Processamento manual em microondas: Comparação entre a utilização do xilol e do isopropanol

Processamento manual em microondas: comparação entre autilização do xilol e isopropanol

Processamento manual emmicroondas: Comparação entre autilização do xilol e doisopropanol

Duarte, Raquel Filipa

RESUMO.O processamento de tecidos é uma das etapas mais importantes na rotinahistológica de um laboratório de Anatomia Patológica. Este processo é feitoautomaticamente daí o presente estudo fazer o processamento manualmentereduzindo assim o tempo para um diagnóstico. O Processamento compreende trêsfases: a desidratação numa série crescente de álcoois, diafanização com xilole impregnação dos tecidos em parafina. O xilol é o agente diafanizador deeleição para a histopatologista, contudo por ser extremamente tóxico, seráestudado o isopropanol como substituto de xilol.Este presente estudo tem como objetivo reduzir o tempo de diagnóstico de umpaciente pelo processamento manual de tecidos, bem como reduzir a exposiçãodos técnicos de Anatomia Patológica ao xilol usando o isopropanol.Concluiu-se que o processamento manual de tecidos revela resultados idênticosao processamento automático e é aconselhado o uso do isopropanol.Palavras-chave: processamento de tecidos; xilol; isopropanol; diafanização;micro-ondas

Página | 1APCT|Raquel Duarte|Investigação em Anatomia Patológica


ABSTRACT

Tissue Processing is one of the most important steps of the routine in aPathology laboratory. This process is done automatically and the present studydo it manually thereby reduce the processing time for a diagnosis. Theprocessing consists of three stages: dehydration in an ascending series ofalcohols, leaf clearing with xylene and paraffin impregnation of tissue. Thexylene is the agent of choice for the histopathologist as a clearing agente,however due to its severe toxicity, isopropanol will be studied as itssubstitute.This present study aims to reduce the time of diagnosis of a patient by manualprocessing the tissues, as well as reduce the exposure of Pathologytechnicians to xylene, using isopropanol.It was concluded that the manual processing of tissues revealed similarresults to automatic processing and is recommended the use of isopropanol assubstitute.key words: tissue processing; xilol; isopropyl alcohol; clearing agente;microwave



INTRODUÇÃODepois da remoção de uma amostra detecido do paciente, esta é sujeita auma série de etapas para assegurarque as lâminas finais paradiagnóstico, sejam de qualidade. Ostecidos são expostos a uma série dereagentes que fixam, desidratam,diafanizam e fazem a impregnação,com a incorporação final num meioque fornece suporte para o tecido. A qualidade da preservação doscomponentes estruturais do tecido édeterminada pela escolha dereagentes e tempos expostos aosreagentes durante o processamento.Cada etapa do processamento detecidos é importante desde aaquisição da amostra, a seleção daamostra, determinar os protocolos ereagentes apropriados para usar, acoloração e diagnóstico final. A produção de lâminas de qualidadepara o diagnóstico exige habilidadesque são desenvolvidas através daprática e experiência continuada comnovas tecnologias e instrumentação.O processamento de tecidos emhistologia é um processo físico, queenvolve soluções químicas que reagemcom as amostras biológicas.

PROCESSAMENTO DE TECIDOS O Processamento de tecido éconcebido para remover toda a águaextraída dos tecidos, substituindo-apor um meio de suporte que

proporciona rigidez suficiente parapermitir que o tecido não sofradanos ou distorção.Este processo decorre em três fases,nomeadamente, a desidratação,diafanização e impregnação dostecidos. (Bancroft, J. D. (2002)A desidratação de tecidos tem comoprincipio a remoção de água efixador do tecido substituindo-o porum reagente desidratante como oetanol. Segue-se o passo dadiafanização que faz a remoção doagente desidratante (etanol)substituindo-o por um fluidomiscível, tanto com ele como com omeio de impregnação, que substitui oagente diafanizador pelo meio deimpregnação.A Parafina é o meio mais utilizadopara a impregnação, pois esta ébarata, de fácil manuseio na qual setraduz em poucas dificuldades nocorte. O processamento de tecidosautomático foi implementado em 1940,sendo que o processador tipocarrossel e os sistemas de troca defluidos foram os primeirosprocessadores de tecido automáticosutilizados no laboratório dehistologia (L. Ralph Rohr, M. L.(2011); este tipo de processadorfunciona através de contentores quecontêm os respetivos reagentes e sãocontrolados automaticamente, fazendocom que o cesto dos blocos de tecidosejam transferidos de contento em



contentor emergindo os blocos nosdiferentes reagentes. Estes dispositivos têm evoluídolentamente, para que seja maissegura a sua utilização, para lidarcom números de amostras maiores,tornar o processamento mais rápido eproduzir melhores resultados e dequalidade. Porém este tipo deprocessador demora em média 12h aterminar o processamento, ficando emovernigh para rentabilizar tempos narotina histopatológica.Existem situações em que oprocessamento de tecidos automáticonem sempre é possível de realizarsendo substituído pelo processamentomanual, que é raramente utilizadohoje em dia, contudo há exceções,nomeadamente, quando existe falha deenergia, mau funcionamento doequipamento e pequenas biópsias, queprecisam de um diagnóstico rápido(Anthony S.-Y. Leong, M. M. (2004). Este presente estudo tem comoobjetivo reduzir o tempo dediagnóstico de um paciente peloprocessamento manual de tecidos, bemcomo reduzir a exposição dostécnicos de Anatomia Patológica aoxilol usando o isopropanol comosubstituto.

XILOL Vs. ISOPROPANOLO xilol é o agente diafanizadoreleito para uso diário doslaboratórios histopatológicos. É umhidrocarboneto aromático amplamenteutilizado como solvente na indústria

e na tecnologia médica; é um gásincolor, que se encontranaturalmente no petróleo e alcatrãofresco, no entanto, este solventepode danificar as amostras de tecido(Birkner e Woltman, 2007).Como intuito de eliminar o uso doxilol no laboratório, numerosasalternativas foram investigadas(Ankle e Joshi 2011), tendo emconsideração o custo, a toxicidade,flamabilidade e que preserve amorfologia e as características dacoloração no tecido como oIsopropanol.O Isopropanol é um líquido incolor,inflamável com um odor alcoólicocaracterístico. Este é completamentemiscível com a maioria dossolventes, incluindo a água.É um agente desidratante, nãoutilizados frequentemente devido ásua lenta penetração nos tecidos,todavia este provoca um menorendurecimento.MATERIAIS E MÉTODOSForam utilizados fragmentos de rim efígado fixados em formaldeído,seguidos de processamento manual emmicro-ondas comparando os efeitos doisopropanol como substituto dexilol.Após fixação do tecido emformaldeído, enxaguou-se as cassetescom água para eliminar apossibilidade da precipitação desais aquando em etanol absoluto.Posteriormente as cassetes foramcolocadas num recipiente de plástico



e foi preenchido com etanol absolutoá temperatura ambiente (deve-serepetir este passo para enxaguar aágua). No processamento livre dexilol o etanol absoluto deve serpré-aquecido para assim enxaguartoda a água. De imediato as cassetes sãocolocadas no micro-ondas e aquecidas(4 minutos a uma temperatura de62ºC/600W e deixar repousar durante15 minutos e 3 minutos a 50ºC/600W esecar de imediato as cassetes, comxilol com isopropanolrespetivamente). Durante oaquecimento deve-se agitar ascassetes de 30 em 30 segundos. Após o repouso de 15 minutos, deve-se secar as cassetes e repetirnovamente o passo anterior. Deseguida as cassetes são levadas aoagente diafanizador (xilol 4 minutoa 67ºC/700W e isopropanol 3 minutosa 60ºC/600W).A impregnação dos tecidos é feitapela parafina a 60ºC 20 minutos aoque no processamento comisopropanol, as cassetes vãopreviamente ao micro-ondas durante2 minutos a 65ºC/700W.É seguida a rotina laboratorial deinclusão, corte e coloração dostecidos por Hematoxilina Eosina.RESULTADOSDe entre as amostras processadas,não foram observadas diferençassignificativas no processamento detecidos por micro-ondascomparativamente ao processamento

automático nem na substituição doxilol pelo isopropanol. No rim, houve uma ligeira retraçãotecidular no uso do isopropanol enotou-se endurecimento tecidular pósprocessamento o que levou adificuldades no corte de modo aevitar erros de técnica1.Usando o isopropanol, os artefactosestavam mais evidenciados em todasas amostras do que na utilização doxilol. Às condições a que sesubmeteram as amostras, oisopropanol tem propriedades maisagressivas nos tecidos, fazendo comque os cortes não adiram com tantafacilidade às lâminas e que tenhamtendência a degradar-se maisfacilmente.O detalhe nuclear na coloração de HEfoi bastante razoável, no entanto acitoplasmática foi muito melhor emtodas as amostras. Provavelmente,nas condições experimentais

utilizadas, é mais vantajoso aatuação de corantes citoplasmáticosnos tecidos. Apos o registomacroscópico, foi possível avaliar adureza dos tecidos, concluindo queapós o processamento os tecidosficam mais rígidos tanto com o uso



de ambos os reagentes, contudo estestorna-se friáveis e quebradiços como isopropanol.1


Figura 1 – figado fixado em formaldeido,processado por microondas utilizando o xilol eisopropanol como agente diafanizador, comcoloração de Hematoxilina-Eosina. A –sinusoides hepáticos com isopropanol 200x; B-

Figura 2 – figado de porco fixado em formaldeido,usando o isopropanol como agente diafanizador. (HE,400x)


DISCUSSÃO/CONCLUSÃOO principal problema na elaboraçãodeste mesmo trabalho foram ascondições a que se sujeitaram asamostras, pois o aparelho demicroondas é um aparelhoconvencional e não uma máquinatípica de um laboratório (al, C. C.(2012). Ao colocar os recipientescom os reagentes e as cassetes, nãoera mantida uma temperaturaconstante, mas sim um aumento damesma e o vácuo era também umacondição necessária para obtermelhores resultados, mas nestetrabalho era impossível o fazer.Fazendo-se uma atividadeexperimental com uma maioramostragem e um conjunto variado deprotocolos com tempos, potência econcentrações distintas a seremtestados, conseguir-se-ia obterresultados mais fidedignos.O processamento manual por micro-ondas foi Introduzido por Mayers em1970, que referiu que as radiações

do mico ondas desnatura asproteínas, podendo não ocorrer umaligação cruzada das moléculasproteicas, sendo necessária umafixação química (prévia ouposteriormente)Temperatura ótima de aquecimentoestima-se que varie entre os 50 e os65ºC., sendo que temperaturasinferiores levam a cortes dequalidade inferior e temperaturassuperiores conduzem a vacuolização,sobre coloração de citoplasma enúcleos picnótico.A desidratação deve ser realizadalentamente pois, se o gradiente deconcentração entre o fluido nointerior e no exterior do tecido forexcessiva, as correntes de difusãoque atravessam as membranas dascélulas durante a troca de fluidos,aumentam a possibilidade dedistorção das células. Por estarazão, as amostras são sempreprocessadas através de uma sériegradual de reagentes de concentraçãocrescente. Assim, a desidrataçãoexcessiva pode fazer com que otecido se torne duro, frágil, ereduzido..O isopropanol é miscível com aágua, o etanol e a maior parte dossolventes orgânicos, sendo que esteé frequentemente usado emprocessamento de micro-ondas, e nãocausar sobre endurecimento ouretração do tecido. (A. Pollak, D.C. (28 de Abril de 2013)


Figura 3 – rim de porco fixado em formaldeidoutilizando o isopropanol como agentediafanizador, corados por Hematoxilina-eosina


A Escolha do agente diafanizadordepende da sua rapidez na remoção doagente desidratante na sua fácilremoção pelo banho de parafina nosdanos mínimos provocados no tecidona sua Inflamabilidade, toxicidade ecusto.As maiorias dos agentes dediafanização são líquidosinflamáveis, que exigem prudência nasua utilização, em que o ponto deebulição deste dá uma indicaçãovelocidade de substituição deparafina fundida. Líquidos com umponto de ebulição baixo sãogeralmente mais facilmentesubstituídos.

Neste presente estudo, a amostragemé muito reduzida para que se possamtirar verdadeiramente as conclusõesaguardando futuras investigações;apenas com este estudo não se podeconcluir que o isopropanol poderáser um bom substituto para o xilolno processamento de tecidos emmicro-ondas.

BIBLIOGRAFIA

Academic Editors: A. Pollak, D. C. (28 de Abril de 2013). Propranolol in Usefor Treatment of Complex Infant Hemangiomas: Literature Review RegardingCurrent Guidelines for Preassessment and Standards of Care before Initiationof Therapy.

al, C. C. (2012). Domestic microwave processing for rapid immunohistochemicaldiagnosis of bovine rabies.

Anthony S.-Y. Leong, M. M. (2004). Microwaves and Turnaround Times inHistoprocessing. Is This a New Era in Histotechnology?

Bancroft, J. D. (2002). Theory and Practice of Histological Techniques. ChurchillLivingstone.

DVORAK, G. R. (11 de Novembro de 1987). Microwave fixation provides excellentpreservation tissue, cells and antigens for light and electronmicroscopy .

K. KAYSER, H. S. (2010). Rapid microwave fixation- a morphometric study .

L. Ralph Rohr, M. L. (2011). A Comparison of Routine and Rapid MicrowaveTissue Processing in a Surgical Pathology Laboratory. Quality of HistologicSections and Advantages of Microwave Processing.



Morale, A. R., & et.al. (2004). Experience With an Automated Microwave-Assisted Rapid Tissue Processing Method. Validation of Histologic Quality andImpact on the Timeliness of Diagnostic Surgical Pathology.

Temel, S., S , N., I, C., & Z, K. (25 de Março de 2005). A simple and rapidmicrowave-assisted hematoxylin and eosin staining method using 1,1,1trichloroethane as a dewaxing and a clearing agent.

Vincent James Cogliano, e. a. (Setembro de 2005). Meeting Report: Summary ofIARC Monographs.

Visinoni F, M. J. (1998). Ultra-rapid microwave/Variable Pressure-InducedHistoprocessing: description of a new tissue processor.


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