UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

BRAZ JOSÉ DO NASCIMENTO JÚNIOR

AVALIAÇÃO DO EFEITO DO MONOTERPENO BORNEOL SOB MUCOSITE

ORAL INDUZIDA POR 5-FLUOROURACIL E DESENVOLVIMENTO DE FORMA

FARMACÊUTICA PARA USO ODONTOLÓGICO

RECIFE

2017

BRAZ JOSÉ DO NASCIMENTO JÚNIOR

AVALIAÇÃO DO EFEITO DO MONOTERPENO BORNEOL SOB MUCOSITE

ORAL INDUZIDA POR 5-FLUOROURACIL E DESENVOLVIMENTO DE FORMA

FARMACÊUTICA PARA USO ODONTOLÓGICO

Orientadora: Prof.ª Dra. Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim

Co-Orientadora: Prof.ª Dra. Talita Mota Gonçalves (UNIVASF)

RECIFE

2017

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) para a obtenção do Título de Doutor em Ciências Farmacêuticas.

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BRAZ JOSÉ DO NASCIMENTO JÚNIOR

AVALIAÇÃO DO EFEITO DO MONOTERPENO BORNEOL SOB MUCOSITE ORAL INDUZIDA POR 5-FLUOROURACIL E DESENVOLVIMENTO DE FORMA

FARMACÊUTICA PARA USO ODONTOLÓGICO

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências Farmacêuticas.

Aprovada em: 06/04/2017.

BANCA EXAMINADORA

____________________________________________________________ Prof.ª Dr.ª Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim (Presidente)

Universidade Federal de Pernambuco

____________________________________________________________ Prof.ª Dr.ª Teresinha Gonçalves da Silva (Examinadora Interna)

Universidade Federal de Pernambuco

____________________________________________________________ Prof. Dr. Luiz Alberto Lira Soares (Examinador Interno)

Universidade Federal de Pernambuco

____________________________________________________________ Prof. Dr. José Thadeu Pinheiro (Examinador Externo)

Universidade Federal de Pernambuco

____________________________________________________________ Prof. Dr. Tadeu José da Silva Peixoto Sobrinho (Examinador Externo)

Centro Universitário do Vale do Ipojuca

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

REITOR

Prof. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

VICE- REITORA

Profa. Florisbela de Arruda Camara e Siqueira Campos

PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

Prof. Ernani Rodrigues de Carvalho Neto

DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Prof. Nicodemos Teles de Pontes Filho

VICE-DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Profa. Vânia Pinheiro Ramos

COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

Prof. Almir Gonçalves Wanderley

VICE-COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

Prof. Rafael Matos Ximenes

R E C I F E

2017

A memória de minha avó materna, Luiza Onélia de

Almeida, falecida em 2014 aos 89 anos, um exemplo de

vida. Foi ela que me ensinou muitas lições, além das

primeiras letras e dos primeiros números. Mulher de fé em

Deus, “frasista nata”, dedicada à família, esforçada,

honesta, simples, ensinou-me o respeito ao próximo e à

natureza. Não estudou muito, no entanto, era muito sábia,

soube superar todas as adversidades de seu tempo,

inclusive continuar cuidando dos seus filhos quando meu

avô a deixou para viver com outra mulher. Entre os seus

admiradores, sou um dos mais ardorosos. Escrevo essas

palavras com lágrimas nos olhos. Dedico também à

memória do meu irmão Carlos Esdras Almeida do

Nascimento, falecido em 1993, aos 20 anos de idade num

acidente de carro que ceifou sua vida. Nessa fase

estávamos vivendo uma amizade verdadeira de irmãos, a

união fraternal era quase uma regra. As brigas

corriqueiras e frequentes aos irmãos já estavam ficando

ausentes há mais de cinco anos... Minhas boas

lembranças... Sei que a vida é passageira e o que fica é a

boa recordação...

AGRADECIMENTOS

Ao Deus da minha salvação, pelo dom da vida e pela fortaleza nos momentos de

angústias;

A minha família pela compreensão das minhas ausências durante esse período, pelo

amor, carinho e apoio em meus projetos de vida. Principalmente, a minha esposa

Karla Adriana, aos meus filhos Nínive Victória, Rafael Pedro e Igor Samuel, aos

meus pais Capitão Braz e dona Conceição, ao meu irmão Welvson Dennis e minha

Tia Jandaracy, os meus amados.

A Professora Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim por ter me aceitado como orientando

e por todos seus ensinamentos científicos e de vida.

A FACEPE pela Bolsa de Doutorado que viabilizou os gastos com a minha

formação.

A UNIVASF pela liberação do afastamento para o doutoramento, pelas instalações e

o fornecimento dos animais para o experimento.

Aos alunos de graduação Cínthia Reyjane, Lucas Brito, Luana Matos, Walquíria

Nunes e Daniela Gonçalves pela ajuda nos experimentos com os animais.

A FARMACE, na pessoa do Dr. Emanuel Jair Gonçalves Souza Carvalho pelo

auxilio na produção dos géis e Dr. Sílvio Alan Gonçalves Bonfim Reis pela ajuda nos

testes de estabilidade dos produtos.

Ao Prof. Luciano Ribeiro (UNIVASF) pela ajuda nos testes estatísticos.

Ao Prof. Almir Gonçalves Wanderley pela boa coordenação da PPGCF.

Aos professores da pós-graduação em Ciências Farmacêuticas que contribuíram na

minha formação e com os quais cursei as disciplinas.

Aos técnicos da Secretaria da PPGCF, Nerilin Trajano, Jane Barbosa, Rilvan

Guedes e Jenifer Oliveira (LAPRONAT), mas também, as estagiárias Júlia Hellen e

Bárbara de Paula pela paciência quando me ajudaram no que era necessário.

Aos professores da Banca pelas boas sugestões que contribuirão para o

melhoramento desse documento, bem como, para meu crescimento como

pesquisador.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram, porque não fazemos nada

sozinhos.... O meu muito obrigado...

“Porque dele, por ele, e para ele, são todas as

coisas; glória, pois, a ele eternamente. Amém”.

(Romanos 11: 36)

RESUMO

A mucosite oral é a mais comum e angustiante patologia que se desenvolve como efeito adverso agudo da quimioterapia e radioterapia da cabeça e pescoço e está entre as principais causas de interrupções ou diminuições de dose na terapia do câncer, com isso, expondo o paciente a progressão da doença. O objetivo dessa pesquisa foi investigar a ação do borneol em mucosites orais induzidas por 5-Fluorouracil (5- FU) em modelo experimental de Ratos Wistar e preparar géis bucais a base desse monoterpeno. Os géis foram preparados com base Aristoflex®, incorporando-se o borneol nas concentrações de 1,2% e 2,4% (m/m). Os produtos foram submetidos a testes de estabilidade preliminar por centrifugação, ciclos de congelamento-descongelamento por 12 dias e análise dos parâmetros organolépticos e físico-químicos. No estudo experimental foram utilizados 48 ratos Wistar machos (Rattus norvegicus). A indução de mucosite oral foi realizada através da administração de 30 mg/Kg de 5-Fluorouracil por via intraperitoneal, nos dias 0, 2 e 4. No segundo dia, as mucosas jugais direitas dos animais foram injuriadas quimicamente com ácido acético a 50%, embebido em papel de filtro por 60 segundos. Os animais foram numerados de 1 a 48 e distribuídos aleatoriamente em quatro subgrupos de 12 animais (Grupo I = Borneol 0%; Grupo II = Borneol 1,2%; Grupo III = Borneol 2,4% e Grupo IV = Controle). Seis animais de cada grupo foram submetidos à eutanásia nos dias 7 e 14 após as injurias. As mucosas jugais direitas foram removidas e fixadas em formaldeído a 10% tamponado, processadas com cortes transversais de 5 µm, coradas em HE e Tricrômico de Masson. As lâminas obtidas foram analisadas em microscópio óptico munido de câmera digital. Nas avaliações semiquantitativa e qualitativa foram utilizados escores de cicatrização que variaram de 0 a 3 e tabela guia. A avaliação quantitativa foi conduzida com o auxílio do software ImageJ®. A análise estatística dos dados foi realizada por ANOVA Two-Way, seguida de pós-teste de Tukey em todas as comparações, exceto na avaliação dos escores de cicatrização, na qual foi usado o teste de Mann Whitney. Considerou-se o nível de significância p<0,05 em todas as análises. Os resultados de estabilidade dos géis comprovaram que os produtos apresentaram mínima variação na estrutura, sendo considerados estáveis. Além do mais, os produtos mostraram adesividade nas mucosas dos animais e com características tixotrópicas, o que facilitou a permanência do gel por mais tempo nos locais das lesões, com isso, otimizando os efeitos locais do borneol. Ambos os géis contendo Borneol (1,2% e 2,4% m/m) foram eficazes nos parâmetros avaliados: escores de cicatrização, percentual de perda de peso, quantidade de células inflamatórias, número de vasos sanguíneos e percentual de colágeno neoformado. A constatação da ação anti-inflamatória e cicatrizante do borneol em mucosites orais em ratos é um forte indicativo desta atividade para extratos vegetais que sejam ricos nesta molécula.

Palavras-chave: Quimioterapia. Ulceração. Mucosite oral.

ABSTRACT

Oral mucositis is the most common and distressing pathology that develops as an acute adverse effect of chemotherapy and radiation therapy of the head and neck and is among the main causes of interruptions or dose reductions in cancer therapy, thereby exposing the patient to progression of the disease. The objective of this research was to investigate the action of borneol in oral mucosites induced by 5-Fluorouracil (5-FU) in an experimental model of Wistar rats and to prepare buccal gels based on this monoterpene. The gels were prepared with Aristoflex® base, incorporating the borneol at concentrations of 1.2% and 2.4% (m / m). The products were subjected to preliminary stability tests by centrifugation, freeze-thaw cycles for 12 days and analysis of organoleptic and physicochemical parameters. In the experimental study 48 male Wistar rats (Rattus norvegicus) were used. Induction of oral mucositis was performed by administering 30 mg / kg of 5-Fluorouracil intraperitoneally on days 0, 2 and 4. On the second day, the right oral mucosa of the animals were chemically injured with 50% acetic acid, Soaked in filter paper for 60 seconds. The animals were numbered from 1 to 48 and randomly assigned to four subgroups of 12 animals (Group I = Borneol 0%, Group II = Borneol 1.2%, Group III = Borneol 2.4% and Group IV = Control). Six animals from each group were submitted to euthanasia on days 7 and 14 after insults. The right jugal mucosa were removed and fixed in 10% buffered formaldehyde, processed with 5 μm transverse sections, stained in HE and Masson's Trichrome. The slides obtained were analyzed under an optical microscope equipped with a digital camera. In the semiquantitative and qualitative evaluations, healing scores ranging from 0 to 3 and guide table were used. The quantitative evaluation was conducted using ImageJ® software. Statistical analysis of the data was performed by Two-Way ANOVA, followed by Tukey's post-test in all comparisons, except for the evaluation of the healing scores, in which the Mann Whitney test was used. The significance level was set at p <0.05 for all analyzes. The stability results of the gels showed that the products showed minimal variation in the structure and were considered stable. Moreover, the products showed adhesiveness in the mucous membranes of the animals and with thixotropic characteristics, which facilitated longer gel stay at the lesion sites, thereby optimizing the local effects of borneol. Both gels containing Borneol (1.2% and 2.4% m / m) were effective in the evaluated parameters: healing scores, percentage of weight loss, number of inflammatory cells, number of blood vessels and percentage of neoformed collagen. The finding of the anti-inflammatory and healing action of borneol in oral mucosites in rats is a strong indicator of this activity for plant extracts that are rich in this molecule. Keywords: Chemotherapy. Ulceration, Oral mucositis.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Tipos de crescimento celular alterados.......................................................28

Figura 2. Os mecanismos de geração dos oncogenes..............................................30

Figura 3. Passo a passo do processo de carcinogênese...........................................31

Figura 4. As cinco fases de desenvolvimento da mucosite oral.................................39

Figura 5. Os métodos de estabelecimento de modelos pré-clínicos de mucosite e

tratamentos testados..................................................................................................45

Figura 6. Estrutura do borneol e Isoborneol...............................................................48

Figura 7. Isômeros D e L do Borneol..........................................................................48

Figura 8: Aspecto inicial dos géis antes da centrifugação.........................................52

Figura 9: pHmetro de bancada digital usado nas medições de pH dos géis.............52

Figura 10. Viscosímetro rotativo micro processado (Quimis, modelo Q-860M21).....53

Figura 11: Centrífuga Centribio®, modelo 80-2B utilizada nos testes de

estabilidade................................................................................................................54

Figura 12. Sala de Experimentação do Laboratório de Prática Cirúrgica da UNIVASF

– Campus Petrolina – Centro.....................................................................................55

Figura 13. Balança de precisão (Mettler-Toledo SB8000).........................................56

Figura 14. Analisador automatizado (pocH-100iV DIFF) para determinação de

parâmetros hematológicos nos animais como contagem de Hemácias, Leucócitos e

Plaquetas, além da concentração de hemoglobina...................................................57

Figura 15. Procedimento de injuria química da mucosa jugal na intenção de indução

da mucosite oral.........................................................................................................58

Figura 16: Tratamentos conforme os grupos. Aplicações diárias dos géis com hastes

flexíveis.......................................................................................................................59

Figura 17. Processamento do material biológico. Os espécimes em solução de

formaldeído a 10% tamponado, em seguida desidratação, diafanização, microtômia,

coloração e montagem das lâminas...........................................................................60

Figura 18. Ilustração da tela de leitura do software utilizado para mensuração dos

vasos sanguíneos e das células inflamatórias...........................................................63

Figura 19. Utilização do Software ImageJ® para o cálculo do percentual de

colágeno.....................................................................................................................64

Figura 20. Representação da coloração observada na tela para determinação do

percentual de colágeno neoformado..........................................................................65

Figura 21: Resultados da viscosidade média do gel Borneol 2,4%, antes e após os

testes de congelamento e descongelamento.............................................................68

Figura 22. Aspectos macroscópicos dos géis antes e após testes de Estabilidade..68

Figura 23. Escores de cicatrização da mucosite oral de acordo com os grupos e o

dia de experimentação...............................................................................................69

Figura 24. Aspectos microscópicos dos grupos com sete dias de experimentação..70

Figura 25. Aspectos microscópicos dos grupos com 14 dias de experimentação.....71

Figura 26. Aspectos microscópicos do colágeno neoformado dos grupos com sete

dias.............................................................................................................................72

Figura 27: Aspectos microscópicos do colágeno neoformado dos grupos com

quatorze dias..............................................................................................................73

Figura 28. Contagem do número de vasos de acordo com os grupos e os dias de

experimentação..........................................................................................................74

Figura 29. Contagem do número de células inflamatórias de acordo com os grupos e

os dias de experimentação.........................................................................................75

Figura 30. Percentual de Colágeno de acordo com os grupos com sete e 14 dias...76

Figura 31: Percentagem de perda de massa de acordo com o grupo e dia de

experimentação..........................................................................................................77

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Representação esquemática do experimento...........................................56

Quadro 2. Guia para análise microscópica qualitativa das Lâminas..........................61

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Métodos para estabelecimento de modelos animais de mucosite oral......44

Tabela 2. Demonstração dos quatro grupos e tratamento medicamentoso de cada

um deles.....................................................................................................................55

Tabela 3. Resultados da avaliação da estabilidade preliminar dos géis de Borneol,

antes e após o teste de congelamento e descongelamento......................................67

Tabela 4: Determinação de parâmetros hematológicos nos animais como contagem

de Hemácias, Leucócitos e Plaquetas, além do hematócrito.....................................78

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

5-FU - 5-Fluorouracil

ACS - American Cancer Society

AMCSC / SIOO - Diretrizes do Grupo da Associação Multinacional de Cuidados de

suporte em Câncer / Sociedade Internacional de Oncologia Oral

ASCO - American Society of Clinical Oncology

CIV - Cosmetic Ingredient Review

CPC - Chinese Pharmacopoeia Commision

CTCEA - Escala de Critérios de Terminologia Comuns para Eventos Adversos

DTMP - Desoxitimidina Monofosfato

ESMO - Grupo de Trabalho em Mucosite Oral

FCE - Fator de Crescimento Epidermal

FCQ - Fator de Crescimento de Queratinócitos

FDA - Food and Drug Administration

FDUMP - Monofosfato de Fluorodesoxiuridina

IARC - Agência Internacional de Investigação da Organização Mundial da Saúde

sobre o Câncer

INCA – Instituto Nacional do câncer

iNOS – Óxido Nítrico Sintetase

MN - Mononucleares

MO - Mucosite oral

NCI - National Cancer Institute

NF-kB - Fator de Transcrição Nuclear Kappa B

OMS - Organização Mundial de Saúde

PMN - Polimorfonucleares

PPRC - Pharmacopeia of the People’s Republic of China

RGB Stack - RGB é a sigla do sistema de cores aditivas formado pelas iniciais das

cores em inglês Red, Green e Blue no programa ImageJ®

SAS/MS – Secretaria de Atenção à Saúde do Ministério da Saúde

SNC - Serviço Nacional de Câncer

SUS – Sistema Único de saúde

UICC – União Internacional Contra o Câncer

VEGF - Fator de Crescimento do Endotélio Vascular

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 18

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 22

2.1 HISTÓRICO DO CÂNCER NO MUNDO E NO BRASIL ...................................... 22

2.2 CONSIDERAÇÕES SOBRE O CÂNCER ............................................................ 27

2.3 TRATAMENTO ATUAL DO CÂNCER ................................................................. 31

2.4 EFEITOS COLATERAIS DO TRATAMENTO DO CÂNCER ............................... 36

2.4.1 Mucosite Oral .................................................................................................. 36

2.5 TRATAMENTO DA MUCOSITE ORAL ............................................................... 38

2.6 MODELOS ANIMAIS DE MUCOSITE ORAL ...................................................... 44

2.7 O BORNEOL ....................................................................................................... 47

3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 50

3.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 50

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 50

4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 51

4.1 PREPARAÇÃO DOS GÉIS BASE ARISTOFLEX® ............................................. 51

4.2 CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DAS FORMULAÇÕES .............................. 51

4.2.1 Análise macroscópica da formulação .......................................................... 51

4.2.2 Determinação do pH....................................................................................... 52

4.2.3 Condutividade ................................................................................................ 52

4.2.4 Viscosidade .................................................................................................... 53

4.2.5 Avaliação preliminar da estabilidade............................................................ 53

4.2.5.1 Resistência à centrifugação .......................................................................... 53

4.2.5.2 Ciclo Gelo-Degelo ......................................................................................... 54

4.3 A EXPERIMENTAÇÃO........................................................................................ 54

4.3.1 Os animais e o manejo ................................................................................... 54

4.3.2 Formação de grupos experimentais ............................................................. 55

4.3.3 Pesagem dos ratos......................................................................................... 56

4.3.4 Análise Hematológica .................................................................................... 57

4.3.5 Indução da mucosite oral nos animais......................................................... 57

4.3.6 Tratamentos dos grupos ............................................................................... 58

4.3.7 Procedimento de retirada das mucosas jugais direitas dos animais. ....... 59

4.3.8 Processamento do material Biológico ......................................................... 60

4.3.9 Avaliação Histológica Qualitativa e Semiquantitativa................................. 60

4.3.10 Avaliação Histológica Quantitativa ............................................................. 62

4.3.10.1 Número de células inflamatórias e a quantidade de vasos sanguíneos nas regiões ulceradas ...................................................................................................... 62

4.3.10.2 Percentual de colágeno neoformado nas regiões ulceradas ....................... 64

4.3.11 Análise Estatística ........................................................................................ 65

4.3.12 Atendimento aos Critérios Éticos da Pesquisa ......................................... 65

5 RESULTADOS ....................................................................................................... 67

5.1 PREPARAÇÃO E AVALIAÇÃO DAS FORMULAÇÕES ...................................... 67

5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DOS GÉIS DE BORNEOL SOBRE A MUCOSITE ORAL ........................................................................................................................ 69

5.3 AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS QUANTITATIVAS .............................................. 72

6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 79

6.1 AVALIAÇÃO DAS FORMULAÇÕES CONTENDO BORNEOL. .......................... 79

6.2 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DOS ANIMAIS ................................................. 81

6.3 A EXPERIMENTAÇÃO, A ANÁLISE HISTOLÓGICA E A ANÁLISE ESTATÍSTICA. .......................................................................................................... 82

7 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 86

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 87

ANEXO A - CARTA DE APROVAÇÃO DO PROJETO NO COMITÊ DE ÉTICA DA UNIVASF ................................................................................................................. 102

ANEXO B - CARTA DE ACEITE. ............................................................................ 103

ANEXO C - ARTIGO ACEITO PELO BRAZILIAN JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES (QUALIS B2 – FARMÁCIA). ................................................................. 104

18

1 INTRODUÇÃO

Pretendeu-se com essa tese, estudar a ação do monoterpeno borneol em

mucosites quimioinduzidas experimentalmente por 5-Fluorouracil (5-FU) em Rattus

norvegicus. Estudos anteriores realizados em modelos experimentais mostram que o

borneol possui ação antinociceptiva e anti-inflamatória. Apesar dessa substância ser

pesquisada na área médica e em variados modelos animais, não há relatos de

estudos para o tratamento da mucosite oral quimioinduzida. Logo, existe uma lacuna

na qual uma pergunta precisou ser respondida: será que o borneol poderia controlar

o processo inflamatório em mucosites quimioinduzidas por 5-Fluorouracil (5-FU) em

Rattus norvegicus?

O tratamento do câncer tem sido cada vez mais intervencionista com a

utilização de doses de quimioterápicos, isolados ou combinados, cada vez maiores.

Tal fato encontra justificativa na tentativa de vencer a resistência primária das

neoplasias a ação das drogas e a busca de uma maior eficiência nas terapêuticas de

tratamento e de primeira linha. Porém, o efeito colateral dessa prática se constitui,

na maioria das vezes, no principal obstáculo a continuidade do protocolo utilizado

(SOUZA et al., 2000).

Também, o cirurgião-dentista deve estar presente na equipe multidisciplinar, e

ter conhecimento amplo sobre todas as manifestações que a terapia de radiação

causa no organismo, realizando tratamento odontológico previamente e

posteriormente a radioterapia, otimizando o tratamento antineoplásico, garantindo

assim melhor qualidade de vida ao paciente diante das adversidades que o

tratamento do câncer pode causa na cavidade oral (SERA et al., 2013).

Existem três formas de tratamento das neoplasias malignas: cirurgia,

radioterapia e quimioterapia. Nos dois últimos casos, o tratamento é inespecífico e

não difere o tipo celular alterado, ou seja, a inibição de crescimento celular também

se dá nas células normais de crescimento rápido, como na mucosa oral e medula

óssea (VOLPATO et al., 2007).

As complicações devido ao tratamento antineoplásico estão associadas a

fatores como: número de frações do quimioterápico, dose total da radioterapia,

intervalo entre as sessões, tempo total de tratamento e também a fatores

relacionados aos pacientes como idade, fumo, índice de higiene oral e álcool

(BUENO et al., 2012). As manifestações clínicas mais comumente associadas à

19

terapia de radiação na cavidade oral são: mucosite, osteorradionecrose, xerostomia,

cárie de radiação, trismo, infecções oportunistas, disfagia entre outras (SIMÕES et

al., 2011).

O 5-fluorouracil é um quimioterápico antimetabólito análogo ao folato, purinas

e pirimidina, usado comumente no tratamento de tumores malignos do trato

gastrintestinal, sendo uma das principais drogas que causam mucosite. Essa droga

que inibe a síntese do DNA tende a produzir mucosite. O aparecimento da mucosite

se justifica pelo fato da terapia do câncer afetar células do epitélio basal oral, que

são comumente sensíveis a drogas citotóxicas, usadas na quimioterapia, e à

radiação ionizante, utilizada na radioterapia de cabeça e pescoço. Como

consequência, observa-se a presença de mucosite oral em 36% a 100% dos

pacientes (SANTOS, 2011).

Dentre as principais alterações bucais, a mucosite oral é mais frequente e o

maior fator limitante de dose para radioterapia e quimioterapia, podendo levar à

interrupção do tratamento levando, ao comprometimento do tratamento e da taxa de

sobrevida. Ainda importante salientar que os portadores de mucosites oral referem

dor intensa, dificuldade para se alimentar e realizar higiene oral. Caracteriza-se

clinicamente por lesões eritematosas e ulcerativas que acometem o vermelhão dos

lábios e a mucosa oral (SMITH et al., 2007).

Essa alteração foi descrita inicialmente por Sonis et al., (2004a) como um

processo biológico complexo subdividido em cinco fases, apesar de descritas

linearmente, acontecem de forma bastante rápida e simultaneamente: iniciação,

super-regulação e geração de mensageiros, sinalização e amplificação, ulceração e

inflamação e fase de cura.

Segundo Sonis et al., (2004b), a frequência com que os pacientes submetidos

à quimioterapia apresentam problemas bucais é afetada por diversas variáveis.

Estas podem ser divididas em variáveis relacionadas com o paciente e aquelas

relacionadas com a terapia. Os fatores relacionados com o paciente incluem idade,

diagnóstico e o estado de sua boca antes e durante a terapia. As variáveis

relacionadas com a terapia incluem o tipo de droga, a dose e a frequência do

tratamento, além do uso de terapia concomitante.

O Borneol (C10H18O) é um álcool bicíclico, monoterpenoide, um material de

valor médico, especiaria aromática, material químico, também tem sido usado em

alimentos e medicina popular na China e na Índia. Muitos estudos mostram que o

20

borneol possui ação analgésica, anti-inflamatória, antioxidante, antibacteriana e

cicatrizante (LIU et al., 2009; BARRETO, 2013; MIRANZADEH et al., 2015). Em

remédios populares, o borneol é utilizado para vários fins, tais como dor de

garganta, feridas, queimaduras e infecções da pele. Além disso, diversas

publicações têm mostrado que o borneol aumenta a penetração de drogas através

da pele e da córnea (CUI et al., 2011; QI et al., 2013) e acelera a abertura da

barreira hemato-encefálica, aumentando a distribuição de drogas no tecido cerebral

(YU et al., 2013).

A síntese do monoterpeno borneol é iniciada pela formação do cátion geranila

que sofre isomerização, ciclizações que termina com a perda de um próton ou a

acréscimo de um nucleófilo (DEGENHARDT et al., 2009). O borneol é formado

partindo do intermediário difosfato de bornila. Nesta síntese, a enzima terpeno

sintase catalisa a formação do difosfato de bornila partindo do cátion de bornila. A

molécula é então hidrolisada ou oxidada, formando o borneol (CROTEAU; KARP,

1979).

As prescrições do borneol puro na medicina tradicional recomendam seu uso

por via oral, pois o mesmo é absorvido pela mucosa da membrana gastrointestinal e

entra no sistema circulatório para ser distribuído para órgãos e tecidos. Essa forma

de administração/veiculação apresenta biodisponibilidade inferior, pois é distribuída

lentamente e passa por fases de degradação. Este Monoterpeno é mais eficaz por

via intravenosa, mas existem algumas limitações como maior risco de toxicidade,

administração inadequada e preço mais elevado. Em contraste, a administração

intranasal do borneol (é absorvido e atinge a corrente sanguínea) evita a

degradação do fármaco no trato gastrointestinal, degradação ácida ou enzimática,

resultante do metabolismo de primeira passagem hepática, resulta em rápida

absorção e início de ação e uma maior biodisponibilidade (COSTANTINO et al.,

2007; PILLION et al., 2010). Outra forma de administração eficaz é a utilização de

géis de uso tópico para a mucosa e a pele, impedindo a degradação do fármaco no

sistema gastrointestinal e no fígado, que resultam em rápida absorção e início de

ação com uma maior biodisponibilidade (ZHAO et al., 2012; ALMEIDA et al., 2013;

TANIDEH et al., 2014; DANTAS, 2015).

Apesar do Borneol ter sido citado como eficaz em feridas na boca (LIU et al.,

2009; KONG et al., 2014), modelos pré-clínicos que comprovem a sua ação em

mucosite oral são inexistentes. Para tentar preencher essa lacuna essa pesquisa foi

21

desenvolvida, para contribuir no conhecimento dessa patologia que possui

tratamentos ainda tão variados e com resultados terapêuticos pouco satisfatórios e,

às vezes, apenas sintomáticos.

22

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Histórico do Câncer no mundo e no Brasil A origem da palavra câncer é creditada ao médico grego Hipócrates (460-377

aC), que é considerado o "pai da medicina". Hipócrates usou os termos “carcinos e

carcinoma” para descrever tumores não ulcerosos e formação de úlcera. Em grego,

esta palavra se refere a um caranguejo, pois a maioria dos tumores possui projeções

em forma de dedos que lembra a forma desse animal. O médico romano, Celsus

(28-50 aC), mais tarde, traduziu o termo grego câncer, para a palavra latina

caranguejo. Galeno (130-200 dC), outro médico grego, usou a palavra oncos (grego

para inchaço) para descrever tumores. Embora a analogia caranguejo de Hipócrates

e Celsus ainda seja utilizada para descrever os tumores malignos, o termo de

Galeno é agora utilizado como parte do nome para especialistas em câncer –

oncologistas (ACS, 2014).

A partir do século XV, alguns cientistas desenvolveram uma maior

compreensão do corpo humano. Com isso, Galileu e Newton começaram a usar o

método científico, que mais tarde foi empregado para estudar a doença. As

necropsias feitas por Willian Harvey (1628) conduziram a uma compreensão da

circulação do sangue através do coração e do corpo que tinha sido até então um

mistério. Em 1761, Giovanni Morgagni de Pádua foi o primeiro a fazer algo que se

tornou rotina hoje. Ele fez dissecções em cadáveres para relacionar a doença do

paciente com achados patológicos após a morte. Isto fundamentou a oncologia

científica, o estudo do câncer. O famoso cirurgião escocês John Hunter (1728-1793)

sugeriu que alguns tipos de câncer podiam ser curados por cirurgia e descreveu

como o cirurgião pode decidir quais tipos de cânceres deve operar. Se o tumor não

invadia os tecidos próximos e era "móvel", dizia ele, "não há impropriedade em

removê-lo." Um século mais tarde com o desenvolvimento de anestesia permitiu o

florescimento das cirurgias clássicas do câncer, tais como a mastectomia radical.

(ACS, 2014).

Em 1838, o patologista alemão Johannes Muller fundamentou a teoria

“Blastema” que demonstrou que o câncer é composto de células e não de linfa como

se pensava anteriormente, mas se acreditava que as células cancerosas não vinham

a partir de células normais. Muller propôs que as células cancerígenas eram

desenvolvidas a partir de elementos de brotamento (blastema) que entravam nos

tecidos normais. Seu aluno, Rudolph Virchow (1821-1902), o famoso patologista

23

alemão, determinou que todas as células, incluindo as células cancerígenas, são

derivadas de outras células. Na teoria da irritação crônica de Virchow, a irritação

crônica causa câncer, mas ele acreditava de forma incorreta que o câncer "se

espalhava como um líquido." Na década de 1860, o cirurgião alemão, Karl Thiersch,

mostrou que o câncer gerava metástases através da disseminação de células

malignas e não através de algum líquido não identificado. Na teoria do trauma, esse

agente externo foi considerado por alguns como causa do câncer, apesar dos

avanços na compreensão, a partir de finais dos anos 1800 até a década de 1920.

Esta crença foi mantida apesar da falha na produção de câncer em animais

experimentais (ACS, 2014).

O século XIX viu o nascimento da oncologia científica com o uso do

microscópio moderno no estudo dos tecidos acometidos. Rudolf Virchow foi o

fundador da patologia celular, pois contribuiu com a base científica para o estudo

patológico moderno do câncer. Morgagni correlacionou o curso clínico da doença,

com suas observações das necropsias, de modo semelhante, Virchow correlacionou

à patologia microscópica da doença. Este método não só permitiu um melhor

entendimento dos danos causados pelo câncer, mas também, auxiliou o

desenvolvimento da cirurgia do câncer. Os tecidos do corpo removidos pelo cirurgião

poderiam ser agora examinados e um diagnóstico preciso poderia ser feito. O

patologista também poderia dizer ao cirurgião se a operação tinha removido

completamente o câncer (ACS, 2014; HAJDU, 2011).

Em 1911, Peyton Rous, no Instituto Rockefeller, em Nova York, descreveu um

tipo de câncer (Sarcoma) em frangos causados por aquilo que mais tarde se tornou

conhecido como o vírus do sarcoma de Rous. Ele foi contemplado com o Prêmio

Nobel em 1968. Hoje em dia, vários vírus estão agora ligados ao câncer nos seres

humanos, por exemplo: os vírus da hepatite B ou C podem levar ao câncer de

fígado, o vírus Epstein-Barr tem sido associado a linfomas não-Hodgkin e cânceres

da nasofaringe. O HIV está associado ao sarcoma de Kaposi e linfoma não-Hodgkin,

os vírus papilomas humanos (HPVs) têm sido associados a muitos tipos de tumores,

especialmente em colo do útero, vulva, vagina, ânus, pênis e alguns tipos de câncer

de cabeça e pescoço, principalmente da língua e amígdalas (DEVITA;

ROSENBERG, 2012; ACS, 2014).

Em 1915, Katsusaburo Yamagiwa e Koichi Ichikawa da Universidade de

Tóquio, induziram câncer em animais de laboratório, pela primeira vez por aplicação

24

de alcatrão de carvão na pele de coelho. Mais de 150 anos se passaram desde que

o médico John Hill de Londres, reconheceu o tabaco como uma substância

cancerígena (uma substância que podia causar câncer em seres humanos). Hoje se

sabe que muitas substâncias específicas podem causam cânceres: como alcatrões

de carvão e seus derivados (como o benzeno), alguns hidrocarbonetos, anilina (uma

substância usada para fazer corantes), amianto, e muitos outros. A radiação

ionizante a partir de uma variedade de fontes, incluindo o sol, é também conhecida

como causadora de câncer (ACS, 2014).

Em 2014, a Agência Internacional de Investigação da Organização Mundial da

Saúde sobre o Câncer (IARC) identificou mais de 100 agentes cancerígenos

biológicos, químicos, físicos e muitos destes já são conhecidos há muito tempo.

Hoje, a pesquisa na área da oncologia está buscando descobrir novas substâncias

cancerígenas, explicando como elas podem causar câncer e fornecendo

informações sobre as formas de prevenir a doença (ASCO, 2014; ACS, 2014).

No Brasil, nas duas primeiras décadas do século passado, enquanto as

endemias ocupavam a atenção das políticas de saúde, o câncer começava a

despontar nos países desenvolvidos entre as doenças de maior taxa de mortalidade.

Os números ascendentes na Europa e nos Estados Unidos determinariam, em 1920,

no governo Epitácio Pessoa, a inclusão de propostas para uma política anticâncer

na legislação sanitária brasileira. Na prática, o Decreto nº 14.354 em 1920, proposto

por Carlos Chagas, incluía uma rubrica específica para o câncer nos impressos de

óbito distribuídos em inspetorias, delegacias de saúde e farmácias, assim como a

notificação compulsória, no intuito da produção de medidas sanitárias eficientes

(BRASIL, 2006).

Os dados referentes à população do então Distrito Federal subsidiariam o

primeiro plano anticâncer brasileiro, apresentado pelo obstetra Fernando Magalhães

no Primeiro Congresso Nacional dos Práticos, em setembro de 1922, no contexto

das comemorações pelo Centenário da Independência. Bastante abrangente, o

projeto se voltava para os diversos aspectos da prevenção e tratamento da doença

que começavam a ser prática na Europa e, sob o título de “A luta contra o Câncer”

previa a criação de Institutos do Câncer, de caráter estatal, em vários pontos do

país, voltados para a pesquisa científica sobre a doença; a criação de hospitais

públicos exclusivos para cancerosos; a notificação compulsória dos casos de câncer

e a utilização dos princípios de profilaxia geral em todos os locais em que surgissem

25

casos da doença. O projeto incluía também visita de enfermeiras da saúde pública

aos cancerosos para orientá-los no seu tratamento e nas medidas de precaução de

seus familiares; o aperfeiçoamento do ensino do câncer nas faculdades médicas; a

divulgação de noções básicas da doença para a população. Ainda eram organizadas

reuniões médicas regulares em vários estados do Brasil, sob o patrocínio do

governo, para informação das estatísticas e conhecimento das observações e os

conceitos clínicos sobre a doença (TEIXEIRA; FONSECA, 2007).

A década de 30 foi marcada pela construção de um Hospital para tratamento

e estudo do câncer. Em 1937, Getúlio Vargas assina o decreto-lei nº 378 criando o

Centro de Cancerologia, no Serviço de Assistência Hospitalar do Distrito Federal, no

Rio de Janeiro, embrião do Instituto Nacional de Câncer, que seria inaugurado no

ano seguinte pelo próprio Getúlio Vargas e o médico Mario Kroeff, já no período do

Estado Novo. Apesar do avanço, o tratamento do câncer no Brasil só começou a

prosperar com o projeto anticâncer que ganhou caráter nacional em 23 de setembro

de 1941, com a criação do Serviço Nacional de Câncer (SNC), destinado a

organizar, orientar e controlar a campanha de câncer em todo o país, como previa o

Decreto-Lei nº 3.643 em 1941 (BARRETO, 2005).

Com a nova definição de saúde (1943), como o completo bem estar físico,

social e mental, deixando de consistir apenas em ausência de doença, conforme

proposta da então recém-fundada Organização Mundial de Saúde (OMS), com

participação do Brasil, o SNC passaria a usar essa informação como estratégia da

prevenção, para obtenção do diagnóstico precoce da doença. Essa mudança na

forma de definição da saúde permitiu que as políticas de câncer, ganhassem

visibilidade entre a população, e em consequência, entre os legisladores, o que

garantiria o suporte orçamentário adequado para a expansão da campanha

anticâncer no Brasil e a conclusão do hospital-instituto central (INCA), sede do SNC,

no Rio de Janeiro, inaugurado em agosto de 1957 por Juscelino Kubitschek e Ugo

Pinheiro Guimarães (BARRETO, 2005)

O progresso das iniciativas do SNC e, por tabela, do INCA levaria, a partir de

1965, ao planejamento de reuniões anuais de representantes das organizações

vinculadas à campanha anticâncer visando uma política unificada, com bases

sólidas em todo o país, o que culminaria na institucionalização, pelo Decreto nº

61.968, de dezembro de 1967, da Campanha Nacional de Combate ao Câncer. A

interrupção autoritária das políticas anticâncer, que havia colhido consenso entre o

26

público e o privado, fortalecendo o privado em detrimento do público, resultaria, em

1970, na decadência do INCA e na extinção do SNC, transformado pelo Decreto nº

66.623 em Divisão Nacional de Câncer, de caráter técnico-normativo, administrada

de Brasília e vinculada à Secretaria de Assistência Médica (BARRETO, 2005).

A Constituição Federal de 1988 mudaria significativamente a estrutura

sanitária brasileira, destacando-se a caracterização dos serviços e das ações de

saúde como de relevância pública e seu referencial político básico. Esta diretriz seria

regulamentada pela Lei Orgânica da Saúde (nº 8.080), em 1990. Em relação ao

câncer, no conjunto das demandas do SUS, coube papel diferenciado ao INCA,

entendido como agente diretivo na política nacional no controle de câncer no Brasil.

Nesse percurso, o INCA fortaleceu sua presença e seu papel no processo de

consolidação de serviços públicos de saúde de qualidade a toda população

brasileira (TEIXEIRA; FONSECA, 2007).

Paralelamente ao crescimento do poder político do Ministério da Saúde na

implementação das prioridades políticas definidas para o setor da saúde, o INCA foi

também fortalecendo seu papel no interior do Ministério da Saúde (MS),

consolidando-se como referência na definição de políticas de controle do câncer no

país. Essa orientação se amparava no fato de que, apesar dos avanços na área de

assistência ao câncer, as ações de diagnóstico, tratamento e prevenção não

estavam alterando o perfil da mortalidade da doença no País, que continuava a

atingir níveis altíssimos. Em vários estados, o câncer constituía a segunda causa de

morte, superada apenas pelas doenças cardiovasculares (TEIXEIRA; FONSECA,

2007).

Os decretos presidenciais de 1991, 1998 e 2000 reforçariam o papel do INCA

como órgão responsável por assistir o Ministro da Saúde na formulação da Política

Nacional e como agente condutor das ações do Ministério na prestação de serviços

oncológicos, no âmbito do Sistema Único de Saúde. A criação do SUS trouxe,

portanto, desafios para as instituições vinculadas à saúde pública brasileira, quando

precisaram buscar mecanismos que assegurassem a implementação de serviços

públicos de qualidade, nas esferas federal, estaduais e municipais (TEIXEIRA;

FONSECA, 2007).

O INCA foi reconhecido em 2002 como instituição de referência mundial no

controle do câncer. Na publicação Programas nacionais de controle do câncer –

políticas e diretrizes gerenciais, lançada durante o 18º Congresso Internacional de

27

Câncer da UICC – “Union Internationale Contre le Cancer”, realizado em Oslo, a

OMS considerou o Programa de Controle de Câncer do Brasil um dos cinco

melhores das Américas” (BRASIL, 2002).

O câncer é um dos principais problemas que o sistema de saúde brasileiro

enfrenta atualmente, dada a sua distribuição epidemiológica, social e econômica.

Ressalta-se que pelo menos um terço dos casos novos de câncer que ocorre

anualmente no mundo poderia ser prevenido. A prevenção e o controle da doença

são, por esse motivo, prioridades na Agenda da Saúde do Ministério da Saúde (MS).

Nesse contexto, um dos compromissos do Instituto Nacional de Câncer (INCA) com

a saúde da população brasileira é participar ativamente das políticas do Sistema

Único de Saúde (SUS) e colaborar na constituição da rede de cuidados integrais à

saúde. As abordagens orientadas para enfrentamento desse problema de saúde

são, necessariamente, múltiplas, incluindo: ações de educação para saúde em todos

os níveis da sociedade; prevenção orientada para indivíduos e grupos; geração de

opinião pública; apoio e estímulo à formulação de legislação específica para o

enfrentamento de fatores de risco relacionados à doença; e fortalecimento de ações

em escolas e ambientes de trabalho (BRASIL, 2011; BRASIL, 2014).

2.2 Considerações sobre o câncer

O câncer é responsável por mais de 12% de todas as causas de óbito no

mundo, ou seja, mais de 7 milhões de pessoas morrem anualmente da doença.

Como o aumento da expectativa de vida no planeta tem melhorado gradativamente,

a incidência de câncer em 2002 foi de 11 milhões de casos novos, alcançará mais

de 15 milhões em 2020 (UICC, 2005; BRASIL, 2006).

No ano de 2014, a prevalência de câncer no Brasil foi de aproximadamente

576 mil casos novos, incluindo os casos de pele não melanoma, reforçando a

magnitude do problema do câncer no país. O câncer de pele do tipo não melanoma

(182 mil casos novos) será o mais incidente na população brasileira, seguido pelos

tumores de próstata (69 mil), mama feminina (57 mil), cólon e reto (33 mil), pulmão

(27 mil), estômago (20 mil) e colo do útero (15 mil) (BRASIL, 2014).

O câncer não é uma doença nova. Atualmente, câncer é o nome geral dado

ao grupo de mais de 100 doenças, que têm em comum o crescimento desordenado

de células (Figura 1), que tendem a invadir tecidos e órgãos vizinhos (BRASIL,

2012a).

28

Figura 1. Tipos de crescimentos celulares alterados.

Fonte INCA (2012). ABC do câncer: abordagens básicas para o controle do câncer, p. 18. O câncer faz parte de um grupo de doenças que envolve divisão celular

descontrolada, imortalidade replicativa e resistência à morte celular. As células

cancerosas crescem de forma anormal, formando uma massa tumoral, exceto para

cânceres hematológicos, onde as células cancerosas crescem e se espalham ao

longo dos sistemas sanguíneos e linfáticos e a medula óssea (NCI, 2006).

As neoplasias são originadas principalmente por dano ou mutação de proto-

oncogenes que codificam as proteínas envolvidas na indução da proliferação e

diferenciação celular e os genes supressores de tumores que codificam as proteínas

que produzem sinais inibitórios do crescimento celular e / ou estimulam a apoptose.

São necessárias alterações em ambos os genes para o desenvolvimento do tumor e

são favorecidas por mutações em genes de susceptibilidade tumoral, que codificam

uma família de proteínas implicadas no controle do dano ao DNA. As mutações que

iniciam um tumor são clonalmente selecionadas para favorecerem a divisão celular

aberrante e descontrolada, a ausência de inibição do crescimento celular excessivo,

a deficiência do sistema imunológico, o bloqueio da morte celular, a transmissão e o

acúmulo de erros dos materiais genéticos (POLLOCK; MELTZER, 2002; HANAHAN;

WEINBERG, 2011).

Em células normais, o código de proto-oncogenes para as proteínas envia um

sinal para o núcleo para estimular a divisão celular. Estas proteínas de sinalização

agem em uma série de passos chamados sinal ou via de cascata de transdução. Um

sinal se liga a um receptor tirosina-quinase no exterior da célula. Isso ativa a

proteína de membrana (através da adição de grupos fosfato), que por sua vez

ativam proteínas, tais como as cinases, no citoplasma. Várias outras proteínas

podem estar envolvidas na cascata, em última análise, na ativação de um ou mais

29

fatores de transcrição. Os fatores de transcrição ativados entram no núcleo, onde

eles estimulam a expressão dos genes que estão sob o controle do referido fator.

Este é um exemplo da via RAS, o que resulta na divisão celular. Essa cascata inclui

um receptor de membrana para a molécula sinal, proteínas intermediárias que

transportam o sinal através do citoplasma e fatores de transcrição no núcleo que

ativam os genes para a divisão celular. Em cada passo da via, um fator ou proteína

ativa o seguinte; no entanto, alguns fatores podem ativar mais do que uma proteína

na célula (SLINGERLAND; PAGANO, 2000; SA; STACEY, 2004).

A proteína inibidora da Ciclina p27, por exemplo, desempenha um papel

fundamental na regulação da proliferação celular em resposta ao crescimento

extracelular. A RAS tem a capacidade de suprimir níveis p27, durante cada uma das

fases do ciclo celular. Por conseguinte, os níveis de p27 devem permanecer baixos

para permitir a progressão do ciclo celular. O papel vital da p27 no controle do ciclo

celular é suportado pelo fato que a alta expressão da p27 desempenha um papel

importante na formação do tumor (SLINGERLAND; PAGANO, 2000; SA; STACEY,

2004)

Os oncogenes são versões alteradas dos proto-oncogenes que codificam

para estas moléculas sinalizadoras (Figura 2). Os oncogenes ativam continuamente

a cascata de sinalização, resultando num aumento da produção de fatores que

estimulam o crescimento. Por exemplo, o MYC é um proto-oncogene que codifica

um fator de transcrição. A mutação em MYC converte-o em um oncogene

relacionado com setenta por cento dos cânceres. O RAS é outro oncogene que

normalmente funciona como um interruptor "on-off" na cascata de sinais. As

mutações no RAS fazem com que a via de sinalização permaneça em "on", levando

ao descontrole do crescimento celular (PYLAYEVA-GUPTA et al., 2011).

30

Figura 2. Os mecanismos de geração dos oncogenes.

Fonte. Biology 1151. Principles of Biological Science (2012) Os principais tipos de câncer incluem: carcinomas (que se caracterizam por

começarem na pele ou nos tecidos que revestem ou cobrem órgãos internos, como

os subtipos de carcinomas, incluindo adenocarcinoma, carcinoma de células basais,

carcinoma de células escamosas e carcinoma de células transicionais), Sarcomas

(cânceres que começam no osso, cartilagem, gordura, músculo, vasos sanguíneos,

ou outros tecidos conjuntivos ou de suporte), Leucemia (que começa nos tecidos

que formam o sangue, tal como a medula óssea, fazendo com que um grande

número de células anormais, entrem na corrente sanguínea), Linfoma e Mieloma

(que se caracterizam por começarem nas células do sistema imunológico) e

Cânceres do sistema nervoso central (que se caracterizam por começarem nos

tecidos do cérebro e medula espinal) (BALDUCCI, 2003; SIFER-RIERE et al., 2010).

O processo de carcinogênese é altamente complexo, envolve múltiplas

etapas e inúmeros xenobióticos, assim como outros fatores ambientais, podem

interferir positiva ou negativamente (antimutagênese) em cada um dos passos que

levam ao desenvolvimento final da neoplasia. Além disso, os diferentes fatores

ambientais podem interagir, aumentando ou diminuindo o efeito de cada um deles

quando considerado isoladamente. À luz do conhecimento atual, o desenvolvimento

do câncer pode ser visto, esquematicamente, como um processo sequencial com

três etapas (Figura 3), que são iniciação, promoção e progressão do tumor

(GOMES-CARNEIRO et al., 1997).

31

Figura 3: Passo a passo do processo de carcinogênese.

Fonte: INCA (2012). ABC do câncer: abordagens básicas para o controle do câncer, p. 22.

A iniciação é a primeira etapa do processo cancerígeno, na qual, células

normais de um determinado órgão ou tecido são convertidas em células com

potencial para se tornarem tumor (células iniciadas). É uma fase rápida e irreversível

pela ação de agentes cancerígenos que provocam alterações permanentes nos

genes, porém não é possível detectar o tumor clinicamente. A promoção envolve a

expansão clonal das células “iniciadas” e exige a proliferação celular. É

caracterizada por ser uma etapa longa e reversível, não genotóxica, que não

envolve modificações diretas no DNA e que resulta da exposição a doses repetidas

do agente cancerígeno, em intervalos curtos. O estágio final do processo de

carcinogênese, a progressão, envolve a conversão de lesões pré-neoplásicas

benignas em câncer neoplásico. É uma etapa irreversível, na qual as células tornam-

se “imortalizadas”, perdendo, inclusive, a capacidade de reparar qualquer tipo de

dano (KLAUNING; KAMENDULIS, 2008).

2.3 Tratamento atual do câncer

Existem três formas principais de tratamento do câncer: cirurgia, radioterapia

e quimioterapia. Elas são quase sempre usadas em conjunto no tratamento das

neoplasias malignas, variando apenas quanto à importância de cada uma e a ordem

de sua indicação. Atualmente, poucas são as neoplasias malignas tratadas com

apenas uma modalidade terapêutica. Daí, a importância de uma assistência

completa pela integração de serviços oncológicos (de cirurgia, radioterapia e

quimioterapia), entre si e com serviços gerais, em infraestrutura hospitalar, cuja

regulamentação para credenciamento e habilitação foi atualizada pelas portarias

SAS/MS 741/2005, na 361/2007 (complementada pela Portaria SAS 146/2008) e na

32

102/2012 e suas subsequentes. As portarias SAS/MS 741/2005 e 102/2012 foram

revogadas pela SAS/MS 140/2014, que atualizou os critérios, parâmetros e

estabelecimentos habilitados em oncologia e os serviços isolados de radioterapia

autorizados para o atendimento no SUS (BRASIL, 2015).

Desde as primeiras drogas aprovadas pela FDA para o tratamento de câncer

hematológico e tumores sólidos nos anos quarenta e cinquenta (drogas antifolato,

metotrexato, etc.), as drogas de quimioterapia evoluíram para tratamentos cada vez

mais eficazes. Apesar de avanços importantes no tratamento do câncer, tais como

quimioterapias combinatórias e adjuvantes ou da aprovação de importantes

medicamentos anticancerígenos tais como cisplatina e paclitaxel; a destruição

indiscriminada de células e os efeitos tóxicos dos agentes quimioterapêuticos foram

por muitos anos, a única abordagem possível para o tratamento da doença

metastática (BOULIKAS et al., 2007; GOODMAN; WALSH, 2001). O mecanismo

inespecífico dessas drogas mudou com a descoberta das redes de sinalização

celular envolvidas no controle na proliferação e na diferenciação celular. O que

permitiu a concepção de drogas que afetam especificamente essas redes, e abriu a

porta para o uso das terapias-alvo, no final de 1990 (CHABNER; ROBERT JR,

2005).

No tratamento do câncer, a toxicidade do tratamento sistêmico com drogas

quimioterápicas e as complicações graves da terapia com radiação são os dois

fatores mais críticos e limitantes associados com a segurança do paciente. A

cirurgia e a radioterapia são os mais eficazes e valiosos tratamentos para cânceres

localizados e não metastáticos, mas são ineficientes nas metástases. O uso de

antineoplásicos (quimioterapia, hormonal e terapias biológicas) é a escolha atual

para o tratamento de cânceres metastáticos, uma vez que eles são capazes de

atingir todos os órgãos do corpo através da corrente sanguínea. Os fármacos

quimioterápicos se baseiam em compostos tóxicos que inibem a proliferação rápida

das células cancerosas, mas, infelizmente, eles também inibem o crescimento rápido

necessário para a manutenção de folículos pilosos, medula óssea e células do

aparelho gastrointestinal, levando a efeitos secundários indesejáveis observados no

tratamento de câncer. (CHABNER; ROBERT JR, 2005)

A origem da quimioterapia antineoplásica remonta a tempos antigos, ou seja,

às civilizações egípcia e grega a utilização de drogas como quimioterápicos. Tais

drogas eram utilizadas na forma de sais metálicos, como arsênico, cobre e chumbo.

33

Entretanto, os primeiros registros oficiais de tratamento efetivo de tumores através

da utilização de ferramentas farmacológicas deram-se somente no final do século

XIX, com duas importantes descobertas, a primeira chamada solução de Fowler,

desenvolvida por Lissauer em 1865, a partir do arseniato de potássio e a segunda a

toxina de Coley, uma combinação de diferentes produtos bacterianos, em 1890

(BONASSA, 2000).

Sem dúvida, a quantidade de novos agentes quimioterápicos tem aumentado

muito nas três últimas décadas, principalmente no que se refere aos regimes

terapêuticos e diversificação de associações. Isso tem colaborado de forma gradual

no aumento da sobrevida e qualidade de vida dos pacientes dos inúmeros tipos de

câncer. Infelizmente, apesar dos avanços farmacológicos, alguns tratamentos

possuem efeitos colaterais graves como neutropenia, infecções, mucosite oral e

intestinal, náuseas, vômitos, diarreia, alopecia, neuropatias periféricas, pneumonites

intestinais, cardiomiopatias, mielossupressão, cistite hemorrágica, tornando-se

inviáveis ou limitados (RIBEIRO et al., 2008).

Até os anos 80 poucas descobertas geraram impactos no manuseio dos

efeitos adversos desses medicamentos, porque na maioria dos casos não se sabia a

patogênese dessas reações. Porém, nos anos 90, uma descoberta revolucionou o

tratamento com o lançamento no mercado de um antiemético inibidor do receptor 5-

HT3 da serotonina, que é o mais importante mediador envolvido na gênese das

náuseas e vômitos associados à quimioterapia. Logo depois com a melhoria do

suporte hemoterápico e a disponibilidade de fatores de crescimento de granulócitos

e de eritropoietina recombinante também tornaram a imunossupressão muito mais

gerenciável (RAO; FASO, 2012).

Os fármacos utilizados na quimioterapia do câncer segundo Rang e Dale

(2012) são divididos nas seguintes categorias gerais: 1) Agentes citotóxicos

(agentes alquilantes, antimetabólicos, antibióticos citotóxicos e os derivados

vegetais); 2) Hormônios (glicocorticoides, estrogênios e androgênios); 3) Agentes

diversos que não se enquadram nas categorias anteriores (os mais recentes que

atingem alvos tumorais específicos).

Os agentes alquilantes (ciclofosfamida, clorambucila, tiotepa, melfalana,

bussulfano) contêm grupos químicos capazes de formar ligações covalentes com

substâncias neutrofílicas particulares na célula. Formam íon carbônio com seis

34

elétrons na órbita externa, sendo bastante reativos na doação de elétrons. São

bifuncionais, possuindo dois grupos alquilantes (RANG; DALE, 2012).

Os Antimetabólitos (metotrexato, 5-fluorouracil, 6- mercaptopurina, tioguanina,

ARA-C, hidroxiuréia, hexametilmelamina) são os antagonistas do folato, purina e

pirimidina. Os folatos são essenciais para a produção de nucleotídeos de purina e

interferem na síntese do timidilato, que, por sua vez, são indispensáveis para a

síntese de DNA e a divisão celular. O folato é captado pelas células e atua como

coenzima após serem reduzidos a Tetrahidrofolato (FH4). Esse FH4 atua transferindo

unidades de carbono, processo essencial na metilação da uracila, na formação de

DNA e purinas (RANG; DALE, 2012).

O 5-Fluorouracil é um análogo da uracila e interfere na síntese de

desoxitimidina monofosfato (DTMP). Forma um falso nucleotídeo o monofosfato de

Fluorodesoxiuridina (FDUMP) que não pode ser convertido a DTMP pela timidilato-

sintetase. Como resultado, tem-se a inibição da síntese de DNA, mas não interfere

no RNA ou nas proteínas (RANG; DALE, 2012).

O 5-fluorouracil (5-FU) é a droga anticâncer mais frequentemente prescrita

para o tratamento clínico de diversos tipos de câncer, incluindo câncer colorretal

(KEEFE et al., 2007; GRAHAM; CASSIDY, 2012). Esse medicamento pode levar a

mucosite oral e intestinal, atrofia das vilosidades da cripta e necrose como resultado

de danos no tecido da mucosa, devido às células inflamatórias, infiltração, liberação

de citocina pró-inflamatória e edema (SOARES et al., 2013). Observa-se também um

rápido aumento da apoptose de células epiteliais e de captura de células em divisão

nas criptas intestinais, podendo levar a um colapso da barreira epitelial intestinal e

luminal com contínua translocação bacteriana (WU et al., 2011).

O 5-FU induz mucosite oral e intestinal clinicamente relevante porque pode

perturbar a absorção, provocando má absorção de nutrientes, e com isso, gerar

condições desfavoráveis de saúde que podem levar ao fracasso da terapia, quando

associada com diarreia e vômitos (LONGLEY, 2003).

Alguns antibióticos antitumorais (bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina,

epirrubicina, mitomicina, dactinomicina) produzem seus efeitos principalmente

através de ação direta sobre o DNA. Eles ligam-se ao DNA e inibem tanto a síntese

do DNA quanto a do RNA. A bleomicina provoca fragmentação das cadeias de DNA.

A Dactinomicina se intercala no DNA, interferindo na RNA-polimerase e inibindo a

35

transcrição e a mitomicina é ativada produzindo metabólito alquilante (RANG; DALE,

2012).

Os Alcaloides da vinca (vincristina, vimblastina, vindesina) atuam na tubulina

e inibem sua polimerização em microtúbulos, impedindo a formação do fuso mitótico

nas células em divisão, com consequente interrupção da metáfase. Seus efeitos se

tornam evidentes durante a mitose, mas também inibem a fagocitose e a quimiotaxia

dos leucócitos, bem com transporte axonal. Podem causar atividade

mielossupressora discreta, parestesias, fraqueza muscular e leucopenia. (RANG;

DALE, 2012)

A cisplatina (derivado da platina) é um complexo de coordenação planar

hidrossolúvel, que contém um átomo central de platina circundado por dois átomos

de cloro e dois grupos de amônia. Tem ação análoga aos agentes alquilantes. A

cisplatina é administrada em dose única, sendo extremamente nefrotóxica e provoca

náuseas, vômitos intensos e perda da audição na faixa de alta frequência, porém

apresenta baixa mielotoxicidade. Muito usada no tratamento de tumores sólidos nas

gônadas (ovários e testículos). A Carboplatina possui a mesma ação da cisplatina,

porém com menor efeito colateral (RANG; DALE, 2012).

Os Taxanos (paclitaxel, taxotere) atuam sobre os microtúbulos, estabilizando-

os no estado polimerizado. Eles agem na mesma etapa, mitose, mas a ação não é

semelhante. Os alcalóides impedem a polimerização e os taxanos, a

despolimerização da e -tubulina. São usados no câncer de mama e de ovário e

possuem efeitos adversos graves como supressão da medula óssea e

neurotoxicidade cumulativa. Pode causar edema de membros inferiores e

hipersensibilidade, sendo necessário pré-tratamento com corticosteroides e anti-

histamínicos (RANG; DALE, 2012).

Os agentes antagonistas hormonais são eficazes em vários tumores sensíveis

a hormônios. Os Antiestrógenos (Tamoxifeno, etc.) são eficazes em cânceres de

mama hormônio-dependente e prevenção desses. Possuem ação cardioprotetora

também, pois protege as lipoproteínas de baixa densidade contra a lesão oxidativa.

Os Antiandrógenos (Flutamida e Ciproterona) são usados contra tumores de

próstata. Os inibidores da síntese de hormônios adrenais (Formestano) atuam na

enzima aromatase que metaboliza os andrógenos em estrógenos (RANG; DALE,

2012).

36

2.4 Efeitos colaterais do tratamento do câncer Erickson et al., (2013) realizaram uma revisão de literatura sobre os sintomas

apresentados por pacientes submetidos ao tratamento do câncer. Foram

identificados 51 estudos que forneceram evidências sobre problemas alimentares

como mucosite oral e intestinal, náuseas, problemas de fadiga, insônia, neuropatia

periférica e dor.

A importância de tratar adequadamente os sintomas relacionados com o

câncer está ganhando mais atenção, mas, no geral, muitos sintomas permanecem

subdiagnosticados e subtratados. Fadiga, insônia, neuropatia, dor e mucosite oral

estão entre os problemas mais comuns experimentados por pacientes acometidos

por neoplasias malignas (PACHMAN et al., 2012).

2.4.1 Mucosite Oral Uma variedade de escalas de avaliação existe para a medição da mucosite

oral. Duas das escalas mais comumente utilizadas são a da OMS e do Instituto

Nacional do Câncer (INC), escala de Critérios de Terminologia Comuns para

Eventos Adversos (CTCEA). A Escala OMS para mucosite oral: Grau 0 = Sem

mucosite oral; Grau 1 = eritema e sensibilidade dolorosa; Grau 2 = úlceras, capaz de

comer sólidos; Grau 3 = úlceras, requer dieta líquida (devido à mucosite) e Grau 4 =

úlceras, impossível a ingestão de alimentos (devido à mucosite). Na escala de

critérios de terminologias comuns para eventos adversos (CTCEA) - Versão 4.0:

Grau 1 = sintomas leves ou assintomáticos, intervenção não indicada; Grau 2 = dor

moderada, não interfere na ingestão por via oral, dieta modificada é indicada; Grau 3

= dor severa, interfere na ingestão oral; Grau 4 = consequências com risco de vida;

indicação de intervenção urgente e Grau 5 = Morte (PETERSON et al., 2011).

A boca é um local frequente de complicações decorrentes da quimioterapia ou

da radioterapia, sendo comum o aparecimento de mucosite, xerostomia,

osteorradionecrose e infecções locais. Do ponto de vista da limitação de dose, das

quebras de tratamento, qualidade de vida e os resultados econômicos de saúde, a

mucosite é a toxicidade oral aguda mais significativa. A xerostomia, um efeito

colateral crônico de radiação que envolve o tecido da glândula salivar, resulta em

alterações do paladar, da resiliência do tecido e um risco aumentado de cárie e

doença periodontal. Embora a incidência de osteorradionecrose tenha diminuindo, a

cronicidade e sintomas desta condição óssea purulenta são especialmente difíceis

para os pacientes. Infecções orais locais resultantes da proliferação de organismos

37

oportunistas ou a ativação de vírus latentes são tão comuns e justificam uma

abordagem profilática em muitos casos (SONIS; FEY, 2002; SCULLY; SONIS,

2006).

Os sinais e sintomas mais precoces da mucosite oral incluem eritema e

edema, sensação de queimação e aumento da sensibilidade a alimentos quentes e

condimentados. As áreas eritematosas podem desenvolver placas brancas elevadas

descamativas que, posteriormente, transformam-se em úlceras dolorosas. Tais

úlceras tendem a promover infecções secundárias, além de impossibilitar a nutrição

e a ingestão de fluidos, o que resulta em má nutrição e desidratação e,

consequentemente, interfere na regeneração da mucosa. A mucosa não

queratinizada do palato mole, das bochechas e dos lábios, a superfície ventral da

língua e o assoalho oral são mais vulneráveis à estomatotoxicidade direta, enquanto

a gengiva, o dorso da língua e o palato duro são mais raramente afetados,

provavelmente em virtude de sua menor renovação celular. Habitualmente, as

lesões bucais desaparecem sem deixar cicatrizes, exceto quando a mucosite é

complicada por infecção grave ou xerostomia (SANTOS; MAGALHÃES, 2006;

ARAÚJO et al., 2015).

Mucosite oral (MO) é o termo clínico usado para descrever as alterações

provocadas pela quimioterapia e radioterapia antineoplásicas sobre a mucosa oral.

Esta síndrome, dependendo da gravidade, caracteriza-se por eritema e ulceração,

podendo resultar em dor e disfagia, comprometendo a nutrição e a higiene oral.

(SONIS et al., 2004a)

A mucosite oral é um lado doloroso e muitas vezes debilitante da

quimioterapia e pode afetar substancialmente a ingestão nutricional, as funções

diárias e a qualidade de vida. Aproximadamente 20% a 40% dos doentes que

recebem agentes citotóxicos para tratamento de neoplasias, desenvolvem

complicações bucais. Estas complicações orais podem resultar no aumento de

infecções, atrasos ou interrupções no tratamento e reduções da dose que podem

interferir na remissão da doença e na sobrevivência. Os custos do tratamento

aumentam em proporção a gravidade da mucosite oral (SONIS, 2004b; SONIS,

2011; HORII et al., 2014).

Em todos os locais de tumor, a quimioterapia com 5-Fluorouracil (5-FU),

Capecitabina ou Tegafur conduz a uma taxa alta (20-50%) de mucosite do trato

digestivo. A quimioterapia com metotrexato e outros antimetabólitos conduzem a

38

uma taxa de 20-60% da mucosite do trato alimentar de acordo com a dose da droga

por ciclo (PETERSON et al., 2011).

2.5 Tratamento da mucosite oral As intervenções clínicas para mucosite oral são divididas em duas

abordagens: a prevenção ou o tratamento da mucosite oral, estabelecidas de acordo

com as diretrizes do Grupo da Associação Multinacional de Cuidados de suporte em

Câncer / Sociedade Internacional de Oncologia Oral (AMCSC / SIOO), várias

recomendações são fornecidas para o tratamento da mucosite relacionadas com a

quimioterapia. Muitos destes tratamentos são intervenções para o controle da dor

associada, mas existem poucas intervenções para promover diretamente a cura da

mucosite oral (NICOLATOU-GALITIS et al., 2013; MCGUIRE et al., 2013).

Cerca de 5 a 15% dos pacientes podem ser acometidos por mucosite mais

grave (graus 3 e 4). Destes, 35% sofrerão um atraso nos ciclos subsequentes de

quimioterapia, 60% irão requerer redução nas doses aplicadas e 30%, a

descontinuação do regime de tratamento. Em geral, 60% apresentam febre e

requerem hospitalização. A mucosite oral grave também pode exigir interrupção

parcial ou completa de tratamento antineoplásico, como radioterapia, antes do

regime planejado ser completado, aumentando o risco de proliferação das células

tumorais e dificultando o controle do câncer (RIBEIRO et al., 2008; SCHIRMER et

al., 2012).

A mucosite induzida por quimioterapia e/ou radioterapia é resultado de uma

sequência de eventos biológicos interligados que podem ser divididos em cinco

fases: iniciação, resposta primária ao dano, amplificação do sinal, ulceração e,

finalmente, cicatrização. A Figura 4 resume os mecanismos e mediadores envolvidos

na patogênese da mucosite oral. A manifestação de todos os estágios não ocorre

obrigatoriamente em todos os casos. Portanto, em uma mucosite branda com

poucos danos à mucosa, a rápida recuperação e proliferação epitelial evita a

ocorrência da fase ulcerativa, que é a mais sintomática (RIBEIRO et al., 2008).

39

Figura 4. As cinco fases de desenvolvimento da mucosite oral.

Fonte. Sonis (2004a).

Na fase I, denominada de Iniciação da lesão do tecido, na qual radiação e / ou

quimioterapia induzem dano celular resultando na morte das células epiteliais

basais. Acredita-se que a geração de espécies de oxigênio reativo (radicais livres)

por radiação ou quimioterapia exerce uma função na iniciação da lesão da mucosa.

Estas pequenas moléculas altamente reativas são subprodutos do metabolismo do

oxigênio e podem causar dano celular significativo. Na fase II, denominada de super-

regulação da inflamação, através da geração de sinais de mensagens, além de

causar a morte celular direta, radicais livres ativam os segundos mensageiros que

transmitem sinais a partir de receptores na superfície celular para o interior. Isto leva

a regulação positiva de citocinas pró-inflamatórias, lesão de tecido e a morte celular.

Na fase III, denominada de sinalização e amplificação, ocorre a regulação de

citocinas pró-inflamatórias, tais como o Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α),

produzida principalmente por macrófagos, que causam lesões nas células da

mucosa e também ativa as vias moleculares que amplificam a lesão. Na fase IV,

denominada de ulceração e inflamação, forma-se um infiltrado inflamatório

significativo associado às ulcerações das mucosas, com base nos subprodutos

metabólicos da colonização da microflora oral. Produção de citocinas pró-

inflamatórias é também mais regulada devido a esta infecção secundária. Na fase V,

denominada de cura, ocorre proliferação epitelial, bem como diferenciações

celulares e de tecidos, restaurando a integridade do epitélio (SONIS, 2000; LALLA et

al., 2008).

40

O grau, o local da boca e a extensão da mucosite oral vão depender de

fatores como idade (os idosos são mais acometidos), sexo (prevalente nas

mulheres), doenças sistêmicas associadas (Diabetes melito aumenta a ocorrência) e

cor da pele (mais comum em cútis branca), assim como fatores específicos (por

exemplo, tipos epiteliais, ambiente microbiana local e função). Os efeitos da idade e

do sexo no desenvolvimento da mucosite oral não são claros (LALLA et al., 2008).

Apesar de não haver provas suficientes que cuidados dentários profissionais

possam reduzir a gravidade da mucosite oral, é prudente entender que pacientes

que estão se submetendo ao tratamento do câncer, tornem-se significativamente

imunossuprimidos. Por isso, potenciais traumatismos podem conduzir a lesões da

mucosa e como base do tratamento, a remoção do áspero, irregular ou superfícies

quebradas de dentes e de próteses devem ser realizadas (MCGUIRE et al., 2013).

Não foi comprovado que bochechos isolados com solução fisiológica ou

bicarbonato de sódio podem ser eficazes na prevenção da mucosite oral. Apesar

disso, esses tratamentos são amplamente utilizados em ambientes clínicos e os

autores reconhecem que essas soluções podem ser inofensivas e úteis para a

manutenção da higiene oral e o conforto do paciente. No entanto, o bicarbonato de

sódio pode não ser tão útil em crianças, pelo paladar desagradável. Nesse caso,

uma solução salina normal, anestésicos tópicos e carinho dos pais seriam mais

apropriados (MADAN et al., 2008; BHATT et al., 2010; MCGUIRE et al., 2013).

A clorexidina não é indicada para tratamento da mucosite. No entanto, é

importante notar que, apesar desse medicamento não ser indicado para a prevenção

de mucosite, pode haver, outras indicações, tais como o tratamento da gengivite,

controle de placa, etc. (ANTUNES et al., 2010). Outros agentes tópicos como o

Gelclair®, Caphasol® e Biotene®, têm indicação limitada com evidências

conflitantes. No entanto, esses agentes parecem exercer um perfil de segurança e

eficiência, podendo ser benéficos para alguns pacientes (PETERSON et al., 2011).

A Crioterapia oral é a aplicação de cubos de gelo ou água gelada na boca

para evitar a mucosite oral induzida por quimioterapia. Orienta-se que os pacientes

chupem pedaços de gelo antes, durante e após as infusões de drogas mucotóxicas.

Entende-se que o gelo pode induzir a contração dos vasos sanguíneos das

membranas da cavidade oral, portanto diminuindo a exposição da mucosa oral aos

agentes citotóxicos. Esse procedimento simples e fácil é um método que previne

mucosite oral para a terapia com base em 5-FU, e parece ter implicações para

41

outros regimes de quimioterapia, bem como, metotrexato e melfalano. De acordo

com um relatório da Diretrizes do Grupo de Trabalho em Mucosite Oral (ESMO), a

crioterapia oral por 30 minutos é recomendada para prevenção da MO em pacientes

que receberam quimioterapia com 5- FU ou edatrexato. A crioterapia oral, devido à

sua facilidade de aplicação, tolerabilidade e ausência de efeitos colaterais, torna-se

um recurso importante para a redução da incidência e da gravidade da mucosite oral

(HARRIS et al., 2008; HEYDARI et al., 2012; KANUGA, 2013).

O uso de amifostina, glutamina, fator estimulante de colônias granulócitos,

mel, laser, pastilhas ou pasta de polimixina / tobramicina / anfotericina e sucralfato

podem ser benéficos na prevenção da mucosite em pacientes com câncer que estão

recebendo tratamento. Existe evidência clínica de que o sucralfato reduz a gravidade

da mucosite (KANUGA, 2013).

As soluções de Mugard®, Caphosol® e Episil® são preconizadas para o

tratamento da mucosite oral por alguns autores, como no caso de Tiberg e Linden

(2014). Porém outros autores afirmam que o uso de tais soluções não traz nenhum

benefício efetivo na melhoria da mucosite, disfagia e dor quando comparados ao

tratamento padrão preconizado por eles (PETTIT et al., 2014).

A Terapia a laser de hélio-neon que usa laser de baixa intensidade é indicada

como um pré-tratamento para reduzir a gravidade da mucosite em pacientes

submetidos à quimioterapia. O laser age estimulando a atividade celular, conduzindo

à liberação de fatores de crescimento por macrófagos, proliferação de

queratinócitos, aumento da população de granulócitos e de mastócitos e

angiogênese. Esses efeitos podem levar a uma aceleração no processo de

cicatrização de feridas devido, em parte, à redução na duração da inflamação

aguda, resultando numa reparação mais rápida. Seus efeitos são a prevenção e o

tratamento da mucosite de várias origens, sendo capaz de reduzir a gravidade e a

duração da mucosite oral, além de promover redução da dor e melhora na ingestão

de líquidos e sólidos. No entanto, uma vez que este tipo de tratamento requer

equipamento caro e operadores especializados, a sua utilização é restrita a um

número limitado de pacientes (KELNER; CASTRO, 2007; MIGLIORATI et al., 2013;

CAMPOS et al., 2014).

A palifermina, Fator de Crescimento de Queratinócitos (FCQ), parece

estimular células epiteliais à proliferação e diferenciação na boca e trato

gastrointestinal. O FCQ endógeno é produzido pelas células endoteliais do tecido

42

submucoso e funciona como um fator trófico para manutenção da integridade da

camada epitelial por estimular o reparo de feridas durante a cicatrização. O FCQ

estimula as células basais a proliferarem e os queratinócitos a se diferenciarem e a

migrarem, favorecendo a cicatrização. No entanto, o benefício fornecido pela

utilização profilática deste fármaco necessita de uma verificação, uma vez que

atualmente os dados da literatura não são suficientes para utilização em larga

escala. Outras razões que limitam a aplicabilidade da palifermina para prevenção da

mucosite oral é o seu custo elevado e os riscos de efeitos colaterais (RIBEIRO et al.,

2008; CAMPOS et al., 2014; LI; TROVATO, 2012; PATEL et al., 2014).

A benzidamina é uma solução oral de enxague com propriedades analgésica,

anestésica, anti-inflamatória, e antimicrobiana. A capacidade da benzidamina como

um agente de prevenção da mucosite oral rádio e quimioinduzidas tem sido

estudada em alguns estudos duplo-cego e randomizados realizados nas últimas

décadas. Nesses estudos, a benzidamina melhorou a taxa de úlcera e reduziu a

incidência de ulceração e eritema (KAZEMIAN et al., 2009; RODRÍGUEZ-

CABALLERO et al., 2012).

O alívio sintomático dos pacientes com mucosite leve a moderada pode ser

conseguido por cloridrato de benzidamina. Quando é mais grave, um enxaguatório

oral de lidocaína 2% é de grande valor e bochechos de aspirina-mucaína antes das

refeições podem ajudar a combater disfagia. A prostaglandina também demonstrou

aliviar o quadro (SHAW et al., 2000).

A pentoxifilina é um derivado sintético da dimetilxantina, que é quimicamente

semelhante à teofilina e a cafeína, mas em contraste com estas drogas, a

pentoxifilina tem efeitos hematológicos que são úteis no tratamento sintomático de

complicações de doenças vasculares periféricas. A pentoxifilina é um medicamento

que age de diferentes maneiras: Ela relaxa as paredes dos vasos sanguíneos

tornando mais fácil a passagem de sangue; aumenta a quantidade de sangue que

atinge os tecidos; paralisa a agregação de plaquetas, uma vez que aumenta a

formação de prostaciclina e reduz a viscosidade do sangue. Porém os resultados de

ensaios clínicos randomizados são controversos para prevenir mucosite oral

induzida por quimioterapia e não mostram nenhum benefício para o paciente

(RODRÍGUEZ-CABALLERO et al., 2012; LIMA et al., 2015).

Estudos recentes verificaram que a glutamina tem um efeito importante em

pacientes tratados de câncer, já que a demanda metabólica desse aminoácido,

43

excede a capacidade de síntese orgânica. A glutamina tem funções bem definidas

nos processos biológicos humanos. A glutamina, um precursor de glutationa,

desempenha um papel central na regulação do potencial redox intracelular e

investigações clínicas indicam que a glutamina inibe os outros mediadores nas

lesões na mucosa, reduzindo a produção de citocinas pró-inflamatórias e citocinas

relacionadas a apoptose. O uso da glutamina previne os efeitos deletérios das

terapias anticâncer, sobre a mucosa oral evitando-se assim, a estomatite, mucosite

ou colo-enterite. A glutamina oral foi testada e se mostrou eficiente para tratar a

mucosite em radioterapia, como também em pacientes de quimioterapia ou em

terapias concomitantes (NOE, 2009; RODRÍGUEZ-CABALLERO et al., 2012).

Alguns fitoterápicos têm sido utilizados no tratamento, como é o caso do gel

de Aloe vera L. Alguns pacientes frequentemente usam gel tópico de Aloe vera L.

para prevenir dermatite de contato por radiação e para o controle da esofagite (YAGI

et al., 2003). Embora o mecanismo de ação não esteja bem estabelecido, existe a

hipótese de que o gel iniba a cicloxigenase por ter propriedades anti-inflamatórias.

Em um estudo duplo-cego randomizado (SU et al., 2004) realizado para determinar

se Aloe vera L. pode reduzir a incidência, gravidade e duração da mucosite induzida

por radiação em pacientes com câncer de cabeça e pescoço na Universidade de

Stanford, não foi encontrado resultado estatisticamente significante quanto à adição

de Aloe vera L. ao padrão de cuidado oral no tratamento da mucosite induzida por

radiação, ou seja, Aloe vera L. não reduziu a perda de peso nos pacientes, não

diminuiu o uso de medicamentos para a dor e a probabilidade de interrupções de

tratamento ou episódios de desidratação.

Os colutórios do óleo essencial de Leptospermum scoparium e o de Kunzea

ericoides, possuem efeitos satisfatórios na cicatrização de mucosites orais

(MADDOCKS-JENNINGS et al., 2009; RODRÍGUEZ-CABALLERO et al., 2012). Os

óleos essenciais extraídos de plantas são um tratamento alternativo para a mucosite

oral, como Pistacia atlântica L. que acelerou a cicatrização de lesões de mucosite

oral em hamsters (TANIDEH et al., 2016). O extrato hidroalcoólico de Carum carvi L.

foi testado em mucosite oral em hamsters e apresentou resultados satisfatórios na

aceleração da cicatrização (MARDANI et al., 2016).

Enfim, algumas destas intervenções, têm-se obtido algum sucesso e estes

incluem excelente higiene oral, crioterapia oral utilizando gelo, a exposição ao laser

de baixa potência e administração sistêmica de fator de crescimento de

44

queratinócitos. Cada uma destas abordagens tem suas limitações e enquanto não

se descobre nada mais eficiente, os cuidados de suporte para mucosite ainda são

majoritariamente paliativos (SONIS, 2009; RABER-DURLACHER, 2010).

2.6 Modelos animais de mucosite oral Os animais utilizados em estudos pré-clínicos de mucosite incluem ratos,

hamsters, camundongos e coelhos (Figura 5). A mucosite é gerada por radiação ou

drogas quimioterápicas, que replicam o tratamento do câncer em pacientes (Tabela

1). Ao longo dos anos, o modelo de radiação tem sido refinado. Além disso, o

modelo de radiação evoluiu para incluir a quimioterapia, a qual simula tratamento

com drogas para pacientes com câncer (ALVAREZ et al., 2003).

Tabela 1. Métodos para estabelecimento de modelos animais de mucosite oral.

Tipo de Modelo de

Mucosite Oral

Espécie

Usada

Mecanismo Técnica descrita por

Radiação Hamster sírio

dourado

Camundongo

Radiação na bolsa da

bochecha em dose única ou

fracionada

Radiação da língua em dose

única ou fracionada

Hwang et al., 2005

Dorr et al., 1990

Quimioterapia Hamster sírio

dourado

Camundongo

Rato

Coelho

Injeção de 5-FU e lesão da

mucosa oral

Injeção de 5-FU

Injeção de 5-FU e lesão da

mucosa oral

Injeção de sulfato de

cisplatina e lesão da mucosa

com ácido acético

Sonis et al., 1990

Farrell et al., 1998

Vilela-Goulart et al., 2008

Fujisawa et al., 2003

Quimioradiação Hamster sírio

dourado

Camundongo

Radiação com injeção de 5-

FU ou cisplatina

Radiação com injeção de 5-

FU e/ou cisplatina

Alvarez et al., 2003

Dorr et al., 2005

Quimioradiação e

xenoenxerto de câncer

Camundongo Inoculação com câncer e

quimioradiação.

Brake et al., 2008

Sialoadenectomia Coelho Sialoadenectomia e lesão da

mucosa com ácido acético

Fujisawa et al., 2003

Fonte. Viet et al. (2014). Review of Preclinical Studies on Treatment of Mucositis and Associated.

Os ratos também têm sido amplamente utilizados em estudos que investigam

patobiologia da mucosite e tratamento. Além disso, há estudos que foram projetados

para determinar os métodos não invasivos para a detecção de mucosites. Um dos

modelos mais amplament

quimioterapia é o que emprega a utilização de ratas fêmea

Este modelo mostrou o desenvolvimento de mucosite oral de forma semelhante ao

que ocorre em seres humanos. Este modelo tem

ratas portadoras de tumores podem ser estudadas, bem como as lesões da mucosa

oral. Vários agentes quimioterápicos

modelo incluindo irinotecano, metotrexato e 5

Figura 5. Os métodos de estabelecimento de modelos prétratamentos testados.

Fonte. Viet et al. (2014). Review of Preclinical Studies on

No estudo de Vilela

ratos Wistar foram realizadas através da administração do quimioterápico 5

Fluorouracil (dose de 20 mg/Kg), via injeção intraperitoneal, nos dias 0, 2 e 4 de

experimento. No segundo dia, as mucosas jugais direitas dos ani

injuriadas quimicamente com 10 µl de ácido acético a 50%, embebido em papel de

filtro de 9 mm2 por 60 segundos, sob anestesia geral, via intraperitoneal. Os animais

Os ratos também têm sido amplamente utilizados em estudos que investigam

patobiologia da mucosite e tratamento. Além disso, há estudos que foram projetados

para determinar os métodos não invasivos para a detecção de mucosites. Um dos

modelos mais amplamente utilizados para investigar mucosite induzida por

quimioterapia é o que emprega a utilização de ratas fêmea da espécie

strou o desenvolvimento de mucosite oral de forma semelhante ao

que ocorre em seres humanos. Este modelo tem a vantagem adicional de que as

ratas portadoras de tumores podem ser estudadas, bem como as lesões da mucosa

oral. Vários agentes quimioterápicos citotóxicos têm sido investigados com este

modelo incluindo irinotecano, metotrexato e 5-FU (LOGAN et al., 200

Figura 5. Os métodos de estabelecimento de modelos pré-clínicos de mucosite e

Review of Preclinical Studies on Treatment of Mucositis and Associated.

No estudo de Vilela-Goulart et al., (2008), as induções de mucosite

ratos Wistar foram realizadas através da administração do quimioterápico 5

Fluorouracil (dose de 20 mg/Kg), via injeção intraperitoneal, nos dias 0, 2 e 4 de

No segundo dia, as mucosas jugais direitas dos ani

injuriadas quimicamente com 10 µl de ácido acético a 50%, embebido em papel de

por 60 segundos, sob anestesia geral, via intraperitoneal. Os animais

45

Os ratos também têm sido amplamente utilizados em estudos que investigam

patobiologia da mucosite e tratamento. Além disso, há estudos que foram projetados

para determinar os métodos não invasivos para a detecção de mucosites. Um dos

e utilizados para investigar mucosite induzida por

da espécie Dark agouti.

strou o desenvolvimento de mucosite oral de forma semelhante ao

a vantagem adicional de que as

ratas portadoras de tumores podem ser estudadas, bem como as lesões da mucosa

têm sido investigados com este

et al., 2007).

clínicos de mucosite e

Treatment of Mucositis and Associated.

, as induções de mucosite oral nos

ratos Wistar foram realizadas através da administração do quimioterápico 5-

Fluorouracil (dose de 20 mg/Kg), via injeção intraperitoneal, nos dias 0, 2 e 4 de

No segundo dia, as mucosas jugais direitas dos animais foram

injuriadas quimicamente com 10 µl de ácido acético a 50%, embebido em papel de

por 60 segundos, sob anestesia geral, via intraperitoneal. Os animais

46

foram tratados e submetidos à eutanásia nos dias sete e 14 após a injúria com ácido

acético.

O Hamster Sírio Dourado foi o primeiro animal modelo a ser investigado para

indução de mucosite utilizando o 5-fluorouracil. Avaliações clínicas e histológicas

indicam que as mudanças que ocorrem nas mucosas são semelhantes à de seres

humanos com mucosite. Em adição, as induções por mielossupressão também são

experimentadas por esses animais. Estudos com esse modelo ou com variações

desse têm sido usados para se investigar vários aspectos da mucosite como

patobiologia e tratamento, bem como mucotoxicidade e citotoxicidade de

medicações. A seleção desses animais se deu pelo grande volume de mucosa jugal

e a capacidade desses para tolerar dosagens produtoras de mucosite de 5-FU sem

mortalidade significativa (SONIS et al., 1990; LOGAN et al., 2007).

O Camundongo representa outra espécie utilizada como modelo para

investigar os aspectos da mucosite oral. Mais uma vez a diversidade de estudos é

ampla e abrange investigação para o tratamento de mucosite e patobiologia.

Modelos murinos foram usados para testar as estratégias de tratamento

relacionadas com a toxicidade associada a drogas específicas. A administração de

doxorrubicina tem sido descrita para causar apoptose no epitélio intestinal em ratos,

resultando em toxicidade gastrintestinal. Morelli et al., (1996) investigou o efeito de

aplicações tópicas e sistêmicas de um anticorpo monoclonal anti-doxorrubicina para

o tratamento e prevenção de mucosite oral. Eles observaram sinais reduzidos de

toxicidade gastrointestinal em camundongos após a administração oral do anticorpo

anti-doxorrubicina. Na mucosa oral dos camundongos, a apoptose epitelial foi

eliminada pela aplicação tópica do anticorpo anti-doxorrubicina. As primeiras

investigações usando modelos murinos de quimioterapia para induzir lesão de

mucosite, onde o fator de crescimento de queratinócitos foi administrado antes da

quimioterapia, utilizando 5-FU ou metotrexato, demonstrou que a sobrevivência foi

melhorada, bem como parâmetros histológicos no intestino delgado, tais como o

aumento da altura das vilosidades e aprofundamento das criptas (LOGAN et al.,

2007).

Os coelhos são menos usados como modelo de mucosite oral, por possuírem

um porte bem maior que os três anteriores. O fator de crescimento epidermal (FCE)

foi usado num modelo de mucosite oral em coelhos, induzida por sialoadenectomia e

lesão da mucosa com ácido acético. Neste estudo, os autores injetaram FCE

47

sistemicamente após o desenvolvimento das lesões de mucosite. Eles mostraram

que FCE sistêmico acelera a cura da mucosa. No entanto, a aplicação tópica FCE

não foi significativamente para acelerar a cicatrização das feridas (FUJISAWA et al.,

2003; VIET et al., 2014).

No futuro, muitas moléculas novas podem chegar, tendo como alvos

mediadores pró-inflamatórios de sinalização e fases de amplificação, como citocinas

e fator de transcrição da mucosite oral. Vários modelos animais estarão disponíveis

para o teste com drogas para tratamento da mucosite oral. A indução da doença no

animal não é tão fácil por causa da toxicidade associada com quimioterapia e

radiação. Muitas vezes tem sido observado que o animal pode sofrer morbidade

e/ou mortalidade após a administração de agentes quimioterápicos e radiação

(PATEL et al., 2014).

2.7 O Borneol Com base na sua estrutura e na origem biossintética, os produtos vegetais

podem ser classificados em diferentes grupos, tais como os terpenos, alcaloides e

compostos fenólicos (CROTEAU et al., 2000). Os Monoterpenos, pertencentes a um

grupo grande e diverso de compostos químicos chamados "terpenos," representam

um grupo de compostos orgânicos de ocorrência natural cuja estrutura básica

consiste em duas unidades de isopreno, que são formados por uma base de cinco

carbonos (C5) cada. Elas são as mais representativas moléculas que constituem

90% dos óleos essenciais e têm uma grande variedade de estruturas, com várias

propriedades farmacológicas, incluindo cardiovascular, antioxidante, anti-inflamatória

e analgésica (GUIMARÃES, 2013; ALMEIDA et al, 2013)

O Borneol (C10H18O) é um álcool monoterpenóide bicíclico (Figura 6), um dos

materiais médicos valiosos, especiaria aromática e material químico superior, tem

sido usado em alimentos e também na medicina popular da China e Índia. Este

composto é geralmente considerado como seguro, aprovado pela FDA como

tempero. Além disso, o borneol é utilizado como fragrância em cosméticos

decorativos, perfumes finos, xampus, sabonetes e outros produtos de higiene

pessoal, bem como em produtos não cosméticos tais como, produtos de limpeza e

detergentes. Seu uso em todo o mundo está em torno de 10-100 toneladas por ano

(CHEN, 2011; ALMEIDA et al., 2013).

Figura 6. Estruturas do Borneol e Isoborneol.

Existem dois tipos diferentes de borneol, o borneol sintético que é uma

mistura de DL-borneol e isoborneol, em que o teor de

55 %, e o borneol natural, cujo principal componente é

de 95 % de borneol natural (Figura 7). Estudos anteriores mostraram que borneol

sintético é degradado lentamente durante o armazenamento, formando cânfora e

diminuindo o teor inicial de borneol sintético (SILVA

Figura 7. Isômeros D e L do borneol.

De acordo com a Farmacopeia da República Popular da China, o borneol, é

um ingrediente importante em cerca de 63 produtos de ervas (PPRC, 2005). É

encontrado em algumas plantas como

Rosmarinus officinalis

pectinatus Fisch (Tomilho),

(HORVÁTHOVÁ et al., 2009).

Figura 6. Estruturas do Borneol e Isoborneol.

Existem dois tipos diferentes de borneol, o borneol sintético que é uma

borneol e isoborneol, em que o teor de DL-borneol deve ser inferior a

55 %, e o borneol natural, cujo principal componente é D-borneol, o qual possui mais

de 95 % de borneol natural (Figura 7). Estudos anteriores mostraram que borneol

o lentamente durante o armazenamento, formando cânfora e

diminuindo o teor inicial de borneol sintético (SILVA-FILHO et. al., 2012

Isômeros D e L do borneol.

De acordo com a Farmacopeia da República Popular da China, o borneol, é

um ingrediente importante em cerca de 63 produtos de ervas (PPRC, 2005). É

encontrado em algumas plantas como Eucalyptus globulus

Linn (Alecrim), Salvia officinalis Linn

(Tomilho), Dryobalanops aromatica Gaertn. F. (Cânfora

2009).

48

Existem dois tipos diferentes de borneol, o borneol sintético que é uma

borneol deve ser inferior a

borneol, o qual possui mais

de 95 % de borneol natural (Figura 7). Estudos anteriores mostraram que borneol

o lentamente durante o armazenamento, formando cânfora e

et. al., 2012).

De acordo com a Farmacopeia da República Popular da China, o borneol, é

um ingrediente importante em cerca de 63 produtos de ervas (PPRC, 2005). É

Labhll (Eucalipto),

Linn (Sálvia), Thymus

. (Cânfora-de-bornéu)

49

Outra evidência mostrou que Borneol tem a capacidade de soltar as junções

apertadas intercelulares na barreira hematoencefálica, acelerar o transporte de

substâncias através da passagem intercelular, aumentar o número e o volume de

vesículas de pinocitose das células da barreira hematoencefálica, e assim, acelerar

o transporte de substâncias por meio da pinocitose nas células do cérebro (YANG et

al., 2009). Por estas razões, o borneol se tornou um ingrediente importante em

muitas receitas da medicina tradicional chinesa e em fórmulas de incenso japonês

com elevados efeitos sobre o cérebro (KOMIYA et al., 2006).

Mostrou-se como anti-inflamatório, antioxidante e com efeitos de proteção

das células, diminuindo a expressão da iNOS e na liberação de fatores inflamatório,

bem como, a translocação de NF-kB e caspase relacionada a apoptose em modelo

neuronal de isquemia / reperfusão. Promove cicatrização de feridas e é usado para

úlceras e edema (CPC, 2010; MEYER-HAMME et al., 2013). Além disso, diversas

publicações têm mostrado que o borneol aumenta a penetração de drogas através

da pele e da córnea (CUI et al., 2011; QI et al., 2013).

É usado externamente em feridas na pele, ulcerações e queimaduras, de

ação sedativa, anti-inflamatória, analgésica, anti-nociceptiva e vasorrelaxante

(SILVA-FILHO et. al., 2011; ALMEIDA et. al., 2013; EHRNHOFER-RESSLER et. al.,

2013), porém pouco se sabe sobre o mecanismo de ação desse monoterpeno que

determina muitos desses efeitos. É também eficaz na analgesia, insônia, no

tratamento de doenças gastrointestinais, como cicatrizante, em dores reumáticas,

hemorroidas, doenças de pele e úlceras (ZHENG et. al., 2008).

Alguns estudos farmacológicos comprovaram a sua ação inibitória em Gram-

positivos e Gram-negativos, atividade antifúngica, ação antioxidante,

imunomodulador, antitrombótico e antiplaquetário (KORDALI, 2005; JUHA, 2008; LI

et. al., 2012). Tem também ação como inibidor eficaz de reabsorção óssea in vivo e

in vitro, provavelmente através de um efeito direto sobre a formação de osteoclastos,

principalmente em células hematopoiéticas (HORVTHOV, 2009).

50

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral Investigar a ação do borneol em mucosites orais induzidas por 5-Fluorouracil

(5- FU) em modelo experimental de Ratos Wistar e preparar géis bucais a

base desse monoterpeno.

3.2 Objetivos Específicos

Preparar géis bucais estáveis contendo borneol nas concentrações de 1,2% e

2,4% a base de Aristoflex®;

Avaliar a estabilidade do gel obtido;

Avaliar a ação anti-inflamatória do borneol através de parâmetros

quantitativos, como número de vasos sanguíneos e quantidade de células

inflamatórias em mucosa jugal de ratos;

Avaliar a ação cicatrizante dos géis através de parâmetros qualitativos, como

reepitelização e aspectos normais dos tecidos conjuntivos.

51

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Preparação dos géis base Aristoflex®

Os géis foram preparados com a utilização do polímero hidrofílico

(Aristoflex®) e Metilparabeno (p-hidroxibenzoato de metila) em água, agitando-se, a

seguir, com auxilio de um mixer (agitador Heidolph RZR), por 30 minutos até

gelificação completa e finalmente, incorporando-se o borneol a 97% em pó (Sigma-

Aldrich) (OLIVEIRA, 2009). Os géis obtidos foram acondicionados, rotulados e

analisados quanto ao aspecto, características sensoriais, parâmetros físico-químicos

e de estabilidade. Os géis apresentaram as seguintes formulações:

Para formulação a 1,2% de Borneol:

Aristoflex® (m/m)..........................................................................................0,3g

Metilparabeno (p-hidroxibenzoato de Metila).............................................0,03g

Borneol........................................................................................................0,36g

Água destilada....................................................................................q.s. 29,3 g

Para formulação a 2,4% de Borneol:

Aristoflex® (m/m)..........................................................................................0,3g

Metilparabeno (p-hidroxibenzoato de Metila).............................................0,03g

Borneol........................................................................................................0,72g

Água destilada..................................................................................q.s. 28,95 g

4.2 Caracterização e avaliação das formulações

4.2.1 Análise macroscópica da formulação

Após a manipulação dos géis, as amostras foram analisadas quanto às

características organolépticas, a fim de identificar qualquer instabilidade, alteração

da cor ou separação de fases. A comparação visual da amostra com o gel base

permite a análise da cor, aspecto e odor, e foi realizada em cerca de 10 g da

amostra acondicionados em frascos iguais. A fonte de luz empregada foi a luz

branca, natural, de modo que a amostra pudesse ser avaliada criteriosamente com

iluminação adequada comparada antes e após a centrifugação (Figura 8).

52

Figura 8: Aspecto inicial dos géis antes da centrifugação.

Fonte do próprio autor.

4.2.2 Determinação do pH A análise de pH do gel foi realizada em pHmetro de bancada digital

(MSTecnopon equip. Especiais LTDA) (Figura 9) calibrado previamente com as

soluções determinadas pelo próprio equipamento (tampão de pH 7 e 4). A

verificação do pH foi realizada em triplicata.

Figura 9: pHmetro de bancada digital usado nas medições de pH dos géis.

Fonte do próprio autor.

4.2.3 Condutividade Para avaliação da condutividade do gel, o mesmo equipamento que verificou

o pH foi utilizado (MSTecnopon equip. Especiais LTDA), as medidas de

condutividade foram dadas em milivolt (mV), e a mensuração da condutividade foi

realizada em triplicata.

53

4.2.4 Viscosidade Para avaliação da viscosidade foi empregado o viscosímetro rotativo micro

processado (Quimis, modelo Q-860M21) (Figura 10). Aproximadamente 30g de gel

foram utilizados de forma suficiente para manter a haste do sistema imersa na

amostra e foi padronizado o “spindle 2”, em seis velocidades (10, 20, 30, 40, 50 e 60

rpm) o que permite medir eletronicamente a força de torção já convertida em

viscosidade. Todas as análises foram realizadas em triplicata.

Figura 10. Viscosímetro rotativo micro processado (Quimis, modelo Q-860M21).

Fonte do próprio autor.

4.2.5 Avaliação preliminar da estabilidade

4.2.5.1 Resistência à centrifugação Antes de iniciar o estudo de estabilidade e ao final dele, os géis foram

submetidos à centrifugação (centrífuga Centribio®, Modelo 80-2B). A centrifugação

(Figura 11) foi realizada utilizando-se 10 g das amostras, que foram centrifugadas a

3.000 rpm durante 30 minutos, a fim de detectar qualquer sinal de instabilidade,

como separação espontânea em duas fases (gel e líquido). O valor da Força

Gravitacional (Força G) ou Força Centrífuga Relativa (RCF) foi obtido através da

fórmula: RCF ou Força G = 1,12 x R x (RPM/1000)², na qual, o raio é dado em

milímetros e que no equipamento mede 135 mm, a Força G foi 1.360,8. Em seguida,

foi realizado o teste de estabilidade preliminar analisando parâmetros organolépticos

(aspecto, cor e odor) e físico-químicos (pH, condutividade e viscosidade).

54

Figura 11: Centrífuga Centribio®, modelo 80-2B utilizada nos testes de estabilidade.

Fonte do próprio autor.

4.2.5.2 Ciclo Gelo-Degelo A amostra do gel foi submetida ao teste do ciclo gelo-degelo, mediante

variações extremas de temperatura, o teste foi realizado no período de 12 dias com

6 ciclos alternados de 24 h a 40 ± 2 ºC e 24 h a 5 ± 2 ºC, em estufa e refrigerador

respectivamente (BRASIL, 2008). As análises dos parâmetros organolépticos

(aspecto, cor e odor), valor de pH, condutividade e viscosidade foram realizadas

antes e após os ciclos. Depois deste período, as amostras foram submetidas

também ao teste de centrifugação Centrífuga Centribio® (Modelo 80-2B) com 3.000

rpm durante 30 minutos, a fim de identificar sinal de instabilidade.

4.3 A Experimentação

4.3.1 Os animais e o manejo O experimento foi realizado no Laboratório de Prática Cirúrgica da UNIVASF

– Campus Petrolina – Centro (Figura 12). Foram utilizados 48 ratos albinos machos

(Rattus norvegicus) da linhagem Wistar provenientes da colônia de criação da

Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF), com idade de 12 a 16

semanas e peso médio entre 300-350g. Os ratos foram aclimatados por seis dias

antes do início dos experimentos e mantidos durante todo o período em temperatura

de 22±2°C, ciclo de claro-escuro de 12/12h e com livre acesso à ração e à água.

55

Figura 12. Sala de Experimentação do Laboratório de Prática Cirúrgica da UNIVASF – Campus Petrolina – Centro.

Fonte do próprio autor.

4.3.2 Formação de grupos experimentais Os animais foram marcados com números de 1 a 48 e distribuídos

aleatoriamente em quatro subgrupos de 12 animais (Tabela 2).

Tabela 2: Grupos formados para o estudo e tratamento medicamentoso de cada um

deles.

Grupos Tratamentos

I Borneol 0% Animais com mucosite quimioinduzida tratados com a

base Aristoflex (n=12)

II Borneol a 1,2% Animais com mucosite quimioinduzida tratados com gel

Aristoflex com Borneol a 1,2% (n=12)

III Borneol a 2,4% Animais com mucosite quimioinduzida tratados com gel

Aristoflex com Borneol a 2,4% (n=12)

IV Controle Negativo Animais com mucosite quimioinduzida e sem tratamento,

sendo o controle negativo (n=12)

Fonte do próprio autor.

Seis animais de cada subgrupo foram submetidos à eutanásia, por

aprofundamento anestésico nos dias 7 e 14 do experimento (Quadro 1).

56

Quadro 1: Representação esquemática do experimento

X* novo marco para a eutanásia, no sétimo e décimo quarto dias após as injúrias com ácido acético.

Fonte do próprio autor.

4.3.3 Pesagem dos ratos Todos os animais foram pesados com balança de precisão (Mettler-Toledo

SB8000) (Figura 13) ao início e ao final dos experimentos para a avaliação do

estado geral do animal.

Figura 13. Balança de precisão (Mettler-Toledo SB8000)

Fonte do próprio autor.

Dias

0 1 2 3

1º

4

2º

5

3º

6

4º

7

5º

8

6º

9

7º

10

8º

11

9º

12

10º

13

11º

14

12º

15

13º

16

14º

Injeção de 5-FU X X X

Queimadura da

mucosa com

ácido acético a

50%.

X*

Tratamentos

nos grupos de 7

dias

X X X X X X

Tratamentos

nos grupos de

14 dias

X X X X X X X X X X X X X

Eutanásia X X

4.3.4. Análise HematológicaTodos os animais foram submetidos à punção intracardíaca, com anestesia

prévia, para estudo do hemograma, antes da eutanásia.

como auxiliar no rastreio, diagnóstico e monitorização de diferentes patologias,

fornecendo informações qu

um individuo. O hemograma inclui a quantificação e a avaliação morfológica das

células sanguíneas (eritrócitos, leucócitos e plaquetas). 2 ml de sangue foram

retirados de cada animal e processado em

DIFF) (Figura 14) para determinação de parâmetros hematológicos nos animais

como contagem de hemácias, leucócitos e p

hemoglobina (DEPREZ

Figura 14. Analisador parâmetros hematológicos nos animais como contagem de hemácias, leucócitos e plaquetas, além da concentração de hemoglobina.

Fonte do próprio autor.

4.3.5 Indução da mucosite A indução de mucosite

quimioterápico 5-Fluorouracil (5

intraperitoneal, nos dias 0, 2 e 4 (dose de 30 mg/Kg) de experimento (

al., 2003; VILELA-GOULART

zero, o marco inicial do

medicamento indutor da doença.

No segundo dia, as mucosas jugais direitas dos 48 animais foram injuriadas

quimicamente com 10 µl de ácido acético a 50%, embebido em papel de filtro de 9

4.3.4. Análise Hematológica Todos os animais foram submetidos à punção intracardíaca, com anestesia

prévia, para estudo do hemograma, antes da eutanásia. O hemograma é utilizado

como auxiliar no rastreio, diagnóstico e monitorização de diferentes patologias,

fornecendo informações qualitativas e quantitativas sobre o estado hematológico de

um individuo. O hemograma inclui a quantificação e a avaliação morfológica das

células sanguíneas (eritrócitos, leucócitos e plaquetas). 2 ml de sangue foram

retirados de cada animal e processado em analisador automatizado (pocH

DIFF) (Figura 14) para determinação de parâmetros hematológicos nos animais

omo contagem de hemácias, leucócitos e plaquetas, além da concentração de

et al, 2009).

Figura 14. Analisador automatizado (pocH-100iV DIFF) para determinação de parâmetros hematológicos nos animais como contagem de hemácias, leucócitos e plaquetas, além da concentração de hemoglobina.

Indução da mucosite oral nos animais A indução de mucosite oral foi realizada através da administração do

Fluorouracil (5-FU – Eurofarma, São Paulo, Brasil) via injeção

intraperitoneal, nos dias 0, 2 e 4 (dose de 30 mg/Kg) de experimento (

GOULART et al., 2008; LIMA et al., 2015). Entende

zero, o marco inicial do experimento quando foi administrada

medicamento indutor da doença.

No segundo dia, as mucosas jugais direitas dos 48 animais foram injuriadas

quimicamente com 10 µl de ácido acético a 50%, embebido em papel de filtro de 9

57

Todos os animais foram submetidos à punção intracardíaca, com anestesia

O hemograma é utilizado

como auxiliar no rastreio, diagnóstico e monitorização de diferentes patologias,

alitativas e quantitativas sobre o estado hematológico de

um individuo. O hemograma inclui a quantificação e a avaliação morfológica das

células sanguíneas (eritrócitos, leucócitos e plaquetas). 2 ml de sangue foram

analisador automatizado (pocH-100iV

DIFF) (Figura 14) para determinação de parâmetros hematológicos nos animais

laquetas, além da concentração de

100iV DIFF) para determinação de parâmetros hematológicos nos animais como contagem de hemácias, leucócitos e

foi realizada através da administração do

Eurofarma, São Paulo, Brasil) via injeção

intraperitoneal, nos dias 0, 2 e 4 (dose de 30 mg/Kg) de experimento (FUJISAWA et

). Entende-se como dia

a primeira dose do

medicamento indutor da doença.

No segundo dia, as mucosas jugais direitas dos 48 animais foram injuriadas

quimicamente com 10 µl de ácido acético a 50%, embebido em papel de filtro de 9

58

mm2 por 60 segundos, sob anestesia via intraperitoneal (0,4 mL por animal) com

solução de Cloridrato de cetamina a 10% (50 mg/Kg) (Cetamin, Rhobifarma, São

Paulo, Brasil) e Cloridrato de xilasina a 2% (5 mg/Kg) (Xilazin, Rhobifarma, São

Paulo, Brasil) (Figura 15) (VILELA-GOULART et al., 2008; FUJISAWA et al., 2003;

DAMY et al., 2010).

Após as injúrias das mucosas, os animais receberam analgesia com

Butorfanol® (2mg/kg), administrado via subcutânea e passaram por repouso pós-

operatório de 2h, ou seja, eles ficaram em gaiolas individuais e não foram

submetidos a nenhuma intervenção neste período. O Butorfanol é um analgésico

opióide que complementa a anestesia, trazendo alívio pós-operatório para dores

moderadas e severas.

Figura 15. Procedimento de injuria química da mucosa jugal na intenção de indução da mucosite oral.

Fonte do próprio autor.

4.3.6 Tratamentos dos grupos Os tratamentos ocorreram da seguinte forma: O grupo Borneol 0% recebeu

uma aplicação diária da base Aristoflex® com haste flexível descartável, assim

como, os grupos Borneol 1,2% e Borneol 2,4%, que receberam os géis contendo

borneol aplicados topicamente uma vez ao dia (Figura 16). O grupo Controle

negativo recebeu aplicação local com água destilada. Após as aplicações todos os

animais ficaram 30 minutos sem beber água ou comer, para que o produto tivesse

59

mais tempo para agir. Com os grupos de sete dias, os tratamentos ocorreram do 1º

ao 6º dia após as lesões. Nos grupos de 14 dias, os tratamentos ocorreram do 1º ao

13º dia após as lesões (Quadro 1).

Figura 16. Tratamentos conforme os grupos. Aplicações diárias dos géis com hastes flexíveis.

Fonte do próprio autor.

4.3.7 Procedimento de retirada das mucosas jugais direitas dos animais. Nos dias sete e 14, os animais foram anestesiados, via intraperitoneal com

solução de Cloridrato de Cetamina a 10% (100 mg/Kg) (Cetamin, Rhobifarma, São

Paulo, Brasil) e Cloridrato de Xilasina a 2% (10 mg/Kg) (Xilazin, Rhobifarma, São

Paulo, Brasil). Foi injetado em cada animal um volume de 0,5 mL. Após o

aprofundamento anestésico e a eutanásia, que não pode ser por deslocamento

cervical, por exsanguinação ou por decapitação (métodos físicos), pois os ratos

possuem uma musculatura cervical muito robusta e, por isso, poderiam sentir dor

e/ou sofrer. A literatura recomenda uma overdose anestésica (método químico) que

leva a uma parada cardiorrespiratória (AKGULLU et al., 2015). Após a eutanásia, os

ratos tiveram as suas mucosas jugais direitas removidas com auxilio de tesoura íris e

bisturi com lâmina número 15. Em seguida, colocadas em solução de formaldeído a

10% tamponado.

60

4.3.8 Processamento do material Biológico As mucosas jugais direitas foram seccionadas e mantidas em solução de

formaldeído a 10% tamponado por aproximadamente 48 h. Em seguida, foram

desidratadas, diafanizadas e parafinadas.

Para execução do estudo histopatológico, as secções das mucosas jugais dos

animais foram obtidas com cortes transversais de 5 µm de espessura através do

micrótomo (Laica). De cada mucosa foram feitas preparações histológicas coradas

em Hematoxilina-Eosina (HE) e Tricrômico de Masson. Todos os cortes foram

montados em lâminas e lamínulas de vidro, utilizando-se o Entellan (Merck) (Figura

17).

Figura 17. Processamento do material biológico. Os espécimes em solução de formaldeído a 10% tamponado, em seguida desidratação, diafanização, microtômia, coloração e montagem das lâminas.

Fonte do próprio autor.

4.3.9 Avaliação Histológica Qualitativa e Semiquantitativa As análises microscópicas das mucosas jugais foram realizadas em

microscópio óptico com magnitude de 4x e 10x. Na análise qualitativa foram

avaliados os parâmetros inflamatórios como presença de infiltrado celular, necrose,

úlceras e reepitelização classificados de acordo com Tabela de Lara et al. (2007)

61

(Quadro 2). Para a obtenção das imagens, a identificação das lâminas foi bloqueada

com papel pardo e numerada de 1 a 48. As avaliações foram realizadas por

profissional em cego para evitar viés no processo de avaliação.

Quadro 2: Guia para Análise Microscópica Qualitativa das lâminas, Lara et al. (2007). Guia de Análise Microscópica Qualitativa

Ep

itélio

Tamanho

Ulceração

Exocitose

Biofilme

Hiperqueratose

Mitose

□Normal □ Atrófico □ Hiperplásico

□ Ausente □ Presente

□ Ausente □ Presente

□ Ausente □ Presente

□ Ausente □ Presente

□ Ausente □ Presente

Co

njun

tivo

– A

ltera

çõe

s in

flam

ató

rias

Intensidade

Composição

Distribuição

Necrose

Vasos Sanguíneos

Tecido de Granulação

□ Discreta □ Moderada □ Intensa

□PMN □Neutrófilos

□Eosinófilos

□MN □Linfócitos

□Plasmócitos

□Células Gigantes

□ Focal □Difusa

□ Ausente □ Presente

□ Presente (+) □ Presente (++)

□ Congestionados □ Não congestionados

□ Ausente □ Presente

Fonte Lara et al. (2007).

A análise semiquantitativa foi realizada por avaliador em cego que observou

parâmetros inflamatórios incluindo presença de infiltrado inflamatório celular,

vasodilatação, necrose, ulceração, abscesso, hemorragia e edema. Estes

parâmetros foram atribuídos pontuações (escores) de 0-3, como descrito por Lima et

al., (2005): Escore 0 - Epitélio normal e tecido conjuntivo sem vasodilatação;

ausência ou leve infiltração celular; ausência de áreas hemorrágicas, ulcerações ou

abscessos; Escore 1 - Ingurgitação vascular leve, áreas de reepitelização; Infiltrado

inflamatório leve com prevalência mononuclear; ausência de áreas hemorrágicas,

edema, ulcerações ou abscessos; Escore 2 - Ingurgitação vascular moderada,

62

áreas de degeneração epitelial hidrópica, Infiltrado inflamatório com prevalência de

neutrófilos, presença de áreas hemorrágicas, edema e algumas ulcerações,

ausência de abscessos; Escore 3 - Ingurgitação e dilatação vasculares graves,

infiltração inflamatória com prevalência de neutrófilos, presença de áreas

hemorrágicas, edema, ulcerações extensas e abscessos.

4.3.10 Avaliação Histológica Quantitativa O número de células inflamatórias, o percentual de colágeno e a quantidade

de vasos sanguíneos nas regiões ulceradas foram quantificados. Os campos

histológicos foram digitalizados utilizando-se microscópio LEICA® DM2500 (Leica

Biosystems, Wetzlar, Alemanha) com câmera acoplada CELESTRON® Digital

Microscope Imager modelo 44421 (Torrance, Califórnia, Estados Unidos), usando

programa fornecido pela própria câmera digital.

4.3.10.1 Número de células inflamatórias e a quantidade de vasos sanguíneos nas regiões ulceradas

A mesma intensidade de luz foi utilizada em todas as digitalizações. As

imagens digitalizadas foram mantidas com formato RGB, resolução 2048 X 1536

pixels e extensão jpg. Para a avaliação de celularidade, as imagens digitalizadas

obtidas dos campos foram trabalhadas utilizando programa ImageJ, desenvolvido e

disponibilizado por Landini e Perryer (2009). As imagens foram submetidas ao

processo de deconvolução da cor utilizando plugin (“Colour deconvolution”). Usando

esse recurso as cores do corante (Hematoxilina e Eosina) podem ser separadas em

duas imagens destacando quantidade e os padrões do recurso de interesse. Este

método consiste na separação matemática de cores do espectro RGB (“red, green,

blue”) em imagens com combinações de até 3 cores diferentes, como acontece na

coloração HE.

Para a quantificação dos núcleos celulares (celularidade) das lâminas coradas

em HE, seguiu-se o método de deconvolução de cor descrito anteriormente. As

imagens obtidas a partir da coloração HE utilizadas para quantificação de

celularidade também foram submetidas a contagem de vasos sanguíneos para

avaliar angiogênese. Na avaliação quantitativa foi usado o software ImageJ®, versão

1,49t, utilizando o Plugin “Cell Counter”, no qual, o número de células inflamatórias e

de vasos sanguíneos foram mensurados.

63

A contagem de células de um tecido ou de qualquer estrutura é muito utilizada

nas verificações de estudos experimentais. A quantificação de análises

morfométricas podem ser realizadas através da contagem do número de neovasos,

fibroblastos, fibras colágenas, leucócitos, monócitos e células de embriões

(MENDES-JUNIOR; VITERBO, 2007; COSTA et al., 2010).

Para a contagem realizada através do software foram seguidos os passos

iniciais da contagem automática, até a função Color Balance. A partir daí, seguiu-se

os comandos:

Plugins → Particle Analysis → Cell Counter →File→ Open→Escolha da imagem→

abrir→ Initialize→escolha do Type → Efetuar a contagem (Figura 18).

Figura 18. Ilustração da tela de leitura do software utilizado para mensuração dos vasos sanguíneos e das células inflamatórias.

Fonte do próprio autor.

4.3.10.2 Percentual de colágeno neoformado nas regiões ulceradas Também foi utilizad

automaticamente usado o programa de acordo com os grupos e nos dias 7 e 14,

seguindo o esquema abaixo.

File → Open → Procurar imagem → Image → Type → RGB Stack →

Image → Type → 32 Bits → Image → Adjust → Threshold → Ajuste baixo 255 e

ajuste alto 134 → Ok → Yes → Analyze → Measure (Figuras 19 e 20).

Figura 19: Utilização do Software ImageJ

Fonte do próprio autor.

Percentual de colágeno neoformado nas regiões ulceradas Também foi utilizado o software ImageJ®, todas as lâminas foram me

automaticamente usado o programa de acordo com os grupos e nos dias 7 e 14,

seguindo o esquema abaixo.

→ Open → Procurar imagem → Image → Type → RGB Stack →

→ Type → 32 Bits → Image → Adjust → Threshold → Ajuste baixo 255 e

→ Ok → Yes → Analyze → Measure (Figuras 19 e 20).

Figura 19: Utilização do Software ImageJ® para o cálculo do percentual de colágeno.

64

Percentual de colágeno neoformado nas regiões ulceradas , todas as lâminas foram mensuradas

automaticamente usado o programa de acordo com os grupos e nos dias 7 e 14,

→ Open → Procurar imagem → Image → Type → RGB Stack →

→ Type → 32 Bits → Image → Adjust → Threshold → Ajuste baixo 255 e

→ Ok → Yes → Analyze → Measure (Figuras 19 e 20).

para o cálculo do percentual de colágeno.

65

Figura 20. Representação da coloração observada na tela para determinação do percentual de colágeno neoformado.

Legenda: A: Lâmina corada por Tricrômico de Masson. B: Imagem após seleção RGB Stack com 32 Bits. C: Imagem após seleção do Plugin Threshold (255x134). D. Área em azul correspondente ao colágeno Neoformado. Magnitude de X10. Fonte do próprio autor.

4.3.11 Análise Estatística Foram usadas todas as variáveis e comparações entre os grupos,

independentemente do dia; entre os dias, independentemente do grupo; e entre os

grupos, em cada dia. A análise estatística dos dados foi realizada por ANOVA Two-

Way, seguida de pós-teste de Tukey em todas as comparações, exceto na avaliação

dos escores de cicatrização, na qual foi usado o teste de Mann Whitney. Em todas

as avaliações se fixou em 0,05 ou 5% (p ≤ 0,05) o nível de rejeição da hipótese de

nulidade, para os valores significantes.

4.3.12 Atendimento aos Critérios Éticos da Pesquisa O projeto foi submetido à Comissão de Ética no uso de animais (CEUA –

UNIVASF), vindo a ser aprovado com Protocolo nº 0001/140814, em 02 de junho de

66

2015. Durante o experimento procurou-se seguir a regra dos 3 R's da

experimentação animal, que segundo Russell e Burch (1959), é representada por:

a)"Replace", que consiste em substituir os animais capazes de experimentar dor,

prazer, felicidade, medo, frustração e ansiedade; b)"Reduction", que significa reduzir

o número de animais utilizados, sem prejudicar a qualidade dos resultados e

c)"Refinement" significa refinamento, ou seja, a diminuição da incidência ou

severidade de procedimentos aplicados (GRIFFIN et al., 2014). Durante o

experimento e no momento da eutanásia, adotou-se uma conduta de respeito, de

conhecimento e de responsabilidade no manejo, levando-se em conta que o animal

sente dor e sofre.

67

5 RESULTADOS

5.1 Preparação e avaliação das formulações De acordo com os resultados de estabilidade física da formulação submetida

ao teste de centrifugação e congelamento/descongelamento, é possível afirmar que

em todos os testes não interferiram na estrutura das fibras que formam o gel, uma

vez que tanto as amostras submetidas à centrifugação quanto ao

congelamento/descongelamento apresentaram mínima variação dos parâmetros

avaliados. Os géis se mostraram homogêneos, translúcidos e incolores; com pH

entre 4,3 a 4,7, condutividade média inicial e final e sem separação de fases

conforme tabela abaixo (Tabela 3).

Tabela 3: Resultados da avaliação da estabilidade preliminar dos géis de Borneol, antes e após o teste de congelamento e descongelamento.

Amostra Aspecto pH Condutividade Centrifugação a 3000

RPM

Gel (borneol 0%) Homogêneo;

Translúcido e

Incolor.

5,0

100,0 mV

Sem separação de

Fases

Gel – Pré

(Borneol 1,2%)

Homogêneo;

Translúcido e

Incolor.

4,5±0,02

139,0±1,5 mV

Sem separação de

Fases

Gel – Pós

(Borneol 1,2%)

Homogêneo;

Translúcido e

Incolor.

4,7±0,03

120,2±0,5 mV

Sem separação de

Fases

Gel – Pré

(Borneol 2,4%)

Homogêneo;

Translúcido e

Incolor.

4,3±0,02

152,0±1,6 mV

Sem separação de

Fases

Gel – Pós

(Borneol 2,4%)

Homogêneo;

Translúcido e

Incolor.

4,4±0,04

147,2±1,5 mV

Sem separação de

Fases

Fonte do próprio autor.

Com relação à análise reológica das preparações semissólidas, verificou-se o

comportamento característico de sistemas não newtonianos do tipo plástico ou

pseudoplástico, nos quais a viscosidade diminui com o aumento da tensão de

cisalhamento aplicada. Não houve diferença estatística entre os valores de

viscosidade dos géis de borneol após os testes de congelamento e

68

descongelamento (Figura 21). A Figura 21 representa o reograma do Gel de Borneol

a 2,4%, com as curvas descendente e ascendente, obtidos antes e após o estudo de

estabilidade preliminar e acelerada (12 dias), respectivamente. A formulação

analisada apresentou um comportamento pseudoplástico, comum para este tipo de

forma farmacêutica e tixotropia.

Figura 21: Resultados da viscosidade média do gel Borneol 2,4%, antes e após os testes de congelamento e descongelamento.

Legenda: Esquerda Viscosidede preliminar (T0). Direita Viscosidade final (T12). Fonte do próprio autor.

As formulações desenvolvidas apresentaram texturas lisas, transparentes,

aspecto homogêneo e aroma característico do borneol. As características

macroscópicas se mantiveram semelhantes no aspecto antes e após os testes de

estabilidade (Figura 22).

Figura 22. Aspectos macroscópicos do gel Borneol 2,4% antes e após os testes de

Estabilidade.

Fonte do próprio autor.

O Borneol por sua ação anti-inflamatória, antioxidante e antimicrobiana,

utilizado na medicina chinesa no tratamento de queimaduras na pele e aftas, pode

também apresentar ação sob mucosites orais. Por isso, foram testados géis orais

095001900028500380004750057000

05000

100001500020000250003000035000400004500050000

0 20 40 60 80Taxa

de

defo

rmaç

ão

(mPa

s)

Tensão de Cislhamento (rpm)

095001900028500380004750057000

05000

100001500020000250003000035000400004500050000

0 20 40 60 80Taxa

de

defo

rmaç

ão

(mPa

s)

Tensão de Cislhamento (rpm)

Antes Após

69

com base Aristoflex® contendo esse monoterpeno em sua composição, nas

concentrações de 1,2% e 2,4%. Essa base é utilizada em formulações bucais por

seu pH de 4 a 6, próximo a concentração hidrogeniônica da cavidade oral, por sua

boa viscosidade e aderência a mucosa oral.

5.2 Avaliação da atividade dos géis de borneol sobre a mucosite oral No dia sete, foi encontrada uma diferença estatisticamente significativa (p

<0,05) nos escores para o grupo G3 (Borneol 2,4%) em comparação aos grupos G1

(Borneol 0%) e G4 (Controle). Este resultado indicou melhor cicatrização para

Borneol 2,4% (Figura 23).

FIGURA 23. Escores de cicatrização da mucosite oral de acordo com os grupos e o

dia de experimentação.

. Legenda: p <0,05: Controle vs Borneol 2,4% (7 dias); p<0,05: Borneol 0% vs. Borneol 2,4% (7 dias); p<0,05: Controle vs Borneol 2,4% (14 dias); p<0,05: Borneol 0% vs. Borneol 2,4% (14 dias). As diferenças entre os escores foram checadas através do teste de Mann-Whitney. Fonte do próprio autor.

O grupo G1 (Borneol 0%) se apresentou com úlcera extensa, além de

degeneração hidrópica, espongiose e exocitose. No tecido conjuntivo (TC) se

observou a presença moderada e difusa de Polimorfonucleares (PMN) com áreas de

necrose e hemorrágicas. O grupo G2 (Borneol 1,2%) se apresentou com região

ulcerada, presença de degeneração hidrópica, espongiose e exocitose. O TC

apresentou áreas de necrose, presença de alguns vasos sanguíneos

congestionados, além de presença moderada e difusa de PMN. O Grupo G3

70

(Borneol 2,4%) se apresentou com discreta degeneração hidrópica, espongiose e

reepitelizado parcialmente em cinco animais. O TC se apresentou com PMN e

presença de poucos vasos sanguíneos congestionados. O grupo G4 (Controle

Negativo) se apresentou com área ulcerada, além de degeneração hidrópica,

espongiose e intensa exocitose. O TC se apresentou com edema e necrose,

moderados vasos sanguíneos congestionados, além de presença moderada e difusa

de PMN (Figura 24).

Figura 24. Aspectos microscópicos dos grupos com sete dias de experimentação.

Legenda: A: Grupo tratado com base (Borneol 0%); B: Grupo tratado com gel contendo Borneol na concentração de 1,2%; C: Grupo tratado com gel contendo Borneol na concentração de 2,4%; D: Grupo controle negativo. PMN=Polimorfonucleares; VS=Vaso Sanguíneo; U=Ulceração; E=Exocitose; ED=edema; RE=Reepitelização parcial. Aumento de 10X. A barra de Neubauer representa 200 µm. Fonte do próprio autor.

No dia 14, foi encontrada diferença estatisticamente significativa (p <0,05) nos

escores de pontuação para o grupo G3 (Borneol 2,4%) em comparação com os

grupos G1 (Borneol 0%) e G4 (Controle). Este resultado indicou melhor cicatrização

para Borneol 2,4% (Figura 23).

71

O grupo G1 (Borneol 0%), apresentou-se com hiperqueratose e totalmente

reepitelizado. O TC se apresentou com vasos sanguíneos congestionados, além de

presença moderada e difusa de Mononucleares (MN). O grupo G2 (Borneol 1,2%) se

apresentou reepitelizado, porém com maior número de vasos sanguíneos que no

grupo G3. O TC apresentou numerosos vasos sanguíneos congestionados, com

difuso e discreto processo inflamatório crônico. O Grupo G3 (Borneol 2,4%) se

apresentou com aspecto normal e totalmente reepitelizado. O TC apresentou

aspectos normais, além de tecido de granulação com fibroblastos, vasos sanguíneos

congestionados e presença discreta e difusa de MN. O grupo G4 (Controle Negativo)

se apresentou com acantose (aumento de espessura da camada espinhosa) com

perda da integridade da membrana basal e exocitose. Houve reepitelização, porém

com aspecto morfológico divergente do normal em quatro animais. O TC se

apresentou com grande quantidade de tecido de granulação com fibroblastos, vasos

sanguíneos congestionados e infiltrado inflamatório crônico (Figura 25).

Figura 25. Aspectos microscópicos dos grupos com 14 dias de experimentação.

Legenda: A: Grupo tratado com base do gel (Borneol 0%); B: Grupo tratado com gel contendo

Borneol na concentração de 1,2%; C: Grupo tratado com gel contendo Borneol na concentração de 2,4%; D: Grupo Controle Negativo. RE=Reepitelização; HQ=Hiperqueratinização; MN=Mononucleares; VS=Vaso Sanguíneo; AC=Acantose. Aumento de 10X. Coloração H.E. A barra

de Neubauer representa 200 µm. Fonte do próprio autor.

72

5.3 Avaliações estatísticas quantitativas Em relação ao percentual de colágeno, com sete dias houve significância

estatística quando se comparou o grupo G1 (Borneol 0%) com o grupo G3 (Borneol

2,4%), como também, as comparações dos grupos G4 (Controle) com os grupos G2

(Borneol 1,2%) e G3 (Borneol 2,4%) foram significantes (Figura 30). Na Figura 26c

pode-se observar a melhor formação de epitélio no grupo G3.

Figura 26. Aspectos microscópicos do colágeno neoformado dos grupos com sete dias.

Legenda: A: Grupo borneol 0%; B: Grupo borneol 1,2%; C: Grupo borneol 2,4%; D: Grupo controle.

Aumento de 10X. Coloração Tricrômico de Masson. Fonte do próprio autor. A barra de Neubauer

representa 200 µm.

Com 14 dias houve significância nos grupos G2 e G3 quando comparados ao

grupo G4, como também, o grupo G1 (Borneol 0%) comparado ao grupo G3

(Borneol 2,4%) (Figura 30). Observar que houve visivelmente uma maior formação

de colágeno no grupo G3, evidenciado por grande quantidade de fibras coradas em

azul (as fibras colágenas tem grande afinidade pelo corante azul do Tricrômico de

73

Masson, os núcleos se coram de preto, o músculo, o citoplasma e a queratina,

coram-se de vermelho) (Figura 27c).

Figura 27: Aspectos microscópicos do colágeno neoformado dos grupos com quatorze dias.

Legenda: A: Grupo Borneol 0%; B: Grupo Borneol 1,2%; C: Grupo Borneol 2,4%; D: Grupo controle. Aumento de 10X. Coloração Tricrômico de Masson. A barra de Neubauer representa 200 µm. Fonte do próprio autor.

Com sete dias, o Borneol 2,4% apresentou um menor número de vasos que

os outros grupos. Apresentou significância estatística (p<0,05) quando comparado

aos três outros grupos. O Borneol 1,2% apresentou diferenças estatísticas

significantes, quando comparado aos grupos Gel base e Controle. Não houve

diferenças entre o grupo Borneol 0% e o grupo Controle. Com 14 dias, houve

significância estatística entre todos os cruzamentos, exceto entre o grupo Borneol

0% e grupo Controle e entre os grupos Borneol 1,2% e Borneol 2,4%. Nesse caso,

ambos os géis apresentaram resultados parecidos (Figura 28).

74

Figura 28. Contagem do número de vasos de acordo com os grupos e os dias de experimentação.

Legenda: p<0,05: Borneol 0% vs. Borneol 2,4% (7 dias); p<0,05: Controle vs. Borneol 1,2% e Borneol 2,4% (7 dias); p<0,05: Borneol 0% vs. Borneol 1,2% e Borneol 2,4% (14 dias); p<0,05: Controle vs. Borneol 1,2% e Borneol 2,4% (14 dias). (ANOVA Two-Way seguida de pós-teste de Tukey). Fonte do próprio autor.

Em relação ao número de células inflamatórias, os géis contendo borneol nas

concentrações de 1,2% e 2,4% apresentaram ação anti-inflamatória com sete e 14

dias, pois diminuíram o número dessas células no local da lesão. Com sete dias, os

grupos controle e base do gel apresentaram processo inflamatório bem mais intenso

que os grupos tratados (Gel 1,2% e Gel 2,4%), entretanto não se observaram

diferenças entre as duas concentrações de gel. Com 14 dias, os infiltrados celulares

foram bem menos intensos em todos os grupos. Houve diferenças entre o Gel base

em comparação ao Gel 2,4%, como também, de ambos os géis (Gel 1,2% e Gel

2,4%) quando comparados ao controle, contudo não houve diferenças dos dois géis

entre si (Figura 29).

75

Figura 29: Contagem do número de células inflamatórias de acordo com os grupos e os dias de experimentação.

Legenda: p<0,05: Borneol 0% vs. Borneol 1,2% e Borneol 2,4% (7 dias); p<0,05: Controle vs. Borneol 1,2% e Borneol 2,4% (7 dias); p<0,05: Controle vs. Borneol 1.2% e Borneol 2,4% (14 dias). (ANOVA Two-Way seguida de pós-teste de Tukey). Fonte do próprio autor.

Nas lâminas coradas com tricrômico de Masson, os percentuais de colágeno

nos grupos G2 (Borneol 1,2%) e G3 (Borneol 2,4%) foram maiores que nos grupos

G1 (Borneol 0%) e G4 (Controle negativo) no tempo de 14 dias. Isso se deve ao

efeito cicatrizante do borneol que favoreceu a maior formação de fibroblastos com

melhores produções de colágeno e fibronectina nos locais de lesões (Figura 30).

76

Figura 30. Percentual de Colágeno de acordo com os grupos com sete e 14 dias.

Controle

Borneo

l 0%

Borneo

l 1,2

%

Borneo

l 2,4

%0

10

20

30

40

Per

cen

tual

de

Co

lág

eno 7 dias

14 dias

aA

A,BB,D

b,d C c,d

a

Legenda: p<0,05: Borneol 0% vs. Borneol 2,4% (7 dias); p<0,05: Controle vs. Borneol 1,2% e Borneol 2,4% (7 dias). p<0,05: Borneol 0% vs. Borneol 2,4% e Borneol 1,2% (14 dias) p<0,05: Controle vs. Borneol 1,2% e Borneol 2,4% (14 dias). (ANOVA Two-Way seguida de pós-teste de Tukey). Fonte do próprio autor.

Em relação à massa inicial e final dos animais, todos perderam peso ao longo

do experimento devido os efeitos secundários do 5-Fluorouracil, da mucosite oral e

da redução da ingestão de água e ração. Com 7 dias todos animais tiveram redução

percentual de massa semelhante. Com 14 dias de experimentação, os grupos

Borneol 1,2% e Borneol 2,4% apresentaram menores percentuais de perda de peso

em relação aos outros dois grupos (Borneol 0% e Controle), provavelmente devido à

maior ação do Borneol na redução da inflamação e promovendo a cicatrização das

lesões (Figura 31).

77

Figura 31: Percentagem de perda de massa em gramas de acordo com o grupo e dia de experimentação.

Legenda: p <0,05: Controle vs. Borneol 1,2% e Borneol 2,4% (14 dias). p <0,05: Borneol 0% vs

Borneol 1,2% e Borneol 2,4% (14 dias). Fonte do próprio autor.

Como também, as alterações hematológicas foram observadas nos

hemogramas de todos os grupos indistintamente, como decorrência da utilização do

antimetabólito 5-fluorouracil, que causa depressão da medula óssea em diferentes

graus, por isso, os animais apresentaram alterações nas hemácias, nos leucócitos e

nas plaquetas. Observou-se policitemia, leucopenia, leucocitose, plaquetose,

plaquetopenia, anisopecilocitose, macrocitose, microcitose, linfocitose, policromasia,

desvio a esquerda, variando em estágios de discreta, moderada e acentuada

alteração em todos os grupos nos dois dias de avaliação (Tabela 4).

78

Tabela 4. Determinação de parâmetros hematológicos nos animais como contagem de Hemácias, Leucócitos e Plaquetas, além do hematócrito.

Nº Total de

Animais

Total por

grupos

Tratamentos

Dias /

Eutan.

Cont.

Cel.

Bran.

Cont.

Cel.

Verm.

Hematoc. Plaq.

48

6 G1 (Borneol

0%)

Dia 7

1.350 6.345.000 35,25 25.500

6 G2 (Borneol

1,2%)

1.850 5.875.000 33,5 23.500

6 G3 (Borneol

2,4%)

2.250 6.130.000 36,15 216.000

6 G4

(Controle)

1.850 6.881.667 40,85 98.000

6 G1 (Borneol

0%)

Dia 14

5.500 6.726.667 42,45 709.000

6 G2 (Borneol

1,2%)

2.450 5.431.667 31,8 461.500

6 G3 (Borneol

2,4%)

5.150 6.493.333 36,7 478.500

6 G4

(Controle)

4.200 4.605.000 25,25 295.500

Fonte do próprio autor.

79

6 DISCUSSÃO

6.1 Avaliação das formulações contendo borneol. A estabilidade de produtos farmacêuticos pode ser definida como sendo a

capacidade de dada formulação, acondicionada numa determinada embalagem

(primária e secundária), manter intactas as suas propriedades físicas, químicas,

microbiológicas, terapêuticas, toxicológicas, etc. A finalidade dos testes de

estabilidade é garantir que a qualidade de um produto farmacêutico ou substância

ativa não varia com o tempo sob a influência de vários fatores ambientais, tais como

temperatura, umidade e luz. Quando aplicados a novas entidades farmacêuticas,

estes testes permitem estabelecer um prazo de validade para o produto

farmacêutico e as respectivas condições de armazenagem recomendadas. Os

estudos de estabilidade permitem também determinar uma frequência de testes a

serem realizados ao longo de todo o ciclo do medicamento (GUIDELINE, 2003;

SANTOS, 2015).

A viscosidade do produto pode influenciar na sua aplicação e uso. A

viscosidade é a resistência que o produto oferece à deformação ou ao fluxo, e

depende das características físico-químicas e das condições de temperatura do

material (CHORILLI et al., 2007).

A reologia é definida como a ciência que estuda o fluxo e a maneira como os

materiais respondem à aplicação de uma força ou tensão. Do ponto de vista

farmacotécnico, torna-se de fundamental importância o conhecimento do

comportamento e dos parâmetros reológicos, visto que um adequado fluxo dos

sistemas é exigido para que a atividade terapêutica, ou as funções cosméticas do

produto, sejam asseguradas (TONZAR, 2006).

Os fluidos não newtonianos plásticos e pseudoplásticos apresentam como

característica reológica principal, a diminuição da viscosidade após aplicação de

uma tensão de corte, ou seja, este comportamento possibilita a aplicação de uma

preparação semissólida sobre uma superfície, facilitando assim o uso e

espalhabilidade de um gel farmacêutico por diminuição da viscosidade após

aplicação de uma força, fatores estes que contribuem para aceitação e adesão à

terapêutica medicamentosa pelo paciente (SANTOS, 2015).

As formulações dos géis Aristoflex® contendo Borneol apresentaram

comportamento tixotrópico que contribuiu na estabilidade. O produto tixotrópico

tende a ter maior prazo de validade, pois durante o armazenamento (período no qual

80

o produto permanece em repouso), este apresenta viscosidade constante, o que

dificulta a separação dos constituintes da formulação (CORRÊA et al., 2005).

O Aristoflex® é um co-polímero neutralizado de acriloildimetiltaurato do ácido

sulfônico e vinilpirrolidona, sendo assim, um polímero sintético formador de géis em

sistemas aquosos e utilizado em função da sua capacidade de formação de géis

cristalinos e incolores, com característica de excelente consistência, além de

proporcionar boas propriedades sensoriais, conferindo uma agradável sensação

quando aplicado sobre a pele (OLIVEIRA, 2009).

O gel de Aristoflex é uma base que se presta bem para se incorporar

substâncias ácidas, se mantendo incolor, uniforme e de excelente aplicabilidade

tópica (KÜLKAMP-GUERREIRO et al., 2012). Quanto aos seus dados físico-

químicos, é um pó branco com teor de sólidos de 92%, teor de água de 7%

(máximo), pH 4 a 6 (solução 1% em água) e viscosidade (10 rpm) de 48.000 a

80.000 mPas (solução 1% em água). Ele forma uma rede quimicamente estável de

maior viscosidade e valor de cisalhamento do que os outros géis. Entende-se como

valor de cisalhamento a quantidade de força necessária para romper um produto

baseado nele (ZANINI, 2007).

Nas análises físico-químicas, nenhum dos parâmetros avaliados dos géis se

apresentou estatisticamente diferente após o teste de estabilidade acelerada, com o

ciclo de 12 dias de congelamento e descongelamento das fórmulas, onde as

mesmas foram expostas a temperaturas extremas alternando entre estufa e

refrigerador por 12 dias, permanecendo em cada ambiente por 24 horas. Os valores

de pH dos géis variaram entre 4,3 ± 0,02 e 4,7 ± 0,03. Tais valores com pH ácido já

eram esperados, já que o gel base de Aristoflex® foi formulado com um pH de 5,0.

Em outro estudo com o mesmo Gel base, apresentou um pH de 5 e não ocorreu

mudança de fase demonstrando boa viscosidade (RUSSO et al., 2008). Além disso,

o borneol também é considerado uma substância de pH ácido (XIAO-FEI et al.,

2008).

Foram produzidos dois géis Aristoflex® contendo borneol nas concentrações

de 1,2% e 2,4%. Não existe na literatura um gel para uso oral que contenha borneol.

Essas concentrações foram escolhidas baseadas em publicações anteriores como

de uma pomada de vaselina que foi usada na pele humana para tratamento de

úlceras, que contém 0,7% de Borneol (MAI et al., 2003). Na literatura, os géis orais

que contêm extratos vegetais (presença de fitocomplexos) possuem concentrações

81

bem mais elevadas, em torno de 10% (TANIDEH et al., 2014). Dantas (2016) utilizou

uma formulação de gel para uso tópico com 5% de borneol, que foi incorporado a

uma base carbopol® com pH de 3,9.

6.2 Características Clínicas dos animais Em relação aos achados clínicos gerais, todos os animais desenvolveram

alguns efeitos secundários decorrentes da quimioterapia como diarreia, hipertermia,

alopecia, anorexia e perda de reflexo. Estes animais foram imunossuprimidos e

ficaram susceptíveis para desenvolver mucosite oral. Os mesmos efeitos colaterais

pelo uso do 5- Fluorouracil foram relatados por Vilela-Goulart et al. (2008).

Observou-se uma nítida alteração nos hemogramas dos animais em

decorrência ao uso de antineoplásico (Tabela 6). Um estudo realizado por Castello

Branco et al., (2011) revelou parâmetros hematológicos de normalidade em Ratos

Wistar em seis biotérios. Os valores encontrados pelos autores foram: Hematócrito

de 34% a 46%; Contagem de células vermelhas de 6.200.000 a 8.400.00; Contagem

de células brancas de 5.000 a 14.000; Número de plaquetas de 150.000 a 796.000.

Na pesquisa atual encontrou-se: Hematócrito de 25,25% a 42,45%; Contagem de

células vermelhas de 4.605.000 a 6.881.667; Contagem de células brancas de 1.350

a 5.500; Número de plaquetas de 25.500 a 709.000 (Tabela 6). Os autores Tanideh

et al., (2014), também encontraram todas essas alterações nos hemogramas

realizados em seus animais de experimentação.

Os animais do estudo desenvolveram mucosite oral induzida em decorrência

da administração do 5-Fluorouracil em associação com a injuria na mucosa com

ácido acético a 50%. Os modelos pré-clínicos são necessários para compreensão da

patogênese da doença, porém os modelos atuais têm limitações inerentes. Por

exemplo, alguns modelos animais exigem lesão mecânica para indução da

ulceração. Nos pacientes humanos, a mucosa não precisa ser ferida

superficialmente para a mucosite se desenvolver. As doses e agendamento da

quimioterapia ou radioterapia, também não são necessariamente traduzíveis entre

animais e seres humanos. Apesar das limitações dos modelos animais, os estudos

pré-clínicos sobre o tratamento da mucosite oral e da dor associada são necessários

para que se conheça melhor a doença (VIET et al., 2014).

A massa inicial e final dos animais variou ao longo do experimento devido aos

efeitos secundários do 5-Fluorouracil, da mucosite oral e da redução da ingestão de

82

água e ração. Com 7 dias todos animais tiveram redução percentual de massa

semelhante. Com 14 dias de experimentação, os grupos Borneol 1,2% e Borneol

2,4% apresentaram menores percentuais de perda de peso em relação aos outros

dois grupos (Borneol 0% e Controle), provavelmente devido à maior ação do Borneol

na redução da inflamação e promovendo a cicatrização das lesões. Observou-se

uma perda aproximada de 12% da massa inicial em todos os grupos com 7 dias.

Com 14 dias, os grupos Borneol 1,2% e Borneol 2,4% tiveram maiores recuperações

de massa em comparação aos dois outros grupos (Borneol 0% e Controle). Aras et

al., (2013) observaram uma perda bem mais acentuada (17%) na massa inicial em

seus animais, que pode ser justificada pela maior dosagem de 5-Flourouracil

utilizada em seus experimento (165 mg/kg) que a nossa (90 mg/kg).

Com isso, após os testes clínicos, o dentista poderá desempenhar com mais

segurança, o importante papel na abordagem multidisciplinar em pacientes com

câncer e mucosite oral, proporcionando um tratamento detalhado, adequando a

cavidade oral do paciente pela eliminação de doenças e gerando menos sequelas

da quimioterapia e da radioterapia (MENEZES et al., 2014).

6.3 A experimentação, a análise histológica e a análise estatística. O fato dos ratos terem uma cavidade oral maior que a dos camundongos foi

determinante em nossa escolha, apoiada em estudos anteriores que recomendam o

uso desses animais em simulações de tratamentos de mucosite oral (LARA et al.,

2007; VILELA GOULART et al., 2008; ARAS et al., 2013; CAMPOS et al., 2015;

LIMA et al., 2015).

O 5-Fluorouracil (5-FU) foi inicialmente utilizado em duas dosagens de 100

mg/Kg (dia 0) e 60 mg/Kg (dia 2) (ARAS et al., 2013; CAMPOS et al., 2015), porém

causou efeito colateral severo nos ratos como alopécia severa, leucopenia

acentuada, diarreia, perda de peso e morte de 30 animais. Por esse fato, o estudo

teve que ser refeito com a utilização de uma dosagem menor de 5-FU, com três

injeções intraperitoneais de 30 mg/Kg nos dias 0, 2 e 4 (LARA et al., 2007; VILELA

GOULART et al., 2008; LIMA et al., 2015). Com isso, não houve perda de animais e

os mesmos apresentaram sinais e sintomas característicos da quimioterapia, porém

bem menores que no experimento anterior.

A indução da mucosite oral nos ratos foi realizada com sucesso,

estabelecendo-se a sequência cronológica do processo inflamatório. A resolução da

83

inflamação ocorreu a partir do momento em que os granulócitos foram eliminados e

a população de células mononucleares teciduais (macrófagos e linfócitos) retornou

ao número e fenótipo normais (SERHAN et al., 2007). Nesse estudo, encontrou-se

que em todos os grupos, no período inicial, ocorreu a presença de significativo

número de neutrófilos polimorfonucleares que diminuiu ao longo dos dias do

experimento.

Entre as complicações localizadas de maior interesse para os cirurgiões

dentistas são a mucosite oral, infecções bucais oportunistas (estomatites), função

glandular alterada, síndrome de ardência oral, xerostomia, dificuldade mastigatória,

cáries de radiação, hiperestesia dental, osteorradionecrose, doença periodontal,

trismo, hemorragia, disgeusia, dermatite crônica e fibrose tecidual (NEVILLE et al.,

2009).

Segundo Robbins e Cotran (2010), inflamação aguda é uma rápida resposta

do hospedeiro que serve para levar leucócitos e proteínas do plasma, tais como

anticorpos, para os locais de infecção ou tecido injuriado. Apresenta como

componentes a alteração do calibre vascular que leva a um aumento no fluxo

sanguíneo; mudanças estruturais nos vasos sanguíneos permitindo a passagem de

leucócitos e seu acúmulo no foco da injúria e sua ativação para eliminar o agressor.

De forma que os resultados de uma inflamação aguda são a resolução completa,

cura por substituição do tecido conjuntivo (fibrose) e a progressão para uma

inflamação crônica. As principais células migratórias encontradas no início dos

processos inflamatórios agudos são os Polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos e

basófilos), enquanto os Mononucleares (linfócitos e plasmócitos) são mais

frequentemente encontrados nas fases mais tardias das reações inflamatórias. Ao

longo do tempo, se não houver complicações, o número de células inflamatórias vai

gradativamente diminuindo.

Os géis apresentaram ação anti-inflamatória, pois diminuíram a quantidade de

células inflamatórias no local da lesão nos primeiros sete dias de experimento, ou

seja, um menor infiltrado inflamatório em comparação ao Borneol 0% e ao controle.

Com 14 dias, a redução dessas células no local da lesão se deu de maneira

significante nos grupos tratados (Borneol 1,2% e Borneol 2,4%). Esses achados

estão de acordo com estudo de Almeida et al., (2013), no qual os autores ratificaram

a ação do monoterpeno e apoiaram a tese de que essa substância possui potencial

terapêutico em doenças dolorosas e inflamatórias. Vilela-Goulart et al., (2008)

84

estudaram a mucosite oral induzida em ratos e observaram uma redução no número

de células inflamatórias no local da lesão em decorrência de ação anti-inflamatória

do tratamento. Tanideh et al., (2014) testaram a ação do extrato de Hypericum

perforatum L. para tratar mucosite oral induzida em seus animais. O extrato dessa

planta contém borneol (CIV, 2012) e foi administrado por gavagem e por via tópica,

com a utilização de um gel oral. O extrato apresentou ação anti-inflamatória e

cicatrizante, principalmente por via sistêmica.

Segundo Robbins e Cotran (2010), a cura de feridas muco-cutâneas é

dividida em três fases que são inflamação, proliferação e maturação. A lesão inicial

leva a formação do coágulo que conduz a inflamação. Na fase proliferativa há a

formação de tecido de granulação, proliferação e migração de células do tecido

conjuntivo (fibroblastos e células do endotélio vascular que formam pequenos vasos

sanguíneos) e reepitelização na superfície da ferida. Com sete dias, o tecido de

granulação preenche toda e ferida e a neovascularização atinge o seu ponto

máximo. Por fim, a maturação envolve a deposição de matriz extracelular rica em

colágeno, o remodelamento do tecido e a contração da ferida. Nesse momento, a

quantidade de neutrófilos diminui e aumenta os macrófagos que fagocitam os restos

de tecido e outros materiais estranhos, dando condições para os fibroblastos

produzirem colágeno e fibronectina.

Os grupos tratados (Borneol 1,2% e Borneol 2,4%) apresentaram uma menor

quantidade de vasos sanguíneos que os grupos Gel base e Controle. Se por um

lado a cicatrização depende da neoformação de vasos sanguíneos, por outro lado, o

excesso no surgimento e a permanência por mais tempo desses vasos, pode

denotar a existência de inflamação crônica ou uma lesão tecidual persistente

(Fibrose). Fibrose é definida como deposição excessiva de colágeno e outros

componentes da matriz extracelular em um tecido submetido à inflamação crônica

(ROBBINS; COTRAN, 2010). Na análise histológica dos vasos sanguíneos, o grupo

controle apresentou um grande número de vasos sanguíneos no processo final da

cicatrização em comparação com os animais dos outros grupos (G2 e G3). Este fato

nos mostra que no grupo controle, o processo de cicatrização necessitou de uma

demanda maior de angiogênese para a formação do tecido de granulação

(ABRUCEZE, 2013).

Em estudo realizado por Lemos (2008), a angiogênese se mostrou como um

importante fator no desenvolvimento do processo fibroso, uma vez que precedeu o

85

depósito do colágeno, em todos os modelos estudados, independente do agente

etiológico. Até pouco tempo a angiogênese era vista apenas no contexto do

processo de reparo, onde naturalmente, após processo inflamatório crônico, o tecido

lesado iniciaria um depósito de material conjuntivo na tentativa de reparar os danos

causados ao tecido. Hoje, sabe-se que a angiogênese excessiva pode levar a

fibrose e a persistência da inflamação crônica.

O estímulo à proliferação de vasos sanguíneos é dado pelo Fator de

Crescimento do Endotélio Vascular (VEGF). Alguns fatores estimulam a expressão

da VEGF na angiogênese, a isquemia, assim como o aumento de certos fatores de

crescimento são os responsáveis pelo aumento da expressão do VEGF na

inflamação crônica e na cicatrização (NAGY et al., 2007). Como tecido inflamado

geralmente está em hipoxia, a inflamação pode promover a angiogênese induzindo a

liberação de fatores angiogênicos, levando a fibrose. O borneol apresentou ação

anti-fibrótica comprovada em estudo de Dai et al., (2009), no qual o monoterpeno

controlou a proliferação de fibroblastos. Eles mostraram que o borneol é benéfico

para a cicatrização da mucosa e pode ser usado com segurança como um

potenciador de penetração para outras substâncias.

Tanideh et al., (2014) também observaram aumento da estimulação da

produção de colágeno pela aplicação tópica de gel de Hypericum perforatum L., o

que ajudou na reparação das feridas, fechando a área danificada da mucosa oral

dos seus animais. Esse fato pode estar associado à ação bactericida do borneol, o

que impede a infecção secundária por fungos e bactérias, favorecendo a

reepitelização e a normalização do conteúdo de fibras colágenas (Tabanca et al.,

2001; Wenqiang et al., 2006).

86

7 CONCLUSÃO Os géis contendo borneol (1,2% e 2,4%) se mantiveram estáveis aos testes

de estabilidade e se mostraram eficazes no tratamento da mucosite oral induzida em

ratos quando comparados aos outros grupos (Borneol 0% e Controle). Além do

mais, os produtos mostraram adesividade nas mucosas dos animais e com

características tixotrópicas, o que facilitou a permanência do gel por mais tempo nos

locais das lesões, com isso, otimizando os efeitos locais do borneol.

O grupo G3 (Borneol 2,4%) foi estatisticamente superior aos outros três

grupos na avaliação semiquantitativa (escores de cicatrização), promovendo

aumento na reepitelização e cicatrização da mucosite oral quimicamente induzida.

Ambos os géis (Borneol 1,2% e Borneol 2,4%) foram eficazes nos parâmetros

avaliados: percentual de perda de peso, quantidade de células inflamatórias, número

de vasos sanguíneos e percentual de colágeno neoformado. Não houve diferenças

significantes (p< 0,05) entre os dois géis. Nesse caso, é preferível utilizar dose

menor por risco de ingestão, e com isso, a possibilidade de apresentar efeitos

tóxicos.

A constatação da ação anti-inflamatória e cicatrizante do borneol em

mucosites orais em ratos é um forte indicativo desta atividade para extratos vegetais

que sejam ricos nesta molécula. Diante desses resultados é possível afirmar que o

borneol apresentou ação anti-inflamatória e cicatrizante em mucosites orais

induzidas na mucosa jugal de ratos Wistar.

87

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102

ANEXO A - CARTA DE APROVAÇÃO DO PROJETO NO COMITÊ DE ÉTICA DA UNIVASF

103

ANEXO B - CARTA DE ACEITE.

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ANEXO C - ARTIGO ACEITO PELO BRAZILIAN JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES (QUALIS B2 – FARMÁCIA).

Anti-inflammatory and healing action of oral gel containing borneol

monoterpene in chemotherapy-induced mucositis in rats (Rattus norvegicus).

Braz José do Nascimento-Júnior1,3*, Lucas de Souza Brito2, Walquíria Nunes Barros3, Daniela

Marques Gonçalves3; Luana de Souza Matos3, Cínthia Reyjane Borges Nascimento3, Luciano

Augusto de Araújo Ribeiro3, Ricardo Santana de Lima2 , René Geraldo Cordeiro Silva-Júnior4,

Sílvio Alan Gonçalves Bomfim Reis5, Talita Mota Gonçalves2, Elba Lúcia Cavalcanti de

Amorim1

1Department of Pharmacy, Faculty of Pharmacy, Post Graduation Program in

Pharmaceutical Sciences, Federal University of Pernambuco, Recife, PE, Brazil, 2Department of Pathology, Faculty of Medicine, Federal University of São Francisco

Valley, Petrolina, PE, Brazil, 3Department of Pharmacy, Faculty of Pharmacy,

Federal University of São Francisco Valley, Petrolina, PE, Brazil, 4Department of

Experimental Practice, Faculty of Veterinary Medicine, Federal University of São

Francisco Valley, Petrolina, PE, Brazil, 5Laboratory of Pharmacotechniques in

Medicinal Plants, Department of Pharmacy, Faculty of Pharmacy, Federal University

of São Francisco Valley, Petrolina, PE, Brazil,

*Correspondence

B. J. Nascimento-Júnior

Departamento de Farmácia

Faculdade de Farmácia

Universidade Federal de Pernambuco

CEP: 56304-917 - Av. José de Sá Maniçoba, S/N – Centro - Petrolina/PE, Brazil.

Phone: +55 87 98807-5035; +55 87 2101-6862

E-mail: braz.jose@univasf.edu.br

The aim of this study was to investigate the effect of gels containing the monoterpene

borneol in induced oral mucositis using an animal model. Gels were prepared with

borneol at 1.2% and 2.4% (w/w). Oral mucositis was induced by administration of

three doses of 5-fluorouracil (30 mg/kg, i.p.) and injury with acetic acid (50%, v/v)

soaked in filter paper applied to right cheek mucosa for 60s. Four subgroups

comprising 12 animals each were formed. Six animals from each group were

105

sacrificed at days seven and fourteen after oral mucositis induction. Mucous samples

were processed and stained with hematoxylin-eosin and Masson’s Trichrome. The

semiquantitative evaluation involved observation of inflammatory parameters.

ImageJ® software was used in the quantitative evaluation. For statistical analyses,

Two-way ANOVA, followed by Tukey's post-test (p <0.05), were employed.Borneol

2.4% gel proved effective in the treatment of oral mucositis with statistically

significant differences between groups for angiogenesis control, inflammatory cell

count reduction and percentage neoformed collagen increase. The confirmation of

anti-inflammatory and healing action of borneol in oral mucositis in rats renders it a

good marker for predicting this activity for plant extracts rich in this substance.

Uniterms: bornyl alcohol, Chemotherapy, Palliative care.

INTRODUCTION

The clinical manifestations most commonly associated with treatment of

cancer of the oral cavity are oral mucositis (OM), osteoradionecrosis, dry mouth,

radiation caries, trismus, opportunistic infections and dysphagia, among others. OM

is an important complication of oncological treatments such as head and neck

radiotherapy, chemotherapy and Hematopoietic Stem Cell Transplantation (HSCT),

autologous or allogeneic, having a prevalence of 75%–99%. (Simões et al., 2011;

Patussi et al., 2014). Therefore, the healthcare team should have a broad knowledge

of all oral complications of anticancer therapy in order to improve patients´ quality of

life (Sera et al., 2013).

Among the different oral manifestations, mucositis is the most common and

distressing condition that develops as an acute adverse effect of chemotherapy and

radiotherapy of the head and neck and is one of the leading causes of disability that

limits cancer therapy dose. This complication leads to therapy alteration, dose

reduction, delay, interruption or termination and can negatively affect the healing

process. It is clinically characterized by erythematous and ulcerative lesions that

affect the vermilion of the lips and oral mucosa (Smith et al., 2007).

The use of medicinal plants and herbal medicines represents a good

alternative treatment approach for this patient group. Products containing Aloe vera

L., Leptospermum scoparium J.R. e G. Forst and Kunzea ericoides A. Rich have

been used to treat oral mucositis with satisfactory results (Rodriguez-Caballero et al.,

106

2012; Freitas et al., 2014.). Chamomile has been used in the treatment of OM with

promising results (Dos Reis et al., 2016; Braga et al., 2015; Curra et al.,2013; Pavesi

et al., 2011)

Also, Hypericum perforatum L. extract, whose phytocomplex contains borneol,

has shown anti-inflammatory and healing action in oral mucositis animal models both

systemically and locally through oral gel (Tanideh et al., 2014). Borneol (Figure 1) is

a monoterpene, bicyclic aromatic alcohol, present in many essential oils of medicinal

plants of the Dipterocarpaceae, Lamiaceae (Rosmarinus officinalis L., Thymus

vulgaris L. and Salvia officinalis L.) (Dipterocarpus turbinatus Gaertn.) Valerianaceae

(Valeriana officinalis L.) and Asteraceae (Matricaria chamomilla L.) families

(Horváthová et al., 2009; Borges et al., 2012). In Chinese and Indian folk medicine,

borneol is used in the treatment of sore throats, mouth sores, wounds, burns and

skin infections (Liu et al., 2009; Kong et al., 2014). Some studies indicate that

borneol has analgesic, anti-inflammatory, antioxidant, antibacterial and healing

actions (Horváthová et al., 2009; Liu et al., 2009; Barreto, 2013).

FIGURE 1 - Chemical structure of borneol (monoterpene, bicyclic aromatic alcohol).

Although borneol has been shown to be effective in lesions of the oral cavity,

the literature reports no pre-clinical models demonstrating its action in oral mucositis.

In order to fill this gap, the present study was conducted investigating the action of

gels containing borneol in 5-Fluorouracil-induced oral mucositis using an animal

model with Wistar rats.

107

MATERIALS AND METHODS

Plant Material

(+)-Borneol 97% was obtained in isolated and powder form (420247 - Sigma Aldrich,

USA), Synonym: endo-(1R)-1,7,7-Trimethylbicyclo[2.2.1] heptan-2-ol; CAS

Number: 464-43-7; Empirical Formula: C10H18O; Molecular Weight 154.25; Lot #

BGBB9812V. Preparation of aristoflex® gels containing borneol and stability tests.

Aristoflex polymer was mixed with methylparaben in water at ambient

temperature under stirring at 400 rpm (Heidolph RZR stirrer, Germany) for 30

minutes to complete gelation. The mixture was then incorporated into (+)-borneol

powder (Sigma-Aldrich, USA) at concentrations of 1.2% and 2.4%. The gels thus

obtained (30 g each, containing borneol at concentrations of 0%, 1.2% and 2.4%)

were packaged, labeled and analyzed for organoleptic (appearance, color and odor)

and physico-chemical (pH, conductivity and viscosity) parameters and also for both

primary and accelerated stability (Oliveira, 2009).

Animals

Male Wistar rats (300-350 g, 12-16 weeks, n = 48) were acclimatized for six

days prior to experiments and housed during the experimental period at 22 ± 2 ° C

under a 12/12h light-dark cycle with access to feed and water ad libitum. After the

onset of oral mucositis, the animals were tagged and randomly distributed into four

subgroups of 12 animals each: G1 Group (Borneol 0%); G2 Group (Borneol 1.2%);

G3 Group (Borneol 2.4%); and G4 group (Control). All animals were weighed at the

beginning and end of the experiment for clinical evaluation. Another 24 animals were

used in pilot tests for dose and technique adjustments, but not included in the results

of the study. The project was submitted to the Research Ethics Committee on the

use of animals (CEUA - UNIVASF) and was approved under permit 0001/140814 on

June 2nd, 2015.

Chemotherapy-induced oral mucositis

Oral mucositis was induced by administration of the 5-fluorouracil

chemotherapy drug (Eurofarma, São Paulo, Brazil) on days 0, 2 and 4 (30 mg/kg,

i.p.) according to Lima et al. (2015). On day two, the animals were anesthetized

[ketamine hydrochloride 10% (50 mg/kg) and xylazine hydrochloride 2% (5 mg/kg

i.p.), 0.4 ml per animal] and right cheek mucous chemically injured by applying 9 mm2

filter paper soaked in 10 µl of solution [glacial acetic acid 96% (50%, v/v) in distilled

water] for 60 seconds (Figures 2A, 2B and 2C).

108

FIGURE 2 - Experimental procedure for testing. A. Placement of filter paper soaked in 50% acetic

acid; B. Contact time with cheek mucosa of 60 s; C. Aspect of standardized lesion (9 mm2) after filter

paper removal; D. Appearance of gels used in treatments.

Treatment subgroups

The G1, G2 and G3 Groups received a daily application of gels at

concentrations of 0%, 1.2% and 2.4%, respectively, using disposable flexible swabs

(Figure 2D). The G4 Group (Control) received topical application with distilled water.

After the application, all animals were prevented from drinking water or eating for 30

minutes to allow time for the gels to act (Tanideh et al., 2014). The treatments were

administered from the third to 13th day after injury with acetic acid.

Mucous removal and histology procedure

Six animals from each group were sacrificed by deep anesthesia [ketamine

hydrochloride 10% (100 mg/kg) and xylazine hydrochloride 2% (10 mg/kg) i.p., 0.5 ml

per animal] on days seven and fourteen after injury. Subsequently, right cheek

mucous was removed from each animal with surgical scissors and scalpel blade

number 15 and placed in 10% neutral buffered formalin solution for 48h (Akgullu et

al., 2015).

Specimens were dehydrated, diaphonized, embedded in paraffin and cut

transversely into 5 µm-thick slices on a microtome (Leica Biosystems, Wetzlar,

Germany). Mucous samples were stained with hematoxylin-eosin (HE) and Masson’s

109

trichrome. All sections were mounted on glass slides with cover slips using Entellan

(Merck, Darms tadt, Germany) for microscopy.

Histological evaluation

Fields were scanned using a Leica® DM2500 microscope (Leica Biosystems,

Wetzlar, Germany) under x4 and x10 objective lenses, coupled to a CELESTRON®

Digital Microscope Imager Model 44421 camera (Torrance, California, United States)

using the software supplied with the digital camera. The same light intensity was

used in all digitalization; images were acquired in RGB format at a resolution of 2048

X 1536 pixels with JPEG extension. For quantitative analysis, the ImageJ® program

was employed using the plugin "Cell Counter" and the number of inflammatory cells

and amount of blood vessels stained with HE on the slides were measured. To

evaluate percentage collagen, the slides stained with Masson's trichrome were

photographed and then processed using ImageJ® and the Threshold plugin to

measure percentage collagen at the injury site (Vilela-Goulart et al., 2008).

The semiquantitative analysis was performed by a blinded evaluator who observed

inflammatory parameters including presence of cellular inflammatory infiltrate,

vasodilatation, necrosis, ulceration, abscess, hemorrhage and edema. These

parameters were attributed scores of 0-3, as described by Lima et al. (2005): Score 0

- normal epithelium and connective tissue without vasodilatation; absence of, or mild,

cellular infiltration; absence of hemorrhagic areas, ulcerations or abscesses; Score 1

- mild vascular ingurgitation, re-epithelization areas; mild inflammatory infiltration with

mononuclear prevalence; absence of hemorrhagic areas, edema, ulcerations or

abscesses; Score 2 - moderate vascular ingurgitation, areas of hydropic epithelial

degeneration, inflammatory infiltration with neutrophil prevalence, presence of

hemorrhagic areas, edema and some ulcerations, absence of abscesses; Score 3 -

severe vascular ingurgitation and dilatation, inflammatory infiltration with neutrophil

prevalence, presence of hemorrhagic areas, edema and extensive ulceration and

abscesses.

Statistical analysis

Comparisons for all variables were performed independent of day, between

days, independent of group and between groups. Quantitative and semiquantitative

variables were expressed as means. For comparisons, the two-way ANOVA test,

followed by Tukey's post-test, was used for comparisons. In all tests, p ≤ 0.05 was

adopted for the level of rejection of the null hypothesis for significant values.

110

RESULTS AND DISCUSSION

The formulation developed was stable and transparent with a smooth texture,

homogeneous appearance and characteristic aroma. Borneol 0% had pH = 5.0;

Conductivity = 100.0 mV; Viscosity = 58,500 mPa.s; and centrifugation without phase

separation. Borneol 1.2% had a pH = 4.7 ± 0.1; Conductivity = 120.2 ± 0.5 mV;

Viscosity = 45,360 mPa.s; and centrifugation without phase separation. Borneol 2.4%

had a pH = 4.5 ± 0.2; Conductivity = 139.0 ± 1.5 mV; Viscosity = 55,560 mPa.s; and

centrifugation without phase separation. Acid pH values were expected because the

Aristoflex® gel base was formulated with a pH of 5.0. In a previous study, the same

gel base had a pH of around 5.0, no phase change and good viscosity (Russo et al.,

2008). Furthermore, borneol is also considered an acid pH substance (Xiao-Fei et al.,

2008). Dantas et al. (2016) used a topical gel formulation with 5% borneol which had

a pH of 3.95.

FIGURE 3 – Wound healing score according to group and day of experimentation. ap<0.05: Control

vs. Borneol 2.4% (7 days) ; bp<0.05: Borneol 0% vs. Borneol 2.4% (7 days). cp<0.05: Control vs.

Borneol 2.4% (14 days). dp<0.05: Borneol 0% vs. Borneol 2.4% (14 days). (Two-Way Analysis of

Variance ANOVA, followed by Tukey's post-test).

At day seven, a statistically significant difference (p <0.05) in scores was found

for the G3 group (Borneol 2.4%) compared with both the G1 (Borneol 0%) and G4

(Control) groups. This result indicated better healing for Borneol 2.4% (Figure 3). G1

111

Group (Borneol 0%) exhibited extensive ulcers and hydropic degeneration,

spongiosis and exocytosis. Connective tissue (CT) showed moderate and diffuse

presence of polymorphonuclear cells (PMNs) with areas of necrosis and bleeding.

The G2 Group (Borneol 1.2%) showed ulcerated areas, hydropic degeneration,

spongiosis and exocytosis. CT showed areas of necrosis, presence of some

congested blood vessels, as well as moderate and diffuse presence of PMNs. The

G3 Group (Borneol 2.4%) had discrete hydropic degeneration, spongiosis, and partial

reepithelialization in five animals. CT showed PMNs and the presence of few

congested blood vessels. The G4 Group (Negative control) exhibited ulcerated

areas, hydropic degeneration, spongiosis and intense exocytosis. CT had edema and

necrosis, moderate congested blood vessels, as well as moderate and diffuse

presence of PMNs (Figure 4).

FIGURE 4 - Microscopic aspects of groups at seven days of experimentation. A Group treated with

gel base (Borneol 0%); B Group treated with gel (Borneol 1.2%); C Group treated with gel (Borneol

2.4%); and D Group (Negative control). PMN = Polymorphonuclear cells; BV = Blood vessel; U =

Ulcerated area; E = Exocytosis; ED = edema. Magnification x10. HE staining.

At day 14, a statistically significant difference (p <0.05) in scores was found for

the G3 group (Borneol 2.4%) compared with both the G1 (Borneol 0%) and G4

(Control) groups. This result indicated better healing for Borneol 2.4% (Figure 3). G1

Group (Borneol 0%) showed hyperkeratosis and full reepithelialization. CT had

112

congested blood vessels, as well as moderate and diffuse presence of Mononuclear

(MN) cells. The G2 Group (Borneol 1.2%) showed reepithelialization but with more

blood vessels in G3. CT showed numerous clogged blood vessels and a diffuse mild

chronic inflammatory process. The G3 Group (Borneol 2.4%) had a normal aspect

and full reepithelialization. CT showed normal features, in addition to granulation

tissue with fibroblasts, congested blood vessels and discrete, diffuse presence of

MN. The G4 Group (Negative Control) had acanthosis (thickened spinous layer) with

loss of integrity of basal membrane and exocytosis. Epithelialization occurred with

different morphology in four animals. The CT was found to contain a large amount of

granulation tissue with fibroblasts, congested blood vessels and chronic inflammatory

infiltrate (Figure 5).

FIGURE 5 - Microscopic aspects of groups at fourteen days of experimentation. A Group treated

with gel base (Borneol 0%); B Group treated with gel (Borneol 1.2%); C Group treated with gel

(Borneol 2.4%); and D Group (Control). RE = reepithelialization; HK= Hyperkeratinization; BV = Blood

Vessel; MN = Mononuclear; AC = acanthosis. Magnification x10. HE staining.

At seven days, the group treated with Borneol 2.4% showed a lower number of

vessels than the other groups (G1, G2 and G4). The G3 Group showed statistical

significance (p <0.05) when compared to the three other groups. The G2 Group

(Borneol 1.2%) showed statistically significant differences when compared to both

113

the G1 Group (Borneol 0%) and Control Groups. There were no differences between

the G1 and Control Groups. At 14 days, there was statistical significance between all

cross comparisons except the G1 Group and Control Group (Figure 6).

Control

Borneo

l 0%

Borneo

l 1.2

%

Borneo

l 2.4

%

0

5

10

15

207 days14 days

a

aa,b

b

c d

c,d

c,d

FIGURE 6 - Vessel count according to group and day of experimentation on anti-inflammatory

activity test of oral gel containing different concentrations of borneol. ap<0.05: Control vs. Borneol

1.2% and Borneol 2.4% (7 days) ; bp<0.05: Borneol 0% vs. Borneol 1.2% and Borneol 2.4% (7 days). cp<0.05: Control vs. Borneol 1.2% and Borneol 2.4% (14 days). dp<0.05: Borneol 0% vs. Borneol 1.2%

and Borneol 2.4% (14 days) (Two-Way Analysis of Variance ANOVA, followed by Tukey's post-test).

While healing depends on the neoformation of blood vessels, persistent or

excessive vessels may denote the existence of chronic inflammation or fibrosis

(Abbas et al., 2010). On histological analysis of the blood vessels, the Control Group

showed a greater number of blood vessels in the final process of wound healing

compared to the other groups (G2 and G3). This indicates that the healing process in

the Control Group required a greater angiogenesis for the formation of granulation

tissue (Abruceze, 2013).

The proliferation of blood vessels is stimulated by vascular endothelial growth

factor (VEGF). Some factors stimulate the expression of VEGF in angiogenesis and

ischemia, while increases in certain growth factors are responsible for the elevated

VEGF expression in chronic inflammation and wound healing. The inflamed tissue is

generally in hypoxia, where inflammation may promote angiogenesis by inducing the

release of angiogenic factors leading to fibrosis (Nagy et al., 2007). According to a

study by Dai et al. (2009), borneol showed anti-fibrotic action.

114

Regarding inflammatory cell count, the gels containing borneol at

concentrations of 1.2% and 2.4% exhibited anti-inflammatory action at seven and 14

days, reducing the number of these cells at the injury site. The Control Group and

Borneol 0% groups, at seven days, showed a much more intense inflammatory

process than the treated groups (Borneol 1.2% and Borneol 2.4%), but no

differences were observed between the two borneol concentrations. Cell infiltrates

were less intense in all groups at 14 days. Differences were observed between the

G1 Group and G3 Group and also between the two gels (Borneol 1.2% and Borneol

2.4%) compared to the Control Group, but no differences between the two

concentrations were evident (Figure 7).

FIGURE 7 - Inflammatory cell count according to group and day of experimentation. ap<0.05:

Control vs. Borneol 0%, Borneol 1.2% and Borneol 2.4% (7 days) ; bp<0.05: Borneol 0% vs. Borneol

1.2% and Borneol 2.4% (7 days). cp<0.05: Control vs. Borneol 1.2% and Borneol 2.4% (14 days)

(Two-Way Analysis of Variance ANOVA, followed by Tukey's post-test).

The findings for number of inflammatory cells corroborate the results of the

study by Almeida et al. (2013), in which the authors confirmed the action of

monoterpene and suggested that the substance has therapeutic potential in painful

and inflammatory diseases. Tanideh et al. (2014) tested the action of Hypericum

perforatum L. extract for treating induced oral mucositis in animals. The extract of this

plant contains Borneol (CIV, 2012) and was administered by gavage (systemically)

115

and locally via an oral gel. The extract showed anti-inflammatory and healing action,

especially systemically.

In the present study, percentage collagen at seven days showed statistical

significance on comparison of the G1 Group (Borneol 0%) with the G3 Group

(Borneol 2.4%) and also on comparisons of the G2 Group and G3 Group with the G4

Group (Control). Comparison of the G2 and G3 Groups with the G4 Group also

proved significant at 14 days (Figure 8).

FIGURE 8 - Percentage collagen according to group. ap<0.05: Control vs. Borneol 1.2% and

Borneol 2.4% (7 days) ; bp<0.05: Borneol 0% vs. Borneol 2.4% (7 days). cp<0.05: Control vs. Borneol

1.2% and Borneol 2.4% (14 days). dp<0.05: Borneol 0% vs. Borneol 2.4% (14 days) (Two-Way

Analysis of Variance ANOVA, followed by Tukey's post-test).

Percentage collagen in the G2 and G3 Groups on slides stained with Masson's

trichrome was higher than in both G1 and G4 Groups at 14 days. This was due to the

healing effect of borneol which promoted greater formation of fibroblasts with better

collagen and fibronectin production in local lesions (Figure 9). Tanideh et al. (2014)

also observed increased stimulation of collagen production by topical gel Hypericum

perforatum L., which helped repair the wounds, closing areas of damaged oral

mucosa in the animals. This effect may be associated with the bactericidal action of

borneol, which prevents secondary infection by fungi and bacteria, promoting

116

reepithelialization and standardization of collagen fiber content (Tabanca et al., 2001;

Wenqiang et al., 2006).

FIGURE 9 - Microscopic aspects of groups at fourteen days of experimentation. G1 Group treated

with gel base (Borneol 0%); G2 Group treated with gel (Borneol 1.2%); G3 Group treated with gel

(Borneol 2.4%); and G4 Group (Control). Note the greater quantity of newly formed collagen in treated

groups (G2 and G3). Magnification x10. Masson’s trichrome.

All animals lost weight throughout the experiment due to the side effects of 5-

Fluorouracil, oral mucositis and reduction in water and feed intake. At 14 days of

experimentation, the Borneol 2.4% Group had a lower percentage of weight loss

relative to the other three groups (Borneol 0%, Borneol 1.2% and Control), probably

due to the greater action of Borneol 2.4% in reducing inflammation and promoting

wound healing (Figure 10).

117

FIGURE 10 - Percentage weight loss according to group and day of experimentation. ap<0.05:

Control vs. Borneol 1.2% and Borneol 2.4% (14 days). bp<0.05: Borneol 0% vs. Borneol 1.2% and

Borneol 2.4% (14 days) (Two-Way Analysis of Variance ANOVA, followed by Tukey's post-test).

CONCLUSIONS

The Borneol 2.4% Group was superior to the Borneol 1.2%, Borneol 0% and

Control Groups in the treatment of induced oral mucositis in rats, promoting

angiogenesis control, inflammatory cell count reduction at the injury site and

percentage neoformed collagen increase in reepithelialization. The G3 group

(Borneol 2.4%) was statistically superior to the other three groups on the

semiquantitative evaluation, promoting improvement in reepithelialization and healing

of chemotherapy-induced oral mucositis.

The confirmation of anti-inflammatory and healing action of borneol in oral

mucositis in rats renders it a good marker for predicting this activity for plant extracts

rich in this substance. The study results showed that borneol has anti-inflammatory

and healing action in induced oral mucositis in cheek mucosa of Wistar rats.

ACKNOWLEDGMENTS

The authors extend their thanks to the Pharmacist Dr. Emanuel Jair

Gonçalves Souza Carvalho (FARMACE) for help in the production of gels and to the

FACEPE for financing the study and awarding doctoral fellowships.

118

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