TINCIÓN DE GRAM Y OBSERVACIÓNMICROSCÓPICA

Buritica Ahumada Brayan Alexander1., Castañeda Torres MiguelAngel2., Medina Díaz Hassay Lizeth3., Vargas Corredor Yuri

Alexandra4.

Fundación Universitaria De San Gil-Unisangil, Facultad DeCiencias e Ingenierías. Ingeniería

AmbientalYopal, Colombia

nayarb_01@hotmail.commigel-ac77@hotmail.comhassay2610@hotmail.com Yuricitar4@hotmail.com

Resumen – En el siguiente artículo se presenta ladescripción de un procedimiento en el cual se llevóa cabo la tinción de Gram con el fin de contrastarlas bacterias presentes en una UFC (unidadformadora de colonia) de una muestra de suelo,para identificar la presencia de bacterias según sugrupo taxonómico: Gram positivas y Gramnegativas. En este procedimiento, en un portaobjetos limpio y seco, se agregó una gota de aguadestilada y posteriormente se colocó una UFC(unidad formadora de colonia) encima de estagota con un asa de siembra previamenteesterilizada; seguidamente se calentó suavementeen la llama de un mechero para fijar la muestra.Posteriormente se tiño con cristal violeta deHucker, luego se lavó con agua destilada,nuevamente se tiño con lugol y seguidamente selavó con alcohol para retirar el exceso decolorante, después se aplicó fucsina básica para

contrastar y por último se lavó con agua corrientey se dejó secar la muestra. Finalmente se procedióa la identificación la presencia de bacterias segúnsu grupo taxonómico: Gram positivas o Gramnegativas presentes en la UFC a través delmicroscopio con el objetivo de 100x obteniendoStaphylococcus sp Gram positivos y baterías Gramnegativas con forma de bacilo.

Palabras claves: Gram, negativas, positivas,tinción, fucsina, colonias, suelo, Staphylococcus sp

Abstract- The following article presents thedescription of a procedure which was performedGram staining in order to contrast the bacteriapresent in a UFC ( colony forming unit ) of a soilsample to identify the bacteria by taxonomicgroup : Gram positive and Gram negative. In this

1. Estudiante de ingeniería ambiental2. Estudiante de ingeniería ambiental3. Estudiante de ingeniería ambiental4. Estudiante de ingeniería ambiental

procedure, a clean and dry objects carrier wasadded a drop of distilled water and subsequentlyplaced a UFC ( colony forming unit ) above thisdrop a previously sterile inoculation loop , thenwarmed gently in the flame of a lighter to set thesample. Subsequently stained with Hucker crystalviolet , then washed with distilled water, stainedwith Lugol again and then washed with alcohol toremove excess dye , basic fuchsin was then appliedto contrast and finally washed with water and thesample was allowed to dry . Finally proceeded toidentify the presence of bacteria by taxonomicgroup : Gram positive or Gram negative bacteriapresent in the UFC through microscope with 100xobjective Staphylococcus sp obtaining batteriesGram positive and Gram negative rod-shapedbacteria .

Keywords: Gram negative, positive, staining,fuchsin, colonies, soil, Staphylococcus sp

I. INTRODUCCIÓN

El principal impedimento en laobservación de bacterias enmicroscopio óptico es la falta decontraste entre la célula enobservación y el medio que larodea, la manera más simple defacilitar el contraste es lautilización de colorantes,revelando la presencia dedeterminados constituyentescelulares, tales como flagelos,esporas, cápsulas, paredescelulares, centros de actividadrespiratoria, etc. Parabacterias, el proceso de fijaciónpor calor es lo más habitual,aunque también puede fijarse consustancias químicas como

formaldehido, ácidos y alcoholes.Después de esto se añade elcolorante. La fijación producehabitualmente el encogimiento delas células; la tinción, por elcontrario, hace que las célulasparezcan mayores de lo que sonrealmente. La mayoría de loscolorantes son compuestosorgánicos que tienen algunaafinidad por los materialescelulares. [1]

Algunos colorantes teñiránmejor sólo después de que lacélula haya sido tratada con otrasustancia química, que no es uncolorante por sí mismo. Estasustancia se denomina mordiente;un mordiente habitual es el ácidotánico. El mordiente se combinacon un constituyente celular y loaltera de tal modo que ahora sípodrá atacar el colorante.

Una técnica de coloración y lamás conocida es la tinción deGram, denominada así por elbacteriólogo danés ChristianGram, quien desarrollo estatécnica en 1844. Sobre la base dela tinción de gran, las bacteriasse clasifican en dos grupos: granpositivos y gran negativos.

En cuanto a la tinción de granla secuencia es la siguiente: elfrotis bacteriano se fija concalor se tiñe con cristal violetapor min, se lava con agua, se laaplica un mordiente por 1 min yse lava nuevamente con agua,después se decolora con unamezcla alcohol etílico/acetona.Escurrir y cubrir con safranina(color de contraste) durante 1min lavar y secar.

Las bacterias Gram positiva yGram negativas tiñen de formadistinta debido a las diferenciasconstitutivas en la estructura desus paredes celulares. La paredde la célula bacteriana sirvepara definir su tamaño y su formaal organismo así como paraprevenir la lisis osmótica. Lapared de la células Grampositivas es gruesa y consiste envarias capas interconectadas depeptidoglicano (cadenas linealesde un polisacárido formado porresiduos alternativos de N-acetilglucosamina y N-acetilmurámico unidos mediante unenlace) [3] y un poco de ácidoteicoico (forman parte de lagruesa capa de peptidoglicano querodea a la membrana plasmática yestán directamente unidos a élmediante un enlace fosfodiéster.De este modo pueden conectarvarias capas de peptidoglicano)[3], mientras que las bacteriasgram negativas se componen de unacapa delgada de peptidoglicano yestá rodeada por una capaexterior de lipopolisacáridos(forma parte de la pared de lapared celular de las bacteriasGram-negativas. Tienen carácteranfipático, presentan carganegativa, y repelen moléculashidrofóbicas. Son tóxicos para elhombre, y también se llamanendotoxinas) [3] por lo cual estasdos tipos de bacterias se tiñende diferente color y es posibleidentificarlas como Gram positivao Gram negativa. [2]

II. MATERIALES Y MÉTODOS

A. Procedimiento I: TINCIÓN DEGRAM

Teniendo en cuenta elprocedimiento de la guía llamadaTINCION DE GRAM Y OBSERVACIÓNMICROSCÓPICA de la fundaciónuniversitaria de San Gil –Unisangil, este se divide en dossecciones:

Sección A. Extensión: primeramentese limpió un portaobjetos conalcohol y posteriormente seflameó, luego se colocó una gotade agua destilada en el centrodel porta y con el asa desiembra, esterilizada a la llama,se colocó una pequeña cantidad desuspensión de bacterias, de unacolonia sobre la gota de aguadestilada, después con el asa seextendió la gota y las bacteriassobre el porta y se fijó lamuestra por el calor, luego secalentó suavemente a la llama delmechero hasta que se secó.

Sección B. Coloración: Se aplicó a lamuestra fijada anteriormente unacantidad del colorante cristalvioleta de Hucker suficiente paracubrir la superficie delextendido durante un minuto y selavó con agua destilada lamuestra fijada, seguidamente seaplicó lugol (mordiente) sobretoda la superficie del extendidodurante un minuto, luego seagregó alcohol de 95° pararetirar el exceso de colorante(decolorante) y se lavó con aguadestilada, después se aplicófucsina básica (colorante decontraste) durante un minuto ynuevamente se la se lavó la

muestra pero esta vez con aguacorriente, luego se dejó secarla muestra, colocándola invertidasobre papel, una vez que lapreparación estuvo totalmenteseca, se puso una gota muypequeña de aceite de cedro y seobservó al microscopio con elobjetivo de inmersión. (Esteprocedimiento se repito una vezmás, para observar otro tipo debacterias)

Nota: el cultivo del cual seextrajo las colonias que seutilizaron para realizar latinción de Gram proviene de unamuestra de suelo.

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 1. Staphylococcus ssp en Tinción deGram. Microscopía óptica en objetivo 100x. Bacterias de color violeta (Grampositivas).

En la figura 1 se puedeapreciar Staphylococcus ssp Gram

positivos que se encuentran enracimos, pares y e cadenas cortascon forma redonda (coco). Estabacteria se observa de colorvioleta ya que en el proceso detinción donde se le agrego losdiferentes colorantes comocristal violeta y fucsina básica,quedaron teñidas; aun cuando seles retiró el exceso de colorantecon agua destilada y alcohol de95°, tomando este colorcaracterístico que se le denominaa las bacterias que lo presentan“Gram positivas”. Estas bacteriaspresentan este color ya que laenvoltura celular de lasbacterias Gram-positivas cubrenla membrana citoplasmática y unapared celular compuesta por unagruesa capa de peptidoglicano,que rodea a la anterior. La paredcelular se une a la membranacitoplasmática mediante moléculasde ácido lipoteicoico[4]. La capade peptidoglicano le proporcionauna gran resistencia a estasbacterias y es la responsable deretener el tinte durante latinción de Gram al poseer unagran proporción de este polímerocomplejo (mureína) la cual no lahace susceptibles a la acción delsolvente orgánico, sino que esteactúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que puedaescaparse el complejo cristalvioleta/yodo, y manteniendo lacoloración azul-violácea [5]. Adiferencia de las Gram-negativas,estas bacterias no presentan una

segunda membrana lipídicaexterna.

Figura 2. Bacillu spp en tinción de Gram.Microscopia óptica en objetivo 100x.Bacterias de color rosado (Gramnegativas).

En la figura 2 es posibleobservar bacterias con forma debacilo (forma de barra o vara) yde color rosadas, lo que indicaque son baterías Gram negativas.Esta coloración se debe a lascaracterísticas que poseen lasbacterias Gram negativas en supared celular. Debido a que lasbacterias Gram negativas poseenen su pared celular una capadelgada de peptidoglicano(mureína) unida a una membranaexterna formada por proteínas,fosfolípidos y polisacáridos, lacantidad de colorante cristalvioleta y del mordiente lugol queretiene es mínima, en comparacióna las bacterias Gram positivas,que “tiene varias capas depeptidoglucano unido a lamembrana plasmática, donde seencuentra el ácido lipoteicoico,y más en la superficie, el ácidoteicoico” [5], por lo cual elcomplejo de las moléculas decristal violeta, lugol y ácido

teicoico que se forma en la paredcelular de las Gram positivas, esmuy difícil de remover, lo que nosucede con las Gram negativas,porque el cristal violeta y ellugol no reaccionan con el ácidoteicocio, debido a que lasbacterias Gram negativas en supared celular no lo tienen. Porotra parte, la membrana externaque poseen las bacterias Gramnegativas es soluble encompuestos orgánicos como a lamezcla de alcohol y acetona, porlo tanto al momento de agregar eldecolorante alcohol 95°, elcomplejo de cristal violeta ylugol se perdió. De igual forma,las bacterias Gram negativastomaron su color rosado, debido aque se le agrego el colorante decontraste llamado Fuscina paracolocarlas en manifiesto.

Es importante decir que lascolonias a las que se les realizótinción de Gram, eran de unamuestra de suelo, lo cual explicala presencia de estas bacterias,debido a que en el suelopredominan las bacterias Gramnegativas. Sin embargo en elsuelo también se encuentranbacterias Gram positivas, pero enmenor proporción que las Gramnegativas, lo cual tambiénexplica la presencia de estasbacterias en el suelo.

IV. CONCLUSIONES

Tanto las bacterias Grampositivas como las Bacterias Gramnegativas se presentan

morfológicamente como cocos obacilos, sin embargo al ejecutartinción de Gram en estas paraidentificar su grupo taxonómico,las Gram positivas se tiñen decolor violeta mientras que lasGram negativas se tiñen de colorrosado.

Mediante la tinción de Gram seidentifican bacterias Grampositivas y Gram negativasgracias al color que tornandespués de ser teñidas; en elcaso de las bacterias Grampositivas se tiñen de violeta,esto se debe a que gracias a quecontienen una pared gruesa depeptidoglicano y gran cantidad deácidos teicóicos que permitenfijar y retener rápidamente elcolorante inicial el cual es, elcristal violeta de Hucker, yademás son resistentes a ladecoloración. Lo contrario ocurrecon el caso de las Gramnegativas, las cuales poseen unapared delgada con menos cantidadde peptidoglicano y lípidos, lacual requiere de un colorante decontratincion como la safranina ola fucsina en este caso, ya queel colorante inicial esfácilmente retirado en ladecoloración con alcohol, debidoa que por su delgada paredcelular no lo retienen.

La tinción de Gram permiteconocer la morfología celular,el tamaño, la forma y suclasificación taxonómica (Grampositivos o Gram negativos) deacuerdo al color que tornan las

bacterias después de la tinción,sin embargo no permite conocer laespecie o género de la bacteriaal cual pertenece.

Las colonias de bacterias a lasque se les realizó tinción deGram se tomaron de una muestra desuelo, lo cual explica lapresencia de estas bacterias,debido a que en el suelopredominan las bacterias Gramnegativas. Sin embargo en elsuelo también se encuentranbacterias Gram positivas, pero enmenor proporción que las Gramnegativas, lo cual tambiénexplica la presencia de estasbacterias en el suelo. Deacuerdo a esto Fue posibleobservar bacterias Gram negativascon forma de bacilo (con forma debarra o vara) y Gram positivascomo Staphylococcus sp.

REFERENCIAS

[1] Díaz Camilo (2011). Definición detinción. [En línea]. Disponible:http://es.scribd.com/doc/52811425/Tinciones-en-Microbiologia-Seminario. Citado:19/11/2013.

[2] Santambrosio Eduardo. (2009).tinciónde gram. [En línea]. Disponible:http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practico4.pdf. Citado: 19/10/2013.

[3] González Juan. Definición depeptidoglicano, ácido teicoico ylipopolisacáridos [En línea]. Disponible:http://www.ehu.es/biomoleculas/hc/sugar35b.htm#lp. Citado: 19/10/2013.

[4] Martinez Roberto. (2009). Bacteriagram positiva [En línea]. Disponible:http://martinez-roberto.blogspot.com/.Citado: 19/10/2013.

[5] Wikipedia (2013). Tinción de Gram.[En línea]. Disponible:http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram. Citado: 19/11/2013

[6] Cedeño, Kenia (2011).fuentes deerror en la tinción de gram. [En línea].Disponible:http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.com/p/tincion-de-gram_20.html. Citado:19/10/2013.

[7] López Tévez, Leonor (2006).Comportamiento de las bacterias en latinción de gram. [En línea]. Disponible:http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp6.pdf. Citado: 19/10/2013.

[8] Wikipedia (2013). Tinción de Ziehl-Neelsen. [En línea]. Disponible:http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl_Neelsen. Citado:19/11/2013

[9] Diagnóstica re activos para uso invitro (2007).Aceite de inmersión. [Enlínea]. Disponible:http://www.ihrdiagnostica.com/tecnicas/pdf/AceiteDeInmersionv2.pdf Citado:19/10/2013.

Anexo 1. PREGUNTAS POSTLABORATORIO N°5

1. ¿Cuáles son las fuentes deerror más comunes en la Tinciónde Gram?

Los peores obstáculos de laTinción, que impiden conseguir elresultado perseguido, son los

errores del técnico. Paraevitarlos hay que elegir bien losreactivos y ser muy cuidadosos alejecutar la técnica. Acontinuación se especificanalgunas de las fuentes de error:

Impurezas en losreactivos de Tinción.

Concentracióninadecuada de los reactivosde tinción.

pH inadecuado. El colorante se fija a

la célula por mecanismosfísico-químicos, que sealteran si el PH no es elapropiado.

Los colorantes puedenser ácidos, básicos oneutros.

Tiempo de Tinciónincorrecto.

Temperaturasuficiente. [6]

2. ¿A qué se debe el distintocomportamiento de las bacteriasGram+ o Gram- al tratamiento conla coloración de Gram?

La coloración de gran es degran importancia en Microbiologíaporque permite diferenciar dosgrandes grupos de bacterias(Gram+ y Gram-), según secomporten ante esta tinción. Elfundamento radica en la diferenteestructura de la pared celular deambos grupos: las bacterias Gram+tienen una gruesa capa depeptidoglicano en su pared,mientras que las bacterias Gram-tienen una capa de peptidoglicanomás fina y una capalipopolisacarídica externa, por

este motivo a las bacterias Gram+se les fija el primer coloranteusado en la mezcla, mientras quelas Gram- después del lavado sedesprende el colorante y se fijael colorante de contraste de latinción.

3. Explique como la tinción deGram permite realizaridentificación bacteriana.

La tinción de Gram ofrece lacoloración de las bacteriasdependiendo sus característicaspresentes en la pared celular, enlas cuales si es Gram positivaestas se tiñen del primercolorante (cristal violeta) y alutilizar el mordiente (lugol), sefija a la pared celular, por locual al aplicar el decolorante nose pierde el color como sucede enlas Gram negativas se tiñen delcolorante de contraste (fucsina),por lo cual al observar en elmicroscopio se logra definir lamorfología de las bacterias, esdecir el tamaña y la forma por locual se logra identificar lostipos de bacterias. [7]

4. Investigue otra técnica deTinción selectiva utilizada paraidentificación bacteriana,explique los fundamentos de estastécnicas.

Tinción de Ziehl-Neelsen: Lasparedes celulares de ciertasbacterias contienen ácidos grasos(ácidos micólicos) de cadenalarga (50 a 90 átomos de carbono)que les confieren la propiedad deresistir la decoloración conalcohol-ácido, después de latinción con colorantes básicos.Por esto se denominan ácido-

alcohol resistentes. Lasmicobacterias como Mycobacteriumtuberculosis y M. marinum secaracterizan por sus propiedadesde ácido-alcohol resistencia. Lacoloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamientopara que el colorante atraviesela pared bacteriana que contieneceras. Al suspender elcalentamiento y enfriar con agua,provoca una nueva solidificaciónde los ácidos grasos de modo queel colorante ya no puede salir delas bacterias. Por otro lado, elcalentamiento aumenta la energíacinética de las moléculas delcolorante lo cual tambiénfacilita su entrada a lasbacterias. Las bacterias queresisten la decoloración son decolor rojo y las que no, se vende color azul ya que se utilizaazul de metileno como tinción decontraste. [8]

Figura 3. Observación al microscópico óptico de una tinción de ziehl-Neelsen.

5. ¿Para qué se utiliza el aceitede inmersión?

El aceite de inmersión paramicroscopio tiene aproximadamenteel mismo índice de refracción queel vidrio. Mediante el aceite deinmersión se elimina casicompletamente la desviación delos rayos de luz y se aumentaconsiderablemente la eficacia delos objetivos de losmicroscopios. [9]