ISOLASI PROTEIN DAN WESTERN BLOTING
-
Upload
keke-awaliyah-awaliyah -
Category
Science
-
view
329 -
download
3
Transcript of ISOLASI PROTEIN DAN WESTERN BLOTING
ISOLASI PROTEIN DAN WESTERN BLOT
KELOMPOK 7 :1. AYU ANASTASYA (F1C1 13
086)2. NURSAN (F1C1 13
028)3. KEKE AWALIYAH (F1C1 13
020)4. RISNAWATI (F1C1 13 066) JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS HALU OLEOKENDARI2016
Pokok Bahasan1
Definisi Protein1
Sifat dan Jenis Protein
2
Definisi Westren Blot
Teknik Westren Blot
Teknik Isolasi Protein
3
4
5
Definisi Protein
Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida yang mengandung unsur-unsur C, H, O, N dan ada pula yang mengandung unsur S dan P.
Definisi Protein
Protein terletak didalam sel makhul hidup, terutama dalam membran sel baik itu pada sel hewan maupun pada sel tumbuhan.
Sifat – Sifat Protein
Mempunyai titik lebur besar dibanding senyawa karboksilat dan amina
1. Dalam larutan dapat membentuk ion zwitter
Mempunyai momen dipol besar
Bersifat amfoter
Bersifat elektrolit yaitu kurang basa dibanding amina dan kurang asam dibanding karboksilat
1
2
3
4
5 Mempunyai kurva titrasi yang khas6 Mempunyai pH isoelektrik yaitu pH pada saat asam amino tidak bermuatan7
Struktur Protein
Struktur Dasar Asam Amino
Protein intra seluler merupakan jenis protein yang di produksi dari dalam sel
Protein ekstra seluler merupakan jenis protein yang di produksi dari dalam sel dan kemudian dikeluarkan, sehingga protein tersebut berada di luar selcontohnya: enzim α-amilase pada bakteri
Tipe Protein Berlainan
Protein from cells or tissue
Microbial cells or tissue
Break cells, tissue, or organ
Blender, homogenizer, sonication,pressure,osmotic shock
Pellet with intact cells, organelles, membranes and membrane proteins
Supernatant withSoluble protein
Separated by centrifugationpurification
Choose a suitable clone INOCULATION in fermenter
ExtractionINTRACELLULAR
EXTRACELLULARDesiredcells
STEPS INVOLVED IN EXTRACTION OF PROTEINS
Isolasi Protein
Isolasi protein adalah suatu cara memisahkan protein dari makromolekul yang lain atau memisahkan protein dari protein lain yang tidak diinginkan.
Secara sederhana, proses dari isolasi protein konsepnya sama dengan isolasi DNA, hanya saja isolasi protein menggunakan buffer lysis untuk melisiskan sel.
Faktor-faktor yang mempengaruhi isolasi protein
SuhupHRadiasiPelarut Organik Ion LogamEnzim-enzimPerlakuan mekanisPenambahan garam
Isolasi Protein Intraseluler Secara Umum
Sel
Lisis
Sentrifugasi
Pelet Supernatan
Pelisisan Sel
Mekanik1
Kimiawi2
Metode Pelilisan Sel
Homogenisasi tingkat tinggiEkstruksi tekanan tinggi
Metode blendingPenggerusan
Sonikasi
Larutan bufferDetergenKelator
Inhibitor protease
Pelisisan Sel
PengerusanMekanik
1
Untuk memecah dinding sel dan memperluas permukaan sampel agar dapat mempermudah proses ekstraksi sehingga Interaksi antara sampel dan pelarut akan semakin luas.
Pelisisan Sel
Kimiawi2
Penambahan Larutan Buffer
Penambahan buffer ekstrak selama penggerusan bertujuan untuk mempertahankan agar kondisi komponen sel tetap optimum seperti keadaan yang sebenarnya dan tidak mengalami perubahan.
Pelisisan Sel
Kimiawi2
Detergen
P
O
O
O
OH2C
HC
O
H2C
O
CCO O
R R Fosfolipid
Penambahan detergen selama penggerusan bertujuan Untuk memecah membran sel yang penyusun utamanya fosfolipid sehingga akan terjadi reaksi saponifikasi antara fosfolipid dan detergen pada sel.
Pelisisan Sel
Kimiawi2
Klasifikasi Detergen
Detergen Ionik : dapat memecah interaksi protein-protein
a Detergen Nonionik : dapat memecah interaksi lipid-lipid dan interaksi lipid-protein
b
Pelisisan Sel
Kimiawi2
Kelotor
Penambahan kelator selama penggerusan bertujuan untuk menghilangkan ion-ion aktivator enzim protease. Misalkan EDTA dapat berperan sebagai chelating agent dalam isolasi protein. EDTA dapat mengkelat ion Ca2+ yang dapat berperan sebagai aktivator enzim protease.EDTA (Etilen Diamin Tetraasetat)
Pelisisan Sel
Kimiawi2
Inhibitor Protease
Enzim protease adalah enzim yang dapat memutuskan ikatan peptida antara asam amino satu dengan asam amino yang lain.
Untuk mencegah proses pemutusan ikatan peptida pada protein, yaitu dengan cara : Isolasi protein dilakukan pada temperatur rendah (4 oC) dan penambahan inhibitor seperti EDTA
Pada sel hewan, enzim protease berasal dari lisosom.
Sedangkan, pada sel tumbuhan enzim protease berasal dari
vakuola
Sebelum Sentrifuge
Ditambahkan Amonium Sulfat
NH4+
2S
O
O
O
O
Untuk presipitasi garam secara salting out, sehingga menyebabkan interaksi hidrophobik antar molekul protein. Interasi hidrophobik antar molekul protein akan mengakibatkan kelarutan protein menjadi rendah dan akan mengakibatkan penggumpalan, sehingga mudah dapat dipisahkan dengan sentrifuse. Penggunaan amonium sulfat lebih didasarkan pada sifat kelarutannya yang tinggi, tidak merusak struktur protein.
SentrifugePrinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas.
Supernatan
Pelet
Memiliki bobot lebih rendah
Memiliki bobot lebih tinggi
Siap untuk di deteksi
Pemurnian Protein
• Secara umum proses pemurnian protein dilakukan dengan menggunakan metode kromatografi kolom penukaran ion
Pemisahan dengan kromatografi penukar ion didasarkan atas interaksi muatan ionik yang berbeda dari komponen sampel terhadap sisi aktif muatan pada matrik penukar ion
Definisi Western Blot
W. Neal Burnette
1. Western blot adalah proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke membran
2. Membran ini dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga protein yang terblot pada membran dapat dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi
3. Deteksi ekspresi protein pada organisme dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder
TujuanWestern Blot
1. Mengetahui keberadaan & berat Molekul protein sampel pada campuran
2. Membandingkan reaksi silang antar protein
3. Mempelajari modifikasi protein selama sintesis
Teknik Western Blot
Elektroforesis1
Elektrotransfer2
Deteksi3
Pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul dalam suatu tegangan listrik tertentu
Pemindahan protein dari gel poliakrilamid menuju gel transfer menggunakan arus listrik sebagai faktor pendorong
Deteksi protein tersebut memanfaatkan interaksi antara antigen dan antibodi yang bersifat spesifik
Teknik Western Blot
Elektroforesis1. Dalam elektroforesis, sampel yang
mengandung protein biasanya dicampur dengan SDS (sodium dodecyl sulfat)
2. Muatan negatif SDS tersebut mengganggu kestabilan protein, sehingga protein mengalami denaturasi.
3. Suatu protein multimer juga akan terurai menjadi monomer penyusunnya
4. Sampel dengan protein rantai polipeptida lurus tersebut dimasukkan dalam suatu membran poliakrilamid yang dialiri arus listrik
5. Dalam gel poliakrilamid tersebut akan terbentuk pita-pita yang merupakan protein-protein yang telah terpisah berdasarkan berat molekul
Elektrotransfer
Blotting semi kering menggunakan kertas saring yang telah dibasahi dengan buffer transfer
1 Blotting basah tidak menggunakan kertas saring diantara gel poliakrilamid dan gel transfer, tetapi kedua gel tersebut diimpitkan dan direndam dalam buffer transfer
2
Gel transfer yang umum digunakan pada WB ada dua, yaitu nitroselulosa dan nilon.
Deteksi ProteinBerdasarkan penggunaan antibodi primer dan antibodi sekunder, ada dua metode deteksi, yaitu:
Metode langsung menggunakan antibodi primer yang telah
terkonjugasi dengan molekulmarker
1Metode tidak langsung
menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder
2
• Antibodi primer berfunsi mengikat protein target • Antibodi sekunder berfungsi mengikat antibodi primer dan
terkonjugasi dengan molekul penanda• Molekul penanda yang umum digunakan diantaranya adalah
enzim alkalin fosfatase (AP), enzim horsedish peroksidase (HRP), immunogold, dan 125I
TERIMA KASIH