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Présentation à la surface de phages filamenteux :

les multiples applications du phage display

Christelle Souriau, The Duc Hua, Marie-Paule Lefranc, Mylène Weill

La présentation à la surface de phages filamenteux, lephage display, est devenue un très puissant outil desélection et de synthèse combinatoire des protéines. Lesphages filamenteux peuvent présenter à leur surface despeptides aléatoires, des protéines ou encore des fragmentsd’anticorps. Les banques de peptides exposés sur phage ont étésélectionnées avec succès sur différentes cibles purifiées.Les sélections sur anticorps monoclonaux caractérisentrapidement des épitopes tandis que les sélections surrécepteurs ou sur enzymes identifient de nouveaux ligandset de nouveaux substrats. Les banques combinatoires de fragments d’anticorps ontpermis d’isoler des anticorps dirigés contre un très grand

nombre d’antigènes différents. Les banques dites naïves nenécessitent pas d’immunisation et sont particulièrementintéressantes pour isoler des anticorps humains ou desanticorps dirigés contre des protéines très conservées.De nouveaux protocoles permettent maintenant lessélections sur des cibles complexes telles que des cellules,des sérums de patients ou des tissus.Enfin, une protéine active exposée sur phage peut êtresoumise à différentes modifications suivies de sélectionssur une cible. Cette « évolution in vitro » représente unpuissant outil d’analyse des relations entre la structure etla fonction d’une molécule.Cette revue décrit différentes applications développées dansun nombre croissant de laboratoires.

DOSSIERmédecine/sciences 1998 ; 14 : 300-9

La présentation de peptides àla surface de phages filamen-teux a été démontrée pour lapremière fois par GeorgesSmith en 1985 [1], mais il a

fallu attendre quelques années pourcomprendre l’importance de ce puis-sant outil de sélection [2, 3]. Lesphages filamenteux sont utilisés pourprésenter à leur surface, en fusionavec le domaine amino-terminal deleurs protéines pIII ou pVIII, desmolécules telles que des peptidesaléatoires [3], des fragments d’anti-corps (Fab, Fv ou scFv single chain F)[4] ou d’autres protéines (figure 1A).Les phages recombinants sont sélec-tionnés pour leur capacité de liaisonà une cible (figure 2). Après de nom-breux lavages, les phages fixés sontélués puis isolés et amplifiés parinfection de bactéries. Les phages

amplifiés sont sélectionnés à nouveausur la même cible. Après 3 à 4 toursde sélection-amplification, les phagessélectionnés sont analysés et testéspour l’activité recherchée. Des pres-sions de sélection différentes peuventêtre introduites à chaque tour ainsiqu’une diversité additionnelle parmutagenèse. Cette stratégie fondéesur la sélection est nettement pluspuissante qu’une stratégie de cri-blage classique qui nécessite de nom-breuses manipulations. Il est en effetpossible de cribler 106 à 1010 molé-cules recombinantes différentes dansun volume réduit de quelques micro-litres. De plus, l’association de la pro-téine exposée en surface (phéno-type) avec son ADN codé par lephage (génotype) permet d’accéderrapidement aux séquences des molé-cules sélectionnées car l’ADN est

directement isolé avec la protéinepour laquelle il code. Cette méthodeest très efficace puisqu’il est possiblede sélectionner un phage dont la fré-quence était de 1/108 dans la banqueoriginale. Le nombre croissant depublications apparues ces dernièresannées indique que la technologiedu phage display représente un outilperformant pour de très nombreusesapplications.

Les banques de peptidessur phage

Construction

Les banques de peptides sont engen-drées par clonage d’oligonucléotidesaléatoires en 5’ des gènes pIII oupVIII d’un phage filamenteux. Lalongueur des peptides fusionnés avec

TECHNIQUE

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pIII ne semble pas perturber la mor-phologie du phage. En revanche, lenombre important de protéinespVIII en surface limite la taille despeptides fusionnés à environ 8 acidesaminés pour éviter les phénomènesd’encombrement stérique. Pourexposer des peptides plus longs oupour diminuer la valence des molé-cules présentées il est nécessaired’utiliser des vecteurs phagemides

qui permettent une dilution des pro-téines fusionnées par des protéinessauvages issues du phage auxiliaire(figure 1B). Un facteur limitant lataille des peptides est en fait la taillede la banque nécessaire pour quetous les peptides aléatoires possiblessoient représentés. L’efficacité declonage est telle qu’au-delà de 6 à7 acides aminés les banques obtenuessont partielles puisqu’elles nécessi-

tent plus de 1011 transformants [5].Cela n’est pas forcément gênantpuisque de telles banques ont pu êtrecriblées avec succès.Les banques sont régulièrement régé-nérées, contrairement aux banqueschimiques qui, elles, s’épuisent.Cependant, le caractère « vivant » deces banques biologiques peut présen-ter certains désavantages. De nom-breux clones, ceux qui sont toxiques

Vecteur phage pIII

Gène III Gène étranger

ori f1

Vecteur phagemide pIII

Gène III Gène étranger

ori f1

ori pBR322

+ phage auxiliaire

Moléculeétrangère

pIII

Gène IIIchimérique {

B

pIII

930

nm

pVI

pVII-pIX

pVIII

A

6,5 nm

Figure 1. A. Représentation schéma-tique du bactériophage filamenteuxfd. Le phage présente une longueurde 930 nm et un diamètre de 6,5 nm.Son ADN est logé à l’intérieur d’uncylindre flexible composé d’environ2 700 monomères de protéine pVIII.Une extrémité de la particule pré-sente 5 copies des protéines pVII etpIX tandis que l’autre extrémité pré-sente 5 copies des protéines pIII etpVI. Les protéines pIII exposées surla tête du phage sont impliquéesdans l’attachement aux pili de la bac-térie hôte qui précède l’infection. Lesprotéines pVIII composent le man-teau du phage. B. Exemple d’expres-sion à la surface d’un vecteur phageou d’un vecteur phagemide. Dans lecas d’une expression à la surfaced’un vecteur phage pIII, toutes lesprotéines pIII du phage sont fusion-nées à la molécule étrangère. Dansle cas d’une expression à la surfaced’un vecteur phagemide pIII, la pro-téine pIII du phagemide fusionnée àla molécule étrangère et la protéinepIII sauvage codée par le phage auxi-liaire sont exprimées dans la mêmecellule. Plusieurs combinaisonsd’expression sont possibles et lenombre de molécules étrangèresexprimées en surface est variable.

pour l’hôte, ceux qui sont sensiblesaux protéases endogènes, ceux quisont faiblement traduits ou sécrétésou ceux qui diminuent le pouvoirinfectieux des phages, peuvent êtreabsents d’une banque théoriquementcomplète. De plus, une à deux ampli-fications successives appauvrissentconsidérablement la diversité d’unebanque car certains clones présententdes avantages de pousse et envahis-sent rapidement la population. Larégénération d’une banque nécessitedonc un reclonage des insertions etnon pas une simple amplification. Lasélection de phages recombinantsissus de banques différentes, sur unemême cible, identifie parfois des pep-tides différents révélant ainsi l’impor-tance du contexte de présentationdes peptides. Les séquences flan-quantes sont importantes, et un pep-tide peut perdre totalement ses capa-cités de liaison s’il est synthétiséchimiquement sous forme soluble.Ces observations ont orienté les cher-cheurs vers la construction debanques « contraintes ».Les banques dites contraintes présen-tent les peptides aléatoires dans uneconformation qui accepte peu dedegrés de liberté. Les peptides peu-vent être cycliques (leur séquence estflanquée de deux cystéines formantun pont disulfure), ou abrités dansdes structures fixes d’autres protéinestelle qu’une boucle hypervariabled’un domaine VH d’immunoglobu-line. Une étude systématique dumode de présentation semble indi-quer que les peptides contraints pré-sentent souvent des affinités et desspécificités de liaison supérieures auxpeptides linéaires et sont plus infor-matifs sur les sites de liaison. De plus,les versions solubles conservent engénéral leur capacité de liaison.

Applications

Sélection sur différentes ciblesLes banques de peptides permettentla sélection rapide de peptidescapables de se fixer sur une cibleimmobilisée. En général, la sélectionrévèle plusieurs peptides différentsqui définissent un ou plusieursconsensus. Les consensus sont ensuitetestés sous forme soluble pour l’acti-vité recherchée. Lorsque aucun

consensus ne peut être obtenu, il estsouvent difficile et onéreux de testerchaque peptide séparément. Un nou-veau protocole de sélection ou unenouvelle banque sont alors utilisés.

La cible est un anticorps monoclonalC’est certainement l’application laplus fréquente de la sélection de pep-tides sur phage. La localisation duconsensus sélectionné dans laséquence de l’antigène (celle-ci estgénéralement connue), permet l’iden-tification de l’épitope de l’antigènereconnu par l’anticorps. L’identitéentre le consensus et l’épitope n’estsouvent que partielle mais des expé-riences de compétition permettent devalider l’interaction. De nombreuxépitopes linéaires ont pu être ainsi car-tographiés (pour revue [6]). Lorsquel’épitope recherché est conformation-nel ou discontinu, les séquencesconsensus identifiées ne présententpas d’analogie avec le ligand naturelde l’anticorps. Les peptides sélection-nés correspondent dans ce cas à desmimotopes. Il est également possiblede mettre en évidence des épitopesmodifiés de manière post-traduction-nelle. Westendorf et al. (ScrippsResearch Institute, La Jolla, CA, USA)ont phosphorylé une banque de pep-tides de 15 acides aminés et l’ontensuite sélectionnée sur l’anticorpsMPM2 dirigé contre des phosphopro-téines de la phase M des cellules euca-ryotes. Après trois tours de sélection,ils ont mis en évidence une séquenceconsensus fixant l’anticorps unique-ment sous sa forme phosphorylée [7].

La cible est une protéine La sélection de peptides sur protéinepurifiée permet, comme dans le casd’une sélection sur anticorps, d’iden-tifier le site de liaison d’un ligandnaturel dont la séquence est déjàconnue. En général, l’interrogationde bases de données à partir duconsensus obtenu ne permet pasd’identifier un partenaire nouveau.Pour ce type de projets, le systèmedouble hybride ou les banques deproduits d’ADN complémentaires(ADNc) exposés sur phages (voirplus loin) semblent plus adaptés.Cependant les banques de peptidessur phages représentent un moyenrapide d’identifier les sites d’interac-

tion entre deux protéines connues.La sélection de peptides sur le pro-duit de l’oncogène HDM2 a permisde confirmer son interaction avec laprotéine p53 et d’identifier un pep-tide potentiellement thérapeutiquecapable d’inhiber l’interaction de cesdeux protéines (pour revue [8]).Plusieurs laboratoires ont isolé despeptides sur des protéines dont leligand naturel n’est pas peptidique. Lasélection sur streptavidine identifie lepeptide HPQ (His-Pro-Gln) qui entreen compétition avec la biotine [9]. Lasélection sur concanavaline A, une lec-tine qui fixe l’α-D-mannopyranoside,identifie le peptide YPY (Tyr-Pro-Tyr)qui entre en compétition avec le sucreet présente une affinité comparablepour la cible [10]. Ces deux exemplesmontrent que des peptides peuventmimer un ligand naturel non pepti-dique sans pour autant former lesmêmes contacts avec la cible.

La cible est de l’ADN La compréhension du mode de recon-naissance protéine-ADN est compli-quée car il n’existe pas de correspon-dance simple établie entre acidesaminés et nucléotides. Les protéines àdoigts de zinc représentent un modèleidéal pour étudier le mode de recon-naissance de l’ADN car chaque doigtde zinc reconnaît précisément 3 pairesde bases consécutives. Choo et Klug(Cambridge, GB) ont mis au pointune méthode d’analyse systématiqued’une banque de doigts de zinc expri-més sur phage pour établir une basede données doigt de zinc/ADN [11].Ils ont utilisé ce « code syllabique »pour trouver les doigts de zinc sefixant sur une séquence de 9 pb repré-sentant la jonction des oncogènesBCR et ABL sur l’ADNc p190 BCR-ABL. Les doigts de zinc se fixant surchacun des trois codons ont été asso-ciés dans l’ordre approprié puis testéssur la séquence cible. La spécificitéobtenue in vitro est remarquable et laprotéine en doigt de zinc synthétique,produite dans des cellules eucaryotes,bloque la transcription de l’ADN pos-sédant la séquence cible.

La cible est un récepteur purifiéLa sélection sur récepteur purifiéreprésente un immense intérêt phar-macologique. Le but ici est de trou-

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ver de nouveaux agonistes ou antago-nistes sans se préoccuper du côté« naturel » de ces molécules. De nom-breuses sélections ont été réaliséesavec succès. La sélection sur le récep-teur de l’érythropoïétine (REPO) aidentifié plusieurs peptides cycliquesdont les séquences diffèrent de cellede l’érythropoïétine et qui se fixentplus faiblement sur le récepteur. Lesétudes fonctionnelles montrent qu’ilsinduisent la dimérisation du REPO,la transmission du signal associé ainsique la croissance et la différenciationde cellules murines (pour revue [8]).Ce travail important montre qu’il estpossible de sélectionner de petitspeptides biologiquement actifs,capables de mimer des hormones, etreprésentant une nouvelle classe de

molécules thérapeutiques (m/s n° 10,vol. 12, p. 1124). Les sélections surintégrines, protéines impliquées dansl’adhérence cellulaire, identifient lesconsensus RGD (Arg-Gly-Asp) etKGD (Lys-Gly-Asp) (pour revue [6]).Ces deux peptides sont présents dansles venins de serpents connus pourinhiber l’agrégation plaquettaire. Ilsinhibent la liaison de nombreusescellules à la fibronectine.

La cible est un mélange complexeSélection sur cellulesLa sélection sur cellules est très impor-tante puisque de nombreuses ciblessont des récepteurs transmembra-naires difficiles à purifier ou à recons-tituer sans membrane, ou encore desrécepteurs inconnus. Le problème

majeur rencontré est évidemment lebruit de fond car de nombreux phagesse fixent de manière non spécifiquesur la surface cellulaire. Plusieursessais sont réalisés dans différents labo-ratoires et pour l’instant peu de résul-tats sont publiés. Il semble importantde choisir des récepteurs fortementexprimés et d’éluer les phages fixéspar compétition avec un agoniste. Ilest possible de pratiquer des sélectionsdites négatives sur des cellules qui nepossèdent pas le récepteur cible pourépuiser la banque de tous les phagesnon concernés. Une stratégie promet-teuse consiste à surexprimer le récep-teur cible dans deux types cellulairesdifférents. La sélection de peptides enalternance sur les deux types cellu-laires permet de se débarrasser pro-gressivement du bruit de fond. Lasélection sur plaquettes entières a per-mis d’isoler plusieurs peptides dont lepeptide RGD, déjà isolé sur intégrinespurifiées et connu pour inhiber l’agré-gation plaquettaire (pour revue [8]).Sélection sur animalUn travail novateur démontre la pos-sibilité de sélection in vivo. Aprèsinjection intraveineuse d’une banquede peptides cycliques à une souris, lesdifférents organes de l’animal ont étébroyés et les phages correspondantsamplifiés [12]. Plusieurs tours desélection ont permis d’identifier despeptides qui présentent une fortespécificité pour le cerveau et les vais-seaux du rein. Certains organes, telsque le foie ou les poumons, captu-rent trop de phages et rendent lasélection impossible. Des globulesrouges recouverts de ces peptidesspécifiques ont ensuite été injectéspar voie intraveineuse puis localisésdans les organes cibles. Ces expé-riences ouvrent un champ importantd’applications pour le ciblage spéci-fique de médicaments dans certainescellules (en particulier les cellulestumorales) ou dans certains tissus.Sélection sur sérums de patientsLa sélection de peptides sur sérumsde patients permet d’identifier desépitopes spécifiques de maladiesinfectieuses ou auto-immunes sansavoir besoin de connaître la naturede l’antigène pathogène. Les pep-tides isolés réagissent contre les anti-corps présents dans les sérums demalades mais pas avec ceux des

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Phages sélectionnés

Phage

pIIIpIII

pIII

ExpressionSélectionClonage

- anticorps- protéine- récepteur- ADN- cellule…

LavagesÉvolution

Infection

Amplification

Cible

- peptides- anticorps- produits d'ADNc- mutants…

ADN

Répertoire de molécules

Figure 2. Sélection d’un répertoire de molécules exprimées à la surface dephages filamenteux pour leur liaison à une cible (biopanning). Le mélangede phages est incubé avec la cible en milieu de saturation. Après plusieurslavages, les phages fixés sont élués puis utilisés pour infecter des bactériesen phase exponentielle de croissance. Les phages sélectionnés sont ensuiteamplifiés puis utilisés pour un nouveau tour de sélection.

sérums témoins. En fait, ces peptidesmiment l’antigène pathogène (pourrevue [8]). L’immunisation à l’aidede ces peptides immunogènes peutreprésenter un moyen rapide de pro-duire des anticorps neutralisants.

Sélection de phages-substratsL’équipe de Jim Wells (Genenteh,CA, USA) a développé une approcheastucieuse pour sélectionner des sub-strats de protéases [13]. Ils ontexprimé sur phage, de façon mono-valente, des protéines de fusion tri-partites qui possèdent un domaineamino-terminal capable de se fixersur un support solide, suivi d’uneséquence peptidique aléatoire (sub-strat potentiel de protéases), puis dudomaine carboxy-terminal de pIII.Après fixation sur le support solide,les phages qui expriment les substratspotentiels sont traités par la protéaseétudiée (la subtilisine ou le facteurXa). Les phages qui exposent unpeptide substrat sont alors libérés etamplifiés, alors que les phages quiexposent un peptide résistant à laprotéolyse restent fixés (figure 3).Cette technique a également étéappliquée à d’autres enzymes [13].

ImmunisationPar définition, les peptides isoléspour leur liaison à un anticorps peu-vent présenter certaines propriétésd’anti-idiotypes telles que le pouvoirimmunogène (pour revue [6]). Il estparfois possible d’identifier desmimotopes qui ressemblent à l’anti-gène original, mais qui sont suffisam-ment dégénérés pour présenter diffé-rents spectres de réactions croisées.Par exemple, un mimotope sélec-tionné sur un anticorps spécifiqued’un sous-type du virus de l’hépatiteB (HBV) a permis d’induire uneréponse humorale anti-HBV non res-treinte et donc plus protectrice. Ils’agit cependant de cas heureux caril arrive également que les anticorpsdirigés contre des peptides mimo-topes ne soient pas capables dereconnaître l’antigène original et,dans ce cas, les mimotopes injectésne présentent aucun pouvoir protec-teur. Le phage lui-même représenteun excellent vecteur pour l’immuni-sation. Greenwood et al. (Cambridge,GB) ont exposé le peptide corres-

pondant à l’antigène de surfacemajeur de Plasmodium falciparum à lasurface de pVIII. Les phages porteursde peptides injectés se sont avérésfortement immunogènes [14]. Il estpossible d’imaginer la constructionde phages « super-immunogènes »présentant simultanément des épi-topes B et T ainsi qu’une cytokineimmunostimulante.

Les banquescombinatoires d’anticorps

Une application essentielle du phagefilamenteux a été la construction debanques combinatoires de fragmentsd’anticorps (pour revue [4, 15]). Lesdomaines variables d’un anticorpspeuvent être exprimés sur phage, soitsous forme de fragments scFv (singlechain Fv), dans lesquels les domainesVH et VL réarrangés sont liés demanière covalente par un court pep-tide, soit sous forme de fragmentsFab. Cette technique a permisd’obtenir de nombreux anticorps

monoclonaux et s’est avérée particu-lièrement intéressante dans le casd’anticorps humains pour lesquelsles hybridomes sont techniquementet éthiquement difficiles à obtenir.Le répertoire immunitaire naïf d’unanimal (répertoire avant la rencontreavec les antigènes) contient des anti-corps capables de se fixer sur la plu-part des molécules avec des affinitésmodérées (Ka ~ 106-107 M– 1). Cerépertoire dérive du réarrangementcombinatoire des différents gènes Vdans les cellules souches (figure 4).Chaque cellule B (~ 108 chez la souriset 1012 chez l’homme) exprime uneseule combinaison VH et VL, quirésulte d’un réarrangement V-D-Jpour la chaîne lourde et V-J pour lachaîne légère. L’immunisation induitla prolifération des cellules B quireconnaissent l’immunogène, leurdifférenciation en plasmocytes et lasécrétion de l’anticorps correspon-dant. Une maturation de l’affinitédes anticorps est effectuée par unprocessus de sélection d’hypermuta-

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Phages-substrats sélectionnés

Expression sur phage

hGHrécepteur

Digestion par protéaseInfection

+ phage auxiliaire

ADNc de substrats de protéase potentielsclonés dans un phagemide

Protéase

hGH pIII

Figure 3. Sélection de phages-substrats. Les phages monovalents codantpour des substrats potentiels fusionnés à l’hormone de croissance (hGH,human growth hormone), sont incubés avec le récepteur de l’hormone (hGHrécepteur). Après traitement par la protéase d’intérêt, les phages porteurs depeptides substrats sont libérés et utilisés pour infecter des bactéries enphase exponentielle. Les phages sélectionnés peuvent éventuellement êtreamplifiés pour réaliser une nouvelle sélection.

tions somatiques. C’est à ce stade queles cellules B sont généralementrécoltées pour préparer les hybri-domes.Les gènes réarrangés VH et VL desanticorps peuvent être amplifiésséparément par PCR (polymerasechain reaction), associés au hasard,puis clonés dans des phages permet-tant d’obtenir ainsi des banquescombinatoires (figure 4). Dans le casde banques construites à partird’une source « immunisée », desfragments d’anticorps de forte affi-nité pour l’immunogène peuventêtre sélectionnés directement. Dansle cas de banques construites à par-tir du répertoire naïf, des anticorpsd’affinité modérée peuvent êtresélectionnés contre une grandevariété d’antigènes sans recourir àl’immunisation [16]. Les banquescombinatoires naïves dites natu-relles, sont construites à partir desgènes réarrangés VH (V-D-J) et VL(V-J) de l’animal. Les banques com-binatoires naïves dites synthétiques,sont construites à partir des diffé-rents gènes (V, D, J) non réarrangés.Leur réarrangement est réalisé invitro par PCR. L’utilisation d’oligo-nucléotides aléatoires correspon-dant aux régions CDR (complementa-rity determining regions) [17] permetd’augmenter la diversité de labanque. Il a été montré que plus labanque combinatoire naïve est com-plexe, plus il est possible d’isoler desanticorps contre n’importe quelantigène et plus leur affinité est éle-vée. L’infection combinatoire a per-mis d’obtenir des banques naïves deplus de 1010 fragments Fab différentsprésentant de bonnes affinités (Ka~ 108-109 M– 1) pour une très grandevariété d’antigènes [18]. Bien desaspects du système immunitairenaturel sont donc ainsi copiés. Sou-vent, des processus de maturation invitro doivent être appliqués pourobtenir les « meilleurs » anticorps enterme de spécificité et d’affinité. Lespermutations de chaînes qui ontlieu durant le développement descellules B peuvent être mimées invitro par la technique de l’échangede chaînes (chain shuffling) danslaquelle une chaîne (VH ou VL) estgardée puis réassociée à toutes lesautres chaînes de la banque (pour

revue [4]). La maturation de l’affi-nité est également assurée par intro-duction de mutations dans les CDRdes fragments sélectionnés.Le système artificiel des banquescombinatoires s’est donc avéré parti-culièrement intéressant pour touteproduction d’anticorps pour laquellel’immunisation est difficile voire

impossible. C’est le cas de certainsanticorps humains ou encore d’anti-corps dirigés contre des moléculestrès conservées non immunogènes. Ilest également utile pour l’étude durépertoire immunitaire de patientsinfectés par certains virus pathogènesou de patients atteints de maladiesauto-immunes [19].

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Réarrangement

Cellule souche Plasmocyte

Expansion clonale

Maturation

Immunisation

IgM, IgGForte affinité

IgMIgD

Faible affinité

V

V

D J

J

V

V

D J

J

Cellule B

V

V

D J

J

In vivo

In vitro

Sang, moelle osseuse, rate

Clonage des gènesV, D, J ou V, J réarrangés

Clonage des gènesV, D, J ou V, J non réarrangésRéarrangement par PCR

Anticorps de faible affinitécontre n'importe quel antigène

Anticorps de forte affinitécontre l'immunogène

Banqueimmunisée

SélectionSélection

Banque naïve"naturelle"

Banque naïvesynthétique

Figure 4. Production d’anticorps. In vivo, après réarrangement des différentsgènes variables dans les cellules B, les anticorps naïfs sont exprimés en sur-face sous forme d’IgM et d’IgD. Après immunisation, les clones qui recon-naissent l’immunogène prolifèrent (expansion clonale) et se différencient enplasmocytes qui sécrètent les anticorps sous forme d’IgG (commutation declasse). Des mutations somatiques (représentées dans le schéma par despoints rouges), s’accumulent dans les régions variables et conduisent, aprèssélection, à une augmentation de l’affinité des anticorps pour l’immunogène.Les banques combinatoires permettent de mimer ce processus in vitro.

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Banques de produitsd’ADN complémentairesprésentés sur phagefilamenteux

La présentation de produits d’ADNc àla surface du phage filamenteux esttrès séduisante car elle permet desélectionner les ligands naturels den’importe quelle cible. Jacobsson etFrykberg (Uppsala, Suède) ontexprimé une banque complèted’ADNc de Staphylococcus aureus à lasurface de pVIII [20]. Leur sélections’est avérée particulièrement efficacepuisque la majorité des clones sélec-tionnés présentaient des séquences deprotéines connues pour se lier auxdifférentes cibles testées. Cependant,les ADNc eucaryotes ne peuvent êtreexprimés directement en fusion avecpIII ou pVIII à cause des sites de ter-minaison de transcription présentsdans leur région 3’ non codante. Cra-meri et Suter (Davos, Suisse) ontdéveloppé une stratégie astucieuse,fondée sur l’association des protéinesJun et Fos, pour lier de manière cova-lente le produit de l’ADNc à la surfacedu phage. Les gènes Jun et Fos sontexprimés à partir de deux promoteurslacZ distincts du phagemide pComb3.Dans le phage pJuFo, Jun est expriméen fusion avec pIII tandis que le pro-duit de Fos est synthétisé en fusionamino-terminale avec les produits desADNc de la banque. Pour éviter laperte de la paire phage/ADNc, l’asso-ciation Jun-Fos a été rendue covalentegrâce à des ponts disulfure (figure 5).Les auteurs ont présenté sur phageune banque complète de produitsd’ADNc d’Aspergillus fumigatus qu’ilsont sélectionnés avec succès sur sérumIgE humain [21].

Cassettes de mutagenèse,l’évolution in vitro

Le phage filamenteux représente uneexcellente cassette de mutagenèse.Une protéine exprimée en surface duphage est mutée de manière aléatoirepuis sélectionnée pour l’activitérecherchée, le plus souvent la liaisonà une cible. De nombreuses protéinesexprimées à la surface de phages ontconservé leur activité et ont pu êtreainsi « améliorées » (Tableau I). La

taille des protéines ne semble pas êtreun paramètre limitant ; en revanche,la protéine doit supporter la sécrétionde pIII ou pVIII à travers l’environne-ment périplasmique oxydant de labactérie lors de l’assemblage duphage. C’est pourquoi le systèmesemble plus efficace pour des pro-téines normalement extracellulairesou sécrétées. Cette application est fré-quemment utilisée pour augmenterl’affinité d’un fragment d’anticorpspour l’antigène. Dans ce cas plusieursstratégies de mutagenèse ont été envi-sagées. L’anticorps peut être muté demanière totalement aléatoire, soit enaugmentant fortement le tauxd’erreurs de la Taq polymérase, soit àl’aide d’une souche bactériennemutatrice [22]. Une autre stratégieconsiste à utiliser les techniquesd’analyse structurale classiques pouridentifier les résidus importants.Ensuite, deux à trois positions seule-ment sont mutées simultanément, cequi réduit la complexité de la banquede mutants nécessaire, puis les posi-tions optimales sélectionnées sontcombinées pour obtenir le « meilleurmutant ». Nous avons choisi cette

approche « semi-rationnelle » d’ana-lyse par résonance magnétiquenucléaire et modélisation moléculairesuivie de mutagenèse aléatoire pouraugmenter l’affinité d’un anticorpsanti-phényloxazolone [23].

Importance du modede sélection

Il est toujours possible d’éluer desphages après chaque tour de sélec-tion, de les amplifier, et de recom-mencer... Il est, hélas, très fréquentd’être déçu : le ligand sous formesoluble ne se fixe plus sur la cible ; ilse fixe in vitro sur la cible purifiée,mais pas in vivo ; il se fixe in vivo maisne présente aucune activité, ce quiest gênant lors de la recherche d’ago-nistes ou d’antagonistes de récep-teurs, lors de la recherche d’enzymesmodifiées actives ou encore lors de larecherche d’anticorps bloquants oud’anticorps catalytiques !Des modes de sélection sophistiquéset plus adaptés à chaque probléma-tique ont donc fait leur apparition.Le système SAP [24] ou SIP [25] per-met de coupler la reconnaissance

Produit de l'ADNc

COOHFos

Jun

Extracellulaire

Périplasme

Cytoplasme

Phage

COOHFosJun

COOH

lacZ pelB

pIII FosJun ADNc

lacZ pelB

Figure 5. Expression d’ADNc à la surface du phagemide pJuFo. Les construc-tions Jun-pIII et Fos-ADNc sont sous le contrôle de deux promoteurs lacZdistincts. Le peptide signal pelB permet le passage des protéines dansl’espace périplasmique bactérien. La protéine Jun est fusionnée à la protéinepIII du phage et la protéine Fos est fusionnée au produit de l’ADNc. L’asso-ciation Jun-Fos est rendue covalente à l’aide de ponts disulfures. L’ADNc etson produit exprimé en surface sont donc liés physiquement sur la mêmemolécule de phage.

anticorps-antigène à l’infectiosité duphage. Les fragments d’anticorpsexprimés à la surface de protéinespIII défectueuses sont sélectionnéssur une cible couplée à une pIII sau-vage ou complémentaire. Seuls lesphages porteurs d’anticorps liés à lacible-pIII sont infectieux et amplifiésdans E coli. Soumillion et al. ont misau point une méthode astucieusepour sélectionner des enzymes selonleur activité catalytique [26]. La β-lac-tamase exprimée sur phage est incu-

bée avec un substrat inhibiteur sui-cide lié à la biotine. Lorsquel’enzyme est active, après réactionavec le substrat, les phages sont mar-qués à la biotine et se fixent sur desbilles de streptavidine. L’enrichisse-ment en phages porteurs d’enzymeactive après un seul tour de sélectionest très convaincant.La recherche d’agonistes ou d’anta-gonistes de ligands naturels peut éga-lement être très décevante. En effet,de nombreux ligands sélectionnés

sur récepteur ne présentent ensuiteaucune activité en terme de transmis-sion du signal. Dans le laboratoire,nous avons développé un système decriblage fonctionnel permettant dedétecter rapidement des agonistes ouantagonistes de l’EGF humain [27].Une lignée stable a été établie quiexprime la luciférase sous le contrôlede l’enhancer SIE du gène c-Fos impli-qué dans la voie de transmission dusignal EGF. Lorsque cette lignée eststimulée par de l’EGF soluble ou duphage-EGF, une forte activité lucifé-rase est mesurée. L’étude de plu-sieurs mutants de l’EGF exprimés à lasurface du phage permet de détecterles positions cruciales de la molécule.La caractérisation de différentsligands, à la fois pour leur liaison aurécepteur et pour leur activité detransmission, identifie rapidementles agonistes et antagonistes poten-tiels de l’EGF.

Conclusion

La technologie du phage display sedéveloppe dans de très nombreuxlaboratoires. Les limitations du sys-tème, taille des répertoires, matura-tion in vitro, sélections adaptées...,sont résolues progressivement. Lesprotocoles de sélection classiquessont aujourd’hui très simples et seulesles connaissances de bactériologieclassiques sont requises. Selon l’acti-vité recherchée, le choix du mode desélection peut s’avérer crucial. Lasélection peut s’opérer sur cible fixéesur support solide (plaque ELISA,boîte de Pétri, immunotube, agarose)ou sur cible en solution, en généralmarquée à la biotine. Les conditionsexpérimentales : le milieu de satura-tion des sites non spécifiques, la pré-sence de détergent lors des lavages,l’élution (pH acide, alcalin, infectiondirecte sans élution, élution spéci-fique par compétition avec un ligand)sont à déterminer pour chaque pro-blématique. La sélection sur cellulesreprésente un enjeu très importantmais les problèmes de bruit de fondrestent difficiles à résoudre. Peu derésultats sont publiés par rapport auxefforts engagés.La construction de banques est uninvestissement important. Dans lescas où des répertoires particuliers ne

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Tableau I

PROTÉINES FONCTIONNELLES PRÉSENTÉES À LA SURFACE DE PHAGES

Protéines Références

Facteurs de croissance/cytokineshGH revue [5]IL-8 revue [5]CNTF [28]TNF revue [5] hIL6 [29] hIL2 [30] hIL3 revue [5] hEGF [27]

Récepteurs / LectinesRicine (chaîne B) revue [5] Récepteur IgE (FcεRI chaîne α) revue [5] Récepteur PDGF revue [5] CD4 revue [5] Protéine A (domaine B) revue [5]

EnzymesGlutathion transférase [31] Phosphatase alcaline revue [5] Nucléase de staphylocoque revue [5] β-lactamase [26] Trypsine revue [5]

Inhibiteurs de protéasesInhibiteur du précurseur amyloïde β (APPI) revue [5] Inhibiteur de la trypsine pancréatique bovine (BPTI) revue [5] Inhibiteur de la coagulation associé [32] aux lipoprotéines (LACI-DI)Inhibiteur de la papaïne (cystatine) [33] Inhibiteur de l’activateur du plasminogène (PAI-1) revue [5]

Fragments d’anticorps et de récepteurs TFab revue [5] scFv revue [5], [34]

Chaîne α de récepteur T [35]

Protéine à doigts de zinc Zif268 revue [5] gag VIH [36] Peptide auriculaire natriurétique (ANP) revue [5]

sont pas requis, il semble plus judi-cieux d’obtenir des banques « prêtesà l’emploi » déjà construites qui sontdistribuées par les laboratoires derecherche. La sélection de plusieursbanques différentes sur une mêmecible d’intérêt permet d’éviter denombreuses déceptions. Les banquesde longs peptides (30 à 40 acides ami-nés) qui sont théoriquement par-tielles, semblent cependant très effi-caces puisqu’elles ont permis lasélection de clones spécifiques etaffins alors qu’aucun peptide courtn’avait pu être identifié (D. Capra,communication personnelle). Ilsemble que la structure des peptidessoit en fait très importante. La pré-sentation de molécules structurées(hélices α, feuillet β...) représenteaujourd’hui un axe de rechercheimportant ■

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Remerciements

Nous remercions Lutz Riechmann, AndrewGriffiths et Yvan Boublik pour leur discussionsconstructives. Nous remercions le professeurGérard Lefranc pour sa correction critique etattentive. Nous remercions chaleureusementPasteur Mérieux Sérums et Vaccins ainsi que lafondation Marcel Mérieux pour leur accueil etl’organisation des sessions phages aux « Pen-sières ». Nous remercions le Centre National dela Recherche Scientifique, le ministère del’Éducation nationale, de la Recherche et de laTechnologie, le ministère des Affaires étran-gères (Programme d’Actions Intégrées Franco-Britannique), l’Association pour la Recherchesur le Cancer, la Ligue pour la Recherche sur lecancer et la Société Française d’Immunologie.

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SummaryPhage display technology, a wide range of applications

The phage display is becoming a very powerful technology. Filamentousphages can present on their surface either peptides, proteins or antibodyfragments. Peptide libraries are selected on antibodies to rapidly map epi-topes, or on purified target to identify interaction sites. Selection on recep-tors identifies new therapeutic ligands while selection on enzymes identifiesnew substrates. New protocols are leading to selection on more complextargets as cells, patient serums or tissues. Combinatorial antibody librariesrepresent a performant alternative to hybridoma technology. Librariesconstructed from immunised repertoires allow rapid selection of high affi-nity binders. Libraries constructed from naive repertoires allow isolationof low affinity antibodies against a large range of antigens without theneed of immunisation. Naive libraries are particularly interesting to isolatehuman or anti-self antibodies. A large number of biologically active proteinshave been expressed on phage and submitted to several rounds of modifica-tion/selection on target. This « in vitro evolution» represents an excellent toolfor structure-function analysis. This review summarises several applicationswhich are developped in an increasing number of laboratories.

Christelle SouriauÉtudiante en thèse

The Duc HuaÉtudiant en stage postdoctoral

Marie-Paule LefrancProfesseur universitaire, université Mont-pellier II

Mylène WeillMaître de conférences, Université Montpel-lier II. Laboratoire d’immunogénétique molé-culaire, Institut de génétique moléculaire,UMR Cnrs 5535, 1919, route de Mende,34293 Montpellier Cedex 5, France.

TIRÉS À PARTM. Weill.

Cours de Biologie Moléculaire de la CelluleEnseignement Pratique

9 mars-10 avril 1998Responsables du cours : A. Dautry-Varsat et D. Louvard

Secrétariat des Enseignements et des StagesInstitut Pasteur,

28, rue du Docteur-Roux, 75724 Paris Cedex 15, FranceTél. : 01 45 68 81 41 ou 01 40 61 33 62 - Fax : 01 40 61 30 46

EMBO WORKSHOP25-28 mars 1998

St. Catherine’s College, Universityof Oxford, Royaume-Uni

Protein Folding and Misfolding insideand outside the Cell

Organisateurs : John Ellis, Chris Dobson, Chris Leaver

Principaux thèmes

• The principles of proteinfolding, from both theoreticaland experimental view-points.

• The roles of molecular cha-perones, with emphasis onprotein folding in vivo.

• Protein misfolding andaggregation, with emphasison the molecular origins ofhuman diseases associatedwith protein folding.

Renseignements complémentaireshttp://www.ocms.ox.ac.uk/ocms/EMBOworkshop.html

Secrétariat : Lindsay Battle,Oxford Centre for MolecularSciences, New ChemistryLaboratory, South Parks Road,Oxford, UK, OX1 30T.Telephone : +44 1865 275698.Fax : +44 1865 275905Email :Lindsay.Battle@ocms.ox.ac.uk

SOCIÉTÉ DE BIOLOGIESéance du 13 mai 1998 - 16 heures - La Mélatonine

Y. TOUITOU (Hôpital Pitié-Salpêtrière - Paris) - La mélatonine, un agent de synchronisationA. D. STROSBERG (CNRS - Paris)- Récepteurs de la mélatonine, Structure et fonctions

P. CHEMINEAU (INRA - Tours) - Mélatonine et reproductionJ. SERVIÈRE (INRA - Jouy-en-Josas) - Rôle des mitochondries dans le vieillissement

CHU Pitié-Salpêtrière, 91, boulevard de l’Hôpital,75013 Paris, France (salle 219)

Renseignements : Secrétariat de la Société de Biologie, Collège de France,3, rue d’Ulm, 75231 Paris Cedex 05 - Tél./Fax : 01 44 27 13 40