KCV

16
Prosedur Percobaan 1. Kolom untuk KCV disiapkan . Bagian dalamnya di masukkan penjerap (bubur silika gel) hingga batas tertentu . Perhatikan keserbasamaan penjerap ke semua tempat dalam kolom , karena adanya rongga-rongga udara dalam kolom atau ketidakserbasamaan penjerap dalam kolom akan berpengaruh buruk pada proses pemisahan . 2. Setelah kolom siap (pengkondisian kolom) , ekstrak yang akan di pisahkan ditempatkan di atas lapisan penjerap dalam bentuk lapisan tipis yang rata diatas seluruh permukaan penjerap . Setelah itu dilakukan proses elusi dengan campuran pelarut berbagai perbandingan . Elusi di percepat dengan cara penghisapan melalui pompa vakum . 3. Eluen di ganti dengan campuran yang mempunyai perbandingan berbeda dengan volume eluen yang sama dengan volume eluen pada proses pertama . Fraksi yang keluar kolom di tampung dan di gunakan untuk analisis lanjutan . Komposisi larutan dan eluen adalah sebagai berikut : n-Heksana (ml) Etil Asetat (ml) 100 0 90 10 80 20 70 30 60 40 50 50

Transcript of KCV

Page 1: KCV

Prosedur Percobaan

1. Kolom untuk KCV disiapkan . Bagian dalamnya di masukkan penjerap (bubur silika

gel) hingga batas tertentu . Perhatikan keserbasamaan penjerap ke semua tempat

dalam kolom , karena adanya rongga-rongga udara dalam kolom atau

ketidakserbasamaan penjerap dalam kolom akan berpengaruh buruk pada proses

pemisahan .

2. Setelah kolom siap (pengkondisian kolom) , ekstrak yang akan di pisahkan

ditempatkan di atas lapisan penjerap dalam bentuk lapisan tipis yang rata diatas

seluruh permukaan penjerap . Setelah itu dilakukan proses elusi dengan campuran

pelarut berbagai perbandingan . Elusi di percepat dengan cara penghisapan melalui

pompa vakum .

3. Eluen di ganti dengan campuran yang mempunyai perbandingan berbeda dengan

volume eluen yang sama dengan volume eluen pada proses pertama . Fraksi yang

keluar kolom di tampung dan di gunakan untuk analisis lanjutan .

Komposisi larutan dan eluen adalah sebagai berikut :

n-Heksana (ml) Etil Asetat (ml)

100 0

90 10

80 20

70 30

60 40

50 50

40 60

30 70

20 80

10 90

0 100

DATA FRAKSI :

Page 2: KCV

Fraksi Warna Fraksi Warna

1 Bening 7 Kuning muda

2 Bening 8 Kuning

3 Bening 9 Kuning tua

4 Bening 10 Kuning tua

5 Kuning muda 11 Kuning kecoklatan

6 Kuning muda 12 -

Data Rf :

Penjerap : Silika Gel GF 254

Pengembang : n-Heksana

Penampang Bercak : AlCL3

Pola Kromatogram :

No.

bercak

Rf Pengamatan

Sinar tampak UV 254 UV 366 AlCl3

E1 0,9125 - Ungu Coklat -

F2 0,90625 - Ungu Coklat -

Page 3: KCV

F3 0,875 - Ungu Coklat -

F4 0,7375 Ada Ungu Coklat Kuning

G5 0,8875 - Ungu Coklat -

G6 0,85 - Ungu Coklat -

G7 0,75 Ada Ungu Coklat Kuning

G8 0,5625 - Ungu Coklat -

G9 0,525 - Ungu Coklat -

H10 0,8375 - Ungu Coklat -

H11 0,75 Ada Ungu Coklat Kuning

H12 0,7125 - Ungu Coklat -

H13 0,5625 - Ungu Coklat -

H14 0,525 - Ungu Coklat -

H15 0,4875 - Ungu Coklat -

I16 0,7375 Ada Ungu Coklat Kuning

I17 0,5 - Ungu Coklat -

J18 0,725 Ada Ungu Coklat Kuning

J19 0,4625 - Ungu Coklat -

K20 0,3625 - Ungu Coklat -

Setelah dilakukan optimasi :

RfPengamatan

Sinar Tampak UV 254 UV 366 AlCl3

0,283 Ada Ungu Coklat Kuning

Page 4: KCV

Pembahasan

Kromatografi Cair vakum merupakan kromatografi kolom yang dipercepat dan bekerja pada

kondisi vakum, fase gerak digerakkan dengan kondisi vakum sehingga prosesnya

berlangsung cepat. Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh

kerapatan maksimum. Alat yang digunakan terdiri dari tabung kolom, sumbat karet, pengisap

yang dihubungkan dengan pompa vakum serta wadah penampung fraksi. KCV memerlukan

jumlah sampel yang lebih banyak dari pada kromatografi lapis tipis (KLT) .

Kromatografi kolom cair dapat dilakukan pada tekanan atmosfer atau pada tekanan

lebih besar dari atmosfer dengan menggunakan bantuan tekanan luar misalnya gas nitrogen.

Untuk keberhasilan praktikan di dalam bekerja dengan menggunakan kromatografi kolom

vakum cair,oleh karena itu syarat utama adalah mengetahui gambaran pemisahan cuplikan

padakromatografi lapis tipis.

 

Kromatografi vakum cair dilakukan untuk memisahkan golongan senyawa metabolitsekunder

secara kasar dengan menggunakan silika gel sebagai absorben dan berbagai perbandingan

pelarut n-heksana : etil asetat : metanol (elusi gradien) dan menggunakan pompavakum untuk

memudahkan penarikan eluen

Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran

dimana cuplikan berkesetimbangan di antara dua fasa, fasa gerak yang membawa cuplikan

dan fasa diam yang menahan cuplikan secara selektif. Bila fasa gerak berupa gas,

Page 5: KCV

disebutkromatografi gas, dan sebaliknya kalau fasa gerak berupa zat cair, disebut

kromatografi cair .

Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom kromatografi dikemas kering

(biasanya dengan penjerap mutu KLT 10-40 μm) dalam keadaan vakum agar diperoleh

kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah

dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dipisah sampai kering dan

sekarang siap dipakai .

Kromatografi ialah cara pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan zat-zat terlarut yang

bergerak bersama-sama dengan pelarutnya pada permukaan suatu benda penyerap. Cara ini

umum dilakukan pada pemisahan zat-zat berwarna (bahasa Yunani: chromos = warna).

Kromatografi vakum cair merupakan salah satu jenis dari kromatografi kolom.Kromatografi

kolom merupakan suatu metode pemisahan campuran larutan dengan perbandingan pelarut

dan kerapatan dengan menggunakan bahan kolom. Kromatografi kolom lazim digunakan

untuk pemisahan dan pemurnian senyawa .

Yang pertama kali dilakukan adalah menyiapkan tabung kolom , kolom yang di gunakan

pada percobaan kali ini adalah kolom dengan diameter 4cm . Kolom dicuci terlebih dahulu

menggunakan etanol sebelum di gunakan untuk menghilangkan bekas-bekas senyawa yang

tertinggal di dalam kolom sehingga hasil yang didapatkan bisa murni . setelah di cuci ,

kolom di bilas dengan n-heksan untuk menghilangkan sisa-sisa etanol dan pelarut-pelarut

lainnya di dalam kolom agar tidak mengkontaminasi sampel . kemudian kolom di keringkan

sampai benar-benar kering tanpa ada nya air .

Pada percobaan KCV ini fasa diam yang digunakan adalah silika gel . fasa diam adalah fasa

yang menahan sampel agar tidak terlarut semua hanya ekstraknya saja . silika gel termasuk

senyawa polar .Ciri-ciri senyawa polar :

dapat larut dalam air dan pelarut polar lain

memiliki kutub + dan kutub - , akibat tidak meratanya distribusi elektron

memiliki pasangan elektron bebas (bila bentuk molekul diketahui) atau memiliki

perbedaan keelektronegatifan .

Page 6: KCV

silika gel yang digunakan di sini adalah silika gel 60 . maksud 60 pada silika gel ini yaitu

rata-rata diameter partikel silika gel ini adalah 60Å . silika gel ini juga bisa di sebut silika gel

230-400 . penggunaan silika gel ini karena dapat menghasilkan hasil pemisahan yang baik

dengan partikel-partikel dengan ukuran yang sangat kecil sehingga senyawa bisa terpisah

dengan baik . sedangkan fasa gerak yang di gunakan adalah n-heksana . fasa gerak adalah

fasa yang membawa senyawa yang berada di sampel keluar dari penjerap . n-heksana

merupakan senyawa non polar . ciri-ciri senyawa non-polar :

tidak larut dalam air dan pelarut polar lain

Tidak memiliki kutub + dan kutub - , akibat meratanya distribusi elektron

tidak memiliki pasangan elektron bebas (bila bentuk molekul diketahui) atau

keelektronegatifannya sama

Silika gel pada mulanya masih belum aktif, dan untuk mengaktifkannya sebaiknya setelah

dicampurkan dengan n-heksana lalu dipanaskan pada suhu diatas 45˚C. Namun, pada

percobaan ini tidak dilakukan pemanasan. Ada dua cara melapisi kolom dengan silika gel

yaitu proses basah dan proses kering. Proses basah yaitu silika gel ditambahkan dengan n-

heksana hingga berbentuk seperti bubur, lalu dituangkan kedalam kolom, dan dihisap

pelarutnya dengan mesin vakum, dan dihentikan sampai panjang kolom sesuai dengan yang

diinginkan, maka diperoleh silika gel yang padat pada kolom. Yang kedua proses kering yaitu

memasukkan silika gel yang dalam bentuk padat langsung kekolom lalu dipadatkan. Pada

percobaan ini, pembuatan kolom dengan silika gel dilakukan dengan cara proses basah. Pada

saat silika gel dicampurkan dengann-heksana terlihat bahwa kedua senyawa ini tidak

bercampur, hal ini dikarenakan n- heksana dan silika gel berbeda kepolarannya, yaitu n-

heksana merupakan non polar dan silika gel polar. Kita tidak menggunakan metanol

(CH3OH) karena senyawa ini polar, dan dapat mengakibatkan semua senyawa akan turun .

Silika gel sebanyak 30 gr di timbang , dipisahkan menjadi 2 , 28 gr untuk membuat bubur

silika gel , 2 gr untuk mencampurkannya dengan sampel . pembuatan bubur silika gel yaitu

dengan mencampurkan silika dengan n-heksan sampai semua silika basah yaitu sekitar 15-30

ml . setelah jadi , silika di masukan kedalam kolom yang telah di siapkan tadi menggunakan

batang pengaduk yang di tempelkan di dinding tabung sedikit demi sedikit agar jatuhnya

silika secara merata dan di jaga agar tidak adanya rongga dalam lapisan silika gel ini , sambil

dinyalakan vakum untuk menampung eluen , sehingga sisa-sisa silika gel dan bagian-bagian

dinding tabung kolom yang tertinggal silika gel dapat di bilas lagi dengan eluen agar merata

Page 7: KCV

dan di tuangkan lagi sampai semua silika berada dalam kolom dan untuk pemadatan silika

agar tidak adanya rongga . Kolom sambil di ketuk-ketukan agar tidak terdapat rongga yang

dapat menyebabkan ekstrak akan ikut turun memasuki rongga sehingga ekstrak yang di

hasilkan tidak murni . tinggi silika pada kolom ini adalah 5 cm .

Setelah itu disiapkan ekstrak dengan cara kering . ekstrak kental di timbang sebanyak 2 gr

kemudian di tambahkan silka gel sebanyak 2 gr dan di gerus sampai homogen . ekstrak yang

sudah di campurkan dengan silika gel kemudian di masukkan ke dalam kolom secara merata

dengan cara memasukkanya sedikit demi sedikit jangan sampai miring atau terlalu banyak di

bagian kanan atau kiri sehingga terbentuk pita-pita warna pada kolom .

KVC merupakan pemisahan fraksi berdasarkan pelarutnya. Agar fraksi tertentu turun, maka

harus ditingkatkan kepolarannya dari non polar, sedikit polar, semi polar,agak polar sampai

100% polar, hal ini dikarenakan didalam sampel itu terdapat senyawa yang berbeda

kepolarannya. Untuk meningkatkan kepolaran pelarut dilakukan perbandingan campuran

pelarut, pada mulanya pelarut non polar dicampur dengan pelarut semi polar

dengan perbandingan tertentu, dan sampai nanti pelarut semipolar dicampur dengan pelarut

polar dengan perbandingan tertentu. Sampel atau fraksi yang turun itu sesuai dengan

kepolaran pelarut yang digunakan. Bila pelarut yang digunakan adalah n-heksana (non polar)

maka fraksi yang akan turun adalah senyawa non polar, sedangkan senyawa polar tidak turun

karena tidak larut dengan pelarut n-heksana.

Perbandingan pelarut yang di gunakan adalah :

n-Heksana (ml) Etil Asetat (ml)

100 0

90 10

80 20

70 30

60 40

50 50

40 60

30 70

20 80

10 90

0 100

Page 8: KCV

Pelarut yang pertama di tuangkan adalah eluen yang tidak polar , sebelum vakum di nyalakan

,di siapkan wadah fraksi di bawah kolom untuk menampung fraksinya . setelah tertampung ,

langsung di tuangkan eluen dengan tingkat kepolaran yang bertingkat secara bertahap jangan

sampai silika dalam keadaan kering karena dapat merusak kolom dengan adanya rongga

udara yang terbentuk jika silika kering , ini dapat mempengaruhi hasil fraksinasi sehingga

senyawa lain dapat ikut terbawa dan hasil fraksi menjadi tidak murni . dalam pengerjaan

kromatografi cair ini terjadi kerusakan kolom (kolom menjadi berongga sehingga tidak

terbentuk pita lagi) sehingga fraksi yang di hasilkan tidak sempurna .

Setiap fraksi hasil KCV ditampung kemudian dipekatkan untuk selanjutnya dianalisis dengan

menggunakan KLT. Analisis KLT dilakukan dengan menggunakan fase diam lempeng silica

gel GF254 berukuran ×10 cm untuk setiap fraksi dan fase gerak.perbandingan pengembang

yang di gunakan adalah 5:5(n-heksan : etil asetat ). Pada analisis KLT ini untuk setiap fraksi

dibuat 12 spot. spot pertama sebagai spot dari ekstrak dan 11 spot lain dari hasil ekstraksi

yang akan dideteksi dengan menggunakan pereaksi semprot AlCl3 yang dilihat berdasarkan

literatur . Deteksi hasil bercak hasil elusi dilakukan dengan dilihat dibawah sinar UV 254 nm

dan UV 366 nm

Didapatkan 11 fraksi dalam percobaan ini :

Fraksi Warna Fraksi Warna

1 Bening 7 Kuning muda

2 Bening 8 Kuning

3 Bening 9 Kuning tua

4 Bening 10 Kuning tua

5 Kuning muda 11 Kuning kecoklatan

6 Kuning muda 12 -

Didapatkan pola kromatografi :

Page 9: KCV

No.

bercak

Rf Pengamatan

Sinar tampak UV 254 UV 366 AlCl3

E1 0,9125 - Ungu Coklat -

F2 0,90625 - Ungu Coklat -

F3 0,875 - Ungu Coklat -

F4 0,7375 Ada Ungu Coklat Kuning

G5 0,8875 - Ungu Coklat -

G6 0,85 - Ungu Coklat -

G7 0,75 Ada Ungu Coklat Kuning

G8 0,5625 - Ungu Coklat -

G9 0,525 - Ungu Coklat -

H10 0,8375 - Ungu Coklat -

H11 0,75 Ada Ungu Coklat Kuning

H12 0,7125 - Ungu Coklat -

H13 0,5625 - Ungu Coklat -

H14 0,525 - Ungu Coklat -

H15 0,4875 - Ungu Coklat -

I16 0,7375 Ada Ungu Coklat Kuning

I17 0,5 - Ungu Coklat -

J18 0,725 Ada Ungu Coklat Kuning

J19 0,4625 - Ungu Coklat -

K20 0,3625 - Ungu Coklat -

Page 10: KCV

Fraksi 1

Pada fraksi ini menggunakan pelarut non polar yaitu (100:0) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini

bersifat nonpolar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya juga yang

bersifat nonpolar . Fraksi ini berwarna bening , dan saat di KLT tidak terdapat bercak.

sehingga fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone .

Fraksi 2

Pada fraksi ini menggunakan pelarut non polar yaitu (90:10) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini

bersifat nonpolar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya juga yang

bersifat nonpolar . Fraksi ini berwarna bening , dan saat di KLT tidak terdapat bercak .

sehingga fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone .

Fraksi 3

Pada fraksi ini menggunakan pelarut non polar yaitu (80:20) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini

bersifat nonpolar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya juga yang

bersifat nonpolar . Fraksi ini berwarna bening , dan saat di KLT tidak terdapat bercak.

sehingga fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone .

Fraksi 4

Pada fraksi ini menggunakan pelarut non polar yaitu (70:30) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini

bersifat nonpolar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya juga yang

bersifat nonpolar . Fraksi ini berwarna bening , dan saat di KLT tidak terdapat bercak.

sehingga fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone .

Fraksi 5

Pada fraksi ini menggunakan pelarut non polar (60:40) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini

bersifat non polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat

non polar. Fraksi ini berwarna kuning, dan saat di KLT terdapat 1 bercak dengan nilai rf

0,9125 . dan setelah di semprotkan dengan AlCl3 tidak terdapat bercak yang berflorosensi

berwarna coklat . sehingga fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone .

Fraksi 6

Pada fraksi ini menggunakan pelarut dengan perbandingan yang sama (50:50) n-heksana : etil

asetat . Fraksi ini bersifat semi polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di

dalamnya bisa bersifat polar maupun non polar . Fraksi ini berwarna kuning muda, dan saat

di KLT terdapat 3 bercak dengan nilai rf 0,90625 , 0,875 , dan 0,7375 . dan setelah di

semprotkan dengan AlCl3 terdapat bercak yang berflorosensi berwarna coklat di nilai rf

0,7375. sehingga fraksi ini mengandung senyawa xanthone .

Page 11: KCV

Fraksi 7

Pada fraksi ini menggunakan pelarut polar (40:60) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat

polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat polar. Fraksi ini

berwarna kuning muda , dan saat di KLT terdapat 5 bercak dengan nilai rf 0,8875 , 0,85 ,

0,75 , 0,5625 , 0,525 dan setelah di semprotkan dengan AlCl3 terdapat bercak yang

berflorosensi berwarna coklat di nilai rf 0,75 . sehingga fraksi ini mengandung senyawa

xanthone .

Fraksi 8

Pada fraksi ini menggunakan pelarut polar (30:70) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat

polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat polar. Fraksi ini

berwarna kuning muda , dan saat di KLT terdapat 6 bercak dengan nilai rf 0,8375 , 0,75 ,

0,7125 , 0,5625 , 0,525 , 0,5625 , 0,4875 dan setelah di semprotkan dengan AlCl3 terdapat

bercak yang berflorosensi berwarna coklat di nilai rf 0,75 . sehingga fraksi ini mengandung

senyawa xanthone .

Fraksi 9

Pada fraksi ini menggunakan pelarut polar (20:80) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat

polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat polar. Fraksi ini

berwarna kuning muda , dan saat di KLT terdapat 2 bercak dengan nilai rf 0,7375 dan 0,5 ,

setelah di semprotkan dengan AlCl3 terdapat bercak yang berflorosensi berwarna coklat di

nilai rf 0,7375 . sehingga fraksi ini mengandung senyawa xanthone .

Fraksi 10

Pada fraksi ini menggunakan pelarut polar (10:90) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat

polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat polar. Fraksi ini

berwarna kuning muda , dan saat di KLT terdapat 2 bercak dengan nilai rf 0,725 dan 0,4625,

setelah di semprotkan dengan AlCl3 terdapat bercak yang berflorosensi berwarna coklat di

nilai rf 0,725 . sehingga fraksi ini mengandung senyawa xanthone .

Fraksi 11

Pada fraksi ini menggunakan pelarut polar (100:0) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat

polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat polar. Fraksi ini

berwarna kuning muda , dan saat di KLT terdapat 1 bercak dengan nilai rf 0,3625 setelah di

semprotkan dengan AlCl3 tidak terdapat bercak yang berflorosensi berwarna coklat. sehingga

fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone .

Page 12: KCV

Setelah dilakukan optimasi , di KLT lagi menggunakan perbandingan pelarut 7:3 (n-

heksan:etil asetat ) agar nilai rf yang dihasil kan berkisar 0,2-0,3 yang akan di gunakan untuk

isolasi senyawa menggunakan kolom .

RfPengamatan

Sinar Tampak UV 254 UV 366 AlCl3

0,283 Ada Ungu Coklat Kuning