Prosedur Percobaan
1. Kolom untuk KCV disiapkan . Bagian dalamnya di masukkan penjerap (bubur silika
gel) hingga batas tertentu . Perhatikan keserbasamaan penjerap ke semua tempat
dalam kolom , karena adanya rongga-rongga udara dalam kolom atau
ketidakserbasamaan penjerap dalam kolom akan berpengaruh buruk pada proses
pemisahan .
2. Setelah kolom siap (pengkondisian kolom) , ekstrak yang akan di pisahkan
ditempatkan di atas lapisan penjerap dalam bentuk lapisan tipis yang rata diatas
seluruh permukaan penjerap . Setelah itu dilakukan proses elusi dengan campuran
pelarut berbagai perbandingan . Elusi di percepat dengan cara penghisapan melalui
pompa vakum .
3. Eluen di ganti dengan campuran yang mempunyai perbandingan berbeda dengan
volume eluen yang sama dengan volume eluen pada proses pertama . Fraksi yang
keluar kolom di tampung dan di gunakan untuk analisis lanjutan .
Komposisi larutan dan eluen adalah sebagai berikut :
n-Heksana (ml) Etil Asetat (ml)
100 0
90 10
80 20
70 30
60 40
50 50
40 60
30 70
20 80
10 90
0 100
DATA FRAKSI :
Fraksi Warna Fraksi Warna
1 Bening 7 Kuning muda
2 Bening 8 Kuning
3 Bening 9 Kuning tua
4 Bening 10 Kuning tua
5 Kuning muda 11 Kuning kecoklatan
6 Kuning muda 12 -
Data Rf :
Penjerap : Silika Gel GF 254
Pengembang : n-Heksana
Penampang Bercak : AlCL3
Pola Kromatogram :
No.
bercak
Rf Pengamatan
Sinar tampak UV 254 UV 366 AlCl3
E1 0,9125 - Ungu Coklat -
F2 0,90625 - Ungu Coklat -
F3 0,875 - Ungu Coklat -
F4 0,7375 Ada Ungu Coklat Kuning
G5 0,8875 - Ungu Coklat -
G6 0,85 - Ungu Coklat -
G7 0,75 Ada Ungu Coklat Kuning
G8 0,5625 - Ungu Coklat -
G9 0,525 - Ungu Coklat -
H10 0,8375 - Ungu Coklat -
H11 0,75 Ada Ungu Coklat Kuning
H12 0,7125 - Ungu Coklat -
H13 0,5625 - Ungu Coklat -
H14 0,525 - Ungu Coklat -
H15 0,4875 - Ungu Coklat -
I16 0,7375 Ada Ungu Coklat Kuning
I17 0,5 - Ungu Coklat -
J18 0,725 Ada Ungu Coklat Kuning
J19 0,4625 - Ungu Coklat -
K20 0,3625 - Ungu Coklat -
Setelah dilakukan optimasi :
RfPengamatan
Sinar Tampak UV 254 UV 366 AlCl3
0,283 Ada Ungu Coklat Kuning
Pembahasan
Kromatografi Cair vakum merupakan kromatografi kolom yang dipercepat dan bekerja pada
kondisi vakum, fase gerak digerakkan dengan kondisi vakum sehingga prosesnya
berlangsung cepat. Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh
kerapatan maksimum. Alat yang digunakan terdiri dari tabung kolom, sumbat karet, pengisap
yang dihubungkan dengan pompa vakum serta wadah penampung fraksi. KCV memerlukan
jumlah sampel yang lebih banyak dari pada kromatografi lapis tipis (KLT) .
Kromatografi kolom cair dapat dilakukan pada tekanan atmosfer atau pada tekanan
lebih besar dari atmosfer dengan menggunakan bantuan tekanan luar misalnya gas nitrogen.
Untuk keberhasilan praktikan di dalam bekerja dengan menggunakan kromatografi kolom
vakum cair,oleh karena itu syarat utama adalah mengetahui gambaran pemisahan cuplikan
padakromatografi lapis tipis.
Kromatografi vakum cair dilakukan untuk memisahkan golongan senyawa metabolitsekunder
secara kasar dengan menggunakan silika gel sebagai absorben dan berbagai perbandingan
pelarut n-heksana : etil asetat : metanol (elusi gradien) dan menggunakan pompavakum untuk
memudahkan penarikan eluen
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran
dimana cuplikan berkesetimbangan di antara dua fasa, fasa gerak yang membawa cuplikan
dan fasa diam yang menahan cuplikan secara selektif. Bila fasa gerak berupa gas,
disebutkromatografi gas, dan sebaliknya kalau fasa gerak berupa zat cair, disebut
kromatografi cair .
Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom kromatografi dikemas kering
(biasanya dengan penjerap mutu KLT 10-40 μm) dalam keadaan vakum agar diperoleh
kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah
dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dipisah sampai kering dan
sekarang siap dipakai .
Kromatografi ialah cara pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan zat-zat terlarut yang
bergerak bersama-sama dengan pelarutnya pada permukaan suatu benda penyerap. Cara ini
umum dilakukan pada pemisahan zat-zat berwarna (bahasa Yunani: chromos = warna).
Kromatografi vakum cair merupakan salah satu jenis dari kromatografi kolom.Kromatografi
kolom merupakan suatu metode pemisahan campuran larutan dengan perbandingan pelarut
dan kerapatan dengan menggunakan bahan kolom. Kromatografi kolom lazim digunakan
untuk pemisahan dan pemurnian senyawa .
Yang pertama kali dilakukan adalah menyiapkan tabung kolom , kolom yang di gunakan
pada percobaan kali ini adalah kolom dengan diameter 4cm . Kolom dicuci terlebih dahulu
menggunakan etanol sebelum di gunakan untuk menghilangkan bekas-bekas senyawa yang
tertinggal di dalam kolom sehingga hasil yang didapatkan bisa murni . setelah di cuci ,
kolom di bilas dengan n-heksan untuk menghilangkan sisa-sisa etanol dan pelarut-pelarut
lainnya di dalam kolom agar tidak mengkontaminasi sampel . kemudian kolom di keringkan
sampai benar-benar kering tanpa ada nya air .
Pada percobaan KCV ini fasa diam yang digunakan adalah silika gel . fasa diam adalah fasa
yang menahan sampel agar tidak terlarut semua hanya ekstraknya saja . silika gel termasuk
senyawa polar .Ciri-ciri senyawa polar :
dapat larut dalam air dan pelarut polar lain
memiliki kutub + dan kutub - , akibat tidak meratanya distribusi elektron
memiliki pasangan elektron bebas (bila bentuk molekul diketahui) atau memiliki
perbedaan keelektronegatifan .
silika gel yang digunakan di sini adalah silika gel 60 . maksud 60 pada silika gel ini yaitu
rata-rata diameter partikel silika gel ini adalah 60Å . silika gel ini juga bisa di sebut silika gel
230-400 . penggunaan silika gel ini karena dapat menghasilkan hasil pemisahan yang baik
dengan partikel-partikel dengan ukuran yang sangat kecil sehingga senyawa bisa terpisah
dengan baik . sedangkan fasa gerak yang di gunakan adalah n-heksana . fasa gerak adalah
fasa yang membawa senyawa yang berada di sampel keluar dari penjerap . n-heksana
merupakan senyawa non polar . ciri-ciri senyawa non-polar :
tidak larut dalam air dan pelarut polar lain
Tidak memiliki kutub + dan kutub - , akibat meratanya distribusi elektron
tidak memiliki pasangan elektron bebas (bila bentuk molekul diketahui) atau
keelektronegatifannya sama
Silika gel pada mulanya masih belum aktif, dan untuk mengaktifkannya sebaiknya setelah
dicampurkan dengan n-heksana lalu dipanaskan pada suhu diatas 45˚C. Namun, pada
percobaan ini tidak dilakukan pemanasan. Ada dua cara melapisi kolom dengan silika gel
yaitu proses basah dan proses kering. Proses basah yaitu silika gel ditambahkan dengan n-
heksana hingga berbentuk seperti bubur, lalu dituangkan kedalam kolom, dan dihisap
pelarutnya dengan mesin vakum, dan dihentikan sampai panjang kolom sesuai dengan yang
diinginkan, maka diperoleh silika gel yang padat pada kolom. Yang kedua proses kering yaitu
memasukkan silika gel yang dalam bentuk padat langsung kekolom lalu dipadatkan. Pada
percobaan ini, pembuatan kolom dengan silika gel dilakukan dengan cara proses basah. Pada
saat silika gel dicampurkan dengann-heksana terlihat bahwa kedua senyawa ini tidak
bercampur, hal ini dikarenakan n- heksana dan silika gel berbeda kepolarannya, yaitu n-
heksana merupakan non polar dan silika gel polar. Kita tidak menggunakan metanol
(CH3OH) karena senyawa ini polar, dan dapat mengakibatkan semua senyawa akan turun .
Silika gel sebanyak 30 gr di timbang , dipisahkan menjadi 2 , 28 gr untuk membuat bubur
silika gel , 2 gr untuk mencampurkannya dengan sampel . pembuatan bubur silika gel yaitu
dengan mencampurkan silika dengan n-heksan sampai semua silika basah yaitu sekitar 15-30
ml . setelah jadi , silika di masukan kedalam kolom yang telah di siapkan tadi menggunakan
batang pengaduk yang di tempelkan di dinding tabung sedikit demi sedikit agar jatuhnya
silika secara merata dan di jaga agar tidak adanya rongga dalam lapisan silika gel ini , sambil
dinyalakan vakum untuk menampung eluen , sehingga sisa-sisa silika gel dan bagian-bagian
dinding tabung kolom yang tertinggal silika gel dapat di bilas lagi dengan eluen agar merata
dan di tuangkan lagi sampai semua silika berada dalam kolom dan untuk pemadatan silika
agar tidak adanya rongga . Kolom sambil di ketuk-ketukan agar tidak terdapat rongga yang
dapat menyebabkan ekstrak akan ikut turun memasuki rongga sehingga ekstrak yang di
hasilkan tidak murni . tinggi silika pada kolom ini adalah 5 cm .
Setelah itu disiapkan ekstrak dengan cara kering . ekstrak kental di timbang sebanyak 2 gr
kemudian di tambahkan silka gel sebanyak 2 gr dan di gerus sampai homogen . ekstrak yang
sudah di campurkan dengan silika gel kemudian di masukkan ke dalam kolom secara merata
dengan cara memasukkanya sedikit demi sedikit jangan sampai miring atau terlalu banyak di
bagian kanan atau kiri sehingga terbentuk pita-pita warna pada kolom .
KVC merupakan pemisahan fraksi berdasarkan pelarutnya. Agar fraksi tertentu turun, maka
harus ditingkatkan kepolarannya dari non polar, sedikit polar, semi polar,agak polar sampai
100% polar, hal ini dikarenakan didalam sampel itu terdapat senyawa yang berbeda
kepolarannya. Untuk meningkatkan kepolaran pelarut dilakukan perbandingan campuran
pelarut, pada mulanya pelarut non polar dicampur dengan pelarut semi polar
dengan perbandingan tertentu, dan sampai nanti pelarut semipolar dicampur dengan pelarut
polar dengan perbandingan tertentu. Sampel atau fraksi yang turun itu sesuai dengan
kepolaran pelarut yang digunakan. Bila pelarut yang digunakan adalah n-heksana (non polar)
maka fraksi yang akan turun adalah senyawa non polar, sedangkan senyawa polar tidak turun
karena tidak larut dengan pelarut n-heksana.
Perbandingan pelarut yang di gunakan adalah :
n-Heksana (ml) Etil Asetat (ml)
100 0
90 10
80 20
70 30
60 40
50 50
40 60
30 70
20 80
10 90
0 100
Pelarut yang pertama di tuangkan adalah eluen yang tidak polar , sebelum vakum di nyalakan
,di siapkan wadah fraksi di bawah kolom untuk menampung fraksinya . setelah tertampung ,
langsung di tuangkan eluen dengan tingkat kepolaran yang bertingkat secara bertahap jangan
sampai silika dalam keadaan kering karena dapat merusak kolom dengan adanya rongga
udara yang terbentuk jika silika kering , ini dapat mempengaruhi hasil fraksinasi sehingga
senyawa lain dapat ikut terbawa dan hasil fraksi menjadi tidak murni . dalam pengerjaan
kromatografi cair ini terjadi kerusakan kolom (kolom menjadi berongga sehingga tidak
terbentuk pita lagi) sehingga fraksi yang di hasilkan tidak sempurna .
Setiap fraksi hasil KCV ditampung kemudian dipekatkan untuk selanjutnya dianalisis dengan
menggunakan KLT. Analisis KLT dilakukan dengan menggunakan fase diam lempeng silica
gel GF254 berukuran ×10 cm untuk setiap fraksi dan fase gerak.perbandingan pengembang
yang di gunakan adalah 5:5(n-heksan : etil asetat ). Pada analisis KLT ini untuk setiap fraksi
dibuat 12 spot. spot pertama sebagai spot dari ekstrak dan 11 spot lain dari hasil ekstraksi
yang akan dideteksi dengan menggunakan pereaksi semprot AlCl3 yang dilihat berdasarkan
literatur . Deteksi hasil bercak hasil elusi dilakukan dengan dilihat dibawah sinar UV 254 nm
dan UV 366 nm
Didapatkan 11 fraksi dalam percobaan ini :
Fraksi Warna Fraksi Warna
1 Bening 7 Kuning muda
2 Bening 8 Kuning
3 Bening 9 Kuning tua
4 Bening 10 Kuning tua
5 Kuning muda 11 Kuning kecoklatan
6 Kuning muda 12 -
Didapatkan pola kromatografi :
No.
bercak
Rf Pengamatan
Sinar tampak UV 254 UV 366 AlCl3
E1 0,9125 - Ungu Coklat -
F2 0,90625 - Ungu Coklat -
F3 0,875 - Ungu Coklat -
F4 0,7375 Ada Ungu Coklat Kuning
G5 0,8875 - Ungu Coklat -
G6 0,85 - Ungu Coklat -
G7 0,75 Ada Ungu Coklat Kuning
G8 0,5625 - Ungu Coklat -
G9 0,525 - Ungu Coklat -
H10 0,8375 - Ungu Coklat -
H11 0,75 Ada Ungu Coklat Kuning
H12 0,7125 - Ungu Coklat -
H13 0,5625 - Ungu Coklat -
H14 0,525 - Ungu Coklat -
H15 0,4875 - Ungu Coklat -
I16 0,7375 Ada Ungu Coklat Kuning
I17 0,5 - Ungu Coklat -
J18 0,725 Ada Ungu Coklat Kuning
J19 0,4625 - Ungu Coklat -
K20 0,3625 - Ungu Coklat -
Fraksi 1
Pada fraksi ini menggunakan pelarut non polar yaitu (100:0) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini
bersifat nonpolar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya juga yang
bersifat nonpolar . Fraksi ini berwarna bening , dan saat di KLT tidak terdapat bercak.
sehingga fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone .
Fraksi 2
Pada fraksi ini menggunakan pelarut non polar yaitu (90:10) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini
bersifat nonpolar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya juga yang
bersifat nonpolar . Fraksi ini berwarna bening , dan saat di KLT tidak terdapat bercak .
sehingga fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone .
Fraksi 3
Pada fraksi ini menggunakan pelarut non polar yaitu (80:20) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini
bersifat nonpolar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya juga yang
bersifat nonpolar . Fraksi ini berwarna bening , dan saat di KLT tidak terdapat bercak.
sehingga fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone .
Fraksi 4
Pada fraksi ini menggunakan pelarut non polar yaitu (70:30) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini
bersifat nonpolar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya juga yang
bersifat nonpolar . Fraksi ini berwarna bening , dan saat di KLT tidak terdapat bercak.
sehingga fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone .
Fraksi 5
Pada fraksi ini menggunakan pelarut non polar (60:40) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini
bersifat non polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat
non polar. Fraksi ini berwarna kuning, dan saat di KLT terdapat 1 bercak dengan nilai rf
0,9125 . dan setelah di semprotkan dengan AlCl3 tidak terdapat bercak yang berflorosensi
berwarna coklat . sehingga fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone .
Fraksi 6
Pada fraksi ini menggunakan pelarut dengan perbandingan yang sama (50:50) n-heksana : etil
asetat . Fraksi ini bersifat semi polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di
dalamnya bisa bersifat polar maupun non polar . Fraksi ini berwarna kuning muda, dan saat
di KLT terdapat 3 bercak dengan nilai rf 0,90625 , 0,875 , dan 0,7375 . dan setelah di
semprotkan dengan AlCl3 terdapat bercak yang berflorosensi berwarna coklat di nilai rf
0,7375. sehingga fraksi ini mengandung senyawa xanthone .
Fraksi 7
Pada fraksi ini menggunakan pelarut polar (40:60) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat
polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat polar. Fraksi ini
berwarna kuning muda , dan saat di KLT terdapat 5 bercak dengan nilai rf 0,8875 , 0,85 ,
0,75 , 0,5625 , 0,525 dan setelah di semprotkan dengan AlCl3 terdapat bercak yang
berflorosensi berwarna coklat di nilai rf 0,75 . sehingga fraksi ini mengandung senyawa
xanthone .
Fraksi 8
Pada fraksi ini menggunakan pelarut polar (30:70) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat
polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat polar. Fraksi ini
berwarna kuning muda , dan saat di KLT terdapat 6 bercak dengan nilai rf 0,8375 , 0,75 ,
0,7125 , 0,5625 , 0,525 , 0,5625 , 0,4875 dan setelah di semprotkan dengan AlCl3 terdapat
bercak yang berflorosensi berwarna coklat di nilai rf 0,75 . sehingga fraksi ini mengandung
senyawa xanthone .
Fraksi 9
Pada fraksi ini menggunakan pelarut polar (20:80) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat
polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat polar. Fraksi ini
berwarna kuning muda , dan saat di KLT terdapat 2 bercak dengan nilai rf 0,7375 dan 0,5 ,
setelah di semprotkan dengan AlCl3 terdapat bercak yang berflorosensi berwarna coklat di
nilai rf 0,7375 . sehingga fraksi ini mengandung senyawa xanthone .
Fraksi 10
Pada fraksi ini menggunakan pelarut polar (10:90) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat
polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat polar. Fraksi ini
berwarna kuning muda , dan saat di KLT terdapat 2 bercak dengan nilai rf 0,725 dan 0,4625,
setelah di semprotkan dengan AlCl3 terdapat bercak yang berflorosensi berwarna coklat di
nilai rf 0,725 . sehingga fraksi ini mengandung senyawa xanthone .
Fraksi 11
Pada fraksi ini menggunakan pelarut polar (100:0) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat
polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat polar. Fraksi ini
berwarna kuning muda , dan saat di KLT terdapat 1 bercak dengan nilai rf 0,3625 setelah di
semprotkan dengan AlCl3 tidak terdapat bercak yang berflorosensi berwarna coklat. sehingga
fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone .
Setelah dilakukan optimasi , di KLT lagi menggunakan perbandingan pelarut 7:3 (n-
heksan:etil asetat ) agar nilai rf yang dihasil kan berkisar 0,2-0,3 yang akan di gunakan untuk
isolasi senyawa menggunakan kolom .
RfPengamatan
Sinar Tampak UV 254 UV 366 AlCl3
0,283 Ada Ungu Coklat Kuning