ISOLASI ISOLASI
DAN DAN
PEMISAHAN PROTEINPEMISAHAN PROTEIN
Pendahuluan
Protein adalah molekul organik yang terbanyak di dalam sel. Lebih dari 50% berat kering
sel terdiri atas protein. Selain itu, protein adalah biomolekul yang sesungguhnya,
karena senyawa ini yang menjalankan berbagai fungsi dasar kehidupan, antara lain
proses berkontraksi melakukan gerak, menjalankan berbagai proses metabolisme dalam
bentuk enzim. Protein dapat pula berperan membawa informasi dari luar ke dalam sel dan
di dalam bagian-bagian sel sendiri. Protein juga mengendalikan dapat tidaknya, serta
waktu yang tepat untuk pengungkapan informasi yang terkandung di dalam DNA, yang
diperlukan untuk sintesis protein itu sendiri. Jadi secara tidak langsung protein mengatur
perbanyakan diri sendiri dengan mengatur DNA, yang merupakan alat perekam informasi
untuk protein, sehingga dengan demikian operasinya di bawah kendali protein.
Secara kimia, protein adalah heteropolimer dari asam-asam amino, yang terikat satu
sama lain dengan ikatan peptida. Ada suatu universalisme di dalam molekul protein.
Protein apapun dan berasal dari makhluk apapun juga ternyata hanya tersusun dari
20 macam asam amino saja. Perbedaan protein yang satu dengan yang lain disebabkan
oleh jumlah dan kedudukan asam-asam amino tersebut di dalam tiap-tiap molekul. Kedua
puluh asam-amino itu mempunyai ciri umum sebagai berikut. Pertama, semuanya
mempunyai konfigurasi L. Kedua, sama-sama mempunyai 1 gugus COOH dan 1 gugus
NH2 yang terikat ke atom C. Perbedaan individual dari asam-asam amino ini disebabkan
oleh perbedaan rantai samping. Yang menyebabkan perbedaan kimia antara asam-asam
amino tersebut, pada gilirannya akan menyebabkan perbedaan sifat kimia dan biologis dari
molekul protein yang disusunnya. Rantai samping R ini tidak ikut membentuk ikatan
peptida. Muatan suatu protein dalam suatu larutan ditentukan oleh gugus NH2 bebas di
suatu ujung dan gugus COOH bebas di ujung yang lain serta jumlah rantai yang
bermuatan.
Molekul protein, melalui ikatan hidrogen, berinteraksi dengan molekul air membentuk
mantel air. Karena molekulnya besar, di dalam air protein membentuk larutan koloid.
Adanya sejumlah elektrolit dengan konsentrasi encer sanat meningkatkan kelarutan suatu
protein (salting in). Sifat ini, yaitu kelarutan dalam bentuk larutan koloid yang dipermudah
oleh mantel air dan elektrolit encer, dimanfaatkan untuk pemisahan protein. Selain itu, sifat
lain, yaitu ukuran molekul yang berbeda sebagai akibat dari jumlah asam amino yang
menyusun dan muatan yang tidak sama antar protein yang satu dengan yang lain karena
perbedaan jenis asam amino yang menyusunnya, menjadi dasar dari pemisahan protein
yang akan dilakukan pada praktikum berikut ini.
Tujuan Praktikum :
1. Mengenal reaksi umum berdasarkan adanya beberapa ikatan peptida pada suatu
protein dan mampu menggunakannya untuk melacak protein dalam suatu bahan
2. Melakukan pemisahan suatu protein dari kelompok protein lain secara reversibel
dengan menggunakan larutan garam divalen konsentrasi tinggi (salting out) dan
menerangkan mekanisme pemisahan tersebut.
3. Melakukan pemisahan protein secara reversibel, dengan menggunakan bahan
higroskopis dan menerangkan mekanisme pemisahan tersebut.
4. Melakukan pemisahan protein secara denaturasi ireversibel dengan menggunakan
pereaksi alkaloid, menerangkan mekanisme kerjanya dan mampu menggunakan
untuk melacak protein.
5. Memperlihatkan kemampuan logam berat dalam mengendapkan dan mendenaturasi
protein dan menjelaskan masalah yang ditimbulkan oleh logam berat sebagai
pencemar lingkungan.
6. Mengetahui cara pemisahan suatu protein dari protein lain ataupun senyawa lain,
berdasarkan perbedaan berat molekul, dengan menggunakan cara kromatografi gel
penyaring molekul sederhana.
Percobaan Protein
1. Uji Biuret
Tujuan :
Memperlihatkan bahwa protein mempunyai ikatan peptida yang bereaksi positif dengan uji
biuret. Reaksi ini tidak terjadi pada makromolekul lain.
Dasar :
Ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein dan polipeptida, dalam larutan bersuasana
alkali akan berwarna lembayung bila direaksikan dengan Cu++.
Bahan dan Pereaksi :
1. Larutan albumin atau putih telur
2. Air liur
3. Larutan pati 1%
4. Human serum
5. Aquades
6. NaOH 10%
7. Larutan CuSO4 0,1%
Cara Kerja dan Hasil :
Menyiapkan 5 tabung reaksi yang bersih. Mempipetkan ke dalam tabung reaksi, seperti
pada tabel 1.
Tabel 1. Prosedur Reaksi biuret
Tabung 1 2 3 4 5
Larutan albumin
(putih telur)
1 mL - - - -
Air liur - 1 mL - - -
Larutan pati - 1 mL - -
Air suling - - - 1 mL -
Serum sapi - - - - 1ml
NaOH 10% 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1ml
Larutan CuSO4 * 1 tetes 1 tetes 1 tetes 1 tetes 1 tetes
Warna lembayung Ya Ya Tidak Tidak Ya
* Bila belum terbentuk warna lembayung, CuSO4 dapat ditambahkan lagi, sampai 10 tetes.
Kesimpulan :
Dari hasil percobaan di atas menunjukkan bahwa yang membentuk warna lembayung/ungu adalah tabung yang berisi larutan albumin (putih telur), air liur, dan serum sapi. Protein akan bereaksi positif pada uji biuret karena protein mengandung ikatan peptida. Ikatan peptida akan bereaksi dengan Cu++ dan menghasilkan warna lembayung (ungu) dalam suasana alkali. Dari percobaan diatas dapat disimpulkan bahwa larutan albumin dan air liur mengandung protein, sedangkan larutan pati dan air suling tidak mengandung protein.
Jawaban Pertanyaan :
1. Apakah uji ini akan positif untuk asam amino?
=Ya, uji ini akan positif terhadap asam amino yang mengandung protein dengan
memiliki ikatan peptida.
2. Asam amino apa saja yang menyusun protein?
=Asam amino yang menyusun protein antara lain : Glisin, Alanin, Valin, Leusin,
Isoleusin, Fenilalanin, Metionin, Prolin, Triptofan, Serin, Treonin, Tirosin,
Asparagin, Glutamin, Sistein, Aspartat, Glutamat, Arginin, Lisin, Histidin.
3. Bagaimana pengelompokan asam amino?
=Pengelompokan asam amino adalah: Asam amino dengan gugus R nonpolar,
Asam amino dengan gugus polar R netral, Asam amino dengan gugus R
bermuatan,yang terdapat dalam pengelompokan Simple dan Conjugated.
4. Apa yang dimaksud dengan asam amino essensial? Asam amino apa saja yang
essensial?
=Asam Amino esensial adalah asam amino yang dibutuhkan oleh tubuh tapi tidak
diproduksi oleh tubuh. Contohnya : Arginin, Histidin, Isoleusin, Methionin,
Phenylalanine, Threonin, Triptofan, Valin, Leusin. Sedangkan asam amino non
esensial adalah asam amino yang tidak begitu dibutuhkan oleh tubuh.
Contohnya : Hydroxiproline, Hydroxilisine, Glysine, Proline, Serin, Tyrosin,
Aspargin, Glutamat, Glisin, Cystein, Alanine.
5. Gambarkan ikatan peptida!
O O
H2N CH-C H CH C OH
N R2
Residu N R1 Residu C
Ikatan peptida
2. Pengendapan Protein Dengan Larutan Garam
Konsentrasi Tinggi (Salting Out)
Tujuan :
Memperlihatkan bahwa sebagai makromolekul yang larut dalam bentuk larutan koloid,
protein dapat dipisahkan satu dari yang lain, dengan menggunakan larutan garam divalent
konsentrasi tinggi.
Dasar :
Untuk larutan dalam air, suatu molekul harus dapat berinteraksi dengan molekul air
dengan cara membentuk ikatan hidrogen sehingga molekul tersebut tersebar rata
diantara molekul-molekul air. Adanya muatan listrik pada molekul terlarut sangat
membantu kelarutan, karena muatan yang sama saling menjauhi, sehingga agregasi
molekul tidak terjadi.
Protein merupakan makromolekul karena memiliki BM (berat molekul) besar. Pada
umumnya,protein mudah larut dalam air karena protein mempunyai kedua sifat berikut.
Gugus -CO- dan –NH- yang ada pada iktan peptida dapat berinteraksi dengan molekul air
melalui ikatan hidrogen, sedangkan berbagai rantai samping, yang diantaranya ada yang
hidrofilik,bahkan juga bermuatan, sangat mudah berinteraksi dengan molekul air. Selain
itu, muatan listrik yang sama dalam 2 partikel molekul protein yang sama, akan bertolakan,
sehingga membantu meningkatkan kelarutan protein (salting in).
Setiap keadaan yang menyebabkan ditariknya air yang mengelilingi molekul protein,
sangat mengurangi kelarutan protein, sehingga protein mengendap. Larutan garam
berkonsentrasi tinggi bersifat demikian. Selain itu, larutan garam berkonsentrasi tinggi
akan menetralkan muatan listrik, sehingga kelarutan akan makin berkurang.
Oleh karena pengendapan dengan cara ini hanya bersifat menarik air di sekeliling protein,
sedangkan molekul protein sendiri tidak mengalami perubahan kimia, maka perubahan
tersebut bersifat reversible. Kelarutan dan fungsi protein pada umumnya akan pulih
kembali bila dikembalikan ke keadaan semula.
Larutan garam divalent lebih efisien dalam mengendapkan protein, karena di dalam air
garam tersebut akan berdisosiasi menjadi 3 ion, yang masing-masing berinteraksi
sempurna dengan air. Sebagai contoh, globulin dapat diendapkan oleh (NH4)2SO4
setengah jenuh, sedangkan NaCl baru dapat mengendapkan protein tersebut bila berada
dalam larutan jenuh. Albumin, yang baru akan mengendap oleh (NH4)2SO4 jenuh, tidak
dapat diendapkan oleh NaCl jenuh, kecuali dengan penambahan asam mineral dalam
jumlah yang sangat kecil. Pada gambar 2.1 diperlihatkan mekanisme terjadinya
pengendapan protein oleh garam dalam konsentrasi tinggi.
H O H O H H H H O O O
R- R- O H H
N C N C C + (NH4)2SO4
NH3+ R+ O Protein terlarut
NH3+ COO-
COO- NH3+
NH3+ COO-
COO- NH3+
Protein beragregasi / mengendap
Gambar 1. Pengendapan Protein Dengan Cara Salting Out
Bahan dan Pereaksi :
1. Serum sapi
2. Larutan ammonium sulfat (NH4)2SO4 jenuh dan1/2 jenuh
3. Larutan NaOH 10%
4. Larutan CuSO4 0,1%
5. Kertas saring+ corong
Cara Kerja dan Hasil :
Menyiapkan 3 tabung reaksi yang bersih dan kering. Melakukan prosedur seperti yang
tertera dalam tabel 2 :
Tabel 2. Percobaan salting out
Tabung 1
Serum sapi 1 ml
Amonium sulfat jenuh : tetes demi tetes 1 ml
Endapan : ada / tidak ada Ada endapan
Amonium sulfat ½ jenuh: tetes demi tetes* 1ml
Endapan: ada / tidak ada Ada endapan
Pisahkan endapan dengan menyaring
Lakukan uji biuret terhadap:
Filtrat Amonium sulfat jenuh
Endapan Amonium sulfat jenuh
Filtrat Amonium sulfat 1/2 jenuh
Endapan Amonium sulfat 1/2 jenuh
- (tidak berwarna lembayung)
+ (warna lembayung)
+ (warna lembayung)
+ (warna lembayung)
* Amonium sulfat ½ jenuh dibuat dengan cara mengencerkan Amonium sulfat jenuh dan
aquades dengan perbandingan 1:1
*Amonium sulfat jenuh warna biru muda
*Amonium sulfat ½ jenuh warna ungu/lembayung
Kesimpulan :
Protein dapat diendapkan dengan menggunakan garam konsentrasi tinggi melalui proses
salting out. Dengan penambahan ammonium sulfat yang jenuh akan mengendapkan serum
sapi sehingga larutan menjadi bersifat reversibel. Hal ini dikarenakan garam berdivalent
tinggi lebih kuat menarik mantel air daripada protein dalam serum.
Serum mengandung 2 jenis protein, yaitu globulin dan albumin. Setelah
penambahan ammonium sulfat jenuh, ternyata terbentuk endapan. Dan setelah
diuji dengan biuret, baik filtrat maupun endapan yang dihasilkan, sama-sama
terbentuk warna ungu. Jadi, endapan yang dihasilkan adalah albumin, sedangkan
filtrat adalah globulin, karena albumin akan mengendap pada penambahan
ammonium sulfat jenuh.
Jawaban Pertanyaan :
1. Pada penambahana satu volume ammonium sulfat jenuh ke dalam satu volum serum
terjadi pengendapan protein. Apakah nama protein tersebut?
= Protein yang mengendap pada penambahan satu volume amonium sulfat jenuh
ke dalam satu volume serum adalah protein Albumin.
2. Apa nama protein serum yang tidak dapat diendapkan pada penambahan ammonium
sulfat jenuh tersebut?
= Yang tidak dapat diendapkan pada percobaan tersebut adalah Globulin.
3. Apa fungsi protein dalam darah dan di mana disintesis?
= Fungsi Albumin adalah mengikat Ligand, albumin disintesis di hati. Fungsi
Protein dalam darah = sebagai transport dan storage. Contoh : CO2 dan O2
dalam darah / eritrosit.
4. Pada keadaan apa saja terjadi defisiensi protein tersebut dan apa gejala utamanya?
= Alkaptonuria, defisiensi enzim homogentisic acid dioxygenase.Ditandai dengan
perubahan warna urine yang menjadi gelap kalau didiamkan.
3. Pemisahan Protein Dengan Etanol
Absolut
Tujuan :
Memperlihatkan, bahwa sebagai makromolekul yang larut, protein dapat dipisahkan
dengan mengendapkannya dengan penambahan etanol absolut.
Dasar :
Etanol absolut bersifat sangat kuat menarik air (higroskopis). Penambahan etanol absolut
pada suatu larutan protein, akan menyebabkan molekul air yang berinteraksi dengan
molekul protein melalui ikatan hidrogen ditarik oleh etanol. Akibatnya molekul-molekul
protein beragregasi satu sama lain sehingga mengendap. Bila agregat partikel protein
tersebut dibiarkan bersentuhan dengan etanol untuk waktu yang lama endapan yang
terbentuk tidak dapat dilarutkan lagi sehingga denaturasi yang terjadi irreversibel.
Dengan menggunakan etanol berbagai konsentrasi dan suhu yang rendah, Cohn
pada tahun empat puluhan telah berhasil memisahkan protein serum dalam 5 fraksi, dan
fraksi V yang diperoleh sebagian besar terdiri atas albumin.
Protein tidak dapat mengendap disebabkan oleh karena protein tersebut memiliki
muatan listrik, gerak Brown, dan mantel air yang mempengaruhi pengendapan protein
tersebut dalam larutan tertentu.
Bahan dan Pereaksi :
1) Serum
2) Larutan albumin telur
3) Etanol absolut
4) Larutan NaOH encer
5) Larutan CuSO4
6) Kertas saring dan corong
Cara Kerja dan Hasil :
Menyiapkan 3 tabung reaksi yang bersih dan kering. Lakukan prosedur yang tertera pada
tabel 3 :
Tabel 3. Percobaan Pengendapan Protein Dengan Etanol Absolut
Tabung 1 2
Serum 1 ml -
Larutan albumin telur - 1 ml
Etanol absolut 1 ml 1 ml
Endapan: ada/tidak ada Ada endapan Ada endapan
Pisahkan endapan dengan menyaring
Uji biuret terhadap:
Filtrat
Endapan
-
+
-
+
Kesimpulan :
Protein dapat dipisahkan dengan mengendapkannya dengan penambahan etanol absolut.
Kemudian dipisahkan antara endapan dan supernatan, lalu dites biuret tetap memberikan
hasil positif. Demikian juga serum dan etanol absolut, ditandai dengan warna ungu.
Jawaban Pertanyaan :
1. Sebutkan secara garis besar protein utama dari fraksi Cohn I sampai V.
Fraksi I : Fibrinogen α,β,γ
Fraksi II : β,γ- Globulin (Antibodi)
Fraksi III : α+A, β1, γ+β2- Globulin (Kolesterol, Fosfatida, Karotenoid,
VitaminA, Estrogen ), Isoaglutinin
Fraksi IV : β1,α2, α1, Α, β, α2, α+Α (Kolesterol, Fosfatida, Fosfatase,
Esterase serum, Hipertensinogen )
Fraksi V : Albumin
2. Apakah fungsi tiap-tiap protein tersebut?
Fraksi I banyak berperan dalam koagulasi darah
Fraksi II berperan sebagai Imunitas
Fraksi III dan IV berperan sebagai Lipoprotein
Fraksi V yaitu Albumin yang merupakan bagian terbesar dari elektroforesis ini
berfungsi sebagai zat yang mempertahankan volume plasma(mencegah shock,
Hipoproteinemia dan Odem)
4. Pengendapan Protein Secara
Denaturasi Ireversibel
Pengendapan protein dengan
logam berat
Tujuan :
Memperlihatkan, bahwa logam berat mengendapkan protein secara denaturasi ireversibel.
Dasar :
Logam berat akan mendenaturasikan dan mengendapkan protein. Peristiwa itu terjadi, bila
berbagai gugus di permukaan molekul protein bermuatan negatif, sehingga membentuk
garam dengan kation logam berat. Jumlah protein yang diendapkan sebanding dengan
jumlah logam berat yang ditambahkan. Makin banyak logam berat yang ditambahkan,
makin banyak protein yang mengendap, selama dalam larutan masih terdapat protein.
Protein tertentu memerlukan penambahan beberapa tetes alkali supaya protein tersebut
bermuatan negatif. Selain itu, kelebihan logam berat dapat pula melarutkan kembali
kompleks logam berat-protein, walaupun protein tersebut tetap dalam keadaan denaturasi.
“Protein bermuatan negatif membentuk garam dengan kation logam berat menjadikan
protein terdenaturasi dan mengendap.”
Bahan dan Pereaksi :
1. Putih telur( albumin)
2. larutan HgCl2 1%
3. Larutan Pb-asetat
4. Serum sapi
Cara kerja dan Hasil :
Siapkan dua buah tabung reaksi, lakukan prosedur yang tertera dalam tabel 4.
Tabel 4.B.
Pengendapan Protein Dengan logam Berat
Tabung 1 2 3 4
Putih telur (Albumin) 1 ml 1ml - -
Serum sapi - - 1ml 1ml
HgCl2 Tetes - tetes - Tetes - tetes
Pb-asetat - Tetes - tetes - Tetes - tetes
Endapan ada/tidak ada Ada Ada Ada Ada
Kesimpulan :
Pada percobaan di atas diketahui bahwa logam berat seperti HgCl2 dan Pb-asetat dapat mengendapkan albumin. Ini berarti protein terdapat pada albumin.
Jawaban Pertanyaan :
1. Apakah tiap kali penambahan logam berat diikuti oleh penambahan endapan
protein? Mengapa?
Ya, pada tiap kali penambahan logam berat selalu diikuti oleh penambahan
endapan protein. Hal ini dikarenakan logam berat mempunyai sifat
pendenaturasi protein dan kandungan kation logam berat akan bereaksi
dengan molekul yang bermuatan negatif yang dapat memicu pembentukan
endapan pada protein.
2. Berapa tetes setiap logam diperlukan untuk mengendapkan protein di kedua bahan
tersebut?
Masing-masing dibutuhkan 5 tetes untuk proses pengendapan kedua
kation.
3. Sebutkan logam-logam berat yang menjadi pencemar utama lingkungan, sumber
pencemaran dan jelaskan mengapa logam tersebut berbahaya. Sebutkan nama suatu
penyakit berbahaya yang terkenal yang diambil dari suatu nama teluk di Jepang,
yang disebabkan oleh keracunan logam berat. Logam berat apakah yang menjadi
penyebab dan jelaskan bagaimana logam tersebut meracuni manusia?
Logam berat yang menjadi pencemar utama lingkungan adalah Pb dan
sumber pencemaran berasal dari asap kendaraan bermotor. Logam berat ini
dapat membahayakan sirkulasi pernafasan, sehingga terjadi infeksi saluran
pernafasan.
Cystinuria. Ekskresi sistin dalam urine meningkat (bisa mencapai 30 x
nilai normalnya). Ekskresi Lysine, Arginine dan Gangguan
reabsorpsi asam amino dari
Maple Syrup Urine Disease
4. Apakah yang perlu dilakukan ,bila terjadi keracunan logam berat yang akut?
Sebutkan pula apakah yang perlu dilakukan bila terjadi pemaparan kronis. Berilah
contoh nyata pemaparan kronis.
Hal yang dapat dilakukan bila terjadi keracunan logam berat yang akut
adalah dengan meminum susu untuk menetralisirnya.
LAPORAN PRAKTIKUM
BIOKIMIA IV
ISOLASI DAN PEMISAHAN PROTEIN
Disusun Oleh :
AYU KARTIKA SARI (405080161)
ANGELA KRISTIANA INTAN (405080162)
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS TARUMANAGARA
2008
Top Related