukaan agar.
Kertas cakram ditekan menggunakan pinset supaya menempel
sempurna di permukaan agar.
Inkubasi pada suhu 37 0C selama 24-48 jam.
Ukur diameter zona hambat (mm) kemudian bandingkan
dengan table sensitivitas antibiotik.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 53
Cara menginterpretasikan :
Ukur diameter zona hambat (zona jernih). Misal didapatkan
zona hambat suatu bakteri berdiameter 26 mm untuk
Eryhtromycin.
Maka interpretasinya adalah bakteri tersebut peka terhadap
antibiotic Eryhtromycin.
Resistent : tahan
Intermediate : medium
Susceptible : peka
III. ALAT DAN BAHAN
Alat
Nama JumlahCawan petri 7Jarum ose 1Bunsen 1Incubator 1 Kulkas 1Bahan
Nama JumlahMedium NA kondisi asam,
basa dan netral
Secukupn
yaBakteri Bacillus sp Secukupn
yaBakteri E.Coli Secukupn
yaKertas buram Secukupn
yaKertas label Secukupn
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 54
yaKorek api Secukupn
yaAntibiotic Secukupn
yaAlcohol 70% Secukupn
ya
IV. CARA KERJA
A. Pengaruh Suhu
1. Menyiapkan 3 cawan petri yang berisi medium NA
dengan PH netral
2. Menginokulasi bakteri Bacillus sp pada masing-masing
media
3. Membungkus media dengan kertas buram
4. Melabeli masing-masing cawan petri sesuai dengan
suhu
5. Menempatkan masing-masing cawan petri tsb pada suhu
yang berbeda yaitu suhu panas, dingin dan kamar
6. Mengamati pertumbuhan bakteri setiap hari selama 3
hari
7. Mencatat dan menggambarkan hasil pada laporan
sementara
B. Pengaruh PH
1. Menyiapkan 3 cawan petri yang berisi medium NA
dengan pH netral (7), pH asam (4) dan pH basa (9)
2. Menginokulasi bakteri Bacillus sp pada masing-
masing media
3. Membungkus media dengan kertas buram
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 55
4. Melabeli masing-masing cawan petri sesuai dengan
pH
5. Menempatkan masing-masing cawan petri tsb pada
suhu kamar
6. Mengamati pertumbuhan bakteri setiap hari selama
3 hari
7. Mencatat dan menggambarkan hasil pada laporan
sementara
C. Pengaruh antibiotic
1. Menyiapkan 1 cawan petri yang berisi medium NA
dengan PH netral
2. Menginokulasi bakteri Bacillus sp pada masing-
masing media
3. Menempatkan antibiotic pada goresan bakteri
4. Membungkus media dengan kertas buram
5. Melabeli masing-masing cawan petri sesuai dengan
suhu
6. Menempatkan masing-masing cawan petri tsb pada
suhu yang berbeda yaitu suhu panas, dingin dan kamar
7. Mengamati pertumbuhan bakteri setiap hari selama
3 hari
8. Mencatat dan menggambarkan hasil pada laporan
sementara
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 56
VIII. LAMPIRAN
SURAKARTA, ………………….
ASISTEN PRAKTIKAN
(……….……………) (……….……………)
JUDUL V
KOLOM WINOGRADSKY
I. TUJUAN
1. Mengamati dan menjelaskan perubahan warna dan
stratifikasi pada kolom winogradsky.
2. Mengetahui jenis-jenis mikroorganisme yang mampu hidup
di setiap lapisan winogradsky.
II. DASAR TEORI
Salah satu kelompok makhluk hidup di atas yang
penting dalam pembuatan produk primer dan berperan dalam
decomposer senyawa organic dan anorganik adalah bakteri.
Bakteri yang biasa ditemukan dalam lingkungan akuatik
dimana dalam kondisi an aerobic dan cahaya adalah bakteri
fotosintetik, ungu dan hijau. Bakteri fotosintetik mampu
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 59
mendekomposisi senyawa senyawa organic dengan bantuan sinar
matahari menjadi O2, H2 dan senyawa organic sederhana di
mana senyawa organic ini mampu menyediakan sumber karbon
untuk flora sekunder dari bakteri pereduksi sulfur. Bakteri
pereduksi sulfur selama respirasi anaerob akan menghasilkan
H2S dan CasO4 yang disuplementasi. H2S yang terbentuk
merupakan sumber tenaga pereduksi bagi bakteri fotosintetik
sulfur jika tumbuh dalam kondisi ada cahaya. Salah satu
cara yang dikembangkan dalam mempelajari bakteri
fotosintetik adalah kolom Winogradsky (19880. Kolom ini
merupakan kultur yang terdiri bahan tanaman dan lapisan-
lapisan lumpur yang digenangi air.
Penerapan hasil metaboliisme tersebut berhasil
dibuktikan oleh Winogradsky dengan kolom yang terdiri dari
beberapa zone dengan habitat dan lingkungan yang
terkendali.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 60
Zona aerobik
Zona mikroaerobikTumbuh bakteri non sulfur fotosintetik (pirang)
Tumbuh bakteri non sulfuranaerob
Zona anaerobi
Pengaturan ke dalam bentuk sampel ke dalam wadah
yang bersih di campur air dan disegel. Proses seleksi alam
terhadap pertumbuhan mikroorganisme fotosintetik selalu
stabil dan didalamnya dengan sedikit O2 sampai terdapat
banyak racun. Kebanyakan dari berbagai macam spesies
terjadi pola tingkat level yang berbeda pada kolom.
Interaksi dan hubungan timbale balik antara spesies yang
berbeda mungkin dapat dilihat. Gambaran kuadran O2 dalam
suatu percobaan Winogradsky yaitu:
Agar mikrobia dapat bertahan hidup selama masa
pembiakan maka harus ditaruh dalam lingkungan yang berair.
Hal ini disebabkan karena kebanyakan bakteri akan segera
mati bila tidak tersedia kelembaban yang memadai.
Berdasasrkan keberadaannya dalam tanah, Winogradsky
membaginya dalam dua kelompok besar yaitu: (1) mikrobia
otokton (autochtonous), yakni mikrobia setempat atau pribumi
(indigenous) pada tanah-tanah tertentu dan bersifat endemik,
contohnya Azospirilium halopraeferen yang selalu ditemukan
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 61
aerob
fakultatif
-2H akseptor selain O2
O2 dan-2H akseptor selain O2
anaerobDaerah terbatas O2
2H
Daerah pengurangan O2
Daerah bebasO2
di tanah salin, (2) mikrobia zymogen, yaitu mikrobia yang
pertumbuhannya dipengaruhi oleh adanya perlakuan khusus
seperti penambahan pupuk, bahan organic dan pengelolaan
tanah. Selain itu dikenal juga (3) mikrobia transien, yaitu
mikrobia yang keberadaannya di dalam tanah bersifat sebagai
penetap sementara. Mikrobia transien umumnya merupakan
mikrobia yang diintrodusir ke dalam tanah baik sengaja
maupun tidak disengaja. Mikrobia ini kemungkinan juga
bertahan untuk sementara waktu di dalam tanah
III. BAHAN DAN ALAT
Bahan:
1. Pasir laut 2. Pasir sungai3. Lumpur 4. Air laut5. Air Sumur6. Alumunium foil7. Kuning Telur8. CaCO3
9. Kertas Koran10. Kertas labelAlat:1. Kolom Winogradsky2. Gelas Beker3. Penggaris4. Pengaduk5. Timbangan analitik
IV. CARA KERJA
1. Menyiapkan dua buah kolom Winogradsky.
2. Tabung pertama diisi dengan campuran pasir pantai dengan
2 gram CaCO3 dan satu kuning telur.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 62
3. Tabung kedua diisi dengan campuran lumpur sungai dengan
2 gram CaCO3 dan satu kuning telur.
4. Campuran tersebut dimasukkan dan dipadatkan hingga tidak
ada rongga udara dengan tinggi 5 cm.
5. Kertas koran dipotong-potong dibasahi dengan air hingga
menjadi bubur koran dan dimasukkan ke dalam tabung, lalu
dipadatkan hingga tidak ada rongga udara dengan tinggi 3
cm.
6. Pasir laut dimasukkan ke dalam tabung dengan hati-hati
melalui dinding tabung hingga tingginya 12 cm.
7. Tabung ditutup dengan rapat menggunakan alumunium foil.
8. Tabung ditempatkan pada tempat yang cukup mendapat sinar
matahari.
9. Diamati setiap seminggu selama 3 minggu.
V. ANALISIS DATA
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 63
VII. DAFTAR PUSTAKA
VIII. LAMPIRAN
SURAKARTA, ………………….
ASISTEN PRAKTIKAN
(……….……………) (……….……………)
JUDUL VI
PEMBUATAN NATA
I. TUJUAN
1. Mengetahui cara pembuatan nata dari berbagai substrat
2. Mengukur tebal nata pada berbagai macam substrat
3. Membandingkan tebal nata pada berbagai macam substrat
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 65
II. DASAR TEORI
Nata merupakan makanan pencuci mulut (desert). Nata
adalah makanan yang banyak mengandung serat, mengandung
selulosa kadar tinggi yang bermanfaat bagi kesehatan dalam
membantupencernaan.Kadungan kalori yang rendah pada Nata merupakan
pertimbangan yang tepat produk Nata sebagai makan diet.
Dari segi penampilannya makanan ini memiliki nilai estetika
yang tinggi, penampilan warna putih agak bening, tekstur
kenyal, aroma segar. Dengan penampilan tersebut maka nata
sebagai makanan desert memiliki daya tarik yang tinggi.
Dari segi ekonomi produksi nata menjanjikan nilai tambah.
Pembuatan nata yang diperkaya dengan vitamin dan mineral
akan mempertinggi nilai gizi dari produk ini.Nata dibentuk oleh spesies bakteri asam asetat pada
permukaan cairan yang mengandung gula, sari buah, atau
ekstrak tanaman lain. Beberapa spesies yang termasuk
bakteri asam asetat dapat membentuk selulosa, namun selama
ini yang paling banyak dipelajari adalah Acetobacter xylinum.
Bakteri Acetobacter xylinum termasuk genus Acetobacter. Bakteri
Acetobacter xylinum bersifat Gram negatip, aerob, berbentuk
batang pendek atau kokus.Pemanfaatan limbah pengolahan kelapa berupa air
kelapa merupakan cara mengoptimalkan pemanfaatan buah
kelapa. Limbah air kelapa cukup baik digunakan untuk
substrat pembuatan Nata de Coco. Dalam air kelapa terdapat
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 66
berbagai nutrisi yang bisa dimanfaatkan bakteri penghasil
Nata de Coco. Nutrisi yang terkandung dalam air kelapa
antara lain : gula sukrosa 1,28%, sumber mineral yang
beragam antara lain Mg2+ 3,54 gr/l, serta adanya faktor
pendukung pertumbuhan (growth promoting factor) merupakan
senyawa yang mampu meningkatkan pertumbuhan bakteri
penghasil nata (Acetobacter xylinum).Adanya gula sukrosa dalam air kelapa akan
dimanfaatkan oleh Acetobacter xylinum sebagai sumber energi,
maupun sumber karbon untuk membentuk senyawa metabolit
diantaranya adalah selulosa yang membentuk Nata. Senyawa
peningkat pertumbuhan mikroba (growth promoting factor)
akan meningkatkan pertumbuhan mikroba, sedangkan adanya
mineral dalam substrat akan membantu meningkatkan aktifitas
enzim kinase dalam metabolisme di dalam sel Acetobacter xylinum
untuk menghasilkan selulosa.
Pemeliharaan Kultur Murni Acetobacter xylinum
Biakan atau kultur murni Acetobacter xylinum yang
diperoleh ditumbuhkan pada media Hassid Barker. Koleksi
kultur dapat dalam bentuk kering beku dalam ampul, maupun
dalam bentuk goresan dalam agar miring (slant agar).
Koleksi kultur dalam bentuk kering beku dalam ampul dapat
bertahan hidup bertahun-tahun tanpa peremajaan. Sedangkan
koleksi kultur dalam agar miring perlu peremajaan setiap 2-
3 bulan. Kebanyakan koleksi kultur pemeliharaannya dengan
cara peremajaan dilakukan pada media agar miring.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 67
Pemeliharaan koleksi kultur yang dimiliki dapat
dilakukan dengan cara: pembuatan media Hassid Barker Agar
(HBA) dalam tabung reaksi dan peremajaan kultur setiap 2-3
bulan. Komposisi media HBA adalah sebagai berikut: sukrosa
10%, (NH4)2SO4 0,6 g/L, K2HPO4 5,0 g/L, ekstrak khamir 2,5
g/L 2 % asam asetat glasial, agar difco 15 g/L . Media HBA
dimasukkan kedalam tabung reaksi dan disterilkan dalam
autoclave 121 oC, 2 atm, selama 15 menit. Media dalam
tabung reaksi masih panas diletakkan mring hingga membeku
untuk menghasilkan media agar miring. Peremajaan dapat
dilakukan dengan cara menggoreskan 1 ose kultur kedalam
media agar miring yang telah dipersiapkan. Kutur baru
diinkubasi pada suhu kamar, selama 2-3 hari. Kultur akan
tumbuh pada media HBA miring dengan bentuk sesuai alur
goresan. Kultur yang terlah diremajakan siap untuk kultur
kerja, dan sebagian disimpan untuk kultur simpan atau
kultur stok (Stock Culture).Sustrat adalah media pertumbuhan bakteri Acetobacter
xylinum, bentuk cair yang didalamnya mengandung nutrisi
yang diperlukan untuk pertumbuhan Acetobacter xylinum, untuk
menghasilkan Nata. Cara penyiapan substrat untuk pembuatan
Nata dengan bahan baku air kelapa atau sari buah yang lain
ádalah sebagai berikut; air kelapa atau sari buah yang lain
disaring dengan menggunakan kain saring bersih. Ke dalam
substrat ditambahkan sukrosa (gula pasir) sebanyak 10%
(b/v). Gula ditambahkan sambil dipanaskan, diaduk hingga
homogen. Urea (sebanyak 5 gram urea untuk setiap 1 liter
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 68
substrat bergula yang disiapkan) ditambahkan dan diaduk
sambil didihkan. Substrat ini didinginkan, kemudian
ditambah asam acetat glacial (asam cuka ) sebanyak 2% atau
asam cuka dapur 25% (16 ml asam asetat untuk setiap 1 liter
air kelapa). Substrat disterilkan dengan cara dimasukkan
dalam outoclave pada suhu 121 oC, tekanan 2 atm, selama 15
menit (atau didihkan selama 15 menit).Penyiapan Starter
Starter adalah bibit Acetobacter xylinum yang telah
ditumbuhkan dalam substrat pertumbuhan kultur tersebut
sehingga populasi bakteri Acetobacter xylinum mencapai
karapatan optimal untuk proses pembuatan nata, yaitu 1 x
109 sel/ml. Biasanya kerapatan ini akan dicapai pada
pertumbuhan kultur tersebut dalam susbtrat selama 48 jam (2
hari).
Penyiapan starter adalah sebagai berikut: substrat
disterilkan dengan outoclave atau dengan cara didihkan
selama 15 menit. Setelah dingin kira-kira suhu 40 oC,
sebanyak 300 ml dimasukkan ke dalam botol steril volume 500
ml. Substrat dalam botol steril diinokulasi (ditanami bibit
bakteri Acetobacter xylinum) sebanyak 2 ose (kira-kira 2 pentol
korek api), bibit Acetobacter xylinum. Substrat digojog,
sebaiknya menggunakan shaker dengan kecepatan 140 rpm
(secara manual digojog setiap 2-4 jam). Starter ditumbuhkan
selama 2 hari, pada suhu kamar.Fermentasi
Fermentasi adalah suatu proses pengubahan senyawa yang
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 69
terkandung di dalam substrat oleh mikroba (kulture)
misalkan senyawa gula menjadi bentuk lain (misalkan
selulosa/Nata ), baik merupakan proses pemecahan maupun
proses pembentukan dalam situasi aerob maupun anaerob. Jadi
proses fermentasi bisa terjadi proses katabolisme maupun
proses anabolisme.
Fermentasi substrat air kelapa yang telah dipersiapkan
sebelumnya prosesnya sebagai berikut; substrat air kelapa
disterilkan dengan menggunakan outoclave atau dengan cara
didihkan selama 15 menit. Substrat didinginkan hingga suhu
40oC. Substrat dimasukkan pada nampan atau baskom steril
dengan permukaan yang lebar, dengan kedalaman substrat
kira-kira 5 cm. Substrat diinokulasi dengan menggunakan
starter atau bibit sebanyak 10 % (v/v). Substrat kemudian
diaduk rata, ditutup dengan menggunakan kain kasa. Nampan
diinkubasi atau diperam dengan cara diletakan pada tempat
yang bersih, terhindar dari debu, ditutup dengan
menggunakan kain bersih untuk menghindari terjadinya
kontaminasi. Inkubasi dilakukan selama 10 – 15 hari, pada
suhu kamar. Pada tahap fermentasi ini tidak boleh digojok.
Pada umur 10-15 hari nata dapat dipanen.
III. ALAT DAN BAHAN
Bahan:
1. Biakan Acetobacter xilinum 2. Gula pasir3. Urea
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 70
4. Substrat (air kelapa, air siwalan, air jambu, air nanas,ampas tahu, air leri, aloe vera, dll)
5. Air6. Karet gelang7. Kertas label8. Asam cuka9. Ekastrak tauge
Alat:
1. Kompor2. Panic+tutup3. Pengaduk4. Toples+tutup5. Saringan6. Wadah7. Blender8. Pisau 9. Gelas ukur10. Selotipe besar
IV. CARA KERJA
1. Substrat buah masing-masing bahan dikupas, dibersihkan,
dipotong-potong dan dimasukkan dalam blender lalu
dihaluskan kemudian ditambahkan sedikit air agar cepat
halus.
2. Substrat disaring sehingga diperoleh substrat yang tidak
berampas.
3. Substrat masing-masing bahan diambil 500 ml dimasukkan
ke dalam panci kemudian direbus dan ditambahkan 50 gr
gula pasir 50 ml sari tauge.
4. Substrat yang telah mendidih dituang dalam wadah.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 71
5. Setelah dingin ditambahkan cuka 15 ml dan ditambahkan 50
ml Acetobacter xilinum sambil diaduk-aduk.
6. Memasukkan campuran tersebut ke dalam toples dan ditutup
rapat dengan penutup dan selotip.
7. Disimpan + 1 bulan pada suhu 20-25◦C.
8. Setelah 1 bulan diamati dan diukur tebal nata yang
terbentuk
V. ANALISIS DATA
VI. KESIMPULAN
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 72
VII. DAFTAR PUSTAKA
VIII. LAMPIRAN
SURAKARTA, ………………….
ASISTEN PRAKTIKAN
(……….……………) (……….……………)
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 73
JUDUL VIII
PEMBUATAN YOGURT
I. TUJUAN
1. Mengetahui cara pembuatan yoghurt berbahan dasar susu
skim dengan campuran bakteri Lactobacillus bulgaricus dan
Streptococcus thermophylus.
2. Menguji kualitas produk yoghurt dengan uji
organoleptik.
3. Mengetahui tingkat keasaman (pH) yoghurt selama masa
penyimpanan serta mengetahui kadar asam laktat selama
masa penyimpanan.
II. DASAR TEORI
Yogurt Berbahan Dasar Susu
Susu dapat dimanfaatkan oleh mikroorganisme sebagai
substrat pertumbuhannya. Aktivitas mikroorganisme
menyebabkan terjadinya perubahan pada susu baik yang
diinginkan maupun yang tidak diinginkan. Yoghurt merupakan
salah satu produk olahan susu dengan memanfaatkan aktivitas
mikroorganisme yang dikenal dengan istilah fermentasi.
Tujuan dari proses fermentasi adalah memperpanjang umur
simpan, penganekragaman produk, meningkatkan nilai gizi dan
daya cerna, dan menghasilkan kartakteristik rasa, aroma,
dan tekstur yang diinginkan serta menguntungkan bagi
kesehatan. Dalam industri persusuan, susu yang difermentasi
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 74
dihasilkan dengan cara menginokulasikan susu yang telah
dipasteurisasi dengan suatu biakan mikroorganisme yang
diketahui, yang kadang-kadang disebut starter kultur yang
dapat diandalkan untuk menghasilkan fermentasi yang
dikehendaki sehingga menjamin dihasilkannya produk yang
baik dan seragam (Pelczar dan Chan, 1988).
Yogurt merupakan salah satu produk olahan susu
fermentasi yang memiliki tingkat nutrisi yang tinggi. Hasil
olahan susu ini berbentuk seperti bubur yang kental, dan
biasanya dibuat dari bahan dasar susu segar maupun susu
skim yang tanpa lemak. Starter yang digunakan adalah
bakteri asam laktat Lactobacillus bulgaricus dan
Streptococcus thermophillus dengan perbandingan yang sama.
Karena digunakan bakteri laktat yang mampu memproduksi asam
laktat, maka produk yang terbentuk berupa susu yang
menggumpal dengan rasa masam dan mempunyai cita rasa yang
khas.
Yoghurt sangat bermanfaat bagi kesehatan diantaranya
dapat menurunkan kadar kolesterol darah, menjaga kesehatan
lambung dan mencegah penyakit kanker saluran pencernaan.
Manfaat yang terakhir ini dikarenakan yoghurt mengandung
bakteri hidup sebagai probiotik dari makanan yang
menguntungkan bagi mikroflora dalam saluran pencernaan.
Selain itu mengkonsumsi yoghurt membolehkan seseorang yang
menderita kelainan lactoce intolerence seolah mampu
mengkonsumsi susu (McLean, 1993). Lactoce intolerance
adalah suatu kelainan dari seseorang yang akan diare setiap
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 75
minum susu dikarenakan memiliki kekurangan laktosa dalam
usus kecilnya. Laktosa adalah enzim yang tersebar pada
laktosa disakarida di dalam glukosa dan galaktose. Jika
terdapat laktosa tidak dikenal atau tidak diketahui, maka
laktosa yang dicerna dalam usus tetap tinggal pada usus dan
sebagai hasil dari osmosis, air bergerak ke usus dan
menyebabkan diare. Pada yoghurt laktosanya telah
difermentasikan ke dalam bentuk asam laktat di mana setiap
orang memiliki enzim untuk mencernanya (Ginting dan
Elgustri, 2005).
Gambar 16. Yogurt siap konsumsi.
Berdasarkan komposisinya, yogurt dibedakan menjadi
yogurt berkadar lemak penuh dengan kandungan lemak diatas
3%, yogurt berkadar lemak medium dengan kandungan lemak
0,5-3%, dan yogurt berkadar lemak rendah bila kandungan
lemaknya kurang dari 0,5% (Noorkomalasari, 2009).
Berdasar metode pembuatannya, jenis yogurt dibagi
menjadi dua, yaitu set yogurt dan stirred yogurt. Bila fermentasi
atau inkubasi susu dilakukan dalam kemasan kecil sehingga
gumpalan susu yang terbentuk tetap utuh dan tidak berubah
sewaktu didinginkan atau sampai siap dikonsumsi disebut set
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 76
yogurt. Sedangkan stirred yogurt adalah adalah yogurt yang
difermentasi dalam kemasan besar, ketika dikemas dalam
wadah yang lebih kecil gumpalan susu akan pecah sebelum
pengemasan atau pendinginan selesai.
Berdasarkan cita rasanya, yogurt dibedakan menjadi
yogurt alami atau sederhana dan yogurt buah. Yogurt alami
yaitu yogurt yang tidak ditambah cita rasa sehingga asamnya
tajam. Sedangkan yogurt buah adalah yogurt yang ditambah
dengan komponen cita rasa lain spserti buah-buahan, sari
buah, flavor sintetik dan zat pewarna.
Pada pembuatan yoghurt dilakukan proses fermentasi
dengan memanfaatkan bakteri asam laktat misalnya dari
golongan Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcuc thermophilus.
Streptococcus thermophilus berkembang biak lebih cepat dan
menghasilkan baik asam maupun CO2. Asam dan CO2 yang
dihasilkan tersebut kemudian merangsang pertumbuhan dari
Lactobacillus bulgaricus. Di sisi lain, aktivitas proteolitik
dari Lactobacillus bulgaricus memproduksi peptida penstimulasi
dan asam amino untuk dapat dipakai oleh Sreptococcus
thermophilus. Mikroorganisma ini sepenuhnya bertanggung jawab
atas pembentukan tekstur dan rasa yoghurt (Goff, 2003).
Temperatur memegang peranan penting bagi pertumbuhan
bakteri. Dalam pengembangbiakannya dengan cara membelah
diri, bakteri memerlukan temperatur dan keadaan lingkungan
tertentu sehingga daur hidupnya dapat terus berjalan.
Menurut Eckles (1980) pengaruh temperatur terhadap
mikroorganisma dapat digolongkan 3 bagian yaitu temperature
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 77
rendah yaitu di bawah 10°C, biasanya pertumbuhan
mikroorganisma menjadi lambat pada temperatur ini.
Temperatur sedang yaitu 10 – 43°C. Diantara susu ini akan
didapati suhu optimum bagi organisme secara mayoritas.
Temperatur tinggi yaitu di atas 43°C. Kebanyakan
mikroorganisma mati pada temperatur sekitar dan di atas
60°C.
III. CARA KERJA
Pembuatan Yogurt
Pembuatan yogurt dengan menggunakan dua jenis starter
bakteri yaitu: Lactobacillus bulgaricus dan Streptococus
thermophyllus. Masing-masing starter bakteri akan
diujicobakan pada bahan dasar susu yang berbeda,
diantaranya: susu sapi segar, susu skim, susu full krim,
dan susu kambing. Langkah-langkah pembuatan yogurt mengacu
metode yang dilakukan oleh Ginting (2005) yaitu:
(1) Persiapan bahan dasar susu
Siapkan bahan-bahan dasar susu, dan bahan tambahan
berupa: gula, perisa buah, dan penstabil berupa
gelatin. Susu yang berupa susu segar dilakukan
pasteurisasi selama 30 menit dengan sushu 60-70 °C
agar lebih kental atau lebih pekat, sedangkan pada susu
skim dapat dilarutkan dengan sedikit air dengan
perbandingan susu dan air sebesar 1 : 20. Sedangkan
pada susu kental manis bisa ditambahkan susu skim agar
lebih pekat.
(2) Pembuatan Starter
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 78
Siapkan inokulum berupa Lactobacillus bulgaricus dan
Streptococus thermophyllus yang masing-masing dibiakkan dalam
media susu secara terpisah dan inkubasi selama 18 jam,
kemudian dicampur dengan perbandingan 1: 1 ketika akan
digunakan.
(3) Pembuatan yogurt.
Bahan dasar susu sebelum diinokulasikan dengan starter
harus dipanaskan selama 30 menit pada suhu 85°C, hal
ini bertujuan untuk menghilangkan bakteri lain yang
hidup dalam susu agar tidak mengganggu pertumbuhan
bakteri asam laktat, selain itu juga menguapkan kadar
air dalam susu agar lebih kental. Setelah
dipasteurisasi, starter ditambahkan sebanyak 2- 5% dari
bahan dasar susu yang digunakan. Inkubasi atau
fermentasi yogurt pada suhu 37°C selama 15 jam dalam
keadaan tertutup rapat, setelah 15 jam keluarkan dari
ikubator dan simpan dalam lemari pendingin. Selama
inkubasi, susu akan mengalami penggumpalan disebabkan
karena penurunan pH akibat dari aktivitas bakteri
asam laktat. Selama masa inkubasi juga akan terjadi
perubahan flavor karena terbentuk asam laktat, asetal
dehid, asam asetat dan diasetil.
(4) Penyimpanan starter
Starter atau bibit yogurt terdiri dari biakan bakteri
Lactobacillus bulgaricus dan Streptoccus thermophillus. Pembuatan
bibit untuk yogurt dilakukan secara bertahap. Pertama,
kedua kultur bakteri tersebut dibiakkan dalam susu
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 79
secara terpisah. Untuk mempertahankan ketersediaan
masing-masing bibit harus dipindahkan ke dalam medium
susu yang baru secara berkala atau kultur tersebut
dikeringbekukan.
(5) Pengamatan kualitas yogurt.
Setelah diikubasi, akan terbentuk gumpalan asam susu
yang disebut yogurt. Dari masing-masing jenis bahan
dasar susu untuk yogurt, masing-masing diuji bagaimana
warna, tekstur, rasa (uji organoleptik), dan uji
mikrobiologi (mengetahui aktivitas bakteri pada level
temperature tertentu).
IV. ALAT DAN BAHANa. BAHAN
· Susu sapi segar sebanyak satu liter· Biakan murni bakteri Lactobacillus bulgaricus danStreptococcus thermophillus.
b. Alat· Panci email· Kompor atau alat pemanas lainnya· pH meter atau kerta pH· Panci penangas· Erlenmeyer 500 ml· Thermometer· Pengaduk kaca· Gelas ukur· Kertas alumunium foil
IX. ANALISIS DATA
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 80
XI. DAFTAR PUSTAKA
XII. LAMPIRAN
SURAKARTA, ………………….
ASISTEN PRAKTIKAN
(……….……………) (……….……………)
JUDUL IX
HIDROLISIS PATI DAN SKIM
I. TUJUAN
1. Mengetahui indeks amilolitik pada media agar + pati
dan indeks proteolitik pada media agar + skim Bacillus sp
dan E. Coli
2. Membandingkan kemampuan Bacillus sp dan E. Coli dalam
menghidrolisis pati dan skim
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 82
3. Membuktikan bahwa bakteri mampu menghidrolisis pati
dan skim
II. DASAR TEORI
Hidrolisis adalah proses penguraian molekul dengan
penambahan air. Beberapa mikroorganisme dapat menyesuaikan
diri dengan lingkunganya yang kaya akan molekul kompleks
dengan cara mensekresikan enzim yang disebut co-enzim.
a. Hidrolisis Pati
Salah satu polisakarida yang dapat dihidrolisis oleh
mikroorganisme adalah pati. Hidrolisis pati memeliki hasil
akhir berupa dekstrin. Terjadinya hidrolisis pati
disebabkan oleh adanya enzim amylase pada mikroorganisme.
Akan tetapi, tidak semua mikroorganisme memiliki amylase.
Dengan demikian, hidrolisis ini dapat sebagai karakteristik
dan dapat dipakai dalam identifikasi (Slamet, 2000 : 15)
Ratna (1999: 143) menambahkan bahwa larutan iodine garam
adalah indicator pati. Bila medium yang mengandung pati
diberi larutan iodine, maka tempat-tempat yang mengandung
pati akan terlihat jernih.
b. Hidrolisis Kasein (protein)
Kasein adalah protein pokok pada suatu susu yang merupakan
suspense koloid yang menyebabkan susu terlihat putih
mengkilap. Hans (1999 : 20) menambahkan bahwa pengukuran
terhadap garis tengah, lebar akan diperoleh volume. Volume
atau berat jenis jasad renik digunakan dalam proses
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 83
industri. Selain itu jahad renik tadi dipakai pula untuk
medianya.
Uji Amilolitik
Amilum adalah senyawa yang memiliki berat molekul
tinggi, terdiri atas polimer glukosa yang bercabang-cabang
yang diikat dengan ikatan glikosidik. Degradasi amilum
membutuhkan enzim amilase yang akan memecah/menghidrolisis
menjadi polisakarida yang lebih pendek (dextrin), dan
selanjutnya menjadi maltosa.
Hidrolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut
yang dapat ditransport masuk ke dalam sel. Indikator yang
dipakai pada uji amilolitik adalah iodine. Amilum
akanbereaksi dengan iodine membentuk warna biru hitam yang
terlihat pada media. Prosedur di bawah ini menunjukkan
aktivitas amilase. NA yang tersuspensi pati digunakan
sebagai media. Indikator yang dipakai adalah iodine. Amilum
akan bereaksi dengan iodine membentuk komplex warna biru
hitam yang terlihat pada media. Warna biru hitam terjadi
jika iodine masuk ke dalam bagian kosong pada amilum yang
berbentuk spiral.
Indeks Amilolitik (IA) = Diameter zona bening
Diameter zona koloni
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 84
Uji proteolitikUji proteolitik ditujukan untuk mengetahui kemampuan
mikroorganisme menghasilkan enzim protease. Pada praktikum
ini protein yang digunakan dalam bentuk kasein susu.
Hidrolisis kasein secara bertahap akan menghasilkan
monomernya berupa asam amino. Proses ini dinamakan
peptonisasi atau proteolisis.
Indeks Proteolitik (IP) = Diameter zona bening
Diameter zona koloni
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 85
III. ALAT DAN BAHAN
1. ALAT No Nama Jumlah1. Cawan petri 4 buah2. Bunsen 1 buah3. Jarum ose 1 buah4. Penggaris 1 buah5. Simbol 1 buah
2. BAHAN
No Nama Jumlah1 Media NA + Pati 2 buah2 Media NA + Skim 2 buah3 Biakan Bakteri E. coli 1 buah4 Biakan Bakteri Bacillus
sp1 buah
5 Alkohol Secukupnya6 Kertas Label Secukupnya7 Korek api Secukupnya8 Kertas buram 4 buah
IV. CARA KERJA
1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan2. Menyemprotkan alcohol 70% pada tangan praktikan dan
meja praktikum agar berada dalam kondisi steril 3. Menyalakan api Bunsen dan menjaga kondisi ruangan4. Mengambil cawan petri yang berisi media dan
membaginya menjadi 4 kuadran5. Melakukan inokulasi bakteri biakan di setiap kuadran
dengan metode titik dengan benar dan steril
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 86
6. Membungkus cawan petri dengan kertas buram denganposisi terbalik
7. Menyimpan petri di ruangan yang steril pada suhuruang
8. Setelah 2 hari, melihat perkembanganya dan dihitungdiameter zona bening dan zona koloni bakteri padatiap kuadran untuk mendapatkan indeks proteolitikdan amilolitik selama 3 hari berturut-turut
9. Mencatat dalam tabel data pengamatan
V. ANALISIS DATA
VI. KESIMPULAN
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 87
VII. DAFTAR PUSTAKA
VIII. LAMPIRAN
SURAKARTA, ………………….
ASISTEN PRAKTIKAN
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 88
(……….……………) (……….……………)
JUDUL X
PEWARNAAN PADA SEL BAKTERI
I. TUJUAN
Untuk mengamati morfologi bakteri melalui pewarnaan
sederhana dan pewarnaan gram.
II. DASAR TEORI
Bakteri merupakan organism yang sangat kecil
(berukuran mikroskopis). Bakteri rata-rata berukuran lebar
0,5-1 mikron dan panjang hingga 10 mikron (1 mikron = 10-
3). Hal ini berarti bahwa jasad renik sangat tipis sehingga
dapat tembus cahaya. Akibatnya pada mikroskop tidak tampak
jelas dan sukar untuk melihat bagian-bagiannya. Untuk
melihat bakteridengan jelas, permukaan selnya perlu diisi
dengan warna, pewarnaan ini disebut dengan pewarnaan
bakteri.
Pewarnaan bakteri sudah dilakukan sejak permulaan
berkembangnya mikrobiologi di pertengahan abad ke-19 oleh
Louis Pasteur dan Robert Koch. Terdapat dua macam zat warna
yang sering dipakai, yaitu:
1. Zat warna yang bersifat asam; komponen warnanya adalah
anion, biasanya dalam bentuk garam natrium.
2. Zat warna yang bersifat alkalis; dengan komponen warna
kation, biasanya dalam bentuk klorida.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 89
Untuk mendapatkan hasil pengewarnaan yang lebih baik,
tidak jarang diperlukan bahan penolong, yang biasanya
disebut pemantek (mordant). Bahan yang sering digunakan
sebagai pemantek diantaranya: ammonium oksalat, fenol, asam
tanat, garam alumunium, besi, timah, krom, dll.
A. Pengewarnaan Sederhana
Tujuan pengewarnaan ini adalah untuk membedakan
bakteri dari benda-benda mati lain yang bukan bakteri dan
untuk melihat bentuk dan ukurannya. Larutan warna hanya
terdiri dari satu bahan warna yang dilarutkan dalam suatu
pelarut. Bahan yang banyak dipakai untuk keperluan ini
adalah karbol fuksin, Kristal violet dan methylen Blue.
B. Pengewarnaan diferensial
Untuk pengewarnaan ini digunakan lebih dari satu macam
bahan warna. Dengan cara ini bahan-bahan warna yang dipakai
ada kalanya terpisah atau tercampur dan digunakan dalam
satu larutan. Dua macam pengecatan yang terpenting dari
golongan ini adalah pewarnaan gram dan pewarnaan tahan
asam.
Sediaan (preparat) untuk proses pewarnaan dibuat
sebagai berikut:
1. Kaca objek dibersihkan, sehingga bebas lemak.
2. Pada bagian ujung kaca objek diberi tanda, sebaiknya
di sebelah permukaan yang tidak dicat.
3. Dengan ose dibuat goresan tipis pada permukaan yang
telah dibersihkan.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 90
4. Goresan dikeringkan di udara atau dengan hawa hangat
dari api gas.
5. Fiksasi dilakukan dengan cara menyentuhkan permukaan
kaca objek tiga kali berturu-turut pada ujung api
Bunsen.
6. Setelah didinginkan preparat sudah siap untuk dicat.
Yang dimaksud dengan fiksasi adalah meletakkan bakteri
pada kaca objek, mamatikan bakteri dengan cepat agar sifat-
sifatnya tidak banyak berubah. Fiksasi harus dilakukan
setelah preparat kering.
Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram pertama kali dikemukakan oleh
Christian Gram (1884). Dengan pewarnaan ini goresan tipis
bakteri mula-mula dilapisi dengan larutan zat warna karbol
gentinviolet (karbol kristal violet, karbol metal violet)
dan didiamkan beberapa saat, kemudian disiram dengan
larutan iodium dan dibiarkan terendam dalam waktu yang agak
lama. Sampai tingkat pewarnaan ini selesai, semua sel
bakteri akan berwarna ungu.
Selajutnya preparat didekolorisasi dengan alcohol atau
campuran alcohol atau aseton sampai semua zat warna tampak
launtur dari film bakteri. Setelah dicuci dengan air,
preparat diberi warna kontras (counterstain) seperti
safranin atau karbolfuksin encer, air fuksin, atau pironin
B.
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 91
Diantara bermacam-macam bakteri yang diwarnai, ada
yang dapat menahan warna ungu (metil violet, Kristal
violet, gentian violet) dalam selnya meskipun telah
didekolorisasi dengan alcohol atau aseton. Bakteri yang
memberi reaksi demikian dinamakan Bakteri Gram Positif.
Sebaliknya bakteri yang tidak dapat menahan zat warna
setelah didekolorisasi dengan alcohol akan kembali menjadi
tidak berwarna dan bila diberikan pengecatan dengan dengan
zat warna kontras akan berwarna sesuai dengan zat warna
kontras. Bakteri yang memperlihatkan reaksi semacam ini
dinamakan bakteri gram negatif. Atas dasar pewarnaan Gram ini
dunia bakteri dibagi dalam dua golongan besar, yaitu
bakteri gram posistif dan bakteri gram negatif (Koes
Irianto, 2006).
Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya
lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya
lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri
berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram
positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki
dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 93
baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada
di antara dua lapis membran sel.
III. ALAT DAN BAHAN
Pewarnaan Sederhana
Alat Jumlah Bahan JumlahObject
glass
1 Buah Sampel
bakteri
Secukupnya
Ose 1 Buah Methylene
Blue
Secukupnya
Bunsen 1 Buah Kapas SecukupnyaKorek api 1 Buah Air SecukupnyaSpidol
Marker
1 Buah Spirtus Secukupnya
Rak
Pengecatan
1 Buah Secukupnya
Pewarnaan Gram
Alat Jumlah Bahan JumlahObject
glass
1 Buah Sampel
bakteri
Secukupnya
Ose 1 Buah Larutan
gentian
violet
Secukupnya
Bunsen 1 Buah Larutan
iodium
Secukupnya
Korek api 1 Buah Alkohol SecukupnyaSpidol 1 Buah Safranin Secukupnya
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 94
MarkerRak
Pengecatan
1 Buah Kapas Secukupnya
Air SecukuonyaSpirtus Secukupnya
IV. CARA KERJA
a. Pembuatan preparat
1. Kaca objek (object glass) dibersihkan,
sehingga bebas lemak
2. Pada bagian ujung kaca objek diberi tanda,
sebaiknya di sebelah permukaan yang tidak
dicat
3. Dengan ose dibuat goresan tipis dari biakan
bakteri pada permukaan yang telah dibersihkan
4. Goresan dikeringkan di udara atau dengan hawa
panas dengan api gas
5. Fiksasi dilakukan dengan cara meneyentuhkan
permukaan kaca objek tiga kali berturut-turut
pada ujung api Bunsen
6. Setelah didinginkan preparat sudah siap untuk
dicat
b. Pewarnaan preparat
1. Pewarnaan sederhana
- Genangi preparat yang sudah jadi dengan
larutan zat warna (methylene blue)
- Cuci dengan air mengalir, keringkan
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 95
- Amati dibawah mikroskop
2. Pewarnaan Gram
- Genangi preparat yang sudah jadi dengan
larutan zat warna gentian violet selama 2-5
menit
- Buang sisa cat
- Genangi preparat dengan larutan iodium selama
30 detik sampai 1 menit
- Buang sisa cat
- Decolorisasi preparat dengan alkohol atau
aseton sampai warna ungu pada preparat
memudar
- Cuci dengan air mengalir
- Genangi preparat dengan larutan safari selama
2-5 menit
- Cucu dengan air mengalir, keringkan
- Amati dibawah mikroskop
V. ANALISIS DATA
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 96
VIII. LAMPIRAN
SURAKARTA, ………………….
ASISTEN PRAKTIKAN
(……….……………) (……….……………)
Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 98
Top Related