Protokoll IA

Kreatinin

Angerer Tina (0520541) PR Instrumentelle Analytik

Bestimmung von Kreatinin in Urin mittels CZE

(Kapillarzonenelektrophorese)Aufgabenstellung:Es soll die Kreatinin-Konzentration einer Harnprobe mittelsKapillarzonenelektrophorese und externer Kalibrierung sowieStandardaddition bestimmt werden.

CE-Konditionen: Apparatur: Agilent 3D-CE Capillary Electrophoresis System Kapillare: fused silica, 60cm x 50µm I.D. Elektrolyt: 40mM Phosphatpuffer (pH 2,25 mit Triethanolamin) Injektion: Druckinjektion, 50mbar für 5s Trennspannung: +25kV Detektion: direkte UV-Detektion bei 210nm (Photodiodenarray)

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Durchführung:

Herstellen des Carrier Elektrolyten: 250mLPhosphorsäure (85%) wird mit destilliertem Wasser zu einerKonzentration von 40mM/L verdünnt, anschließend mit Triethanolaminder pH-Wert auf 2,25 eingestellt.

M(H3PO4)= 98,00g/mol40mmol/L →in 250mL 10mmol m(100%iger H3PO4 )=n x M= 0,010mol x 98,00g/mol= 0,98g

m(85%iger H3PO4)= = 1,153g H3PO4 einwiegen und auf 250mL

auffüllen, dann pH einstellen

Herstellen der Kalibrierlösungen:Kreatinin wird in destilliertem Wasser so gelöst, dass eine StockLösung mit einer Kreatinin-Konzentration von 250mg/L entsteht. Vondieser Stock Lösung werden Kalibrierlösungen mit den Konzentrationen250mg/L, 100mg/L, 50mg/L und 25mg/L hergestellt. Von jederKalibrierlösung wird ca 1 mL in ein CE-Fläschchen gefüllt.

250mg/L 25mg Kreatinin auf 100mL aufgefüllt (mit H2O) →Stocklösung100mg/L 20mL Stock auf 50mL aufgefüllt50mg/L 10mL Stock auf 50mL aufgefüllt25mg/L 5mL Stock auf 50mL aufgefüllt

Probenvorbereitung:Drei verschiedene Urinproben wurden ausgegeben. Jede Probe wird1:12,5 verdünnt, indem 2mL Urin in ein 25mL Fläschchen pipettert unddieses aufgefüllt wird (mit destilliertem Wasser). Die Lösung wirdfiltriert (0,45µm Spritzenfilter) und 1 mL davon in CE-Fläschchenüberführt. Zu Beachten gilt, dass bei biologischen Proben immerHandschuhe zu verwenden sind.

Standardlösungen:Für die Quantifizierung mittels Standardaddition werden folgendeLösungen hergestellt und in CE-Fläschchen gefüllt:

A) 800µL Urin + 200µL H2O

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B) 800µL Urin + 80µL Kreatinin Stock Lösung + 120µL H2OC) 800µL Urin + 200µL Kreatinin Stock Lösung

Messungen:Die Kalibrierlösungen werden, beginnend bei der höchsten Verdünnung,in das CE-Gerät platziert und analysiert. Die Ergebnisse werden dannverwendet, um eine Kalibriergerade zu erstellen und somit dieunbekannte Kreatinin Konzentration der Proben zu ermitteln. (externeKalibrierung)

Danach werden die 3 vorbereiteten Proben jeweils 3-mal analysiert.

Danach werden die Standardlösungen analysiert, womit die unbekannteKreatinin Konzentration der Proben bestimmt werden kann.(Standardadditionsmethode)

Protokoll der Messungen:Kapillare 2 min mit 1M NaOH und danach 5min mit ElektrolytspülenSample injizierenLaufzeit Trennung 10minNach 4-5 Läufen mit Puffer spülen

Auswertung:

Probe: 1:12,5 Verdünnung

Urin 1 Urin 2 Urin 3

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5,7800 20,0684 29,72005,3605 22,3264 22,04016,6393 19,9562 22,4490

Mittelw 5,9266 20,7837 24,7364StdAbweichun

g0,6519 1,3372 4,3208

Die 3 Urinproben wurden jeweils 3-mal injiziert, und der Mittelwertfür die Konzentrationsberechnung verwendet. Bei der Urinprobe 1scheint etwas schief gegangen zu sein, daher verwenden wir für dieweitere Auswertung den Wert der Standardaddition ohne Standard.

Vergleich der 3-fach Messungen der Urinproben 2 und 3:

Urin 2 - 210nm Urin 3 - 210nmPeakfläc

hePeakhöhe Migrationszei

t [min]Peakfläc

hePeakhöhe Migrationszei

t [min]20,06 7,52017 6,208 29,72001 7,61658 6,494

22,32641 8,48967 6,248 22,04014 8,16502 6,22219,95623 8,19615 6,151 22,44899 10,75778 6,334

Mittelwert

20,78088 8,06866333

6,202333333 24,73638 8,84646 6,35

Stabw. 1,33947351

0,49716416

0,04874765 4,32078877

1,67781248

0,13670406

Stabw.[%]

6,44570159

6,1616669

0,785956621 17,4673447

18,9659195

2,152819841

Die Dreifachmessung fand aus demselben Vial statt, d.h. es ist beiallen drei Messungen exakt dieselbe Probe. Die Unterschiede in denMessungen weichen auch nicht sonderlich voneinander ab, wobei die17,5% und 19% Standardabweichung bei Urin 3 schon grenzwertig sind.

Externe Kalibrierung:

Konzentrationen Creatinin Peakfläche25 6,464550 6,5712100 25,9652250 67,6793

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Berechnung der Konzentration mittels Externer Kalibrierung; Werte der Peakflächen vonStAddA (1:12,5 Verd und nochmalige 4:5 Verd.):

Peakfläche KonzentrationProbe

Konzentration Urin[µg/mL]

Probe 1 20,0374 76,16 1189,97Probe 2 16,1631 61,96 968,15Probe 3 16,7219 64,01 1000,15

Berechnung der Konzentration mittels Externer Kalibrierung; Werte der Peakflächen der 3-fach Urinmessungen (1:12,5 Verdünnung):

Peakfläche KonzentrationProbe


Probe 1 5,9266 24,45 305,64Probe 2 20,7837 78,89 986,16Probe 3 24,7364 93,38 1167,21

Anmerkung: Bei Probe 1 ist hier offensichtlich etwas schiefgegangen, da die Peakfläche hier viel zu niedrig ist und die Werteder Kreatinin-Konzentration in Urin 1 in beiden Tabellen ähnlichsein sollte. (Im Idealfall sollten die Werte gleich sein.)

Standardaddition:

Konzentrationen StdAdd Probe1

StdAdd Probe2

StdAdd Probe3

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StdAdd A 0 20,0374 16,1631 16,7219StdAdd B 20 25,2871 20,7312 22,4539StdAdd C 50 32,1570 30,3721 27,0058

Konzentration Probe[µg/mL]

83,70 54,76 86,20


1307,76 855,68 1346,88

Ergebnisse:

[µg/mL] ext.Kalibrierung

StAdd

Urin 1 1189,97 1307,76Urin 2 986,16 855,68Urin 3 1167,21 1346,88

Die Abweichungen sind leider sehr groß, was wohl auf Ungenauigkeitenbei der praktischen Arbeit zurückzuführen ist. Die gemessenen Werteliegen in einem realistischen Bereich, vgl. dazu die untenstehendeTabelle.

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Elektropherogramme Standardaddition 1A:

Standardaddition 1B:

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Standardaddition 1C:

Standardaddition 2A:

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Standardaddition 3A:

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Standardlösung 25mg/mL Creatinin:

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Urin 2.1

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Urin 2.2

Urin 2.3

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Urin 3.1

Urin 3.2

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Urin 3.3

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