1
ANALISA DNA
I. PENDAHULUAN
Analisis DNA banyak digunakan untuk karakterisasi sifat
genetik pada level molekuler yang secara langsung mencerminkan
sifat genotipe (materi genetik) yang dimiliki oleh organisme
tertentu. Analisa pada level ini, jauh lebih akurat dibanding dengan
analisa fenotipe (morfometrik) karena ciri fenotipe merupakan hasil
interaksi antara genotipe dengan lingkungan. Dengan kata lain,
interpretasi hasil analisa fenotipe tidak persis mencerminkan
genotipe yang dimiliki oleh organisme tertentu.
Aplikasi analisis DNA antara lain penentuan marker (penanda)
dalam mengukur hubungan kekerabatan antar kelompok ikan
dalam populasi, baik yang di alam maupun di lingkungan budidaya,
studi taksonomi, genetika populasi, dan diagnosa penyakit.
Penggunaan marker pada level DNA memiliki beberapa kelebihan
yaitu tidak dipengaruhi oleh lingkungan dan faktor pertumbuhan,
lebih sensitif, hampir semua jaringan dapat digunakan sebagai
sumber material genetik dan dapat digunakan dalam jangka waktu
yang relatif lebih lama. Sedangkan kelemahannya adalah prosedur
yang cukup rumit dan mahalnya biaya analisa.
Prosedur analisa DNA diawali dengan mengekstraksi genom
DNA dari sumber sel yang diikuti dengan proses isolasi sekuen
DNA tertentu. Seperti yang diutarakan oleh Lewin (1994), bahwa
langkah awal dalam menganalisa DNA adalah memecahkan genom
DNA menjadi fragmen-fragmen spesifik yang berukuran lebih kecil.
Ekstraksi DNA dilakukan untuk memisahkan genom DNA dari
molekul-molekul lain di dalam suatu jaringan yang dilarutkan.
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational ProcedureDepartemen Budidaya Perairan 2011Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB
2
Karena secara alami, DNA adalah suatu molekul primer yang
keberadaannya selalu terkait denga RNA dan protein. Sedangkan
dalam menganalisa DNA yang diperlukan adalah DNA dalam
bentuk murni (Stine, 1973).
Langkah pertama dalam mengekstraksi DNA umumnya adalah
menghancurkan sel dan isolasi asam nukleat. Selanjutnya dilakukan
penghancuran inti sel sehingga DNA akan terlepas dan akan
menyebabkan viskositas larutan meningkat sehingga molekul DNA
terlihat lebih nyata. Langkah kedua adalah pemisahan DNA dari
bahan-bahan kontaminan seperti RNA dan protein.
Dalam ekstraksi DNA, jenis sumber sel yang digunakan ada
beberapa macam seperti hati, otot, sirip, darah dan sel hasil kultur.
Sedangkan kondisi sumber sel meliputi sumber sel segar, sumber
sel terfiksasi dan sumber sel beku.
II. BAHAN DAN ALAT
Bahan
1
. Jaringan ikan uji 7. Primer
2
. Cell lysis solution 8. Master mix PCR
3
.
Protein precipitation
solution9. Marker DNA
4
. RNase
1
0.1 x TBE
5
. Proteinase K
1
1. Etidium bromida
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational ProcedureDepartemen Budidaya Perairan 2011Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB
3
6
.
Ion Exchange
water/distilled water
Alat
1
. Inkubator
5
.Mesin PCR
2
. Tabung mikro
6
.Vortex
3
. Pipet mikro
7
.Satu set elektroforesis
4
. Sentrifuse
8
.UV illuminator
III. PROSEDUR KERJA
3.1. PROSEDUR EKTRAKSI DNA
Penghancuran sel (Cell lysis)
1. Semua peralatan yang akan digunakan dalam pembuatan
ekstraksi DNA diautoclave.
2. Sampel ikan ditimbang sebanyak 10 – 20 mg, lalu dimasukkan
ke dalam tabung mikro (1.5 ml).
3. Tambahkan 200 µl Cell Lysis Solution dan 1.5 µl Proteinase K
solution ke dalam tabung mikro.
4. Tabung berisi suspensi kemudian diinkubasi pada suhu 550C
selama 3 – 24 jam.
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational ProcedureDepartemen Budidaya Perairan 2011Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB
4
Gambar 5. Inkubasi jaringan dengan Dry Thermo Unit
Eliminasi RNA
1. 1,5 µl RNase (4 mg/ml) dimasukkan ke dalam setiap tabung lalu
diaduk dengan membolak-balikkan tabung sebanyak 25 kali.
Kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 30 – 60 menit.
2. Setelah inkubasi selesai, dinginkan sampel sampai mencapai
kondisi suhu ruang.
Pengendapan Protein
1. 200 µl Protein Precipitation Solution ke dalam larutan sampel
lalu divortex pada kecepatan tinggi selama 20 detik.
2. Inkubasi sampel on ice selama 10 - 15 menit.
3. Kemudian sampel disentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm
selama 10 menit hingga terbentuk endapan protein dan larutan
yang mengandung DNA.
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational ProcedureDepartemen Budidaya Perairan 2011Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB
5
Gambar 6. Sentrifuse
Pengendapan DNA
1. Larutan supernatan yang terbentuk dituangkan dengan hati-hati
ke dalam tabung baru yang telah berisi 600 µl Larutan
Isopropanol 100%.
2. Tabung yang berisi larutan DNA ini kemudian diaduk dengan
membolak-balikkan tabung sebanyak 50 kali hingga terlihat
untaian pita DNA yang berwarna putih.
3. Kemudian tabung tersebut disentrifuse dengan kecepatan
12.000 rpm selama 10 menit hingga terbentuk pelet DNA di
dasar tabung.
4. Larutan supernatan dibuang.
5. 300 µl Larutan Etanol 70% dingin, kemudian dimasukkan ke
dalam tabung yang berisi pelet DNA. Lalu tabung dibolak-balik
beberapa kali untuk membilas sisa-sisa DNA yang berada di
dinding tabung.
6. Tabung disentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm selama 10
menit.
7. Kemudian larutan etanol dibuang dengan hati-hati, lalu tabung
dikeringkan diatas kertas tissue dan dibiarkan kering udara
selama 30 menit.
8. Pelet DNA yang terbentuk dilarutkan kembali dengan
menambahkan 30-50 µl akuades steril (SDW) ke dalam tabung.
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational ProcedureDepartemen Budidaya Perairan 2011Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB
6
9. Kemudian larutan DNA disimpan dalam freezer (-20°C) atau
langsung digunakan untuk proses selanjutnya.
Pemurnian DNA
1. Ambil 20 µl sampel DNA dan masukkan ke dalam tabung mikro
(0.6 ml)
2. Kemudian tambahkan 20 µl larutan Phenol/Chloroform mix (1:1)
3. Larutan di vortex dan di inkubasi pada suhu ruang selama 5
menit sampai tebentuk 3 lapisan
4. Ambil lapisan atas (larutan DNA) dengan sangat hati-hati dan
pindahkan ke tabung yang baru.
5. Tambahkan 2 µl NaOAC (3M pH 5.2) kedalam tabung mikro
berisi DNA.
6. Tambahkan 60 µl Etanol absolut dan campuran larutan divortex.
7. Kemudian di inkubasi di dalam freezer -80°C selama 15 menit.
Gambar 7. Tiga lapisan yang terbentuk setelah inkubasi
8. Sentrifuse tabung pada kecepatan 12.000 rpm selama 30 menit
9. Buang supernatant, kemudian cuci pellet DNA dengan 20 µl
Etanol 70%.
10.Sentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.
10.Kemudian larutan etanol dibuang dengan hati-hati, lalu tabung
dikeringkan diatas kertas tissue dan dibiarkan kering udara
selama 30 menit.
11.Pelet DNA yang terbentuk dilarutkan kembali dengan
menambahkan 10 µl akuades steril (SDW) ke dalam tabung.
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational ProcedureDepartemen Budidaya Perairan 2011Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB
7
12.Kemudian larutan DNA disimpan dalam freezer (-20°C) atau
langsung digunakan untuk proses selanjutnya.
3.2. PROSEDUR PENGUKURAN KONSENTRASI DNA DAN
RNA
1. Larutan DNA diencerkan terlebih dahulu 80 kali dengan SDW
(RNA dengan DEPC) dengan volume akhir 100.
2. Alat Gene Quant dinyalakan, dan kuvet dikeluarkan dari tempat
penyimpanan lalu dibilas dengan akuades.
3. Kalibrasi dilakukan dengan mengukur absorbansi pelarut (SDW
untuk DNA dan DEPC untuk RNA), dengan memasukkan 80 µl
pelarut tersebut ke dalam kuvet. Kemudian kuvet dimasukkan
ke dalam alat, lalu tekan tombol “set ref”, hasil pembacaan akan
menunjukkan nilai absorbansi 0.000. Dilanjutkan dengan
pengukuran konsentrasi DNA atau RNA.
4. Kuvet yang akan digunakan, dibilas terlebih dahulu dengan
akudes. Setelah itu larutan asam nukleat yang akan diukur
dimasukkan ke dalam kuvet sebanyak 80 µl dan kuvet
ditempatkan di dalam alat.
5. Setelah tombol “sample” ditekan dan konsentrasi larutan sudah
terbaca, kuvet dikeluarkan dan dibilas dengan akuades.
Gambar 8. Gene Quant
3.3. PROSEDUR PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational ProcedureDepartemen Budidaya Perairan 2011Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB
8
a. Preparasi sampel dapat dilakukan dengan beberapa cara sesuai
dengan Taq Polymerase yang digunakan :
Menggunakan ExTaq Polymerase
1. Pembuatan larutan premix yang terdiri dari :
Bahan Jumlah
10 x Buffer Ex
Taq
1.00 l x jumlah sampel
+ 1
DNTP1.00 l x jumlah sampel
+ 1
Primer
Forward 1.00 l x jumlah sampel
+ 1
Reverse1.00 l x jumlah sampel
+ 1
Ex Taq0.05 l x jumlah sampel +
1
SDW4.95 l x jumlah sampel +
1
2. Larutan premix dibagi ke dalam masing–masing mikrotube
sebanyak 9 l.
3. Masukkan masing–masing sampel DNA sebanyak 1 l
sehingga volume akhir tiap mikrotube adalah 10 l.
Menggunakan Pure Taq Ready-To-Go- PCR Beads
Tambahkan pada tube yang berisi PCR Beads masing-masing
bahan berisi berikut ini, hingga volume akhir setiap mikrotube
adalah 25 l.
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational ProcedureDepartemen Budidaya Perairan 2011Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB
9
Sampel DNA 2 l
Primer
Forward
2 l
Primer
Reverse
2 l
SDW 19 l
Total Volume 25 l
Menggunakan My PCR KIT 1 (Vivantis)
1. Pembuatan premix
Bahan Jumlah
2 x Taq Master
Mix
5.00 l x jumlah sampel
+ 1
MgCl2
0.50 l x jumlah sampel
+ 1
Primer
Forward 1.00 l x jumlah sampel
+ 1
Reverse1.00 l x jumlah sampel
+ 1
SDW1.5 l x jumlah sampel +
1
2. Larutan premix dibagi ke dalam masing–masing mikrotube
sebanyak 9 l.
3. Masukkan masing–masing sampel DNA sebanyak 1 l
sehingga volume akhir tiap mikrotube adalah 10 l.
b. Masukkan masing-masing mikrotube ke dalam mesin PCR yang
telah diprogram sebagai berikut :
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational ProcedureDepartemen Budidaya Perairan 2011Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB
10
ProsesSuhu Lama Waktu Siklu
s
Denaturasi
awal
940C 3 menit 1
Siklus PCR :
Denaturasi
Annealing
Extension
940C
590C
720C
30 detik
30 detik
30 detik
30
Final
ekstension
720C 3 menit 1
Note : Program PCR dapat berubah sesuai DNA yang akan
dianalisa. Suhu annealing disesuaikan dengan sekuen
primer yang digunakan.
Setelah proses PCR selesai mesin dimatikan dan hasil PCR
disimpan di dalam freezer -200C untuk selanjutnya dapat
dielektroforesis.
Gambar 9. Mesin PCR
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational ProcedureDepartemen Budidaya Perairan 2011Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB
11
PEMOTONGAN DNA DENGAN ENZIM RESTRIKSI
Pemotongan mtDNA dengan enzim restriksi dilakukan dengan
cara mencampurkan bahan-bahan berikut :
Buffer enzim 1 l
Enzim 1 l
Hasil PCR 2 l
SDW 6 l
Volume Akhir 10 l
Kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 1- 3 jam. Hasil
pemotongan dengan enzim restriksi ini dapat langsung dilihat
dengan elektroforesis.\
Contoh jenis – jenis enzim dan situs pemotongannya.
No
.Nama Sumber
Situs
Pemotongan
1 Hinf I Haemophilus
influenza Rf
G A N T C
C T N A G
2 Hae III Haemophilus
aegyptius
G G C C
C C G G
3 Alu I Arthrobacter luteus A G C T
T C G A
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational ProcedureDepartemen Budidaya Perairan 2011Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB
12
4 Mbo I Moraxella bovis sp. G A T C
C T A G
5 Cfr 13 I Citobacter freundii
RFL 13
G G N C C
C C N G
G
PROSEDUR ELEKTROFORESIS
Proses elektroforesis dimulai dengan pembuatan gel agarose yang
kepekatannya disesuaikan dengan sample yang akan dicek, yaitu
sebagai berikut :
No
.Ukuran DNA
Konsentrasi
Gel
1 0.8 – 10 kb 0.7%
2 0.5 – 7 kb 0.9%
3 0.4 – 6 kb 1.2%
4. 0.2 – 4 kb 1.5%
5. 0.1 – 2 kb 2%
Cara pembuatan gel agarose :
1. Larutkan serbuk agarose dalam larutan 1 x Tris Borate EDTA
(TBE) yang mengandung Ethidium Bromide (30 l/1 liter TBE).
2. Panaskan dalam microwave selama 1.5 menit atau larutan
sampai menjadi bening.
3. Larutan dibiarkan sampai hangat kemudian dituangkan ke
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational ProcedureDepartemen Budidaya Perairan 2011Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB
13
dalam cetakan (Ganbar 10A) yang telah dilengkapi sisir/comb
sebagai cetakan sumur/well elektroforesis.
4. Gel dibiarkan membeku, kemudian dimasukkan kedalam bak
elektroforesis (Gambar 10B) yang telah berisi larutan buffer
elektroforesis.
Prosedur Elektroforesis :
1. 3 l volume sampel yang akan di cek dicampur dengan 0.5 l
loading buffer yang mengandung bahan pemberat DNA dan
pewarna (Bromophenol Blue).
2. Campuran dimasukkan ke dalam sumur-sumur elektroforesis.
3. Bak elektroforesis ditutup dan lisrik dialirkan dengan tegangan
200 volt dan kuat arus 60 – 100 mA.
4. Setelah DNA bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif
mencapai ¾ bagian dari panjang gel, maka proses elektroforesis
dapat dihentikan.
5. Gel diangkat dari bak elektroforesis dan dilepaskan dari cetakan
untuk selanjutnya diamati dengan menggunakan ultraviolet
transluminator (Gambar 10C) dengan panjang gelombang
pendek (280 nm).
6. Contoh-contoh hasil elektroforesis dapat dilihat pada gambar
11, 12, dan 13.
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational ProcedureDepartemen Budidaya Perairan 2011Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB
14
1
2
A B
C
Gambar 10. Seperangkat alat elektoforesis, A= Cetakan agarosa,
1= Sumur dan 2= Cetakan sumur, B= Bak
Elektroforesis, C= Ultraviolet Illuminator
Gambar 10. Hasil Elektroforesis DNA β_Actin Ikan Zebra (M =
Marker GeneRulerTM 1kb DNA Ladder, No.1-5= Sampel
ikan zebra, = DNA β_Actin ukuran 200 bp)
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational ProcedureDepartemen Budidaya Perairan 2011Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB
15
Gambar 11. Hasil elektroforesis gen glikoprotein KHV (M = Marker
2-Log DNA Ladder (0.1-10.o kb, = DNA β_Actin ukuran
400 bp)
Gambar 12. Hasil elektroforesis RAPD PCR ikan gurame
(Osprhonemus gouramy)
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik Standard Operational ProcedureDepartemen Budidaya Perairan 2011Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan - IPB