UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI

Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Química de Minas Gerais

Taís Aparecida Reis Cordeiro

DETECÇÃO SIMULTÂNEA DAS DOENÇAS DE CHAGAS E LEISHMANIOSE

VISCERAL: uma plataforma específica para o diagnóstico point-of-care

Diamantina-MG

2020

Taís Aparecida Reis Cordeiro

DETECÇÃO SIMULTÂNEA DAS DOENÇAS DE CHAGAS E LEISHMANIOSE

VISCERAL: uma plataforma específica para o diagnóstico point-of-care.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

Multicêntrico em Química de Minas Gerais da

Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e

Mucuri como requisito para obtenção do título de

Doutor em Química.

Orientador: Prof. Dr. Lucas Franco Ferreira

Coorientadora: Profa. Dra. Helen Rodrigues Martins

Diamantina-MG

2020

Elaborado com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).

C794d

Cordeiro, Taís Aparecida Reis Detecção simultânea das doenças de chagas e leishmaniose

visceral: uma plataforma específica para o diagnóstico point-of-care / Taís Aparecida Reis Cordeiro, 2020.

143 p. il.

Orientador: Lucas Franco Ferreira Coorientadora: Helen Rodrigues Martins

Tese (Doutorado- Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Química de Minas Gerais) - Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, Diamantina, 2020.

1. Doença de chagas. 2. Leishmaniose visceral. 3. Imunosensor. 4.

Espectroscopia de impedância eletroquímica. 5. Monocamadas auto-organizadas.6. Eletropolimerização. I. Ferreira, Lucas Franco. II. Martins, Helen Rodrigues. III. Título. IV. Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri.6.

CDD 614. 4323

Ficha Catalográfica – Sistema de Bibliotecas/UFVJM Bibliotecária: Viviane Pedrosa – CRB6/2641

AGRADECIMENTOS

Agradeço imensamente a Deus por iluminar o meu caminho e me permitir concluir

mais essa etapa da minha trajetória acadêmica e principalmente por me dar força para continuar

mesmo nos momentos em que julguei não conseguir.

Aos meus pais por estarem presentes na minha vida, por não medirem esforços para

me ajudar e por sempre acreditarem em mim. Às minhas irmãs Amanda e Kati que juntamente

com os meus pais são o meu porto seguro. Agradeço a vocês pelo carinho e apoio.

Em especial agradeço ao meu marido que sempre esteve ao meu lado, me

incentivando sempre, desde quando eu tinha medo de não passar no vestibular. Você me faz

acreditar que eu posso ir mais longe em busca dos meus sonhos e sou grata por isso.

Ao meu orientador Professor Dr. Lucas Franco Ferreira que me proporcionou nestes

anos de convivência grandes oportunidades e ensinamentos que me enriqueceram imensamente

tanto profissionalmente como pessoalmente. Por ter tido muita paciência, pela disponibilidade

e por ter acreditado em mim. Por ser um exemplo de grande profissionalismo e sensibilidade

com as pessoas.

À Prof. Dra. Helen Rodrigues Martins, pela co-orientação, pessoa indispensável

para realização desse projeto. Obrigada por ter contribuído em todo o trabalho com aporte

técnico e intelectual. Serei eternamente grata.

A todos os integrantes e ex-integrantes do GENAp que tive o prazer de conviver e

que me ajudaram sempre com disposição e boa vontade. Em especial meu amigo Filipe Cruz

pela cumplicidade, carinho e companheirismo. Por estar presente em minha vida, pelos dias de

diversão escutando Glee e pelos sorrisos incontáveis quando estávamos juntos no laboratório.

Aos membros da banca pela grande disponibilidade, por aceitarem o convite para

fazer parte da comissão examinadora. É uma honra contar com vocês nesse momento

importante. Obrigada por contribuírem com o trabalho.

A UFVJM pela formação profissional e pela bolsa que me possibilitou realizar esse

trabalho.

E a todos que direta ou indiretamente me incentivaram e ajudaram nesse projeto.

Muito Obrigada!

“E ainda que tivesse o dom da profecia, e conhecesse

todos os mistérios e toda a ciência, e ainda que tivesse

toda a fé, de maneira tal que transportasse os montes, e

não tivesse amor, nada seria”...

1 Coríntios 13.2-3

RESUMO

A doença de Chagas (DC) e a de Leishmaniose Visceral (LV) são enfermidades que apresentam

grande impacto na saúde pública. Ambas são causadas por protozoários pertencentes à mesma

família, a Trypanosomatidae. A proximidade genética dessas doenças causa reatividade

cruzada dos anticorpos com os antígenos ubíquos, o que resulta em baixa especificidade dos

testes diagnósticos utilizados para identificação de tais doenças, podendo incorrer em falsos

resultados. Esse problema causa dificuldades ainda maiores se considerado as regiões co-

endêmicas para essas doenças. Assim esse trabalho buscou inicialmente testar uma plataforma

simples de reconhecimento utilizando a técnica de espectroscopia de impedância eletroquímica

(EIE) através da imobilização de antígenos brutos de L. infantum em monocamadas auto-

organizadas (SAMs) de ácido 3-mercaptopropiônico (3-MPA), para o reconhecimento de

anticorpos específicos do parasito presentes em soros caninos positivos para LV. Todos os

parâmetros da análise foram otimizados para a detecção da doença utilizando o dispositivo

proposto. Desta forma, com os resultados satisfatórios obtidos essa plataforma foi adaptada para

um sistema de eletrodos impressos duplos de carbono, formandos por dois eletrodos de trabalho

(W1 e W2) que podem permitir a detecção simultânea das doenças de Chagas e Leishmaniose

Visceral. Para isso, foram utilizados antígenos recombinantes T. cruzi (IBMP8.1) e L. infantum

(rLCi1,2) que aumentam a especificidade da análise realizada e diminuem a ocorrência de

possíveis reações cruzadas. Nessa plataforma, os antígenos recombinantes IBMP8.1 e L.

infantum (rLCi1,2) foram imobilizados nos eletrodos W1 e W2, respectivamente, modificados

com filme poliméricos obtidos através da eletropolimerização do ácido 4 -hidroxifenilacético

(4-HFA). O imunossensor proposto foi desenvolvido e caracterizado com sucesso, sendo um

sistema simples, eficaz e específico para a discriminação do reconhecimento dos anticorpos de

DC e LV presentes em soros caninos e humanos, o que representa um campo encorajador para

o progresso do diagnóstico dessas doenças em regiões endêmicas e co-endêmicas. Os resultados

apresentados podem trazer contribuições significativas para a sociedade, principalmente em

regiões mais pobres que sofrem com o impacto dessas doenças e não possuem acesso a exames

clínicos de rotina para início do tratamento. Neste contexto, o objetivo principal do trabalho foi

desenvolver um template de um dispositivo do tipo point of care que possa ser utilizado em

postos de pronto atendimento, acelerando o diagnóstico das doenças de DC e LV, e

consequentemente iniciando o tratamento de pessoas infectadas com essas doenças,

proporcionando uma melhor qualidade de vida e menores custos ao sistema de saúde pública

(SUS).

Palavras-chave: Doença de Chagas; Leishmaniose Visceral; Imunosensor; Espectroscopia de

Impedância eletroquímica; Monocamadas Auto-organizadas; Eletropolimerização.

ABSTRACT

Chagas disease (CD) and Visceral Leishmaniasis (VL) are diseases that have a impact on public

health. Both are caused by protozoa belonging to the same family, Trypanosomatidae. The

genetic proximity of these diseases causes cross-reactivity of antibodies with ubiquitous

antigens, which results in low specificity of the diagnostic tests used to identify such diseases,

which may result in false results. This problem causes even greater difficulties when

considering the co-endemic regions for these diseases. Thus, this work initially sought to test a

simple recognition platform using the Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS)

technique by immobilizing L. infantum crude antigens in self-organized monolayers (SAMs) of

3-mercaptopropionic acid (3-MPA), for the recognition of antibodies specific to the parasite

present in canine sera positive for LV. All optimization parameters were determined for that

device. After satisfactory results, this platform was adapted using double carbon electrodes,

formed by two different working electrodes (W1 and W2) that allow simultaneous detection of

these diseases. For this purpose, recombinant antigens of T. cruzi (IBMP8.1) and L. infantum

(rLCi1,2) have used that increase the specificity of the analysis performed and decrease the

occurrence of possible cross-reactions. In this platform, the recombinant antigens IBMP8.1 and

rLCi1,2 were immobilized in W1 and W2 respectively, modified with poly (4-HFA) film. The

proposed immunosensor was successfully developed as a simple, effective and specific system

for the discrimination of CD and VL antibodies present in canine and human sera, which

represents an encouraging field for the progress of the diagnosis of these diseases in endemic

and co-endemic regions. We hope that the results presented here can make a major contribution

to society, especially the poorest who suffer from the impact of these diseases. The main

objective of this project is to develop a template that helps as a foundation for the future

development of a point of care type device that can be used in emergency rooms, accelerating

the diagnosis and treatment of people infected with these diseases, providing a better quality of

life and lower costs to the Brazilian public health system.

Keywords: Chagas Disease; Visceral leishmaniasis; Immunosensor; Electrochemical

Impedance Spectroscopy; Self-assembled Monolayer; Electropolymerization.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Número estimado de casos de pessoas infectadas com T. cruzi no mundo. ............ 23

Figura 2. Casos de LV reportados em todo o mundo. ............................................................. 25

Figura 3. Esquema representando os tipos de reações cruzadas que podem acontecer. ......... 27

Figura 4. Esquema representativo do funcionamento de um biossensor................................. 29

Figura 5. Diferentes classificações dos biossensores. ............................................................. 31

Figura 6. Resposta senoidal da corrente frente a uma perturbação no potencial, evidenciando o

ângulo de fase ........................................................................................................................... 34

Figura 7. Diagrama de Nyquist para um sistema eletroquímico simples. ............................... 35

Figura 8. Representação do circuito de Randles ..................................................................... 36

Figura 9. Número de publicações com base no tema imunossensor impedimétrico de 1995 a

2018. ......................................................................................................................................... 37

Figura 10. Exemplos de eletrodos impressos comercializados pela Metrohm DropSens. (a)

eletrodo de ouro do tipo BT, (b) eletrodo duplo de ouro tipo simétrico (c) eletrodo de grafite (d)

eletrodo duplo de ouro (e) eletrodo duplo de grafite. ............................................................... 38

Figura 11. Representação esquemática da SAM 3-MPA sobre a superfície do ouro. ............. 41

Figura 12. Estrutura química do 4HFA. .................................................................................. 43

Figura 13. Mecanismo de eletropolimerização do monômero 4-HFA. ................................... 43

CAPÍTULO 1 – Desenvolvimento de um imunossensor impedimétrico baseado na

modificação de eletrodos de ouro impressos para detecção de anticorpos anti-L.infantum

Figura 1. Esquema mostrando o desenvolvimento do imunossensor para detecção de anti L.

infantum. ................................................................................................................................... 64

Figura 2.Voltamograma cíclico obtido para a superfície do eletrodo impresso de ouro AT não

modificada em solução 0,5 mol L-1 de H2SO4. ......................................................................... 68

Figura 3. Imagens de MEV para eletrodo impresso de ouro AT nas ampliações de (a) 1.000x,

(b) 2.500x, (c) 5.000x e (d) 10.000x. ........................................................................................ 69

Figura 4. Voltamogramas cíclicos obtidos SPE-Au não modificado (curva 1) e modificados

com SAM/3-MPA (curva 2) em solução aquosa contendo Fe(CN)6 3−/ 4− (1.0 mmol L−1) e KCl

(0.1 mol L−1), velocidade de varredura de 50 mV s−1. ............................................................. 70

Figura 5. Diagramas de Nyquist (gráfico Z’ vs. Z’’) para as medidas de espectroscopia de

impedância eletroquímica realizadas para SPE -Au () e SPE -Au / SAM 3-MPA (). ......... 71

Figura 6. Circuitos utilizados para simulação dos dados de EIE. (1) circuito Randles e (2)

circuito Randles modificado. .................................................................................................... 72

Figura 7. Esquema representando a reação EDC/NHS. .......................................................... 74

Figura 8. Diagramas de Nyquist dos antígenos L. infantum imobilizados sob o eletrodo

modificado (antígeno / SAM 3-MPA / SPE-Au(∆)) em comparação com a superfície

modificada com 3-MPA () na presença da sonda redox. ....................................................... 74

Figura 9. Efeito da concentração do antígeno no valor da Rct. ............................................... 76

Figura 10. A dependência da Rct em função do tempo de imobilização do antígeno

(50 μg mL−1). Todas as medidas foram realizadas em solução de KCl (0,1 mol L−1) contendo

Fe(CN)63−/4− (1,0 mmol L−1). .................................................................................................... 76

Figura 11. Diagramas de Nyquist obtidos para antígeno/SAM/3-MPA/SPEAu (curva 1), o

imunossensor na presença de amostras de soro canino contendo anticorpos negativos (Ab ,

curva 2) e positivos (Ab+, curva 3). ......................................................................................... 77

Figura 12. Valores de Rct obtidos para a detecção de anticorpos positivos e negativos em 10,

20, 30 e 60 minutos de incubação. ........................................................................................... 79

Figura 13. Valores de Rct obtidos para soros caninos positivos e negativos nas diluições de

1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1280 e a diferença obtida entre positivo e negativo em cada

diluição, ∆Rct. .......................................................................................................................... 80

Figura 14. Valores de Rct em função do fator de diluição para os as diluições positivas de 1:40,

1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1: 1280. ......................................................................................... 81

Figura 15. Diagramas de Nyquist mostrando a resposta do imunossensor frente a adição de

amostras de sangue positivo (curva 1) e negativo (curva 2). As medidas foram realizadas em

solução de KCl (0.1 mol L−1) contendo Fe(CN)63−/4− (1.0 mmol L−1). ..................................... 82

CAPÍTULO 2 – Desenvolvimento de um imunossensor para detecção simultânea de Leishmaniose Visceral e Chagas utilizando eletrodos impressos duplos de grafite

Figura 1. Instrumentação utilizada nos estudos de espectroscopia de ressonância de plásmons

de superfície (SPR). Espectrômetro de SPR BioNavis utilizado para as medidas ópticas. ...... 96

Figura 2. Eletrodos utilizados no desenvolvimento do trabalho (a) eletrodo duplo de grafite,

(b) chip de ouro para análises de SPR. ..................................................................................... 96

Figura 3. Esquema demonstrando as etapas para o desenvolvimento do imunossensor duplo.

................................................................................................................................................ 102

Figura 4. Curvas de SPR evidenciando as etapas de associação e dissociação para a adição de

anticorpo anti-T.cruzi positivo (curva 1) e anti-L. infantum positivo (curva2) sobre proteína

recombinante IBMP 8.1 imobilizada sobre SAM/Au. ........................................................... 106

Figura 5. Curvas de SPR evidenciando as etapas de associação e dissociação para a adição de

anticorpos anti- L.infantum positivos (curva 1) e anticorpos anti- T.cruzi positivos (curva2)

sobre proteína recombinante rLci1,2 imobilizada sobre SAM/Au. ........................................ 106

Figura 6. Voltamograma cíclico dos eletrodos de trabalho W1(vermelho) e W2 (preto) em

solução 5,0 mM Fe(CN)63−/4− contendo KCl 0,10 M. v = 50mV/s. ....................................... 108

Figura 7. Imagens de MEV para os eletrodos W1 (A) e W2 (B) não modificados na ampliação

de 1000x. ................................................................................................................................ 108

Figura 8. VCs consecutivos obtidos em solução de 2,50 mM de 4-HFA utilizando EIDG.

Eletrólito suporte: 0,50 M HClO4. Número de ciclos = 10; v = 50 mV/s. ............................. 110

Figura 9. Voltamograma cíclico obtido em solução 5,0 mM Fe(CN)63−/4− contendo KCl 0,10

M para: (1) EIDG e (2) poli(4HFA)/EIDG. v = 50mV/s. ...................................................... 110

Figura 10. Diagramas de Nyquist dos espectros de impedância eletroquímica obtidos em

solução 5,0 mM Fe(CN)63−/4− contendo KCl 0,10 M para: (1) EIDG e (2) poli(4-HFA)/EIDG.

Amplitude 10 mV. Intervalo de Frequência: 100 kHz a 10 mHz. As linhas sólidas representam

o ajuste do circuito aos dados experimentais.......................................................................... 111

Figura 11.Diagramas de Nyquist dos espectros de impedância eletroquímica obtidos para: (A)

EIDG/ Ag IBMP 8.1 (curva 1) e EIDG/ + Ab T. cruzi (curva 2) (B) EIDG/ Ag rLci1,2 (curva

1) +Ab L. infantum (curva 2). (C) poli 4-HFA/ Ag IBMP (curva 1) + Ab T. cruzi (curva 2). (C)

poli 4-HFA/ Ag rLci1,2 (curva 1) + Ab T. cruzi (curva 2). Amplitude 10 mV. Intervalo de

Frequência: 100 kHz a 10 mHz. As linhas sólidas representam o ajuste do circuito aos dados

experimentais. ......................................................................................................................... 113

Figura 12. Diagramas de Nyquist obtidos em solução de K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6 5,00 mM

contendo KCl 0,10 M para os diferentes números de ciclos realizados na eletropolimerização

sendo: 5 (curva 1), 10 (curva 2), 15 (curva 3) e 20 (curva 4) ciclos. Amplitude 10 mV. Intervalo

de Frequência: 100 kHz a 10 mHz. As linhas sólidas representam o ajuste do circuito aos dados

experimentais. ......................................................................................................................... 115

Figura 13. Valores de Rct obtidos para as etapas de construção do imunossensor, evidenciando

o valor de ∆Rct obtido para a imunorreação em diferentes números de ciclos (A) W1 e (B)W2.

................................................................................................................................................ 117

Figura 14. Diagramas de Nyquist obtidos para (A) poli 4-HFA/ Ag IBMP 8.1 (curva 1) +Ab

T. cruzi positivo (curva 2) (B) poli 4-HFA/ Ag IBMP 8.1(curva 1) +Ab L. infantum positivo

(curva 2) (C) poli 4-HFA/ Ag IBMP 8.1+BSA (curva 1)+ Ab T. cruzi positivo (curva 2) (D)

poli 4-HFA/ Ag IBMP 8.1+BSA (curva 1) + Ab L. infantum positivo (curva 2). As linhas sólidas

representam o ajuste do circuito aos dados experimentais. .................................................... 119

Figura 15. Diagramas de Nyquist obtidos para (A) poli 4-HFA/ Ag rLci1,2 (curva 1) +Ab

L.infantum positivo (curva 2) (B) poli 4-HFA/ Ag rLci1,2 (curva 1) +Ab T.cruzi positivo (curva

2) (C) poli 4-HFA/ Ag rLci1,2+BSA (curva 1)+ Ab L.infantum positivo (curva 2) (D) poli 4-

HFA/ Ag rLci1,2 (curva 1) + Ab T. cruzi positivo (curva 2). As linhas sólidas representam o

ajuste do circuito aos dados experimentais............................................................................. 121

Figura 16. Diagramas de Nyquist obtidos para poli 4-HFA (15ciclos de varredura) () +Ab

L.infantum positivo (). As linhas sólidas representam o ajuste do circuito aos dados

experimentais. ......................................................................................................................... 121

Figura 17. Diagramas de Nyquist dos espectros de impedância obtidos para (A) W1- poli (4-

HFA)/ antígeno IBMP 8.1 e (B) W2- poli (4-HFA)/ antígeno rLci1,2em diferentes tempos de

imobilização 5 (), 10 (), 15(), 20(), 25 (∆) e 30 () minutos. Amplitude 10 mV. Intervalo

de Frequência: 100 kHz a 10 mHz. As linhas sólidas representam o ajuste do circuito aos dados

experimentais. ......................................................................................................................... 122

Figura 18. (A)Influência da concentração do antígeno IBMP 8.1 no valor de ∆Rct em W1 ao

ser adicionado o alvo específico () amostras de soro contendo anticorpos anti- T. cruzi

negativo () e anti- L. infantum positivo ().(B) Influência da concentração do antígeno rLci1,2

no valor de ∆Rct em W2 ao ser adicionado o alvo específico () amostras de soro contendo

anticorpos anti- L. infantum negativo () e anti- T. cruzi positivo (). Todas as medidas foram

realizadas em solução de Fe(CN)63−/4− (5,0 mmol L−1) contendo KCl (0,1 mol L-1). ............ 125

Figura 19. Influência do tempo de imobilização da proteína BSA no valor de ∆Rct em (A) W1

e (B) W2. Antígeno imobilizado em condições otimizadas. Todas as medidas foram realizadas

em solução de Fe(CN)63−/4− (5,0 mmol L−1) contendo KCl (0,1 mol L-1). ............................. 127

Figura 20. (A) Efeito do tempo de imunorreação no valor de ∆Rct para W1 e (B) W2. Diluição

de anticorpo utilizada foi 1:320. Antígeno e BSA utilizados em condições otimizadas. Todas as

medidas foram realizadas em solução de Fe(CN)63−/4− (5,0 mmol L−1) contendo KCl (0,1 mol

L-1). ......................................................................................................................................... 128

Figura 21. (A) ∆Rct em função do fator de diluição do soro positivo () e negativo () para

Chagas e positivo para Leishmaniose Visceral () em W1. (B) ∆Rct em função fator de

diluição do soro positivo () e negativo () para Leishmaniose Visceral e positivo para Chagas

() em W2. ............................................................................................................................ 129

Figura 22. (A) Investigação da seletividade do imunossensor em condições otimizadas.

Antígeno específico e mistura de antígenos estão na mesma diluição 1:320 (20 minutes). (B)

Avaliação da repetibilidade do imunossensor desenvolvido. (C) Estudo da estabilidade de

armazenamento do imunossensor. .......................................................................................... 131

Figura 23. Reatividade obtida para amostras de soros humanos e caninos para T. cruzi-positivo

(TcP), T. cruzi-negativo (TcN), L. infantum-positivo (LiP), and L. infantum-negativo (LiN)

individualmente. O valor de cut-off é o indice de reatividade = 1,0, e a área sombreada

representa a zona cinza (RI = 1,0 ± 0,10). Linhas horizontais e números para cada grupo de

resultados representam as médias geométricas (± 95% CI). AUC (área sob a curva); Sen

(sensibilidade); Spe (especificidade); Acc (precisão); K (coeficiente Kappa de Cohen); GZ

(zona cinza)............................................................................................................................. 133

Figura 24. Análise de reatividade cruzada (CR) de IBMP-8.1 ou rLci1A / rLci2B com soros

humanos de indivíduos com doenças não relacionadas. O valor de corte é o índice de reatividade

= 1,0, e a área sombreada representa a zona cinza (RI = 1,0 ± 0,10). As linhas horizontais

representam as médias geométricas (IC95%), com os resultados correspondentes mostrados

abaixo para cada grupo. ATL (leishmaniose tegumentar americana); HBV (vírus da hepatite

B); HIV (vírus da imunodeficiência humana); HTLV (vírus linfotrópico de células T humanas);

TOXO (Toxoplasmose); GZ (zona cinza); RI (índice de reatividade). .................................. 136

LISTA DE TABELAS Tabela 1: Exemplos recentes de biosensores construídos para diagnóstico de LV e DC. ...... 46

CAPÍTULO 1 – Desenvolvimento de um imunossensor impedimétrico baseado na

modificação de eletrodos de ouro impressos para detecção de anticorpos anti-L.infantum

Tabela 1. Valores de Rct obtidos para os as diluições de 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:

1280 positivas e negativas. ....................................................................................................... 80

CAPÍTULO 2 – Desenvolvimento de um imunossensor para detecção simultânea de Leishmaniose Visceral e Chagas utilizando eletrodos impressos duplos de grafite

Tabela 1: Parâmetros obtidos na simulação dos dados de EIE para as plataformas de poli (4-

HFA)/ EIDC modificados com diferentes números de ciclos utilizando o circuito equivalente

proposto .................................................................................................................................. 116

Tabela 2: Valores de ∆Rct obtidos para W1 e W2 ao ser adicionado soro específico e não

específico para a plataforma na presença e na ausência de agente bloqueador BSA. ............ 119

Tabela 3: Influência do tempo de imobilização do antígeno T. cruzi nos valores de Rct das

etapas do desenvolvimento do imunossensor – W1. .............................................................. 123

Tabela 4: Influência do tempo de imobilização do antígeno L. infantum nos valores de Rct das

etapas do desenvolvimento do imunossensor –W2. ............................................................... 124

Tabela 5: Valores de indice de reatividade para avaliação de desempenho do diagnóstico. . 134

Tabela 6: Valores de índice de reatividade para avaliação de reatividade cruzada. ATL –

Leishmaniose tegumentar americana, HBV - Vírus da Hepatite B, HIV – Virus da

imunodeficiencia humana, HTLV - vírus linfotrópico da célula humana e TOXO –

Toxoplasmose. ........................................................................................................................ 136

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

3-MPA: 3-Mercaptopropionic acid

4- HFA: ácido hidroxifenilacético

11-MUA: ácido 11-mercaptoundecanóico

Ab: anticorpos

Ag: antígenos

AuNPs: nanopartículas de ouro

BSA: Soroalbumina bovina

Cd: dupla camada elétrica

CCD: Doença de chagas congênita

DC: doença de chagas

EIDG: eletrodo impresso duplo de grafite

EDC: 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida

EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético

EIE: Espectroscopia de Impedância Eletroquímica

ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay

Epa: Potencial de pico anódico

Epc: Potencial de pico catódico

FIOCRUZ: Fundação Instituto Oswaldo Cruz

FTIR: Espectroscopia de absorção no Infravermelho com transformada de Fourier

HBS-EP: Hepes Buffered Saline

HEPES: Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico

HIV: vírus da imunodeficiência humana

HTLV: vírus linfotrópico da célula humana

Ipa: Corrente de pico anódica

Ipc: Corrente de pico catódico

IBMP 8.1: antígeno quimérico obtido no Instituto de Biologia Molecular do Paraná

LTA: Leishmaniose tegumentar Americana

LV: Leishmaniose visceral

MEV: Microscopia eletrônica de varredura

NHS: N-hidroxisuccinimida

PCR: reação em cadeia da polimerase

Rct: Resistência à transferência de elétrons

Rs: resistência ôhmica da solução

RIFI: teste de imunofluorescência indireta

SAM: Monocamada auto-organizada

SPR: Ressonância de plásmons de superfície

TOXO: toxoplasmose

UFOP: Universidade Federal de Ouro Preto

v: Velocidade de varredura

VC: Voltametria cíclica

W1: eletrodo de trabalho 1

W2: eletrodo de trabalho 2

Zw: impedância de Warburg

∆Ep: variação de potencial de pico

∆Rct: Variação da resistência a transferência de elétrons

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 21

2. REFERENCIAL TEÓRICO ........................................................................................ 23

2.1 – Aspectos gerais e atuais da doença de Chagas e Leishmaniose Visceral ................... 23

2.2 – O diagnóstico laboratorial da doença de Chagas e Leishmaniose Visceral ................ 26

2.3 – Novas abordagens no diagnóstico sorológico da doença de Chagas e Leishmaniose

Visceral ................................................................................................................................ 28

2.3.1 – Biossensores ............................................................................................................. 28

2.3.2 – Imunossensores Impedimétricos .............................................................................. 32

2.3.3 – Eletrodos impressos ................................................................................................. 38

2.3.4 – Eletrodos Modificados ............................................................................................. 39

2.3.4.1 – Monocamadas auto organizadas ................................................................... 40

2.3.4.2 – Filmes poliméricos ........................................................................................ 41

2.3.5 – Biossensores aplicados na detecção da doença de Chagas e Leishmaniose Visceral

............................................................................................................................................. 44

REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 48

CAPÍTULO 1 – DESENVOLVIMENTO DE UM IMUNOSSENSOR

IMPEDIMÉTRICO BASEADO NA MODIFICAÇÃO DE ELETRODOS DE OURO

IMPRESSOS PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-L.INFANTUM ........... 59

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 61

2. OBJETIVOS ................................................................................................................... 62

2.1 – Objetivo geral ............................................................................................................. 62

2.2 – Objetivos específicos .................................................................................................. 62

3. METODOLOGIA .......................................................................................................... 63

3.1 – Reagentes e soluções .................................................................................................. 63

3.2 – Instrumentação ............................................................................................................ 63

3.3 – Análises em eletrodo impresso de ouro ...................................................................... 64

3.4 – Produção de antígenos brutos de L. infantum ............................................................. 65

3.5 – Soros caninos contendo anticorpos anti-L. infantum .................................................. 65

3.6 – Limpeza, caracterização e modificação da superfície do sensor ................................ 66

3.7 – Imobilização de antígenos L. infantum sobre a SAM ................................................ 66

3.8 – Detecção da imunorreação entre antígenos L. infantum e anticorpos anti L. infantum

............................................................................................................................................. 67

3.9 – Desempenho do imunossensor frente adição de amostras de sangue ......................... 67

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................. 68

4.1 – Caracterização e modificação da superfície do sensor ............................................... 68

4.2 – Avaliação e otimização da imobilização de antígenos L. infantum sobre SAM-3MPA

............................................................................................................................................. 72

4.3 – Detecção e otimização da imunorreação entre antígenos L. infantum e anticorpos anti

L. infantum ........................................................................................................................... 77

4.4 – Testes de desempenho do imunossensor .................................................................... 79

5. CONCLUSÃO ................................................................................................................ 84

REFERENCIAS ................................................................................................................. 85

CAPÍTULO 2 - DESENVOLVIMENTO DE UM IMUNOSSENSOR PARA

DETECÇÃO SIMULTÂNEA DAS DOENÇAS DE LEISHMANIOSE VISCERAL E

CHAGAS SOBRE ELETRODOS IMPRESSOS DUPLO DE GRAFITE ................... 88

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 92

2. OBJETIVOS ................................................................................................................... 94

2.1 – Objetivo geral ............................................................................................................. 94

2.2 – Objetivos específicos .................................................................................................. 94

3. METODOLOGIA .......................................................................................................... 95

3.1 – Reagentes e soluções .................................................................................................. 95

3.2 – Instrumentação ............................................................................................................ 95

3.3 – Obtenção do poliantígeno recombinante IBMP 8.1 e das proteínas rLci2B e rLci1A97

3.4 – Estudos da interação antígeno e anticorpo empregando SPR ..................................... 97

3.5 – Estudo da influência da modificação da superfície do sensor na imobilização de

antígenos e no reconhecimento da imunorreação ................................................................ 98

3.6 – Imobilização dos antígenos recombinantes IBMP 8.1 e rLci1,2. ............................... 99

3.7 – Influência do uso de BSA ......................................................................................... 100

3.8 – Avaliação da interação Antígeno-Anticorpo ............................................................ 101

3.9 – Testes de desempenho do imunossensor .................................................................. 102

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES .............................................................................. 105

4.1 – Avaliação da resposta da interação antígeno-anticorpo empregando SPR ............... 105

4.2 – Caracterização eletroquímica e morfológica dos eletrodos impressos duplos de grafite

........................................................................................................................................... 107

4.3 – Caracterização da superfície de eletrodos impressos duplos não modificados e

modificados com poli (4-HFA) .......................................................................................... 109

4.4 – Efeito da modificação da superfície do sensor na imobilização dos antígenos

recombinantes e na detecção do anticorpo específico. ...................................................... 112

4.5 – Influência do número de ciclos voltamétricos na formação do poli(4-HFA) e na

imunorreação. .................................................................................................................... 115

4.6 – Influência do uso de BSA no desempenho do imunossensor ................................... 118

4.7 – Otimização dos parâmetros de imobilização dos antígenos recombinantes IBMP 8.1 e

rLci1,2. ............................................................................................................................... 122

4.8 – Caracterização e otimização da interação antígeno-anticorpo por espectroscopia de

impedância eletroquímica .................................................................................................. 127

4.9 – Avaliação de Desempenho do Imunossensor no Diagnóstico Sorológico da Doença de

Chagas e Leishmaniose Visceral ....................................................................................... 130

5. CONCLUSÃO .............................................................................................................. 138

PERSPECTIVAS ............................................................................................................. 139

REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 140

21

1. INTRODUÇÃO

Leishmaniose e Doença de Chagas são enfermidades endêmicas que representam

um preocupante problema de saúde pública. A Leishmaniose é uma doença causada por

protozoários do gênero Leishmania estando classificada como uma das principais doenças

negligenciadas, uma vez que atingem a parcela mais desfavorecida da população

(REITHINGER, 2002). No Brasil, a Leishmaniose em humanos pode ser dividida em duas

diferentes classes de acordo com o tipo da espécie de Leishmania e a resposta imune

desenvolvida pelo individuo infectado pela doença: a Leishmaniose tegumentar americana

(LTA) e a Leishmaniose Visceral (LV). A LTA também conhecida como “ferida brava”

provoca feridas na pele e mucosas podendo surgir, dependendo da imunidade da pessoa,

caroços espalhados pelo corpo, já a LV é a forma mais grave e preocupante da doença, exibindo

altos índices de mortalidade, sendo o número de casos diretamente correlatado à situação

econômica da região (SMITH et al., 2007; OKWOR e UZONNA, 2016). A doença de Chagas

(DC) é uma inflamação de caráter endêmico, de evolução geralmente crônica causada pelo

protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. Este parasita multiplica-se no tubo digestivo de

barbeiros e as formas infectantes são então eliminadas com suas fezes e urina, que no momento

da picada podem entrar em contato com os tecidos cutâneos e mucosas do humano transmitindo

a infecção. Apesar dos esforços para o controle da transmissão ainda existe uma gama de

pessoas infectadas que precisam de diagnóstico e atendimento nos serviços de saúde (COURA

& BORGES-PEREIRA, 2012; MONCAYO, 2006).

Os testes sorológicos são os mais utilizados para diagnóstico dessas doenças no

Brasil, porém esses testes podem apresentar reações cruzadas devido à similaridade genética

dos parasitas causadores dessas doenças, podendo ter maior impacto em localidades onde

coexistem gêneros de Trypanossoma e Leishmania podendo ocorrer a co-infecção, ou seja, o

cão ou o humano podem estar apresentando ambas infecções, ou apenas uma delas, e assim

apresentar reação cruzada no teste impossibilitando a interpretação segura dos resultados

(MATOS et al., 2015; PEREIRA, 2016). Nesse sentido, estudos que buscam identificar a

infecção simultânea de Trypanosoma cruzi e Leishmania infantum em humanos e cães presentes

em áreas de sobreposição de DC e LV tornam-se necessários para uma identificação correta e

diferenciação dessas espécies. Essa relação pouco tem sido avaliada, sendo de extrema

22

importância o diagnóstico correto evitando falsos positivos além de sacrifícios desnecessários

de cães considerados infectados, bem como impedir a permanência de cães afetados e sendo

julgados como falso negativos servindo como razão de infecção para vetores (FERREIRA et

al., 2014).

Neste contexto, este trabalho propõe o desenvolvimento de um imunossensor

impedimétrico para o diagnóstico simultâneo da DC e LV visando estabelecer perspectivas para

melhorias no diagnóstico de ambas as doenças, uma vez que tal metodologia é extremamente

promissora para o diagnóstico dessas e de outras infecções, demonstrando sensibilidade maior

que os testes tradicionais utilizados, além da possibilidade de uma análise mais rápida e em

tempo real com perspectivas para aplicação em áreas endêmicas. O trabalho traz inovações para

a área científica uma vez que não há estudos prévios relatados na literatura relacionados a

detecção simultânea de DC e LV utilizando eletrodos duplos impressos, visando contribuir

significativamente na melhoria do diagnóstico e consequentemente no tratamento correto e

seguro de pessoas infectadas com tais doenças, além de resultar em menores custos ao sistema

de saúde pública no Brasil (SUS).

23

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 - Aspectos gerais e atuais da doença de Chagas e Leishmaniose Visceral

A doença de Chagas é uma doença causada pelo protozoário flagelado

Trypanosoma cruzi. Estima-se que anualmente aproximadamente 8 milhões de pessoas são

infectadas pelo Trypanosoma Cruzi, protozoário causador da doença e sabe-se que pelo menos

10 mil pessoas morrem com complicações ligadas à doença de Chagas no mundo (WHO, 2018).

Por muito tempo o controle dessa doença foi negligenciado pelas autoridades públicas, porém

na década de 90 quando a quantidade de infectados se tornou alarmante se iniciou programas

de intervenções atuando principalmente no controle da transmissão do parasito, através do

combate ao vetor e também através da triagem dos bancos de doadores de sangue (DIAS, 2017;

MONCAYO, 2006).

Porém, apesar de tais medidas, a doença de chagas continua representando um sério

problema de saúde pública, sendo considerada a sexta doença negligenciada mais importante

do mundo. A Figura 1 representa uma estimativa do número de casos de pessoas infectadas com

T. cruzi.

Figura 1. Número estimado de casos de pessoas infectadas com T. cruzi no mundo.

Fonte: WHO, 2018

24

Em virtude do fluxo migratório de latino-americanos para outras localidades o

número de casos em áreas não endêmicas aumentou significativamente sobretudo nos EUA,

Canadá, Europa e alguns países do pacífico ocidental (MONTES-RINCÓN et al., 2018). Nessas

regiões, os casos são justificados devido a transfusões sanguíneas, transplante de órgãos e

acidentes laboratoriais (MACHADO et al., 2012).

De forma análoga, a leishmaniose é uma zoonose infecciosa, mas não contagiosa,

de evolução crônica causada pelo protozoário parasita Leishmania e tem como principal vetor

a fêmea do mosquito Flebótomo, conhecido como mosquito palha, tendo o cão como principal

fonte de infecção para tais vetores. O ciclo biológico da Leishmania se inicia quando a fêmea

pica um hospedeiro infectado, alimentando-se do sangue contendo os macrófagos

contaminados com as formas amastigotas do parasito. O hospedeiro saudável é então infectado

durante o repasto sanguíneo. (REIS et al, 2006).

Dependendo do tipo de parasita causador da infecção, a leishmaniose pode ser

classificada em leishmaniose tegumentar ou cutânea e leishmaniose visceral ou calazar. A

leishmaniose cutânea é a forma mais comum de leishmaniose, caracterizada por úlceras na pele,

lesões inflamatórias nas mucosas do nariz e da boca; sem tratamento pode ter consequências

graves (CHAPPUIS et al, 2007; ALVAR, 2012).

A leishmaniose visceral (LV) é a forma mais grave de leishmaniose, identificada

por febre de longa duração, perda de peso, podendo atacar órgãos viscerais como fígado, baço

e medula óssea, podendo levar a morte se não tratada. Tal infecção é negligenciada apesar de

ser endêmica em mais de 60 países localizados principalmente na África, Ásia e América Latina

(BRASIL, 2018; WHO, 2018). Segundo a Organização Mundial da Saúde (WHO, 2018) mais

de 1 bilhão de pessoas vivem em áreas endêmicas com risco de infecção, sendo que por ano são

reportados cerca de 300 mil novos casos de LV, e destes são estimadas mais de 20 mil mortes

a cada ano.

A Figura 2 reporta o número de casos mundiais de LV. O Brasil incluindo Nepal,

Etiópia, Bangladesh, Índia e Sudão são os seis países que apresentam o maior número de casos

de LV. Os fenômenos associados à integração dos países e a globalização aumentam o risco de

exposição a esses agentes infecciosos principalmente em países em que essa doença não é

endêmica, sendo o maior problema neste caso é o risco de transmissão por transfusão sanguínea

(ABEIJON, 2020).

25

Figura 2. Casos de LV reportados em todo o mundo.

Fonte: WHO, 2018.

No Brasil, a incidência de casos de LV vem aumentando apesar das medidas

adotadas pelo Ministério da Saúde. Estas medidas incluem o tratamento precoce da doença,

controle de vetores através de gestão química e ambiental além da eutanásia dos cães infectados

(BRASIL, 2006).

Para o tratamento da LV não existem muitas opções, de forma geral são utilizados

antiamoniais, antibióticos e técnicas de imunoterapia para minimizar os efeitos colaterais

resultantes do tratamento (MARTINS, 2018).

Os riscos de transmissão podem ser evitados através de medidas de proteção

individual como o uso de telas, repelentes, saneamento ambiental, controle de cães infectados,

controle do vetor por meio químico, além de orientações à população quanto ao diagnóstico e

tratamento; as quais são medidas fundamentais para o controle da leishmaniose (ROCHA e

PETRONI, 2017).

26

2.2 - O diagnóstico laboratorial da doença de Chagas e Leishmaniose Visceral

As doenças de Chagas e Leishmaniose são doenças da família Trypanosomatidae,

constituída por protozoários uniflagelados parasitas que podem ter o seu ciclo de vida em um

ou mais hospedeiros (BORGHESAN, 2018; CAMPOS, 2018). Diversos métodos podem ser

utilizados para diagnosticar tais doenças, dos quais podemos citar os testes parasitológicos

(direto e indireto), molecular, imunológico (celular ou sorológico) (ABEIJON, 2020).

As técnicas parasitológicas são empregadas com o objetivo de se visualizar as

formas amastigotas do parasita em microscópio, porém é um método bastante invasivo uma vez

que é necessário a realização de biopsia da medula óssea, baço ou fígado. Além disso, a análise

do parasita pode ser difícil devido à baixa carga parasitaria, principalmente em estágios iniciais

da doença (REIS et al., 2006; ALVES et al., 2004; DESJEUX, 2004).

No Brasil, principalmente na região Amazônica é comum a presença de coinfecção

de LV e DC, enfatizando assim a necessidade de uma avaliação clínica mais acurada e o

desenvolvimento de testes de diagnósticos mais específicos (MATOS et al, 2015; MAYWALD

et al., 1996). Por isso, os exames devem ser realizados com muita cautela para que o paciente

seja tratado com a medicação correta.

Testes sorológicos são comumente utilizados para detecção dessas doenças,

realizados através do teste de ELISA e o teste de imunofluorescência indireta (RIFI), porém a

reação cruzada entre as doenças para detecção de casos assintomáticos é a principal limitação

desses ensaios (LUCIANO et al., 2009; ROMERO et al., 2009).

A reatividade cruzada se refere à capacidade de moléculas de um anticorpo em

particular reagir com mais de um determinante antigênico. Essa interação ocorre porque o

antígeno envolvido na reação cruzada compartilha o mesmo epítopo (área do antígeno que se

liga aos receptores celulares e aos anticorpos) com o antígeno imunizador, ou porque tais

antígenos são estruturalmente muito semelhantes, assim quanto maior a similaridade maior a

intensidade da interação, como mostrado esquematicamente na Figura 3.

27

Figura 3. Esquema representando os tipos de reações cruzadas que podem acontecer.

Fonte: MAYER, 2017.

O tratamento adequado do indivíduo depende do diagnóstico precoce e correto de

modo a evitar que a doença se agrave. Assim, um aspecto importante dos métodos sorológicos

é a escolha do antígeno. Por serem da mesma família, a DC e a LV compartilham múltiplos

epítopos comuns (BARBOSA-DE-DEUS et al., 2002), então a utilização de antígenos brutos

em sorodiagnósticos leva a uma gama de reações falso positivas em indivíduos contaminados

com o outro tripanossomatídeo, sendo propensa a erros e levando a diagnósticos incorretos.

Outro fator importante é que essas doenças possuem fator geográfico comum e quadro clínico

semelhante (MALCHIODI, 1994).

Tal problema pode ser contornado utilizando-se antígenos recombinantes. O

antígeno rK39, por exemplo, foi desenvolvido com o objetivo de melhorar a especificidade e

sensibilidade, tal antígeno é comumente empregado no teste de ELISA e no teste por

imunocromatografia (SILVA, 2014). BRAZ et al. (2002) analisaram a sensibilidade e a

especificidade do teste de ELISA utilizando o antígeno recombinante rK39. Os resultados

indicaram que o ELISA baseado em rK39 é um teste sensível e específico para LV, uma vez

que anticorpos anti-rK39 não foram detectados em controles saudáveis ou com doença de

Chagas. Em contraste, o ELISA utilizando antígenos brutos foi sensível, mas não foi específico.

Entretanto, estudos apontaram que a utilização deste antígeno tem sido menos eficiente em

algumas regiões como, por exemplo, o leste africano. As causas ainda não foram explicadas,

mas de certa maneira, indivíduos infectados do Sudão apresentam uma menor quantidade de

28

títulos de anticorpos anti-rK39 quando comparados com indivíduos indianos (RITMEIJER, et

al., 2006).

Vários grupos de pesquisa buscam novas estratégias para um diagnóstico efetivo e

de baixo custo, porém apesar de tais esforços os métodos desenvolvidos ainda não são efetivos

e possuem algumas limitações como custo, sensibilidade e especificidade principalmente no

que se refere aos casos de reações cruzadas, o que reforça a necessidade de desenvolvimento

de testes de diagnósticos mais confiáveis (SINGH e SIVAKUMAR, 2003).

2.3 - Novas abordagens no diagnóstico sorológico da doença de Chagas e Leishmaniose

Visceral

A necessidade de sistemas de diagnóstico mais versáteis para o monitoramento de

doenças tem estimulado estudos para o desenvolvimento de técnicas mais acuradas

(PERINOTO et al., 2010).

Atualmente muitos procedimentos analíticos requerem o uso de instrumentos

complexos e de pessoas altamente especializadas para sua manipulação. Desse modo, tem sido

investigada novas abordagens para o diagnóstico das infecções de chagas e leishmaniose que

combinem robustez, rapidez, simplicidade e portabilidade, com adequada especificidade e

sensibilidade, (LUQUETTI et al., 2003).

Neste contexto surgem os sensores químicos que utilizam instrumentos simples,

seguros, de fácil manipulação, combinando alta sensibilidade e especificidade para o

reconhecimento de biomoléculas (ALFAYA, 2002; LUZ, 2015; SKOTTRUP et al., 2008).

2.3.1 Biossensores

O desenvolvimento de um biossensor se baseia na correspondência entre o

componente biológico e o transdutor. O componente biológico reconhece a molécula alvo,

presente na amostra, por meio de uma ligação bioquímica específica gerando uma variação no

sistema e o transdutor converte essa energia em um sinal mensurável que será ampliado e

exibido de forma apropriada (WANG, 2000; PATHAK et al., 2007).

Os elementos bioreceptores podem ser enzimas, antígenos, anticorpos, ácidos

nucleicos, micróbios, células, dentre outras substâncias (OLIVEIRA, 2016). A Figura 4

29

representa um esquema do funcionamento de um biossensor. A amostra contém além do analito

outros componentes, porém somente o analito é reconhecido pelo componente biológico, o que

torna o biossensor um instrumento altamente seletivo para determinado analito.

Existem diferentes campos de aplicação para os sensores biológicos tais como área

clínica para detectar doenças, na indústria alimentícia para identificar patógenos específicos

que contaminam alimentos, dentre outras funções. O desenvolvimento de biossensores possuem

grandes perspectivas, tendo como objetivo principal o aumento da qualidade de vida da

população (BARBOSA, 2011).

Figura 4. Esquema representativo do funcionamento de um biossensor.

Fonte: Stobiecka, 2016 (Adaptado)

30

Para a construção e validação do dispositivo algumas características analíticas são sempre

requeridas, tais como:

a) Tempo de análise: Análises rápidas e respostas em “tempo real”;

b) Sensibilidade: resposta do sistema frente a adição de pequenas concentrações do

analito. A sensibilidade deverá ser suficientemente alta para permitir medições

convenientes;

c) Seletividade: característica do dispositivo que consegue diferenciar alvos específicos

de outras espécies presentes na amostra;

d) Estabilidade: Tempo em que o dispositivo ainda consegue preservar suas propriedades

sob condições normais de operação;

e) Reprodutibilidade: obtenção de respostas reprodutíveis e consistentes que aumentam a

confiabilidade do sensor;

f) Tamanho: o dispositivo deverá ter o menor tamanho possível, permitindo a

portabilidade;

g) Fácil manuseio: Não exigem mão de obra especializada podendo ser manipulado por

qualquer pessoa;

h) Custo: Baixo custo unitário e operacional que permita sua aplicabilidade no mercado.

Os biossensores podem ser classificados de acordo com o elemento de

reconhecimento biológico utilizado ou o método de transdução de sinal empregado, como

mostra a Figura 5 (PERUNAL e HASHIM, 2014). De acordo com o método de transdução

empregado os biossensores podem ser classificados como biossensores ópticos, piezoelétricos

ou eletroquímicos.

Os biossensores ópicos se baseiam no fato de que a imobilização de espécies na

superfície do eletrodo altera a resposta do sensor quando expostos a fontes luminosas. Desta

maneira convertem a informação requerida em um sinal óptico detectável, sendo rápidos na

geração de sinal e detecção da resposta, além de serem altamente sensíveis e isentos da

necessidade de marcadores biológicos. As desvantagens dos métodos ópticos estão associadas

a penetração limitada da luz, interferência na medida devido à presença de outras espécies

biológicas, sensibilidades às variações de pH e temperatura, além de custos elevados

(ALCANTARA, 2017). Uma das técnicas ópticas que mais tem sido utilizada atualmente é a

31

Ressonancia de Plasmon de Superfície (SPR) no qual o ângulo de SPR resultante é altamente

sensível a mudanças nas propriedades ópticas do sistema, uma característica interessante na

detecção de biomoléculas (CHOI, et al., 2014; LUZ, 2015)

Figura 5. Diferentes classificações dos biossensores.

Fonte: ALVES, 2016. Adaptado.

Os métodos piezoelétricos realizam a medida da mudança da quantidade de massa

depositada sobre a superfície de um cristal oscilante. Sistemas utilizando cristais de quartzo,

denominado microbalança de cristal de quartzo (EQCM), são frequentemente utilizados no

desenvolvimento de biossensores os quais baseiam-se no princípio de cobrir a superfície do

eletrodo com uma substância biologicamente ativa que irá entrar em contato com uma solução

contendo o analito de interesse. Caso haja ligação entre a molécula e o analito haverá aumento

de massa sobre a superfície do eletrodo e então a frequência de oscilação do cristal de quartzo

irá diminuir proporcionalmente. A principal desvantagem desse método diz respeito a

sensibilidade do ensaio que é totalmente dependente da massa do analito, podendo analitos

muito leves como fármacos, hormônios e toxinas não possuírem massa suficiente para causar

mudança significativa na frequência (WANG et al, 2011; AFONSO, 2013).

Voltamétricos

Impedimétricos

Amperométricos

32

Os biossensores eletroquímicos são frequentemente utilizados devido a sua

simplicidade, alta sensibilidade, e rápida resposta na conversão do sinal biológico em um sinal

útil de corrente, potencial ou impedância elétrica, além de permitirem detecções em uma ampla

faixa de concentração. A combinação entre as técnicas eletroquímicas e o reconhecimento de

biomoléculas trouxe grandes avanços para a ciência, podendo ser aplicado em diferentes áreas,

incluindo a análise e detecção de doenças. (CASTRO, 2020; ARDUINI et al., 2016).

2.3.2 Imunossensores Impedimétricos

Os imunossensores são biossensores de afinidade que se baseiam na especificidade

da ligação entre antígeno e anticorpo em concentrações muito baixas e em matrizes biológicas

complexas, como o sangue (WANG et al., 2008). Essa ligação geralmente é não covalente,

sendo, portanto, reversível e mantidas por forças intermoleculares (ligações de hidrogênio,

ligações de van der Waals, forças eletrodinâmicas e hidrofóbicas) que são individualmente

fracas, porém na totalidade proporcionam uma forte coesão entre o antígeno e o anticorpo

(CASTRO, 2020).

Neste tipo de biossensor pode ocorrer a imobilização do antígeno ou do anticorpo

e a ligação específica entre essas moléculas gera mudanças na massa, resistência a transferência

de carga, nas propriedades ópticas, as quais serão detectadas por um transdutor (DMITRIEV et

al., 2002). A maior vantagem de se utilizar tais moléculas é que não há necessidade de

purificação das amostras antes da detecção (CHAMBERS et al, 2008).

Os primeiros estudos realizados objetivando o desenvolvimento de imunossensores

foram realizados por Yalow & Berson (1959), porém somente a partir da década de 80 é que

esses dispositivos passaram a ganhar destaque. Atualmente os imunossensores têm despertado

grande interesse, uma vez que podem proporcionar detecções rápidas e seguras e quantificação

de biomoléculas com aplicação em análises ambientais por meio da análise de campos e rios

(GIZELI e LOWE, 1996), avaliações clínicas para diagnóstico e prevenção de doenças (LUZ,

2015), no controle de qualidade dos alimentos (CHOWDHURY, 2012), dentre outros.

Os imunossensores podem operar de forma direta (não marcados) ou indireta

(marcado) de acordo com o mecanismo de reconhecimento proposto, isso significa que o

imunossensor pode detectar diretamente a interação Ag-Ab ou empregar uma molécula,

geralmente uma enzima ou um composto fluorescente que irá sinalizar a formação do

33

imunocomplexo. Os sensores não marcados são preferíveis em relação aos marcados uma vez

que dispensam o uso de compostos adicionais para a marcação, ocorrendo a detecção em uma

única etapa (FARIA, 2018; PICÓ, 2014).

Os imunossensores impedimétricos são biossensores eletroquímicos que

monitoram a impedância elétrica e seus componentes: resistência e capacitância, os quais

empregam medidas diretas dessas propriedades (GOMES, 2011) utilizando para tal a

espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE).

A EIE é uma técnica eletroquímica, não destrutiva, ou seja, que proporciona

medições sucessivas sem deteriorar o sensor. Além disso possibilita a investigação de alterações

na superfície por meio da mudança da resistência elétrica devido à facilidade ou a dificuldade

da transferência de elétrons da sonda redox para a superfície do eletrodo. Essa técnica pode ser

utilizada para caracterização do eletrodo ou na obtenção da resposta analítica do imunossensor,

sendo possível desenvolver dispositivos livres de marcadores, uma vez que a formação do

imunocomplexo gera uma mudança na resposta do sistema, simplificando e diminuindo custos

no desenvolvimento do imunossensor (RUSHWORTH et al, 2014; ALVES, 2016).

O princípio da técnica consiste na aplicação de um estímulo elétrico (perturbação) que

pode ser o potencial ou a corrente. Ou seja, é realizada uma análise dos processos que ocorrem

numa interface eletrodo-solução na condição não estacionária (CHA, 2002, MACDONALD,

1987; ARMSTRONG et al., 1978)

Em sistemas de corrente contínua é possível descrever a Lei de Ohm como:

𝑅 = 𝐸𝐼

sendo: E o potencial aplicado, R a resistência e I a corrente.

No entanto em sistemas de corrente alternada surge uma nova relação entre o

potencial e a corrente que é a impedância (Z), que pode ser considerada, em geral, como um

tipo de resistência. A resposta da corrente ou do potencial que surge pode estar completamente

fora de fase ou defasada em relação a outra função (𝜑 − ângulo de fase), como pode ser

representado na Equação 2 e na Figura 6.

(1)

34

𝐸(𝑡) = ∆𝐸 𝑠𝑒𝑛(𝜔𝑡) → 𝐼(𝑡) = ∆𝐼 𝑠𝑒𝑛(𝜔𝑡 + 𝜑)

sendo: E(t) é o potencial aplicado, 𝜔 a frequência angular definida por 𝜔 = 2𝜋𝑓, I(t) a

corrente decorrente da perturbação aplicada e 𝜑 o ângulo de fase.

Figura 6. Resposta senoidal da corrente frente a uma perturbação no potencial, evidenciando o ângulo de fase

Fonte: SOUSA, 2013.

Durante a medida, o potenciostato converte, através da Transformada de Fourier, o

eixo do tempo em um eixo de frequência 𝜔. A frequência é então variada com a perturbação

aplicada no sistema, ocorrendo uma variação de frequências (determinada pelo operador) na

qual em cada frequência é obtida a relação corrente – potencial, ou seja, a impedância que

corresponde àquela determinada frequência.

O número 𝑍(𝜔) é descrito como uma série complexa contendo uma parte

imaginária 𝑍′′ e outra real 𝑍′, podendo ser descrita pela equação 3.

𝑍(𝜔) = 𝑍′(𝜔) + 𝑗 𝑍′′(𝜔) (3)

em que 𝑗 é número imaginário de valor √−1 e |𝑍| o módulo da impedância.

(2)

(3)

35

Essa função pode ser representada em um plano complexo em que o componente

real fica localizado no eixo das abscissas e o componente imaginário no eixo das ordenadas,

obtendo assim uma das representações gráficas mais utilizadas em EIE, o diagrama de Nyquist

representado na Figura 7.

Figura 7. Diagrama de Nyquist para um sistema eletroquímico simples.

Fonte: ROCHA, 2014.

Através do diagrama de Nyquist podem ser obtidos parâmetros importantes na

análise de EIE (resistência ôhmica da solução (Rs), a resistência de transferência de carga (Rct)

e a capacitância da dupla camada elétrica, (Cd) e uma variação linear em média e baixas

frequências (GIROTTO, 1999).

Para avaliar a variação de impedância em uma célula eletroquímica é conveniente

considerar um circuito equivalente, que é representado por uma combinação de elementos de

um circuito elétrico que irá representar o sistema em estudo, ou seja, modelar através de um

circuito as transformações que acontecem na interface eletrodo-solução. É comum representar

sistemas biológicos utilizando-se o circuito de Randles composto por um elemento de fase

constante (Q), resistores (Rs e Rct) além da impedância de Warburg (Zw), como mostra a Figura

8 (CARVALHO, 2006).

Neste circuito, Rs representa a resistência da solução eletrolítica e está associada à

região de alta frequência; Rct corresponde a resistência a transferência de carga relacionada com

a facilidade ou a dificuldade com que ocorre a transferência eletrônica da sonda na interface. O

elemento de fase constante, Q, leva em consideração os desvios do comportamento ideal de um

36

capacitor puro como rugosidades na superfície, presença da camada difusa e a adsorção de íons

na superfície do eletrodo. Zw é a impedância de Warburg que decorre da difusão de reagentes

para o eletrodo e/ou de produtos do eletrodo para a solução (LVOVICH, 2012; LASIA, 2002).

Figura 8. Representação do circuito de Randles

Fonte: Carvalho, 2006. Adaptado.

Assim, EIE é uma técnica eletroquímica que pode ser utilizada, por exemplo, para

monitorar a adsorção de proteínas, uma vez que não necessita que a molécula imobilizada ou

reconhecida seja eletroativa, o que é uma vantagem para aplicação em sistemas imunológicos

(FARIA, 2018).

O trabalho desenvolvido por Santos et al. (2016) descreve o desenvolvimento de

um imunossensor eletroquímico para a detecção qualitativa de Tripanossomíase americana em

amostras de soro. Foram utilizados eletrodos de ouro modificados com monocamadas auto-

organizadas (SAM) de 3-MPA, e após ativação com EDC/NHS os antígenos T. cruzi foram

imobilizados sobre a plataforma. Foram otimizados os parâmetros: concentração, tempo de

incubação do antígeno e do anticorpo utilizando Fe(CN)63−/4− como sonda redox. Os resultados

indicam que o imunossensor é seletivo e sensível para detecção qualitativa de anticorpos anti

T. cruzi sendo uma alternativa promissora no diagnóstico da doença de Chagas.

A transdução por EIE combinada com a tecnologia imunossensora também foi

utilizada por Ionescu et al. (2010) para detecção de atrazina, um herbicida utilizado para o

controle de ervas daninhas. Para tal, foi utilizado um eletrodo de ouro modificado com filme de

polipirrol (poli) e ácido nitrilotriacético (NTA). O filme denominado poli-NTA foi previamente

modificado com íons Cu2+. Sobre essa plataforma foram imobilizados anticorpos anti-atrazina

K47 marcados com histidina. A imunorreação entre atrazina e a plataforma resultou em um

37

aumento de resistência do sistema proporcional à concentração do composto, permitindo a

detecção de uma concentração de 10 pgmL-1.

A avaliação do receptor de fator de crescimento epidérmico HER2, superexpresso

em muitas neoplasias, ajuda a reduzir as taxas de mortalidade por câncer de mama. Pensando

nisso, Sharma et al. (2018) propuseram um imunossensor impedimétrico altamente sensível e

de baixo custo para detectar a presença de HER2 empregando eletrodos impressos de grafite

modificados com nanopartículas de ouro. O método proposto exibiu uma ampla faixa linear de

0,01 – 100 ng mL-1 e limite de detecção de 10 pg mL-1 demonstrando um grande potencial para

o monitoramento dos níveis do receptor HER2 para auxiliar no tratamento do câncer de mama

e outras formas de câncer.

Os trabalhos relatados são alguns, dos inúmeros exemplos de trabalhos relacionados

com o desenvolvimento de imunossensores impedimétricos para detecção de diversos tipos de

analitos em diferentes áreas que podemos encontrar na literatura. Verificou-se que até 2018

foram publicados cerca de 715 trabalhos com base nesse tema, apresentando um aumento

significativo a partir do ano de 2008, como pode ser observado na Figura 9.

Figura 9. Número de publicações com base no tema imunossensor impedimétrico de 1995 a 2018.

1996 2003 2009 20150

50

100

150

200

250

300

Num

de p

ublic

açõe

s

Ano

Fonte: WEB OF SCIENCE, 2020.

38

2.3.3 - Eletrodos impressos

A regeneração da superfície após a utilização do biossensor é a maior dificuldade

para o desenvolvimento de eletrodos sólidos comerciais (NASCIMENTO, 1998). De certo

modo, a regeneração da superfície e consequentemente recuperação do anticorpo ou antígeno

imobilizado não tem sido satisfatória. A solução para tal é o emprego de eletrodos impressos

que são confeccionados com o objetivo de serem descartáveis, sendo os mais adequados para a

comercialização (RICCARDI, 2002).

Existem, comercialmente, uma gama de variedades desses eletrodos

confeccionados a base de um filme de tinta depositado sobre um suporte geralmente de

cerâmica, pelo método silk-screen e cobertos por uma segunda camada de material isolante

(NASCIMENTO, 1998). Estes eletrodos são projetados na forma de um único sistema contendo

o eletrodo de trabalho, o eletrodo de referência e o contra eletrodo acoplados em um único

dispositivo, sendo comercializados na forma de eletrodo descartável, mostrando versatilidade

em seu uso modificado e não modificado em várias aplicações (HONEYCHURCH et al., 2002;

MASAWAT et al., 2003; TSAI et al., 2006; LASCHI et al., 2006).

Existem eletrodos impressos de diferentes configurações e formatos que podem ter

a sua superfície modificada de acordo com a finalidade pretendida. A Figura 10 mostra alguns

exemplos de eletrodos impressos comercializados pela empresa Metrohm DropSens.

Figura 10. Exemplos de eletrodos impressos comercializados pela Metrohm DropSens. (a) eletrodo de ouro do tipo BT, (b) eletrodo duplo de ouro tipo simétrico (c) eletrodo de grafite (d) eletrodo duplo de ouro (e) eletrodo duplo de grafite.

Fonte: METROHM, 2019.

(a)

(b) (d)

(e) (c)

39

Os eletrodos impressos têm sido considerados muito atrativos devido a sua

versatilidade e baixo custo, dispensando o tratamento do eletrodo, possibilitando utilização da

plataforma in situ e permitindo que sejam realizadas análises com baixos volumes de amostras,

sendo interessante para o meio ambiente e economicamente, podendo ser utilizados como

ferramentas para os chamados dispositivos de teste point of care: sistemas portáteis para

diagnóstico junto ao paciente que apresentam resultados rápidos, grande exatidão e fácil

manipulação (SANTOS, 2013; SILVA, 2015).

Existe também a possibilidade desses eletrodos serem confeccionados com dois

eletrodos de trabalho, viabilizando detecções simultâneas e diminuindo o tempo de análise

(AHMED et al., 2013).

2.3.4 - Eletrodos Modificados

A denominação eletrodo quimicamente modificado foi utilizado primeiramente na

eletroquímica na década de 70 para caracterizar eletrodos que continham moléculas

quimicamente ativas imobilizadas em sua superfície (PEREIRA, 2002). O objetivo de uma

modificação é melhorar a condutividade, seletividade, garantir reprodutibilidade, amplificação

do sinal e permitir a imobilização de biomoléculas que não se ligam diretamente ao eletrodo,

além de permitir maior robustez e o uso de metodologias simplificadas (BERGAMINI, 2007).

Os métodos mais importantes para a modificação de um eletrodo consistem em

adsorção, ligação covalente, filmes poliméricos e materiais compósitos. De forma geral, o

método escolhido está intimamente relacionado com as características do substrato e da solução

modificadora, assim como o tipo de modificação a ser escolhida dependerá do material do

eletrodo e também da estrutura da molécula que se pretende imobilizar ou detectar. Assim, a

grande variedade de materiais e possibilidade de combiná-los torna a modificação de eletrodos

uma promissora vertente da eletroanálise (PEREIRA, 2002; SOUZA, 2017).

Neste âmbito, uma das modificações mais promissoras é o emprego de

monocamadas auto organizadas (SAM’s), estruturas que se formam a partir da adsorção de

moléculas em uma superfície, geralmente o ouro (AFONSO, 2013). Além das SAM’s um outro

tipo de modificação que tem sido bastante aplicada é a utilização de filme polimérico, uma vez

que tem mostrado ser uma plataforma eficiente devido à presença de grupos funcionais em sua

40

estrutura responsáveis por auxiliar na imobilização de biomoléculas (GOMES, 2011;

PEREIRA, 2002).

Neste trabalho, foram utilizados dois tipos de materiais de eletrodo (ouro e grafite),

cada um com suas características específicas. Tomando como princípio os trabalhos já

realizados por nosso grupo, para o eletrodo de ouro foi utilizada modificação com SAM e para

o eletrodo de grafite foi realizada a formação de um filme polimérico. Sendo assim esses dois

tipos de modificação foram destacados nos próximos tópicos, explicitando as condições para

tal utilização e a importância de cada um no desenvolvimento de biossensores.

2.3.4.1 Monocamadas auto organizadas

A imobilização das biomoléculas é uma etapa fundamental, pois é o que garante

uma maior retenção de moléculas com atividade biológica na superfície do transdutor,

garantindo-se a este, maior sensibilidade e estabilidade. Para isso, existem alguns

procedimentos que permitem que estas condições sejam satisfeitas. Um exemplo é a utilização

de monocamadas auto organizadas (SAM’s) para modificação da superfície do eletrodo

(ANSARI et al, 2010; MOCCELINI et al, 2008).

As SAM’s tem sido largamente utilizadas para o desenvolvimento de biossensores

em virtude da sua versatilidade, simplicidade, estabilidade e capacidade de formar superfícies

altamente organizadas, sendo formadas por cadeias orgânicas altamente ordenadas que se fixam

na superfície do eletrodo a partir da interação entre este e o grupo funcional de uma das suas

extremidades, ficando o outro grupo funcional livre para possibilitar a imobilização da molécula

de interesse (ARYA et a.l, 2004; ASAV et al., 2010).

Para uma imobilização efetiva de proteínas sobre SAM’s são utilizados agentes de

acoplamento (EDC-NHS, glutaraldeido), que ativam a formação de uma ligação amida ou éster

entre os grupos carboxílicos terminais da monocamada e as proteínas (LOVE et al, 2005;

HOMOLA; 2008).

Um dos exemplos de monocamadas mais empregados por pesquisadores é o que

explora moléculas de tióis e eletrodos de ouro devido à alta interação do agrupamento enxofre,

que se liga espontaneamente à superfície do ouro. Assim, diversas monocamadas podem ser

41

utilizadas uma vez que o tamanho da cadeia carbônica e o grupo funcional da extremidade

oposta ao enxofre podem variar conforme a finalidade de uso do sensor (SMITH et al., 2007).

A Figura 11 representa a adsorção de uma monocamada formada a partir do ácido

3-mercaptopropiônico.

Figura 11. Representação esquemática da SAM 3-MPA sobre a superfície do ouro.

A metodologia mais aplicada para formação de monocamadas em ouro é a imersão

deste substrato em uma solução etanólica do tiol diluída por um período de tempo específico à

temperatura ambiente. A densidade de cobertura é conseguida quase que imediatamente, porém

o processo de organização é lento, requer de 18 a 24 horas para potencializar a densidade de

cobertura e diminuir os defeitos da SAM, levando a formação de uma monocamada altamente

organizada (SOUTO, 2016).

A utilização de monocamadas para modificação de superfícies está muito bem

estabelecida, apresentando-se como o principal método de funcionalização de superfícies

empregados na construção de biossensores, podendo ser encontrados na literatura inúmeros

artigos e capítulos de livros que abordam tal tema (BAHADIR e SEZGINTURK, 2016;

MANAKHOV et al., 2016; PRABOWO et al., 2016).

2.3.4.2 Filmes poliméricos

Os filmes poliméricos são formados pela repetição de inúmeras unidades químicas

denominados monômeros. Devido a sua alta massa molecular os polímeros são denominados

O

S

OH

O

S

OH

O

S

OH

O

S

OH

42

macromoléculas podendo ser orgânicos ou inorgânicos sendo os orgânicos mais investigados e

relevantes comercialmente (GOMES, 2011).

A técnica mais comum de preparação dos filmes poliméricos é a polimerização

eletroquímica por voltametria cíclica, uma vez que se trata de uma técnica simples e

reprodutível realizada a temperatura ambiente. Esse processo ocorre em uma célula

eletroquímica que contém o eletrodo imerso em um meio adequado contendo o monômero, e

assim através da aplicação de potencial iniciando o processo de eletropolimerização (FAEZ,

REZENDE, MARTIN et al., 2000; GERARD, 2002; FERREIRA et al, 2011; JANÁKY, 2014).

Os polímeros contendo ligações π conjugadas apresentam propriedades eletrônicas

diferentes das designadas a polímeros comuns como condutividade elétrica, baixa energia de

ionização e transição óptica e elevada afinidade eletrônica. Por isso esses polímeros podem ser

chamados de metais sintéticos, uma vez que possuem características semelhantes aos metais e

preservam propriedades convencionais dos polímeros orgânicos (DE CASTRO et al, 2011).

A utilização de filmes poliméricos para o desenvolvimento de biossensores tem se

tornado cada vez mais relevante, pois tem mostrado ser uma plataforma eficiente devido à

presença de grupos funcionais preservados em sua estrutura responsáveis por beneficiar a

imobilização de biomoléculas. Além disso, essa modificação garante à plataforma maior

estabilidade, sensibilidade, seletividade e aplicabilidade se comparados à superfície sem

modificação (PEREIRA, 2002; SANTOS, 2014).

A utilização de monômeros fenólicos para a formação de filmes poliméricos tem

sido amplamente estudada, dado que o grupo hidroxila ligado ao anel aromático pode ser

oxidado gerando um cátion radical, espécie indispensável para iniciação da eletropolimerização

(SILVA, 2008).

O ácido 4-hidroxifenilacético (4-HFA), mostrado na Figura 12, é um exemplo de

monômero fenólico, também conhecido como ácido para hidroxifenilacético, um composto

eletroquimicamente ativo que apresenta um anel benzênico e dois grupos funcionais ligados a

ele, sendo: uma hidroxila (-OH) e outro uma carboxila (-COOH) o que o torna interessante para

o estudo da interação de filmes poliméricos com biomoléculas, especialmente aquelas que

possuem carga liquida total positiva.

43

Figura 12. Estrutura química do 4HFA.

Rodrigues et al. (2014) propuseram um mecanismo de eletropolimerização do

monômero 4-HFA, mostrado na Figura 13, que pode ser dividido em três etapas: (i)

inicialização do monômetro por eletro-oxidação; (ii) a polimerização por acoplamento do cátion

radical aos carbonos aromáticos pelo oxigênio fenólico e, posteriormente, a eliminação de

prótons para restabelecer a aromaticidade. A propagação é estabelecida pela reoxidação do

oligômero na superfície do eletrodo durante os ciclos de potencial; (iii) a fase de terminação

ocorre ao término da ciclagem de potencial, obtendo-se os filmes poliméricos adsorvidos na

superfície do eletrodo.

Figura 13. Mecanismo de eletropolimerização do monômero 4-HFA.

Fonte: CORRÊA, 2015.

44

Pode-se dizer que eletrodos modificados com poli(4-HFA) encontram-se

funcionalizados possuindo grupos que favorecem a imobilização de biomoléculas, garantindo

estabilidade efetiva para o componente biológico, sendo de grande interesse para o

desenvolvimento de biossensores (CORRÊA, 2015).

Gomes (2011) utilizou um eletrodo de grafite modificado com ácido poli(4-HFA)

como plataforma para investigações das principais características estruturais térmicas e

eletroquímicas do filme polimérico utilizando, para tal, as técnicas FTIR, UV-Vis e

Fluorescência. Resultados mostraram que o ácido poli(4-HFA) apresenta estrutura heterogênea

e complexa e que não apresenta boa estabilidade térmica em temperaturas acima de 100 ºC.

Também foi verificado que após a eletropolimerização os grupos funcionais do ácido são

preservados e que novos grupos são formados. Essa plataforma foi então utilizada no

desenvolvimento de um imunossensor amperométrico para diagnóstico de Leishmaniose

Visceral.

2.3.5 - Biossensores aplicados na detecção da doença de Chagas e Leishmaniose Visceral

Nos últimos anos, vários estudos foram realizados com o objetivo de desenvolver

imunossensores utilizando diferentes técnicas de transdução, como por exemplo SPR, EQCM,

amperometria, aplicáveis para a detecção de LV e DC. Em 2015, Ferreira et al. (2015)

reportaram o desenvolvimento de um imunossensor amperométrico para a detecção da doença

de Chagas utilizando antígenos imobilizados em eletrodos de ouro modificado com SAM de

cisteamina ativadas com glutaraldeido. Os anticorpos presentes em soros de pacientes

interagiram com a superfície e a interação foi monitorada por cronoamperometria em um

potencial de -400 mV.

Adotando a microbalança de cristal de quartzo como sistema de transdução Ramos-

Jesus et al. (2011) desenvolveram um imunossensor para o diagnóstico de LV canina utilizando

o antígeno de Leishmania chagasi (rLci2B-NH6) que foi imobilizado em SAM de cisteamina

ativada com glutaraldeido. Os autores afirmam que os imunossensor mostrou bons resultados

sendo capaz de distinguir soros positivos e negativos para L. chagasi diluídos até 1:1600.

Um imunossensor baseado na ressonância de plasmon de superfície (SPR) foi

desenvolvido por Souto et al (2013) utilizando um chip de SPR modificado com SAM 11MUA

45

para detecção de anticorpos anti-L. infantum. Técnicas de voltametria cíclica (CV),

espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) e microscopia eletroquímica de varredura

(SECM) foram empregadas na caracterização da imobilização do antígeno. De acordo com os

autores, o sensor apreentou boa resposta permitindo a análise em tempo real sem a necessidade

de marcadores, sendo aplicados em soros diluídos até 1:6400, mostrando ser uma grande

perspectiva como sistema de sensoriamento para LV em regiões endêmicas.

Maia e Campino (2008) avaliaram vantagens e desvantagens dos métodos

disponíveis para diagnóstico de LV nas diferentes fases da doença. Foram investigados testes

parasitológicos, sorológicos e moleculares totalizando cerca de 12 métodos dentre eles ELISA,

IFI e PCR. Segundo os autores, uma técnica padrão deve possuir alta sensibilidade e

especificidade, ser reprodutível, fácil de executar, adaptável em laboratórios sem a necessidade

de equipamentos sofisticados e ser capaz de detectar a doença principalmente em estágios

iniciais sem o uso de metodologias invasivas. Porém nenhum dos métodos analisados possuem

esse conjunto de características, então os autores sugerem que mais pesquisas são necessárias

no desenvolvimento de metodologias que contemplem todas as particularidades citadas.

Luz et al. (2015) desenvolveram e avaliaram um imunossensor para a detecção de

anticorpos anti-T. cruzi utilizando SPR. Foram testadas para modificação do chip de ouro de

SPR SAM’s de 3-MPA e 11-MUA ativadas com EDC-NHS como plataforma para imobilização

para antígenos T. cruzi. Após a construção do sensor pools de soros humano positivo e negativo

foram testados, sendo o imunossensor capaz de detectar e discriminar essas amostras de forma

simples, rápida e eficaz representando um trabalho encorajador para o progresso do diagnóstico

da doença de Chagas.

Foguel et al. (2011) utilizaram CDtrodos de ouro modificados com 4-

(metilmercapto) benzaldeído como plataforma de imobilização da proteína Tc85 do

Trypanosoma cruzi na construção de um imunossensor amperométrico para diagnóstico da

doença de Chagas. Os autores concluíram que os CDtrodos possuem vantagem de apresentarem

menor custo, sendo o preço do CDtrodo de apenas 6% do valor de um eletrodo impresso e que

o imunossensor desenvolvido foi capaz de detectar o anticorpo anti-T. cruzi em soros de

pacientes chagásicos.

Regiart et al. (2016) descreveram um imunossensor sanduiche para anticorpos

específicos de T. cruzi anti-IgM que são um biomarcador para a doença de Chagas congênita

46

(CCD). Um eletrodo impresso foi modificado com nanopartículas de ouro (AuNPs). A

plataforma foi caracterizada por microscopia eletrônica de varredura, voltametria cíclica e

difração de raios-X. O eletrodo foi funcionalizado com antígeno recombinante, e então os

anticorpos alvo presentes na amostra de soro foram imobilizados, o anticorpo secundário foi

então adicionado e soluções de H2O2 e 4-terc-butilcatecol e do produto enzimático foram

detectadas a -100 mV. A corrente resultante foi proporcional ao anti-T. cruzi apresentados na

amostra e apresentaram uma tendência linear de 10 a 200 ng mL-1 (R = 0,998). O limite de

detecção foi de 3,03 ng mL-1. Estes valores demonstram que este imunossensor eletroquímico

pode ser utilizado como método sorológico alternativo para o diagnóstico da doença de Chagas

congênita.

A Tabela 1 apresenta alguns estudos, presentes na literatura, referentes ao

diagnóstico de Leishmaniose Visceral e doença de Chagas em relação à infecção estudada,

superfície e/ou tipo do transdutor e técnica utilizada para detecção.

Tabela 1: Exemplos de biossensores construídos para diagnóstico de LV e DC.

Infecção estudada Transdução Tipo de eletrodo Referência

DC EIE Eletrodos de ouro e platina DINIZ et a.l, 2003

DC Amperométrico Eletrodo impresso de ouro FERREIRA et a.l, 2005

DC Amperométrico Eletrodo de ouro BELLUZO et al., 2011

DC EIE Eletrodo de ouro SANTOS et al., 2016

DC SPR Chip de ouro LUZ et al., 2015

LV VPD Eletrodo de carbono vítreo MOHAN et al., 2011

LV SPR Chip de ouro SOUTO et al., 2013

LV VPD Eletrodo de ouro MORADI et al., 2016

LV EQCM Eletrodo de ouro RAMOS-JESUS et al., 2016

LV SPR Eletrodo de ouro FERREIRA et a.l, 2017

Vale ressaltar que em todos os trabalhos descritos essas doenças são detectadas e

estudadas de formas separadas e que não foi encontrado na literatura trabalhos desenvolvidos

para o estudo de ambas as infecções e que descrevesse uma metodologia aplicável no

diagnóstico de tais doenças utilizando eletrodos impressos duplos. Os dispositivos do tipo point

47

of care apresentam vantagens e grande potencial de serem convertidos em ferramentas

diagnósticas com possíveis aplicações em atendimento de triagem de doadores em bancos de

sangue, acompanhamento pós terapêutico, acelerando a tomada de decisão dos profissionais.

Assim, neste trabalho foi desenvolvido o primeiro imunossensor fundamentado em EIE para

detecção simultânea de anticorpos anti-T. cruzi e anti- L. infantum capaz de detectar de forma

rápida, simples, sensível e específica infecções por esses parasitos.

48

REFERÊNCIAS

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CAPÍTULO 1 – DESENVOLVIMENTO DE UM IMUNOSSENSOR IMPEDIMÉTRICO

BASEADO NA MODIFICAÇÃO DE ELETRODOS DE OURO IMPRESSOS PARA

DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-L.INFANTUM

Os resultados deste capítulo foram publicados na revista Talanta, vol. 195, 2019, pg. 327–332,

tendo o artigo o seguinte título: Label-free electrochemical impedance immunosensor based on

modified screen-printed gold electrodes for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis. Doi:

10.1016/j.talanta.2018.11.087.

RESUMO

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença com alto impacto na saúde pública em muitos

países, tendo os cães como reservatórios primários no ambiente doméstico. A LV apresenta alta

morbidade, mortalidade e importância epidemiológica no continente americano. No presente

estudo, o primeiro imunossensor de impedância eletroquímica utilizando eletrodos impressos

(SPEs) sem a necessidade de marcadores biológicos para a detecção de anticorpos contra

Leishmania infantum foi desenvolvido. Sob condições otimizadas, os antígenos solúveis de L.

infantum foram imobilizados sobre uma monocamada de ácido 3-mercaptopropiônico ativado

pela mistura contendo 100,0 mmol.L-1 de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)

e 150 mmol.L-1 de N-hidroxisuccinimida (NHS). A espectroscopia de impedância

eletroquímica (EIE) foi usada para detectar interações bimoleculares que ocorrem na superfície

do eletrodo. A adição de amostras reais constituídas por soros caninos e humanos positivos e

negativos para LV apresentaram alta sensibilidade e seletividade através da EIE. Com base nos

resultados obtidos, um imunossensor sensível, específico, rápido e simples foi desenvolvido

com sucesso, com potencial aplicação para o diagnóstico sorológico da doença por

leishmaniose.

Palavras-chave: Espectroscopia de impedância eletroquimica, Monocamada Auto-

Organizada, Imunossensor, Leishmaniose Visceral, anti – L. infantum.

60

ABSTRACT

Visceral leishmaniasis (VL), is a disease with high impact on public health in many countries

with dogs as primary reservoirs in the domestic environment. VL presents high morbidity,

mortality, and importance in epidemiology in the American continent. In the present study, the

first label-free electrochemical impedance immunosensor using screen-printed electrodes

(SPEs) for the detection of anti- Leishmania infantum antibodies was developed. The soluble

antigens of L. infantum were immobilized on an SPE by a 3-mercaptopropionic acid monolayer

which was activated by the mixture 100.0 mmol.L-1 1- ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl)

carbodiimide (EDC) and 150 mmol.L-1 Nhidroxisuccinimide (NHS). Electrochemical

impedance spectroscopy (EIS) was used for detecting bimolecular interactions occurring at the

electrode surface. The addition of real samples consisting of canine and human sera positive

and negative for VL presented high sensitivity and selectivity through EIS. Based on the results,

a sensitive, specific, rapid, and simple immunosensor was developed successfully with potential

application for the serological diagnosis of leishmaniasis disease.

Keywords: Electrochemical impedance spectroscopy, Self-Assembled Monolayer,

Immunosensor, Visceral Leishmaniasis, anti-L. infantum

61

1. INTRODUÇÃO

Os métodos sorológicos utilizados no diagnóstico da Leishmaniose Visceral tem

uma ampla aplicação em laboratório porém essas técnicas possuem algumas limitações, uma

vez que são laboriosos, exigem inúmeras etapas para sua realização, podem ocorrer reações

cruzadas com outros tripanossomatídeos, possuem baixa sensibilidade em detecção de casos

assintomáticos e além disso são procedimentos difíceis de aplicar em área endêmicas

(SRIVIDYA et al., 2012; CARVALHO et al., 2017; SILVA et al., 2016). Dessa forma, a

possibilidade de um sistema miniaturizado com baixo custo e aplicação rápida, permitindo o

controle em áreas remotas e de campo é desejado. O desenvolvimento de imunosensores tem

apresentado grande capacidade de diagnóstico e possibilitado a geração de plataformas com

excelente sensibilidade e seletividade, sendo uma grande possibilidade para criação de sistemas

para diagnósticos clínicos, especialmente para doenças que apresentam altos índices de

mortalidade (WANG et al., 2016). Neste trabalho, avaliamos o uso da espectroscopia de

impedância eletroquimica (EIE) como ferramenta para o desenvolvimento de sensores. As

vantagens da EIE como um dispositivo de biosensoriamento está em sua capacidade de

detecção em tempo real, as medidas são diretas, ou seja, não necessitam de marcadores

químicos e/ou biológicos, além de tornar possível a detecção de analitos em meios biológicos

complexos com alta especificidade e sensibilidade (ZHANG et al., 2015; WANG et al., 2008).

Para o desenvolvimento de um sistema eficiente é de suma importância que a

molécula a ser imobilizada consiga se ligar a superfície sensora e, além disso manter as suas

propriedades de reconhecimento. A utilização de Monocamadas Auto organizadas (SAMs)

como fase inicial para construção de imunossensores tem proporcionado maior estabilidade a

essas plataformas preservando as propriedades das moléculas imobilizadas (SOARES et al.,

2015). Neste contexto, a aplicação da técnica de EIE para o desenvolvimento de imunosensores

construídos através de SAMs gera grandes expectativas, principalmente como metodologia para

detecção de doenças parasitárias importantes, como a LV.

Assim, levando em consideração a necessidade de avanços no diagnóstico da LV,

este trabalho mostra o desenvolvimento de uma plataforma de baixo custo para detecção de

anticorpos anti-Leishmania infantum em amostras de soros de cães através da técnica de EIE,

sem necessidade de marcadores biológicos.

62

2. OBJETIVOS

2.1 – Objetivo geral

Desenvolvimento de um imunosensor empregando espectroscopia de impedância

eletroquímica para detecção de Leishmaniose Visceral através da imobilização covalente de

antígenos solúveis de Leishmania infantum sobre Monocamadas Auto organizadas em

superfície de eletrodo impresso de ouro.

2.2 – Objetivos específicos

a) Modificar eletrodos impressos de ouro com Ácido 3-mercaptopropiônico e verificar se

a modificação foi satisfatória através de técnicas eletroquímicas.

b) Imobilizar antígenos solúveis de L. infantum sobre a monocamada e caracterizar

eletroquimicamente a plataforma sensora através das técnicas voltametria cíclica e

espectroscopia de impedância eletroquímica e comparar com o eletrodo não modificado.

c) Definir os melhores parâmetros de tempo de imobilização e concentração de antígeno,

bem como diluições e tempo de interação dos soros com a plataforma.

d) Avaliar o potencial do imunossensor como uma ferramenta aplicável no diagnóstico

sorológico da doença de Leishmaniose Visceral através da adição de amostras de sangue

humano intencionalmente contaminadas com anticorpos anti L. infantum.

63

3. METODOLOGIA

3.1 – Reagentes e soluções

Ácido Mercaptopropiônico (3-MPA), N-hidroxisuccinimida (NHS), 1-etil-3-(3-

dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) , ferricianeto de potássio- [K3[Fe(CN)6], ferrocianeto

de potássio triidratado [K4Fe(CN)6.3H2O], ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico

(HEPES), ácido sulfúrico H2SO4, foram adquiridos da Sigma-Aldrich® (St. Louis, MO, EUA).

Ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), hidróxido de sódio (NaOH), cloreto de sódio

(NaCl), cloreto de potássio (KCl) e ácido hidroclorídrico (HCl) foram adquiridos da Isofar®

(Rio de Janeiro, RJ, Brasil). Tween 20 (surfactante P20) 0.005% e KOH foram obtidos de

NEON (São Paulo, Brasil). Etanol (99,5%) foi adquirido da Dinâmica® Química (São Paulo,

Brasil). Ácido sulfúrico (H2SO4) foi adquirido na Vetec® Química Fina (Rio de Janeiro, RJ,

Brasil).

O tampão HBS-EP pH 7,4 utilizado nas análises e diluições dos antígenos e soros

foi obtido através da mistura de soluções de 10,0 mmol L-1 Hepes pH 7,4; 3,0 mmol L−1 EDTA

pH 8,0; 150 mmol L−1 NaCl e 0,005% polissorbato 20. Os demais reagentes aqui utilizados

apresentavam grau analítico e todas as soluções foram preparadas com água ultrapura, obtida

em um sistema de água Milli Q com resistividade de 18,2 MΩ cm-1.

3.2 - Instrumentação

As medidas voltamétricas e impedimétricas foram realizadas em um

potenciostato/galvanostato da Autolab GSTAT204 equipado com módulo de impedância

FRA32M acoplado a um computador contendo o software NOVA 2.1.3. Os dados de

impedância foram analisados pelo software NOVA 2.1.3. Uma modulação do potencial

senoidal da amplitude de 10 mV foi sobreposta no potencial de circuito aberto (OCP) do

sistema. A amplitude e o ângulo de fase da corrente resultante foram registrados em frequências

variando de 100 kHz a 10 mHz.

64

Análises morfológicas da superfície dos eletrodos impressos foram realizadas

através da técnica de microscopia eletrônica de varredura (MEV) em microscópio da Hitachi

modelo TM3000.

Eletrodos de ouro impressos (SPE-Au), modelo DRP-220 AT, Lote. E0016560,

foram adquiridos da DropSens® (Llanera, Asturias, Espanha). Cada dispositivo contém um

eletrodo de trabalho de ouro, um contra eletrodo de ouro e um eletrodo de referência de prata

fixados em uma base de cerâmica (ver Figura 1).

3.3 - Análises em eletrodo impresso de ouro

Testes iniciais foram realizados em eletrodos impressos de ouro (SPE, screen

printed electrodes) comerciais curados a baixa e alta temperaturas (AT e BT). Ao serem

mantidos em solução etanólica por 24h, percebeu-se que a tinta do eletrodo BT se desprendeu

do suporte cerâmico, enquanto a superfície do eletrodo do tipo AT permaneceu intacta. Assim,

toda metodologia foi desenvolvida com eletrodos de ouro do tipo AT, visto que este possui

maior grau de resistência química. A metodologia desenvolvida está representada no esquema

presente na Figura 1. Vale ressaltar que as análises foram realizadas em triplicata para cada uma

das condições experimentais.

Figura 1. Esquema mostrando o desenvolvimento do imunossensor para detecção de anti L. infantum.

65

3.4 - Produção de antígenos brutos de L. infantum

Os antígenos solúveis utilizados neste trabalho foram obtidos da Universidade

Federal de Ouro Preto (UFOP) que utilizaram promastigotas produzidas in house conforme

protocolo e patente depositados no Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI)

PI0605889-2 .

As formas promastigotas foram cultivadas em meio LIT (Live Infusion Tryptose)

na fase estacionária. Em seguida, os parasitas foram lavados três vezes com solução tampão

fosfato (PBS) pH 7,20, utilizando centrifugação de 600 x g por 10 min. Os parasitas foram

rompidos em banho frio usando um disruptor de célula Sonifier® de 40W (Brason Sonic Power

Co, EUA). Então, uma nova centrifugação foi conduzida em uma centrífuga refrigerada

multifuncional Jouan BR4 (Thermo Electron Corporation) a 37.000 x g por 90 min a 4,0 ° C.

O sobrenadante foi dialisado utilizando PBS pH 7,20 durante 24 h a 4,0 ° C sob agitação, o

restante do material na bolsa de diálise foi filtrado em filtros descartáveis de 0,22 µm (Millipore

co. Massachusetts, EUA), e uma amostra foi retirada para ajustar a concentração de proteína ao

valor de 1000 μgmL-1. Após a confirmação da reação imunológica positiva e negativa pelo

método ELISA, o soro foi armazenado a -80,0 °C.

3.5 - Soros caninos contendo anticorpos anti-L. infantum

As amostras de soro clínico canino positivo foram obtidas de cães infectados em

áreas endêmicas e testadas através dos métodos ELISA e imunofluorescência indireta (IFI). A

Secretaria de Saúde da cidade de Belo Horizonte, Minas Gerais (MG), realizou inicialmente os

diagnósticos dessas amostras durante pesquisa sorológica de LV canina. Estas foram enviadas

para o Laboratório de Imunopatologia da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), em Ouro

Preto - MG, e os diagnósticos foram confirmados através dos ensaios sorológicos. Além disso,

soros clínicos de cães híbridos sadios alojados em regiões não endêmicas (Centro de Animais

da UFOP) foram usados como controle. A coleta de amostras foi aprovada pelo comitê de ética

em pesquisa da UFOP, Projeto no 2007/83.

66

3.6 - Limpeza, caracterização e modificação da superfície do sensor

Análises iniciais foram realizadas em eletrodo impresso de ouro do tipo AT. O

primeiro passo realizado foi investigar, utilizando a microscopia eletrônica de varedura, a

superfície do eletrodo. Este é um passo muito importante, pois a presença de irregularidades na

superfície do eletrodo pode impactar na formação da monocamada. As amostras foram

submetidas a ampliações variadas. As principais características foram processadas e analisadas

através dos softwares providos pelo equipamento.

Imediatamente antes do uso, foi realizado um pré-tratamento eletroquímico da

superfície do substrato através de voltamogramas cíclicos obtidos em solução de H2SO4 0,5 mol

L-1, velocidade de varredura de 50 mV s-1 no intervalo de potencial (∆E) de -0,1 a +1,2 V.

Após a limpeza, o eletrodo foi lavado copiosamente com etanol, e então imerso em

solução etanólica contendo ácido 3-mercaptopropiônico (3-MPA 1,0 mmolL-1) durante 24h

para formação da monocamada. Essa modificação foi realizada com o objetivo de promover

ligação de moléculas proteicas sobre a superfície do sensor, uma vez que essas moléculas não

conseguem interagir diretamente com o ouro. A monocamada de 3-MPA se fixa na superfície

do ouro a partir da interação entre este e o grupo funcional enxofre de uma das suas

extremidades, ficando o outro grupo funcional carboxila livre para possibilitar imobilização da

molécula de interesse.

3.7 - Imobilização de antígenos L. infantum sobre a SAM

Após a formação da SAM, o eletrodo foi lavado várias vezes com etanol e seco em

uma corrente de N2. Foi colocado então sobre a superfície do eletrodo uma mistura aquosa de

EDC/NHS (150 mmol L-1 NHS e 100 mmol L-1 EDC) por aproximadamente 10 minutos cujo

objetivo é ativar os grupos terminais da monocamada. E então, à temperatura ambiente (25 ± 2

° C) e em condições não úmidas, as superfícies ativadas foram cobertas com um volume de 20

µL de antígenos de L. infantum em concentrações de 12,5; 25; 50 e 100 µg/mL por 30 min (após

a escolha da concentração ideal, este tempo foi estudado). Em seguida, o imunossensor foi

completamente lavado com tampão HBS-EP pH 7,4 para remover o excesso de material não

67

ligado. A saturação da superfície do eletrodo foi então investigada utilizando albumina de soro

bovino (BSA) a fim de se evitar ligações inespecíficas.

3.8 - Detecção da imunorreação entre antígenos L. infantum e anticorpos anti L. infantum

Após a imobilização do antígeno na plataforma, e fixadas medidas de concentração

e tempo, o sensor foi testado frente a capacidade de reconhecimento do anticorpo. Assim, foram

depositadas sobre a superfície sensora 20 µL de pool de soro positivo na diluição de 1:320

durante 10, 20, 30 e 60 minutos. O mesmo procedimento foi realizado para amostra de pool de

soro negativo.

Depois de estabelecidas as condições ótimas do sistema a serem adotadas, o

imunossensor foi testado frente a diferentes diluições de pool de soro (1:40, 1:80, 1:160, 1:320,

1:640 e 1:1280) positivos e negativos. A intensidade de cada resposta obtida foi medida por

EIE e valores referentes de Rct para cada diluição foram obtidos após simulação dos dados.

3.9 - Desempenho do imunossensor frente adição de amostras de sangue

O imunossensor desenvolvido também foi testado quanto a capacidade de distinguir

e diferenciar no sangue, uma matriz biológica complexa, anticorpos positivos e negativos. Para

isso dois tipos diferentes de amostras foram utilizados no experimento: amostras de sangue de

voluntários não infectados de nosso laboratório e amostras de sangue contaminadas

intencionalmente com anticorpos anti-L.infantum.

Após a coleta de sangue, as amostras positivas foram preparadas utilizando 30 μL

de sangue puro contaminado com 10 μL de soro positivo e 10 μL de tampão HBS-EP. As

amostras negativas foram preparadas com adição de 30 μL de sangue e 20 μL de tampão HBS-

EP, mantendo o mesmo fator de diluição em ambos. Na análise, 20 μL da amostra de sangue

preparado foram depositados sobre a superfície do imunossensor por cerca de 30 minutos. A

superfície foi então lavada com HBS-EP e o teste foi conduzido. Este procedimento foi

realizado para ambas as amostras.

68

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1 - Caracterização e modificação da superfície do sensor

Imediatamente antes do uso, foi realizado um pré-tratamento eletroquímico da

superfície do substrato através de voltamogramas cíclicos obtidos em solução de H2SO4 0,5 mol

L-1. Este protocolo de tratamento de superfície é o mais amplamente aplicável, pois é capaz de

produzir superfícies limpas, monocamadas ordenadas e altamente reprodutíveis.

O perfil voltametrico obtido após 8 varreduras de potencial se encontra na Figura

2.

Figura 2.Voltamograma cíclico obtido para a superfície do eletrodo impresso de ouro AT não modificada em

solução 0,5 mol L-1 de H2SO4.

Para observar irregularidades e identificar as diferenças na superfície do eletrodo

foram realizadas análises da morfologia dos eletrodos impressos de ouro do tipo AT através da

microscopia eletronica de varredura (MEV). As análises foram realizadas nas ampliações de

1.000x, 2.500x, 5.000x e 10.000x e os resultados obtidos estão presentes na Figura 3.

A microscopia eletrônica de varredura (MEV) é uma técnica versátil para análise e observação

das características microestruturais de materiais sólidos, produzindo imagens de alta resolução

sem perda de nitidez. A MEV é uma das técnicas mais versáteis para a obtenção rápida de

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4-20

0

20

40

60

80

100

120

140

Co

rre

nte

/ A

Potencial / V

69

informações sobre a morfologia, apresentando simplicidade na preparação de amostras e

obtenção de imagens. (DEDAVID, 2007).

Observando as imagens obtidas é possível perceber que o eletrodo impresso do tipo

AT possui cobertura total da tinta sobre a superfície de forma bastante homogênea. Estas

características são de grande importância para formação eficiente da plataforma sensora.

Figura 3. Imagens de MEV para eletrodo impresso de ouro AT nas ampliações de (a) 1.000x, (b) 2.500x, (c)

5.000x e (d) 10.000x.

As técnicas de voltametria cíclica e espectroscopia de impedância eletroquímica

foram utilizadas para caracterizar a SAM formada na superfície do ouro. A análise de processos

redox de sondas eletroquímicas, como o par Fe (CN)63−/4− é uma valorosa ferramenta

(a)

)

(b)

(c) (d)

70

eletroquímica para o acompanhamento da modificação de superfícies metálicas através de

SAMs (CHIDSEY & LOIACONO, 1990; LUZ, 2015). Assim, o par redox Fe (CN)63−/4− foi

utilizado como sonda aniônica para examinar a integridade da SAM formada, bem como os

demais processos eletroquímicos realizados nesse trabalho.

A Figura 4 (curva 1) refere-se ao comportamento redox da sonda para o eletrodo de

ouro não modificado, onde é possível observar dois picos bem definidos para o par redox

indicando que a reação de transferência de massa da sonda redox é completamente controlada

por difusão.

Por outro lado, após a modificação do eletrodo com SAM/3-MPA, Figura 4 (curva 2), tem-se

como resultado uma diminuição do pico de corrente, uma vez que com a modificação as

espécies eletroativas presentes na solução ficam mais distantes da superficie do eletrodo,

diminuindo a velocidade de transferência eletrônica se comparada com a superfície não

modificada (ADAMS et al., 2003; CANCINO & MACHADO, 2012).

Figura 4. Voltamogramas cíclicos obtidos SPE-Au não modificado (curva 1) e modificados com SAM/3-MPA

(curva 2) em solução aquosa contendo Fe(CN)6 3−/ 4− (1.0 mmol L−1) e KCl (0.1 mol L−1), velocidade de varredura

de 50 mV s−1.

-0,3 0,0 0,3 0,6 0,9-240

-160

-80

0

80

160

240

2

1

Corr

ente

/

A

Potencial / V

A fim de obter a confirmação da modificação do eletrodo e mais informações sobre

a transferência eletrônica, foram também conduzidos estudos por Espectroscopia de

71

Impedância Eletroquimica (EIE). A Figura 5 mostra os gráficos de Nyquist para os eletrodos

não modificados e modificados na presença da sonda redox ferro/ferricianeto de potássio. As

linhas sólidas mostram ajustes obtidos a partir da simulação dados. Estes foram simulados pelo

circuito de Randles, representado na Figura 6-1.

Figura 5. Diagramas de Nyquist (gráfico Z’ vs. Z’’) para as medidas de espectroscopia de impedância

eletroquímica realizadas para SPE -Au () e SPE -Au / SAM 3-MPA ().

O valor de qui-quadrado (𝑥²) é uma medida que busca quantitativamente avaliar o

quanto os valores observados se desviam do valor esperado. É um parâmetro não paramétrico,

ou seja, não depende de parâmetros populacionais (média e variância). Todos os circuitos

apresentados neste trabalho apresentaram valores de 𝑥² da ordem de 10-3, apresentando assim

um bom ajuste dos dados experimentais com baixo erro estatistico na simulação dos dados

experimentais.

Os resultados de EIE encontrados para o eletrodo modificado com SAM 3-MPA e

para o eletrodo não modificado foram simulados com sucesso pelo ajuste do circuito de Randles

(Fig. 6-1). Porém, após a adição do antígeno, a camada tornou-se mais espessa e o sistema não

pode mais ser representado por tal circuito. Então, foi proposto outro circuito equivalente,

representado na Figura 6-2, que se ajustou aos dados experimentais.

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

-Z''

/

Z' /

72

Figura 6. Circuitos utilizados para simulação dos dados de EIE. (1) circuito Randles e (2) circuito Randles

modificado.

O circuito 2 possui um elemento representando a resistência da solução (R1), seguido

por dois arranjos paralelos R-Q. O primeiro é composto por um elemento de fase constante

representando a pseudocapacitância da dupla camada elétrica (Q1), em paralelo com uma

resistência a transferência de carga (R2). Na segunda parte, um elemento de fase constante

representa a pseudocapacitância da modificação (Q2) e está em paralelo com a resistência da

modificação (R3) que, por sua vez, está em série com o elemento de Warburg (W) que

representa a difusão semi-infinita das espécies carregadas. A necessidade do uso de dois

componentes para essa plataforma sugere a formação de uma camada altamente porosa de

comprimento variável.

A simulação para o eletrodo impresso não modificado, utilizando o circuito 1, exibe

baixa resistência de transferência de carga (Rct = 4,8 ± 0,8 Ω) sugerindo uma rápida

transferência de carga entre a sonda redox e eletrodo. Após a imobilização da SAM, o valor de

Rct aumentou para 19,9 ± 2,0 Ω, indicando um bloqueio parcial da transferência de carga

interfacial, mostrando que a modificação da superfície foi bem sucedida.

Assim, os resultados obtidos através das técnicas VC e EIE mostraram fortes

evidências da formação da SAM na superfície do SPE-Au. A modificação de eletrodos

utilizando monocamadas representa uma metodologia que garante uma imobilização estável e

orientada para os antígenos preservando suas propriedades, o que é altamente desejado visto

que isso garante robustez e confiabilidade aos imunossensores (FREIRE et al. ,2003; LOVE et

al., 2005).

4.2 - Avaliação e otimização da imobilização de antígenos L. infantum sobre SAM-3MPA

A espectroscopia de impedância eletroquímica é uma técnica muito sensível que

pode ser utilizada para caracterização de superfícies e também para detecção de interações

biomoleculares que ocorrem na superfície do eletrodo (PRODROMIDIS, 2010; MUTREJA,

73

2016; FERREIRA, 2015). Através da EIS é possível medir a resistência à transferência de carga

(Rct) que ocorre na interface eletrodo-solução. Valores baixos de Rct indicam que a transferência

de carga entre a sonda redox e o eletrodo ocorre de forma facilitada. Assim, este parâmetro é

apropriado para detecção de espécies ligadas na superfície do sensor layer by layer, pois à

medida que espécies são ligadas na superfície do eletrodo, dificultando a passagem de elétrons,

os valores de Rct vão aumentando. Sendo possível distinguir assim espécies ligadas (positivas)

de espécies não ligadas (negativas). Este é o princípio de construção do imunossensor proposto.

Após verificação da eficiência da modificação do eletrodo partiu-se para a etapa de

imobilização das espécies de interesse sobre o sistema. Para que ocorra a ligação efetiva do

antígeno na SAM é necessário que esta esteja ativada, com o objetivo de transformar a

terminação carboxílica pouco reativa em grupos reativos e susceptíveis ao ataque nucleofílico

pelos grupos amino livres presentes nos antígenos. Para tal utilizou-se os agentes de

acoplamento EDC-NHS de acordo com os procedimentos já descritos na literatura.

(JONHSSON et al, 1991). A utilização desses agentes em conjunto com SAM para a construção

de biossensores é bastante comum na literatura. (LUZ, 2015).

Ao adicionar o eletrodo na solução alcoólica de 3-MPA uma ligação covalente se

forma entre o grupo sulfeto do 3-MPA e o ouro, deixando o grupo ácido carboxílico disponível

para a reação com EDC-NHS. A reação então, segue da seguinte forma: primeiramente o EDC

reage com os grupos carboxílicos e é formado um grupo intermediário chamado acilureia, o

qual é instável e reativo. Esse intermediário reage com o NHS, o qual se liga através do grupo

ácido carboxílico original. Neste caso se forma um grupo reativo, a amina, considerada mais

estável que o grupo acilureia. Em seguida aminas primárias do componente a ser imobilizado

removem o NHS, liberando-o em solução e se ligam ao ácido carboxílico original. Tal processo

se encontra ilustrado na Figura 7.

A utilização de antígenos imobilizados na SAM ao invés de anticorpos, para o

desenvolvimento de imunossensores, é mais aconselhável. Isso se deve ao fato de que

teoricamente os antígenos são mais estáveis na presença de agentes regeneradores de superfície,

possuem menor perda de funcionalidade, além de apresentarem menor risco de orientações

estruturais incorretas (SHANKARAN et al., 2007).

74

Figura 7. Esquema representando a reação EDC/NHS.

Fonte: KARVE, 2011.

A Figura 8 mostra os gráficos de Nyquist dos antígenos L. infantum imobilizados

sob o eletrodo modificado em comparação com a superfície modificada com 3-MPA na

presença da sonda redox. Os dados de EIE foram simulados com um circuito de Randles

modificado mostrado na Figura 6-2.

Figura 8. Diagramas de Nyquist dos antígenos L. infantum imobilizados sob o eletrodo modificado (antígeno /

SAM 3-MPA / SPE-Au(∆)) em comparação com a superfície modificada com 3-MPA () na presença da sonda

redox.

0 50 100 150 200 250 3000

50

100

150

200

250

300

-Z''

/

Z' /

75

Os espectros de impedância obtidos possuem um semicírculo em frequências mais

altas, sendo relacionado com o processo limitante de transferência de elétrons, e uma parte

linear em baixas frequências devido a etapa limitante de difusão do processo eletroquímico. Os

valores de Rct estão relacionados com o diâmetro do semicírculo no diagrama de Nyquist,

podendo ser empregado para descrever as propriedades da interface do eletrodo (RANDLES,

1947).

Com a imobilização do antígeno L. infantum o sistema exibiu um valor de Rct

moderado que aumentou de 19,9 ± 2,0 Ω (somente SAM 3-MPA) para 72,9 ± 1,9 Ω. É possível

que a adsorção do antígeno sobre a SAM proporcione o aumento de uma camada protetora

isolante que bloqueia parcialmente as espécies redox, dificultando assim a aproximação da

sonda redox para a superfície do eletrodo. Este resultado demonstra grandes indícios de uma

efetiva imobilização do antígeno L. infantum sobre a SAM 3-MPA.

Após confirmada a etapa de imobilização foram testadas diferentes concentrações

de antígeno (12,5; 25; 50 e 100 μg mL– 1) em diferentes tempos de imobilização (10, 20, 30 e

60 min) com a finalidade de caracterizar a imobilização da proteína sobre a monocamada e

obter o tempo de ligação e a concentração de L. infantum necessários para se alcançar uma

elevada cobertura de superfície após interação do antígeno-monocamada. Em seguida as

condições otimizadas foram utilizadas para construção do imunossensor impedimétrico.

A Figura 9 mostra a dependência dos valores de Rct a partir da imobilização de

soluções antigênicas em diferentes concentrações (12,5; 25; 50 e 100 μg mL– 1). A análise

desses dados revela que o aumento da concentração do antígeno é acompanhado pelo aumento

do valor da Rct, sugerindo um maior número de moléculas imobilizadas sobre a monocamada.

Tal fato ocorreu devido ao aumento de espécies ligadas sobre a monocamada dificultar cada

vez mais a transferência eletrônica entre a sonda e a superfície do eletrodo, aumentando assim

a resistência à transferência de carga.

Além disso, foi verificado que esse aumento de resposta aconteceu até a concentração

de 50 μg mL− 1, após este valor de concentração nenhuma mudança importante foi observada.

Esta observação sugere que a cobertura da superfície é saturada quando a concentração do

antígeno é maior que esse valor. Como o procedimento usou o ácido carboxílico ativado para

reagir especificamente com o antígeno, a imobilização do antígeno é limitada à disponibilidade

deste grupo funcional ativado. Portanto, a concentração de antígeno de 50 μg mL−1 foi escolhida

76

para a construção do imunossensor. Vale ressaltar que cada passo de imobilização foi seguido

por lavagem para remover o antígeno não adsorvido, garantindo assim reprodutibilidade do

dispositivo. A avaliação dos diferentes tempos de imobilização (10, 20, 30 e 60 minutos)

realizada na concentração escolhida, está representada na Figura 10.

Figura 9. Efeito da concentração do antígeno no valor da Rct.

0 20 40 60 80 10020

30

40

50

60

70

80

Rct /

[Antigeno] / g/mL

Figura 10. A dependência da Rct em função do tempo de imobilização do antígeno (50 μg mL−1). Todas as

medidas foram realizadas em solução de KCl (0,1 mol L−1) contendo Fe(CN)63−/4− (1,0 mmol L−1).

0 10 20 30 40 50 6020

30

40

50

60

70

80

Rct

/

Tempo de imobilização / min

77

A Figura 10 mostra que o valor da Rct aumentou com o aumento do tempo de

imobilização do antígeno até 30 minutos. Isto sugere que a reação de ligação prossegue

rapidamente e é completada em 30 minutos. Para garantir a eficiência de ligação e usar um

menor período de incubação possível, o tempo de 30 minutos foi selecionado para os

experimentos subsequentes.

4.3 - Detecção e otimização da imunorreação entre antígenos L. infantum e anticorpos anti

L. infantum

Após ser otimizado, em função da concentração e tempo de imobilização do

antígeno, o imunossensor foi avaliado quanto a capacidade de detectar anticorpos anti L.

infantum. Nesta etapa foi realizada a detecção da imunorreação utilizando soros positivos e

negativos na diluição de 1:320 (soro:tampão), onde essa diluição foi escolhida com base em

outros trabalhos publicados para detecção de doenças parasitárias (LUZ, 2015; SOUTO 2013).

A Figura 11 mostra os diagramas de Nyquist obtidos após adição do antígeno e para

o imunossensor na presença de amostras de soro canino contendo anticorpos negativos (Ab−) e

positivos (Ab+).

Figura 11. Diagramas de Nyquist obtidos para antígeno/SAM/3-MPA/SPEAu (curva 1), o imunossensor na

presença de amostras de soro canino contendo anticorpos negativos (Ab , curva 2) e positivos (Ab+, curva 3).

0 150 300 450 600 750 9000

150

300

450

3

2

1

-Z''

/

Z' /

78

É percepitível que a resposta analítica foi detectada para o anticorpo positivo, uma

vez que a interação resultou em um aumento significativo do valor de Rct de 72,9 ± 1,9 Ω (curva

1, somente antígeno) para 518 ± 6,9 Ω (curva 3), o que representa uma alta interação do antígeno

com as amostras sorológicas positivas. Por outro lado, quando avaliado o comportamento do

imunossensor frente ao soro negativo (curva 2), foi observado que o dispositivo apresentou uma

menor resposta (Rct = 302 ± 4,2 Ω), este valor sugere uma certa interação, dos anticorpos

negativos com a plataforma. Isso se deve ao fato de que ao se utilizar antígenos brutos, poderá

haver ligação de algumas proteinas inespecíficas com o soro negativo, o que não compromete

capacidade de detecção para o pool positivo, uma vez que a magnitude da diferença da Rct,

demonstra uma grande discriminação entre as respostas positivas e negativas e reforça a

possibilidade de detecção e diferenciação de tais amostras.

Porém, a fim de reduzir a formação de ligações inespecíficas, diminuir a resposta

do soro negativo e, consequentemente aumentar a diferenciação entre as respostas das amostras

positivas e negativas foi utilizada soro albumina bovina (BSA), empregada para promover o

bloqueio de sítios inespecíficos presentes na plataforma sensora (DAWAN et al., 2011; LUZ,

2015). Após a imobilização do antígeno e, antes da incubação dos soros, foram colocados sobre

a superfície sensora 20 µL de solução de BSA 1% durante 10 minutos, seguido de lavagem em

tampão, e posterior adição dos soros testes. Contudo, ao se utilizar BSA não foram observadas

alterações significativas na respota do biossensor. Assim, BSA não foi utilizada em análises

posteriores.

Após confirmada a ocorrência da imunorreação, utilizando o mesmo fator de

diluição (1:320), foi otimizado o tempo de incubação do anticorpo, apresentada na Figura 12,

através da variação do tempo de interação antigeno-anticorpo.(10, 20, 30 e 60 minutos).

Um tempo mínimo de 10 minutos foi escolhido para garantir interação entre o

antígeno e o anticorpo, tempos maiores que 60 minutos não foram testados, pois o objetivo é

obter um maior valor de diferenciação dos soros positivos e negativos (maior ΔRct de

diferenciação) em um menor tempo de resposta.

79

Figura 12. Valores de Rct obtidos para a detecção de anticorpos positivos e negativos em 10, 20, 30 e 60 minutos

de incubação.

-10- -20- -30- -60-0

200

400

600

Rct

128 R

ct

216

Rct

118

Ab+

Ab_

Rct

128

Rct

/

Tempo de incubação / min

Observou-se que com o passar do tempo há um aumento na resposta do Ab+ e esta

é acompanhada por um aumento, porém menos evidente, na resposta Ab−. Devido ao aumento

do tempo de imobilização, mais anticorpos foram imobilizados na superfície do sensor. Após

30 minutos, os anticorpos positivos imobilizados na superfície atingem a saturação, o que

resulta em nenhuma mudança da Rct. Além disso, este é o tempo de imobilização em que ocorre

o maior ∆Rct, ou seja, a maior diferenciação entre anticorpos positivos e negativos. Estes

resultados sugerem que 30 minutos é o tempo ótimo para imobilização de anticorpos positivos

e negativos.

4.4 - Testes de desempenho do imunossensor

Após a otimização, o imunossensor foi avaliado para detecção de anticorpos anti-L.

infantum em diferentes diluições. Assim, utilizou-se soros caninos divididos em dois pools: um

pool positivo preparado a partir de 10 soros de cães infectados e oriundos de áreas endêmicas e

um pool negativo constituído de 10 soros de cães não infectados pelo parasita. A Tabela 1

mostra os resultados obtidos para os valores da Rct para as diluições positivas e negativas do

pool de soros nas diluições de 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1: 1280, além da variação entre

eles (∆Rct).

80

Tabela 1. Valores de Rct obtidos para os as diluições de 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1: 1280 positivas e

negativas.

Para avaliação do desempenho e especificidade do imunossensor, soros caninos

positivos e negativos foram adicionados sobre a superfície do sensor e a resposta de Rct foi

acompanhada para cada conjunto de amostra. Como pode ser visto na Tabela 1, uma ampla

faixa de diluições dos soros positivos e negativos (1:40 – 1:1280) foi apresentada e para uma

fácil comparação os valores de ∆Rct foram evidenciados, ou seja, a diferença dos valores de Rct

das amostras positiva e negativa em cada diluição, como mostra a Figura 13.

Figura 13. Valores de Rct obtidos para soros caninos positivos e negativos nas diluições de 1:40, 1:80, 1:160,

1:320, 1:640 e 1:1280 e a diferença obtida entre positivo e negativo em cada diluição, ∆Rct.

Fator de diluição Ab+ / Rct (Ω) Ab− / Rct (Ω) ∆Rct

1:40 998 ± 2,7 684 ± 5,0 314 ± 5,6

1:80 826 ± 6,0 532 ± 3,3 294 ± 6,8

1:160 678 ± 1,9 318 ± 2,4 360 ± 3,1

1:320 518 ± 6,9 302 ± 4,2 216± 8.1

1:640 347 ± 3,1 288 ± 3,0 59± 4,2

1:1280 206 ± 5,2 183 ± 2,5 23± 5,7

1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:12800

150

300

450

600

750

900

1050

Rct

/

Diluição

Ab+

Ab_

Rct

A

81

A partir dos dados da Tabela 1 e da Figura 13 observa-se que, para menores

diluições de soro há predominância da ligação específica antígeno-anticorpo positivo, sendo

obtida para essas diluições uma grande discriminação entre as respostas positivas e negativas.

Essa tendência é diminuida à medida que a diluição do soro aumenta, indicando também que o

aumento da diluição resulta em uma menor quantidade de espécies interagindo com os

antígenos imobilizados, exibindo assim um menor valor de Rct a cada aumento de diluição. De

acordo com os dados apresentados o maior valor de ∆Rct foi obtido para a diluição de 1:160,

sugerindo que essa seria a melhor diluição para a realização do teste de diagnóstico, pois quanto

maior esse valor, maior a sensibilidade do teste.

A Figura 14 apresenta a curva de calibração que mostra a relação linear entre Rct e

a proporção de diluição de soros caninos. A correlação obtida mostra que existe uma excelente

relação linear entre as diluições do soro positivo com os valores de Rct obtidos durante 30

minutos, visto que o coeficiente de correlação obtido foi 0,9997.

Figura 14. Valores de Rct em função do fator de diluição para os as diluições positivas de 1:40,

1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1: 1280.

1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:12800

200

400

600

800

1000

1200

Rct

/

Diluições Ab positivo

A resposta do imunossensor frente a amostra de Ab negativos também foi avaliada

como controle sob as mesmas condições. Os valores de Rct detectados para os anticorpos

negativos foram menores que os obtidos para o pool positivo em todas as diluições, mas a

82

diferença foi mais acentuada na diluição 1:160, que como abordado anteriormente, deve ser

selecionada como a provável diluição no teste de imunoensaio.

A detecção preliminar de anticorpos anti-Leishmania infantum também foi

realizada diretamente em amostras de sangue, sem qualquer pré-tratamento. Assim, para teste

de resposta de Rct do sensor, um pequeno volume de sangue (20 µL) foi usado, que pode ser

facilmente obtido a partir de orelhas dos cães ou da polpa digital em humanos. As amostras de

sangue foram depositadas na superfície imunossensora por 30 minutos, e os espectros de

impedância obtidos para amostras positivas e negativas estão representados na Figura 15.

Figura 15. Diagramas de Nyquist mostrando a resposta do imunossensor frente a adição de amostras de sangue

positivo (curva 1) e negativo (curva 2). As medidas foram realizadas em solução de KCl (0.1 mol L−1) contendo

Fe(CN)63−/4− (1.0 mmol L−1).

0 300 600 900 1200 15000

300

600

900

1200

1500

2

1

-Z''

/

Z' /

O aumento observado nos valores de Rct da amostra positiva (141 ± 3,0 Ω) é maior

que o observado com a amostra negativa (88,1 ± 0,9 Ω). A comparação entre os dois valores

indica a excelente seletividade do imunossensor, mesmo quando se utiliza o antígeno bruto e

amostras não processadas, uma vez que a adição de soro negativo é acompanhado de uma uma

resposta menor. Entretanto, o estudo e otimização do biossensor com este tipo de matriz não

foi objeto desse trabalho.

Finalmente, com o objetivo de avaliar a aplicabilidade do imunossensor obtendo

um futuro método de diagnóstico, a estabilidade do imunossensor também foi investigada. Após

83

a imobilização adequada do antígeno, o sensor foi armazenado na geladeira a aproximadamente

4,0°C. Após três semanas o dispositivo foi retirado da geladeira, deixado a temperatura

ambiente por cerca de 10 minutos e então a leitura foi realizada. Foi observado que durante tal

tempo o imunossensor conservou 92% do seu valor de resposta inicial.

É importante destacar que, de acordo com o nosso conhecimento, este é o primeiro

estudo envolvendo a detecção de anticorpos da LV utilizando como plataforma de diagnóstico

um imunossensor impedimétrico descartável. Estas caracteristicas somadas com os dados

obtidos revelam o potencial do imunossensor desenvolvido como plataforma de diagnóstico a

ser aplicado à realidade das áreas endêmicas, onde há necessidade de análise de um grande

número de amostras, em curto espaço de tempo e com baixo custo. Vale ressaltar que objetivo

principal desse trabalho é contribuir significativamente em diversos aspectos relacionados com

o diagnóstico e tratamento adequado da LV.

84

5. CONCLUSÃO

Considerando todos os resultados obtidos nos diferentes experimentos realizados

ao longo do presente estudo é possível concluir que:

a) Neste trabalho foi desenvolvido o primeiro imunossensor impedimétrico do tipo point

of care para a detecção de anticorpos anti L. infantum através da imobilização de

antígenos brutos sobre monocamadas auto-organizadas de 3-MPA, representando uma

ótima estratégia diagnóstica, com a vantagem de ser um método mais barato, em

comparação com os métodos tradicionais de análise, e mais rápido do que outras

plataformas utilizadas até agora na construção de imunossensores para a detecção de

LV.

b) O imunossensor EIS desenvolvido demonstrou alta sensibilidade e especificidade para

detecção de anticorpos anti L. Infantum livre de marcadores, capaz de análise em tempo

real, ilustrando a sua adequação para aplicações clínicas e epidemiológicas para

diagnosticar cães com LV.

c) Com base no apresentado, é possível constatar o grande potencial do imunossensor

desenvolvido em constituir uma ferramenta promissora, sensível, específica e rápida

para o sorodiagnóstico de LV em regiões endêmicas.

85

REFERENCIAS

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88

CAPÍTULO 2 - DESENVOLVIMENTO DE UM IMUNOSSENSOR PARA DETECÇÃO

SIMULTÂNEA DAS DOENÇAS DE LEISHMANIOSE VISCERAL E CHAGAS

SOBRE ELETRODOS IMPRESSOS DUPLO DE GRAFITE

Os resultados deste capítulo foram publicados na revista Biosensors and Bioelectronics, vol.

169, 2020, pg. 112573, tendo o artigo o seguinte título: Impedimetric immunosensor for rapid

and simultaneous detection of chagas and visceral leishmaniasis for point of care diagnosis.

Doi: 10.1016//j.bios.2020.112573

RESUMO

As doenças de Chagas e leishmaniose visceral, enfermidades com alto impacto na saúde pública

em muitos países, são causadas por protozoários da família Trypanosomatidae. A proximidade

genética dos dois patógenos e a prevalência de infecções duplas impossibilitam a interpretação

segura do diagnóstico dessas doenças, principalmente em casos assintomáticos. Neste trabalho,

um imunossensor para a detecção dupla de ambas as doenças foi desenvolvido pela primeira

vez baseado no reconhecimento dos anticorpos anti-T. cruzi e anti-L. infantum presentes em

amostras de soros humanos e caninos. Os antígenos recombinantes de T. cruzi (IBMP8.1) e L.

infantum (rLCi1,2) foram imobilizados de forma isolada sobre cada um dos eletrodos de

trabalho (W1 e W2), previamente modificados com filmes poliméricos derivados do ácido 4-

hidroxifenilacético (4-HPA), de um sistema de eletrodos impressos duplos que compartilham o

eletrodo auxiliar e o de referência. Espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) foi usada

para detectar interações biomoleculares que ocorrem na superfície do eletrodo. Em seguida, a

resistência de transferência de carga (Rct) dessa etapa foi monitorada. Após a construção do

imunossensor, o soro positivo para T. cruzi foi adicionado à sua superfície e mostrou variação

significativa no Rct apenas no W1, acompanhado por uma resposta nula ou muito baixa no W2.

Da mesma forma, soro positivo para L. infantum foi adicionado à sua superfície e mostrou

variação significativa no Rct apenas no W2, indicando excelente seletividade da plataforma. Em

seguida, foram definidos alguns parâmetros para a otimização do dispositivo, incluindo tempo

de imobilização, concentração de antígeno recombinante e tempo envolvido na análise do

imunoensaio. Além disso uma gama de soros em diferentes diluições foi adicionada à superfície

sensora e assim, os anticorpos específicos foram detectados em soros diluídos até 10240 vezes

no eletrodo W1 e 5120 no eletrodo W2, indicando excelente sensibilidade e alta capacidade de

89

discriminação de soro de chagas e leishmaniose. Finalmente o dispositivo foi testado frente

amostra de soros de outras infecções além de soros caninos isentos de qualquer infecção, tendo

como resultado valores insignificantes de ∆Rct se comparados a adição de soro específico na

plataforma, confirmando a alta especificidade do dispositivo. Além disso o imunossensor reteve

70,2% de sua resposta inicial em W1 e 78,2% em W2, após 8 semanas de armazenamento.

Assim, a partir dos resultados obtidos é possível afirmar que o imunossensor proposto foi

desenvolvido com sucesso e o imunoensaio permitiu um sistema duplo simples, eficaz e

específico para a discriminação de anticorpos de Chagas e Leishmaniose Visceral, o que

representa um campo encorajador para o progresso do diagnóstico dessas doenças em regiões

endêmicas contribuindo em decisões clínicas corretas, com capacidade de diagnosticar mais

precocemente tais doenças, impactando positivamente na economia e na vida da sociedade.

Palavras- chave: Leishmaniose Visceral, doença de chagas, imunossensor impedimétrico,

eletropolimerização.

90

ABSTRACT

Chagas disease and Visceral Leishmaniasis, diseases with a high impact on public health in

many countries, are caused by protozoa of the family Trypanosomatidae. The genetic proximity

of the two pathogens and the prevalence of double infections, make it impossible to interpret

the results safely, especially in asymptomatic cases. In this work, a dual detection system

immunosensor has been developed by the first time for detection of anti-T. cruzi and anti-L.

infantum antibodies in serum samples. The T. cruzi and L. infantum recombinant antigens were

immobilized on a poly- hydroxyphenylacetic (4-HPA) on a dual screen-printed carbon

electrode (SPCE) formed by two carbon working electrodes (W1 and W2) sharing auxiliary and

a reference electrode. Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for detecting

biomolecular interactions occurring at the electrode surface. The IBPM 8.1 and rLCi1,2

recombinant antigens at different concentrations were immobilized on the W1 and W2

electrodes respectively. After washing with HBS-EP buffer to remove surplus antigens, the

antigen-modified electrode was treated with BSA solution to avoid non-specific interactions.

Then, the change in the charge transfer resistance (Rct) resulting from this step was monitored.

After the immunosensor construction, serum positive for T. cruzi was added to its surface and

showed significant variation in the Rct only in the W1, accompanied by a null or very low

response in the W2. In the same way serum positive for visceral leishmaniasis was added to its

surface and showed significant variation in the Rct only in the W2 indicating excellent

selectivity of the platform. Then, some parameters for the optimization of the device were

defined, including immobilization time and recombinant antigen concentration and time

involved in the analysis of the immunoassay. After that, a pool of sera infected with T. cruzi

and L. infantum were added to its surface and the antibodies were detected in sera diluted up to

10240 times in the W1 electrode and 5120 for the W2 electrode, indicating excellent sensitivity

and high capability of the technique dual in the discrimination of chagas and leishmaniasis sera.

Finally, the device has been tested to sample sera from other infections, as well as canine sera

free from any infection, resulting in insignificant values of ∆Rct compared to the addition of

specific serum on the platform, confirming the high specificity of the device. In addition, the

immunosensor retained 70.2% of its initial response in W1 and 78.2% in W2, after 8 weeks of

storage. Thus, from the results obtained it is possible to affirm that the proposed immunosensor

91

was successfully developed and the immunoassay allowed a simple, effective and specific

double system for the discrimination of Chagas and Visceral Leishmaniasis antibodies, which

represents an encouraging field for progress diagnosis of these diseases in endemic regions,

contributing to correct clinical decisions, with the capacity to diagnose these diseases earlier,

positively impacting the economy and the life of society.

Keywords: Chagas disease, Visceral Leishmaniasis, impedimetric immunosensor,

electropolymerization.

92

1 INTRODUÇÃO

No Capítulo 1, foi relatada a preparação de um imunossensor eletroquímico com

base em eletrodos de ouro impressos modificados para o diagnóstico de leishmaniose visceral

canina (CORDEIRO, 2019). O imunossensor EIS desenvolvido demonstrou alta sensibilidade

e especificidade para detecção de anticorpos de L. infantum em soros, ilustrando sua adequação

para aplicações clínicas e epidemiológicas para o diagnóstico de LV.

No capítulo 2, foi relatado o desenvolvimento de um imunossensor impedimétrico

para o diagnóstico simultâneo de DC e LV, com o objetivo de estabelecer perspectivas de

melhorias no diagnóstico de ambas as doenças, uma vez que essa metodologia é extremamente

promissora para o diagnóstico dessas e de outras infecções, demonstrando maior sensibilidade

se comparada com a de testes tradicionais utilizados, além da possibilidade de uma análise mais

rápida e em tempo hábil com perspectivas de aplicação em áreas endêmicas.

Após análises preliminares e detecção efetiva da LV utilizando antígenos brutos e

o estabelecimento das condições ótimas de trabalho, descritas no capítulo 1, foram realizadas

análises utilizando antígenos recombinantes de T. cruzi e L. infantum denominados

respectivamente IBMP 8.1 e rLC1.2. O uso de tais biomoléculas permite o desenvolvimento de

uma plataforma mais seletiva e específica para o diagnóstico, proporcionando um

reconhecimento mais eficaz e análise mais acurada de LV e DC. Além disso, os testes seguiram

no sentido de transpor a plataforma para conseguir detectar ao mesmo tempo essas doenças,

utilizando para tal sistemas que permitem detecção simultânea.

Vale destacar que devido a impossibilidade financeira de obtenção de eletrodos

duplos de ouro, então foram consideradas alternativas para que a plataforma fosse substituída,

desde que a eficiência do imunossensor não fosse perdida. Assim, foi proposto a utilização de

eletrodos impressos de carbono grafite, plataforma que possui menor custo em relação aos

eletrodos impressos de ouro, mas que possui diversas abordagens na literatura, inclusive sua

utilização como substrato para imobilização efetiva de biomoléculas (XAVIER, 2017;

GOMES, 2011). Resultados obtidos indicaram que o eletrodo de grafite apresenta

características eletroquímicas apropriadas para a construção de filmes poliméricos, suporte

efetivo para as moléculas biológicas. Dessa forma, a imobilização de antígenos sobre os filmes

pode ocorrer de forma direta sem necessidade de utilização de agentes de acoplamento (EDC-

93

NHS), mantendo a funcionalidade da molécula e além disso diminuindo uma etapa no processo

de desenvolvimento do imunossensor. Por apresentar vantagens que ampliarão os resultados

satisfatórios já obtidos anteriormente os eletrodos impressos duplos de grafite foram

selecionados como plataforma em um sistema de reconhecimento promissor para ser explorado

em imunodiagnósticos simultâneos.

O trabalho traz inovações para a área científica, uma vez que não existem estudos

anteriores relatados na literatura relacionados à detecção simultânea de DC e LV utilizando

eletrodos duplos impressos. O principal propósito desse estudo foi contribuir significativamente

na melhoria do diagnóstico, buscando um disposto seguro e de baixo custo, que consiga detectar

e diferenciar tais doenças principalmente em estágios iniciais, em que a carga parasitária ainda

é baixa, possibilitando um tratamento correto e real aplicação deste dispositivo como uma

ferramenta alternativa para o diagnóstico imunológico dessas infecções.

94

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Desenvolver um imunossensor para detecção simultânea da doença de Chagas e

Leishmaniose Visceral visando elaborar uma plataforma que permita um diagnóstico mais

acurado e específico em relação às técnicas atualmente empregadas. Para tal será realizada a

imobilização de antígenos recombinantes solúveis de T.cruzi (IBMP 8.1) e L.infantum

(rLCi1,2) em eletrodo impresso duplo modificado com poli(4-HFA), empregando a

espectroscopia de impedância eletroquímica como técnica de reconhecimento da interação

antígeno/anticorpo específico.

2.2 Objetivos específicos

a) Avaliar por SPR, em tempo real, as amostras de antígeno recombinante de DC e LV,

frente a adição de soros específicos e não específicos para o antígeno em questão.

b) Estudar a superfície dos eletrodos impressos duplos e investigar a influência da

modificação sobre a imobilização de antígenos e consequente resposta do dispositivo;

c) Definir os melhores parâmetros de tempo de imobilização antigênica, concentração de

antígeno utilizada, bloqueio de sítios inespecíficos, tempo de imunoreação e diluição do

soro.

d) Avaliar por EIE a capacidade de detecção do imunossensor desenvolvido através da

adição de soros específicos e não específicos para infecções pelo T. cruzi e L.infantum

em diferentes diluições.

e) Avaliar o desempenho do imunossensor impedimétrico como técnica para o

imunodiagnóstico simultâneo da doença de Chagas e Leishmaniose Visceral.

95

3. METODOLOGIA

3.1 – Reagentes e soluções

Ferricianeto de potássio [K3[Fe(CN)6], ferrocianeto de potássio triidratado

[K4Fe(CN)6.3H2O], ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico (HEPES), Ácido

perclórico HClO4, foram adquiridos da Sigma-Aldrich® (St. Louis, MO, EUA). Ácido

etilenodiamino tetra-acético (EDTA), hidróxido de sódio (NaOH), cloreto de sódio (NaCl),

cloreto de potássio (KCl) foram adquiridos da Isofar® (Rio de Janeiro, RJ, Brasil). Tween 20

(surfactante P20) 0.005% e KOH foram obtidos de NEON (São Paulo, Brasil). Etanol (99.5%)

e peróxido de hidrogênio (H2O2) foram adquiridos da Dinâmica® Química (São Paulo, Brasil).

Ácido sulfúrico (H2SO4) e hidróxido de amônio (NH4OH) foram comprados na Vetec®

Química Fina (Rio de Janeiro, RJ, Brasil). Ácido 4-hidroxifenilacético (4-HFA) foi adquirido

na Alfa Aesar.

O tampão HBS-EP pH 7,4 utilizado nas análises e diluições dos antígenos e soros

foi obtido através da mistura de soluções de 10,0 mmol L-1 Hepes pH 7,4; 3,0 mmol L−1 EDTA

pH 8,0; 150 mmol L−1 NaCl e 0,005% polissorbato 20. Os demais reagentes aqui utilizados

apresentavam grau analítico e todas as soluções foram preparadas com água ultrapura, obtida

em um sistema de água Milli Q com resistividade de 18,2 MΩ cm-1.

3.2 – Instrumentação

Para as medidas do ângulo de SPR, utilizadas nas avaliações das interações

biomoleculares entre antígenos e anticorpos na superfície do ouro, foi utilizado um

espectrômetro de SPR (MP-SPR Navi™ 200, BioNavis Ltd., Tampere, Finlândia). Este

instrumento possui dois canais (Fig.1), cada um contendo um par de lasers com comprimentos

de onda fixos em 670 e 850 nm. Os dados foram analisados utilizando Data Viewer e

TraceDrawer™ 210A SPR Bionavis software. O princípio de transdução da MP-SPR é baseado

na configuração de Kretchmann.

96

Figura 1. Instrumentação utilizada nos estudos de espectroscopia de ressonância de plásmons de superfície (SPR).

Espectrômetro de SPR BioNavis utilizado para as medidas ópticas.

Eletrodos impressos duplos de grafite (EIDG), modelo DRP-X1110, Lote:

E0019539, foram adquiridos da DropSens® (Llanera, Asturias, Espanha). Cada dispositivo

contém dois eletrodos de trabalho de carbono (W1 e W2), um contra eletrodo de carbono e um

eletrodo de referência de prata fixados em uma base de cerâmica (Fig. 2, a). Chips de ouro de

SPR 12x 20 mm foram adquiridos da BioNavis (FIG 2, b).

Figura 2. Eletrodos utilizados no desenvolvimento do trabalho (a) eletrodo duplo de grafite, (b) chip de ouro para

análises de SPR.

W1

W2

(a) (b)

97

3.3 Obtenção do poliantígeno recombinante IBMP 8.1 e das proteínas rLci2B e rLci1A

As amostras do antígeno quimérico IBMP 8.1 foram cedidas pelo Instituto de

Biologia Molecular do Paraná e foi produzido de acordo com os métodos prescritos por Santos

e colaboradores (SANTOS et al., 2017). Resumidamente, genes sintéticos otimizados para a

expressão de E. coli antígenos quiméricos de T. cruzi foram obtidos de um fornecedor comercial

(GenScript, Piscataway, NJ, EUA). Os genes sintéticos adquiridos no pUC57 foram

subclonados internamente no vetor de expressão pET28a E. coli. O antígeno recombinante foi

expresso como proteínas solúveis em Escherichia coli BL21-Star (DE3) cultivada em meio LB

suplementado com 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido. As proteínas foram

primeiro purificadas por cromatografia de afinidade e de troca iônica, depois quantificadas

usando um ensaio fluorimétrico (Qubit 2.0, Invitrogen Technologies, Carlsbad, CA, EUA).

As proteínas recombinantes rLci1A e rLci2BA foram clonadas em pBK-CMV e

pRSET B, respectivamente. Escherichia coli BL21 (DE3) / pLysS foi transformada com

plasmídeos pRSET contendo a inserção do gene Lci1A ou Lci2B L. infantum. A expressão de

proteína recombinante foi induzida pela adição de 1 mM de isopropil-b-Dthiogalactopyranosid.

Após a etapa de expressão, as proteínas rLci1A e rLci2B foram purificadas por cromatografia

de afinidade, conforme descrito anteriormente por de Souza e colaboradores (de Souza et al.,

2012). Para desenvolver o imunossensor foi utilizada uma mistura equimolar dos antígenos

recombinantes rLci1A e rLci2B, assim, a solução antigênica resultante será denominada nesse

trabalho por rLci1,2. A utilização desses antígenos combinados resulta em ganho no

desempenho do diagnóstico sorológico, além de proporcionar elevada sensibilidade no teste

(KER, 2016).

3.4 – Estudos da interação antígeno e anticorpo empregando SPR

Inicialmente a interação antígeno recombinante de T. cruzi /anticorpo foi analisada

por SPR. Antes do uso, foi realizada a limpeza do chip de ouro de SPR através da imersão do

mesmo em solução contendo NH4OH, H2O2 e H2O (1:1:5) a 250 ºC por 2 a 3 minutos. Em

seguida, o chip foi imerso em água mili-Q por aproximadamente 30 minutos. A plataforma

utilizada para modificação da superfície do chip foi semelhante à descrita na seção 3.6 do

98

capítulo 1. Neste caso, os antígenos recombinantes IBMP 8.1 e rLci1,2 foram imobilizados em

chips de ouro de SPR distintos funcionalizados com monocamada de 3- MPA e ativada com

EDC-NHS. Os testes iniciais foram realizados sob as mesmas condições de tempo e

concentração descritas para o imunossensor impresso de LV desenvolvido (30 min de

imobilização, concentração de 50 µg/mL), e além disso foi realizada etapa de bloqueio com

BSA 1%, durante 10min.

A adição dos anticorpos de T. cruzi e L. infantum foi então acompanhada em tempo

real via deslocamento do ângulo de SPR em função do tempo. O chip de ouro contendo

antígenos recombinantes IBMP 8.1 foi colocado no equipamento e as medidas foram iniciadas

com a adição de um fluxo de 50 µL/min de tampão HBS-EP para obtenção de uma linha de

base. Na sequência, foram injetadas 50 µL de amostras de anticorpos anti T. cruzi positivo e

anti L. infantum positivo ao mesmo tempo em diferentes canais. O fluxo de tampão foi

desligado, e o perfil de resposta foi acompanhado por cerca de 8 minutos. Por fim, o fluxo de

tampão foi novamente acionado a fim de remover espécies fracamente ligadas. Da mesma

forma, o chip de ouro contendo antígenos recombinantes rLc1,2 foi colocado no equipamento

e então foram adicionadas amostras de anticorpos anti T. cruzi positivo e anti L. infantum

positivo, sendo então monitorada a etapa de associação das biomoléculas por cerca de 8

minutos.

3.5- Estudo da influência da modificação da superfície do sensor na imobilização de

antígenos e no reconhecimento da imunorreação

Primeiramente foi testada a viabilidade de se modificar ou não a superfície do

eletrodo. Os eletrodos duplos foram fabricados com tinta de carbono, assim a utilização de

monocamadas para modificação do eletrodo não é recomendada neste caso, uma vez que, como

exposto anteriormente, esse tipo de modificação é usualmente empregado em eletrodos de ouro.

Para a realização da etapa de modificação do eletrodo foi utilizada a técnica de

eletropolimerização para modificação de tal eletrodo.

Antes do procedimento de eletropolimerização os eletrodos foram analisados e

condicionados em solução de ferrocianeto/ferricianeto de potássio numa faixa de potencial de

-0,25 a 0,8 V, posteriormente lavados com água, secos sob fluxo de N2. Após esse procedimento

99

foi realizada voltametria cíclica em ácido perclórico 0,5 M na faixa de potencial de 0,0 a +1,2V,

com o objetivo de verificar a eletroatividade dos eletrodos.

Em um mesmo dispositivo, um eletrodo de trabalho não foi modificado (W2) e o

outro foi modificado (W1) com ácido 4 - hidroxifenilacetico (4HFA). Operacionalmente, para

que isso ocorra, apenas o eletrodo de trabalho W1 deve estar conectado ao potenciostato. A

eletropolimerização do 4-HFA, em W1, foi realizada através da técnica eletroquímica de

voltametria cíclica. O eletrodo de trabalho W1 foi modificado com 10 ciclos de potencial na

faixa de potencial de +0,00 a +1,20 V a 50 mV/s. O eletrodo de trabalho W2 ficou apenas em

contato com a solução do monômero, e como não foi conectado ao potenciostato não houve

eletropolimerização.

O antígeno recombinante foi adicionado sobre ambos os eletrodos, W1 e W2 por

20 minutos e logo após foi adicionado BSA 1% por 10 min. Em seguida, o imunossensor foi

incubado com o analito específico na diluição de 1:320 por 20 min, logo após foi lavado

minuciosamente com tampão, e então a leitura da impedância foi tomada. Este processo foi

realizado em duas plataformas diferentes: uma contendo o antígeno IBMP 8.1 e a outra o

antígeno rLci1,2, sendo os experimentos realizados em triplicata.

Estudos de otimização dos valores utilizados para o número de ciclos, tempo de

imobilização de BSA e a influência dessas variáveis na imunorreação serão detalhados neste

trabalho.

Para os estudos acerca do número de ciclos, os eletrodos foram modificados com 5,

10, 15 e 20 ciclos de potencial, na faixa de +0,0 a +1,2V, mantendo-se a velocidade de varredura

constante a 50 mV/s, sendo esse valor para a velocidade escolhido por ser bastante utilizado e

difundido na literatura (Silva et al, 2008). Após a eletropolimerização, os eletrodos contendo

os filmes poliméricos de poli(4-HFA), foram lavados com água deionizada em abundância e

secos sob fluxo de N2(g).

3.6- Imobilização dos antígenos recombinantes IBMP 8.1 e rLci1,2.

Após a otimização da formação da plataforma polimérica utilizando concentração

fixa de 1µgmL-1 e tempo de imobilização de 20min dos antígenos recombinantes; estudos foram

realizados para monitorar as melhores condições de desses parâmetros. Para tal, sobre diferentes

100

eletrodos contendo filmes poliméricos, foram imobilizados antígenos recombinantes de T. cruzi

em W1 e L. infantum em W2 nas concentrações 1,5, 10, 15, 20, 25, 30 e 35 ng mL-1 durante 20

minutos em ambos eletrodos. A superfície foi lavada com tampão para a remoção de espécies

fracamente ligadas. Logo após foi adicionado 2 µL de BSA 1,0% sobre a plataforma durante

10 min, e então a superfície foi novamente lavada com tampão. Após esse procedimento foram

adicionados pools de soros positivos e negativos para cada eletrodo em diluição fixa (1:320).

Após 20 minutos de interação, o valor da variação de Rct foi obtido em triplicata para cada uma

das condições experimentais.

Para avaliar a influência do tempo de imobilização do antígeno na resposta

fornecida pelo imunossensor, as soluções antigênicas nas concentrações otimizadas de W1 e

W2 foram deixadas em contato com a superfície do eletrodo por tempos distintos: 5, 10, 15, 20,

25 e 30 minutos. Após a etapa de imobilização do antígeno 2 µL de BSA 1,0% foram

adicionados ao sensor durante 10 minutos, seguido da lavagem da superfície com tampão HBS-

EP pH 7,4. Posteriormente, pools de soros negativos e positivos para cada eletrodo em questão

na diluição de 1:320 foram imobilizados nas superfícies sensoras submetidas a diferentes

tempos de imobilização de antígeno. A variação do valor de Rct para cada análise foi obtida em

triplicata após 20 minutos de imobilização do anticorpo.

3.7- Influência do uso de BSA

Nessa etapa foi testada a influência do uso de BSA no desempenho do

imunossensor. Desse modo, a imunorreação foi realizada na presença e na ausência do agente

bloqueador. Após a etapa de imobilização do antígeno e antes da adição dos soros testes, 10 µL

de BSA (1,0%) foram injetados no sensor durante 10 minutos, seguido da lavagem da superfície

com tampão HBP-ES pH 7,4. Posteriormente a esta etapa foi realizada a adição de soros

positivos específicos e não específicos para as plataformas em questão.

Após essa etapa foi avaliado a influência do tempo de imobilização de BSA na

resposta fornecida pelo imunossensor. Uma solução de BSA (1,0%) foi deixada em contato

com o eletrodo por tempos distintos: 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos. Para cada superfície sensora

submetida a diferentes tempos de BSA, pool de soros positivos na diluição de 1:320 foram

101

injetados e a variação de Rct para cada análise foi obtida em triplicata após 20 minutos e lavagem

do sistema com tampão.

3.8- Avaliação da interação Antígeno-Anticorpo

Inicialmente, a interação entre os antígenos recombinantes dos parasitos

imobilizados na superfície do imunossensor e os anticorpos presentes nos pools de soros foi

avaliada durante 20 minutos. Entretanto, após ter sido definido o melhor tempo de imobilização

do agente bloqueador BSA, foi verificado a possibilidade de melhorar a resposta do

imunossensor em função do tempo de imunoreação. Para tanto, a diluição 1:320 do pool de

soros positivos foi testada em diferentes tempos de interação (5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos).

Além disso, após ser otimizado, o imunossensor foi avaliado quanto à sua

capacidade em detectar anticorpos anti-T. cruzi e anti-L.infantum. Para os ensaios, quatro pools

de soros caninos foram preparados consistindo em: 10 soros positivos para LV, 10 soros

negativos para LV, 10 soros positivos para DC e 10 soros negativos para DC.

Não é possível para tais amostras a dosagem de anticorpos presentes nesses soros,

então foram realizados estudos de diluições e não de quantificação de anticorpos. Todos os

pools foram diluídos em tampão HBS-EP (pH 7,4) em diferentes diluições (v/v): 1:40, 1:80,

1:160, 1:320, 1:640, 1:1280, 1:2560 , 1:5120 e 1:10240 com objetivo de definir preliminarmente

a capacidade de detecção do método proposto e a melhor diluição do soro capaz de discriminar

os grupos positivos dos negativos.

O processo global de fabricação do imunossensor é apresentado na Figura 3.

102

Figura 3. Esquema demonstrando as etapas para o desenvolvimento do imunossensor duplo.

3.9- Testes de desempenho do imunossensor

Após a construção do imunossensor e determinação das melhores condições para

realização do imunoensaio, foi realizada uma investigação preliminar para avaliar o seu

desempenho para aplicação no sorodiagnóstico das doenças de Chagas e Leishmaniose

Visceral. Estes testes são importantes, pois garantem um diagnóstico seguro além de avaliar a

potencial aplicação do dispositivo no sorodiagnóstico dessas doenças.

Para confirmar a seletividade da plataforma em identificar o anticorpo específico

para tal, o imunossensor de impedância foi incubado com uma mistura de anticorpos de T. cruzi

e L. infantum na diluição de 1:320, em W1 e W2, simulando um paciente com co-infecção.

Além disso foram realizadas análises de soros de pacientes portadores de outras infecções:

103

leishmaniose tegumentar americana (LTA), toxoplasmose (TOXO) e síndrome da

imunodeficiência adquirida (AIDS), além de soro canino isento de qualquer infecção (CN).

Para o estudo de repetibilidade do imunossensor, foram testados três dispositivos

diferentes por dia, durante três dias. A estabilidade do imunossensor foi avaliada realizando-se

experimentos em intervalos de 7 dias durante 8 semanas. Este teste foi realizado através da

imobilização dos antígenos recombinantes, bloqueados com BSA, em diferentes eletrodos que

foram armazenados a 4,0°C. Todas as análises descritas foram realizadas sob condições

anteriormente otimizadas.

3.10- Análises estatísticas

Os dados foram analisados usando um software de gráfico de dispersão (GraphPad

Prism versão 8, San Diego, CA, EUA). As variáveis contínuas foram determinadas como média

geométrica ± desvio padrão (DP), e o teste de Shapiro-Wilk foi usado para testar a normalidade

dos dados. Quando a homogeneidade foi confirmada, o teste t de Student foi usado; caso

contrário, o teste de postos sinalizados de Wilcoxon foi empregado. Foi adotado um nível de

significância de 5% para todos os testes estatísticos (pvalor <0,05). As áreas sob a curva ROC

(AUC) foram calculadas para avaliar a precisão global para cada antígeno, que pode ser

classificado como baixo (0,51–0,61), moderado (0,62–0,81), elevado (0,82–0,99) ou excelente

(1,0) (Swets, 1988). Todos os resultados do imunossensor foram medidos pela alteração da

resistência de transferência de carga (∆Rct / kΩ), com os valores do índice de reatividade (IR)

correspondentes calculados como ∆Rct / kΩ dividido por CO. Os resultados foram interpretados

da seguinte forma: positivo (IR ≥ 1,0), negativo (IR <1,0) e zona cinza (0,90 ≥ IR ≤ 1,10). Os

parâmetros de desempenho do antígeno recombinante de T. cruzi e L. infantum foram

determinados usando uma abordagem dicotômica e comparados quanto à sensibilidade (Se),

especificidade (Sp) e acurácia (Ac). Um intervalo de confiança de 95% (IC 95%) foi calculado

para abordar a precisão das estimativas de proporção. A força de concordância entre a

metodologia do imunossensor, usando IBMP-8.1 ou rLci1A / rLci2B, e o perfil da amostra

sorológica estabelecido anteriormente foi avaliada usando o coeficiente Kappa de Cohen ()

(Landis e Koch, 1977), interpretado da seguinte forma: pobre ( = 0), leve (0,20 ≤ > 0),

razoável (0,40 ≤ > 0,20), moderado (0,60 ≤ > 0,40), substancial (0,80 ≤ > 0,60), quase

104

perfeito (1,0 <> 0,80), ou perfeito ( = 1,0). O fluxograma 1 foi preparado de acordo com as

diretrizes dos Padrões para Relatórios de Estudos de Precisão de Diagnóstico (STARD) (Cohen

et al., 2016).

Fluxograma 1: Desenho do estudo em conformidade com as diretrizes dos Padrões para Relatórios de Estudos de

Precisão de Diagnóstico (STARD).

Amostras Potencialmente elegíveis (n = 80)

Amostras de soro de Cães T.Cruzi positivas (n = 10) T.Cruzi negativas (n = 10) L Infantum positivas (n = 10) L. Infantum negativas (n = 10)

Amostras de soro Humano T.Cruzi positivas (n = 10) T.Cruzi negativas (n = 10) L Infantum positivas (n = 10) L. Infantum negativas (n = 10)

Número de testes realizados com as proteínas recombinantes ( n = 80)

Resultados negativos (n=40)

Referido a testes padrão de referência

Testes padrão de referência realizados (n=40)

Excluídos (n=0) Resultados inconclusivos (n=0) Resultados discordantes (n=0)

Diagnóstico Final (IBMP-8.1)

Diagnóstico Final

Amostras de soro Humano - T.Cruzi positivas (n=0) - T.Cruzi negativas (n=10) Amostras de soro de Cães - T.Cruzi positivas (n=0) - T.Cruzi negativas (n=10)

Amostras de soro Humano - L. Infantum positivas (n=0) - L. Infantum negativas (n=10) Amostras de soro de Cães - L. Infantum positivas (n=0) - L. Infantum negativas (n=10)

Resultados negativos (n=40)

Referido a testes padrão de referência

Testes padrão de referência realizados (n=40)

Excluídos (n=0) Resultados inconclusivos (n=0) Resultados discordantes (n=0)

Diagnóstico Final (IBMP-8.1)

Amostras de soro Humano - T.Cruzi positivas (n=10) - T.Cruzi negativas (n=0) Amostras de soro de Cães - T.Cruzi positivas (n=10) - T.Cruzi negativas (n=0)

Amostras de soro Humano - L. Infantum positivas (n=10) - L. Infantum negativas (n=0) Amostras de soro de Cães - L. Infantum positivas (n=10) - L. Infantum negativas (n=0)

105

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1 Avaliação da resposta da interação antígeno-anticorpo empregando SPR

Para a detecção seletiva de anticorpos anti-T cruzi e consequente diferenciação de

sinal entre as doenças LV e DC, é de fundamental importância o emprego de antígenos

recombinantes ao invés de antígenos brutos, pois estes melhoram a especificidade dos testes de

diagnóstico, diminuindo a possibilidade de reações cruzadas. Assim inicialmente foi estudada,

empregando SPR, a interação entre a proteína recombinante IBMP8.1 (antígeno recombinante

de Chagas) e anticorpos positivos anti-T. cruzi e anti-L.infantum, além da interação entre a

proteína recombinante rLC1,2 (antígeno recombinante de Leishmaniose Visceral) e anticorpos

positivos anti- L.infantum e anti- T. cruzi. Este estudo teve como motivação avaliar em tempo

real a intensidade da interação de tal antígeno com soros e analisar o perfil de resposta.

Assim, o eletrodo de chip de ouro modificado com SAM de 3-MPA ativada

contendo antígenos IBMP 8.1 imobilizados foram levados até o equipamento de SPR e foram

injetadas simultaneamente amostras positivas anti-T. cruzi e anti-L.infantum. A Figura 4

evidencia as curvas características de ângulo de SPR obtidas após adição dos pools positivo

anti- T. cruzi (curva 1) positivo anti- L.infantum (curva 2) em diluição de 1:320. Da mesma

forma a plataforma foi modificada com o antígeno de leishmania rLC1,2 e a Figura 5 mostra os

resultados obtidos após a adição dos pools positivo anti- L.infantum (curva 1) positivo anti- T.

cruzi (curva 2) em diluição de 1:320.

Analisando as curvas de SPR, Figuras 4 e 5, foi possível observar que a interação

entre anticorpo positivo e a proteína recombinante aumentou o índice de refração do meio e

como resultado dessa interação foi obtido um deslocamento característico do ângulo de SPR

(θSPR) devido à presença de moléculas que interagem com a superfície. Percebe-se ainda que

a adição dos soros não específicos, para ambos eletrodos, não foi acompanhada com resposta

significativa, indicando a ausência de interação dessas espécies com as plataformas. Tais

resultados mostram a especificidade do processo de reconhecimento do anticorpo positivo pelo

antígeno recombinante imobilizado.

106

Figura 4. Curvas de SPR evidenciando as etapas de associação e dissociação para a adição de anticorpo anti-T.cruzi positivo (curva 1) e anti-L. infantum positivo (curva2) sobre proteína recombinante IBMP 8.1 imobilizada sobre SAM/Au.

Figura 5. Curvas de SPR evidenciando as etapas de associação e dissociação para a adição de anticorpos anti- L.infantum positivos (curva 1) e anticorpos anti- T.cruzi positivos (curva2) sobre proteína recombinante rLci1,2 imobilizada sobre SAM/Au.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

1

SP

R /

gra

us

Tempo / min

2

SPR

=0,0917

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

2

SP

R /

gra

us

Tempo / min

1

SPR

=0,0945

107

Assim a técnica SPR foi aplicada com sucesso para avaliar em tempo real a

afinidade das proteínas recombinantes frente a anticorpos visando através de uma abordagem

qualitativa, demonstrar a aplicabilidade dessas proteínas no imunodiagnóstico.

A obtenção de proteínas recombinantes é considerada um processo dispendioso;

assim, apesar das respostas obtidas por SPR terem sido satisfatórias, as análises subsequentes

não foram realizadas através dessa técnica. Para cada análise deve ser utilizada grande

quantidade de material biológico, cerca de 100 µL a cada injeção o que não é viável em se

tratando de proteínas recombinantes. Desse modo, objetivando o desenvolvimento de

dispositivos do tipo point of care a plataforma foi modificada, miniaturizada e otimizada em

eletrodos duplos impressos que teriam a mesma ideia de análise simultânea do SPR, porém com

a utilização de menores volumes de amostras e maior possibilidade de utilização, no futuro,

como uma ferramenta de diagnóstico. Vale ressaltar que as análises realizadas em SPR

permitiram confirmar a atividade do material biológico, sendo válida a utilização deste para o

desenvolvimento das próximas etapas propostas para o trabalho.

4.2 - Caracterização eletroquímica e morfológica dos eletrodos impressos duplos de grafite

Para obtenção de respostas confiáveis e reprodutíveis, antes de iniciar as análises,

o perfil voltamétrico dos dois eletrodos de trabalho, denominados W1 e W2, presentes no

eletrodo impresso duplo de grafite (EIDG) foram testados em solução de Fe(CN)63−/4−. Além

disso, foi avaliada a morfologia do eletrodo através de imagens obtidas por MEV.

A princípio é desejado que os eletrodos de trabalho apresentem respostas

semelhantes para serem utilizados nos experimentos, para que assim qualquer variação de

resposta obtida posteriormente seja exclusivamente devido às alterações de parâmetros do

sistema em estudo. A Figura 6 apresenta o perfil do voltamograma cíclico obtido para W1 e

W2 não modificados durante apenas um ciclo de potencial.

Assim, as medidas realizadas em solução contendo o par redox

ferrocianeto/ferricianeto de potássio foram utilizadas como um indicativo da qualidade de

resposta eletroquímica do eletrodo. Observando a Figura 6 é possível perceber que as medidas

realizadas para os eletrodos se sobrepõem exibindo uma resposta idêntica, o que indica ausência

de alterações na superfície de tais eletrodos.

108

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

-100

-50

0

50

100

50mV

Co

rre

nte

/

A

Potencial /V

140mVA

Figura 6. Voltamograma cíclico dos eletrodos de trabalho W1(vermelho) e W2 (preto) em solução 5,0 mM Fe(CN)6

3−/4− contendo KCl 0,10 M. v = 50mV/s.

Para complementar a análise de caracterização do eletrodo duplo foram realizadas

imagens da morfologia da superfície do eletrodo impresso duplo. A Figura 7 apresenta a

imagens referentes a ampliação de 1000x, para os eletrodos impressos W1 e W2.

Figura 7. Imagens de MEV para os eletrodos W1 (A) e W2 (B) não modificados na ampliação de 1000x.

(A) (B)

109

As imagens de microscopia eletrônica de varredura, presentes na Figura 7,

permitem identificar que ambos eletrodos possuem uma superfície com grafite depositado de

forma uniforme, com baixa rugosidade. É notório que não existem diferenças significativas na

morfologia dos eletrodos, complementando os resultados encontrados na análise voltamétrica.

Assim todos os resultados obtidos, eletroquímicos e morfológicos, permitem concluir que os

eletrodos apresentam reprodutibilidade da superfície para realização dos experimentos

eletroquímicos.

4.3 – Caracterização da superfície de eletrodos impressos duplos não modificados e

modificados com poli (4-HFA)

A imobilização de biomoléculas na plataforma sensora é uma das etapas mais

importantes no desenvolvimento de um biossensor, tendo como finalidade reter a máxima

atividade da biomolécula na superfície do sensor (AFONSO, 2008; PATACAS, 2007). Assim,

a imobilização dos antígenos foi realizada no eletrodo não modificado e modificado com filme

poli (4-HFA).

A eletropolimerização do ácido 4-HFA foi realizada por VC, com 10 ciclos de

potencial, velocidade de varredura de 50 mV/s e com faixa de potencial de 0,0 a +1,2 V, após

borbulhamento de nitrogênio por 10 min. A Figura 8 mostra o VC referente aos 10 ciclos de

varredura de potencial do 4-HFA.

Pode ser observado em cerca de +0,75V a onda de oxidação do 4-HFA. Nessa etapa,

ocorre a formação do cátion radical, necessário para iniciar a eletropolimerização do

monômero. Pode ser notado, ainda, o início da reação de desprendimento de oxigênio em

aproximadamente +1,20 V. Conduto, nenhum processo catódico no sentido reverso é

observado.

A partir da análise da Figura 8 fica evidente a diminuição nos valores da corrente

de pico anódica (Ipa) à medida que ocorre o aumento do número de ciclos, o que ocorre devido

à formação do filme e consequente consumo do monômero.

110

Figura 8. VCs consecutivos obtidos em solução de 2,50 mM de 4-HFA utilizando EIDG. Eletrólito suporte: 0,50 M HClO4. Número de ciclos = 10; v = 50 mV/s.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

Co

rrente

/

A

Potencial / V

0,75V

Após o procedimento de eletropolimerização a modificação do eletrodo foi

confirmada ao se comparar os perfis eletroquímicos obtidos para o par redox Fe(CN)63−/4−

utilizando EIDG e EIDG/poli(4HFA), e para tal foram utilizadas as técnicas de VC e EIE. A

Figura 9 mostra o VC obtido em solução 5,0 mM Fe(CN)63−/4− contendo KCl 0,10 M para EIDG

(curva 01) e EIDG/poli(4HFA) (curva 02).

Figura 9. Voltamograma cíclico obtido em solução 5,0 mM Fe(CN)6

3−/4− contendo KCl 0,10 M para: (1) EIDG e (2) poli(4HFA)/EIDG. v = 50mV/s.

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

-80

-40

0

40

80

(2)

Co

rre

nte

/

A

Potencial / V

(1)

111

A adsorção de substância na superfície do eletrodo pode ocasionar modificações

nas propriedades de transferência eletrônica do sistema. Observando a Figura 9, pode-se

perceber que o perfil voltamétrico do par redox Fe(CN)63−/4− utilizando EIDG (Fig. 9- curva 1)

foi afetado pela presença do poli(4-HFA) adsorvido na superfície do eletrodo (Fig. 9- curva 2),

uma vez que há um bloqueio quase total da transferência eletrônica do par Fe(CN)63−/4−,

notando-se uma diminuição da corrente faradáica, o que pode ser justificado pelo fato de que o

material adsorvido apresenta uma cobertura de superfície elevada, a qual é suficiente para

suprimir a eletroatividade da sonda devido à alta resistência à transferência eletrônica gerada

na superfície. Outra possível justificativa seria que o filme formado na superfície do eletrodo

possui caráter aniônico e, uma vez que a sonda também possui caráter aniônico, ocorre repulsão

eletrostática entre a sonda redox e o filme polimérico, fazendo com que as espécies da sonda

tenham maior dificuldade em atingir a superfície do eletrodo.

Para fins de complementação da resposta obtida por VC foram realizadas medidas

de EIE para EIDG e poli(4HFA)/EIDG como pode ser observado na Figura 10. Para simulação

dos dados foi sugerido o circuito equivalente demonstrado na Figura 6-2, presente no capítulo

1.

Figura 10. Diagramas de Nyquist dos espectros de impedância eletroquímica obtidos em solução 5,0 mM Fe(CN)6

3−/4− contendo KCl 0,10 M para: (1) EIDG e (2) poli(4-HFA)/EIDG. Amplitude 10 mV. Intervalo de Frequência: 100 kHz a 10 mHz. As linhas sólidas representam o ajuste do circuito aos dados experimentais.

112

Os resultados de EIE obtidos mostram a formação de uma região de semicírculo

menor para o eletrodo não modificado uma vez que a resistência a transferência eletrônica para

tal foi de 3,52 ± 0,321 kΩ. Quando o eletrodo foi modificado com poli(4-HFA) o valor de Rct

aumentou para 10,5± 1,1 kΩ. Em conjunto, esses dados confirmam a tendência já observada e

discutida nos estudos de voltametria cíclica.

4.4 - Efeito da modificação da superfície do sensor na imobilização dos antígenos

recombinantes e na detecção do anticorpo específico.

Uma etapa fundamental para construção do imunossensor envolve a imobilização

apropriada da biomolécula. Assim, após avaliadas as condições do eletrodo foram investigadas

por EIE a eficiência da imobilização dos antígenos recombinantes em eletrodos impressos não

modificados e modificados com poli (4-HFA). Os resultados mostraram que após a

imobilização do antígeno no eletrodo não modificado a resistência aumentou de 3,52 ± 0,321

kΩ para 5,41 ± 0,218 kΩ e 7,32± 0,128 em W1 e W2 respectivamente. Para o eletrodo

modificado, após a imobilização do antígeno a resistência do sistema diminuiu de 10,5 ± 1,1

kΩ para 1,55 ± 0,245 kΩ e 3,94 ± 0,245 kΩ em W1 e W2 respectivamente Os dados revelam

que em ambos os casos (plataforma com e sem modificação) houve uma variação do Rct do

sistema, indicando que houve imobilização do antígeno sobre o eletrodo, mesmo na ausência

de modificação. Então uma próxima etapa foi verificar qual dessas plataformas seria a mais

adequada para reconhecimento do anticorpo.

Assim, para avaliar o efeito da modificação do eletrodo na detecção de anticorpos

o imunossensor foi incubado por cerca de 20 minutos com anticorpos anti-T.cruzi em W1 e anti

L. infantum em W2 ambos na diluição de 1:320.

Os resultados de W1 revelam um ∆Rct = 0,198 ±0,083 kΩ para a detecção do

anticorpo positivo T.cruzi pelo antígeno IBMP 8.1 imobilizado sobre o eletrodo não modificado

(Fig. 11A). Já para a detecção do anticorpo utilizando a plataforma modificada com poli (4-

HFA) obteve-se um ∆Rct = 0,570 ±0,121 kΩ (Fig. 11C), ou seja, ao utilizar o eletrodo

modificado ocorre um aumento de quase 200% na resposta.

Os resultados de W2 exibem ∆Rct = 0,25 ±0,054 kΩ para a detecção do anticorpo

positivo L. infantum pelo antígeno rLci1,2 imobilizado sobre o eletrodo não modificado(Fig.

113

11B). Com a modificação da plataforma obteve-se um ∆Rct = 0,82 ±0,121 kΩ (Fig. 11D), o que

significa um aumento de 236%.

Figura 11.Diagramas de Nyquist dos espectros de impedância eletroquímica obtidos para: (A) EIDG/ Ag IBMP 8.1 (curva 1) e EIDG/ + Ab T. cruzi (curva 2) (B) EIDG/ Ag rLci1,2 (curva 1) +Ab L. infantum (curva 2). (C) poli 4-HFA/ Ag IBMP (curva 1) + Ab T. cruzi (curva 2). (C) poli 4-HFA/ Ag rLci1,2 (curva 1) + Ab T. cruzi (curva 2). Amplitude 10 mV. Intervalo de Frequência: 100 kHz a 10 mHz. As linhas sólidas representam o ajuste do circuito aos dados experimentais.

0 500 1000 1500 2000 2500 30000

500

1000

1500

2000

2500

3000

-Z''

/

Z' /

A

(1)

(2)

0 1000 2000 30000

1000

2000

3000

-Z''

/

Z' /

(2)

(1)

B

114

0 1000 2000 30000

1000

2000

3000

-Z''

/

Z' /

(1)

(2)

C

0 1000 2000 3000 40000

1000

2000

3000

4000

-Z''

/

Z' /

C

Essa melhora significativa na resposta pode ser justificada pelo fato de que a

modificação do eletrodo foi capaz de manter o sitio dos antígenos preservados e livres para

possível ligação com o anticorpo, além de possivelmente ter proporcionado um aumento da

área superficial do eletrodo possibilitando que uma maior quantidade de antígenos possa

interagir com a superfície e, consequentemente, melhorar a resposta do biossensor. Outra

possibilidade é que geralmente a eletropolimerização funcionaliza o eletrodo o que favorece a

interação da plataforma com materiais biológicos (GOMES, 2011). Diante disso, o emprego do

filme poli(4-HFA) como plataforma na construção do biossensor foi selecionada para etapas

posteriores no desenvolvimento do imunossensor proposto.

D

(1)

(2)

115

4.5 – Influência do número de ciclos voltamétricos na formação do poli(4-HFA) e na

imunorreação.

A adsorção de substâncias eletroativas na superfície de um eletrodo acarreta

alterações nas propriedades de transferência eletrônica do sistema. Além disso, o número de

ciclos de varredura de potenciais influencia diretamente a formação do filme e seu uso na

imobilização de biomoléculas. As propriedades de troca iônica dos filmes poliméricos de

poli(4-HFA) foram investigadas utilizando a sonda aniônica ferrocianeto/ferricianeto de

potássio. Possíveis interações eletrostáticas existentes entre a sonda redox e o polímero são

capazes de sugerir informações acerca das propriedades elétricas do poli(4-HFA). A Figura 12

exibe os diagramas de Nyquist obtidos através das medidas de EIE que foram realizadas para

uma melhor compreensão das propriedades elétricas dos filmes de poli(4-HFA) nos diferentes

números de ciclos estudados: 5 (curva 1), 10 (curva 2), 15 (curva 3) e 20 (curva 4) ciclos de

varredura de potencial.

Figura 12. Diagramas de Nyquist obtidos em solução de K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6 5,00 mM contendo KCl 0,10 M para os diferentes números de ciclos realizados na eletropolimerização sendo: 5 (curva 1), 10 (curva 2), 15 (curva 3) e 20 (curva 4) ciclos. Amplitude 10 mV. Intervalo de Frequência: 100 kHz a 10 mHz. As linhas sólidas representam o ajuste do circuito aos dados experimentais.

0 20000 40000 60000 800000

20000

40000

60000

80000

-Z''

/

Z' /

(4)

(3)(2)(1)

Como pode ser visto na Tabela 1, o número de ciclos na eletropolimerização exerce

uma forte influência nas propriedades de transferência de carga da superfície do eletrodo. A

partir dos dados de impedância correspondentes, pode-se notar que, à medida que o ciclo de

116

deposição aumenta, o valor de Rct aumenta e o filme tende a ser menos capacitivo e a mostrar

uma resistência total mais alta (RT = Rct + Rf) para o par redox estudado. Esse comportamento

é esperado, uma vez que à medida que o número de ciclos aumenta, ocorre maior incorporação

de material na superfície do eletrodo, e assim maior bloqueio na transferência eletrônica do par

redox aumentando, dessa forma, o valor da Rct. Logo, dependendo da quantidade de ciclos

utilizada, diferentes espessuras podem ser obtidas. Dessa forma, os resultados mostraram que

um número maior de ciclos leva a maiores valores de Rf, menores valores de Qf e filmes mais

espessos. Além disso, os pequenos valores de W, em todos os casos, mostram que a morfologia

da superfície do poli (4-HFA) é mais plana do que porosa, assim como o que foi obtido por

Ferreira et al, 2014.

Tabela 1: Parâmetros obtidos na simulação dos dados de EIE para as plataformas de poli (4-HFA)/ EIDC

modificados com diferentes números de ciclos utilizando o circuito equivalente proposto

Parâmetro Número de ciclos

5 10 15 20

Rs / Ω cm2 249 290 328 344

Rct / kΩ cm2 10,5 19,4 35,1 62,8

Qdl / μF cm−2 12,7 5,83 1,96 1,17

ndl 0,72 0,81 0,88 0,92

W / mΩ cm2 s-0.5 1,17 0,464 0,639 0,216

Rf / kΩ cm2 7,60 14,4 10,2 8,32

Qf / μF cm−2 1,09 0,835 1,07 1,56

nf 1,01 0,991 1,09 1,08

2 0,058 0,039 0,076 0,039

A plataforma modificada com 20 ciclos de potencial apresentou o valor de Rct 64%

superior quando comparada com a plataforma modificada com 5 ciclos de potencial. Porém

esses dados não são suficientes para concluir qual seria a melhor plataforma para imobilização

da biomolécula que resultaria em uma maior resposta da imunorreação.

Deste modo, para cada valor de ciclo de potencial foi estudada a influência deste

parâmetro na resposta do imunossensor, sendo que, por se tratar de materiais biológicos

117

diferentes, todos os testes foram realizados em W1 e W2, Figura 13 A e B respectivamente, os

valores de Rct foram obtidos para cada etapa de construção do imunossensor.

Figura 13. Valores de Rct obtidos para as etapas de construção do imunossensor, evidenciando o valor de ∆Rct

obtido para a imunorreação em diferentes números de ciclos (A) W1 e (B)W2.

5 10 15 200,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Rct

Número de ciclos

Filme+Ag+BSA

+Ab positivo

RctA

5 10 15 200,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4HFA +Ag +BSA

+Ab

Rct

R

ct

/

Número de ciclos

B

O perfil de resposta obtido em ambos os eletrodos é semelhante. Os filmes,

independentemente da quantidade de ciclos, sofreram mudanças na sua resistência a cada etapa

de imobilização, indicando a ligação do material desejado. Após a imobilização do antígeno

(concentração=1µg/mL, tempo de imobilização=20min) e posterior adição de BSA (1%, tempo

118

de imobilização=10min) é observado uma diminuição no valor de Rct, justificada pela presença

de uma alta densidade de cargas positivas na superfície do eletrodo que ocasionam o

favorecimento da transferência eletrônica do par redox. O imunossensor então foi testado

quanto à capacidade de detecção da amostra positiva (diluição=1:320, tempo de imobilização=

20min) e, em ambos os casos foi registradoo um aumento do valor de Rct caracterizando a

interação antígeno-anticorpo. O parâmetro de resposta avaliado foi a variação do valor de

resistência de transferência de carga (ΔRct- gráfico azul), que foi calculado pela subtração do

valor de Rct obtido após a incubação com o antígeno, e o valor de Rct obtido na etapa de bloqueio

(última etapa de modificação).

Em conjunto, estes dados apontam maior capacidade de detecção apresentada pelo

sistema W1=10 ciclos e para W2=15 ciclos, pois após estes valores não há variação significativa

no valor de ∆Rct, que pode ser explicado pelo fato de que essa é a quantidade de ciclos suficiente

para cobrir a superfície e possibilitar maior capacidade de imobilização do antígeno. A

modificação do eletrodo ao disponibilizar mais moléculas de antígenos para associações com

anticorpos presentes no soro, faz com que o imunossensor apresente uma maior sensibilidade

analítica associada, sendo esses valores escolhidos para prosseguimento no estudo.

Vale ressaltar que tais antígenos possuem estruturas, tamanhos e características

diferentes, logo comportamentos e resultados distintos já eram esperados; razão pela qual todos

os experimentos foram realizados para ambos os eletrodos.

4.6– Influência do uso de BSA no desempenho do imunossensor

O presente estudo buscou testar um dos agentes mais utilizados como bloqueador

de sítios inespecíficos: o BSA. A plataforma foi montada na presença e na ausência de tal agente

e os resultados de Rct foram obtidos para pool de soros positivos T.cruzi e L.infantum, buscando

testar a plataforma também frente a possibilidade de reações cruzadas.

Os gráficos presentes na Figura 14 e 15 representam os resultados que foram

obtidos para W1 (imunossensor chagas) e W2 (imunossensor leishmaniose), respectivamente.

119

Figura 14. Diagramas de Nyquist obtidos para (A) poli 4-HFA/ Ag IBMP 8.1 (curva 1) +Ab T. cruzi positivo (curva 2) (B) poli 4-HFA/ Ag IBMP 8.1(curva 1) +Ab L. infantum positivo (curva 2) (C) poli 4-HFA/ Ag IBMP 8.1+BSA (curva 1)+ Ab T. cruzi positivo (curva 2) (D) poli 4-HFA/ Ag IBMP 8.1+BSA (curva 1) + Ab L. infantum positivo (curva 2). As linhas sólidas representam o ajuste do circuito aos dados experimentais.

A partir dos gráficos e dos valores de ∆Rct mostrados na Tabela 2 é possível

observar que para W1, o valor de ∆Rct obtido após a adição de soro específico para a plataforma

isenta do agente bloqueador (Fig. 14A) foi maior que o valor encontrado no sistema em que o

BSA fora utilizado (Fig.14C).

Tabela 2: Valores de ∆Rct obtidos para W1 e W2 ao ser adicionado soro específico e não específico para a plataforma na presença e na ausência de agente bloqueador BSA.

ELETRODO ANTICORPO ∆Rct SEM BSA ∆Rct COM BSA

W1 T.cruzi 0,68 ± 0,03 0,57 ± 0,02

L.infantum 0,07 ± 0,05 0,04 ± 0,01

W2 L.infantum - 0,80 ± 0,01

T.cruzi 0,09 ± 0,03 0,02 ± 0,02

0 1000 2000 3000 40000

1000

2000

3000

4000

-Z''/

/

Z' /

A

(1)

(2)

0 1000 2000 3000 40000

1000

2000

3000

4000

-Z''

/

Z' /

B

(1)

(2)

0 1000 2000 30000

1000

2000

3000

-Z''

/

Z' /

(1)

(2)

C

0 1000 2000 30000

1000

2000

3000

-Z''

/

Z' /

(1)

(2)

D

120

Sabe-se que, durante o desenvolvimento de imunoensaios é crucial a obtenção de

um dispositivo altamente sensível aos analitos de interesse, porém é necessário também que

este seja resistente aos demais componentes inespecíficos existentes nas matrizes das amostras.

Consequentemente, é fundamental conhecer o comportamento do sistema e minimizar essas

variações, a fim de evitar que tais mudanças, produzidas pela adsorção de proteínas

inespecíficas presentes em espécimes biológicos, conduza a falsos positivos (SHANKARAN

et al., 2007). O uso de agentes bloqueadores minimiza esses efeitos por se ligarem a tais sítios

impedindo que ligantes inespecíficos se adsorvam sobre a superfície. Desse modo, o BSA ao

ser adicionado à plataforma ocupou sítios livres presentes na superfície e, consequentemente,

reduziu as chances de ligantes inespecíficos se adsorverem na mesma, o que explicaria a menor

variação de Rct quando o soro específico foi adicionado em W1 na plataforma em que o agente

foi utilizado.

Cabe ressaltar que o valor de ∆Rct obtido, mesmo sendo menor, não compromete a

capacidade de detecção para o pool positivo, além disso a adição de BSA fez com que o pool

de soros negativos (Fig. 14 D) fornecesse menores resultados de variação de Rct se comparados

aos resultados obtidos na ausência de BSA (Fig. 14B).

A Figura 15 A corresponde ao diagrama Nyquist obtido ao ser adicionado à

plataforma, isenta de BSA, soro L.infantum. Nota-se que após a adição do soro (curva 2) sobre

o dispositivo (curva1) houve uma diminuição na resistência à transferência de elétrons,

discordante com as respostas obtidas anteriormente para W1, o que mostra a possibilidade de,

na ausência de BSA, o anticorpo estar se ligando também ao filme e não somente ao antígeno.

Deste modo, foram imobilizados sobre o filme polimérico de 4-HFA amostras de

soro de L. infantum (Fig. 16) e assim pode-se comprovar que, o fenômeno observado se deve

ao fato de que o anticorpo anti L. infantum é capaz de interagir com a plataforma polimérica,

fato este que não é observado quando amostras de anticorpos anti T.cruzi são adicionados. Esse

fenômeno revela o quão importante é o uso do BSA para o bom desempenho do dispositivo,

pois ao se ligar à plataforma, este ocupa sítios livres presentes na superfície e, permite que o

anticorpo tenha acesso somente ao antígeno imobilizado fato este comprovado pela análise da

Figura 15C, no qual apresenta o diagrama de Nyquist obtido ao se utilizar BSA na construção

do dispositivo e a consequente adição de amostra de anticorpo específico anti- L.infantum.

121

Figura 15. Diagramas de Nyquist obtidos para (A) poli 4-HFA/ Ag rLci1,2 (curva 1) +Ab L.infantum positivo (curva 2) (B) poli 4-HFA/ Ag rLci1,2 (curva 1) +Ab T.cruzi positivo (curva 2) (C) poli 4-HFA/ Ag rLci1,2+BSA (curva 1)+ Ab L.infantum positivo (curva 2) (D) poli 4-HFA/ Ag rLci1,2 (curva 1) + Ab T. cruzi positivo (curva 2). As linhas sólidas representam o ajuste do circuito aos dados experimentais.

Figura 16. Diagramas de Nyquist obtidos para poli 4-HFA (15ciclos de varredura) () +Ab L.infantum positivo (). As linhas sólidas representam o ajuste do circuito aos dados experimentais.

0 1000 2000 3000 4000 5000 60000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

-Z''

/

Z' /

(1)

(2)

A

0 1000 2000 3000 4000

0

1000

2000

3000

4000

-Z''(

)

Z'()

B

(1)

(2)

0 1000 2000 3000 40000

1000

2000

3000

4000

-Z''

/

Z' /

C

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

-Z''

/

Z' /

D

(1)

(2)

0 10000 20000 30000 40000 500000

10000

20000

30000

40000

50000

-Z''

/

Z' /

A

(1)

(2)

122

A utilização de BSA também afeta a resposta do imunossensor ao ser utilizada a

amostra não específica para W2 (amostra positiva anti T.cruzi), uma vez que na presença de

BSA o dispositivo demonstra uma melhor especificidade em discriminar indivíduos portadores

da doença de Chagas e leishmaniose visceral (Fig. 15 C,D).

4.7– Otimização dos parâmetros de imobilização dos antígenos recombinantes IBMP 8.1

e rLci1,2.

Esta etapa teve como finalidade caracterizar a imobilização da proteína sobre o

filme polimérico, assim como, otimizar a concentração e o tempo necessário para obter elevada

cobertura de superfície após interação da biomolécula com o filme.

Inicialmente foi avaliada a influência do tempo de imobilização do antígeno sobre

a resposta fornecida pelo imunossensor. O eletrodo modificado com filme polimérico de 4-HFA

foi deixado em contato com solução antigênica IBMP 8.1 em W1 (Fig. 17 A) e solução

antigênica de rLci1,2 em W2 (FIG 17 B) ambos a 1µg mL-1 durante 5, 10, 15, 20, 25 e 30min.

Figura 17. Diagramas de Nyquist dos espectros de impedância obtidos para (A) W1- poli (4-HFA)/ antígeno IBMP 8.1 e (B) W2- poli (4-HFA)/ antígeno rLci1,2em diferentes tempos de imobilização 5 (), 10 (), 15(), 20(), 25 (∆) e 30 () minutos. Amplitude 10 mV. Intervalo de Frequência: 100 kHz a 10 mHz. As linhas sólidas representam o ajuste do circuito aos dados experimentais.

0 1000 2000 3000 40000

1000

2000

3000

4000

-Z''

/

Z' /

A

123

0 2000 4000 6000 8000 100000

2000

4000

6000

8000

10000

-Z''

/

Z' /

B

A Tabela 3 traz os valores da resistência à transferência de carga obtidos para os

testes realizados após a adição do antígeno recombinante IBMP 8.1 em W1, além do valor de

∆Rct obtido após adição do pool de soro específico (1:320 por 20 minutos) nos diferentes

períodos propostos.

Tabela 3: Influência do tempo de imobilização do antígeno T. cruzi nos valores de Rct das etapas do desenvolvimento do imunossensor – W1.

Tempo (min) Ag 1 + BSA

(Rct / kΩ)

Ag + BSA+ Ab 320 ∆Rct

5 2,26 ± 0,025 2,32 ± 0,006 0,06

10 1,72 ± 0,021 1,96 ± 0,015 0,24

15 1,45 ± 0,021 1,53 ± 0,01 0,28

20 1,23 ± 0,025 1,60 ± 0,02 0,57

25 1,22 ± 0,025 1,62 ± 0,01 0,40

30 1,20 ± 0,021 1,61 ± 0,01 0,41

É possível visualizar valores de Rct decrescentes à medida que o tempo de

imobilização aumenta até aproximadamente 20min. Após esse tempo os valores praticamente

se mantiveram constantes. Tal resultado deve ser reflexo do fato de que tempos inferiores a 20

124

minutos, provavelmente, não são suficientes para a formação das ligações entre o filme

polimérico e o antígeno recombinante de T. cruzi.

De maneira semelhante a Tabela 4 traz os valores obtidos para W2. Nota-se que o

tempo de adsorção também afetou bastante a combinação Ag-Ab, dado que nos tempos de 5 e

10 minutos não foi possível obter valores de ∆Rct, ocorrendo nesses tempos uma diminuição na

resistência a transferência de carga ao ser adicionado a amostra de anticorpo anti- L. infantum.

Tabela 4: Influência do tempo de imobilização do antígeno L. infantum nos valores de Rct das etapas do desenvolvimento do imunossensor –W2.

Time (min) Ag + BSA1%

(Rct / kΩ)

Ag + BSA+ Ab 320

(Rct / kΩ)

∆Rct

5 4,26 ± 0,020 3,32 ±0,010 -

10 3,51± 0,020 1,15 ± 0,020 -

15 1,82 ± 0,020 2,26 ± 0,006 0,44

20 0,904 ± 0,006 1,68 ± 0,016 0,77

25 0,826 ± 0,014 1,62± 0,034 0,79

30 0,832 ± 0,018 1,65 ± 0,028 0,82

Este fato pode ser justificado pelo fato de que estes tempos de imobilização não

foram suficientes para que todo o antígeno se ligasse a plataforma, e mantendo o tempo de

adição de BSA (10 min), o anticorpo provavelmente encontrou espaços livres na superfície.

Pode ser verificado que os resultados para os tempos de 20, 25 e 30 pouco variaram entre si,

isso sugere que após 20 minutos em contato com a superfície sensora, os antígenos de rLci1,2

se ligam consideravelmente ao filme polimérico atingindo um provável ápice de imobilização

que se mantém constante ao longo do tempo, possivelmente, devido à saturação dos

grupamentos livres na superfície sensora a partir de 20 minutos. Como resultado, o tempo de

imobilização de 20 min foi selecionado em nosso trabalho para ambos os antígenos.

Para determinar a concentração ótima, uma grande variedade de concentrações de

antígenos foi imobilizada na superfície do filme 4-HFA. Inicialmente diminui-se a concentração

utilizada nos testes iniciais 1µgmL-1 para 1ngmL-1, para ambos eletrodos, percebeu-se então

uma diminuição de 73% em W1 e 53,6% em W2. Assim, foram realizados testes a partir dessa

125

concentração (5, 10, 15, 20, 25, 30 e 35 ngmL-1), até ser obtida uma concentração ótima. A

Figura 18 apresenta os valores obtidos de ∆Rct em função dessas concentrações.

Figura 18. (A)Influência da concentração do antígeno IBMP 8.1 no valor de ∆Rct em W1 ao ser adicionado o alvo específico () amostras de soro contendo anticorpos anti- T. cruzi negativo () e anti- L. infantum positivo ().(B) Influência da concentração do antígeno rLci1,2 no valor de ∆Rct em W2 ao ser adicionado o alvo específico () amostras de soro contendo anticorpos anti- L. infantum negativo () e anti- T. cruzi positivo (). Todas as medidas foram realizadas em solução de Fe(CN)6

3−/4− (5,0 mmol L−1) contendo KCl (0,1 mol L-1).

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Rct / k

Concentração IBMP 8.1 / ngmL-1

A

0 5 10 15 20 25 30 35 400,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Rct / k

Concentração LC1,2 / ngmL-1

B

A análise dos gráficos apresentados na Figura 18 que o aumento da concentração

de antígeno foi acompanhado por um aumento no valor de ∆Rct para a amostra positiva () em

126

ambos os eletrodos. Esse comportamento é esperado, uma vez que um maior número de

moléculas antigênicas imobilizadas tende a possibilitar que uma maior quantidade de anticorpos

específicos se ligue, aumentando assim a resposta obtida.

O imunossensor produziu uma curva de resposta que aumentou até 10 ng mL-1 para

a concentração de antígeno IBMP 8.1 (Fig. 18A) e 20ng mL-1 para o antígeno rLci1,2 (Fig.

18B), com não linearidade devido ao início da saturação dos locais de ligação específicos do

sensor observados acima desses valores. Assim, em relação a concentração utilizada nos testes

iniciais (1µgmL-1), houve uma diminuição de 100 vezes na concentração do antígeno utilizada

em W1, dimuição de apenas 38% na resposta, já para W2 houve uma diminuição de 50 vezes

na concentração do antígeno utilizada, percebendo-se uma diminuição de apenas 18,78% na

resposta do imunossensor. Os resultados obtidos são satisfatórios, uma vez que, foi mantida

uma boa resposta do imunossensor utilizando essas concentrações e, além disso, como se trata

de antígenos recombinantes, uma menor concentração a ser utilizada, significa menor gasto de

material biológico, diminuindo o custo de fabricação do imunossensor.

Análises com amostras não específicas para a plataforma também foram realizadas,

ou seja, em W1 foram testados soros negativos de T.cruzi () e positivos de L.infantum ().

Enquanto em W2 foram realizados testes com amostras negativas de L.infantum () e positivas

de T.cruzi (). Os dados presentes na Figura 18 mostram respostas analíticas baixas para essas

amostras, indicando que os soros não específicos não fornecem resultados significativos de

∆Rct e que o imunosensaio proposto conseguiu discriminar nas concentrações escolhidas os

pools de soros negativos dos positivos.

Com o intuito de melhorar o desempenho do imunossensor desenvolvido o tempo

de imobilização da proteína BSA, utilizada como agente bloqueador, também foi estudado.

Através da análise da Figura 19 é possível perceber que um valor máximo de ∆Rct é atingido

em aproximadamente 10 minutos para W1 e para W2 foi escolhido o tempo de 20min, uma vez

que após esse período não houve aumento significativo do valor de ∆Rct ( apenas 8% de 20

para 25min e 2% de 25 para 30min), sendo tempo suficiente para obtenção de uma elevada

eficiência no bloqueio e consequentemente uma melhor resposta do imunossensor.

127

Figura 19. Influência do tempo de imobilização da proteína BSA no valor de ∆Rct em (A) W1 e (B) W2. Antígeno imobilizado em condições otimizadas. Todas as medidas foram realizadas em solução de Fe(CN)6

3−/4− (5,0 mmol L−1) contendo KCl (0,1 mol L-1).

4.8– Caracterização e otimização da interação antígeno-anticorpo por espectroscopia de

impedância eletroquímica

As melhores condições de tempo de incubação e diluição do soro foram estudadas,

visto que o ensaio deve estar ocorrendo nas condições que mais favorece a reação de

reconhecimento da interação antígeno-anticorpo.

5 10 15 20 25 300,0

0,1

0,2

0,3

0,4

R

ct / k

Tempo BSA / min

A

5 10 15 20 25 300,50

0,55

0,60

0,65

0,70

0,75

0,80

0,85

0,90

0,95

Rct / k

Tempo BSA / min

B

128

Para o presente imunossensor, todos os resultados até então apresentados foram

obtidos em análises de incubação de anticorpos conduzidas durante 20 minutos. Com o objetivo

de tentar combinar baixo tempo analítico e máxima resposta na imunorreação, foram avaliados

diferentes períodos de análise: 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos utilizando a diluição de 1:320. A

Figura 20 mostra a influência do tempo de imunorreação no valor de ∆Rct, em que é possível

perceber que após 20 minutos não ocorre melhora considerável na resposta do diagnóstico.

Figura 20. (A) Efeito do tempo de imunorreação no valor de ∆Rct para W1 e (B) W2. Diluição de anticorpo utilizada foi 1:320. Antígeno e BSA utilizados em condições otimizadas. Todas as medidas foram realizadas em solução de Fe(CN)6

3−/4− (5,0 mmol L−1) contendo KCl (0,1 mol L-1).

5 10 15 20 25 300,26

0,28

0,30

0,32

0,34

0,36

0,38

0,40

0,42

Rct / k

Tempo de imunoreação - W1

A

5 10 15 20 25 300,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Rct

/ k

Tempo de imunoreação - W2

B

129

Dessa maneira, tais achados sugerem que tempos de imunorreação maiores que 20

minutos não são necessários para que ocorram interações entre as biomoléculas no imunoensaio

proposto, tanto em W1 quanto em W2.

Após ser detectado o melhor tempo de imunorreação, o imunossensor foi avaliado

quanto à sua capacidade em detectar anticorpos anti-T. cruzi e anti-L.infantum. Para os ensaios,

soros anti- T.cruzi e anti- L.infantum positivos e negativos foram utilizados nas seguintes

diluições: 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280 , 1:2560 , 1:5120 e 1:10240. A Figura 21

representa as variações do valor de Rct fornecidas pelo imunossensor após a adição do pool

positivo (), negativo () e positivo não específico () para as plataformas W1 e W2 nas

diferentes diluições.

É perceptível que a resposta analítica foi detectada para as diluições empregas para

o pool positivo 1:40 até 1:10240 para W1 e 1:40 até 5120 para W2. Por outro lado, quando

avaliado o comportamento do imunossensor frente ao pool negativo e amostra não específica

para o eletrodo em questão, foi observado que o dispositivo mostrou pequenas variações nos

valores de ∆Rct em todas as diluições, indicando elevada especificidade e ausência de reações

cruzadas.

Figura 21. (A) ∆Rct em função do fator de diluição do soro positivo () e negativo () para Chagas e positivo para Leishmaniose Visceral () em W1. (B) ∆Rct em função fator de diluição do soro positivo () e negativo () para Leishmaniose Visceral e positivo para Chagas () em W2.

1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2540 1/51201/10240

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Rct

/ k

Diluição

A

130

1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:51200,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

R

ct / k

Diluição

B

4.9– Avaliação de Desempenho do Imunossensor no Diagnóstico Sorológico da Doença de

Chagas e Leishmaniose Visceral

Após terem sido definidos os parâmetros operacionais a serem adotados para o

imunossensor desenvolvido e, com o intuito de certificar a perspectiva de real aplicação do

dispositivo no sorodiagnóstico simultâneo das doenças de Chagas e Leishmaniose Visceral, se

faz necessária a adoção de uma estratégia de análise criteriosa para o imunoensaio proposto,

bem como uma avaliação preliminar do desempenho da metodologia. Dessa forma, os

resultados subsequentemente apresentados estão relacionados a essas questões.

Para confirmar que as alterações de impedância observadas foram de fato baseadas

na interação específica e para confirmar a seletividade da plataforma, o imunossensor de

impedância foi incubado com uma mistura de anticorpos de T. cruzi e L. infantum nas condições

experimentais já estabelecidas, simulando um paciente com co-infecção, ou seja, presença de

ambas as infecções. A Fig. 22 A compara as respostas obtidas para a adição da amostra

específica e a amostra com a mistura de anticorpos, para W1 e W2. A adição do anticorpo

específico para DC foi obtido um valor de ∆Rct = 0,37±0,032kΩ, para a adição da mistura de

anticorpos nota-se que não ocorreu mudança significativa na resposta (∆Rct = 0,44± 0,021kΩ),

o que indica que a presença de anticorpos anti L. infantum não interfere significativamente na

resposta do imunossensor em W1. Resultados similares foram obtidos para W2 onde para a

131

adição do anticorpo específico para LV foi obtido um valor de ∆Rct = 0,80±0,043kΩ, sendo

que para a adição da mistura de anticorpo foi obtido um valor de ∆Rct = 0,82±0,036 kΩ

mostrando que foram obtidas respostas praticamente idênticas. Esses resultados revelam que o

imunossensor possui boa seletividade e poderia ser usado para identificar a co-infecção.

Figura 22. (A) Investigação da seletividade do imunossensor em condições otimizadas. Antígeno específico e mistura de antígenos estão na mesma diluição 1:320 (20 minutes). (B) Avaliação da repetibilidade do imunossensor desenvolvido. (C) Estudo da estabilidade de armazenamento do imunossensor.

132

A Fig. 22 B apresenta os resultados obtidos para os estudos de repetibilidade que

foram realizados para o imunossensor utilizando as condições anteriormente otimizadas. Podem

ser consideradas fontes de erro a simulação manual dos dados através do software NOVA, o

preparo diário de soluções (monômero, BSA, antígeno e anticorpo) e outros fatores que podem

ocasionar perturbações no sistema. Considerou-se nesse estudo o desvio relativo entre os

valores da resistência a transferência de carga de todas as medidas realizadas. Para tal foram

testados três dispositivos diferentes por dia durante três dias, no qual foi obtido desvio padrão

relativo (DPR) de 2,8% para W1 e 3,6 % para W2, indicando grande potencial analítico da

plataforma.

A Fig. 22C apresenta os resultados obtidos da avaliação da estabilidade de

armazenamento do imunossensor proposto que foi investigada com o intuito de avaliar o tempo

de vida útil do dispositivo. O imunossensor foi armazenado durante 8 semanas a 4° C e após

este período observou-se que o dispositivo reteve 70,2% de sua resposta inicial em W1 e 78,2%

em W2. Esses resultados sugerem que uma estabilidade a longo prazo pode ser esperada, devido

à forte ligação das moléculas de antígeno à superfície do eletrodo modificado, impedindo perda

de Ag, e proporcionando assim um efeito mínimo na reação imunológica mesmo após

armazenado.

Como abordado anteriormente, não é possível realizar a dosagem de anticorpos

presentes nas amostras de soro utilizadas, logo o limite de detecção e a faixa de trabalho para o

sistema não podem ser calculados.

O desempenho de diagnóstico simultâneo do imunoensaio frente a uma gama de

soros caninos e humanos para detecção de anticorpos específicos também foi avaliado. Para tal,

foram analisadas a reatividade de 10 amostras de soros humanos e 10 amostras de soros caninos

para T. cruzi-positivo (TcP), T. cruzi-negativo (TcN), L. infantum-positivo (LiP), and L.

infantum-negativo (LiN) individualmente, ou seja, um total de 40 amostras. Conforme mostrado

na Fig 23, a análise das amostras em uma diluição de 1:320 permite uma separação clara entre

amostras infectadas e não infectadas tanto no grupo de soros humanos quanto no grupo de cães.

De acordo com os valores de AUC, os antígenos IBMP-8.1 e rLci1A / rLci2B

alcançaram valores excelentes de precisão global (1,0), indicando que eles podem distinguir

com eficiência amostras positivas de negativas. Além disso, foram encontrados valores de alta

133

sensibilidade (100%), especificidade (100%) e acurácia (100%), além de perfeita concordância

entre os testes padrão de referência e o imunossensor.

Figura 23. Reatividade obtida para amostras de soros humanos e caninos para T. cruzi-positivo (TcP), T. cruzi-negativo (TcN), L. infantum-positivo (LiP), and L. infantum-negativo (LiN) individualmente. O valor de cut-off é o indice de reatividade = 1,0, e a área sombreada representa a zona cinza (RI = 1,0 ± 0,10). Linhas horizontais e números para cada grupo de resultados representam as médias geométricas (± 95% CI). AUC (área sob a curva); Sen (sensibilidade); Spe (especificidade); Acc (precisão); K (coeficiente Kappa de Cohen); GZ (zona cinza).

134

Para o antígeno IBMP-8.1, esses resultados estão de acordo com dados anteriores

obtidos por nosso grupo de pesquisa usando ELISA (DEL-REI et al., 2019; DOPICO et al.,

2019; LEONY et al., 2019; SANTOS et al., 2016, 2017A, 2018) ou liquid microarray como

plataformas de diagnóstico (Santos et al., 2017b).

Para o antígeno rLci1A / rLci2B, o imunossensor impedimétrico apresentou

resultados ligeiramente superiores aos obtidos anteriormente por nosso grupo de pesquisa,

usando o protótipo de teste rápido imunocromatográfico baseado na plataforma de dupla via e

sorologia de citometria de fluxo (FRAGA et al., 2014; KER et al., 2019). Além disso, diferenças

superiores a 6,97 foram observadas entre os sinais de RI (os valores de RI individuais estão

disponíveis Tabela 5) das amostras positivas e negativas para todas as proteínas, fornecendo

mais evidências de sua alta capacidade discriminatória.

Tabela 5: Valores de indice de reatividade para avaliação de desempenho do diagnóstico.

Soro Humano

Leishmaniose Visceral Doença de Chagas

Amostra ID RI Amostra ID RI L. infantum-positive 01 1.76 T. cruzi-positive 01 1.65 L. infantum-positive 02 1.90 T. cruzi-positive 02 1.87 L. infantum-positive 03 2.10 T. cruzi-positive 03 1.94 L. infantum-positive 04 2.37 T. cruzi-positive 04 2.03 L. infantum-positive 05 2.75 T. cruzi-positive 05 1.87 L. infantum-positive 06 2.54 T. cruzi-positive 06 2.32 L. infantum-positive 07 2.75 T. cruzi-positive 07 1.94 L. infantum-positive 08 2.68 T. cruzi-positive 08 1.87 L. infantum-positive 09 3.25 T. cruzi-positive 09 1.97 L. infantum-positive 10 1.86 T. cruzi-positive 10 1.90 L. infantum-negative 01 0.14 T. cruzi-negative 01 0.10 L. infantum-negative 02 0.07 T. cruzi-negative 02 0.19 L. infantum-negative 03 0.14 T. cruzi-negative 03 0.19 L. infantum-negative 04 0.10 T. cruzi-negative 04 0.13 L. infantum-negative 05 0.24 T. cruzi-negative 05 0.16 L. infantum-negative 06 0.24 T. cruzi-negative 06 0.26 L. infantum-negative 07 0.10 T. cruzi-negative 07 0.35 L. infantum-negative 08 0.10 T. cruzi-negative 08 0.10

135

L. infantum-negative 09 0.14 T. cruzi-negative 09 0.26 L. infantum-negative 10 0.24 T. cruzi-negative 10 0.16

Soro de cães

Leishmaniose Visceral Doença de Chagas

Amostra ID RI Amostra ID RI L. infantum-positive 01 3.07 L. infantum-positive 01 3.44 L. infantum-positive 02 2.93 L. infantum-positive 02 3.06 L. infantum-positive 03 2.73 L. infantum-positive 03 1.67 L. infantum-positive 04 3.71 L. infantum-positive 04 3.11 L. infantum-positive 05 2.59 L. infantum-positive 05 2.22 L. infantum-positive 06 2.54 L. infantum-positive 06 2.50 L. infantum-positive 07 1.61 L. infantum-positive 07 1.17 L. infantum-positive 08 3.22 L. infantum-positive 08 3.72 L. infantum-positive 09 3.85 L. infantum-positive 09 2.28 L. infantum-positive 10 3.56 L. infantum-positive 10 1.83 L. infantum-negative 01 0.29 L. infantum-negative 01 0.83 L. infantum-negative 02 0.20 L. infantum-negative 02 0.28 L. infantum-negative 03 0.15 L. infantum-negative 03 0.33 L. infantum-negative 04 0.34 L. infantum-negative 04 0.33 L. infantum-negative 05 0.24 L. infantum-negative 05 0.22 L. infantum-negative 06 0.29 L. infantum-negative 06 0.33 L. infantum-negative 07 0.15 L. infantum-negative 07 0.39 L. infantum-negative 08 0.39 L. infantum-negative 08 0.22 L. infantum-negative 09 0.24 L. infantum-negative 09 0.28 L. infantum-negative 10 0.29 L. infantum-negative 10 0.50

A ocorrência de reatividade cruzada entre DC, LV e outros patógenos é uma

importante limitação das metodologias sorológicas convencionais utilizadas no diagnóstico.

Assim, o imunossensor proposto também foi testado quanto à sua especificidade, através da

realização de experimentos de controle com outras infecções tais como pelo vírus linfotrópico

da célula humana (HTLV), vírus da imunodeficiência humana (HIV), Leishmaniose

Tegumentar Americana (ATL), Toxoplasmose (TOXO) e Hepatite B (HBV), sendo todas as

amostras utilizadas preparadas na mesma diluição (1:320), os resultados obtidos para tal

avaliação estão apresentados na Figura 24 e os valores de índice de reatividade se encontram

na Tabela 6.

136

Figura 24. Análise de reatividade cruzada (CR) de IBMP-8.1 ou rLci1A / rLci2B com soros humanos de indivíduos com doenças não relacionadas. O valor de corte é o índice de reatividade = 1,0, e a área sombreada representa a zona cinza (RI = 1,0 ± 0,10). As linhas horizontais representam as médias geométricas (IC95%), com os resultados correspondentes mostrados abaixo para cada grupo. ATL (leishmaniose tegumentar americana); HBV (vírus da hepatite B); HIV (vírus da imunodeficiência humana); HTLV (vírus linfotrópico de células T humanas); TOXO (Toxoplasmose); GZ (zona cinza); RI (índice de reatividade).

Tabela 6: Valores de índice de reatividade para avaliação de reatividade cruzada. ATL – Leishmaniose tegumentar americana, HBV - Vírus da Hepatite B, HIV – Virus da imunodeficiencia humana, HTLV - vírus linfotrópico da célula humana e TOXO – Toxoplasmose.

Soro Humano

Leishmaniose Visceral Doença de Chagas

Amostra ID RI Amostra ID RI ATL_01 0.14 ATL_01 0.35 ATL_02 0.24 ATL_02 0.26 HBV_01 0.14 HBV_01 0.16 HBV_02 0.10 HBV_02 0.19 HIV_01 0.24 HIV_01 0.13 HIV_02 0.20 HIV_02 0.16

HTLV_01 0.20 HTLV_01 0.13 HTLV_02 0.14 HTLV_02 0.16 TOXO_01 0.10 TOXO_01 0.06 TOXO_02 0.14 TOXO_02 0.13

137

É possível observar que nenhuma amostra testou positivo com IBMP-8.1 ou rLci1A

/ rLci2B. Resultados semelhantes foram encontrados para IBMP-8.1, usando ELISA (DALTRO

et al., 2019; DEL-REI et al., 2019; DOPICO et al., 2019; LEONY et al., 2019; SANTOS et al.,

2016a, 2017a, 2018b) e microarray líquido (SANTOS et al., 2017b). Para rLci1A / rLci2B, o

imunossensor novamente apresentou resultados superiores aos obtidos anteriormente por nosso

grupo, usando o protótipo de teste rápido imunocromatográfico baseado na plataforma de dupla

via e sorologia de citometriade fluxo (FRAGA et al., 2014; KER et al., 2019). Nossos resultados

mostram separação total entre os grupos infectados e não infectados, bem como nenhuma

reatividade cruzada, pode ser detectada entre os soros com outras infecções. Isso é

extremamente relevante, uma vez que a leishmaniose representa uma fonte importante de

resultados falso-positivos entre os testes sorológicos convencionais (DALTRO et al., 2019).

O desenvolvimento bem-sucedido de um dispositivo com potencial de aplicação no

diagnóstico simultâneo de DC e VL em áreas onde L. infantum e T. cruzi são co-endêmicos

acabaria por reduzir os custos diagnósticos devido a uma redução significativa no número de

amostras que precisam ser reavaliadas.

Assim, diante do apresentado, o imunossensor proposto e desenvolvido neste

trabalho pode ser aplicado satisfatoriamente para o diagnóstico seguro e simples das doenças

de Chagas e Leishmaniose Visceral, apresentando excelente resultado para a metodologia de

detecção de amostras de soro humanos e caninos. Este sistema apresenta grandes perspectivas,

por exemplo, para a triagem de doadores em bancos de sangue, no acompanhamento pós-

terapêutico e comprovam pela primeira vez a possibilidade de uma real aplicação como uma

ferramenta alternativa para o diagnóstico imunológico dessas infecções parasitárias que são

doenças consideradas negligenciadas.

138

5. CONCLUSÃO

Considerando todos os resultados obtidos nos diferentes experimentos realizados

ao longo do presente estudo é possível concluir que:

a) O presente trabalho buscou uma nova inovação metodológica para o diagnóstico das

doenças de chagas e leishmaniose através da imobilização de antígenos recombinantes

sobre filme polimérico de 4-HFA, propondo o desenvolvimento de um dispositivo do

tipo point of care.

b) Foram definidos os melhores parâmetros de tempo de imobilização dos antígenos

recombinantes, concentração de antígeno utilizada, tempo de avaliação da resposta do

dispositivo, e diluição do soro para as duas doenças; além de testes de tempo de vida

útil do imunossensor impresso proposto.

c) O imunossensor EIS desenvolvido demonstrou alta sensibilidade e especificidade na

discriminação dos anticorpos anti- L. infantum e anti- T. Cruzi, livre de marcadores,

que poderá resultar em um método de imunodiagnóstico, simples e rápido, com

perspectivas para aplicação em áreas endêmicas e, principalmente, em triagem de

doadores em bancos de sangue, com tempo de resposta de menos de 50 min.

d) Com base no apresentado é possível constatar o grande potencial do imunossensor

desenvolvido em constituir uma ferramenta sensível, específica e rápida para o

sorodiagnóstico da leishmaniose visceral e da doença de chagas.

139

PERSPECTIVAS

Apesar de terem sido alcançados os objetivos propostos, o presente trabalho ainda abre

perspectivas para novos estudos, tais como:

a) Avaliar o potencial do imunossensor como uma ferramenta aplicável no diagnóstico

sorológico de LV e DC, por meio de uma população inquérito artificial composta

por um diversificado panorama com uma quantidade de amostras de soro maior do

que a quantidade de soros já estudada.

b) Avaliar o tempo de vida útil do imunosensor proposto em diferentes temperaturas

de armazenamento.

c) Avaliar a resposta do imunossensor frente a adição de amostras de sangue humano

e canino.

140

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