Phan tich sac ki khi Th Vung

1

Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký

Chương 1: CƠ SỞ LÍ THUYẾT CHUNG VỀ TÁCH SẮC KÝ

1.1. Giới thiệu phương pháp

1.1.1 Định nghĩa sắc kí (Chromatography)

Định nghĩa của Mikhail S. Tsvett (1906):

? Sắc kí là một phương pháp tách trong đó các cấu tử của một hỗn hợp được tách trên một cột hấp thụ đặt trong một hệ thống đang chảy.

Định nghĩa của IUPAC (1993):

? Sắc kí là một phương pháp tách trong đó các cấu tử được tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định.

1.1.2. Phân loại ? Người ta phân loại các phương pháp sắc kí dựa vào cơ chế hoạt động sắc kí: hấp phụ,

phân bố, trao đổi ion… và vào tính chất của pha tĩnh cũng như phương pháp thể hiện sắc kí. Ví dụ:

- Phương pháp sắc kí lỏng rắn trên cột, phương pháp sắc kí phân bố khí lỏng trên cột.

- Phương pháp sắc kí phân bố lỏng lỏng trên bản phẳng hai chiều. - Phương pháp sắc kí phân bố lỏng lỏng pha ngược áp suất cao trên cột…

? Cơ chế sắc kí có nhiều nhưng để thực hiện quá trình sắc kí thì chỉ có hai dạng: dạng cột và dạng bản phẳng (bản kính, polime, kim loại, giấy).

? Trong sắc kí cột, pha tĩnh được giữ trong một cột ngắn và pha động được cho chuyển động qua cột bởi áp suất hoặc do trọng lực. Trong sắc kí bản mỏng, pha tĩnh được phủ trên một mặt phẳng thủy tinh hoặc kim loại.

? Thường để đơn giản hóa, tuy không chính xác người ta gọi tắt các phương pháp sắc kí: sắc kí khí, sắc kí lỏng, sắc kí lỏng cao áp, sắc kí lớp mỏng, sắc kí gel…

? Trong số các phương pháp sắc kí được biết, quan trọng nhất là sắc kí hấp phụ, sắc kí phân bố và sắc kí trao đổi ion. Dưới đây sẽ giới thiệu ba phương pháp sắc kí này nhằm vào hai mục đích: chuẩn bị mẫu cho chất phân tích và phân tích một hỗn hợp chất.

Bảng 1: Phân loại các phương pháp sắc kí cột

Phân loại chung Phương pháp cụ thể Pha tĩnh Kiểu cân bằng Sắc kí lỏng (LC) (Pha động : lỏng)

- Lỏng- lỏng hoặc phân bố - Pha lỏng liên kết - Lỏng-rắn hoặc hấp phụ trao đổi ion

- Lỏng được phủ trên một chất rắn - Chất hữu cơ được gắn trên một bề mặt rắn - Rắn Nhựa trao đổi ion

- Phân bố - Phân bố giữa chất lỏng và bề mặt liên kết - Hấp phụ Trao đổi ion

2


Sắc kí khí (GC) (pha động: Khí)

- Khí-lỏng - Khí - pha liên kết - Khí - rắn

- Lỏng được phủ trên một chất rắn - Chất hữu cơ được liên kết trên một bề mặt rắn - Rắn

- Phân bố giữa khí và lỏng - Phân bố giữa lỏng và bề mặt liên kết - Hấp phụ

Sắc kí lỏng siêu tới hạn

Pha lỏng: chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid)

Chất hữu cơ được liên kết trên một bề mặt rắn

Phân bố giữa chất lỏng siêu tới hạn và bề mặt liên kết

Hình 1.1: Sơ đồ nguyên tắc a) sắc kí cột b) sắc kí bản mỏng

1.2. Cơ sở lí thuyết chung của phương pháp sắc kí

1.2.1 Quá trình sắc kí

? Sắc kí là một kỹ thuật tách trong đó các cấu tử cần tách trong một hỗn hợp mẫu được vận chuyển bởi pha động đi qua pha tĩnh. Mẫu đi vào tướng động được mang theo dọc hệ thống sắc kí (cột, bản phẳng) có chứa pha tĩnh phân bố đều khắp.

? Pha động có thể là pha lỏng hoặc khí, pha tĩnh có thể là một lớp phim được phủ trên bề mặt của chất mang trơ hoặc một bề mặt rắn. Sự tương tác xảy ra giữa các cấu tử với pha tĩnh nhờ đó các cấu tử sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh.

Pha động

Mẫu

Pha tĩnh Hướng chảy pha động

Sắc kí đồ

Detector

Các cấu tử giải tách ra

Pha động

Lớp mỏng pha tĩnh Bản mỏng trơ

Các cấu tử tách ra

Hướng chảy pha động

Mẫu (A+B+C) Xuất phát

Điểm đến dung môi

Nồng độ của B

3


? Sự ái lực khác nhau của các chất tan trên pha tĩnh làm chúng di chuyển với những vận tốc khác nhau trong pha động của hệ thống sắc kí. Kết quả là chúng được tách thành những dải trong pha động và vào lúc cuối của quá trình các cấu tử lần lượt hiện ra theo trật tự tương tác với pha tĩnh.

? Cấu tử di chuyển chậm (tương tác yếu) ra trước, cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn ra sau dưới dạng các đỉnh (pic) tách riêng rẻ (hoặc bậc thang) tùy thuộc vào cách tiến hành sắc kí và được hiển thị dưới dạng sắc kí đồ.

Hình 1.1 minh họa một quá trình tách một hỗn hợp đơn giản gồm hai chất A và B (lực tương tác với pha tĩnh của A < B) theo thời gian.

? Mẫu chứa A và B được tiêm vào cột. Khi cho một chất rửa giải bắt đầu chảy qua cột, phần của mẫu được hòa tan trong pha động được di chuyển tại phần đầu của cột (tại thời điểm to). Ở đây các cấu tử A và B tự phân bố giữa hai pha.

? Tiếp tục cho pha động đi qua cột thì nó sẽ đẩy phần hòa tan này chạy xuống dưới và một sự phân bố mới giữa pha động và pha tĩnh sẽ xảy ra (thời điểm t1). Đồng thời sự phân bố giữa dung môi mới và pha tĩnh cũng diễn ra tại vị trí của mẫu lúc đầu.

? Việc thêm tiếp dung môi sẽ mang các phân tử hòa tan chạy xuống cột trong một loạt liên tiếp các chuyển biến giữa hai pha. Bởi vì sự di chuyển của chất tan chỉ xảy ra trong pha động, nên tốc độ trung bình của sự di chuyển chất tan phụ thuộc vào phần thời gian chất tan ấy nằm trong pha đó. Phần thời gian này là nhỏ đối với chất tan bị lưu giữ mạnh bởi pha tĩnh (cấu tử B trong ví dụ trên) và lớn đối với chất tan (cấu tử A) có sự lưu giữ trong pha động mạnh hơn. Sau một thời gian các phân tử chất A và B dần dần được tách khỏi nhau.

? Nếu đặt một detectơ có khả năng phát hiện được các chất tan (cấu tử A và B) tại cuối cột tách và tín hiệu của nó được vẽ lại như một hàm của thời gian (hoặc thể tích được thêm vào) thì một loạt pic đối xứng sẽ được ghi lại và được gọi là sắc kí đồ.

? Vị trí của các pic theo thời gian được dùng để nhận diện định tính và diện tích của píc được dùng cho phép phân tích định lượng của cấu tử đang xét.

4


Hình 1.2: Quá trình tách sắc kí trên cột của hai chất A và B

1.2.2. Các phương pháp tiến hành tách sắc kí

Để thực hiện tách sắc kí người ta có thể sử dụng một trong ba phương pháp sau:

1.2.2.1. Phương pháp rửa giải

? Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi nhất trong các phương pháp sắc kí hiện nay. ? Một lượng nhỏ hỗn hợp mẫu được giới thiệu vào cột với pha động có ái lực với pha tĩnh

bé hơn so với bất kì cấu tử cần tách có trong mẫu. Vì thế các cấu tử cần tách di chuyển

Mẫu

Cột nhồi

Pha động

Detector

Sắc kí đồ

Thời gian

5


với tốc độ chậm hơn so với chất rửa giải. Tốc độ này được xác định bởi ái lực tương đối của mỗi cấu tử lên pha tĩnh so với pha động, đó chính là hệ số phân bố K = Csp/Cmp. Ở đây Csp, Cmp là nồng độ của cấu tử đang xét trên pha tĩnh và trong pha động.

? Các cấu tử được rửa giải theo trật tự ái lực của chúng nhưng tốc độ di chuyển tương đối của chúng phụ thuộc vào tương tác 3 thành phần giữa chúng với pha động, với pha tĩnh và giữa pha động với pha tĩnh. Bởi vì các cấu tử được tách khỏi nhau với một vùng pha động ở giữa chúng nên phương pháp này được sử dụng trong các phép tách với mục đích phân tích.

? Pha động có thể không thay đổi thành phần dung môi trong suốt quá trình rửa giải; có thể thay đổi dung môi rửa giải sau một thời gian định trước (rửa giải theo từng giai đoạn); cũng có thể không thay đổi các dung môi tạo nên pha động nhưng thay đổi nồng độ của các thành phần có trong pha động sau một thời gian định trước (rửa giải gradient).

1.2.2.2. Phương pháp tiền lưu

? Hỗn hợp cần tách gồm các chất A, B và C được cho chảy liên tục vào phần trên của cột, trong đó A là cấu tử có ái lực yếu nhất với pha tĩnh.

? Do các cấu tử A, B và C bị lưu giữ trên cột, nên trước hết từ cột chảy ra chỉ có dung môi. A do có lực tương tác trên cột yếu nhất sẽ di chuyển xuống dưới còn các cấu tử có ái lực mạnh hơn A bị pha tĩnh giữ ở phần trên của cột.

? Do dung dượng có hạn của pha tĩnh nên khi vượt dung lượng này thì cấu tử A sẽ di chuyển dọc theo cột và ra khỏi cột ở dạng nguyên chất sau đó là hỗn hợp của các thành phần tiếp theo A+B rồi A+B+C.

? Phương pháp tiền lưu ít được dùng do không thực hiện được việc tách hoàn toàn các cấu tử, đặc biệt khi sử dụng sự tách sắc kí vào mục đích phân tích.

1.2.2.3. Phương pháp thế đẩy:

? Mẫu được cho vào cột, dùng dung môi rửa giải có ái lực với pha tĩnh mạnh hơn bất kì một cấu tử nào của hỗn hợp tách để đẩy các cấu tử cần tách thoát ra khỏi cột.

? Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác yếu nhất với pha tĩnh, sau đó đến các cấu tử khác có ái lực với pha tĩnh tăng dần.

? Phương pháp này tạo nên các dải rửa giải không hoàn toàn được tách khỏi nhau: có dải thu được chất nguyên chất nhưng có dải giữa các dải nguyên chất thì gồm hỗn hợp của chúng.

Trong thực hành phòng thí nghiệm để tách các hỗn hợp phức tạp người ta thường hay dùng hơn cả là phương pháp rửa giải.

6


Hình 1.3: Các phương pháp rửa giải, tiền lưu, thế đẩy

1.2.3. Đặc tính sắc kí của chất tan

1.2.3.1. Tính chất lưu giữ

Tính chất lưu giữ phản ánh sự phân bố của chất tan giữa pha tĩnh và pha động và được biểu thị bằng các đại lượng thể tích lưu hay thời gian lưu.

? Thể tích lưu VR là thể tích pha động cần thiết để vận chuyển chất tan i từ thời điểm đưa mẫu vào, đi qua cột và đến detectơ (trên sắc kí đồ là điểm cực đại của pic).

? Thời gian lưu tRi là thời gian từ lúc chất tan i được nạp vào cột tách ở bộ phận tiêm mẫu cho đến lúc chất ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại.

Dung môi rửa giải (E)

Pha tĩnh

Rửa giải Tiền lưu Thế đẩy

Đến Detector

Tín hiệu Detector

Thể tích dung môi rửa giải

7


? Thể tích lưu có thể nhận được trực tiếp từ thời gian lưu tR trên sắc kí đồ bằng cách nhân với tốc độ thể tích dòng Fc (thể tích của pha động trên một đơn vị thời gian):

VR = tR. Fc

? Tốc độ dòng được tính theo các thông số của cột như sau:

Mt

cc t

LdF ??? ??4

2

Ở đây:

dc là đường kính của cột, L là chiều dài cột, εt là độ rỗng toàn phần của chất nhồi cột (độ rỗng của chất nhồi cột biểu

thị tỉ số thể tích kẽ hở của chất nhồi và thể tích khối toàn phần của nó: đối với chất nhồi rắn = 0.35 - 0.45, chất nhồi xốp = 0.70 - 0.90, cột mao quản = 1.0),

Vc là thể tích bên trong cột.

? Tốc độ tuyến tính trung bình u của sự dịch chuyển chất tan là: RtLu ?

? Tốc độ tuyến tính trung bình u của pha động là: MtLu ?

Ở đây tM hay to là thời gian không bị lưu giữ của chất tan (thời gian chất tan lưu trong pha động). Trong sắc kí khí, tM được lấy bằng thời gian cần thiết cho CH4 di chuyển đi qua cột.

Tương ứng tM hay to có thể tích VM (hoặc Vo) biểu thị thể tích trống của cột (bao gồm cả thể tích của bộ phận tiêm mẫu (injector), thể tích các đoạn ống nối, thể tích rỗng của chính cột và thể tích detectơ).

? Thể tích lưu hiệu chỉnh V’R hoặc thời gian lưu hiệu chỉnh t’R được cho bởi:

V’R = VR –VM hoặc t’R = tR – tM

(thời gian không bị lưu giữ của chất tan gần đúng được xem như là thời gian lưu của pha động).

8


Hình 1.4: Sắc kí đồ minh họa các thời gian lưu t (hoặc thể tích lưu) và độ rộng của đáy pic W của chất tan không bị lưu giữ M và của 2 chất bị lưu giữ 1 và 2

1.2.3.2. Hệ số phân bố K (Partition coefficient)

? Mỗi cấu tử hoặc chất tan được phân bố giữa 2 pha với một cân bằng được thiết lập và tất cả các quá trình tách sắc kí được dựa trên sự khác nhau về khả năng phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh.

? Khi chất tan đi vào hệ thống sắc kí, nó ngay lập tức phân bố giữa các pha động và pha tĩnh. Giả thiết nếu pha động dừng lại vào bất kì một thời gian nào, chất tan có một sự phân bố cân bằng giữa hai pha, và nồng độ của chất tan ở trong mỗi pha được cho bởi hệ số phân bố nhiệt động:

M

s

CCK ?

Ở đây Cs và CM là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động tương ứng.

Trường hợp khi K = 1 thì chất tan được phân bố bằng nhau giữa hai pha.

? Hệ số phân bố xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan (chính xác là tâm vùng) do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột.

? Đối với pic đối xứng, khi cực đại pic xuất hiện ở lối ra của cột, một nửa lượng chất tan đã được rửa khỏi cột trong thể tích lưu VR và một nửa còn lại được phân bố giữa thể tích pha động VM và thể tích pha tĩnh Vs:

VRCM = VMCM + VsCs

hay VR = VM + KVs

hay VR – VM = KVs

Tiêm mẫu

Cường độ tín hiệu Detector

Thời gian (thể tích)

9


? Phương trình này đúng với cột phân bố lỏng, còn đối với cột hấp phụ, Vs phải thay bằng Ss là diện tích bề mặt của chất hấp thụ.

1.2.3.3. Hệ số dung lượng k’ (The capacity factor)

? Hệ số dung lượng k’ là thông số thực nghiệm quan trọng trong sắc kí cột được sử dụng rộng rải để mô tả các tốc độ dịch chuyển của các chất tan trên cột.

? Cho một chất tan, hệ số dung lượng k’ được định nghĩa như là tỉ số mol chất tan trong pha tĩnh và số mol chất tan trong pha động:

k’ = M

s

MM

ss

VVK

VCVC ?

Tỉ số VM/Vs được gọi là tỉ số thể tích pha

? Hệ số dung lượng còn được định nghĩa là tỉ số giữa thời gian của chất tan lưu lại trên pha tĩnh và thời gian cần để chất tan đó di chuyển trong pha động suốt chiều dài của cột nếu không bị lưu giữ tM.

M

MR

M

MR

M

R

VVV

ttt

ttk ?????

'

'

? Khi k’ cho một chất tan nhỏ hơn 1 nhiều, sự rửa giải xảy ra rất nhanh nên việc xác định

thời gian lưu là rất khó. Còn khi k’ khoảng 20 đến 30 thì thời gian rửa giải sẽ bị kéo dài. Vì vậy các phép tách nên được thực hiện ở những điều kiện mà các k’ của các chất tan nằm trong khoảng giá trị từ 1 đến 5.

? Giá trị k’ trong sắc kí khí có thể được thay đổi bởi việc thay đổi nhiệt độ và cách nhồi

cột. Còn trong sắc kí lỏng, k’ thường được điều khiển để cho phép tách tốt hơn bởi thay đổi thành phần pha động và pha tĩnh.

1.2.3.4. Hệ số chọn lọc (The selectivity factor)

? Khả năng của một pha tĩnh tách 2 cấu tử A và B (B là cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn) được xác định bởi tỉ số phân bố tương đối của chúng và cũng là những hệ số lưu giữ của chúng đối với một pha tĩnh đã cho.

? Hệ số chọn lọc α là một hàm của sự lưu giữ tương đối của mỗi cấu tử trên pha tĩnh:

A

B

A

B

R

R

KK

kk

tt ??? '

'

'1

'2?

10


? Hệ số chọn lọc của một cặp dải (pic) gần nhau là một hàm phụ thuộc vào loại pha tĩnh được sử dụng, pha động và nhiệt độ của cột. Để cho một sự tách được tốt thì α nên có gía trị lớn hơn 1. Hai chất cần tách càng tách ra xa khỏi nhau khi α càng lớn nhưng nếu quá lớn thì thời gian phân tích càng kéo dài, α nên trong khoảng từ 1,05 đến 2,0.

1.2.3.5. Những yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu giữ

Tốc độ di chuyển của một dải chất tan qua một cột hay một đĩa sắc kí lớp mỏng phụ thuộc vào sự phân bố của các phân tử chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Những nhân tố ảnh hưởng đến sự phân bố hay sự lưu giữ là:

? Thành phần và tính chất của pha động ? Kiểu và tính chất của pha tĩnh ? Các lực tương tác các phân tử giữa các cấu tử của pha động và pha tĩnh ? Nhiệt độ

Hai yếu tố góp phần để tách tốt các hợp chất bởi sắc kí là:

? Sự khác nhau về thời gian phân bố của chúng trong 2 pha: nếu sự khác nhau càng lớn thì sự tách chúng càng tốt.

? Độ doãng rộng của các pic nếu càng rộng thì sự tách chúng càng kém.

1. 3. Sự doãng rộng của pic và hiệu lực tách

1.3.1. Mở đầu

? Hiệu lực của một cột tách chịu tác động bởi độ lớn của sự doãng rộng pic xảy ra khi một chất chuyển động dọc theo cột.

? Chất tan khi chạy dọc theo cột có khuynh hướng phân bố như một hình phân bố chuẩn Gaussian với độ lệch chuẩn σ (hình 5).

? Nếu chất tan tiêu tốn nhiều thời gian khi dịch chuyển dọc xuống cột thì pic càng bị doãng rộng. Độ doãng rộng của một pic thường được biểu diễn thông qua các giá trị: W1/2 là độ rộng của của pic được đo ở ½ chiều cao của pic, W là độ rộng của đáy pic được xác định tại hai điểm cắt của hai đường tiếp tuyến của

hai bên thân pic với đường nền.

11


Hình 1.5: Sơ đồ của một dải chất tan và sự đánh giá của dải sắc kí đồ cho hiệu lực cột.

1.3.2. Sự khuếch tán

? Nguyên nhân chính dẫn đến sự doãng rộng của pic là sự khuếch tán. Hệ số khuếch tán D đo tốc độ J tại đó một chất di chuyển một cách ngẫu nhiên từ một vùng có nồng độ cao đến vùng có nồng độ thấp.

dxdcD

smmolJ ??)

.( 2

D là hệ số khuếch tán c là nồng độ x là độ dài di chuyển

? Sự khuếch tán trong chất lỏng thấp hơn trong chất khí khoảng 104 lần, còn các phân tử lớn thì khuếch tán chậm hơn các phân tử nhỏ từ 10 đến 100 lần.

? Độ rộng của dải sắc kí do khuếch tán được biểu diễn qua phương trình sau:

)4/(2

4Dtxe

Dtmc ???

ở đây:

Độ lệch chuẩn của dải

Tiêm mẫu Chiều cao pic

Chiều cao ½ pic

Trục thời gian

12


c là nồng độ (mol/cm3), t là thời gian, x là khoảng cách di chuyển được dọc theo cột, D là hệ số khuếch tán, m là số mol chất tan dịch chuyển qua một đơn vị diện tích tiết diện ngang của cột.

? Phương trình trên cho biết độ lệch chuẩn của dải sắc kí: Dt2??

1.3.3. Chiều cao đĩa lý thuyết H

? Chiều cao đĩa lý thuyết H là một hằng số giữa phương sai σ2 của dải chất tan và khoảng cách x mà nó di chuyển. Tên gọi này là từ lý thuyết chưng cất trong đó sự tách được thực hiện trong những giai đoạn rời rạc được gọi là đĩa tách.

H = σ2/L

Với L là chiều dài của cột nhồi

? Có thể giả định cột sắc kí được chia thành N phần mỏng hay N lớp hay N đĩa tách. Ở mỗi đĩa sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới (sắc kí là một quá trình động, thực ra pha động chảy liên tục và thời gian không đủ để thiết lập trạng thái cân bằng).

? Chiều cao của đĩa tách cũng được gọi là chiều cao đĩa lý thuyết. Mặc dù trong cột sắc kí không có các đĩa thực nhưng người ta vẫn sử dụng khái niệm này để chỉ mối quan hệ giữa độ rộng của dải sắc kí và khoảng cách dịch chuyển dọc theo cột sắc kí.

? Nếu chiều cao đĩa lý thuyết càng nhỏ (tức số đĩa lý thuyết càng nhiều) thì độ rộng hay sự doãng rộng của pic càng nhỏ.

? Khả năng tách các cấu tử của một hỗn hợp của một cột được cải thiện nếu giảm chiều cao một đĩa lý thuyết. Các chất tan khi dịch chuyển qua cùng một cột tách có chiều cao đĩa lý thuyết khác nhau bởi vì chúng có hệ số khuếch tán khác nhau.

? Chiều cao một đĩa lý thuyết khoảng từ 0.1 đến 1 mm trong sắc kí khí và khoảng 10 µm trong săc kí lỏng hiệu năng cao và nhỏ hơn 1µm trong sắc kí điện di mao quản.

1.3.4. Số đĩa lý thuyết N

N = 2

2

?L

HL ?

Ở đây L là chiều dài cột, với RtWL

4??? nên:

13


N = 2

216W

tR

Hay N = 22/1

254.5W

tR?

Với:

tR là thời gian lưu của pic, W là độ rộng của pic ở đáy, W1/2 là chiều rộng của pic đo ở nửa chiều cao từ đỉnh đến đáy pic.

Công thức này được sử dụng để xác định thực nghiệm số đĩa lí thuyết của một cột tách.

Hiệu lực của cột tách sẽ tăng lên khi số đĩa lí thuyết càng lớn và khi chiều cao đĩa càng nhỏ.

1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực tách của cột

1.4.1. Ảnh hưởng của tốc độ của pha động

? Mức độ ảnh hưởng động học lên hiệu lực của một cột rõ ràng phụ thuộc vào độ dài thời gian của pha động tiếp xúc với pha tĩnh tức phụ thuộc vào tốc độ pha động.

? Nghiên cứu về hiệu lực cột nói chung được thực hiện bởi việc xác định chiều cao H như là một hàm phụ thuộc vào tốc độ pha động.

? Kết quả cho thấy cả sắc kí khí lẫn sắc kí lỏng đều có chiều cao đĩa lí thuyết đạt cực tiểu ở trong vùng tốc độ dòng thấp của pha động và nói chung tốc độ đó của sắc kí lỏng thấp hơn so với sắc kí khí.

1.4.2. Lí thuyết về sự doãng rộng pic

? Hơn 40 năm qua, rất nhiều công trình nghiên cứu về thực nghiệm lẫn lý thuyết về mối quan hệ định lượng để giải thích ảnh hưởng của các thông số như: vận tốc tuyến tính của pha động, hệ số khuếch tán trong pha động và trong pha tĩnh, tỉ số phân bố, đường kính của hạt nhồi, bề dày của lớp chất lỏng phủ trên hạt… đến chiều cao đĩa lý thuyết cho các loại cột khác nhau.

? Những yếu tố ảnh hưởng này được phản ánh qua phương trình của Van Deemter như sau:

uCuCuBAH Ms ????

Ở đây:

H là chiều cao đĩa lý thuyết (cm); u là vận tốc tuyến tính của pha động (cm/s);

14


A là hệ số mô tả ảnh hưởng đến H của sự khuếch tán xoáy; B là hệ số khuếch tán dài; Cs và CM là các hệ số chuyển khối của pha tĩnh và pha động.

Hình 1.6: Đường cong H-u (Van Deemter) cho một cột sắc kí khí

1.4.2.1 Sự khuếch tán xoáy:

? Thành phần A mô tả sự khuếch tán xoáy của các cấu tử và các đường đi khác nhau của pha động chạy xuyên qua pha tĩnh được nhồi trong cột. Vì thế các cấu tử phải di chuyển với những khoảng cách đường đi khác nhau qua một đơn vị chiều dài của cột.

? Số hạng A độc lập với tốc độ của pha động nhưng phụ thuộc vào: Đường kính hạt nhồi trong pha tĩnh dp, Cách chúng được nhồi trong cột hoặc được phủ trên bản mỏng được biểu diễn qua

λ là hàm số phụ thuộc vào độ đồng thể của chất nhồi, dạng hình học và kích thước của cột:

A = λ.dp

? Một số phân tử chất tan có đường đi gần với thành cột sẽ di chuyển nhanh hơn so với những phân tử khác do ở đó mật độ nhồi tương đối thấp, tốc độ nhanh hơn. Các phân tử đi theo đường ngắn hơn được rửa giải ra trước những phân tử đi theo những đường quanh co dài hơn dẫn đến doãng rộng pic của mỗi chất tan.

? Một sự tách và độ rộng của pic tối thiểu sẽ đạt được nếu dùng các hạt nhồi có đường kính trung bình đủ nhỏ và được nhồi đồng thể vào trong cột. Tuy nhiên, hạt càng nhỏ thì áp suất cần để pha động dịch chuyển qua cột càng cao, đặc biệt sẽ gặp khó khăn để nhồi cột đồng thể. Trong sắc kí khí cột nhồi người ta nhồi cột với các hạt có kích thước tối ưu

Đường H = f(u)

Số hạng B

Số hạng Cs

Số hạng CM

Số hạng A

Vận tốc tuyến tính trung bình u

15


khoảng 0.15 µm. Trong sắc kí khí – lỏng khi sử dụng màng mỏng trên thành cột mao quản thì số hạng A = 0.

Hình 1.7: Ảnh hưởng của khuếch tán xoáy (a), khuếch tán dọc (b) sự truyền khối (c) đến phương trình Van Deemter.

1.4.2.2. Sự khuếch tán dọc

? Khuếch tán là quá trình chất di chuyển từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp hơn với tốc độ tỉ lệ với sự chênh lệch nồng độ và hệ số khuếch tán của chất đang xét.

? Trong sắc kí, khuếch tán dọc được dùng để mô tả sự khuếch tán diễn ra dọc theo trục của cột và song song với đường đi của pha động. Nó dẫn đến sự dịch chuyển của chất tan từ trung tâm nồng độ của một dải chất tan đến những vùng loãng hơn về hướng phía trước hoặc sau của dòng chảy.

? Khuếch tán dọc là một nguồn của sự doãng rộng của pic trong sắc kí khí do tốc độ khuếch tán cao trong pha khí. Hiện tượng này ít hơn trong sắc kí lỏng. Độ lớn của B

Pha động

Hạt pha tĩnh Tương tác chất tan với hạt pha tĩnh

Nồng độ của dải

Sự khuếch tán ra trước và sau của dải

Pha động

Dải chất tan

Pha động

Pha tĩnh

Di chuyển khỏi pha tĩnh

Di chuyển vào pha tĩnh

Chất tan bị giữ trong pha tĩnh

16


trong phương trình Van Deemter được xác định phần lớn bởi hệ số khuếch tán DM của chất phân tích trong pha động và tỉ lệ thuận với hằng số này:

B = 2γ. DM

ở đây:

γ là hệ số trở kháng của chất nhồi cột đến khuếch tán dọc, DM là hệ số khuếch tán của chất tan trong pha động.

? Trong các cột mao quản thì γ có giá trị bằng 1 còn trong cột nhồi thì khoảng 0.7. ? B ảnh hưởng lớn trong phương trình V-D khi tốc độ pha động thấp nên trong sắc kí lỏng

ảnh hưởng này ít hơn nhiều bởi vì pha động có tốc độ thấp hơn nhiều so với của sắc kí khí.

1.4.2.3. Sự truyền khối trong pha tĩnh

? Khi pha tĩnh là chất lỏng: hệ số truyền khối Cs tỉ lệ thuận với bình phương chiều dày của lớp phim trên bề mặt chất mang và tỉ lệ nghịch với hệ số khuếch tán Ds của chất tan trong lớp phim.

? Giải thích: với lớp phim dày các phân tử chất tan phải di chuyển trung bình xa hơn để tiến đến bề mặt, và với hệ số khuếch tán nhỏ hơn, chúng sẽ di chuyển đến chậm hơn. Hậu quả là tốc độ truyền khối chậm hơn và chiều cao đĩa lý thuyết tăng lên.

? Khi pha tĩnh là một bề mặt rắn: hệ số truyền khối pha tĩnh Cs tỉ lệ thuận với thời gian được đòi hỏi cho những cấu tử bị hấp phụ hoặc giải hấp, hay tỉ lệ nghịch hằng số tốc độ bậc nhất của các quá trình này.

? Sự chuyển động của phân tử trong pha tĩnh tiêu tốn một thời gian dài hơn, trong khi những phân tử khác chuyển động về phía trước cùng với pha động, sẽ dẫn đến pic sẽ doãng rộng. Pha động đi qua cột càng nhanh và tốc độ truyền khối trong pha tĩnh càng nhỏ thì pic càng doãng rộng hơn.

? Khắc phục: những chất lỏng ít nhớt hơn có thể được chọn làm pha tĩnh để tăng hệ số khuếch tán. Có thể giảm chiều dày của pha tĩnh nhưng dung lượng của cột sẽ bị giảm xuống.

1.4.2.4. Sự truyền khối trong pha động

? Các quá trình truyền khối trong pha động rất phức tạp. Sự hiểu biết tốt về mặt định tính của những yếu tố từ nguyên nhân này tác động đến sự doãng rộng của pic dẫn đến sự cải thiện lớn lao trong tất cả các loại cột sắc kí.

? Hệ số truyền khối trong pha động CM: tỉ lệ nghịch với hệ số khuếch tán của chất tan trong pha động DM tỉ lệ thuận với bình phương đường kính của hạt nhồi, tỉ lệ thuận với bình phương của đường kính cột và tốc độ chảy của pha động.

17


? Sự doãng rộng của dải trong pha động là do một phần vào số đông các đường đi nhờ đó một phân tử hoặc ion có thể tìm được cách của nó để đi qua cột nhồi. Trên bề mặt của pha tĩnh có thể chứa các lỗ khích thước khác nhau nên một số các phân tử chất tan có thể chuyển động vào ra các lỗ này dẫn đến sẽ bị chậm so với những phân tử khác. Các dòng chất lỏng của pha động ở gần các hạt chuyển động chậm hơn dòng chất lỏng ở giữa khoảng cách các hạt.

? Như vậy thời gian lưu trong cột cho các phân tử của cùng một chất cũng khác nhau. Các phân tử này đi đến cột qua những khoảng thời gian khác nhau dẫn đến sự doãng rộng pic. Ảnh hưởng này thỉnh thoảng được gọi là khuếch tán xoáy, độc lập với tốc độ của dung môi.

1.4.2.5. Các phương pháp giảm sự doãng rộng pic

? Hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của cột là đường kính của các hạt nhồi và đường kính của cột: Nếu sử dụng các hạt nhồi có đường kính càng nhỏ thì càng giảm chiều cao đĩa lý

thuyết. Trong khi đó lợi dụng ảnh hưởng của đường kính cột, các cột ngày càng hẹp hơn

được sử dụng trong những năm gần đây. ? Với pha động khí, tốc độ của khuếch tán dọc có thể được giảm một cách đáng kể bởi hạ

thấp nhiệt độ và như vậy làm giảm hệ số khuếch tán DM. Điều này dẫn đến chiều cao đĩa lý thuyết sẽ nhỏ hơn tại nhiệt độ thấp. Ảnh hưởng này không đáng kể trong trường hợp sắc kí lỏng bởi vì sự khuếch tán là đủ chậm nên sự khuếch tán dọc có ảnh hưởng rất nhỏ đến chiều cao đĩa lý thuyết.

? Đối với pha tĩnh lỏng, chiều dày của lớp chất lỏng hấp thụ nên càng mỏng càng tốt bởi vì Cs trong phương trình Van-Deemter tỉ lệ thuận với bình phương của đại lượng này.

1.5. Độ phân giải của cột (Column resolution)

1.5.1. Định nghĩa

? Trong sắc kí, độ phân giải Rs của hai pic được xác định như sau (hình 8):

Rs =

212

12

WWtt

WV

Wt RR

av

R

av

R

??????

ở đây :

o ΔtR và ΔVR là hiệu của thời gian hoặc thể tích lưu giữ của hai pic, o Wav là độ rộng trung bình của hai pic.

18


Hình 1.8: Sự phân giải pic.

Tiêm mẫu Thời gian

Độ phân giải kém, độ chọn lọc tồi

Độ phân giải kém, độ chọn lọc tốt nhưng thời gian phân tích dài

Độ phân giải kém, độ chọn lọc tốt và thời gian phân tích hợp lí

Độ phân giải kém, độ chọn lọc tốt nhưng thời gian phân tích quá dài, pic bị doãng rộng

19


? Độ phân giải của một cột tách cho biết khả năng tách hai chất phân tích bởi cột. Nếu cột

tách có độ phân giải khoảng 1.5 thì phép tách A và B gần như hoàn toàn (sự xen phủ chỉ còn khoảng 0.3%), trong khi nếu độ phân giải 0.75 thì không tách được còn độ phân giải bằng 1 thì sự xen phủ của hai pic còn khoảng 4%.

? Độ phân giải cho một pha tĩnh đã chọn có thể được cải thiện bởi tăng chiều dài của cột tách (tức tăng số đĩa l í thuyết N của cột tách) nhưng như vậy sẽ làm kéo dài thời gian phân tích.

1.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ phân giải

? Mối quan hệ giữa số đĩa lý thuyết và độ phân giải là:

Từ M

MR

tttk ??'

'1

'2

kk??

2

216W

tN R?

Rs =

212

12

WWtt RR

??

Rút ra:

Độ phân giải Rs = )1

)(1(4 '

2

'2

kkN?

??

?

ở đây: N là số đĩa lý thuyết,

k’2 là hệ số dung lượng của cấu tử thứ hai, α = '1

'2

kk

Nếu số đĩa lý thuyết của 2 pic không giống nhau thì thay thế N bằng 21NN và thay k’2 bằng k’av.

Cải thiện Rs nhờ chiều cao đĩa lý thuyết

20


? Một chi tiết quan trọng trong phương trình trên là độ phân giải tỉ lệ thuận với N . Vì

vậy nếu tăng gấp đôi chiều dài cột thì tăng độ phân giải lên 2 lần. ? Tuy nhiên khi tăng số đĩa lý thuyết lên do tăng chiều dài cột thì quá trình sắc kí phải tiêu

tốn nhiều thời gian hơn trừ khi sự tăng số đĩa là do giảm chiều cao mỗi đĩa và không tăng chiều dài của cột, nhiệt độ của cột (cho trường hợp sắc kí khí) và chiều dày của lớp phim (cho sắc kí lỏng). Việc tối ưu hóa tốc độ pha động cũng có ích.

Cải thiện Rs nhờ hệ số chọn lọc α

? Khi tăng α hay khi tăng tỉ số phân bố thì độ phân giải cũng tăng theo. Cách để thay đổi α là thay đổi pha tĩnh hoặc thay đổi cả pha tĩnh lẫn pha động trong sắc kí lỏng bởi vì thay đổi bản chất của các pha sẽ dẫn đến thay đổi α.

? Khi tỉ số phân bố =2 thì đảm bảo cho sự phân giải tốt. Tuy nhiên sự tối ưu này là cho một cặp cấu tử. Trong trường hợp hỗn hợp chứa nhiều cấu tử thì cần phải thay đổi k’ để có sự phân tách giữa các cấu tử.

? Trong sắc kí khí, giá trị tối ưu hóa của k’ có thể đạt được bằng chương trình hóa nhiệt độ còn trong sắc kí lỏng thì bằng chương trình hóa thành phần pha động tức thay đổi tỉ lệ giữa các dung môi của pha động.

Cải thiện Rs nhờ hệ số dung lượng

? Thường sự tách có thể được cải thiện một cách đáng kể bằng việc thay đổi hệ số dung lượng k’. Nói chung, sự tăng giá trị k’ làm tăng độ phân giải. Để xác định khoảng tối ưu của giá trị k’, phương trình được viết dưới dạng:

'1'k

kQRs ??

Ở đây Q chứa phần còn lại của phương trình.

? Thường giá trị của k’ > 10 nên tránh vì dù tăng lên chút ít độ phân giải nhưng thời gian đòi hỏi cho sự tách tăng lên rất đáng kể. Giá trị tối ưu của k’ trong khoảng từ 1 đến 5.

? Cách dễ nhất để cải thiện độ phân giải là tối ưu hóa k’: Đối với pha động là khí, k’ thường có thể được cải thiện bởi sự thay đổi nhiệt độ. Các phương pháp để giảm chiều cao của đĩa lý thuyết như được đề cập trong mục 4,

bao gồm giảm kích thước hạt nhồi, đường kính của cột

21


Bài tập

Câu 1.1: Trình bày định nghĩa của các khái niệm sau: (2 điểm)

a) Sự rửa giải b) Pha động c) Pha tĩnh d) Hệ số phân bố e) Thời gian lưu f) Hệ số dung lượng g) Độ chọn lọc h) Chiều cao đĩa lí thuyết

Câu 1.2: Trình bày các yếu tố làm doãng rộng các pic (1.5đ)

Câu 1.3: Mô tả phương pháp để xác định số đĩa lí thuyết của một cột sắc kí.

Câu 1.4: Trình bày sự khác nhau giữa

a) Sắc kí khí-lỏng và sắc kí khí-rắn b) Sắc kí lỏng-lỏng và sắc kí lỏng-rắn

Câu 1.5: Trình bày các phương pháp để cải thiện độ phân giải của hai chất trên một cột sắc kí.

Câu 1.6: Trong một phép phân tích sắc kí tinh dầu chanh, pic của limonene có thời gian lưu là 8.36 min với độ rộng đáy pic bằng 0.96 phút. Terpinene rửa giải ở 9.54 phút, với độ rộng đáy pic là 0.64 phút. Tính độ phân giải của 2 pic trên? (Ans: 1.48)

Câu 1.7: a) Trong một phép phân tích sắc kí các axit có trọng lượng phân tử thấp, butyric acid

rửa gải ở thời gian lưu là 7.63 phút. Thời gian không lưu giữ TM của cột là 0.31 phút. Tính hệ số dung lượng của butyric acid. (Ans: 23.6)

b) Thời gian lưu của isobutyric acid là 5.98 phút. Hỏi độ chọn lọc của isobutyric acid và butyric acid? (Ans: 1.29)

Câu 1.8: Trong một phép phân tích sắc kí thuốc trừ sâu cơ clo Dieldrin cho một pic với thời gian

lưu là 8.68 phút và độ rộng đáy pic là 0.29 phút. Hỏi có bao nhiêu đĩa lí thuyết liên quan đến phép tách này ? Cho chiều dài cột là 2.0 met, Tính chiều cao một đĩa lí thuyết? (Ans:0.14 mm)

Câu 1.9: Một hỗn hợp benzene, toluene, và methane được tiêm vào một máy sắc kí khí. Methane

cho một pic sắc nhọn ở 42s, trong khi benzene và toluene có thời gian lưu 251 s và 333s. Tính thời gian lưu hiệu chỉnh và hệ số dung lượng cho mỗi chất tan. Tính độ chọn lọc giữa benzene và toluene. (Ans: α = 1.39)

22


Câu 1.10: Các số liệu sau đây thu được từ phép tách 4 cấu tử trong cột mao quản dài 20-m.

Compound tr (min) w (min) A 8.04 0.15 B 8.26 0.15 C 8.43 0.16

(a) Tính số đĩa lí thuyết của mỗi hợp chất và số đĩa lí thuyết trung bình của cột. (b) Tính chiều cao trung bình của một đĩa lí thuyết. (c) Giải thích tại sao mỗi hợp chất có thể có số đĩa lí thuyết khác nhau.

Câu 1.11: Moody đã nghiên cứu hiệu lực tách của phép tách sắc kí khí 2-butanone trên cột

dinonyl phthalate . Đánh giá chiều cao đĩa lí thuyết như một hàm của tốc độ dòng pha động theo phương trình van Deemter với A là 1.65 mm, B là 25.8 mm x mLx min–1, and C là 0.0236 mm x min x mL–1. (a) Vẽ đồ thị biễu diễn H theo u (tốc độ dòng) trong khoảng 5–120 mL/min. (b) Khoảng giá trị nào của tốc độ dòng pha động cho mỗi giá trị của A, B và C có ảnh hưởng lớn nhất. (c) Giá trị tối ưu của tốc độ dòng và chiều cao của đĩa lí thuyết ở tại giá trị đó (d) Đối với cột mao quản mở thì giá trị A bằng 0. Nếu B và C vẫn không thay đổi thì tốc độ dòng tối ưu là bao nhiêu và chiều cao đĩa lí thuyết ở giá trị này?

23


Chương 2: SẮC KÍ KHÍ

2.1. Mở đầu

2.1.1 Khái niệm

? Cơ sở để tách bằng sắc kí khí là sự phân bố của mẫu thử giữa hai pha: pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn, pha động là khí thấm qua toàn bề mặt tĩnh đó.

? Nếu pha tĩnh là rắn thì gọi là sắc kí khí-rắn. Chất rắn nhồi cột thường là silicagel, rây phân tử hoặc than hoạt tính. Quá trình này chủ yếu là hấp phụ.

? Nếu pha tĩnh là lỏng, ta có sắc kí khí-lỏng. Chất lỏng bao bọc quanh bề mặt một chất rắn trơ, gọi là chất mang, tạo nên một lớp phim mỏng. Cơ sở cho sự tách ở đây chính là sự phân bố của mẫu trong và ngoài lớp phim mỏng này.

2.1.2 Vài nét lịch sử

? 1905 Ramsey tách hỗn hợp khí và hơi dựa trên cơ sở hấp phụ của than hoạt. ? 1906 Tswett tách các sắc tố thực vật trên cột và gọi quá trình tách là ‘sắc kí’ ? 1941 Martin và Synge (giải thưởng Nobel) trình bày lý thuyết đĩa trong chưng cất và

chiết suất ngược dòng. Trên cơ sở đó James và Martin đề xuất ra sắc kí khí-lỏng (1952) ? Từ đó đến nay GC ngày càng hoàn thiện. Đến năm 1968 đã có khoảng 18000 công trình

về GC. Những năm gần đây được sự hỗ trợ của công nghệ điện tử và tin học, GC đạt được nhiều thành tựu hơn nũa.

2.2.Thiết bị

2.2.1. Giới thiệu

? Hiện nay, hơn 30 nhà sản xuất cung cấp ra thị trường khoảng 150 mẫu khác nhau của thiết bị sắc kí khí.

? Trong thập niên 70, các bộ tích phân kế điện tử và xử lý số liệu dựa trên máy tính trở nên thông dụng.

? Thập niên 80 đã xuất hiện các thiết bị sắc kí khí với các thông số như nhiệt độ của cột, tốc độ dòng, tiêm mẫu, được điều khiển bằng máy tính với giá cả vừa phải; và có lẽ quan trọng nhất là sự phát triển của các cột có khả năng tách những mẫu phức tạp có chứa nhiều cấu tử trong một khoảng thời gian ngắn.

Những thành phần chính của thiết bị sắc kí khí được mô tả trong hình 2.1.

24


Hình 2.1: Sơ đồ khối của một máy sắc kí khí

Hình 2.2: Một sắc kí đồ tiêu biểu tách các este bão hòa bởi sắc kí khi-lỏng 1. methyl formate 2. methyl acetate 3. ethyl formate 4. ethyl acetate 5. n-propyl formate 6. iso-propyl acetate 7. n-butyl formate 8. sec-butyl acetate 9. iso-butyl acetate 10. n-butyl acetate

2.2.2 Hệ thống cung cấp khí mang

? Các khí mang phải trơ về mặt hóa học như He, Ar, N2, CO2 và H2 và việc chọn lựa khí mang thường được quyết định bởi loại detector sử dụng.

? Hệ thống cung cấp khí mang bao gồm các bộ điều chỉnh áp suất (pressure regulators), các thiết bị đo áp suất (gauges), và thiết bị đo tốc độ dòng.

? Hệ thống khí mang còn chứa một hệ thống lọc phân tử để tách nước và các chất nhiễm bẩn khác.

? Tốc độ dòng được kiểm soát bởi các bộ điều chỉnh áp suất hai giai đoạn được lắp vào các bình chứa khí mang.

Bộ điều dòng

Bộ điều áp Bộ tiêm mẫu

Bình khí pa động

Lò

Cột tách

Tiêm mẫu Thời gian

Thiết bị đo tốc độ dòng

Lớp đệm cao su silicon

25


? Áp suất của khí vào thiết bị nằm trong khoảng từ 10 đến 50 psi để có tốc độ dòng từ khoảng 30 đến 150 ml/ph đối với cột nhồi và khoảng từ 1 đến 25 ml/ph đối với cột mao quản. Nói chung, nếu áp suất đi vào thiết bị không đổi thì tốc độ dòng sẽ không đổi. Để đo tốc độ dòng khí người ta dùng thiết bị đo tốc độ dòng (flowmeter) với bọt xà phòng và đồng hồ bấm giây.

Khí mang

Độ giảm áp suất tỉ lệ với độ nhớt khí mang nên cần chọn khí mang có độ nhớt thấp cho cột mao quản và cột nhồi chặt. Bảng sau dẫn ra một số đặc tính cơ bản của một số khí mang

Khí Độ dẫn điện χ, 10-4 cal/cm.oK

Độ nhớt η ở 1 atm 50oC 100oC 200oC 300oC

Argon Heli Nito

Hydro

0.52 4.08 0.37 5.47

242 208 188 94

271 229 208 103

321 270 246 121

367 307

- 139

Khi lựa chọn cần chú đến detector đang sử dụng như sau:

? Detector đo độ dẫn cần phải sử dụng khí mang có độ dẫn cao như H2, He. Khí He có ưu điểm không nguy hiểm.

? Detector ion hóa ngọn lửa thường sử dụng khí mang N2 do rẻ và không nhuy hiểm nhưng trong trường hợp ghép nối với các thiết bị khác, ví dụ ghép nối với khối phổ phải dùng khí mang là heli.

? Detector cộng kết ngọn lửa thường dùng khí mang là N2.

Sau đây là đặc điểm của một số khí mang thông dụng:

? Khí H2 khi sử dụng làm khí mang cần dùng khí nitơ làm khí bảo vệ thổi qua cột trước. Trong các phòng thí nghiệm người ta đã dùng phổ biến máy sản xuất khí hydro với công suất từ 125 ml/ph đến 225 ml/ph. Khi dùng H2 trong phòng thí nghiệm phải có mày dò chỗ hở H2 và cấm lửa.

? Khí He, argon là khí trơ hóa học rất thích hợp cho sắc kí ở nhiệt độ cao. ? Khí nitơ do không nguy hiểm, giá rẻ và dễ dàng làm tinh khiết nên N2 được dùng nhiều

cho sắc kí khí. Cần chú y là độ dẫn nhiệt của N2 rất gần với độ dẫn của nhiều khí và hơi nhiều chất hữu cơ nên có trường hợp pic sắc kí có thể bị ngược.

2.2.3 Hệ thống tiêm mẫu

26


? Cách thông dụng nhất để đưa mẫu vào cột là sử dụng một bơm tiêm mẫu vi lượng (microsyringe) để tiêm một mẫu lỏng hoặc khí qua một đệm cao su silicon (septum) chịu nhiệt vào một buồng hóa hơi (injector). Buồng này được đốt nóng với nhiệt độ thích hợp và được nối với cột tách (hình 3).

? Đối với các cột tách thông thường, cỡ mẫu thường thay đổi từ một vài đến 20µl. Cột mao quản đòi hỏi lượng mẫu đưa vào nhỏ hơn nên trong trường hợp này hệ thống chia dòng mẫu được thiết kế trong bộ injector được sử dụng để chỉ giao một phần nhỏ lượng mẫu được tiêm đi vào cột, phần còn lại được thải ra ngoài.

Kỹ thuật sử dụng bơm tiêm

? Hút dung dịch mẫu vào bơm tiêm và điều chỉnh dung dịch đến vạch rồi kéo ngược pit tông ra sau để lượng mẫu đó chuyển hết vào thân bơm tiêm (đầu kim rỗng).

? Sau khi xuyên kim qua lớp đệm cao su silic của injector để yên khoảng 3 đến 5 giây để kim được cân bằng nhiệt độ trong injector rồi mới đẩy pittong.

? Cách này giúp tránh một số cấu tử khó bay hơi còn đọng lại ở đầu kim gây sai số khi định lượng những cấu tử này.

Tiêm mẫu có chia dòng (Split injection)

? Thích hợp cho mẫu có các cấu tử phân tích có nồng độ lớn hơn 0.1% mẫu. ? Với các phân tích có độ phân giải cao, các kết quả tốt nhất thu được cho lượng nhỏ nhất

của mẫu (≤ 1µl) tiêm vào có thể được dò tìm khoảng ≤ 1ng cho mỗi cấu tử. ? Việc tiêm toàn bộ mẫu sẽ làm quá tải cột có đường kính 0.32 mm hoặc nhỏ hơn. Trong

khi đó tiêm mẫu có chia dòng chỉ giới thiệu vào cột khoảng 0.2 đến 2% lượng mẫu. ? Mẫu được tiêm nhanh (< 1s) qua lớp đệm cao su silic (septum) vào vùng hóa hơi của hệ

thống tiêm mẫu (injector) được giữ ở nhiệt độ cao (ví dụ ở 350oC) để quá trình bay hơi mẫu được diễn ra nhanh (hình 4).

? Một dòng chảy mạnh của khí mang lôi kéo mẫu qua buồng trộn, ở đó có sự hóa hơi hoàn toàn và hòa trộn tốt.

? Tại điểm chia dòng, một phần nhỏ của hơi đi vào trong cột sắc kí còn phần lớn đi qua van chia dòng đến lỗ thông khí thải. Tỉ lệ của mẫu không được giới thiệu vào cột được gọi là tỉ số chia dòng (split ratio) có giá trị từ 50:1 đến 600:1. Sau khi mẫu bị sục ra khỏi buồng tiêm mẫu (khoảng 30 s), van chia dòng đóng lại và khí mang được giảm tương ứng.

? Một µl chất lỏng được tiêm vào sẽ tạo khoảng 0.5 ml thể tích khí và nhanh chóng làm đầy buồng tiêm mẫu. Vài khí có thể thoát ra trở lại theo đường của đệm cao su silicon.

? Các cấu tử có nhiệt độ sôi thấp sẽ thoát ra đầu tiên rồi đến các cấu tử có nhiệt độ sôi cao hơn. Nhiệt độ của buồng tiêm mẫu nên đủ lớn để giảm thiểu phần mất này của mẫu. Tuy nhiên nếu nhiệt độ quá cao, sự phân hủy mẫu có thể xảy ra.

? Trong suốt quá trình tiêm mẫu và sắc kí, có dòng khí 1ml/ph làm sạch lớp đệm cao su silicon để tách hơi mẫu dư và các khí thoát ra từ lớp đệm cao su này (septum purge).

27


Tiêm mẫu không chia dòng (splitless injection)

? Thích hợp cho phân tích lượng vết những cấu tử có nồng độ nhỏ hơn 0.01% mẫu và cách tiêm này có khoảng 80 % mẫu được giới thiệu vào cột.

? .Hệ thống tiêm mẫu tương tự như trường hợp tiêm mẫu chia dòng (hình 2), nhưng ống thủy tinh trong buồng tiêm mẫu là thẳng, trống và không có buồng trộn mẫu.

? Một thể tích lớn (khoảng 2 µl) của dung dịch được pha loãng trong dung môi có nhiệt độ sôi thấp được tiêm chậm (khoảng 2s) vào trong ống thủy tinh của buồng tiêm mẫu với lỗ thoát chia dòng bị đóng.

? Nhiệt độ của buồng tiêm mẫu cho chế độ không chia dòng giữ thấp hơn (khoảng 220oC) so với chế độ chia dòng vì mẫu bị lưu giữ lâu hơn trong buồng tiêm mẫu và tránh mẫu bị phân hủy nhiệt.

Hình 2.3: Hệ thống tiêm mẫu có chia dòng, không chia dòng và tiêm mẫu vào cột

2.3. Cột sắc ký

2.3.1. Giới thiệu

Trong thực tế có nhiều dạng cột tách khác nhau nhằm thỏa mãn các mục đích nghiên cứu. Nói chung, cột tách sắc kí cần thỏa mãn các yêu cầu sau:

? Đảm bảo trao đổi chất tôt giữa pha động và pha tĩnh nhờ việc tối ưu hóa các thông số của phương trình Van Deemter.

? Độ thấm cao tức có độ giảm áp suất nhỏ với một tốc độ khí mang nhất định. ? Khả năng tải trọng cao của cột. ? Có khoảng nhiệt độ sử dụng rộng và chịu được nhiệt độ cao.

2.3.2. Cột nhồi

2 mL/min

1 mL/min

Dòng làm sạch septum

Van chia dòng

Cột tách Nhiệt độ bằng nhiệt độ ban đầu của lò

Tiêm mẫu chia dòng Tiêm mẫu không chia dòng Tiêm mẫu vào côtj

28


? Cột thường được làm bằng thép không rỉ, nicken, thủy tinh với đường kính khoảng từ 3 đến 6 mm và chiều dài khoảng từ 1 đến 5 m.

? Cột nhồi chứa các hạt chất mang rắn được phủ một lớp pha tĩnh lỏng hoặc bản thân hạt rắn là pha tĩnh. Chất mang rắn thường là diatomite đã được silan hóa để giảm liên kết hydro với các chất phân cực:

- Si - O - Si - + (CH ) SiNHSi(CH ) - Si - O - Si - + NH

OH OH ( CH ) SiO OSi(CH )

3 3 3

3 3 3 3

3 3

? Kích thước hạt đồng nhất sẽ làm giảm chiều cao cột và tăng độ phân giải. Cở hạt nhỏ sẽ làm giảm thời gian cân bằng hòa tan nhờ vậy làm cải thiện hiệu quả của cột. Tuy nhiên, nếu kích thước hạt càng nhỏ thì càng ít không gian trống giữa các hạt và áp suất để ép pha động qua cột phải càng cao.

? Kích thước hạt được biểu diễn theo micromet hoặc cở mesh, tức là cở lưới mà hạt có thể đi qua hoặc bị giữ lại trên sàng. Ví dụ các hạt cở 80/100 mesh đi qua được cở sàng 80 mesh (170µm) nhưng không đi qua được cở 100 mesh (150 µm).

? Yêu cầu của chất mang rắn là không tham gia vào sự tách và có khả năng giữ được pha tĩnh (không ít hơn 10 %).

Một số loại chất mang rắn:

Có hai điều quan trọng cần chú ý khi chọn một chất mang là: cấu trúc và đặc tính bề mặt.

? Cấu trúc góp phần vào hiệu quả của chất mang, trong khi các đặc trưng bề mặt chi phối sự tham gia của chất mang vào kết quả của việc tách.

? Các chất mang phải là các chất trơ về mặt hóa học với tất cả các loại mẫu. Nó nên có diện tích bề mặt lớn để pha lỏng có thể trải thành một lớp phim mỏng và cấu trúc bề mặt phải thích hợp để lưu giữ lớp phim mỏng đó. Tuy nhiên, diện tích bề mặt lớn không là điều đảm bảo cột hiệu quả.

Hầu hết các chất mang trong sắc ký cột nhồi được tạo từ diatomite. Loại chất mang đầu tiên dùng trong sắc ký khí do hãng Johns Manville chế tạo có tên thương mại là Chromosorb. Sau đây là một số loại chất mang thông dụng.

? Chromosorb A dùng ở qui mô điều chế, có khả năng giữ tốt pha lỏng (tối đa đến 25%), có cấu trúc khó bị phá vở và có bề mặt khá trơ. Thường được sản xuất ở kích thước 10/20, 20/30 và 30/40 mesh. Sử dụng cho những cột dài, chênh lệch áp suất thấp.

? Chromosorb G dùng để tách các hợp chất phân cực. Nhờ có diện tích bề mặt thấp, độ cứng, tỉ trọng cao nên nó được sử dụng cho các trường hợp tẩm pha lỏng hàm lượng thấp. Tẩm 5% trên Chromosorb G tương ứng với tẩm 12 % trên Chromosorb W.

29


? Chromosorb P được chế tạo từ gạch chịu lửa C-22 có màu hồng (nên có kí hiệu P-pink) và tương đối cứng. Bề mặt ít hấp thụ hơn so với các loại Chromosorb khác, được dùng cho những việc tách hydrocacbon.

? Chromosorb W được chế tạo từ Celite 545, màu trắng và dễ vỡ hơn so với loại G. Bề mặt tương đối không hấp thụ và được dùng để tách các hợp chất hữu cơ phân cực.

Có hai vấn đề chung của các chất mang:

? Thứ nhất, tương tác bề mặt chất mang (hấp phụ hoặc xúc tác) chính là nguyên nhân gây ra những pic có đuôi hoặc biến dạng. Chính những nhóm -OH hay oxit trên bề mặt chất mang là nguyên nhân của những tương tác đó. Có thể che các nhóm này bằng một lượng nhỏ pha lỏng phân cực. Nhưng cách tốt nhất hiện nay là silan hóa với các thuốc thử DMCS (dimethyl dichorosilan) hoặc HMDS (hexamethyl disilazane).

? Thứ hai, kích thước hạt càng nhỏ thì số hạng A trong phương trình Van Deemter càng nhỏ, nhưng sự chệnh lệch áp suất trong cột sẽ tăng vượt khỏi giới hạn làm việc thực tế. Hiệu suất cột chỉ có thể cải thiện nếu dùng các hạt có kích thước như nhau.

Tỉ lệ phần trăm pha lỏng

? Lượng chất lỏng cần phải đủ để bao bọc các hạt bằng một lớp mỏng đồng nhất. Pha lỏng quá nhiều sẽ đọng lại ở những chỗ trống giữa các hạt làm giảm hiệu suất cột. Trên chất mang Chromosrb khi tỉ lệ pha lỏng lớn hơn 30% hiệu quả của cột giảm đi rất nhiều. Trước đây người ta hay tẩm 15-30% chất lỏng, nhưng hiện nay có khuynh hướng chỉ tẩm 2-10%.

? Vì thời gian lưu tỉ lệ với lượng pha lỏng trong cột nên phép phân tích càng nhanh khi cột có lượng pha lỏng phủ lên càng nhỏ. Khi tải chất lỏng quá thấp sẽ xuất hiện những tâm hấp phụ trên chất mang. Muốn tránh điều này cần phải dùng những chất mang trơ.

? Độ bay hơi của mẫu thử cũng phải tính đến khi chọn lượng pha lỏng. Các chất khó bay hơi như steroit cần phải được phân tích trong những cột có tải thấp (khoảng 3% hay thấp hơn). Các chất rất dễ bay hơi như các hydrocacbon nhẹ thì cần có cột tải cao (20-30%) vì lượng chất lỏng càng nhiều thời gian các chất có trong pha lỏng càng lâu, sự phân bố càng tốt.

Mật độ nhồi

Mật độ nhồi có một sự ảnh hưởng rõ rệt đến sự lưu giữ trên pha tĩnh. Pha tĩnh được phủ trên một chất mang trên cơ sở phần trăm trọng lượng, trong khi vật liệu nhồi được đặt trong cột trên cơ sở thể tích. Nếu mật độ nhồi của chất mang tăng lên, khối lượng tổng của pha tĩnh trong cột tăng lên.

Chuẩn bị pha tĩnh và nhồi cột:

30


Tẩm pha tĩnh lên chất mang có nhiều cách, một trong số đó là dùng máy cất quay chân không.

? Lấy một lượng pha tĩnh tính toán sẵn hòa tan vào trong một dung môi thích hợp trong một bình đáy tròn, cho tiếp chất mang rắn với lượng tính toán thích hợp vào. Lắp bình vào máy cất quay. Quay bình cho đến khi dung môi bay hết. Đun nóng bình bằng cách thủy hoặc bằng đèn hồng ngoại.

? Lấy đoạn ống thẳng có chiều dài và đường kính mong muốn, nút một đầu bằng bông thủy tinh, đầu kia lắp một cái phểu, đổ đầy chất mang đã tẩm pha lỏng vào phểu. Lắc cột bằng máy lắc hoặc đập nhẹ vào cột đến khi không thấy giảm thể tích chất mang trên phểu nữa thì cột đã nạp đầy. Nút đầu còn lại bằng bông thủy tinh và cuộn ống lại cho thích hợp với lò ổn nhiệt của máy GC.

Luyện cột:

? Cột cần phải đặt ít nhất 2 giờ ở 25 oC trên nhiệt độ tối đa mà cột sẽ sử dụng nhưng không được quá giới hạn trên của nhiệt độ bay hơi của pha lỏng.

? Một luồng khí mang nhỏ (5-10 ml/ph) được cho qua cột. Đầu ra của cột hở không nối với detector để tránh làm bẩn nó.

2.3.3. Cột mao quản

? Đa số các phép phân tích trong sắc kí khí sử dụng các cột mao quản dài từ 15 đến 100 m và đường kính trong rất nhỏ từ 0.10 đến 0.53 mm. Các cột này được chế tạo từ thủy tinh oxit tinh khiết nấu chảy có mức độ liên kết ngang cao hơn nhiều so với thủy tinh thường nên bền và chịu được nhiệt độ cao đến 350oC. Lực căng cao của ống thủy tinh cho phép chế tạo các cột có thành mỏng và dễ uốn.

? Các cột mao quản mở có lớp phim mỏng tráng trên thành ống cung cấp độ phân giải cao hơn, thời gian phân tích ngắn hơn và độ nhạy cao hơn cột nhồi nhưng chúng có dung lượng thấp hơn cho các mẫu. Cột mao quản mở hẹp cung cấp độ phân giải cao hơn cột mao quản mở rộng hơn nhưng chúng đòi hỏi áp suất cao hơn để hoạt động và có dung lượng cho mẫu nhỏ hơn.

? Lớp phim mỏng lỏng pha tĩnh dày khoảng từ 0.1 đến 5 µm trên bề mặt bên trong như được minh họa trong hình 2.5. Nếu giảm độ dày của lớp phim này sẽ làm tăng độ phân giải, giảm thời gian lưu và giảm dung lượng cho mẫu.

? Một loại khác là các cột mao quản có các hạt rắn chất mang phủ một lớp pha tĩnh lỏng được gắn trên bề mặt bên trong của cột. Bởi vì diện tích bề mặt của loại này tăng lên, cột này có thể xử lý những mẫu lớn hơn cột phủ lớp phim mỏng trên thành cột. Loại cột này là trung gian giữa cột mao quản phủ phim mỏng trên thành và cột nhồi.

31


Hình 2.4: Cột mao quản được làm bằng polyamide và fused silica

Hình 2.5: Minh họa cấu trúc bên trong của các cột nhồi và cột mao quản

2.3.4. Những yêu cầu về pha tĩnh lỏng

? Một pha tĩnh lỏng lý tưởng cho sắc ký khí lỏng cần thể hiện độ chọn lọc và khả năng hòa tan của các cấu tử được tách và có khoảng nhiệt độ làm việc rộng.

? Nó cũng phải bền hóa học và có áp suất hơi bão hòa thấp ở tại các nhiệt độ cao.

Chất mang Pha lỏng

Cột nhồi Cột mao quản

32


? Nhiệt độ làm việc nhỏ nhất nên gần nhiệt độ phòng, ở đây chất lỏng pha tĩnh phải tồn tại ở dạng lỏng chứ không phải rắn.

? Khi chọn lựa pha tĩnh, một sự thỏa hiệp giữa lý thuyết và thực nghiệm phải được xem xét. Ví dụ theo phương trình Van Deemter thì hiệu quả tách của cột cao hơn nếu cột chứa pha tĩnh lỏng ít hơn so với cột như vậy chứa pha tĩnh lỏng nhiều hơn. Nhưng trong thực tế pha tĩnh lỏng phủ trên chất mang mỏng quá có thể tạo nên một sự che phủ không đầy đủ các vị trí hoạt động trên bề mặt chất mang dẫn đến sự kéo đuôi của pic, khi đó cần tăng phần trăm của pha tĩnh lỏng trên chất mang.

? Các phép tách trong sắc ký khí lỏng là kết quả của những tương tác pha tĩnh hòa tan chọn lọc và sự khác nhau của hơi bão hòa của các chất tan. Lực tương tác chính chịu trách nhiệm trong tương tác của chất hòa tan với pha tĩnh là phân bố, cảm ứng, định hướng và tương tác cho nhận. Tổng của chúng được đo lường bởi “độ phân cực” của pha tĩnh đối với chất tan.

Trong sắc ký khí lỏng, khả năng chọn lọc của một cột chi phối khoảng trống giữa các pic và độ lớn cực đại của pic được tách. Sự khác nhau về độ chọn lọc là có ý nghĩa vì chúng cho phép việc tách các chất tan có cấu trúc gần giống nhau bởi một pha tĩnh chọn lọc.

Các thông số sau đây ảnh hưởng đến độ chọn lọc:

? Bản chất của pha tĩnh ? Nồng độ của pha tĩnh ? Nhiệt độ cột ? Việc chọn lựa và xử lý sơ bộ chất mang rắn hoặc chất hấp phụ.

Một vài loại pha tĩnh lỏng thông dụng được liệt kê trong bảng và việc chọn pha tĩnh lỏng cho một đối tượng mẫu được dựa trên qui tắc “các chất càng giống nhau thì càng tan tốt vào nhau”.

? Cột không phân cực là tốt nhất cho mẫu phân tích không phân cực. ? Các cột có độ phân cực trung bình thì tốt cho mẫu phân cực trung bình và phân cực mạnh

thì tốt cho mẫu phân cực mạnh. ? Ví dụ để tách ancol ta phải chọn pha lỏng phân cực như cacbowax-20, ngược lại để tách

hidrocacbon no mạch thẳng phải sử dụng các pha lỏng không phân cực. ? Khi cột dùng nhiều bị lão hóa thì pha tĩnh bị đốt bay mất nên các nhóm silan (Si-OH) bị

lộ ra và các pic bị kéo dài đuôi tăng lên. ? Nếu trong cột có oxi ở nhiệt độ cao cũng dẫn đến sự thoái hóa cột và pic bị kéo đuôi. Để

giảm khuynh hướng pha tĩnh bị mất ở nhiệt độ cao, người ta gắn chúng vào bề mặt pha tĩnh silica bằng các liên kết cộng hóa trị.

Người ta chia các pha lỏng và các đối tượng cần tách ra nhiều nhóm theo tính phân cực của phân tử như sau:

33


? Nhóm rất phân cực: H2O, glycol, glyxerin, poliphenol, axit dicacboxylic. ? Nhóm phân cực: ancol mạch thẳng, axit béo hữu cơ, phenol, amin bậc 1,2, hợp chất nitro

và nitril có chứa hydro α. ? Nhóm phân cực trung bình: ete, ankanal, ankanon, este, amin bậc 3, hợp chất nitro và

nitril không chứa hidro α. ? Nhóm ít phân cực: hidrocacbon thơm, anken, hidrocacbon đã bị halogen hóa một phần. ? Nhóm không phân cực: ankan, thioankanol, sunfua, ankan đã bị halogen hóa.

Các loại pha tĩnh phổ biến nhất là Squalane, polysioxanes và polyethylene glycol.

-Squalane

CH3 CH3 CH3 CH3

HC-(CH2)3-CH-(CH2)3-CH-(CH2)4-CH-(CH2)3-CH-(CH2)3-CH

CH3 CH3 CH3 CH3

-Polysioxanes: là các pha tĩnh được sử dụng rộng rải nhất cho các cột sắc ký khí mao quản cũng như cột nhồi. Bởi vì cấu trúc của chúng có thể được gắn thêm một số loại nhóm chức đa dạng nên chúng thể hiện tính phân cực trong một dải rộng. Các loại silicon này là dạng gôm nhớt nên có thể phủ tốt trên silica và cũng thích hợp lý tưởng cho cột sắc ký mao quản.

34


Polyethylene glycol

? Các pha tĩnh không chứa silicon được sử dụng rộng rải nhất là các polyethylene glycol. Chúng có sẵn trên thị trường với một khoảng rộng của trọng lượng phân tử như Carbowax 20M và Superox-4.

? Cấu trúc chung của một polyethylene glycol có thể được mô tả như sau:

HO-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2-)n-O-CH2-CH2-OH

Loại pha tĩnh lỏng này có độ phân cực cao, nhưng cũng có một vài hạn chế. Ví dụ Carbowax 20M có nhiệt độ làm việc cực đại khá thấp 225oC và nhiệt độ làm việc tối thiểu là 60oC. Hơn nữa, những lượng vết của oxi và nước có những ảnh hưởng không tốt trên các pha tĩnh lỏng nhưng đặc biệt không tốt cho carbowax 20M, làm tăng nhanh quá trình lão hóa của cột.

35


2.3.5. Chỉ số lưu Kovats

? Việc báo cáo các số liệu như thời gian lưu tuyệt đối tR là vô nghĩa bởi vì hầu như mỗi thông số sắc ký và bất kỳ dao động thực nghiệm liên quan đều tác động đến phép đo thời gian lưu giữ.

? Với việc sử dụng số liệu thời gian lưu giữ tương đối (α = t’R2/t’R1) đã có một vài cải thiện, nhưng việc thiếu một tiêu chuẩn thống nhất thích hợp cho một khoảng nhiệt độ rộng trên các pha tĩnh có độ phân cực khác nhau đã làm giảm những sự tiện ích của nó.

? Thể tích lưu tương đối cũng ít được sử dụng vì chúng phụ thuộc vào rất nhiều thông số như chiều dài cột tách, lượng pha tĩnh, lưu lượng dòng…

Kovats và Ettre đã thống nhất đề nghị chọn dãy đồng đẳng n-ankan là chất chuẩn nhằm xác định thể tích lưu tương đối vì:

? Các n-ankan không có dị tố về nhóm chức nhằm tránh các hiệu ứng lưỡng cực-lưỡng cực, hiệu ứng cảm ứng giữa phân tử lưỡng cực –trung hòa.

? Giữa chúng và pha tĩnh tương tác với nhau chỉ theo lực khuếch tán Van Der Waals nên thể tích lưu của chúng đối với bất cứ pha tĩnh nào cũng không khác nhau nhiều hay có thể xem là không đổi.

? Trong sự tiếp cận của Kovat, chỉ số lưu I của một n-ankan được công nhận một giá trị bằng 100 lần số cacbon của nó. Ví dụ, các giá trị I của n-octan, n-decan, và n-dodecan lần lượt bằng 800, 1000 và 1200. Theo định nghĩa đó I có thể áp dụng trên bất kỳ cột nào, mao quản hở hoặc nhồi, với bất kỳ pha lỏng và độc lập với mỗi điều kiện sắc ký, bao gồm cả nhiệt độ cột.

? Đối với tất cả các hợp chất khác, các điều kiện sắc ký như pha tĩnh, nồng độ của nó, chất mang và nhiệt độ cột nhồi phải được chỉ rõ. Bởi vì các chỉ số lưu cũng là phương pháp thích hợp cho việc báo cáo các số liệu lưu giữ với các cột mao quản nên pha tĩnh, độ dày lớp phim và nhiệt độ cột cũng phải được chỉ định rõ cho những hợp chất khác n-ankan; ngược lại các giá trị I là vô nghĩa.

? Chỉ số lưu I của cấu tử khác được xác định bằng cách so sánh thời gian lưu của nó với với thời gian lưu của hai n-ankan, trong đó một cấu tử được rửa giải ra trước còn cấu tử kia được rửa giải ra sau chất nghiên cứu trong những điều kiện sắc kí cụ thể.

? Nói cách khác, chỉ số lưu của một chất phân tích ở tại nhiệt độ cột đẳng nhiệt có thể được tính toán từ phương trình sau:

'

,'

1,

',

',

loglog)log(log

100100ZRZR

ZRxRx tt

ttZI

??

???

Ở đây:

36


t’R,x là thời gian lưu được hiệu chỉnh của cấu tử đang xét.

t’R,Z là thời gian lưu được hiệu chỉnh của n-ankan rửa giải trước chất nghiên cứu,

t’R,Z +1 là thời gian lưu hiệu chỉnh của n-ankan rưả giải sau nó,

Z là số cacbon của n-ankan có thời gian lưu giữ t’R,Z .

? Với những lần chạy sắc ký theo chương trình hóa nhiệt độ, các thời gian lưu hiệu chỉnh trong phương trình trên được thay thế bởi các nhiệt độ rửa giải thích hợp (K).

? Nếu sự khác biệt về số cacbon giữa hai n-ankan trên không phải là 1 mà là 2 hoặc lớn hơn thì phân số trong phương trình trên sẽ được nhân với 200 hoặc một bội số tương ứng của 100.

? Ví dụ: hãy tính chỉ số lưu Kovats của hợp chất X có thời gian lưu tR,x =15.7 phút ? Biết tR(n-octan) = 14.3 và tR,(n-nonan) = 18.5 phút và tR(metan) = 0.5 phút thu được trong cùng

điều kiện sắc kí xác định. Ta có thời gian lưu hiệu chỉnh của các cấu tử: t’R,x =15.7 – 0.5 = 15.2 phút

t’R(n-octan) = 14.3 – 0.5 = 13.8 phút

t’R,(n-nonan) = 18.5 – 0.5 = 18.0 phút

Áp dụng phương trình trên ta có:

Ix = lg15.2 lg13.8800 100( )lg18.0 lg12.8

???

= 836

Trong trường hợp này ta nói cấu tử X có số nguyên tử cacbon biểu kiến là 8,36.

Vì vậy ta có thể định nghĩa chỉ số Kovats như sau: chỉ số lưu Kovats bằng tích số của 100 với số nguyên tử cacbon biểu kiến.

? Chỉ số lưu làm chuẩn hóa các biến thiết bị trong sắc ký khí cho phép các số liệu lưu giữ được tạo trong những hệ thống sắc ký khác nhau có thể so sánh được. Ví dụ, isoamyl acetat với chỉ số lưu 1128 sẽ bị rửa giải giữa n-C11 và n-C12 dưới cùng điều kiện sắc ký. Những chỉ số lưu giữ cũng rất hữu ích trong việc so sánh trật tự rửa giải của một loạt các chất tan trên một cột cụ thể tại một nhiệt độ đã cho và trong việc so sánh hai hoặc nhiều cột.

Mối liên hệ giữa chỉ số lưu và cấu trúc của các hợp chất:

Giữa cấu tử cần xác định và pha tĩnh có các lực tương tác khác nhau:

? Tương tác lưỡng cực-lưỡng cực ? Lực liên kết hydro, khả năng tạo phức cho nhận

37


? Lực Van Der Waals

Thông thường các loại lực tương tác trên đều xuất hiện đồng thời, tùy theo cấu trúc mà loại lực nào sẽ trội hơn các loại lực khác. Dựa vào chỉ số lưu Kovats có thể nghiên cứu mối quan hệ giữa sự lưu giữ và cấu trúc hóa học của các cấu tử nghiên cứu cũng như pha tĩnh.

So sánh chỉ số lưu của hai hợp chất trong cùng một pha tĩnh

Theo dõi chỉ số lưu của một loạt hợp chất có cùng số C nhưng khác nhóm chức để rút ra những gia số ứng với thành phần cấu trúc khác nhau.

Ví dụ hai hợp chất hexylxiclopropan và 1-octan.

? Các chỉ số lưu của chúng ở 80oC trên pha tĩnh squalan là 913.0 và 782.7. ? Các hydrocacbon no mạch thẳng tương ứng là n-nonan (I80 = 900) và n-octan (I80 = 800).

Như vậy các gia số ứng với các nhóm chức trên là +13 và -17.3. ? Dự đoán chỉ số lưu của hợp chất 5-hexenylxiclopropan là = 900 + 13 – 17.3 = 895.7 ? Giá trị thực nghiệm đo được của hợp chất này I80 của hợp chất này đúng bằng 895.7. Lí

do của sự trùng hợp này là hai nhóm chức ở xa nhau nên không có sự tương tác qua lại.

So sánh chỉ số lưu của một hợp chất trên hai pha tĩnh khác nhau

Để minh họa ta xét một loạt giá trị chỉ số lưu của các hợp chất có 6C như trong bảng sau:

Cấu trúc Tên chất IS IDC200 IPPG ∆I CH2=CH-(CH2)3CH3

CH3-(CH2)4-CH2-Cl

CH3-(CH2)4-CHO

CH3-(CH2)3CH2-CO-CH3

O

CH3-(CH2)CH2-OH

Hexen-1

Xiclohexan

1-clohexan

Benzene

Hexanal

Hexanon-2

Xiclohexanon

Hexanol-2

584.5

674.8

829.1

651.0

741.5

726.0

831.1

798.5

591.2

672.3

851.6

692.3

790.2

781.2

893.9

891.3

610.5

699.2

922.6

767.9

899.0

891.0

1038.2

1103.8

26.0

24.4

93.5

116.9

157.5

165.0

207.1

305.3

IS = chỉ số lưu với cột Squalan (100m x 0.25 mm), T = 100oC

38


IDC200 = chỉ số lưu cột DC 200 (100m x 0.25 mm) , T = 100oC

IPPG = chỉ số lưu với cột Polypropylenglycol (100mx0.25 mm), T = 100oC

∆I = IPPG - IS

Trong ba pha tĩnh sử dụng ở đây squalan có tính không phân cực; popropylen có tính phân cực mạnh; còn dầu silicon có tính phân cực trung bình.

Theo định nghĩa của Kovats thì n-hexan có chỉ số lưu là 600.

Các giá trị trong bảng có thể được giải thích như sau:

? n-hexanol có I là lớn nhất vì chúng có tương tác lưỡng cực-lưỡng cực đặc biệt mạnh với sự tham gia cầu nối hydro giữa các nhóm hydroxyl với nguyên tử oxi của ete của polypropylenglycol. Các amin bậc một và bậc hai tương ứng còn có tương tác mạnh hơn nữa.

? Hexen-1 và xiclohexan có các giá trị ∆I nhỏ nhất. Các olefin có tương tác mạnh hơn do có chứa các điên tử pi cho tương tác lưỡng cực cảm ứng.

? Giá trị ∆I của benzene lớn hơn hẳn so với của 1- hexen do có cấu trúc hệ pi liên hợp. ? Phân tử 1-clohexan có chứa lưỡng cực C-Cl nên phân tử này có độ phân cực mạnh tương

đương với độ phân cực của 3 liên kết đôi gộp lại. ? Cả ba hợp chất chứa nhóm cacbonyl đều cho các giá trị ∆I tương đương nhau. Tuy nhiên

xiclohexan lớn hơn rõ rệt so với hexanon-2 do cấu trúc mạch vòng đóng một vai trò đáng kể.

Qua ví dụ trên ta thấy có một mối tương quan chặt chẽ giữa cấu trúc hóa học của các chất với các chỉ số lưu của chúng.

2.3.5. Sự phân loại các pha tĩnh của Mc Reynolds.

2.3.5.1 Cách tiếp cận của Mc Reynolds

? Hệ thống được sử dụng rộng rải nhất trong phân loại các pha tĩnh là hệ thống Mc Reynolds.

? Mc Reynolds đã chọn 10 chất hòa tan thăm dò có những chức khác nhau, mỗi chức được định rõ để đo một tương tác cụ thể với một pha lỏng.

? Ông đo các giá trị I của chúng trên khoảng 200 pha khác nhau, bao gồm Squalane, được phục vụ như một pha lỏng tham khảo dưới cùng một điều kiện sắc ký. Mc Renolds đã tính toán cho mỗi chất giá trị ΔI: ΔI = I liquiphase- I squalane

? Khi sự khác nhau trong chỉ số lưu cho một chất dò trên một pha lỏng đã cho và squalane tăng lên, mức độ tương tác cụ thể liên quan đến chất dò tăng lên.

2.3.5.2. Bảng các chất dò được sử dụng trong sự phân loại các pha tĩnh lỏng

39


? Trong bảng này, 5 hằng số đầu tiên của McRenolds thường được xuất hiện và được biểu diễn bởi các ký hiệu X’, Y’, Z’, U’ và S’.

? Một sự tiếp cận tương tự được thực hiện trước đó bởi Rohrscheiner với 5 chất hòa tan. ? Mỗi chất dò được ấn định giá trị zero với squalane như là pha lỏng tham khảo.

Ký hiệu Chất dò của McReynolds Chất dò của Rohrschneider

Tương tác được đo

X’

Y’

Z’

U’

S’

H’

J’

K’

L’

M’

Benzen

n-Butanol

2-Pentanone

Nitropropane

Pyridine

2-methyl 2-metanol

Iodobutan

2-octyne

1,4 dioxane

Cis-hydrindane

Benzen

Etanol

2-butanone

Nitrometan

Pyridine - - - - -

Mật độ electron cho các hydrocacbon thơm và olefin.

Năng lực cho nhận proton

(ancohol,axit, nitrils).

Tương tác nhận electron (ketone, ete, andehit, este).

Các tương tác lưỡng cực

Tương tác nhận electron mạnh

Tương tác ancol được thế tương

tự như n-butanol.

Các tương tác ankan phân cực

Tương tác hydrocacbon không bão hòa giống như benzene

Tương tác nhận proton

Tương tác phân tán

Ứng dụng:

? Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của các hằng số McRenolds là để nhận biết được những pha tĩnh giống nhau hoặc tương tự nhau nhằm tránh được việc sử dụng trùng lắp.

? Một ứng dụng khác là sử dụng để lựa chọn các cột tách thích hợp. Nói chung giá trị hằng số McRenolds càng lớn thì pha tĩnh có khả năng giữ được cấu tử cần tách lâu hơn.

? Ví dụ pha tĩnh cabowax 20M tách ancol thích hợp hơn OV-17 hoặc OV-101 (giá trị tương ứng của các pha là 536, 158, 57). Để tách các hợp chất mang nhóm chức khác nhau thí dụ ancol khỏi xeton, este… thì giá trị X’, Y’, Z’ … cần phải khác nhau xa.

? Dựa vào hằng số McRenolds ta có thể dự đoán được thứ tự rủa giải của các cấu tử. Các hằng số McRenolds của các pha tĩnh phổ biến cho cột nhồi GC được liệt trong bảng sau:

40


Bảng các hằng số McRenolds và các pha tĩnh được sử dụng thông thường

Pha T(oC) min/max

Bản chất hóa học X’ Y’ Z’ U’ Z’ Các pha có cấu trúc tương tự

Squalane DC200 DC700 SE-30 SE-54 OV-1 OV-3 OV-7 OV-11 OV-17 OV-22 OV-25 OV-61 OV-73 OV-101 OV-105 OV-202 OV-210 OV-215 OV-225 OV-275 OV-330 OV-351 OV-1701 SP 2100 SP2250 SP2300 SP2310 SP2330 SP2340 SP2401

20/100 0/200 5/250 50/300 50/300 100/350 0/350 0/350 0/350 0/375 0/350 0/350 0/350 0/325 0/350 0/275 0/275 0/275 0/275 0/265 25/275 0/250 50/270 0/250 0/350 0/375 20/275 25/275 25/275 25/275 0/275

Paraphin Dimetyl silicon Phenylmetyl silicon Dimetyl 5%phenyl 1% vinyl Dimetyl 10%phenyl-phenyl metyl dimetyl 20%phenyl-phenyl metyl dimetyl 35%phenyl-phenyl metyl dimetyl 50% phenyl 50% metyl 65%phenyl-phenyl metyl dimetyl 75%phenyl-phenyl metyl dimetyl 33%phenyl-diphenyl dimetyl 5.5%phenyl-diphenyl dimetyl Dimetyl (lỏng) Cyanopropylmetyl-dimetyl Trifluoropropyl-metyl(lỏng) Trifluoropropyl-metyl(lỏng) Trifluoropropyl-metyl(gôm) Cyanopropylmetyl-phenylmetyl Dicyanoallyl Phenylsilicon-cabowax copolimer Cabowax nitroterephtalic acid polimer 14%cyanopropylphenyl Metyl 50%phenyl 50%cyanopropyl 55%cyanopropyl 90%cyanopropyl 100%cyanopropyl trìluoropropyl

0 16 107 15 33 16 44 69 102 119 160 178 101 40 17 36 146 146 149 225 629 222 335 67 17 119 316 440 490 529 146

0 57 149 53 72 55 86 113 142 158 188 204 143 86 57 108 238 238 240 369 872 391 552 170 57 156 495 637 725 757 238

0 45 153 44 66 44 81 111 145 162 191 208 142 76 45 95 358 358 363 338 763 273 382 153 45 162 446 605 630 659 358

0 66 228 64 99 65 124 171 219 243 283 305 213 114 67 139 468 468 478 492 1106 417 583 228 67 243 637 840 913 942 468

0 43 190 41 67 42 88 128 178 202 253 280 174 85 43 86 310 310 315 386 849 368 540 171 43 202 530 670 778 800 310

SP-2100,SE-30,OV-101,OV-1 SP-2100, OV-101, OV-1 SP-2100 DC-710 SP2250 SP-2100,SE-30,OV-1 SP-2401 SP2300 SP2340 SP-1000 SE-30,OV-101,OV-1 OV-17 OV-225 OV210

2.4. Detector

41


2.4.1. Detector đo độ dẫn nhiệt (Thermal conductivity detector)

2.4.1.1. Giới thiệu

? Trước đây, detector đo độ dẫn nhiệt là loại thông dụng nhất trong sắc kí khí bởi vì nó đơn giản và đáp ứng hầu hết các chất phân tích.

? Không may, độ dẫn nhiệt không đủ nhạy để dò tìm những lượng nhỏ của chất phân tích tách từ cột mao quản mở có đường kính cột nhỏ hơn 0.53 mm.

? Các detector đo độ dẫn nhiệt vẫn còn sử dụng cho cột mao quản đường kính 0.53 mm và cho các cột nhồi.

Bảng Độ dẫn nhiệt tại 273 K và 1 atm

Khí Độ dẫn nhiệt J/(K.m.s)

Phân tử lượng

H2 He

NH3 N2

C2H4 O2 Ar

C3H8 CO2 Cl2

0.170 0.141 0.0215 0.0243 0.0170 0.0246 0.0162 0.0151 0.0144 0.0076

2 4 17 28 28 32 40 44 44 71

2.4.1.2. Nguyên tắc

? Độ dẫn nhiệt đo khả năng của một chất vận chuyển nhiệt từ một vùng nóng sang vùng lạnh (bảng). Nhiệt mất đi khi các phân tử khí đập vào sợi dây đốt nóng rồi bật ra với một động năng lớn hơn.

? Số va chạm phân tử với sợi đốt trong một đơn vị thời gian càng lớn thì tốc độ mất nhiệt càng lớn. Sự khác nhau về tính dẫn nhiệt của các khí là do tính linh động, nghĩa là tốc độ khí khuếch tán tới và đi khỏi sợi đốt.

? Tốc độ của phân tử lại là hàm của trọng lượng phân tử, do đó phân tử càng nhỏ tốc độ chuyển động càng cao, dẫn nhiệt càng tốt.

? Heli là khí mang thông dụng được sử dụng cho detector đo độ dẫn nhiệt. Nó cũng là khí có độ dẫn nhiệt cao thứ hai (sau H2), nên bất ký chất phân tích nào trộn với dòng khí He cũng làm giảm độ dẫn nhiệt của dòng khí.

? Trong detector (hình 5), chất rửa giải từ cột sắc kí chảy qua sợi dây tóc nung nóng Tungsten-Rhenium. Khi chất phân tích xuất hiện từ cột, độ dẫn nhiệt của dòng khí bị giảm xuống, sợi dây tóc trở nên nóng hơn nên điện trở của nó tăng lên và thế áp vào sợi dây này thay đổi. Detector sẽ đo sự thay đổi thế này theo cầu Wheatstone như sau

42


Hình 2.6: Detector đo độ dẫn nhiệt - Cầu nối Wheatstone

? Một dòng nhỏ khí mang để làm khí so sánh đi qua R1 và R2. Khí mang và mẫu sau khi qua cột được dẫn qua S1 và S2.

? Khi cả 4 sợi đốt S1, S2, R1, R2 ở cùng một nhiệt độ, chúng sẽ có cùng giá trị điện trở thì cầu cân bằng, tín hiệu ra bằng không. Nếu điện trở S1 và S2 thay đổi do khí mang cuốn theo cùng với các cấu tử chất phân tích thì cầu mất cân bằng, tín hiệu ra xuất hiện.

? Độ nhạy của detector đo độ dẫn nhiệt tỉ lệ nghịch với tốc độ dòng khí. Nó nhạy hơn với tốc độ dòng thấp hơn. Độ nhạy tăng theo khi sự khác nhau về nhiệt độ giữa sợi dây đốt với vùng khối xung quanh tăng lên. Độ nhạy cũng tăng theo bình phương của cường độ dòng của dây đốt.

2.4.2. Detector ion hóa ngọn lửa

2.4.2.1 Nguyên tắc hoạt động

? Dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa được tạo bởi hỗn hợp khí H2 và O2 trong không khí (nguồn ion hóa) và được đặt trong một điện trường (buồng điện cực).

? Khí mang sau khi rời khỏi cột đi qua nguồn ion hóa vào buồng điện cực. Ở đó chúng bị bắn phá bởi các chùm hạt electron tạo thành các hạt tích điện (ion dương, ion âm, electron). Kết quả tạo thành dòng điện giữa hai điện cực. Dòng điện này đi qua điện trở đo R. Sự rơi thế Eo qua điện trở R này sẽ được khuếch đại rồi đưa ra máy ghi.

? Nếu chỉ có khí mang đi qua 2 bản của điện cực, dòng điện sinh ra gọi là “dòng nền”, để giảm thiểu dòng này người ta dùng một dòng điện bổ chính.

? Khi khí mang đem theo các phân tử mẫu, các phân tử này bị ion hóa và dòng điện qua điện cực tăng lên. Các tín hiệu được ghi lại dưới dạng các pic.

43


2.4.2.2. Úng dụng:

? Độ nhạy của detector FID cao hơn rất nhiều so với độ nhạy của detector TCD khoảng 100 - 1000 lần.

? Tuy nhiên nó chỉ sử dụng thích hợp nhất với các hợp chất hữu cơ chứa cacbon. ? Có một số hợp chất không thể phát hiện bằng detector này như: CO, CO2, axit formic,

formaldehit, NOx, NH3, hợp chất halogen, CS2, H2S, H2O và bản thân các khí cần thiết dùng để hoạt động detector này như H2, N2, He.

2.4.3. Detector cộng kết điện tử (ECD)

2.4.3.1. Nguyên tắc hoạt động

? Bộ phận chính của detector ECD là buồng ion hóa, nơi diễn ra các quá trình ion hóa, bắt giữ electron và tái liên hợp.

? Quá trình ion hóa: từ một nguồn tia phóng xạ 63Ni được lắp sẵn trong detector, phát ra một chùm tia β với tốc độ khoảng 108, 109 hạt /giây. Các hạt này sẽ ion hóa phân tử khí mang (N2 hoặc 5% metan trong Ar) tạo ra các ion dương của phân tử khí mang và điện tử tự do sơ cấp. So với các điện tử của chùm tia β, các điện tử tự do này chậm hơn. Chúng được gia tốc nhờ một điện trường và chuyển dịch về phía anot. Tại đây chúng bị lấy mất điện tích và qua đó tạo ra dòng nền của detector.

? Quá trình cộng kết điện tử diễn ra khi các phân tử các chất phân tích với ái lực electron cao đi vào detector. Chúng bắt một số electron dẫn đến detector thay đổi hiệu thế giữa anot và catot để duy trì dòng nền không đổi. Sự thay đổi này được ghi nhận dưới dạng pic sắc kí trên giấy ghi hoặc bằng computer.

2.4.3.2. Ứng dụng

? Detector loại này đặc biệt rất nhạy với những phân tử hợp chất có khả năng cộng kết với các điện tử tự do trong pha khí như các phân tử chứa halogen, cacbonyl liên hợp, nitril, hợp chất nitro, và hợp chất cơ kim.

? Nó tương đối kém nhạy với các phân tử hợp chất hydrocacbon, các rượu và xeton.

Như vậy độ nhạy của ECD phụ thuộc vào:

? Độ lớn của dòng nền. ? Khả năng ái điện tử của chất cần phân tích. ? Bản chất của khí mang và hiệu thế đặt vào 2 bản điện cực.

2.4.4. Detector khối phổ

2.4.4.1. Giới thiệu

44


? Máy khối phổ là một detector vạn năng cho phân tích định tính và định lượng các chất hữu cơ cả sắc ký khí lẫn sắc ký lỏng.

? Trong phương pháp khối phổ, các phân tử khí bị ion hóa (thường tạo cation) được tăng tốc trong một trường điện từ và sau đó được tách theo khối lượng của nó. Quá trình ion hóa thường cung cấp đủ năng lượng đến phân tử để phá vở nó thành những mảnh khác nhau.

? Một phổ khối là một biểu đồ cho thấy lượng tương đối của mỗi mảnh vở tạo ra từ detector khối phổ. Trong sắc ký khí mỗi pic của sắc kí đồ tương ứng với một chất phân tích đã được tách ra được nhận diện bởi một phổ khối.

? Hình là một phổ khối của hợp chất được nhận diện khi so sánh với thư viện phổ của những hợp chất đã biết. Trục hoành của phổ khối là m/z, khối lượng của ion chia cho điện tích của ion. Phần lớn các ion đều mang điện tích +1 nên m/z thường chính là khối lượng của ion (đ.v.C). Trục tung chỉ thành phần % tương đối của các ion so với ion có lượng lớn nhất được qui ước 100%.

? Trong phổ khối có một pic quan trọng của ion phân tử không bị phá vở thành các mảnh. Dựa vào tỉ lệ của các đồng vị của một nguyên tố trong tự nhiên, ta có thể nhận thấy tỉ lệ này xuất hiện trong phổ khối qua tỉ lệ của các ion phân tử của các đồng vị. Ví dụ ta có thể hiểu điều này trong phổ khối của 1-brombutan. Vì tỉ lệ của nguyên tố brom trong tự nhiên là 50.52% 79Br và 49.48% 81Br, pic tại m/z=136 của ion phân tử C4H9

79Br có cường độ lớn hơn một chút so với pic của ion phân tử tại m/z=138 của phân tử C4H9

81Br.

Hình 2.7: Sắc kí đồ và phổ MS tương ứng của 1-Butanol và 1-Bromobutane.

2.4.4.2.Máy khối phổ nam châm hình quạt

Nguyên tắc hoạt động với nguồn ion hóa bằng chùm electron

45


? Các phân tử khí đi vào nguồn ion hóa bằng va chạm electron và bị bắn phá bởi các electron có năng lượng động học khoảng 70 eV. Năng lượng này đủ lớn để ion hóa các phân tử (M + e →M+ + 2e) và phá vỡ chúng thành những mảnh vỡ nhỏ hơn.

? Một thế hiệu dương nhỏ ở đĩa đẩy (repeller plate) đẩy những ion hướng về ống phân tích và một thế nhỏ ở các đĩa hội tụ ion (ion focus plates) gia tốc ion giúp các ion có vận tốc cao bị tống khỏi phần đáy của bộ phận này và đi vào ống phân tích.

? Ống phân tích (Analyser tube) được duy trì ở áp suất chân không cao (khoảng 10-5 Pa) để các ion chuyển động qua ống không bị lệch hướng bởi những va chạm với các phân tử khí pha động.

? Các cation di chuyển qua ống phân tích chịu tác động của từ trường đặt vuông góc với hướng di chuyển của chúng. Trường này sẽ hướng các cation về detector đặt ở cuối ống phân tích.

? Một khe ở detector chỉ cho những ion trong một khoảng giá trị khối lượng nhỏ xác định tiếp cận detector. Các phân tử có khối lượng không phù hợp va phải các thành ống hoặc bị loại bỏ bởi khe thoát ion nên không vươn tới được detector.

? Tại bộ phận thu ion (ion collector), mỗi cation đến bị trung hòa bởi một electron. Dòng điện đòi hỏi để trung hòa chùm ion tỉ lệ với số lượng các ion đến bộ phận thu ion này.

? Phổ khối là một đồ thị cho thấy dòng điện như là một hàm của số khối được chọn bởi từ trường.

? Phương pháp ion hóa bởi tương tác electron (electron impact ionization) cho phổ khối có nhiều mảnh vở. Ion phân tử có thể có hàm lượng thấp thậm chí bị biến mất.

? Nếu phân tử lớn thì việc có quá nhiều mảnh vở sẽ làm cho việc giải thích phổ khối của nó gặp nhiều khó khăn. Trong trường hợp này các chương trình máy tính có thể được sử dụng để làm khớp phổ của chất chưa biết này với một phổ khối đã biết trong thư viện phổ lưu trong máy tính.

Nguyên tắc hoạt động với nguồn ion hóa hóa học:

? Một kỹ thuật tinh tế sản sinh ra ít mảnh vở hơn là sự ion hóa hóa học (chemical ionization). Trong trường hợp này, nguồn ion hóa được đổ đầy metan ở áp suất khoảng 100 Pa.

? Các electron được cung cấp đủ năng lượng để chuyển CH4 đến những sản phẩm hoạt động khác:

CH4 + e → CH4+ + 2e

CH4+ +CH4 → CH5

+ + CH3

? CH5+ là chất nhường photon khi tương tác với chất phân tích cho MH+, thường là ion có

hàm lượng lớn nhất trong phổ khối ion hóa hóa học metan (methane chemical ionization mass spectrum).

46


CH5+ + M → CH4 + MH+

2.4.4.3.Máy khối phổ tứ cực

? Máy khối phổ nam châm hình quạt thường ít được chọn để ghép nối với sắc kí bởi vì từ trường không thể thay đổi đủ nhanh để ghi phổ của những dải sắc kí hẹp. Loại được sử dụng phổ biến hiện nay để kết nối với sắc kí là máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer).

? Khi đó mỗi chất hòa tan trong cột sắc kí được tách được thể hiện dưới dạng pic. Chất đó được dẫn đến buồng ion hóa tương tác electron có áp suất chân không, tại đây các phân tử chất phân tích bị các electron được gia tốc bắn phá tạo các ion mảnh vở. Các ion này lại tiếp tục được gia tốc bởi một thế khoảng 5-15 V trước khi đi vào bộ tách theo khối lượng tứ cực (quadupole mass seperator).

? Bộ tách gồm 4 thanh kim loại song song với nhau, trong đó một cặp sẽ được áp vào một thế không đổi và cặp kia một thế hiệu dao động tần số radio. Từ trường được tạo ra làm lệch các hành trình phức tạp khi chúng di chuyển từ buồng ion hóa hướng đến detector và chỉ các ion nào có tỉ số khối lượng với điện tích (m/z) đã chọn trước mới tiếp cận với detector. Các ion khác va đập vào các thanh kim loại và bị mất trước khi vươn đến detector.

? Bằng việc thay đổi nhanh chóng thế áp vào, các ion có khối lượng khác nhau được chọn lọc để được tiếp cận với detector. Các bộ tách khối phổ tứ cực được quét đủ nhanh để ghi hai đến tám phổ trong một giây với khoảng 800 đơn vị khối.

2.5. Phát triển một phương pháp phân tích bằng sắc ký khí

Do có nhiều thông số ảnh hưởng đến quá trình sắc ký nên có thể làm bối rối cho những người mới bắt đầu làm quen với việc chọn một thủ tục cho việc phân tích sắc ký một đối tượng cụ thể nào đó. Nói chung, có nhiều giải pháp khác nhau có thể thỏa mãn. Trong phần này sẽ thảo luận cách để chọn một phương pháp để sử dụng. Trật tự cần xem xét theo thứ tự sau: mục tiêu phân tích, chuẩn bị mẫu, detector, cột và bơm mẫu.

2.5.1. Mục tiêu của phép phân tích

? Mục tiêu của phép phân tích là phân tích định tính hay định lượng? ? Có cần phải thực hiện một phép tách phân giải cao một cấu tử hoặc chỉ cần một phép tách

có độ phân giải đủ tốt cho một phần nào đó thôi trong sắc ký đồ? ? Có cần hy sinh độ phân giải để rút ngắn thời gian phân tích? ? Cần phân tích định lượng chỉ một cấu tử hoặc nhiều cấu tử trong mẫu và có cần độ chính

xác cao không? ? Chất phân tích hiện diện trong mẫu ở nồng độ thích hợp hoặc cần có những kỹ thuật đặc

biệt (cô mẫu và một detector rất nhạy) cho phân tích siêu vết.

47


Mỗi yếu tố đã đề cập dẫn đến một vài sự thỏa hiệp trong việc chọn các kỹ thuật thích hợp.

2.5.2. Chuẩn bị mẫu

Các mẫu trong thực tế rất phong phú và thường có thành phần phức tạp:

? Có mẫu có hàm lượng tương tự nhau nhưng cũng có mẫu bên cạnh cấu tử chính mẫu còn chứa một số cấu tử với hàm lượng vết.

? Có mẫu có các cấu tử với nhiệt độ sôi khác nhau trong một khoảng rộng. ? Mẫu có thể ở dạng dung dịch nhưng cũng có ở dạng khí hoặc dạng rắn. ? Mẫu chứa nhiều cấu tử phân cực hoặc chứa nhiều cấu tử ít hoặc kém phân cực.

Chìa khóa để có một quá trình sắc ký thành công cho một mẫu phức tạp là cần phải làm “sạch” nó trước khi giới thiệu nó vào cột.

? Các phương pháp như vi chiết pha rắn, chiết lỏng - lỏng, chiết rắn - lỏng, sự giải hấp nhiệt các các cấu tử dễ bay hơi và nhiều phương pháp mới khác giúp cô lập những cấu tử cần phân tích trong mẫu phức tạp từ những chất cản trở.

? Các phương pháp này giúp cô lập và làm giàu các cấu tử cần phân tích đến mức độ có thể dò tìm được.

? Nếu ta không làm “sạch” mẫu thì sắc ký đồ thu được sẽ chứa một rừng các pic kém phân giải và các cấu tử không bay hơi sẽ còn giữ trong cột và phá hủy các cột đắt tiền.

2.5.3. Chọn detector

Giai đoạn tiếp theo là chọn detector cho quá trình sắc ký. Vấn đề đặt ra là cần biết mọi thông tin trong mẫu hay chỉ cần một detector chuyên biệt dò tìm một hoặc một nhóm các cấu tử đặc biệt nào đó trong mẫu.

? Detector được sử dụng rộng rải nhất là detector khối phổ nhưng đắt tiền. ? Detector ion hóa ngọn lửa cũng là loại được dùng phổ biến nhất nhưng nó chỉ đáp ứng tốt

cho hợp chất chứa mạch cacbon dài hoặc các hydrocacbon. Loại này không nhạy như detector bắt electron hoặc detector huỳnh quang. Detector ion hóa ngọn lửa đòi hỏi mẫu phải chứa lớn hơn 10 ppm chất cần phân tích cho phân tích tiêm mẫu chia dòng.

? Detector dẫn nhiệt là cách phổ biến nhất để dò tìm các chất nhưng nó không đủ nhạy cho những cột mao quản mở có độ phân giải cao.

? Các detector nhạy cho phân tích siêu vết chỉ đáp ứng với một loại hợp chất nào đó thôi. Ví dụ detector bắt electron là loại đặc biệt cho các hợp chất chứa halogen, cacbonyl liên hợp, nitril, và hợp chất nitro.

? Nếu chỉ cần biết những thông tin định tính để nhận diện các chất rửa giải, các detector khối phổ và hồng ngoại là những chọn lựa tốt. Detector hồng ngoại giống detector đo độ dẫn nhiệt thường không đủ nhạy cho những cột mao quản mở.

48


2.5.4.Chọn cột

Những chọn lựa chính là pha tĩnh, đường kính cột và chiều dài cột.

Chọn pha tính theo nguyên tắc các chất có cấu tạo càng giống nhau thì tương tác tốt với nhau.

? Các pha tĩnh không phân cực được sử dụng nhiều. ? Pha tĩnh có độ phân cực trung bình được sử dụng hầu hết những phép tách mà pha tĩnh

không phân cực không thể. ? Đối với những hợp chất phân cực cao thì một cột phân cực mạnh là cần thiết. ? Các đồng phân quang học và những hợp chất có cấu trúc hình học gần giống nhau đòi hỏi

những pha tĩnh đặc biệt cho phép tách này.

Giữa đường kính cột và bề dày của lớp phim có mối quan hệ trong việc ảnh hưởng đến độ phân giải.

? Độ phân giải cao nhất có thể đạt được bởi những cột hẹp nhất với pha tĩnh mỏng nhất. ? Sự kết hợp này làm giảm thiểu độ trở kháng đối với sự chuyển khối (số hạn C trong

phương trình Van Deemter) trong cả hai pha tĩnh và pha động nhờ vậy làm giảm chiều cao đĩa lý thuyết.

? Các cột hẹp và lớp phim mỏng đặc biệt thích hợp cho việc tách các hỗn hợp của các chất có nhiệt độ sôi cao nên bị lưu giữ quá mạnh trên các cột có lớp phim mỏng. Các thời gian lưu ngắn cung cấp những phép phân tích nhanh.

? Tuy nhiên, các cột hẹp có lớp phim mỏng có dung lượng mẫu rất thấp, đòi hỏi những detector có độ nhạy cao (detecter ion hóa ngọn lửa có thể không tương thích), không lưu giữ tốt những hợp chất dễ bay hơi và có thể chịu những ảnh hưởng do những vị trí hoạt động trên bề mặt có thể bị lộ ra.

? Các cột cở hẹp có lớp phim dày cung cấp một thỏa hiệp tốt giữa độ phân giải và dung lượng mẫu.

? Chúng có thể được sử dụng với nhiều detector (nhưng thường không phải các detector đo độ dẫn điện hoặc hồng ngoại) và với những hợp chất dễ bay hơi. Các thời gian lưu giữ dài hơn so với cột có lớp phim mỏng.

? Các cột cở rộng và có lớp phim dày được đòi hỏi cho việc sử dụng các detector đo độ dẫn điện và hồng ngoại. Chúng có dung lượng mẫu cao và có thể xử lý các hợp chất dễ bay hơi nhưng cho độ phân giải thấp và thời gian lưu giữ lâu.

Nếu một cột chuyên biệt đáp ứng với hầu hết những yêu cầu đặt ra nhưng không cung cấp đủ độ phân giải thì cột dài hơn cùng loại có thể được sử dụng.

? Chiều dài gấp đôi của cột làm tăng gấp đôi số đĩa lý thuyết và theo phương trình tính độ phân giải thì làm tăng độ phân giải lên √2 lần. Điều này không phải là cách tốt nhất để tăng độ phân giải bởi vì nó làm tăng gấp đôi thời gian lưu.

49


? Việc sử dụng một cột hẹp hơn hoặc lớp pha tĩnh mỏng hơn sẽ làm tăng độ phân giải mà không kéo dài thời gian lưu giữ.

? Việc thay đổi pha tĩnh làm thay đổi hoàn toàn sự lưu giữ tương đối của những hợp chất khác nhau (α trong phương trình…) và có thể phân giải các cấu tử đang quan tâm.

5.5. Chọn phương pháp tiêm mẫu

Quyết định chính cuối cùng là làm thế nào để tiêm mẫu.

Chế độ tiêm mẫu chia dòng:

? Tốt nhất cho những mẫu phân tích có nồng độ cao hoặc phân tích khí, nhưng phân tích định lượng có thể có các cấu tử khó bay hơi bị mất trong suốt quá trình tiêm mẫu.

? Tiêm mẫu chia dòng cung cấp độ phân giải cao và có thể xử lý những mẫu bẩn nếu nhồi vào ống trong bộ tiêm mẫu một chất hấp phụ thích hợp.

? Các hợp chất không bền nhiệt có thể phân hủy trong suốt quá trình tiêm mẫu ở nhiệt độ cao.

Chế độ tiêm mẫu không chia dòng:

? Được yêu cầu cho những dung dịch rất loãng. ? Nó cung cấp độ phân giải tốt nhưng trong phân tích định lượng có thể có các hợp chất

kém bay hơi bị mất trong quá trình tiêm. ? Nó tốt hơn chế độ tiêm mẫu chia dòng đối với những hợp chất có độ bền nhiệt trung bình

bởi vì nhiệt độ tiêm mẫu hạ thấp hơn. ? Tiêm mẫu không chia dòng giới thiệu mẫu vào cột chậm vì vậy bẫy dung môi và bẫy lạnh

được đòi hỏi. ? Các mẫu chứa mỗi chất phân tích ít hơn 100 ppm có thể được phân tích trong những cột

có chiều dày lớp phim < 1µm với chế độ tiêm mẫu không chia dòng. Những mẫu có mỗi chất phân tích từ 100-1000 ppm đòi hỏi lớp phim dày hơn 1µm.

Tiêm mẫu trên cột (on-column injection):

? Tốt nhất cho phân tích định lượng và cho những hợp chất kém bền nhiệt. ? Nó là một kỹ thuật có độ phân giải thấp và không thể sử dụng cho những cột có đường

kính nhỏ hơn 0.25 mm. ? Nó có thể xử lý những dung dịch đặc cũng như loãng.

2.5.6. Chương trình hóa nhiệt độ và áp suất

2.5.6.1.Những thuận lợi của chương trình hóa nhiệt độ cột

Cột sắc ký hoạt động ở nhiệt độ không đổi có một số điểm bất lợi:

50


? Nếu nhiệt độ được chọn quá thấp, những pic hòa tan đầu tiên sẽ có khoảng cách rất gần nhau, trong khi đó các cấu tử bị lưu giữ mạnh sẽ có các pic bị doãng rộng và nằm thấp. Ngoài ra nếu nhiệt độ cột hơi thấp thì thời gian phân tích sẽ tăng theo cấp số nhân.

? Khi phân tích hỗn hợp gồm các cấu tử có nhiệt độ sôi khác nhau nằm trong một khoảng hẹp thì việc chọn nhiệt độ cho cột ở chế độ không đổi không thực sự khó khăn. Tuy nhiên, đối với những mẫu phức tạp nhiều cấu tử có khoảng nhiệt độ sôi rộng thì không thể dùng chế độ nhiệt độ cột không đổi.

? Nếu chọn nhiệt độ thích hợp cho các cấu tử có điểm sôi thấp thì các cấu tử có điểm sôi cao sẽ bị lưu giữ lâu trong cột tách dẫn đến pic của chúng bị doãng rộng. Ngược lại nếu thực hiện việc tách ở nhiệt độ cao thì các cấu tử có điểm sôi cao sẽ rửa giải nhanh và có độ phân giải tốt, nhưng các cấu tử có điểm sôi thấp thì bị tách chậm và có độ phân giải kém, thậm chí nhiều pic bị chập lên nhau.

? Những cấu tử lưu giữ mạnh có thể được nhanh chóng rửa giải nếu chọn nhiệt độ cao hơn, và cũng cải thiện khả năng dò tìm chúng. Tuy nhiên, nếu làm như vậy thì các cấu tử cùng bị rửa giải tăng lên dẫn đến các pic cũng sít gần nhau và sẽ làm mất độ phân giải cho các pic ở đầu sắc ký đồ. Trở ngại này có thể được giải quyết trong GC bằng chương trình hóa nhiệt độ, ở đây nhiệt độ của cột trong lò được tăng dần tại một tốc độ tuyến tính suốt quá trình phân tích.

Chương trình hóa nhiệt độ có một vài ưu điểm:

? Nó làm giảm thời gian tiến hành phân tích và cải thiện khả năng dò tìm của các cấu tử (pic sẽ nhọn hơn và có các dải cách đều nhau trong cả sắc ký đồ).

? Trong trường hợp các mẫu không biết thành phần hoặc mẫu phức tạp, những cấu tử có nhiệt độ sôi cao nếu ở điều kiện đẳng nhiệt có thể không rửa giải được hoặc không thể dò tìm, thì có thể thể hiện một thời gian lưu giữ thích hợp hơn.

? Chương trình hóa nhiệt độ cũng có thể giúp rửa sạch một cột bị nhiễm bẩn các cấu tử có nhiệt độ sôi cao trong những lần tiêm trước.

? Chương trình hóa nhiệt độ thường thiết lập nhiệt độ cho cột tách tương ứng với nhiệt độ của cấu tử có nhiệt độ sôi thấp nhất, thích hợp là dưới 90oC. Sau đó nhiệt độ được nâng lên theo tốc độ chọn trước cho đến nhiệt độ cuối cùng tương ứng với nhiệt độ của cấu tử có điểm sôi cao nhất. Khi nhiệt độ của cột tăng lên thì các cấu tử sẽ lần lượt tách khỏi cột vào thời điểm nhiệt độ của cột đạt đến nhiệt độ sôi của từng cấu tử.

Có ba kiểu chương trình hóa nhiệt độ được sử dụng trong sắc ký khí: kiểu đường đạn (ballistic), kiểu tuyến tính và kiểu đa tuyến tính.

51


T cột

A

B C

Thời gian

? Chương trình kiểu đạn đạo diễn ra khi một lò (oven) được duy trì tại một nhiệt độ đà nhanh chóng thay đổi đến một nhiệt độ cao hơn (đường A), và thỉnh thoảng được sử dụng cho việc điều kiện hóa cột sắc ký khí rắn sau khi nó được sử dụng trong một thời gian dài. Tuy nhiên, một cột sắc ký được duy trì ở tại nhiệt độ cao sau đó nhanh chóng nâng nhiệt độ lên cao thì lớp phim pha tĩnh có thể bị phá hủy do bị sốc nhiệt.

? Chương trình hóa nhiệt độ được sử dụng rộng rải nhất là kiểu tuyến tính (đường B). Bắt đầu từ nhiệt độ thấp và được duy trì đẳng nhiệt trong một khoảng thời gian nào đó, sau đó nhiệt độ trong lò chứa cột được tăng với một tốc độ tuyến tính đến một nhiệt độ cuối cùng được chọn sẵn. Nhiệt độ cuối cùng này cũng được duy trì trong một khoảng thời gian cụ thể nào đó. Nhiệt độ ban đầu và tốc độ tăng tuyến tính sau đó được xác định từ một phép phân tích thăm dò trước đó với ghi chú những nhiệt độ rửa giải. Sự chọn lựa những điều kiện ban đầu thích hợp sẽ cho phép việc tách những chất có nhiệt độ sôi thấp, trong khi đó nhiệt độ cuối cùng được chọn nên đủ lớn để rửa giải được nhiều hơn những cấu tử bị lưu giữ mạnh (lưu ý giới hạn nhiệt độ cao nhất của pha tĩnh).

? Kiểu đa tuyến tính được thực hiện trong một vài trường hợp để dò tìm hoặc tăng cường độ phân giải trong một phép tách, nhưng được sử dụng thông dụng hơn trong việc kết hợp với tiêm mẫu trên cột.

? Trong chương trình hóa nhiệt độ, nhiệt độ của một cột được tăng suốt quá trình tách để tăng áp suất hơi của chất hòa tan và nhờ đó giảm thời gian lưu của những cấu tử bị rửa giải chậm. Một ví dụ được trình bày trong hình 6. Tại nhiệt độ hằng định 150 oC, các hợp chất dễ bay hơi hơn xuất hiện gần nhau và các hợp chất ít bay hơi có thể thậm chí không

52


bị rửa giải từ cột. Nếu nhiệt độ được cho tăng từ 50 oC đến 250 oC với tốc độ tăng 8oC/phút, tất cả các cấu tử được rửa giải và các pic xuất hiện khá đều. Cần tránh tăng nhiệt độ lên quá cao để ngăn sự phân hủy nhiệt của chất phân tích và pha tĩnh.

? Hiện nay, các máy sắc ký phần lớn đều được trang bị các bộ điện tử kiểm soát áp suất có thể chương trình hóa của các khí mang đi vào cột. Sự tăng áp suất vào cột làm tăng tốc độ pha động và nhờ vậy làm giảm thời gian lưu.

Hình 2.7: (a) tách đẳng nhiệt của các ankan tương tự ở 150oC. Cột 3% Apiezon-L on 100–120 mesh VarAport 30. Khí mang helium ở 10 ml min–1. (b) Mẫu và cột như (a) nhưng nhiệt độ tách được chương trình hóa cho thấy độ phân giải cao hơn và thời gian ngắn hơn. 2.6. Phân tích định tính trong sắc kí khí

? Trong phân tích định tính, hai detector có thể nhận diện các hợp chất là detector khối phổ và detector hồng ngoại chuyển hóa Fourier. Một pic có thể nhận diện bằng cách so sánh phổ của chúng với một thư viện phổ được lưu giữ trong máy tính.

53


? Một phương pháp kém tinh tế hơn là nhận diện thời gian lưu của một chất với thời gian lưu của chất đó trong một mẫu đã biết trước (mẫu chuẩn) trên các cột có độ phân cực khác nhau (hình 7).

? Cách đáng tin cậy nhất là so sánh các thời gian lưu trong cùng một sắc kí đồ thu được bởi mẫu đã biết trước (mẫu chuẩn) được thêm mẫu cần dò tìm vào trong cùng một điều kiện sắc kí. Nếu như chất cần dò tìm trùng với chất có trong mẫu chuẩn thì pic của chất đó trong mẫu đã thêm sẽ có diện tích hay chiều cao tăng lên so với khi chưa thêm chất chưa biết vào. Sự nhận diện chỉ ở mức thăm dò khi thực hiện trên một cột, nhưng khẳng định hơn khi thực hiện trên một vài cột trên những loại pha tĩnh khác nhau.

? Trong hình 17 cho thấy có thể nhận diện được các đỉnh 2,3,4,7 và 9 là metyl, etyl, n-propyl, n-butyl, và n-amyl alcol. Cần chú rằng có thể có những chất khác nhau nhưng có thời gian lưu giống hoặc rất gần nhau. Vì vậy cần xác định trên nhiều pha tĩnh khác nhau hoặc sử dụng các detector khối phổ hoặc hồng ngoại để xác định.

Hình 2.8: Phân tích định tính bằng cách so sánh thời gian lưu với chất chuẩn

2.7. Phân tích định lượng 2.7.1 Một số nguyên nhân gây ra sai số

54


? Chuẩn bị mẫu: cũng như mọi phương pháp khác, mẫu đem phân tích được lấy mẫu sao đại diện đúng cho cả lô nguyên liệu hay sản phẩm. Các qui tắc lấy mẫu cần phải tuân thủ cho từng loại mẫu. Mẫu cần được làm sạch trước khi tiêm mẫu vào GC. Việc này nếu làm không tốt có thể gây nên mất cấu tử cần xác định.

? Tiêm mẫu: khi chất lỏng tiêm vào buồng tiêm mẫu thì nhiệt độ thiết lập nếu quá cao có thể gây nên sự phân hủy mẫu, hoặc mẫu có tham dự vào một phản ứng nào đó. Kỹ thuật tiêm mẫu cũng có thể gây sai số.

? Mẫu bị phân hủy hoặc bị hấp phụ: có nhiều trường hợp có sự phân hủy hoặc hấp phụ trong buồng tiêm mẫu, trong cột, trong detector có thể làm cho các pic đó không đại diện cho lượng của chúng có trong mẫu. Để khắc phục điều này ta nên dùng phương pháp lập đường chuẩn để biết diện tích hay chiều cao của pic có tỉ lệ tuyến tính với lượng mẫu đưa vào hay không.

? Đáp ứng của detector: mỗi detector đáp ứng khác nhau với các hợp chất khác nhau. Vì vậy cần biết rõ các hệ số đáp ứng này. Hơn nữa khi điều kiện làm việc thay đổi thì đáp ứng của detector cũng thay đổi. Trong GC có thể sử dụng phương pháp chuẩn nội để khắc phục điều này.

? Kỹ thuật lấy tích phân: trong GC có nhiều cách thiết lập quan hệ giữa thông tin nhận được từ pic sắc kí với hàm lượng của cấu tử: Đo chiều cao pic, dùng máy ghi và tích phân, cắt và cân giấy. Các cách này có thể có những sai số riêng trong quá trình xử lí. Ngày nay với sự ghép nối máy tính và các phần mềm hỗ trợ việc tích phân hóa diện tích các pic trở nên dễ dàng và thông dụng. Kết quả được báo cáo đầy đủ các thông tin của pic như chiều cao pic, diện tích pic, phần trăm trong mẫu …

2.7.2 Các phương pháp tính toán định lượng 2.7.2.1. Phương pháp chuẩn hóa diện tích

? Đây là phương pháp tính thành phần phần trăm của mẫu bằng cách đo diện tích từng pic trên sắc kí đồ. Theo cách này đem diện tích pic của chất quan tâm A cho tổng diện tích của các pic: %A = (diện tích pic A/tổng diện tích các pic)x100 %

? Khi phân tích thành phần có điểm sôi sát nhau của một dãy đồng đẳng, phương pháp này có thể dùng để tính tỷ lệ phần trăm khối lượng.

? Phương pháp này chỉ đúng nếu tất cả các cấu tử đều được rửa giải và đáp ứng của detector với mọi cấu tử là giống nhau. Nếu những điều kiện này thõa mãn thì đây là phương pháp nhanh và hiệu quả.

2.7.2.2. Phương pháp tính theo hệ số hiệu chỉnh

? Như đã biết detector đáp ứng khác nhau đối với các chất khác nhau. Vì vậy cần phải tính hệ số hiệu chỉnh. Nhờ hệ số này có thể tính được thành phần phần trăm của các cấu tử trong mẫu.

55


/ ( )%( / ( ))

idien tichcua A F AAdien tichcua Ai F Ai

??

Cách xác định hệ số hiệu chỉnh:

- Tiêm dung dịch chuẩn đã biết nồng độ các cấu tử A, B, C… vào GC - Sắc kí đồ thu được có các pic phân giải hoàn toàn và diện tích thu được tương ứng

SA, SB, SC… tương ứng với các khối lượng trong mẫu mA, mB, mC… - Chọn một pic làm chuẩn ví dụ A có tỉ lệ SA/mA được gán giá trị FA = 1 - Từ tỉ lệ SB/mB, SC/mC… suy ra FB, FC…

2.7.2.3. Phương pháp lập đường chuẩn:

? Lập các đường chuẩn riêng rẽ đối với từng cấu tử trong hỗn hợp bằng cách tiêm những thể tích bằng nhau của một loạt dung dịch hỗn hợp chất chuẩn có nồng độ khác nhau.

? Như vậy một loạt các nồng độ của các chất chuẩn đã được phân tích và diện tích của chúng được xác định. Một đường chuẩn được dựng cho mỗi cấu tử với một trục nồng độ và trục kia là diện tích tương ứng để kiểm tra sự tuyến tính của đáp ứng của detector.

? Tiêm cùng thể tích của mẫu có các cấu tử cần phân tích và chạy sắc kí trong cùng điều kiện như khi chạy chuẩn.

? Từ các diện tích thu được của các cấu tử cần phân tích và đường chuẩn vừa thiết lập suy ra được nồng độ của chúng.

2.7.2.4. Phương pháp dùng chuẩn nội

Phương pháp này còn được gọi là phương pháp chuẩn hóa tương đối hay gián tiếp.

Để định lượng một cấu tử X ta cần phải chọn một chất chuẩn S sao cho:

? Nếu trộn lẫn X với S ta phải thu được 2 đỉnh riêng biệt trên sắc kí đồ. ? Pic của X và S phải khá gần nhau.

Sau đó ta phải pha các hỗn hợp có tỷ lệ trọng lượng của X và S biết trước, chạy sắc kí, đo diện tích các pic, lập tỉ số diện tích tương ứng, cuối cùng lập đường chuẩn tương đối.

56


Sc/Ss

Wc/Ws Chuẩn Cấu tử

Ở đây :

? Sc/Ss là tỉ lệ diện tích của các cặp cấu tử cần xác định X và chất chuẩn nội ? Wc/Ws là tỉ lệ trọng lượng của các cặp cấu tử cần xác định X và chất chuẩn nội

Khi phân tích mẫu thật, ta cho một lượng biết trước chất chuẩn nội S vào mẫu rồi tiến hành sắc kí hỗn hợp. Từ tỉ lệ diện tích đo được, bằng đường chuẩn tương đối vừa dựng ta có tỉ lệ trọng lượng. Với trọng lượng chuẩn S thêm vào đã biết ta tính được trọng lượng của chất X.

Phương pháp này có các ưu điểm:

? Không cần biết đến đáp ứng của detector ? Không cần duy trì nghiêm ngặt các điều kiện tiến hành sắc kí vì những thay đổi được loại

trừ theo cách tính tỷ số.

57


BÀI TẬP

Câu 2.1: a) Trình bày sự khác nhau giữa sắc kí khí lỏng và sắc kí khí rắn.

b) Cho biết những loại cấu tử nào có thể tách được bằng phương pháp sắc kí khí rắn và sắc kí khí lỏng

c) Tại sao sắc khí khí rắn hầu như không được sử dụng rộng rãi như sắc khí khí lỏng

Câu 2.2: Nêu các nguyên tắc hoạt động của các loại detector đước sử dụng trong sắc kí khí:

a) Detector đo độ dẫn nhiệt b) Detector ion hóa ngọn lửa c) Detector bắt electron d) Detector khối phổ

Những ưu điểm và nhược điểm của các loại detector trên

Câu 2.3: Trình bày ảnh hưởng của độ dày lớp phim pha tĩnh lên sắc kí đồ trong sắc kí khí

Câu 2.4: Giải thích tại sao cột mao quản mở cung cấp độ phân giải tốt hơn so với cột nhồi trong sắc kí khí?

Câu 2.5: Khi nào cần sử dụng chế độ tiêm chia dòng, không chia dòng và tiêm thẳng vào cột trong sắc kí khí?

Câu 2.6: Làm thế nào để cải thiện độ phân giải của 2 pic quá sát nhau trong sắc kí khí?

Câu 2.7: Trình các yếu tố ảnh hưởng đến sự doãng rộng của pic sắc kí và những kết luận cần rút ra để giảm sự doãng rộng pic khi tiến hành sắc kí khí lỏng. Câu 2.8: Trình bày các phương pháp xác định định lượng được sử dụng trong sắc kí khí:

a) Phương pháp chuẩn hóa diện tích b) Phương pháp tính theo hệ số hiệu chỉnh

c) Phương pháp lập đường chuẩn d) Phương pháp dùng chuẩn nội

Câu 2.9: Cho biết trật tự rửa giải của hexan, heptan, octan, butanol và 2-pentanone ra khỏi cột có pha tĩnh (diphenyl)0.35 (dimetyl)0.65 polysioxane. Biết chỉ số lưu Kovats của butanol và 2-pentanone trên cột này lần lượt là 717 và 777.

Câu 2.10: Cho biết trật tự rửa giải của hexan, heptan, octan, nonane, benzene, nitropropane và pyridine ra khỏi cột có pha tĩnh (diphenyl)0.05 (dimetyl)0.95 polysioxane. Biết chỉ số lưu Kovats của benzene, nitropropane và pyridine trên cột này lần lượt là 672, 745 và 761.

58


Câu 2.11: Một hỗn hợp các methyl esters của các axit béo được sắc kí trên cột Carbowax 20 M cho các diện tích pic và các hệ số đáp ứng detector như sau: Ester Diện tích pic, cm2 Hệ số đáp ứng methyl-n-butyrate 2.95 0.81 methyl-iso –valerate 0.86 0.88 methyl-n-octanoate 1.66 0.98 methyl-n-decanoate 4.52 1.00 Tính thành phần % hỗn hợp.

Câu 2.12: Trong một phép tách một hỗn hợp các hydrocacbon, các thời gian lưu hiệu chỉnh được đo như sau: propane 2.23 min isobutane 5.71 min butane 6.67 min Tính chỉ số lưu Kovat của các hydrocacbon này?

Câu 2.13: Một hỗn hợp n-heptane, tetrahydrofuran, 2-butanone, and n-propanol rửa giải theo trật tự này khi sử dụng cột có pha tĩnh phân cực như Carbowax. Trật tự rửa giải sẽ đảo ngược lại chính xác theo thứ tự trên khi sử dụng pha tĩnh không phân cực như polydimethyl siloxane. Giải thích trật tự rửa giải trong mỗi trường hợp. Câu 2.14: Các số liệu sau đây là các thời gian lưu hiệu chỉnh của các n-ankan sử dụng pha tĩnh Carbowax 20M.

tr’ Alkane (min) Pentane 0.79 hexane 1.99 heptane 4.47 octane 14.12 nonane 33.11 Hỏi chỉ số lưu Kovat có thời gian lưu hiệu chỉnh là 9.36 min? Câu 2.15: (7) Các số liệu sau đây thu được khi phân tích sắc kí khí p-xylene và methyl isobutylketone (MIBK) trên cột mao quản. Injection tr Peak Peak Width Mode Compound (min) Area (min) split MIBK 1.878 54285 0.028

p-xylene 5.234 123483 0.044 splitless MIBK 3.420 2493005 1.057

p-xylene 5.795 3396656 1.051 Giải thích sự khác nhau giữa thời gian lưu, diện tích pic, và độ rộng pick khi chuyển từ tiêm mẫu chia dòng sang tiêm mẫu không chia dòng.

59


Chương 3: SẮC KÍ LỎNG

(LIQUID CHROMATOGRAPHY)

3.1. Mở đầu

? Sắc kí lỏng cột là một trong những nhánh của phân tích công cụ phát triển nhanh nhất, được áp dụng cho nhiều loại mẫu hơn bất kì kỹ thuật tách nào và có khả năng phân tích những hỗn hợp mẫu cực kì phức tạp trong hóa học và trong sinh học.

? Nghiên cứu kỹ thuật tách bằng LC là cần thiết vì nó sẽ tiếp tục đóng một vai trò quan trọng trong tất cả những lĩnh vực của phân tích hóa học, mặc dù có những tiến bộ hơn nữa trong các thuốc thử chọn lọc và những cải tiến trong các kỹ thuật vật lí đo lường.

? Với sự phát triển trong suốt những thập niên qua về thiết bị và sự nhồi cột, sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) nổi lên như một phương pháp được ưa thích cho kỹ thuật tách và phân tích định lượng của rất nhiều loại mẫu.

? Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có thể dò tìm lượng mẫu nhỏ đến 200 pg. Những cơ hội áp dụng HPLC hầu như không giới hạn do HPLC đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong khoa học và công nghiệp.

? Sắc kí lỏng dựa trên hiện tượng: dưới cùng một điều kiện, mỗi cấu tử trong một hỗn hợp tương tác với môi trường xung quanh khác với tất cả các cấu tử khác.

? Khi được sử dụng như một công cụ phân tích, LC có thể xác định các cấu tử trong một hỗn hợp và lượng của chúng trong mẫu. Khi kết hợp với những kỹ thuật phân tích khác thì có thể nhận diện định tính các cấu tử trong mẫu.

? Phép tách được đòi hỏi khi: Một hỗn hợp quá phức tạp cho việc phân tích trực tiếp ví dụ đo phổ. Các chất phân tích rất giống nhau ví dụ các đồng phân. Sự cần thiết phải điều chế một chất có độ tinh khiết cao. Xác định lượng của của một chất nào đó.

? Sắc kí cột mở, sắc kí bản mỏng được sử dụng trong những trường hợp tách tương đối đơn giản, còn HPLC là kỹ thuật tách những hỗn hợp phức tạp và có khả năng tách với độ phân giải cao để giải quyết những vấn đề nhanh hơn và tốt hơn.

? Trong HPLC nhiều thông số phải được xác định và thiết lập trước khi mẫu được cho vào trong máy. Vì thế để thành công với HPLC, cần thời gian để thiết lập chế độ và điều kiện hoạt động thích hợp cho máy trong mỗi phép phân tích. Điều này có thể mất hàng giờ hoặc ngày tùy theo kinh nghiệm và kiến thức của người phân tích.

3.2. Các bộ phận cơ bản của máy HPLC

60


? Hỗn hợp cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp, tiêm một thể tích

chính xác vào bộ phận tiêm mẫu và được mang vào cột bởi một dòng chảy liên tục của cùng dung môi (pha động) trong đó mẫu được hòa tan. Sự tách diễn ra trong cột có chứa những hạt xốp có diện tích bề mặt lớn (pha tĩnh). Các cấu tử trong mẫu liên tục tương tác với pha tĩnh. Pha động (còn gọi là chất rửa giải) được bơm qua cột được nhồi chặt các hạt sắc kí.

? Với việc chọn pha động và vật liệu nhồi cột thích hợp, các cấu tử trong mẫu sẽ di chuyển dọc trên cột với những tốc độ khác nhau. Khi những cấu tử lần lượt thoát ra khỏi cột và đi vào detector thích hợp, ở đây tín hiệu được ghi lại, xử lí và chuyển ra ngoài một sắc kí đồ, cho biết sự hiện diện của mỗi cấu tử dưới dạng một pic. Khi đó lượng cấu tử có trong mẫu được tính toán dựa vào chiều cao hoặc diện tích của pic của nó.

Các bộ phận cơ bản của một máy HPLC được mô tả trong sơ đồ nguyên tắc chung (hình 3.1):

Hình 3.1: Sơ đồ máy HPLC

3.2.1 Bình chứa dung môi

? Bình chứa dung môi là bình thủy tinh 1 dm3 có nắp được khoan lỗ dẫn ống nhựa (Φ ≈ 1/8 inche) để dẫn dung môi từ bình đến bơm.

? Dung môi bơm vào phải không được chứa bụi bẩn hoặc những vật lạ khác vì điều này có thể làm ảnh hưởng đến tuổi thọ của bơm hoặc làm kẹt các cột tách.

Bình chứa dung môi

Cột tách Van tiêm mẫu

Computor Sắc kí đồ

Lò ổn nhiệt

61


? Cần lọc dung môi qua giấy lọc 0.45µm trước khi sử dụng và để an toàn hơn ở đầu của ống nhựa trong bình chứa dung môi cần phải có đầu lọc.

? Cần loại bỏ hoặc đuổi các không khí hòa tan hoặc các bọt không khí trong dung môi vì khí hòa tan có thể làm biến dạng các pic và sinh bọt khí làm nhiễu đường nền. Loại bỏ bằng cách chạy siêu âm, hoặc sục khí trơ như heli…

? Trong phương pháp rửa giải thường chỉ cần một bình dung môi. ? Trong phương pháp rửa giải gradient thường dùng 2, 3 hoặc 4 bình dung môi khác nhau

và hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp của các loại dung môi trên được trộn với tỷ lệ biến đổi theo chương trình lập trước.

3.2.2. Áp suất trong cột tách

? Áp suất trong cột tách có thể lớn hơn hai trăm lần áp suất khí quyển. ? Theo hệ thống SI thì áp suất được tính bằng đơn vị Pascal (Pa). Áp suất của khí quyển

khoảng 105 Pa. ? Vì sự thuận lợi trong việc thể hiện áp suất bởi những số nhỏ hơn nên nhiều người làm

thực nghiệm và các nhà sản suất cũng sử dụng nhiều đơn vị khác như bar, psi (pounds per square inche) hoặc thỉnh thoảng kg cm-2. 1bar = 10 5 Pa nên 1 bar tương ứng bằng áp suất khí quyển (760 mm Hg hoặc 1 atm). 1 psi = một lực của 0.4536 x 9.81 N tác động lên một diện tích 0.02542 m2 1 psi = 6897 Pa 1 bar = 14.5 psi

? Cột tách có thể chịu đến 200 bar nhưng hầu hết những thí nghiệm trong HPLC chỉ sử dụng áp suất trong cột khoảng 20 đến 100 bar. Áp suất trong cột phụ thuộc vào chiều dài cột, kích thước hạt của pha tĩnh, độ nhớt và tốc độ dòng của pha động.

3.2.3. Hệ thống bơm

? Chức năng chính của bơm là vận chuyển pha động đi qua cột tách với một tốc độ xác định. Bơm cần đáp ứng một số yêu cầu khá cao về tính năng như sau:

o Phía trong bơm không bị tấn công bởi bất kỳ loại dung môi nào được sử dụng. o Một khoảng rộng của tốc độ dòng có thể chọn lựa và dễ thay đổi tốc độ dòng. o Dễ thay đổi từ việc sử dụng dung môi này đến loại dung môi khác. o Dễ bảo dưỡng và sửa chữa.

Một số loại bơm thông dụng như sau: Bơm tốc độ dòng hằng định (constant flow pump)

Đây là bơm kiểu syringe đẩy dung môi liên tục, khi hết dung môi trong ống bơm (khoảng 250 ml) thì dừng lại để nạp lại.

62


Bơm kiểu piston thì đẩy hút luân phiên. Loại này được dùng phổ biến vì có nhiều ưu điểm.

3.2.4. Hệ thống tiêm mẫu

? Phương pháp tiêm mẫu đầu tiên mượn kỹ thuật tiêm mẫu trong GC, trong đó dùng syringe tiêm mẫu qua một đệm cao su tự hàn kín được đặt tại đầu của bộ tiêm mẫu ở đầu cột tách.

? Một phương pháp nữa (stopped flow) là người ta dừng bơm và dùng syringe tiêm mẫu vào cột tách thông qua một cái khóa.

? Phương pháp phổ biến hiện nay là dùng van tiêm mẫu có một vòng mẫu (sample loop) có dung tích khác nhau từ 5 đến 500 µl. Phương pháp này rất dễ sử dụng, dễ tự động hóa và cho độ chính xác rất cao, mặc dầu tương đối đắt tiền. Với phương pháp này mẫu đầu tiên ở áp suất khí quyển được tiêm bằng xilanh vào vòng mẫu. Sau đó chuyển van từ vị trí nạp mẫu (load ) đến vị trí tiêm mẫu (inject ) nối vòng mẫu vào vị trí của dòng chảy của pha động, ở đây lượng mẫu chính xác trong vòng mẫu sẽ được vận chuyển vào cột tách.

3.2.5. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao ? Các cột sử dụng trong HPLC được làm bằng vật liệu thép không rỉ (thép Cr-Ni-Mo)

với mặt trong của cột được làm nhẵn. ? Kích thước phổ biến của một cột là đường kính ngoài bằng 6.35 mm (1/4 in.), 4.6 mm

đường kính trong, và chiều dài nhiều cở đến 25 cm. ? Cột được nhồi các hạt có cở đường kính 3, 4, 5, 10 µm. Chất nhồi trong cột thường là

silicagen hoặc silicagen có bọc hoặc gắn hóa học một màng mỏng chất hữu cơ. Bên cạnh silicagen người ta còn dùng Al2O3, hạt polime xốp, hạt chất trao đổi ion.

Bộ lọc tiền cột / cột bảo vệ

? Sau bộ phận tiêm mẫu và trước cột tách cần phải lắp cột bảo vệ (hay bộ lọc tiền cột) giúp bảo vệ những cột đắt tiền khỏi sự xâm nhập của của các hạt bẩn nhỏ có thể có trong dung môi và trong mẫu tiêm vào.

? Cột bảo vệ không làm thay đổi hiệu quả tách của cột. Nó được thiết kế với một thể tích tổng cộng tương đối nhỏ và thể tích chết nhỏ, nhờ vậy không làm doãng pic.

? Cột bảo vệ được đổ đầy các hạt nhồi tráng phim mỏng hoặc có pha liên kết như trong cột phân tích.

? Cột bảo vệ có một dung lượng xác định cho chất nhiễm bẩn. Số lần tiêm mẫu, sự suy giảm của hình dáng pic hoặc độ phân giải là dấu hiệu cần phải thay cột bảo vệ.

3.2.6. Detector

63


? Chức năng của detector trong HPLC là giám sát pha động đi ra từ cột phân tích. Tín hiệu ra của detector là tín hiệu điện tỉ lệ thuận với với một vài tính chất của pha động hoặc của chất tan trong mẫu.

? Có khá nhiều thiết bị được ứng dụng làm detector trong HPLC. Những đặc trưng quan trọng của detector trong HPLC là: nhạy tuyến tính đáp ứng (respond) chọn lọc hoặc thông dụng đáp ứng không bị tác động bởi những thay đổi của các điều kiện thể tích chết thấp không dễ bị phá hủy rẻ tiền, đáng tin cậy và dễ sử dụng.

? Không có detector nào có thể sở hữu tất cả những đặc trưng trên và chúng không hoàn toàn độc lập với nhau nên cải thiện một đặc tính của nó có thể làm tồi thêm cái kia. Bất kỳ một detector nào cũng chịu tiếng ồn của thiết bị, chủ yếu là phần điện, độ lớn

của nó xác định lượng chất hòa tan nhỏ nhất có thể được dò tìm. Bởi vì khi ta giảm lượng chất phân tích đến một giá trị nào đó thì tín hiệu từ detector sẽ quá nhỏ để có thể phân biệt nó với tiếng ồn của detector.

Độ nhạy của detector thường được xem như nồng độ tạo ra tín hiệu cở như tín hiệu tạo ra bởi tiếng ồn.

Một detector tuyến tính có tín hiệu tỷ lệ thuận với lượng hoặc nồng độ của chất tan. Khoảng tuyến tính của detector chính là khoảng nồng độ mà sự tuyến tính này tuân theo.

Giới hạn phát hiện cho biết lượng tối thiểu của cấu tử có thể được thấy một cách đáng tin cậy trên sắc ký đồ. Về mặt thực nghiệm giới hạn dò tìm của một chất là lượng chất đó cho một pic gấp vài lần tiếng ồn của nền (thường 3 lần).

Một detector vạn năng thì nhạy với mọi thứ có trong mẫu ví dụ detector khối phổ, còn một detector chọn lọc thì chỉ nhạy với một vài cấu tử nào đó như detector ECD nhạy với hợp chất chứa halogen.

Kiểu detector Đáp ứng Mức ồn Giới hạn phát hiện (g/cm3)

Thể tích flowcell (μl)

UV-VIS

Huỳnh quang

Đo độ dẫn

Đo chỉ số khúc xạ

Chọn lọc

Chọn lọc

Chọn lọc

Phổ thông

10-4 a.u

10-7 a.u

10-2 μS/cm

10-7 r.i.u

10-8

10-12

10-7

10-6

1-8

8-25

1-5

5-15

64


3.2.6.1. Detector UV- VIS

? Đây là loại phổ biến nhất trong HPLC. Nguyên tắc của nó là cho pha động từ cột được chảy qua một ống đo (flowcell) nhỏ có một chùm bức xạ đơn sắc UV/VIS chiếu qua.

? Sự hấp thu bức xạ của chất tan là một hàm phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C của nó theo định luật Lambert-Beer:

D = εlC Ở đây: D là đại lượng mật độ quang; l là chiều dài của cell; ε là hệ số hấp thu phân tử và là hằng số cho một chất tan và bước sóng.

? Đơn vị của ε phụ thuộc vào thứ nguyên của l và C. Trong hê SI thứ nguyên của C là mol m-3, l là mét nhưng trong thực tế C được đo với mol dm-3 còn l là cm nên ε là dm3 mol-1 cm-1.

? Định luật Lambert –Beer chỉ đúng khi chùm sáng bị hấp thu là đơn sắc, nhưng hệ thống detector thường không cung cấp chùm tia đủ đơn sắc mà chỉ một dải hẹp các chùm tia quanh giá trị bước sóng được chọn.

? Một ống đo (flow cell) trong UV detector có đường kính trong khoảng 1 mm và chiều dài ánh sáng đi qua khoảng 10 mm, như vậy thể tích chứa khoảng dưới 8 µl.

3.2.6.2. Detector chuỗi photodiot (Photodiode Aray Detector)

? Trong detector UV-VIS chùm sáng đa sắc được cho đi qua mẫu sau đó hội tụ vào khe vào của bộ đơn sắc hóa (monochromator) để tách chùm tia đơn sắc cần đo hướng vào bộ dò tìm.

? Mật độ quang của một mẫu được tìm thấy nhờ so sánh giữa cường độ của chùm tia tới bộ dò tìm khi không có mẫu (còn gọi là mẫu trống) với chùm tia đi qua mẫu.

? Để đo mật độ quang tại những bước sóng khác nhau, bước sóng được thay đổi nhờ quay chậm lăng kính hoặc bộ cách tử (grating) trong bộ đơn sắc hóa.

? Sự hiện diện của bộ phận quay trong thiết bị đã giới thiệu thêm sai số (ví dụ do sự giật lùi cơ học) và việc quay chậm có thể gây tốn thời gian.

Trong detector chuỗi photodiot, chùm tia đa sắc sau khi đi qua mẫu được tán xạ bởi bộ

cách tử được cố định rồi rơi vào một chuỗi các photodiot. Mỗi photodiot đo một dải hẹp các bước sóng trong quang phổ, như vậy nó là bộ thu nhận

số liệu song song, nghĩa là tất cả các điểm được đo đồng thời. Hệ thống này có một số thuận lợi như sau:

65


Bởi vì là bộ thu nhận số liệu song song nên việc xử lý và lưu trữ quang phổ có thể được thực hiện trong khoảng 0.5 s so với vài phút trong detector UV. Vì không có bộ phận di chuyển có thể bị làm mài mòn nên những sai số khi thiết lập lại một bước sóng cần chọn được giảm xuống và thiết bị cũng ít đòi hỏi bảo dưỡng như thiết bị khác. Nhờ khả năng thực hiện những phép đo nhiều bước sóng cùng một lúc và tốc độ thu nhận số liệu nên những kỹ thuật lấy trung bình số liệu khác nhau có thể được sử dụng để làm giảm tiếng ồn và tăng độ nhạy.

Khi được sử dụng như một detector trong HPLC, mặc dù đắt tiền hơn so với loại UV truyền thống nhưng nó cũng có những ưu điểm đáng kể: Quang phổ của mỗi pic trong sắc ký đồ có thể được lưu giữ và lần lượt so sánh

với phổ chuẩn giúp tiện lợi trong việc nhận diện các pic. Bước sóng tối ưu cho việc dò tìm cũng dễ dàng được tìm thấy và những thay đổi

của bước sóng trong quá trình dò tìm cũng có thể được chương trình hóa để xảy ra tại những điểm khác nhau trong sắc ký đồ. Nó cũng cung cấp độ nhạy cực đại cho các pic.

3.2.6.3. Detector huỳnh quang (fluorescence detector)

? Nhiều hợp chất có khả năng hấp thụ chùm tia UV rồi sau đó ngay lập tức phát ra bức xạ có bước sóng dài hơn (huỳnh quang) hoặc sau một sự trễ thời gian (lân quang –phosphorescence). Thường phần năng lượng bị hấp thụ sau đó phát xạ trở lại là tương đối thấp nhưng có một vài hợp chất, phần phát xạ trở lại có thể từ 0.1-1 nên thích hợp cho việc dò tìm huỳnh quang.

? Những hợp chất như vậy thường có vòng liên hợp như các hợp chất vòng thơm có nhiều nhân. Nhiều hợp chất không có phổ huỳnh quang có thể chuyển sang các dẫn xuất có phổ này nhờ xử lý với những thuốc thử thích hợp.

3.2.6.4. Detector đo chỉ số khúc xạ (Refrative index detector)

? Detector (RI) này nhạy với sự khác nhau giữa chỉ số khúc xạ của các chất rửa giải từ cột với dòng chảy của pha động nguyên chất.

? Đây là loại detector thông dụng nhất vì bất kỳ chất hòa tan nào cũng có thể được dò tìm miễn là nó có chỉ số khúc xạ khác với dòng chảy của pha động nguyên chất.Tuy nhiên, loại detector này kém nhạy khoảng 1000 lần so với detector UV.

? Mức độ tiếng ồn tốt nhất có thể thu được vào khoảng 10-7 đơn vị chỉ số khúc xạ, điều này tương ứng với nồng độ tương đương tiếng ồn khoảng 10-6 g.cm-3 cho hầu hết các chất tan.

? Có nhiều mẫu thiết kế cho detector đo chỉ số khúc xạ, nguyên tắc cơ bản hoạt động: Cuvet có hai bình tam giác có thể tích 5 đến 10 microlit trong mỗi bình có

dung môi nguyên chất và dung dịch chất tan chảy vào.

66


Chùm sáng khả kiến đã lọc các bức xạ hồng ngoại (có thể làm nóng mẫu) được chiếu qua cuvet có dung môi nguyên chất chảy qua 2 bình tam giác và được hướng vào ống nhân quang điện nhờ một đĩa deflection.

Khi chất tan với chỉ số khúc xạ khác đi vào cuvet, chùm sáng bị lệch làm tín hiệu của ống nhân quang điện thay đổi.

? Detector RI không dùng trong sắc kí rửa giải biến đổi nồng độ đều (gradient) vì nó không thể dò tìm chính xác khi thành phần pha động bị thay đổi. RI nhạy với sự thay đổi nhỏ của nhiệt độ và áp suất (0.01oC). Vì có độ nhạy thấp nên nó không được dùng trong phân tích lượng vết. RI cũng có khoảng nồng độ tuyến tính hẹp.

3.3. Các phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

3.3.1. Sắc kí phân bố hiệu năng cao Gồm hai loại phương pháp sắc kí lỏng-lỏng và sắc kí pha liên kết Sắc kí lỏng lỏng (LLC) :

? Pha tĩnh là chất lỏng được phủ trên bề mặt của các hạt chất mang (support). ? Pha tĩnh thường bị dung môi hòa tan và mất dần làm cột dần mất hiệu lực nên phương

pháp này ngày càng ít được sử dụng.

Sắc kí pha liên kết (bonded phase chromatography)

Pha tĩnh được gắn hóa học (liên kết) với chất mang (hạt silicagen) tạo nên hợp chất cơ-siloxan (hình 3.2).

? Nếu R là một nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl và pha động là dung môi phân cực như H2O, methanol, acetonitril thì có sắc kí pha đảo (hay sắc kí pha ngược). Ở đây pha tĩnh ít phân cực hơn pha động, trái với truyền thống của sắc kí trước đây là pha tĩnh phân cực hơn pha động.

? Nếu R là nhóm khá phân cực như alkylamin –(CH2)nNH2 hay alkylnitril –(CH2)n-CN và pha động là dung môi ít phân cực như hexan thì ta có sắc kí pha thuận.

Hiện nay sắc kí pha đảo được dùng rộng rãi vì những lí do sau: o Các phân tử không phân cực, ít phân cực, ion, hoặc có thể ion hóa có thể được

tách một cách hiệu quả. o Pha tĩnh có một khoảng phân cực rất rộng để có thể chọn lựa. o Nó cho phép chọn một khoảng rộng chất rửa giải. o Các chất dung môi rửa giải rất thông dụng và không đắt (nước, methanol và

acetonitril). o Kỹ thuật rửa giải gradient có thể được sử dụng mà không sợ hỏng pha tĩnh.

67


o Không có hạn chế về áp suất pha động đi vào cột. o Nó cho kết quả tách tốt với rất nhiều đối tượng tách.

Hình 3.2: Sơ đồ tổng hợp các pha tĩnh pha liên kết hóa học

Chọn các pha: thường chọn pha tĩnh có tính phân cực giống với các chất cần tách và

khác với pha động. Các chất hữu cơ có độ phân cực tăng theo thứ tự sau: Hydrocacbon no, ôlefin, hydrocacbon thơm, halogenua, sunfua, ête, dẫn xuất nitro, este = andehit = xeton, ancol =amin, sunfon, sunfoxit, amit, axit cacboxilic, nước.

? Thứ tự rửa giải trong sắc kí pha thuận là các chất không phân cực ra trước rồi đến các chất phân cực mạnh hơn.

? Trong sắc kí pha đảo các chất phân cực ra trước rồi đến các chất ít và không phân cực lần lượt ra sau.

Ứng dụng: sắc kí lỏng phân bố hiệu năng cao được dùng trong việc tách các chất thuộc nhiều lĩnh vực như:

Thuốc kháng sinh, an thần, giảm đau, steroid

68


Axit amin, protein, hydrat cacbon, lipid… Đường nhân tạo, chất chống oxi hóa, chất phụ gia, aflatoxin… Chất thơm, chất điện hoạt, chất màu, hóa chất công nghiệp… Thuốc trừ sâu, diệt cỏ, phenol và các dẫn xuất phenol… Thuốc, chất độc, cồn trong máu…

3.3.2. Sắc kí hấp phụ hiệu năng cao (sắc kí lỏng –rắn)

? Là phương pháp phát triển sớm nhất và được dùng rất phổ biến. Trong phương pháp này, chất tan bị giữ trên bề mặt pha tĩnh tức là chất hấp phụ và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ)

? Pha tĩnh: pha tĩnh là những bột mịn, silicagen và nhôm oxit là những chất được ưa dùng. Ở đây các chất càng bị phân cực càng bị lưu giữ mạnh và ra chậm khi rửa giải.

? Pha động: bảng dưới cho ta một dãy các dung môi với sức rửa giải tăng dần từ trên xuống (thông số sức dung môi tăng dần). Dãy này được xếp theo khả năng đẩy các chất ra khỏi nhôm oxit. Nhưng với silicagen ta cũng có dãy tương tự. Muốn có dung môi có vị trí trung gian không có trong bảng thì ta dùng hỗn hợp dung môi theo tỉ lệ thích hợp.

? Ứng dụng: Sắc kí hấp thụ được dùng nhiều để tách các chất tương đối ít phân cực, các chất hữu cơ không tan trong nước có phân tử lượng nhỏ hơn khoảng 5000. Phương pháp này mạnh hơn hẳn các phương pháp khác trong việc tách đồng phân.

Dung môi εo

Ete dầu hỏa Hexan Heptan

Xiclohecxan Tetraclocacbon

Ete propylic Toluene Benzene Ete etylic Clorofom

Clometylen Dicloetan

Aceton dioxan Butanol

Etyl acetat Acetonitril

Pyridin Dimetylsunfoxit Rượu isopropylic

Rượu etylic

0.01 0.01 0.01 0.04 0.18 0.28 0.29 0.32 0.38 0.40 0.42 0.49 0.56 0.56 0.56 0.58 0.65 0.71 0.75 0.82 0.88

69


Rượu metylic

0.95

3.3.3. Sắc kí trao đổi ion hiệu năng cao

3.3.3.1.Nhựa trao đổi ion (ionit)

Là phương pháp sắc kí trong đó các nhựa trao đổi ion được dùng làm pha tĩnh dưới dạng bột mịn.

Nhựa trao đổi ion (ionit) là những hợp chất cao phân tử có chứa nhóm chức chứa ion có khả năng trao đổi. ? Nhựa trao đổi cation (cationit) có hai loại: cationit axit mạnh có chứa nhóm –SO3

-H+

được ứng dụng rộng rãi, cationit axit yếu có nhóm –COOH. ? Nhựa trao đổi anion (anionit) cũng có hai loại: anionit bazơ mạnh có nhóm amoni bậc

4 –N(CH3)3+OH- và anionit yếu có nhóm trao đổi là các amin bậc 2 hay 3.

Các nhựa trao đổi ion được chế tạo bởi sự đồng trùng hợp giữa styrene và divinyl benzene với divinyl benzene có hàm lượng thay đổi từ 1 dến 16 % để tăng mức liên kết ngang của polime, dẫn đến chỉ trương nở nhưng không hòa tan trong nước.

Các nhân benzene sau đó được gắn vào các nhóm –SO3H để tạo nhựa cationit hoặc các nhóm amin –NR3

+ tạo nhựa anionit. Nếu axit metaacrylic được dùng thay thế cho styrene thì nhựa cationit axit yếu –COOH được tạo thành.

Hình 3.3: Sơ đồ tổng hợp nhựa ionit

Liên kết ngang Nhóm chức trao đổi ion

70


Các ionit không tan trong nước, khi tiếp xúc với dung dịch trao đổi ion thì có sự trao đổi. Với cationit có sự trao đổi cation, ví dụ sự trao đổi cation Ca2+ với nhựa cationit axit mạnh: 2RSO3

-H+(rắn) + Ca2+ (dd) (RSO3)2Ca(r) + 2H+(dd) Với anionit ta có ví dụ: 2R(CH3)3

+OH- (r) + SO42-(dd) [R(CH3)3]2SO4

2-(r ) + 2OH-(dd) 3.3.3.2. Cân bằng trao đổi ion Quá trình trao đổi ion giữa nhựa cationit axit mạnh với ion Ca2+ trong dung dịch có thể

viết: 2H+(rắn) + Ca2+(dd) Ca2+(r) + 2H+(dd) ? Áp dụng định luật khối lượng ta có:

22

2

][][][]['

2

rdd

dđr

HCaHCaK

?? ?

??

ở đây pha rắn là nhựa ionit. ? Biểu thức trên có thể biểu diễn lại như sau:

2

2]

2 ][['

][][ 2

dd

r

dd

r

HHK

CaCaK ?

?

? ???

K là hệ số phân bố của Ca2+ giữa dung dịch và nhựa ionit. Ion nào có K lớn sẽ bị lưu giữ mạnh trên ionit, K nhỏ sẽ bị lưu giữ yếu.

K phụ thuộc vào điện tích và kích thước của ion đã bị hydrat hóa. Nói chung, nhựa trao đổi ion ưu tiên trao đổi với ion có điện tích cao hơn, bán kính hydrat hóa nhỏ hơn.

Một thứ tự ưu tiên về sự chọn lựa cho các cation có thể được biểu diễn như sau: La3+ > Ce3+ >Eu3+ >Y3+ > Sc3+ > Al3+ > Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+ > Ag+ > Rb+ > K+ > NH4

+ > Na+ > H+ > Li+

3.3.3.3. Pha động trong sắc kí trao đổi ion: ? Rửa giải gradient với sự tăng lực ion hoặc thay đổi pH có giá trị rất lớn trong sắc kí trao

đổi ion. Giả sử xét một cột mà anion A- bị lưu giữ mạnh hơn anion B-. ? Ta tách A- khỏi B- bằng cách rửa giải với ion C- có ái lực với cột yếu hơn cả A- và B- .

Khi nồng độ C- tăng lên, C- dần dần bị thay thế và di chuyển dọc theo cột và ra khỏi cột. Khi nồng độ của C- tiếp tục tăng lên thì A- sẽ bị rửa giải.

? Trong hình 10 cho thấy một sự tăng dần nồng độ H+ được sử dụng để tách trao đổi ion. Trật tự rửa giải giống với trật tự của các hệ số chọn lọc của các cation. Hệ số chọn lọc càng lớn thì nồng độ H+ đòi hỏi càng cao để rửa giải cation đó ra khỏi cột.

71


Hình 3.4: Rửa giải La(III) từ cột nhựa trao đổi cation sử dụng gradient nồng độ H+ để tách cách cation lưu giữ mạnh hơn. La(III) được dò tìm bởi phản ứng với thuốc thử tạo màu sau khi rửa giải.

? Khi tìm giá trị thích hợp pH cho một phép tách cụ thể, điều cần biết là giá trị pKA của các cấu tử có trong mẫu.

Ứng dụng : ? Phương pháp này được dùng để tách các ion vô cơ và hữu cơ. Ví dụ khi cho dung dịch

hỗn hợp các ion Ba2+ , Ca2+ , Zn2+ , Mg2+ đi qua cột cationit axit mạnh thì các ion này bị lưu giữ trên cột . Khi dùng một dung dịch axit loãng để rửa giải thì lần lượt các ion đi ra khỏi cột là Mg2+ , Zn2+ , Ca2+ và Ba2+ .

? Có thể phát hiện các ion được rửa giải ra khỏi cột nhờ detector đo độ dẫn điện. 3.3.4. Sắc kí cặp ion (ion pair chromatography- IPC) Phần lớn sắc kí cặp ion (IPC) nảy sinh do những hạn chế của sắc kí trao đổi ion như:

? Các cột có khuynh hướng ít hiệu quả hơn các cột LC khác. ? Các cột thường không cho kết quả lặp lại ở một mức độ nào đó. ? Các cột thường ít bền. ? Độ chọn loc kém.

Trong ICP ta có thể sử dụng cả sắc kí pha thuận lẫn sắc kí pha đảo, mỗi loại có mặt thuận lợi riêng của nó. ? Pha tĩnh của sắc kí pha đảo có thể gồm có cả pha tĩnh silic được silan hóa được sử

dụng bình thường ví dụ pha liên kết C18 hoặc C8. ? Pha động trong ICP gồm một dung dịch đệm trong nước (cộng với một dung môi hữu

cơ như methanol hoặc acetonitril cho phép tách trong pha tĩnh liên kết) và một ion đối có điện tích ngược dấu với ion phân tử mẫu.

72


? Ví dụ, giả sử cần tách một số các axit hữu cơ, pha động được đệm ở pH =7 để tất cả các hợp chất trong mẫu nằm dưới dạng RCOO-. Ion đối trong trường hợp này có thể dùng ion tetrabutyl amoni (TBA+).

Cột dùng trong ICP được chuẩn bị giống như trong sắc kí pha liên kết và pha thuận. Pha phân bố:

Bảng sau tóm tắt vài hệ thống ICP được báo cáo trong các tài liệu với mỗi ứng dụng chỉ rõ pha động, pha tĩnh, ion đối. Bảng: Các hệ thống sắc kí cặp ion pha thuận

pH của nước Pha động Ion đối Loại mẫu pH 9 0.1MHClO4 Đệm HPO4

2- /PO43-

0.1MHClO4 pH 5-6 pH 6-8.5 0.2-0.25M HClO4 0.1M methane- sunfonic acid pH 8.3

Cyclohexane/CHCl3/1-pentanol Các hỗn hợp của tributyl phosphate, ethyl acetate, butanol, CH2Cl2,và/hoặc hexane Butanol/CH2Cl2/Hexane CH2Cl2/ CHCl3/ butanol và /hoặc Pentanol/CH2Cl2 và/hoặc CHCl3 Butanol/heptane Butanol/CH2Cl2/Hexane Butanol/CH2Cl2/Hexane Butanol/CH2Cl2/Hexane

N,N-dimethyl-protrityline ClO4

- (Butyl)4N+ ClO4

- Picrate (Butyl)4N+ ClO4

- CH3SO3

- (Butyl)4N+

Các axit cacboxylic Các amin Các axit cacboxylic Các amin Các amin Các sunfoamit Amin và các amin bậc bốn Các amin Các axit cacboxylic

Bảng : các hệ thống sắc kí cặp ion pha đảo

Những nguyên tắc chung trong việc kiểm soát sự tách trong ICP tương tự như trong sắc

kí pha đảo và pha thuận,. ? Vai trò của ion đối: Trong sắc kí pha đảo, lực dung môi được thay đổi bởi thay đổi ion

đối hoặc thay đổi nồng độ của nó. o Sự tăng nồng độ của ion đối dẫn đến sự tăng hệ số dung lượng k’ trong ICP pha

đảo. o Trong sắc kí ICP pha thuận và pha đảo thì k’ có thể được thay đổi bởi thay đổi

loại ion đối trong (ví dụ thay thế pentasulfonat bằng heptansunfonat chẳng hạn). Sự cộng thêm một nhóm –CH2- dẫn đến k’ tăng lên khoảng 2.5 lần (ảnh hưởng sẽ lớn hơn nếu nồng độ của ion đối thấp).

o Phân tử ion đối càng lớn thì giá trị k’càng lớn trong sắc kí pha đảo và càng nhỏ trong sắc kí pha thuận.

73


? Độ phân cực của dung môi: o Lực dung môi trong ICP pha thuận và pha đảo có thể được thay đổi bởi thay đổi

độ phân cực của pha động. o Trong các hệ thống pha đảo, hỗn hợp nước với methanol hoặc acetonitril nói

chung được sử dụng là pha động. Khi phần trăm của nước giảm xuống thì dung môi trở nên mạnh hơn và k’ của mẫu giảm xuống.

o Các hỗn hợp giữa butanol và pentanol với CH2Cl2, CHCl3 có hoặc không thêm hexan là những pha động thường dùng trong sắc kí pha thuận ICP.

? Ảnh hưởng của pH o Giá trị k’ của mẫu sẽ chịu tác động nhiều trong ICP bởi thay đổi pH hoặc thay đổi

dung môi này bằng dung môi khác (ví dụ từ acetat etyl thay bằng butanol). o Nếu chúng ta biết giá trị pKA của các axit hoặc pKB của các bazơ đang tách thì ta

có thể dự đoán được sự lưu giữ tương đối của mỗi hợp chất sẽ thay đổi theo pH. o Nói chung pH của pha động được duy trì như thế nào để cho các hợp chất mẫu

được ion hóa hoàn toàn, còn sự tạo thành ion đối thì đạt cực đại. o Ví dụ khi tách các axit nếu pH của pha động thấp thì anion mẫu X- sẽ nằm dưới

dạng HX dẫn đến số lượng mẫu nằm ở dạng ion đối trên pha tĩnh sẽ thấp. Ứng dụng:

? ICP được ứng dụng trong những mẫu phân cực như các bazơ, các ion, và các hợp chất có các nhóm ion hóa.

? Các mẫu nước, bao gồm các dịch sinh lí, cũng nhận được sự quan tâm của ICP. 3.3.5. Sắc kí loại theo cở (Size Exclusion Chromatography)

? Sắc kí loại theo cở hay còn gọi là sắc kí trên gel là một công cụ mạnh cho phân tích các chất có khối lượng phân tử lớn.

? Chất nhồi cột cho sắc kí này là các hạt nhỏ (cở 10 micromet) polime hoặc silica chứa mạng lưới các lỗ đồng nhất trong đó các chất tan và dung môi có thể khuếch tán vào. Trong các lỗ đó các phân tử bị bẫy một cách hiệu quả và bị tách từ dòng chảy của pha động.

? Thời gian cư ngụ trung bình trong các lỗ phụ thuộc vào kích thước hiệu dụng của các phân tử. Các phân tử có kích thước lớn hơn so với kích thước trung bình của các lỗ của chất nhồi thì không bị lưu giữ.

? Còn các phân tử có đường kính nhỏ hơn đáng kể kích thước lỗ thì thâm nhập càng sâu vào trong sâu lỗ và như vậy cần nhiều thời gian hơn để ra khỏi lỗ, dẫn đến bị rửa giải ra sau cùng.

? Nằm giữa hai loại này là các phân tử có kích thước trung bình sẽ xâm nhập vào trong các lỗ nhiều hay ít tùy thuộc đuồng kính của chúng.

? Chú y rằng trong sắc kí loại theo cở thì khác với các trường hợp xét trước đây, ở đây không có sự tương tác hóa học hoặc vật lí giữa các phân tử chất tan và pha tĩnh.

74


Chất nhồi cột ? Có hai loại: Các hạt polime và silica có đường kính từ 5 đến 10 micromet. Loại sau cứng

hơn nên dễ nhồi cột, bền hơn, cho phép sử dụng một khoảng rộng các dung môi bao gồm cả nước, cân bằng thiết lập nhanh hơn trong những dung môi mới, và bền ở nhiệt độ cao hơn.

? Những nhược điểm của hạt silica là có khuynh hướng lưu giữ chất tan bởi sự hấp phụ và có thể có tiềm năng xúc tác cho các phản ứng phân hủy các phân tử chất tan.

? Hầu hết sắc kí loại theo cở đầu tiên được thực hiện trên chất nhựa đồng trùng hợp giữa divinyl benzene với styrene. Kích thước lỗ của loại polime này được kiểm soát bởi sự mở rộng liên kết ngang và vì thế liên quan đến phần trăm divinylbenzen sử dụng để sản xuất nhựa. Vì vậy có nhiều loại gel với kích cở lỗ khác nhau.

? Lúc đầu, các nhựa đồng trùng hợp này là kỵ nước và chỉ được sử dụng với pha động là các dung môi không nước.

? Hiện nay, các gel ưa nước là có sẵn (ví dụ poliacrylamide) dẫn dến có thể sử dụng dung môi nước cho các phép tách các phân tử chất tan trong nước ví dụ các loại đường.

? Các loại silica và hạt thủy tinh có kích thước lỗ trung bình của khoảng 40 đến 2500 Ao hiện có sẵn trên thị trường. Để giảm sự hấp phụ, bề mặt của những chất này thường được chuyển hóa bởi những chất thế hữu cơ. Ví dụ bề mặt của một chất nhồi ưa nước có cấu trúc:

OH OH │ │ │ —Si—CH2—CH2—CH2—CH2—O—CH2—CH—CH2 │

Phương trình rửa giải: ? Trong sắc kí theo gel thể tích của pha động Vm thường được gọi là thể tích rỗng (Void

volume) Vo. Đại lượng Kav được định nghĩa là: Kav = (Vr – Vo)/(Vt - Vo)

Ở đây o Vr là thể tích lưu của một chất tan, o Vt là thể tích tổng của cột = πr2 với r là bán kính). o Đối với một phân tử lớn và không xâm nhập vào gel thì Vr = Vo và Kav = 0. o Đối với các phân tử nhỏ xâm nhập tự do vào gel thì Vr ≈ Vt và Kav ≈ 1. o Các phân tử có kích thước trung bình xâm nhập một phần vào các lỗ thì có Kav

nằm trong khoảng từ 0 đến 1. Thực tế do luôn luôn có sự hấp phụ nên Kav luôn luôn lớn hơn 1.

? Thể tích rỗng được đo bởi cho một loại phân tử trơ có kích thước lớn đi qua cột. Thể tích rửa giải của nó chính là Vo.

75


Hình 3.4: Sơ đồ cấu trúc một poliacrylamide

3.4. Pha động 3.4.1. Sự quan trọng của sự phân cực trong pha động HPLC

? Sự phân bố tương đối giữa 2 pha được xác định bởi sự tương tác của cấu tử chất tan giữa hai pha với cường độ được xác định bởi bởi sự phân cực của các phân tử mẫu, của pha động và của pha tĩnh.

? Các lực tương tác giữa các phân tử có thể gây ra bởi: o Một phân tử chất hòa tan có momen nhờ đó nó có thể tương tác một cách chọn lọc

với những lưỡng cực khác. o Nếu phân tử là chất cho hoặc nhận proton tốt thì nó có thể tương tác tốt với những

phân tử như vậy nhờ liên kết hydro. o Một phân tử cũng có thể tương tác lưỡng cực cảm ứng nhờ bị phân cực bởi các

phân tử khác.

76


? Độ phân cực là một đại lượng được sử dụng trong sắc ký như là một chỉ số đo khả năng của các hợp chất tương tác với chất khác theo những cách khác nhau ở trên: một phân tử càng phân cực thì càng tương tác mạnh với những phân tử khác.

? Nếu độ phân cực của pha tĩnh và pha động giống nhau thì tương tác của chất hòa tan với hai pha này là như nhau dẫn đến sự tách các chất hòa tan là kém. Như vậy với pha tĩnh không phân cực kiểu hydrocacbon ta cần một pha động phân cực mạnh, trong khi pha tĩnh là silica phân cực mạnh thì ta cần pha động phân cực tương đối thấp.

? Nếu ta quan tâm tách các hợp chất tan gần giống nhau về mặt hóa học thì ta nên chọn pha tĩnh gần giống về mặt hóa học như các chất tan cần tách mà ta quan tâm.

? Sự lưu giữ của các chất tan thường thay đổi khi ta thay đổi độ phân cực của pha động. 3.4.2. Đo độ phân cực

? Dễ thấy rằng nước là dung môi phân cực hơn heptan. Nước có một lưỡng cực nên là chất

cho nhận proton và dễ hòa tan các chất ion. ? Tương tự, metanol và acetonitril đều phân cực hơn heptan, nhưng không dễ dàng xác lập

độ phân cực tương đối cho metanol và acetonitril. ? Để tiên lợi có thể biểu diễn độ phân cực của một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi dưới

dạng một con số. ? Điều này được thực hiện bởi nhiều cách và không có cách nào hoàn toàn thỏa mãn. Tuy

nhiên, chúng cho phép ta sắp xếp các dung môi theo trật tự tăng dần của độ phân cực và giúp ta dự đoán được độ phân cực của hỗn hợp các dung môi.

? Bảng sau cho giá trị độ phân cực của các dung môi được sắp xếp theo trật tự tăng dần của thông số sức rửa giải δ.

Dung môi δ Hexan

Metyl benzene Tetrahydrofuran

Triclometan Butanon

Etyl axetat Diclo metan 1,2 dicloetan

Propanon 1,4 dioxan

2-metoxyl etanol Axetonitril

Etanol Methanol

Nước

14.9 18.2 18.6 19.0 19.0 19.6 19.8 20.0 20.2 20.4 23.3 23.9 25.9 29.4 47.8

77


? Thông số sức rửa giải của một hỗn hợp các dung môi có thể được dự đoán sử dụng qui

tắc đơn giản sau:

iim ??? ??

Ở đây Φi là tỉ lệ thể tích của dung môi i và δi là thông số sức rửa giải của dung môi i. ? Như vậy ta có thể tạo một dung dịch hỗn hợp có giá trị độ phân cực cần có bằng cách sử

dụng một hoặc nhiều dung môi có độ phân cực cao hơn trộn với một hoặc vài dung môi có độ phân cực thấp hơn độ phân cực cần đòi hỏi.

? Ví dụ đối với một dung dịch hỗn hợp gồm hai dung môi methanol (M) và nước (w)

)()1(

wMMw

MMwM

MMwwm

????????

?????

??????

??

? Trong sắc ký pha đảo thì các hỗn hợp chứa các dung môi khác nhau có cùng độ phân cực toàn phần được gọi là các dung dịch hỗn hợp cùng lực rửa giải (isoeluotropic).

? Trong thực tế việc thay thế pha động bằng một hỗn hợp isoeluotropic sẽ tạo thời gian phân tích mẫu đó gần bằng như trước nhưng các giá trị k’ của các cấu tử trong mẫu sẽ thay đổi do những hiệu ứng như đã đề cập tức là độ phân giải của chúng sẽ bị thay đổi.

? Một cách phân loại khác theo sức rửa giải của dung môi trên cột pha tĩnh nhôm oxit với nước được chọn là dung môi có sức rửa giải lớn nhất bằng 1.

? Bảng sau cho ta một dãy các dung môi với sức rửa giải tăng dần từ trên xuống (thông số sức dung môi ε tăng dần). Dãy này xếp theo khả năng đẩy các chất ra khỏi nhôm oxit, nhưng với silicagen ta cũng có dãy tương tự.

? Muốn có dung môi pha động với trị trung gian không có trong bảng, ta dùng hỗn hợp dung môi theo tỉ lệ thích hợp.

Dung môi ε

Ete dầu hỏa

He xan Heptan

Cyclohe xan Tetraclorua cacbon

Ete propylic Toluen Ben zen

E te etylic Cloroform

Clorua methylen Dicloroetan

Aceton Dioxan

0.01 0.01 0.01 0.04 0.18 0.28 0.29 0.32 0.38 0.40 0.42 0.49 0.56 0.56

78


Butanol Etyl acetat Acetonitril

Pyridin Dimetyl sunfua

Rượu Izopropylic Rượu etylic

Rượu mêtylic

0.56 0.58 0.65 0.71 0.75 0.82 0.88 0.95

3.4.3. Tối ưu hóa pha động

? Khi phát triển một phương pháp HPLC, ta muốn đạt được một mức độ tách có thể chấp nhận được tất cả các cấu tử ta quan tâm trong mẫu với một thời gian vừa phải và với một độ phân giải vừa đủ xác định. Một số mẫu ta chỉ cần phân tích một hoặc vài cấu tử có trong mẫu.

? Ở một mức độ nào đó, sự tách có thể chịu ảnh hưởng của các thông số như nhiệt độ, cột tách, tốc độ dòng của pha động, nhưng yếu tố quan trọng nhất kiểm soát việc tách vẫn là thành phần của pha động.

? Nếu phép tách không thỏa mãn bởi việc sử dụng pha động là hỗn hợp 2 dung môi thì có thể sử dụng 3 hoặc thậm chí trong một số trường hợp đến 4 dung môi cho thành phần của pha động. Vấn đề là tỉ lệ thành phần pha động của hỗn hợp này là bao nhiêu?

? Sự tối ưu hóa pha động đã được nhiều nhóm nghiên cứu trong thời gian qua và sau đây là một số chiến lược tối ưu hóa pha động được đúc kết.

3.4.3.1. Tìm một pha động thích hợp cho pha đảo

Khi sử dụng một cột pha liên kết theo kiểu pha đảo, việc tìm thành phần pha động tốt nhất cho một phép tách theo một cách tiếp cận chung:

? Đầu tiên nhận diện một dung môi mạnh (ví dụ metanol, acetonitril hoặc tetrahydro furan) mà mẫu có thể hoà tan.

? Bước tiếp theo là chọn một dung môi yếu mà mẫu hòa tan một cách hạn chế. Phần lớn thường chọn nước.

? Một khi một dung môi mạnh và yếu được nhận diện, việc tiêm mẫu vào cột được thực hiện sử dụng dung môi mạnh vừa chọn làm pha động. Trong trường hợp này tất cả các cấu tử đều hòa tan tạo một pic tại Vo.

? Nếu có sự lưu giữ khi sử dụng 100% dung môi mạnh làm pha động thì một dung môi mạnh hơn cần được tìm để thay thế. Ví dụ, nếu sự lưu giữ xảy ra với 100% metanol thì thử 100% acetonitril làm dung môi mạnh cho pha động.

? Sau khi xác định không có sự lưu giữ của các cấu tử trong pha động 100% dung môi mạnh, pha động nên được làm cho yếu hơn nhờ trộn với dung môi yếu với những tỉ lệ khác nhau.

79


? Mẫu sau đó đươc tiêm vào mỗi pha động mới này và sự lưu giữ được ghi chép lại cho đến khi sự lưu giữ xảy ra. Tỉ lệ dung môi mạnh và yếu nên được pha trộn theo những bước logic (ví dụ 100%, 80%, 60%, 40%, 20%). Nhờ vậy sự lưu giữ của các pic có thể được so sánh để tìm thành phần pha động thích hợp mà có thể đạt được độ phân giải mong đợi.

? Cần chú ý đến tốc độ pha động trong quá trình khảo sát trên. Thường một tốc độ pha động nhanh (trong vòng giới hạn áp suất của hệ thống sắc kí) được sử dụng để hạn chế việc tốn thời gian cho việc phát triển phương pháp.

3.4.3.2. Phát triển một pha động để cải thiện độ chọn lọc

? Khi phát triển một phép tách, mục tiêu đầu tiên là tìm cho được một cặp dung môi tốt nhất. Nhưng thỉnh thoảng việc trộn hai dung môi như cách chọn trên không tạo pha động có thể tách tốt. Vì thế cần phải thử một dung dịch hỗn hợp mới, ví dụ nếu hỗn hợp metanol/nước không cho phép tách tốt như mong đợi thì có thể nghĩ đến hỗn hợp acetonitril/nước, hoặc một hỗn hợp dung môi hữu cơ khác/nước.

? Nói chung nếu metanol không thích hợp thì chọn lựa tiếp theo là acetonitril. Các pha động có lực rửa giải giống nhau được gọi là các isoeluotropic. Khi sử dung các pha động isoeluotropic thay thế thì có thể tăng cường độ chọn lọc của những hợp chất có cùng giá trị k’ khi pha động là dung dịch hỗn hợp được chọn lúc ban đầu, nghĩa là có thể tách được chúng.

? Đôi khi một hỗn hợp hai dung môi không thể giúp phép tách đạt được. Trong trường hợp này hỗn hợp 3 dung môi là hữu ích. Có nhiều tài liệu về việc sử dụng nhiều hơn một dung môi hữu cơ cho pha động để đạt được độ chọn lọc. Cũng có nhiều phần mềm trợ giúp phát triển các pha động sử dụng tới 4 dung môi trộn lẫn (ví dụ metanol/acetonitril/ tetrahydrofuran/nước).

? Tuy nhiên, các pha động sử dụng ba dung môi không phải xảy ra phổ biến, thực tế chỉ cần đến chúng cho những trường hợp rất khó khăn trong việc tách và thường đòi hỏi sự trợ giúp của những chương trình máy tính.

80


Hình 3.5: Tối ưu hóa phép tách HPLC sử dụng các pha động có thành phần thay đổi. Các pic: (1) paracetamol, (2) caffein, (3) aspirin, (4) phenacetin, sử dụng cột C18, 5μm,

detection 235 nm.

3.4.3.3. Sử dụng các pha động không nước

? Bởi vì các phép tách pha đảo được dựa trên khả năng hòa tan của mẫu trong các pha động và pha tĩnh nên không cần thiết sử dụng nước nếu khả năng hòa tan đó bị hạn chế.

81


? Thường hai dung môi hữu cơ (một dung môi hữu cơ mạnh và một yếu) có thể và nên được sử dụng hơn là một dung môi hữu cơ mạnh và nước. Chẳng hạn nếu mẫu hoàn toàn không hòa tan trong nước, dung môi yếu phải là một dung môi khác nước.

? Ví dụ trong trường hợp tách triglycerit (các chất béo), nước được xác định là dung môi quá yếu vì các chất béo thậm chí không hòa tan một phần trong nước. Trong phép tách pha đảo, một dung môi mạnh là THF và dung môi yếu kia là acetonitril. Nhớ rằng việc phát triển một phép tách pha đảo không đòi hỏi việc sử dụng một dung môi là nước mặc dù nhiều người không đồng ý như vậy.

3.4.3.4. Tối ưu hóa với hai hoặc ba dung môi cho sắc kí pha đảo

? Hình 3.6 mô tả một quá trình thực hiện một cách có hệ thống để phát triển một phép tách với sự kết hợp của các dung môi.

Hình 3.6: Phát triển phương pháp HPLC sắc kí pha đảo theo kiểu tam giác đều. THF là tetrahydrofuran. Hình trình bày thủ tục được áp dụng cho một phép tách sắc kí thực tế.

? Các bước cần thực hiện để đạt được một phép tách thích hợp để đáp ứng những tiêu chí

đặt ra (có thể không cần qua tất cả các bước): o Bước 1: Tối ưu hóa phép tách với acetonitril/dung dịch đệm để thu được sắc kí A. o Bước 2: Tối ưu hóa phép tách với metanol/dung dịch đệm để thu được sắc kí B. o Bước 3: Tối ưu hóa phép tách với tetrahydrofuran/dung dịch đệm để thu được sắc kí

C. o Bước 4: Trộn các dung môi đã sử dụng ở A, B, C theo từng cặp, với mỗi cặp có tỉ lệ

1:1 để tạo các sắc kí đồ D, E và F. o Bước 5: Xây dựng một hỗn hợp 1:1:1 của các dung môi A,B,C để tạo sắc kí đồ G. o Bước 6: Nếu các kết quả từ A đến G là đủ tốt thì chọn 2 điểm tốt nhất và trộn dung

môi để thu được các điểm giữa hai điểm này.

82


Hình 3.7: Giản đồ cho thấy phần trăm thể tích của dung môi có cùng lực rửa giải. Đường thẳng đứng giao với giao với mỗi đường dung môi tạo những điểm có cùng lực rửa giải. Ví dụ 30% thể tích acetonitril/70% nước có cùng lực rửa giải như 40% thể tích methanol hoặc 22%V của tetrahydrofuran.

3.4.4. Tách bằng pha động có thành phần biến đổi đều (Gradient separations)

? Nhiều trường hợp mẫu chứa nhiều cấu tử có độ phân cực khác nhau trong khoảng rộng nên một phép tách với pha động không thay đổi thành phần có thể dẫn đến :

- Một số cấu tử có hệ số dung lượng k’ nhỏ còn một số thì rất lớn nên khi lực rửa giải của pha động đủ thấp để phân giải các pic ra đầu tiên thì sự rửa giải các pic sau cùng rất chậm làm kéo dài thời gian phân tích và lãng phí dung môi.

- Một số pic có thể bị kéo đuôi. ? Để đạt được độ phân giải nhưng giảm thời gian phân tích, một sự biến đổi nồng độ thành

phần nên được chọn. Phát triển phép tách gradient.

? Bước đầu tiên nên khảo sát trong một khoảng rộng của lực rửa giải theo chế độ không thay đổi thành phần dung môi (isocratic elution), từ 10 đến 100% nồng độ của dung môi hữu cơ mạnh ví dụ acetonitril trong nước. o Điều này giup ta xác định được các giá trị k’ của các cấu tử có trong mẫu cho mỗi

trường hợp. o Nếu các giá trị k’ của các cấu tử khá gần nhau thì trong sắc kí pha đảo ta có thể giảm

nhẹ thành phần dung môi hữu cơ xuống sẽ giúp cải thiện độ phân giải. Nếu không thì thay đổi dung môi khác hoặc thay đổi pha tĩnh.

o Nếu các giá trị k’ của các (hoặc một số) cấu tử có k’ khác nhau khá lớn và vượt ngoài khoảng 5-10 thì nên sử dụng chế độ rửa giải có thành phần pha động biến đổi đều (gradient).

? Bước tiếp theo là trãi các pic rộng ra bằng cách chọn khoảng biến thiên gradient hẹp hơn:

Acetonitril/H2O

Metanol/H2O

Tetrahydrofuran/H2O

83


o Biểu đồ gradient biểu diễn sự phụ thuộc của thời gian từ lúc tiêm mẫu với % của dung môi acetonitril của sắc đồ (a) trong hình 3.8 tăng đều từ 10 dến 90 % trong 40 phút (với thời gian chờ dung môi là gần 5 phút). Pic 1 được rửa giải ở thời điểm phút 14 khi thành phần dung môi là 28% và pic 8 được rửa giải gần 35.5 phút tương ứng thành phần % dung môi là 71%. Như vậy sự biến thiên thành phần dung môi từ 10 đến 28% và từ 71 đến 90 % là không cần thiết.

o Vì thế trong lần chạy sắc kí thứ hai có thể thay đổi thành phần pha động tuyến tính acetonitril từ 28 đến 71% trong thời gian 40 phút. Trong sắc đồ (b) điều kiện được chọn hơi khác một ít là từ 30 đến 82% trong 40 phút. Kết quả các pic được trải rộng hơn và thời gian các pic tách khỏi nhau còn 32 phút.

? Trong sắc kí (c), ta muốn xem thử liệu có thể sử dụng khoảng gradient hẹp hơn để giảm thời gian chạy sắc kí. Thành phần dung môi pha động trong lần này biến đổi như trong (b) nhưng trong khoảng thời gian 20 phút. Kết quả sắc đồ (c) cho thấy các pic 6 và 7 không được phân giải hoàn toàn nên sắc kí đồ (b) hợp lí cho phép tách gradient.

? Nếu phép tách trong sắc kí đồ (b) không thể chấp nhận thì ta có thể thử cải thiện nó bằng cách giảm tốc độ dòng pha động hoặc tiến hành gradient phân đoạn. Lí lẽ của gradient phân đoạn là để sử dụng thành phần dung môi tốt cho mỗi vùng của sắc kí đồ và sau đó tăng % của pha động cho vùng tiếp theo. Điều này tiến hành dễ dàng.

? Với tất cả các công cụ trên, ta có thể tìm ra cách các cấu tử của một hỗn hợp nếu nó không chứa quá nhiều cấu tử. Nếu sắc kí pha đảo thất bại cần chuyển sang một phương pháp khác như sắc kí pha thuận.

84


Hình 3.8: Các phép tách gradient tuyến tính của cùng một mẫu được sử dụng ở trên trong cùng một cột tách và hệ thống dung môi ở tốc độ dòng 1.0 ml/phut. Thời gian chờ dung môi là 5 phút.

3.5. Phát triển một phép tách

? Khi phát triển một phép tách, một chiến lược của việc chọn pha động đã được đề cập. Tuy nhiên khi phân tử có phần phân cực và một phần không phân cực thì những mục tiêu hỗ trợ chiến lược phát triển phương pháp hơi khác với những thảo luận trên.

? Để minh họa cho việc tiếp cận phát triển phương pháp cho loại mẫu này, ba loại estrogen trong một mẫu dược phẩm sẽ được tách. Cấu trúc của ba loại này trong hình 3.9.

85


Hình 3.9: Cấu trúc của 3 estrogen liên hợp

Hình 3.10: Kết quả tách cuối cùng của 3 estrogen (a) Mẫu chuẩn, (b) Mẫu viên thuốc. Pha động sử dụng 35/65 MeOH/H2O(v/v) + đệm KH2PO4 0.001M

? Trong ví dụ này trong khi tất cả các hợp chất có cấu tạo tương tự nhau về mặt cấu trúc,

chúng chỉ khác về mức độ bão hòa trong vòng thứ hai, điều này ngụ ý về sự khác nhau của phần không phân cực trong các phân tử này. Các phân tử này là những muối natri và có điện tích -1 khi hòa tan trong nước.

86


? Sử dụng cột trao đổi ion có lẽ không là một ý tưởng tốt vì tất cả các hợp chất này đều có cùng điện tích và không may pKa của chúng không được biết.

? Bởi vì có sự khác biệt nhau về cấu trúc phần không phân cực trong phân tử, ta nên chọn pha tĩnh mà có thể phân biệt đối xử giữa sự khác nhau của những phần không phân cực này (nếu pKa của chúng khác nhau đáng kể thì có thể tiếp cận phương pháp sắc kí trao đổi ion). Một pha liên kết không phân cực như C18 là một lựa chọn thích hợp. Trong nhiều trường hợp, việc có sẵn nhiều loại cột không phân cực sẽ quyết định loại cột nào được chọn cho phép tách. Tuy nhiên, như đã được đề cập trước đây, bởi vì cột C18 cho sự lưu giữ tốt với một khoảng rộng của lực rửa giải của pha động, nó là cột dùng cho những mục đích phổ biến tốt nhất cho pha đảo.

? Sau khi cột C18 được chọn, nhưng dung môi mạnh và yếu phải được chọn. Bởi vì cột không phân cực được chọn nên nước được chọn như là dung môi yếu còn metanol như là dung môi mạnh. Tuy nhiên, acetonitril hoặc THF có lẽ cũng có thể được chọn như là một dung môi mạnh. Lực dung môi theo trật tự sau : metanol < acetonitril < THF. Vì thế, chọn metanol trước sẽ cho phép uyển chuyển trong việc chọn hai dung môi sau nếu metalnol không cho kết quả tách tốt. Ngoài ra metanol được xem là dung môi ít độc hơn so với hai dung môi kia.

? Bởi vì điểm bắt đầu là một cột pha liên kết C18 10 µm và một pha động gồm metanol/nước, cần chuẩn bị một mẫu chứa 3 chất chuẩn trong một hỗn hợp 50:50 metanol/nước. Đây là một sự lựa chọn tùy ý vì thành phần pha động chưa được xác định. Dung dịch mẫu cũng được hòa tan trong cùng một dung môi như trường hợp dung dịch chất chuẩn, được trộn trong thời gian ngắn và được lọc để tách những chất không hòa tan trong viên thuốc.

? Bước tiếp theo là bắt đầu chạy sắc ký với 100 % metanol như là pha động với tốc độ pha động thích hợp. Metanol được kiểm tra như là một dung môi mạnh bởi việc quan sát sau khi tiêm mẫu, tất cả đều được hòa tan tại thể tích chết vì thế không có sự tách ở đây. Như vậy metanol là dung môi quá mạnh làm cho các cấu tử cần tách trong mẫu đều hòa tan vào trong pha động và không bị lưu giữ trên pha tĩnh. Chất rửa giải này phải được làm yếu hơn nhờ thêm vào nó phần trăm đã biết của nước và mẫu được tiêm vào. Qúa trình này được tiếp tục cho đến khi sự lưu giữ bắt đầu rõ ràng. Trong ví dụ này đó là trường hợp 50:50 metanol/nước và kết quả tách tốt nhất tại 35:65 metanol/nước. Bước tiếp theo là tiêm các chuẩn của estrogen và xác định lại sự lưu giữ của chúng.

3.6. Sắc kí lỏng trên cột mở

3.6.1 Giới thiệu

? Trong phương pháp này người ta sử dụng cột mở hay cột được nhồi với pha động chảy qua. Phương pháp này được phân biệt với phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) ở chỗ dung môi pha động chảy qua cột do trọng lực của nó.

87


? Kĩ thuật này được sử dụng với tất cả các quá trình: hấp thụ, phân bố, trao đổi ion, và săc kí qua gel. Thiết bị và thiết lập thực nghiệm được trình bày trong hình 3.11:

Hình 3.11: Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của cột sắc kí cột mở

? Hiện nay nhiều ứng dụng phân tích định tính của kĩ thuật này đã được thay thế bởi sắc kí bản mỏng và HPLC. Sự phổ biến của HPLC cũng làm giảm nhiều ứng dụng khác của kĩ thuật này. Tuy nhiên, nó vẫn được sử dụng nhiều trong những phép tách với lượng lớn (> 10 g) của những hỗn hợp phản ứng trong tổng hợp hữu cơ, những công việc cô lập và chiết tách các hợp chất hữu cơ tự nhiên.

3.6.2. Các vấn đề thực nghiệm

3.6.2.1. Cột và các thủ tục nhồi cột

? Sắc kí cột mở được thực hiện chủ yếu trong các cột thủy tinh. Kích thước của cột phụ thuộc vào số lượng của chất cần tách. Cột nhỏ nhất có đường kính chỉ vài milimet và chiều dài vài cm, trong khi đó cột lớn nhất có thể vài cm đường kính và chiều dài tương ứng dài hơn.

? Để thu được hiệu quả lớn nhất cột phải được nhồi thích hợp. Ảnh hưởng của kích thước hạt và thủ tục nhồi cột đã được thảo luận trong chương trước. Do phương pháp sử dụng trọng lực của dung môi chảy xuyên qua cột nên kích thước hạt nhồi phải > 150 micromet để thu được những tốc độ dòng chảy có thể chấp nhận được. Cột phải được nhồi đồng nhất để làm giảm thiểu đến mức nhỏ nhất sự biến dạng của sắc kí.

? Một vấn đề nữa cần chú y là bọt không khí trong quá trình nhồi cột. Để ngăn ảnh hưởng này đến mức có thể, chất nhồi cột nên được trộn với dung môi với tỉ lệ 1:3 và rót thành

88


dòng mỏng vào vào trong cột. Nếu kích thước hạt là đồng nhất thì cột dễ hơn để nhồi. Khi nhồi cột hoặc trong quá trình tách không được để cho cột khô ở bất kì vị trí nào vì như vậy dẫn đến không khí xâm nhập vào các vị trí đó.

3.6.2.2. Nạp mẫu

? Mẫu nên được đưa vào đầu cột khi chuẩn bị xong cột và được pha với một lượng dung môi dùng rửa giải thích hợp. Phần trên của cột có thể được bảo vệ bởi một lớp bông thủy tinh, giấy lọc…

? Khi tất cả mẫu được hấp phụ hết thì rót dung môi rửa giải vào và tiến hành sắc kí. Dung môi có thể được nạp liên tục theo yều cầu của phép tách.

3.6.2.3. Các thủ tục rửa giải

Có ba thủ tục rửa giải chính: rửa giải đồng hệ (isocratic), rửa giải phân đoạn fractional (stepwise) và rửa giải biến thiên gradient:

? Isocratic là thủ tục rửa giải với hỗn hợp dung môi có thành phần không thay đổi trong quá trình chạy sắc kí cho đến khi hoàn thành sự tách.

? Factional là thủ tục rửa giải sử dụng một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp để cô lập và tách một hoặc một nhóm cấu tử cần tách trong mẫu. Thỉnh thoảng có thể sử dụng nhiều dung môi khác nhau có lực rửa giải tăng dần để tách các cấu tử hoặc nhóm cấu tử khác nhau.

? Gradient là thủ tục sử dụng môi trường rửa giải được thay đổi liên tục, nghĩa là nồng độ của các dung môi trong hỗn hợp được thay đổi biến thiên đều theo thời gian. Ảnh hưởng của thủ tục này là có thể rửa giải lần lượt các chất hấp phụ mạnh dần và giảm hiện tượng kéo đuôi. Điều này có nghĩa là các dải sắc kí sẽ có khuynh hướng đậm dặc hơn trong cột và chiếm trên cột ít hơn.

3.6.3. Sắc kí hấp phụ

3.6.3.1. Dung môi

? Chất rửa giải sử dụng trong sắc kí hấp phụ được dựa trên các dung môi không phân cực như hexan hoặc chứa lượng nhỏ nhóm phân cực như 2-propanol. Khi mẫu được đưa vào cột thì các phân tử mẫu có chứa các nhóm chức phân cực sẽ liên kết với các vị trí hoạt hóa trên chất nhồi.

? Chúng sẽ bị thay thế lần lượt bởi các phân tử có chứa nhóm phân cực của chất rửa giải khi khai triển sắc kí và sẽ di chuyển xuống các vị trí mới ở phía dưới của cột. Việc thay thế này dễ hay không phụ thuộc vào độ phân cực tương đối của chúng. Các phân tử càng phân cực thì sẽ càng hấp phụ mạnh và vì thế sẽ di chuyển chậm trên cột.

89


? Các dung môi như đã đề cập đóng vai trò cạnh tranh với các phân tử trong mẫu ở các vị trí hoạt động trên chất hấp phụ. Như vậy, các phân tử dung môi liên kết càng mạnh với pha tĩnh thì các chất trong mẫu nằm trong pha động lâu hơn và như thế chúng càng được rửa giải nhanh hơn. Vì thế sự lưu giữ không bị ảnh hưởng quá nhiều bởi khả năng hòa tan của mẫu trong chất rửa giải mà bởi khả năng hấp phụ của dung môi. Dung môi ban đầu nên chọn có những lực rửa giải trung bình để những dung môi mạnh hơn tiếp theo có thể được thử.

? Nói chung, với các chất hấp phụ phân cực như oxit nhôm hoặc silicagen, khả năng hấp phụ tăng lên khi chất bị hấp phụ có tính phân cực càng tăng. Đối với cacbon thì trật tự ngược lại. Trappe đã tìm thấy lực rửa giải của một loạt dung môi cho những chất hấp phụ trên cột chứa silicagen giảm theo trật tự như sau: Nước nguyên chất > methanol> etanol > propanol > aceton > etyl axetat > dietyl ête > clorofom > diclometan > benzene > toluene > tricloetylen > cacbon tetraclorua > cyclohexan > hexan. Thực tế, dung môi là yếu tố kiểm soát trong sắc kí hấp phụ. Với dãy trên ta có thể chọn một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi với lực rửa giải thích hợp.

3.6.3.2. Chất hấp phụ pha tĩnh

? Trên bề mặt mạng lưới của chất hấp phụ xốp như Al2O3, silicagen có chứa các nhóm phân cực hydroxyl –OH, và những nhóm này sẽ tương tác bề mặt với các phân tử chất tan (Al2O3 có những chi tiết cấu trúc thêm sẽ được thảo luận phần sau)

Nhiều chất rắn được sử dụng làm chất hấp phụ được liệt kê trong bảng cùng với những hợp chất cần tách chủ yếu là những chất hữu cơ (các chất vô cơ cần tách thì cần sử dụng phương pháp sắc kí ion).

90


? Các chất hấp phụ được sử dụng làm pha tĩnh có tính phân cực mạnh như Al2O3, silicagen, đá vôi… thì có khả năng hấp phụ mạnh các hợp chất có các nhóm càng phân cực theo trật tự như sau:

-CH=CH- < -OCH3 < -COOR < =C=O < -CHO < -SH < -NH2 < -OH < -COOH

Trật tự này đảo ngược đối với cacbon.

3.6.3.3. Chuẩn bị chất hấp phụ

Silicagen

? Silica hay silica gel hay axit silixic là tên chung cho vật liệu được điều chế bởi cho natri silicat tác dụng với axit sunfuric tạo gel, rửa và sấy khô. pH cuối cùng của dung dịch chứa gel sẽ xác định diện tích bề mặt cụ thể. Ví dụ, ở pH 3.72 diện tích bề mặt là 830 m2g-1, còn ở pH 5.72 là 348 m2g-1. Khi điều chế nhiều lần thì cần giữ giá trị pH không đổi nhờ dung dịch đệm axetic axit/axetat natri.

? Các vị trí hoạt động trên bề mặt gồm các nhóm silanol –Si-OH với khoảng cách khoảng 5Ao. Các thủ tục để bổ sung tính hoạt động bề mặt này phụ thuộc vào việc tách hoặc thêm nước. Bề mặt hấp phụ nước sẽ che các vị trí hoạt động có thể tách một cách đơn giản bởi gia nhiệt. Tuy nhiên khi đun nóng ở nhiệt độ cao cở 400oC dẫn đến sự mất hoàn toàn tính hoạt động của bề mặt do sự tách loại phân tử nước từ hai nhóm silanol kề nhau và tạo thành mối liên kết ete của hai nhóm này (không có hoạt tính sắc kí).

Alumina

? Bề mặt của oxit nhôm có khả năng thể hiện các kiểu tương tác chất tan-chất hấp thụ khác nhau. Điều này là do trước hết có trường dương điện rất mạnh xung quanh Al3+, cho phép tương tác với các chất dễ bị phân cực hóa. Vì vậy nó thích hợp hơn silicagen trong việc phân giải các hợp chất thơm từ olefin. Thứ hai, các vị trí bazơ (có lẽ là O2- ) cho phép tương tác với các chất nhường proton .

? Sự chuẩn bị và hoạt hóa các alumina khác với silicagen ở chỗ hoạt tính của nó tăng lên khi tăng nhiệt độ hoạt hóa. Alumina hoạt tính cao có thể được tạo bởi đun nóng ở nhiệt độ 400oC qua đêm. Bề mặt có thể bị mất hoạt tính bởi nước hydrat trở lại. Alumina ít được sử dụng rộng rãi hơn silicagen do chúng có khuynh hướng làm xúc tác cho nhiều phản ứng.

3.6.4. Sắc kí phân bố

? Trong sắc kí phân bố chất hấp phụ rắn được thay thế bởi nhồi vào cột chất mang rắn trên đó có phủ pha tĩnh lỏng. Pha tĩnh lỏng không được hòa tan và không trộn lẫn với pha động. Sắc kí phân bố là kĩ thuật lợi dụng khả năng của một chất tan phân bố của nó giữa hai pha.

91


? Cơ sở của phương pháp này là do sự khác nhau trong các hệ số phân bố của các cấu tử khác nhau, khi cho pha động thích hợp đi qua thì hỗn hợp sẽ bị phân giải.

Chất mang rắn ? Các chất mang nói chung được sử dụng là silicagel, diatomit, và xenlulo.

? Chất mang sử dụng trong pha tĩnh là chất trơ đối với các chất cần tách. Chất rắn có phủ pha lỏng được nhồi vào cột như trong sắc kí hấp phụ. Cột cũng tương tự. Chất mang phải hấp phụ và lưu giữ pha tĩnh lỏng và phải có diện tích bề mặt rộng. Nó phải bền cơ và dễ dàng nhồi vào cột khi được phủ pha tĩnh lỏng và không cản trở dòng chảy pha động.

92


? Khó khăn lớn nhất không thể tránh khỏi là sự tấn công của hiệu ứng hấp phụ. Thậm chí nếu bề mặt của chất mang đã được phủ kín với pha lỏng tĩnh, hiệu ứng hấp phụ cũng hãy còn. Khi sự phủ kín của bề mặt không dễ đạt được thì sự hấp phụ có thể là ảnh hưởng chính trong sự tách.

3.7. Sắc kí lỏng trên mặt phẳng

? Sắc kí giấy và sắc kí lớp mỏng đã được xây dựng, phát triển và ứng dụng từ lâu. Tuy nhiên hiện nay sắc kí giấy ít được sử dụng.

? Trong sắc kí mặt phẳng, quá trình sắc kí được tiến hành trên một tờ giấy hay một lớp bột rải đều và được giữ trên mặt một tấm kính, chất dẻo hay kim loại, ví dụ nhôm. Bản thân lớp mỏng có thể là pha tĩnh hoặc chỉ là chất mang để giữ pha tĩnh trên đó. Pha động là chất lỏng sẽ thấm và chạy trên lớp mỏng do tác dụng của lực mao dẫn và đôi khi cả trọng lực và điện thế.

? Phổ biến nhất hiện nay là sắc kí lớp mỏng. Ở nước ta phương pháp sắc kí lớp mỏng đã được sử dụng rộng rãi, đã có nhiều tài liệu, chuyên gia có kinh nghiệm về phương pháp này.

3.7.1. Vai trò của phương pháp SKLM

? Về mặt lí thuyết cũng như về chủng loại các pha tĩnh và động, về mặt ứng dụng, SKLM và sắc kí lỏng trên cột khá giống nhau. Vì thế SKLM có thể dùng để tìm các điều kiện tối ưu cho sự tách bằng săc kí lỏng trên cột.

? Ưu điểm của SKLM là có thể tiến hành nhanh chóng và ít tốn kém các thí nghiệm thăm dò cho sắc kí cột.

? SKLM được dùng để thử độ tinh khiết của sản phẩm dùng nhiều trong phòng thí nghiệm, trong nghiên cứu sinh học, hóa sinh…

3.7.2 Nguyên tắc của SKLM

? SKLM thường được tiến hành trên một bản thủy tinh có rải một lợp mỏng dính chắc của các hạt bột mịn. Lớp mỏng này thường được dùng làm pha tĩnh. Các pha tĩnh và động trong SKLM cũng tương tự các pha trong sắc kí lỏng hiệu năng cao

(sắc kí hấp phụ, sắc kí phân bố pha thuận và pha ngược, sắc kí trao đổi ion, sắc kí trên gel). Chuẩn bị các lớp mỏng

? Bột dùng để chế tạo lớp mỏng ( ví dụ bột silicagen) thường được thêm nước thành bột nhão và rải lên bề mặt sach của một tấm kính hay chất dẻo (hoặc phiến kính dùng để soi trên kính hiển vi) thành một lớp mỏng. Người ta thường cho thêm một chất kết dính (như bột bó) và bột nhão để giữ các hạt dính với nhau và dính trên mặt kính.

? Tấm kính được để yên cho lớp mỏng định hình và dính vào mặt kính sau đó được đem sấy vài giờ trong tủ sấy.

93


? Một số hãng hóa chất chế tạo sẵn nhiều loại bản mỏng như bản silicagen chỉ thị huỳnh quang dưới tia tử ngoại bước sóng 254 nm.

Khai triển sắc kí ? Là quá trình cho pha động chạy xuyên qua pha tĩnh và kéo mẫu phân tích di chuyển trên

pha tĩnh. ? Thường người ta chấm một giọt mẫu phân tích gần một mép của bản mỏng. Dùng bút chì

đánh dấu nơi chấm mẫu. ? Sau khi giọt mẫu đã khô, đặt bản mỏng vào bình sắc kí đã bão hòa hơi dung môi của pha

động, mép phía chấm mẫu được nhúng vào dung môi pha động nhưng không được cho điểm chấm mẫu chạm trực tiếp vào dung môi động.

? Sau khi dung môi chạy được nửa hay hai phần ba bản mỏng thì lấy ra sấy khô.

? Có hai cách triển khai:

o Sắc kí lên o Sắc kí ngang

Trên hình là sắc đồ hai chiều một số axit amin. Mẫu thử được chấm ở một góc của lớp mỏng (nơi đánh dấu x) cho dung môi A chạy, bay hơi dung môi , quay 90o cho dung môi B chạy, bay hơi dung môi, phun nihidrin là thuốc thử hiện màu của các axit amin. Xác định các chất bằng cách so sánh vị trí vết của mẫu với các vết của chuẩn.

94


Hình 33: Khai triển sắc kí theo hai chiều Phát hiện các vết trên bản mỏng

? Có nhiều phương pháp để phát hiện các vết: ? Hai cách phổ biến có thể dùng để phát hiện hầu hết các chất hữu cơ là phun dung dịch iot

hay axit sunfuric: sẽ xuất hiện các vết màu tối. Có thể phun các thuốc thử đặc hiệu (như ninhydrin). Cũng có thể thêm chất huỳnh quang vào pha tĩnh: cả bản mỏng sẽ sáng (huỳnh quang) khi soi đèn tử ngoại (ví dụ đèn có bức xạ 254 nm) nơi có chất phân tích thì sẽ tối hoặc có màu huỳnh quang khác với màu nền sáng của bản mỏng.

? Có thể tóm tắt các phương pháp phát hiện như sau: Nếu hợp chất có màu thì chỉ cần ánh sáng ban ngày. Dùng tia tử ngoại UV cho những hợp chất phát được huỳnh quang (có các hệ nối đôi

liên hợp) Phun hơi iot cho những hợp chất chứa ít nhất một nối đôi. DDùùnngg tthhuuốốcc tthhửử DDrraaggeennddoorrffff đđểể ddòò ttììmm ccáácc aallkkaallooiidd.. DDùùnngg tthhuuốốcc tthhửử FFeeCCll33 cchhoo ccáácc hhợợpp cchhấấtt hhọọ pphheennooll.. DDùùnngg aanniilliinnee pphhttaallaatt đđểể pphháátt hhiiệệnn ccáácc llooạạii đđưườờnngg.. DDùùnngg NNiinnhhyyddrriinn đđểể pphháátt hhiiệệnn ccáácc hhợợpp cchhấấtt nniittrroo nnhhưư aammiinn,, aammiinnoo aaxxiitt..

Phân tích bán định lượng

? Có thể ước lượng (bán định lượng) lượng chất trên sắc đồ bằng cách so sánh diện tích vết của mẫu thử với diện tích của vết chuẩn.

? Có thể thu được kết quả tốt hơn nếu cạo lấy bột chứa vết, chiết lấy chất phân tích và đem định lượng bằng một phương pháp lí hóa thích hợp.

95


Bài tập

Câu 3.1: Trình bày sự khác nhau cơ bản giữa sắc kí hấp phụ, sắc kí phân bố, sắc kí trao đổi ion và sắc kí rây phân tử.

Câu 3.2: Giải thích tại sao lực rửa giải tăng lên khi dung môi pha động trở nên ít phân cực hơn trong sắc kí pha đảo, trong khi đó lực rửa gải tăng lên khi dung môi pha động trở nên phân cực hơn trong sắc kí pha thuận.

Câu 3.3: Tại sao áp suất cao cần thiết trong sắc kí lỏng hiệu năng cao?

Pha liên kết trong sắc kí lỏng là gí? Cho biết một số pha lỏng liên kết không phân cực , phân cực trung bình và phân cực mạnh.

Câu 3.4: Trình bày nguyên tắc hoạt động của các loại detector được sử dụng trong HPLC:

a) Detector UV-VIS b) Detector Photo diodArray c) Detector đo chỉ số khúc xạ d) Detector phát huỳnh quang

Câu 3.5: Cho biết các loại cấu tử nào có thể tách được bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao nhưng không thể tách được bằng sắc kí khí.

Câu 3.6: Cho biết các bước cơ bản trong phát triển phép tách isocratic trong sắc kí pha đảo sử dụng một dung môi hữu cơ và hai dung môi hữu cơ

Câu 3.7: Dự đoán trật tự rửa giải của các chất sau:

a) n-hexan, n-hexanol, benzene b) ethyl axetate, diethyl ether, nitrobutane

Khi thực hiện phép tách là sắc kí pha thường và sắc kí pha đảo.

Câu 3.8: Các chất phân cực được tách ra bằng HPLC có cột tách chứa pha tĩnh phân cực polyetylenglycol. Hỏi thời gian lưu của chúng thay đổi như thế nào nếu pha động gồm CH3CN/H2O có nồng độ acetonitril thay đổi từ 40 lên 60%.

Câu 3.9: Khi bạn cố gắng tách một hỗn hợp các chất chưa biết bằng sắc kí pha đảo với pha động là 50% acetonil/50% nước thì thu được sắc kí đồ có các pic nằm quá gần nhau và đước rửa giải trong khoảng k’=2-6. Vậy trong lần chạy tiếp theo bạn nên tăng hay giảm thành phần acetonitril trong pha động để cải thiện độ phân giải. Giải thích ?

96


Câu 3.10: Một hỗn hợp n-heptane, tetrahydrofuran, 2-butanone, và n-propanol rửa giải theo thứ tự này ra khỏi cột pha tĩnh phân cực như Carbowax. Trật tự rủa giải sẽ đảo ngược theo đúng thứ tự trên nàu sử dụng cột pha đảo không phân cực như C18. Hãy giải thích trật tự rửa gải trong mỗi trường hợp. Câu 3.11: Haddad và cộng sự đã báo cáo các hệ số dung lượng sau của một phép tách pha đảo của salicylamide (k ?sal) và caffeine (k ?caff). %v/v methanol 30% 35% 40% 45% 50% 55% k’sal 2.4 1.6 1.6 1.0 0.7 0.7 k’caff 4.3 2.8 2.3 1.4 1.1 0.9 Giải thích sự thay đổi sự thay đổi các giá trị k’ khi tăng nồng độ methanol trong pha động. Explain the changes in capacity factor. Có thuận lợi gì khi sử dụng pha động có % methanol thấp ? có bất lợi gì không? Câu 3.12: Giả sử bạn cần tách một hỗn hợp benzoic acid, aspartame, và caffeine trong một nước giải khát soda. Các thông tin thu được như sau:

tr khi pha động được đệm ở pH bằng Hợp chất 3.0 3.5 4.0 4.5 benzoic acid 7.4 7.0 6.9 4.4 aspartame 5.9 6.0 7.1 8.1 caffeine 3.6 3.7 4.1 4.4 (a) Giải thích sự thay đổi giá trị thời gian lưu cho mỗi hợp chất khi thay đổi pH pha động. (b) Giải thích thời gian lưu của 3 hợp chất khi pha đọng có cùng pH. Câu 3.13: 2) Nồng độ của PAHs trong đất có thể được xác định bằng cách chiết PAHs bằng methylene chloride. Dịch chiết sau đó được pha loãng, nếu cần thiết, và các PAHs được tách bằng HPLC sử dụng detector UV/Vis hoặc detector phát huỳnh quang. Trong một phép phân tích tiêu biểu, cân 2.013-g mẫu đất khô rồi chiết bằng 20.00 mL methylene chloride. Sau khi lọc đất, lấy 1-mL của phần dịch chiết pha loãng đến 10 mL bằng acetonitrile. Tiêm 5 µL của dịch chiết pha loãng này vào máy HPLC cho tín hiệu 0.217 (thứ nguyên tùy chọn) cho trường hợp fluoranthene. Khi tiêm 5 µL dung dịch chuẩn 20.0-ppm fluoranthene vào máy HPLC trong cùng điều kiện thì tín hiệu thu được là 0.258. Tinhd nồng độ ppm của fluoranthene trong mẫu đất trên. Câu 3.14: Thành phần của một viên thuốc multivitamin được xác định bằng HPLC với diode array UV/Vis detector. Tiêm 5-?L mẫu chuẩn có chứa 170 ppm vitamin C, 130 ppm niacin, 120 ppm niacinamide, 150 ppm pyridoxine, 60 ppm thiamine, 15 ppm folic acid, and 10 ppm riboflavin vào máy HPLC, cho các tín hiệu lần lượt thoe thứ tự các chất trên (thứ nguyên tùy chọn), 0.22, 1.35, 0.90, 1.37, 0.82, 0.36, và 0.29. Viên thuốc được chuẩn bị cho phân tích bằng cách ngiền mịn thành bột rồi chuyển vào bình tam giác cở 125-mL chứa 10 mL of 1% v/v NH3 trong dimethyl sulfoxide. Sau khi siêu âm trong 2 min, thêm vào 90 mL of 2% acetic acid, và hỗn hợ dung dịch được khuấy trong and 1 min và siêu âm ở 40 °C trong 5 min. Sau đó dịch được đem lọc với giấy lọc cỡ 0.45-?m. Tiêm 5-?L

97


mẫu vừa chuẩn bị trong máy HPLC trong cùng điều kiện cho các tín hiệu lần lượt là 0.87 cho vitamin C, 0.00 cho niacin, 1.40 cho niacinamide, 0.22 cho pyridoxine, 0.19 cho thiamine, 0.11 cho folic acid, và 0.44 cho riboflavin. Tính số milligrams của mỗi chất có trong viên vitamin. Câu 3.15: . Lượng caffeine trong một viên thuốc giamr đau được xác định bằng HPLC sử dụng phương pháp lập đường chuẩn. Các dung dịch chuẩn caffeine được chuẩn bị và phân tích sử dụng vồng tiêm mẫu có thể tích 10-?L. Kết quả đo các chuẩn như sau Nồng độ các chuẩn Tín hiệu

(ppm) (thứ nguyên tùy chọn) 50.0 8354 100.0 16925 150.0 25218 200.0 33584 250.0 42002

Mẫu được chuẩn bị bằng cách cho một viên thuốc trong một cốc nhỏ và thêm vào 10 mL methanol. Sau khi mẫu hòa tan chuyển toàn bộ phần dịch cả phần không tan trong cốc vào bình định mức 25-mL và thêm methanol đến vạch. Mẫu sau đó được đem lọc, lấy 1.00-mL phần lọc cho vào bình định mức 10-mL rồi thêm methanol đến vạch. Khi phân tích bằng HPLC, tín hiệu thu được là 21469. Tính số milligrams caffeine trong viên thuốc giảm đau.

Phan tich sac ki khi Th Vung

Documents

Transcript of Phan tich sac ki khi Th Vung