Нанотехнологии в биологии и медицине

А.А. Евстрапов, А.Л. Буляница НАНОТЕХНОЛОГИИ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ. МИКРОФЛЮИДИКА

Красноярск СФУ 2015

Министерство образования и науки Российской Федерации

Сибирский федеральный университет

НАНОТЕХНОЛОГИИ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ

МИКРОФЛЮИДИКА

Курс лекций

Электронное издание

Красноярск

СФУ

2015

2

УДК 577:620.3(07)

ББК 28.071я73Н254

Составители: Евстрапов Анатолий АлександровичБуляница Антон Леонидович

Н254 Нанотехнологии в биологии и медицине. Микрофлюидика : курслекций [Электронный ресурс] / сост. : А. А. Евстрапов, А. Л. Буля-ница. – Электрон. дан. – Красноярск: Сиб. федер. ун-т, 2015. – Систем. требования: PC не ниже класса Pentium I; 128 Mb RAM; Windows-98/XP/7; Adobe Reader V8.0 и выше. – Загл. с экрана.

Цель данного курса лекций – формирование у студентов представлений о

микро- и нанотехнологиях, применяемых в биологических и медицинских

исследованиях. Представленные материалы помогут освоить и понять подходы,

используемые в современном приборостроении при создании систем для анализа

биологических проб, изучить принципы функционирования устройств, основан-ных на технологиях и принципах микрофлюидики (микрогидродинамики). Этот

курс лекций появился примерно в 2008 году, затем регулярно дополнялся и

изменялся, читался для студентов старших курсов и магистрантов в Университете

ИТМО и Академическом университете – НОЦ нанотехнологий РАН (Санкт-

Петербург).

Предназначен для студентов и магистрантов нескольких специализаций

Института фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ.

УДК 577:620.3(07)

ББК 28.071я73

© Сибирский федеральный

университет, 2015

Электронное учебное издание

Подготовлено к публикации СЭИ РИО БИК

Подписано в свет 27.05.2015. Заказ № 1337

Тиражируется на машиночитаемых носителях

Издательский центр Библиотечно-издательского комплекса

Сибирского федерального университета 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 79

Тел/факс (391)206-21-49, 206-26-59

E-mail [email protected], http://rio.sfu-kras.ru

Издание этого курса лекций поддержано грантом Российского научного фонда (проект № 15-19-10041).

mailto:[email protected]

http://rio.sfu-kras.ru/

3

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРЕДИСЛОВИЕ .......................................................................................................................................... 5

ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................................................. 6 Тенденции развития аналитических приборов

и систем для биологических и медицинских исследований ................................................................. 9 Биологические материалы и биологические пробы.

Особенности изучения биологических объектов ................................................................................. 11

1. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ АНАЛИЗА ......................................................................................................... 15

1.1. Классификация аналитических методов ..................................................................................... 15 1.2. Требования, предъявляемые к аналитическим методам ............................................................ 16 1.3. Основные стадии анализа ............................................................................................................. 17 1.4. Критерии отбора пробы ................................................................................................................ 17 1.5. Характеристики аналитических методов .................................................................................... 18

2. ОСНОВЫ МИКРО- И НАНОФЛЮИДИКИ...................................................................................... 20

2.1. Гидродинамические и реологические свойства жидкости. Ньютоновские

и неньютоновские жидкости .................................................................................................................. 20 2.1.1. Флюиды: жидкости и газы ........................................................................................................ 20 2.1.2. Факторы, определяющие процессы в микро- и нанофлюидике ............................................ 22 2.1.3. Реология жидких сред ............................................................................................................... 22 2.1.4. Модели жидкости ...................................................................................................................... 26 2.1.5. Межфазовые взаимодействия ................................................................................................... 26 2.1.6. Диффузия. Закон Фика .............................................................................................................. 27 2.1.7. Капиллярные эффекты и течение жидкостей ......................................................................... 28 2.1.8. Отношение площади поверхности к объему .......................................................................... 31

2.2. Моделирование в микро- и нанофлюидике ................................................................................ 31 2.2.1. Подобие гидродинамических явлений. Характеристические числа ..................................... 32 2.2.2. Гипотеза сплошной среды ........................................................................................................ 34 2.2.3. Базовые теоретические положения .......................................................................................... 35 2.2.4. Гидравлическое сопротивление в канале ................................................................................ 40

3. ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В МИКРО- И НАНОФЛЮИДИКЕ .......................... 42

3.1. Двойной электрический слой. Электроосмотический поток в микро- и наноканалах .......... 42 3.2. Электрофоретическое разделение проб. Электрофоретическая подвижность ....................... 47 3.3. Особенности вклада составляющих электрического поля ........................................................ 49

4. УПРАВЛЕНИЕ ДВИЖЕНИЕМ И РАЗДЕЛЕНИЕ ЧАСТИЦ В ЖИДКОСТИ. ОСОБЕННОСТИ

ВОЗДЕЙСТВИЯ ВНЕШНИХ ПОЛЕЙ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ МИКРООБЪЕКТЫ ...................... 50 4.1. Диэлектрофорез ............................................................................................................................. 51

4.1.1. Основные принципы диэлектрофореза ................................................................................... 51 4.1.2. Электроротация ......................................................................................................................... 56 4.1.3. Диэлектрофорез клеток ............................................................................................................. 57

4.2. Управление движением частиц с помощью световых полей .................................................... 58 4.2.1. Фотофорез .................................................................................................................................. 58 4.2.2. Принципы лазерного фотофореза ............................................................................................ 59 4.2.3. Оптофорез .................................................................................................................................. 60 4.2.4. Оптический пинцет ................................................................................................................... 61

4.3. Управление движением частиц с помощью магнитных полей. Магнитофорез ..................... 64 4.3.1. Основные принципы магнитофореза ....................................................................................... 67 4.3.2. Магнитные частицы .................................................................................................................. 67 4.3.3. Применения магнитофореза ..................................................................................................... 68

4.4. Электромагнитофорез (Electromagnetophoresis) ........................................................................ 71

4

5. АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБ .............................................................................................. 72

5.1. Сенсоры и биосенсоры .................................................................................................................. 72 5.1.1. Состав и принцип работы сенсора. Мультисенсорные системы .......................................... 72 5.1.2. Основные аналитические характеристики сенсоров. Иммобилизация биологического

материала .............................................................................................................................................. 74 5.2. «Микросистемы полного анализа» и «лаборатория на чипе» ................................................... 78

5.2.1. Биочипы (матричные чипы) ..................................................................................................... 79 5.2.2. Микро- и нанофлюидные чипы ................................................................................................ 81 5.2.3. Конструкции аналитических микрочипов и функциональные элементы ............................ 82 5.2.4. Методы детектирования в микрофлюидных чипах ............................................................... 89

5.3. Твердофазная, жидкостная и микрофлюидная экстракция.

Идеология Т-сенсора и Н-фильтра ........................................................................................................ 90 5.4. Седиментационный метод анализа. Разделение на CD-чипе .................................................... 93 5.5. Анализ нуклеиновых кислот ........................................................................................................ 95

5.5.1. Электрофоретическое разделение ДНК на микрофлюидном чипе ...................................... 95 5.5.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ...................................................................................... 97 5.5.2.1. ПЦР в реальном времени ...................................................................................................... 99 5.5.2.2. Аналитический сигнал ПЦР в реальном времени ............................................................. 101 5.5.2.3. ПЦР на микрочипе ............................................................................................................... 102 5.5.3. Секвенирование ДНК .............................................................................................................. 105 5.5.3.1. Метод Сэнгера .................................................................................................................... 105 5.5.3.2. Высокопроизводительное пиросеквенирование ДНК (по Маргулису–Эгхольму–

Ротбергу) ............................................................................................................................................ 106 5.5.3.3. Секвенаторы «нового» поколения ....................................................................................... 109

6. НАНОЧАСТИЦЫ И НАНОСТРУКТУРЫ В АНАЛИТИЧЕСКИХ МИКРОЧИПАХ ............. 112

6.1. Обнаружение отдельных молекул и частиц. Наночастицы – носители иммобилизованных

объектов ................................................................................................................................................. 114 6.2. Применение квантовых точек ...................................................................................................... 117 при обнаружении биологических объектов ....................................................................................... 117

7. Медицинские наномашины ............................................................................................................ 118

7.1. Нанороботы .................................................................................................................................. 118 7.2. Био- нанороботы .......................................................................................................................... 121 7.3. Молекулярные машины. Наноразмерные исполнительные механизмы ............................... 123

7.3.1. АТФ-синтаза ............................................................................................................................ 123 7.3.2. Кинезин, миозин, жгутиковый молекулярный двигатель ................................................... 125 7.3.3. Неорганические (химические) молекулярные двигатели .................................................... 126

7.4. Самосборка нанороботов ............................................................................................................ 127 7.5. «Дорожная карта» развития био- нанороботов ........................................................................ 127 7.6. Устройства адресной доставки лекарств ................................................................................... 129

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК .................................................................................................... 131

5

ПРЕДИСЛОВИЕ

Развитие микро- и нанотехнологий, методов аналитической химии и биологии,

микроэлектромеханических систем и целого ряда наукоемких технологий привели к воз-

можности создания принципиально новых устройств и систем, которые в настоящее время

востребованы при биологических и медицинских исследованиях, экологическом монито-

ринге окружающей среды и т.д. Создать универсальное пособие, охватывающее обширную

область применения микроаналитических систем, дающее представление о технологиях и

принципах создания таких систем, материалах, которые используются в современных при-

борах – задача трудная и, наверное, невыполнимая, так как технологии и методы непре-

станно развиваются и совершенствуются. Этот курс лекций появился примерно в 2008 го-

ду, затем регулярно дополнялся и изменялся, а потом трансформировался в два более об-

ширных и глубоких курса, которые читаются для магистров старших курсов в Универси-

тете ИТМО и Академическом университете – НОЦ нанотехнологий РАН (Санкт-

Петербург). Мой друг и коллега профессор Белобров П.И. отговорил меня от радикальной

переделки данного курса – и совершенно правильно, так как это бы затянулось на неопре-

деленное время, а данная версия все-таки дает начальное представления о чрезвычайно ин-

тересном, сложном и обширном пространстве использования микро- и нанотехнологий в

современных биологических и медицинских исследованиях.

Раздел 3.2 написан доктором физ-мат. наук, профессором Буляницей А.Л., которому

я хотел бы выразить огромную благодарность за конструктивную критику и дополнения.

6

ВВЕДЕНИЕ

Нанобиотехнология – (синоним бионанотехнология) – раздел в нанотехнологиях,

занимающийся изучением и воздействием объектов нанометровых размеров на биологиче-

ские объекты и их использованием для развития наномедицины, занимающаяся созданием

нанолекарств, диагностических систем на основе наночастиц, разработкой медицинских

нанороботов и созданием медицинских наноматериалов.

Наномедицина – слежение, исправление, конструирование и контроль над биологи-

ческими системами человека на молекулярном уровне, используя разработанные нано-

устройства и наноструктуры (определение предложено Робертом Фрейтасом).

Под нанобиотехнологиями следует понимать:

1. Прямое или опосредованное манипулирование, осуществляемое на атомно-

молекулярном уровне с целью изменения или управления свойствами биологических объ-

ектов вне зависимости от их размера и свойств;

2. Исследование или использование объектов, представляющих собой невалентно

связанные атомные, атомно-молекулярные или молекулярные кластеры, включающие ве-

щества биологической природы или воздействующие на биосистемы при условии способ-

ности резко изменять свои биологические, физические или химические свойства. Важным

является масштаб критического размера (~1-100 нм) или состоящие из счетного числа (от

десятков до тысяч) частиц.

Из существующих аналитических материалов, создаваемых различными группами

экспертов, особого внимания заслуживают Программа развития нанотехнологий, состав-

ленная корпорацией RAND (Research And Development, США) и Программа Европейской

комиссии (Nanoroadmap Medical and Health, 2006 г.), созданная в рамках подготовки и ре-

ализации Седьмой рамочной программы Европейского Союза по научно-

исследовательскому и технологическому развитию. Эти документы на основе анализа со-

стояние дел в сфере нанобиотехнологий на текущий момент предлагают прогноз развития

отдельных областей нанобиотехнологий на обозримую перспективу (2015-2020 г.). Амери-

канские эксперты выделяют следующий ряд приложений нанотехнологии в биомедицине:

инженерия живых тканей и регенеративная медицина;

биологические наноструктуры;

инкапсуляция лекарств и адресная доставка лекарств;

молекулярная визуализация;

биофотоника;

биосовместимые имплантанты;

биоаналитические мембраны;

молекулярные биосенсоры;

биочипы и лаборатории на чипе (lab-on-a-chip);

функциональные молекулы: переключатели, насосы, транспортные средства.

Эксперты Европейской комиссии составили аналогичный перечень важных, по их

мнению, разделов нанобиотехнологий:

доставка лекарств;

молекулярная визуализация;

косметика;

создание новых лекарственных средств;

методы диагностики;

хирургия, в т.ч. трансплантация тканей и органов;

7

тканевая инженерия;

пищевые технологии;

геномика и протеомика;

прочие технологии, в т.ч. молекулярные биосенсоры.

Эти списки достаточно близки и можно выделить несколько магистральных

направлений развития нанобиотехнологий: адресная доставка лекарственных соединений;

молекулярная визуализация; биочипы/лаборатории на чипе; молекулярные биосенсоры.

Адресная доставка лекарственных соединений. Для улучшения качества и эффек-

тивности лечения и диагностики заболеваний требуются избирательные и эффективные

лекарства и диагностические агенты. Наночастицы, применяемые в качестве лекарств или

их носителей, будут играть важную роль в лекарственной терапии благодаря своим уни-

кальным биологическим, химическим и физическим свойствам, обусловленным их разме-

рами. Сейчас для использования в медицине используются наночастицы из неорганиче-

ских (золото, силикаты и т.д) и полимерных (полисахариды, полилактиды, полиакрилаты)

материалов, полимерные терапевтические средства (полимерные мицеллы и т.д), липосо-

мы. По мнению экспертов, необходимо исследование новых классов наночастиц, так как

известные сейчас наночастицы не могут обеспечить весь спектр нужных терапевтических

функций. Наночастицы предполагается использовать при инкапсулировании в них ле-

карств и других частиц. Поверхность наночастиц может быть модицифицирована покры-

тиями и слоями для создания определенных характеристик (таких как, биосовместимость,

направляемость, способность распознавать формы и участвовать в биологических взаимо-

действиях). Преимуществами наночастиц являются: обеспечение лучшего взаимодействия

с биологическими объектами; защита лекарств от разрушения при транспортировке к ме-

сту назначения; возможность активного или пассивного накапливания в органе – мишени;

способность высвобождать переносимые лекарства контролируемо как по дозе, так и по

времени; возможность использования в качестве контрастных агентов при диагностике.

Молекулярной визуализацией называется неповреждающее визуальное представле-

ние, характеризация и количественный анализ биологических процессов в живых организ-

мах на клеточном и субклеточном уровнях. При молекулярной визуализации молекуляр-

ные зонды, имеющие нацеливаемый узел (специальные молекулы – рецепторы или лиган-

ды), используются в качестве источников контраста визуального образа. Если молекуляр-

ный маркер чувствителен к некоторому заболеванию, контрастирующая среда накаплива-

ется в пораженных тканях.

Биофотоника использует световые пучки и другие формы энергии и может быть

определена как наука о генерации и использовании света для визуализации, детектирова-

ния и манипулирования биологическими материалами. Примером является фотодинамиче-

ская терапия (Photo Dynamic Therapy, PDT), в которой специальные препараты (фотосен-

сибилизаторы) и оптическое излучение определенного спектра используются для удаления

патологически измененных клеток. Световое излучение, необходимое для активации

большинства современных фотосенсибилизаторов, не может проникнуть в ткани доста-

точно глубоко для того, чтобы реализовать весь потенциал этой технологии, поэтому ве-

дутся поиски сенсибилизаторов, которые активируются оптическим излучением в спек-

тральном диапазоне окна прозрачности тканей организма. Молекулярная визуализация и

биофотоника позволяют производить распределение и регистрацию молекулярных зондов

как во времени, так и в пространстве, и, соответственно, обеспечить более содержательное

неповреждающее исследование биологических процессов внутри живого организма.

Биочипы. Одно из направлений развития биочиповых технологий состоит в разра-

ботке процессов компактного воспроизводимого нанесения различных биологических ма-

териалов на участки инертной подложки для последующего автоматизированного и высо-

копроизводительного анализа. До настоящего времени эта технология была эффективной

8

для фундаментальных исследований биохимических процессов. Сейчас биочипы широко

применяются для скрининга лекарственных препаратов и для медицинской диагностики. К

другому направлению биочиповых технологий можно отнести устройства «лаборатории на

чипе» (lab-on-a-chip), обладающие функциональными микро- и наноэлементами, встроен-

ными процессорами и исполнительными механизмами, способными проводить различные

манипуляции, реакции с исследуемой пробой, разделение и детектирование объектов на

единой компактной платформе. По мнению экспертов в ближайшее десятилетие станут

широко распространенными три основных приложения: автоматизированные портативные

приборы «лаборатория на чипе», имплантируемые биосенсоры и недорогие полногеном-

ные аналитические матрицы.

Молекулярные биосенсоры. Биосенсоры – высокоинтегрированные устройства, содер-

жащие биологический чувствительный элемент (рецептор или систему распознавания), пер-

вичный преобразователь сигнала и его усилитель. Главная особенность биосенсора, отлича-

ющая его от других биоаналитических систем – интеграция биохимического распознающего

элемента и преобразователя. Различают два основных типа сенсоров: аффинные и каталитиче-

ские. Аффинные сенсоры основаны на явлении высокоизбирательного связывания биологиче-

ских молекул, которое приводит к изменению физических свойств (коэффициента экстинк-

ции, толщины слоя, поверхностного натяжения, показателя преломления) и может регистри-

роваться соответствующими методами. Каталитические биосенсоры основаны на молеку-

лярном распознавании молекул биокатализаторами и их последующем преобразовании в про-

дукты биохимической реакции, которые регистрируются ферментативным электродом. Био-

сенсоры имеют ряд особенностей, таких как высокая селективность, устойчивость к различно-

го рода внешним воздействиям, минимальная предварительная обработка пробы. При инва-

зивном использовании чувствительный элемент биосенсора должен иметь малые размеры,

быть биосовместимым, стерилизуемым и не обладать токсичными или антигенными свой-

ствами. Биосенсоры рассматриваются и как метод контроля и оценки лечения ряда хрониче-

ских заболеваний. Облегчение ощущений пациента, улучшение функциональности и умень-

шение стоимости приборов – это критические требования к таким биосенсорам.

Фундаментальные исследования, которые ведут академические институты, позво-

лили Комиссии РАН по нанотехнологиям сформировать следующие пять основных стра-

тегических направлений развития нанобиотехнологии.

1. Нанодиагностика и нанодетекция. В рамках этого направления разрабатываются

наноструктурные системы детекции биоорганических субстанций, бактерий, вирусов для

использования в молекулярной биологии, медицине, экологии, криминалистике. Создают-

ся нанобиосенсоры для генодиагностики, наркодиагностики, мониторинга лекарств, нано-

комплексы, пригодные для внутривенного введения, состоящие из биосенсоров с наноча-

стицами, которые регистрируются физическими приборами, расположенными вне тела

(ядерно-магнитный резонанс, ультразвуковые и др.).

2. Нанолекарства. Создание лекарств для клеток-мишеней и клеточных нанострук-

тур, включая генотерапию, новые противоопухолевые, кардиотропные и психотропные

средства, новые антибиотики, иммуномодуляторы, аллерготропины и наноантитела для

лечения иммунодефицитов, аллергии, опухолей и аутоиммунных заболеваний.

3. Нановакцины. Создание иммуногенов, мини-антител, наноантител.

4. Нанотрансгенез, или трансгенное наноконструирование. Трансгенез растений

позволяет создавать новые эффективные гормоны и вакцины, трансгенез животных – но-

вые породы, новые биологические материалы.

5. Нанобионика. Создание нанокомпонентов для новых кровезаменителей, наногу-

бок и нанотрубок для депонирования в тканях биоактивных субстанций, безаллергенных

биоматериалов, энерготрасформирующих наносистем и нанороботов, создание модельных

живых клеток и искусственных вирусов.

9

Тенденции развития аналитических приборов и систем для биологических и медицинских исследований

Аналитическое приборостроение является одной из динамично развивающихся в мире

отраслей. В значительной степени этот факт обусловлен тем, что множество аналитиче-

ских приборов используется в химических, биологических и медицинских исследованиях.

Постоянной тенденцией совершенствования аналитических приборов является авто-

матизация. Анализ состоит из ряда стадий, включающих отбор и подготовку пробы; отде-

ление определяемого компонента или маскирование веществ мешающих определению;

транспортировку пробы; специфическое взаимодействие с аналитом или физическое воз-

действие на анализируемый компонент; детектирование и измерение аналитического сиг-

нала и обработку полученных результатов. Выполнение этих стадий сопряжено с затрата-

ми людских ресурсов и времени, требует организации и взаимной увязки всех стадий ана-

лиза. Автоматизация позволяет уменьшить время анализа, улучшить его правильность и

воспроизводимость за счет исключения из аналитического цикла операций, выполняемых

человеком. Разработчики аппаратуры стремятся интегрировать все стадии в единую авто-

матизированную и компактную систему, которая может состоять из нескольких модулей.

Эти системы получили название системы полного анализа (СПА, англоязычная аббревиа-

тура TAS – Total Analysis System).

Появление СПА во многом связано с развитием гибридных методов анализа и соот-

ветствующих приборов. Гибридные методы сочетают в себе методы разделения и опреде-

ления. Под термином "гибридные методы" понимают сочетание двух (и более) аналитиче-

ских методов для получения нового средства анализа, более эффективного, точного и

быстродействующего. Такое сочетание также позволяет осуществлять анализ компонентов

пробы в режиме реального времени (on-line). Примерами гибридных методов являются:

методы хроматографии и капиллярного электрофореза; проточно-инжекционный анализ и

близкие к нему методы и т.д..

Наиболее сложным при создании СПА является интегрирование в систему устройств

для отбора и подготовки пробы. На текущий момент времени существуют два подхода к

решению этой проблемы. Один из них базируется на использовании роботизированных

систем, механически копирующих действия оператора (лаборанта). Основным недостат-

ком таких систем пробоподготовки является сложность конструкции приборов, что влияет

на стоимость аппаратуры. Другой подход основан на методах с использованием проточ-

ных систем, в частности: проточно-инжекционного анализа и его аналогах, хроматографии

и электрокинетических методах. Следует выделить направление, сочетающее проточные

системы с времяпролетной масс-спектрометрией и спектрометрией ионной подвижности.

В 1989 г Андреасом Манцем и сотр. была предложена концепция создания новых миниа-

тюрных приборов – "микроаналитических систем" (МАС, англоязычная аббревиатура -TAS

– micro-Total Analysis System). Суть концепции сводилась к интеграции всех стадий анали-

тического цикла на микрочипе с разветвленной системой каналов, в которых должна осу-

ществляться предварительная подготовка пробы, разделение и последующее детектирова-

ние. Первые разработки таких приборов с применением микротехнологий появились уже в

1990-х годах. Гораздо раньше, в семидесятые годы, были предприняты первые попытки со-

единить планарные технологии микроэлектроники с методами аналитической химии (миниа-

тюрный газовый хроматограф Стефана Терри представлял собой устройство, сформированное

на поверхности кремниевой пластины диаметром 5 см и состоящее из инжекционного клапа-

на, капиллярной колонки длиной 1.5 м и сечением (200х30) мкм2). Создание аналитических

микросистем во многом обусловлено и необходимостью получения результатов анализа на

10

месте отбора проб в реальном масштабе времени для последующего их использования при

принятии оперативных решений. Кроме того, такие приборы имеют преимущества в обычных

лабораториях за счет меньшего веса, габаритов, расхода электроэнергии и реактивов по

сравнению с их традиционными аналогами.

Внедрение микро- и нанотехнологий в аналитическое приборостроение осуществляет-

ся благодаря масштабным государственным и частным капиталовложениям (в основном

фармакологических и медицинских концернов, военных ведомств и т.д.). Поскольку со-

ставляющей частью аналитических приборов являются электронные компоненты, элемен-

ты механики, оптики, микро-электромеханические системы, программно-математическое

обеспечение и т.п., то миниатюризация аналитических приборов является отражением об-

щей тенденции развития электронных и информационных технологий.

Наряду с уменьшением размеров аналитических приборов и устройств, следует отме-

тить появление новых методов, работающих в масштабе малой размерности. К ним отно-

сятся: микрожидкостная экстракция (МЖЭ), твердофазная микроэкстракция (ТФМЭ),

варианты высокоэффективной жидкостной хроматографии в микромасштабе (микро-

ВЭЖХ), мембранные методы и некоторые другие.

Развитие аналитических приборов приводи к усложнению алгоритмов и правил обра-

ботки результатов измерений, предъявляются повышенные требования к программно-

математическому обеспечению, возникает необходимость реализации оперативных мето-

дов принятия решений. В некоторых приборах оценка результатов анализа осуществляется

на основании экспертных оценок, производится классификация результатов, применяются

методы «обучения» систем и т.д. Все это определяет новую тенденцию развития приборо-

строения – интеллектуализацию.

До появления концепций СПА и МАС миниатюризация ряда аналитических приборов

развивалась по пути создания сенсорных систем. Широкое распространение такой подход

получил в области электрохимических методов анализа, где были созданы первые химиче-

ские сенсоры. Химический сенсор – портативное устройство, позволяющее с высокой се-

лективностью определять один из компонентов сложной смеси. В идеале, сенсор не требу-

ет предварительной подготовки пробы, а его отклик на концентрацию аналита не зависит

от остальных макро- и микрокомпонентов. Химический сенсор состоит из чувствительного

элемента – рецептора и преобразователя отклика рецептора в электрический сигнал (тран-

сдьюсера). Принцип работы устройства предполагает его размещение непосредственно в

анализируемой пробе. Поскольку концепция применения сенсорных систем не предусмат-

ривает стадию пробоподготовки в ходе проведения анализа, создание высокоселективного

чувствительного элемента сенсора применительно к широкому кругу анализируемых объ-

ектов представляет собой сложную и не всегда решаемую задачу.

В настоящее время появились англоязычные термины, отражающие процесс распро-

странения миниатюризации оборудования и приборов в другие области науки. Ранее уже

упоминалась концепция осуществления на подложке площадью в несколько квадратных

сантиметров полного цикла операций, связанных с реализацией, например, многостадий-

ного химического и биологического анализов или органического/неорганического синтеза.

Устройства, позволяющие осуществить подобные операции, получили названия микро-

флюидные системы (МФС, англоязычная аббревиатура MFS – Micro Fluidic Systems) и ла-

боратория на чипе (LOC – Lab-on-a-Chip). Разработка интегрированных микрофлюидных

систем с микроэкстракторами, микрореакторами, микронасосами, микросмесителями,

микроклапанами, микротеплообменниками, микродатчиками, а в настоящее время и с

наноразмерными функциональными элементами, открывает перспективы для таких обла-

стей как комбинаторная и синтетическая химия, геномика и протеомика, высокопроизво-

дительный скрининг (High Throughput Screening Systems), используемый при создании но-

вых лекарственных препаратов и многих других.

11

Биологические материалы и биологические пробы. Особенности изучения биологических объектов

Многие биологические материалы классифицируются как микро- и наночастицы.

Бактерии, интервал размеров которых находится между 1 и 10 мкм, эритроциты человека

(~8 мкм) – принадлежат миру мезоскопических масштабов, в то время как вирусы с

размерами от 10 до 200 нм, белки с размерами 4–50 нм – находятся в диапазоне наночастиц

(рис. 1). Строительные блоки белков – 20 аминокислот, имеют размеры около нанометра

каждая, что находится вблизи нижней границы наноструктур. В природе встречается более

100 аминокислот, только 20 из них используются организмами при синтезе белков. При

формировании молекулы белка эти аминокислоты последовательно соединяются друг с

другом прочными пептидными химическими связями и образуют длинные полипептидные

цепи, содержащие сотни, а в некоторых случаях – тысячи аминокислот. В результате

изгибов и сворачивания полипептидные наноцепи упаковываются в сравнительно

небольшой объем, соответствующий полипептидной наночастице с типичным диаметром в

диапазоне 4–50 нм. Таким образом, белок – это наночастица, представляющая собой

упакованную определенным образом полипептидную наноцепь. Генетический материал –

дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) имеет структуру упакованной наноцепи. Ее

строительные блоки – 4 нуклеотида, которые связываются в длинные двойные спиральные

наноцепи. В случае ДНК человека последовательность содержит около 2,9·109 пар

нуклеотидов. Молекула ДНК – двойная наноцепь, где две нуклеотидные наноцепи

закручены друг вокруг друга с периодом 3,4 нм и диаметром ~2 нм. Упаковываясь в

хромосому около 6 мкм длиной и 1,4 мкм шириной ДНК многокатно скручивается и

складывается. Сама по себе хромосома не настолько мала, чтобы считаться наночастицей,

поскольку ее размеры лежат в мезоскопическом диапазоне.

Такой биологический объект как человеческое сухожилие, имеет достаточно слож-

ное строение. Назначение сухожилия – прикрепление мускула к кости. С точки зрения

биологии основная строительная единица сухожилия – совокупность аминокислот

(0,6 нм), образующих желатиноподобный белок, называемый коллагеном (1 нм), который

свивается в тройную спираль (2 нм). Затем следует тройная последовательность волокни-

стых или фибриллярных наноструктур: микрофибриллы (3,5 нм), субфибриллы (10–20 нм)

и собственно фибриллы (50–500 нм). Следующими структурными уровнями являются

группа волокон, называемых связкой (50–300 мкм), и сантиметровые сухожилия. Размер

связки считается мезоскопическим, а сухожилия – макроскопическим.

Молекулярно-биологические объекты могут избирательно взаимодействовать друг

с другом: например, белки обладают способностью связываться с другими определенными

белками и органическими молекулами. В основном механизм избирательного взаимодей-

ствия биомолекул расшифрован, что позволяет создавать новые материалы, вводя в струк-

туру материалов вещества и нанообъекты, например, металлические наночастицы. К настоящему времени ученым удалось понять строение ряда молекулярных машин,

среди которых рибосома – трехмерное образование, включающее комплекс белков и рибо-

нуклеиновых кислот, производящая белковые «изделия» по программам, записанным в

генах человека. Бионанотехнологии применяются для создания подобных молекулярных

машин, различных устройств и сенсоров.

Одной из важнейших задач бионанотехнологии, имеющей огромное прикладное

значении, является создание средств доставки терапевтических препаратов в определен-

ные виды клеток. Особое внимание уделяется развитию средств диагностики – здесь, без-

условно, следует отметить современные биочиповые технологии, без которых уже немыс-

лимы генетические исследования.

12

Рис. 1. Сравнительная шкала размеров некоторых биологических объектов

и искусственных наноструктур

Современное развитие нанотехнологий позволяет получать функциональные эле-

менты и системы, размеры которых лежат в нанометровой области длин. Это дает

принципиальную возможность осуществлять воздействие на отдельные молекулы и ча-

стицы и позволяет определять характеристики индивидуальных молекул. Так создание

устройств на основе нанопористых структур и полупроводниковых материалов, спо-

собных контролировать положение молекулы ДНК в нанопоре с точностью до одного

нуклеотида, является революционным событием в современной технологии секвениро-

вания, приводящим к значительному сокращению объема исходного вещества – ДНК,

времени и стоимости каждого анализа. Другим ярким примером является применение

бионаносенсоров на основе нанотранзисторов с нанотрубками, реагирующих на при-

сутствие отдельных молекул в исследуемой среде, что может быть успешно использо-

вано для изучения различных биологических процессов, протекающих в живой клетке,

взаимодействий антитело-антиген и т.д. Технологии получения нанонитей из проводя-

щих материалов и их использование для конструирования сенсорных элементов позво-

ляют создавать устройства, регистрирующие не только электрические характеристики

молекулы, но и ее оптические свойства. Подобные примеры иллюстрируют новые воз-

можности микро- и нанотехнологий, а именно – возможность изучения отдельных мо-

лекул вместо ансамблей частиц.

Изучению веществ, вовлеченных в биологические процессы, – биологических мате-

риалов уделяется особое внимание. Вещества, содержащиеся в них, либо непосредственно

связаны с функционированием организмов (являются продуктами их жизнедеятельности),

либо являются внешними по отношению к организму, но способствующими поддержанию

в нем физиологических процессов. Таковыми могут быть:

часть исследуемого объекта, например организма, при изучении свойств ве-

ществ из его внутренней среды (ВС);

13

часть среды обитания организма, например пробы воздуха или воды из окру-

жающей среды (ОС), в которой находится организм в процессе жизнедеятельности;

продукты питания, потребляемые организмом с целью пополнения запасов

энергии и веществ, необходимых для осуществления его жизненно важных функций;

активные минеральные и растительные вещества, например лекарства и пище-

вые добавки, оказывающие значимое влияние на процессы жизнедеятельности в организ-

ме, усиливая или угнетая последние.

Также в качестве объектов лабораторного исследования могут быть выбраны мате-

риалы биотехнологических производств (искусственный белок, дрожжевая масса и т. п.),

фармацевтических производств (лекарственные препараты, пищевые добавки) и т.д.

Вследствие огромного разнообразия конкретных задач лабораторного анализа аналитиче-

ские лаборатории медико-биологического направления различаются по характеру исследу-

емых объектов, видам проводимых исследований, реализуемым методикам, показателям

выполнения анализов, техническим приемам и средствам, производительности работ, по

организационной структуре и внешним связям.

Понятие биологической пробы для микробиологов и аналитиков имеет разное зна-

чение. Если для микробиологов биологическая проба (синоним – биопроба) это метод диа-

гностики инфекционных болезней, основанный на заражении лабораторных животных ис-

следуемым материалом с целью обнаружения и идентификации возбудителей или их ток-

синов или метод контроля биологических препаратов (вакцин, сывороток), основанный на

их введении лабораторным животным с целью оценки токсичности, пирогенности и имму-

нологической активности, то для аналитиков биологическая проба (БП) исследуемой сре-

ды – это некоторое количество биологического материала, взятого из любой исследуемой

среды (ИС), будь то внутренняя среда организма человека или некий внешний источник

вещества из окружающей среды. В общем случае этот биологический материал можно

определить как биосубстрат, понимая, что ИС может содержать биосубстраты разного

вида.

Несмотря на исключительное разнообразие физических и химических свойств жид-

ких сред, а соответственно, и требований, предъявляемых к аналитической аппаратуре,

жидкостный объект наиболее удобен при лабораторных исследованиях, хотя иногда жид-

кофазная биопроба преобразуется в твердую или газообразную форму (например, газовая

хроматография, спектральный анализ, некоторые варианты микроскопии и т. п.). Чрезвы-

чайно важным при аналитическом исследовании является представительность пробы – т.е.

она должна достаточно точно и полно отражать физико-химический состав исследуемого

объекта.

Требования, которые предъявляются к методам аналитических исследований био-

логических проб, главным образом определяются биологической природой и свойствами

объекта исследования. Основными особенностями биологических проб являются:

низкий энергетический уровень внутренних взаимодействий, определяющих

устойчивость структурных комплексов на субклеточном, молекулярном и субмолекуляр-

ном уровнях, нестабильность и травмируемость биологических материалов при внешних

воздействиях;

гетерогенность и многокомпонентность биологических проб;

сохранение биологической специфичности в узком диапазоне значений темпера-

тур, рН, ионной силы и других показателей;

низкие концентрации активных компонентов при больших количествах примесей;

минимальные изменения физико-химических свойств биопробы, приводящие к

существенному влиянию на процессы жизнедеятельности организма;

ограниченный исходный объем проб.

14

Эти особенности определяют основные требования при проведении исследований

биоматериалов, а именно: применение неразрушающих методов обработки БП; поиск и

выбор параметров, наиболее адекватно и полно характеризующих БП; учет факторов ис-

кажающих результаты анализа.

Общими требованиями при проведении аналитических исследований биологиче-

ского материала являются:

соблюдение оптимальных сроков для взятия биологического материала на иссле-

дование: материал должен быть взят в нужном месте и в нужное время;

биологический материал для исследования должен быть взят в необходимом и

достаточном объеме с обеспечением условий, исключающих его контаминацию;

отобранный биологический материал должен быть промаркирован и сопровож-

ден детальным описанием;

контейнеры для транспортировки и хранения материала должны обеспечивать

герметичность, стерильность, целостность, сохранность образцов;

материал контейнеров не должен вступать в реакции с компонентами пробы, об-

ладать низкой адсорбционной способностью и т.д.

Допустимый промежуток времени между отбором биопробы и ее анализом зависит

от состава биосубстрата, природы определяемых компонентов и условий хранения. Если

невозможно сразу после отбора провести анализ, то биопробу консервируют и помещают

на хранение. В процессе отбора и хранения биопроб возможно изменение их состава из-за

загрязнения компонентами, поступающими из материала пробоотборников, различных

приспособлений, емкостей для хранения, воздуха лабораторных помещений и т. д. Ввиду

этого биопробы хранят в посуде из особых сортов стекла или полиэтилена, а материал по-

суды определяется типом анализируемого компонента. Некоторые компоненты биологи-

ческих материалов устойчивы в течение длительного времени и не требуют особых усло-

вий консервации: в этом случае используются быстрое охлаждение, изменение рН среды, в

которой будет находиться биопроба, добавление стабилизирующих веществ. Иногда для

сохранения определяемого компонента его экстрагируют органическими растворителями

или сорбируют на различных твердых веществах. Для иных компонентов в биопробу до-

бавляют различные консерванты (чаще всего, кислоты и вещества, образующие комплекс-

ные соединения).

15

1. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ АНАЛИЗА

1.1. Классификация аналитических методов

Все аналитические методы основаны на получении и измерении аналитического

сигнала – проявления химических или физических свойств вещества, которые можно ис-

пользовать для установления качественного состава измеряемых объектов (качественный

анализ) или для количественной оценки содержащихся в нем компонентов (количествен-

ный анализ).

Подготовленный для анализа объект называют образцом или пробой. Образцы мо-

гут быть однородными или неоднородными. К однородным относят такие гомогенные си-

стемы, как воды, почвенные растворы, воздух. Неоднородные – гетерогенные системы,

состоящие из нескольких частей в разном агрегатном состоянии. Каждая часть может

включать до нескольких гомогенных систем (фаз), отделенных друг от друга поверхно-

стью раздела. Один и тот же элемент может находится в образце в разных формах (напри-

мер, углерод). В зависимости от поставленной задачи проводят элементный анализ образца

или его отдельных фаз. При элементном анализе определяют общее содержание элемента

независимо от формы, в которой он присутствует, при анализе фаз – содержание элемента

в каждой фазе или в его отдельных химических формах.

Цель качественного анализа – обнаружение элементов анализируемого объекта в

виде атомов, молекул, ионов или идентификация индивидуального соединения. Для обна-

ружения и идентификации используют химические реакции с характерным внешним эф-

фектом – выделение газа, появление осадка или окраска, а также физические свойства ве-

щества – температура плавления или кипения, коэффициент преломления, характерный

спектр. Свойства, используемые для обнаружения и идентификации, не зависят от количе-

ства вещества. Каждый метод характеризуется пределом обнаружения – минимальным ко-

личеством вещества, которое можно обнаружить или идентифицировать с допустимой по-

грешностью.

Цель количественного анализа – определение содержания компонентов в пробе по

величине аналитического сигнала, зависящего от концентрации (интенсивность линии в

спектре, количество осадка продукта реакции). Следует различать методы, основанные на

измерении интенсивности сигнала в единственной измерительной позиции (например, при

одной длине волны) и методы, в которых используется несколько позиций (спектр измере-

ний). Методы первой группы – одномерные, методы второй группы – двумерные. Класси-

ческие методы (гравиметрия и титрометрия) относятся к одномерным, а спектроскопиче-

ские, хроматографические и электрохимические – к двумерным.

Свойства веществ, не зависящие от их количества, называют интенсивными, зави-

сящие – экстенсивными. Особенностью экстенсивных свойств является аддитивность –

способность суммироваться; интенсивные свойства не складываются, а выравниваются

или усредняются. Интенсивными свойствами является температура, давление, потенциал,

частота линии в спектре, экстенсивными – масса, объем, энтропия, сила тока, интенсив-

ность спектральной линии.

Обычно качественный анализ основан на интенсивных свойствах, количественный

– на экстенсивных свойствах веществ.

Классификация анализов также может базироваться на масштабе работы, объеме

или массе пробы: макро-, полумикро-, микро-, ультрамикро- и субмикроанализы.

16

Аналитический сигнал по своей природе специфичен, присущ только данным,

вполне определенным атомам, молекулам, частицам. На практике аналитические сигналы

разных веществ часто бывают настолько близки, что даже с помощью приборов их сложно

различить. На аналитический сигнал могут накладываться сигналы от растворителя, реа-

гентов, других компонентов, присутствующих в анализируемом объеме. Для получения

сигнала, наиболее близкого к истинному, используют разные приемы, например, предва-

рительное разделение (определяемый компонент выделяют в чистом виде). Для учета по-

сторонних, мешающих сигналов, используют прием, называемой холостой пробой или хо-

лостым опытом. Холостая проба, содержащая все компоненты, кроме определяемого,

должна быть проведена через все стадии анализа, а сигнал, полученный от этой пробы,

вычитают из общего сигнала. Получение идеальной пробы на практике затруднено. Обыч-

но проводят холостую пробу на растворитель и реагенты, в растворитель вводят все реа-

генты в тех же количествах, что и в анализируемой пробе.

По происхождению аналитического сигнала все методы подразделяются на хими-

ческие, физико-химические и физические.

В химических методах используют донорно-акцепторные реакции с переносом про-

тона (кислотно-основные), электрона (окислительно-восстановительные), электронной па-

ры (комплексообразование), процессы осаждения – растворения и экстракции. Аналитиче-

ский сигнал (выделение газа, осадка, окраска) обычно фиксируют визуально.

Физико-химические методы включают электрохимические, спектроскопические

(оптические), люминесцентные, кинетические, термометрические методы. В этих методах

измеряют аналитический сигнал, возникающий с участием внешних (валентных) электро-

нов и функционально связанный с природой и концентрацией вещества. Сигнал возникает

при взаимодействии вещества с различными видами энергии (электрическая, тепловая,

электромагнитное излучение и др.). В физико-химических методах анализа как правило

используют растворы веществ.

Физические методы включают спектроскопические (не оптические), ядерно-

физические и радиохимические методы. В этих методах возникновение аналитического

сигнала связано с участием внутренних электронов или ядер атомов, агрегатное состояние

и химическая форма веществ в большинстве случаев не имеет значения.

Четких границ между химическими и физико-химическими, физическими и физи-

ко-химическими методами нет.

Физико-химические и физические методы иногда называют инструментальными.

К особым методам следует отнести гибридные методы, сочетающие два или более метода

анализа, например, хромато-масс-спектрометрия – сочетание хроматографии и масс-

спектрометрии.

Особенности инструментальных методов – необходимость калибровки (градуиров-

ки) шкалы приборов с помощью эталонов, обязательное проведение холостой пробы и т.д.

1.2. Требования, предъявляемые к аналитическим методам

Требования, предъявляемые к методам анализа биологических проб, в значительной

степени обусловлены особенностью самой пробы.

Низкий энергетический уровень внутренних взаимодействий, определяющих

устойчивость структурных комплексов на молекулярном и субмолекулярном уров-

нях (стабильность исследуемого материала),

Гетерогенность пробы, сохранение ее специфичности (особенно для биопроб),

17

Низкие концентрации активных компонентов при большом количестве примесей,

Минимальные изменения физико-химических свойств пробы,

Ограниченный объем пробы или измерения on-line,

Экспрессность определения (возможно разрушение пробы),

Возможность учета посторонних факторов, влияющих на результаты измерения,

Высокая чувствительность и селективность метода,

Простая пробоподготовка,

Возможность полной автоматизации (минимизация ошибок),

Безопасность,

Независимость от квалификации обслуживающего персонала,

Доступная стоимость,

Минимальные массо-габаритные характеристики,

Достаточная универсальность.

1.3. Основные стадии анализа

Процесс анализа включает: пробоотбор, пробоподготовку, транспортные операции

с пробой, измерение и обработку результатов (рис. 2).

Рис. 2. Основные стадии анализа жидкой пробы

Принцип анализа – явление природы, которое может предоставить аналитику инте-

ресующую его информацию (взаимодействие излучения с веществом, разделение в хрома-

тографии). Метод анализа – ход анализа с точки зрения его важнейших стадий. Методика

анализа – полное описание всего хода анализа с указанием всех деталей, включая отбор

пробы, измерение, обработку и представление результатов.

1.4. Критерии отбора пробы

В общем случае могут быть сформулированы следующие критерии отбора биоло-

гической пробы.

1. Проба должна быть представительной по отношению к объекту анализа (т.е. коли-

чество пробы должно обеспечивать возможность обнаружения аналита).

18

2. Отбор пробы должен быть сделан в нужном месте и в нужное время (биологические

пробы зависят от биоритмов пациента),

3. Проба не должна содержать загрязнений,

4. Проба должна быть устойчивой до выполнения анализа (иногда ее консервируют с

целью предотвращения протекания химических реакций – окисления, восстановле-

ния, с участием бактерий и т.п.).

В количественном анализе необходимое количество пробы зависит от диапазона

определяемых содержаний компонента. Диапазон от наименьшего до наибольшего содер-

жания, определяемого данным методом, называется рабочим диапазоном. Диапазон коли-

честв определяемого компонента mA, называемый абсолютным, и диапазон количества

матрицы mM, в сумме представляют диапазон количеств пробы P:

MA mmP .

Диапазон содержаний компонента представляет собой отношение количества компонента

к количеству пробы:

MA

A

mm

mG

Содержание макрокомпонентов в твердом образце выражают в виде соотношений

г/г (кг/кг) или массовых процентов. Диапазон их содержаний составляет от 0.01 до 1 г/г (1-

100%). Содержание сопутствующих компонентов составляет 0.0001-0.01 г/г (0.01-1%). Ес-

ли содержание компонента меньше 0.01%, то он называется следовым (это может быть

единичный атом). Содержание следовых количеств вещества выражают в следующих еди-

ницах:

1 part per million (ppm) =1/106 (10-4 %)

1 part per billion (ppb) =1/109 (10-7 %)

1 part per trillion (ppt) =1/1012 (10-10 %)

1.5. Характеристики аналитических методов

Основная задача аналитических исследований – получение точной и адекватной

информации о количественном, качественном и структурном составе пробы. Поэтому ос-

новными характеристиками аналитического метода являются: точность определения,

разрешающая способность, чувствительность, помехоустойчивость, воспроизводи-

мость, специфичность.

Чувствительность определяет минимальную концентрацию исследуемого ком-

понента, статистически достоверно отличающуюся от аналогичного показателя кон-

трольной (холостой) пробы, которая может быть определена данным методом. Фактиче-

ски, эта величина эквивалентна пределу обнаружения искомого компонента в пробе, т. е.

минимальному количеству вещества, которое может быть обнаружено с достаточно вы-

сокой достоверностью.

Воспроизводимость – соответствие результатов повторных измерений (определений) в

одной и той же пробе. Величина, обратная воспроизводимости, характеризует разброс резуль-

татов (аналитическую вариацию), которая зависит от случайных погрешностей.

19

Специфичность характеризует возможность выявления искомого компонента в

условиях мешающего влияния других компонентов среды, а также близких, но не

идентичных по своей структуре ингредиентов.

Необходимо учитывать, что исследуемая проба всегда представляет собой сово-

купность различных веществ, среди которых находится и аналит. Среди остальных ком-

понентов пробы обязательно присутствуют составляющие, дающие неспецифические ре-

акции, близкие к реакциям аналита. Такие реакции искажают результаты исследований и

могут рассматриваться как помехи – примеси (фон). Выделяют два типа помех: аддитив-

ные (представляют собой некоторый компонент пробы, количество которого не связано с

количеством аналита) и мультипликативные (образующие прочное химическое соеди-

нение с полезной составляющей, количество которого пропорционально количеству ана-

лита). Если для удаления аддитивных примесей иногда достаточно включить в техноло-

гическую процедуру, например, операцию фильтрования пробы, которая позволит отде-

лить мешающие компоненты, то для выделения мультипликативных примесей необходи-

мо применять более сложные методы трансформирования пробы (например, диализ,

электрофорез и др.).

20

2. ОСНОВЫ МИКРО- И НАНОФЛЮИДИКИ

Огромное количество веществ анализируется методами жидкофазного анализа.

Наиболее важными и требующими решения проблемами при создании современных

высокочувствительных аналитических систем являются проблемы обеспечения

сверхвысокой производительности анализа и достижения предельной чувствительно-

сти определения компонентов пробы (на уровне “одно-молекулярного” детектирова-

ния). Средние значения кинетической и потенциальной энергий молекул жидкости

близки по величине между собой, а структура жидкости характеризуется наличием

ближнего порядка, т.е. такой корреляцией соседних молекул, при которой координа-

ционное число и взаимное расположение ближайших молекул в среднем одинаковы.

Повышение температуры среды и уменьшение давления приводит к уменьшению ко-

ординационного числа и увеличению радиуса первой координационной сферы,

вплоть до возникновения хаотического распределения скоростей молекул, свойствен-

ного веществам в газообразном состоянии. Понижение температуры и повышение

давления увеличивает степень ближнего порядка, и при температурах, близких к точ-

ке плавления, структура жидкостей становится подобной той, что имеет место в соот-

ветствующем твердом теле. Молекулы жидкости находятся в непрерывном тепловом

движении, а именно, вращение, нерегулярные вращательные и возвратно-

поступательные движения, скачки через потенциальные барьеры, разделяющие воз-

можные положения частиц. Действие постоянной или медленно изменяющейся внеш-

ней силы приводит к появлению преимущественной направленности активированных

переходов молекул из одного пространственного положения в другое – так появляет-

ся жидкостный поток, подчиняющийся законам гидромеханики.

Фундаментальные законы природы, лежащие в основе нашего понимания действия

микро- и наноструктур хорошо известны. Новым является иное взаимодействие между

элементами, частицами – изменение относительной важности сил в микро масштабе по

сравнению с макро масштабом. Поверхностные эффекты, которыми часто пренебрегают в

макро масштабе, оказываются доминирующими в микро- и наносистемах.

2.1. Гидродинамические и реологические свойства жидкости. Ньютоновские и неньютоновские жидкости

2.1.1. Флюиды: жидкости и газы

Два главных класса флюидов – жидкостей и газов, отличаются, прежде всего,

удельным весом и степенью взаимодействия между составляющими молекулами. Плот-

ность газа низка, по крайней мере в 103 меньшая, чем твердого тела, и молекулы двигаются

как свободные частицы, которые только взаимодействуют прямыми столкновениями на

атомных расстояниях ~ 0.1 нм. Относительно большое расстояние между газовыми моле-

кулами ~ 3 нм, делает газ сжимаемым. Плотность жидкости 103 кгм-3 сопоставима с плот-

ностью твердого тела, то есть, молекулы упакованы настолько плотно, насколько возмож-

но с типичным средним межмолекулярным расстоянием ~0.3 нм, и жидкость может для

многих практических целей рассматриваться несжимаемой.

21

Межмолекулярные силы в жидкости имеют весьма запутанную квантовую и элек-

трическую природу, так как каждая молекула всегда окружается множеством молекул в

пределах атомных расстояний.

В модельных вычислениях для простых жидкостей множество особенностей взаи-

модействия пары молекул могут быть воспроизведены путем вычисления потенциала Ле-

нарда-Джонса:

612

4rr

)r(VLJ

,

где r – расстояние между молекулами, – максимальная энергия притяжения, – диаметр

столкновения. Соответствующая межмолекулярная сила дается производной:

dr

dV)r(F LJ

LJ .

В интервалах до нескольких молекулярных диаметров молекулы в жидкости взаи-

модействуют почти также, как в твердых телах. Однако, значительные тепловые флуктуа-

ции вызывают дополнительные молекулярные взаимодействия, что и является особенно-

стью жидких сред.

Для малых расстояний, r < r0 ~ 0.3 nm силы взаимодействия носят отталкивающий

характер (рис. 3, а), в то время, как для больших расстояний, r > r0, они слабо притягива-

ются. Зависимость измеряемой физической величины жидкости как функции объема

Vprobe, будет иметь сложную форму, на которой можно выделить три участка (рис. 3, б).

Для микроскопических объемов анализа будут наблюдаться большие молекулярные коле-

бания величины. Для мезоскопических объемов анализа может быть определена точная

оценка величины, а для макроскопических объемов анализа небольшие вариации измене-

ний флюидов могут наблюдаться при воздействии внешних сил.

а б

Рис. 3. Потенциал Ленарда-Джонса (а) и зависимость измеряемой физической величины жидкости

как функции объема пробы Vprobe (б)

22

2.1.2. Факторы, определяющие процессы в микро- и нанофлюидике

Помимо размерных эффектов, имеющих место в микро- и нанофлюидике, следует

отметить следующие факторы, определяющие процессы в низкоразмерных системах:

шероховатость поверхности (эффекты сопротивления потоку, взаимодействия с ча-

стицами и т.п.);

растворенные газы (образование пузырьков, прилипание к поверхности и т.п.);

химические свойства поверхности (химические реакции и т.д.);

гидрофобность – гидрофильность поверхности;

загрязняющие примеси;

нагрев из-за неконтролируемых процессов;

электрические свойства поверхности (двойной электрический слой, изменение по-

верхностного и объемного заряда, перенос заряда и т.д.).

Вязкие силы в жидкости могут приводить к большой дисперсии потока по оси его

движения. Они оказывают существенное влияние, как в масштабе отдельных молекул, так

и в масштабе микропотоков – вблизи границ раздела жидкость-твердое тело (вне несколь-

ких молекулярных слоев), при движении по сложным и гетерогенным границам.

Влияние граничных областей на частицы и потоки экспериментально наблюдались

в диапазоне от молекулярных толщин до сотен нм. Если поверхность имеет супергидро-

фобные свойства, то этот диапазон может простираться до микронных толщин. Молеку-

лярная теория способна предсказать влияние гидрофобных свойств поверхности в систе-

мах только до десятков нм.

Флюиды, потоки жидкости или газа, характеризуются свойствами, которые меня-

ются непрерывно при действии внешних сил. В жидкости присутствие сил сдвига, малых

по величине, влечет большие изменения в относительном положение элемента флюида.

Напротив, изменения в относительных положениях атомов в твердых телах остаются ма-

ленькими при действии любой маленькой внешней силы. Прекращение действия внешних

сил на флюид не обязательно приводит к восстановлению его начальной форме.

2.1.3. Реология жидких сред

Слово реология происходит от греческого rew – течение. Реологические явления

проявляются во многих природных процессах и в большом числе технологических. Реоло-

гия – наука о деформациях и текучести сплошных сред, обнаруживающих упругие, пла-

стические и вязкие свойства в различных сочетаниях.

При течении реальных жидкостей в них возникают силы внутреннего трения. Для

большего класса жидких сред, так называемых ньютоновских жидкостей, справедлив за-

кон внутреннего трения, линейно связывающий касательное напряжение (напряжение

сдвига, напряжение внутреннего трения) с градиентом скорости потока d/dn:

dn

d ,

где – динамический коэффициент вязкости, – скорость потока, n – координата, пер-

пендикулярная к потоку.

Для ньютоновских жидкостей динамическая вязкость не зависит от режима

движения, но при этом существенно зависит от температуры. Для характеристики дви-

23

жения жидкости вводят кинематический коэффициент вязкости

, где – плот-

ность жидкости.

К неньютоновским жидкостям (их также называют аномально-вязкими или струк-

турно-вязкими) относятся, в частности, суспензии, эмульсии, растворы и расплавы поли-

меров и т.п. Их динамическая вязкость зависит от характера движения, то есть, Re

даже для малых чисел Рейнольдса:

UdRe ,

где U и d – характерные скорость потока и геометрический размер канала, и – плот-

ность и коэффициент динамической вязкости среды соответственно.

Различие между текучими свойствами ньютоновских и неньютоновских жидкостей,

можно пояснить, рассмотрев жидкость между двумя параллельными поверхностями, от-

стоящими друг от друга на расстояние d. Если к верхней приложить силу F, действующую

в направлении x, то пластина начнет двигаться с постоянной скоростью u. При этом жид-

кость просто увлекается в направлении x вследствие своего сцепления с верхней пласти-

ной. Результирующее касательное напряжение определяется формулой: A

F , где

А – площадь поверхности верхней пластины. Для ньютоновской жидкости характерно ли-

нейное распределение скоростей (рис. 4), причем градиент скорости (изменение скорости

сдвига перпендикулярно направлению приложенной силы) dy

du остается постоянным. Уг-

ловой коэффициент графика зависимости напряжения сдвига от градиента скорости соот-

ветствует . Он зависит только от температуры и давления и не зависит от скорости сдви-

га. В случае неньютоновских жидкостей график зависимости от dy

duуже не является

прямой линией, проходящей через начало координат. При этом кажущаяся вязкость, опре-

деляемая как отношение касательного напряжения к результирующей скорости сдвига,

меняется в зависимости от величины скорости сдвига dy

du. Для некоторых жидкостей она

может зависеть от продолжительности действия касательного усилия.

Так псевдопластичные жидкости характеризуются нелинейным реологическим

уравнением: m

kdn

d

,

где k – кажущая вязкость, m – константа (0<m<1), n – координата (x, y, z).

Это уравнение справедливо для большинства коллоидов, полимеров, суспензий с

асимметричными частицами. На практике оказывается, что при постоянных температуре и

давлении, внутреннее трение неньютоновских жидкостей зависит от их гидромеханической

предыстории.

24

Рис. 4. Течение жидкости между параллельными пластинами

Вязкопластичные неньютоновские (бингамовские) жидкости (концентрированные

суспензии, пасты) характеризует наличие предела текучести 0, только при превышении

которого жидкость начинает течь, согласно уравнению Ньютона. При уменьшении напря-

жения и обратном переходе через значение 0, называемое предельным напряжением сдви-

га, бингамовске жидкости обратимо восстанавливают свою структуру. Реологическое

уравнение для бингамовских жидкостей имеет вид:

dn

dp

0 ,

где p – пластическая вязкость.

Для группы дилатантных жидкостей, к числу которых относятся некоторые кон-

центрированные суспензии, в отличие от псевдопластичных сред характерно возрастание

кажущейся вязкости с увеличением градиента скорости потока при m>1.

Рассмотренные типы неньютоновских жидкостей объединены общим свойством

стационарности, т.е. независимостью функции d/dn=f() от времени.

Имеются также два типа неньютоновских жидкостей, кажущаяся вязкость которых

зависит от продолжительности сдвига: тиксотропные и реопектические. У тиксотропных

жидкостей (многие краски и кисломолочные продукты) вязкость понижается с увеличени-

ем продолжительности воздействия постоянных напряжений сдвига вследствие разруше-

ния структуры. После снятия силовых воздействий первоначальная структура восстанав-

ливается и вязкость возрастает. Вязкость реопектических жидкостей повышается с ростом

длительности сдвиговых воздействий.

Вязкоупругие (максвелловские) жидкости (смолы, расплавленные полимеры, теста)

обладают свойствами частичного восстановления своей формы после снятия напряжений,

напоминая этим упругие твердые тела. Характерно, что кажущиеся вязкости всех ненью-

тоновских жидкостей, как правило, значительно превышают вязкость воды.

Реологическая классификация неньютоновских жидкостей и зависимость касатель-

ного напряжения от скорости сдвига для жидкостей приведены на рис. 5 и рис. 6.

25

Рис. 5. Реологическая классификация неньютоновских жидкостей

Рис. 6. Зависимость касательного напряжения от скорости сдвига для жидкостей: слева – жидкости

с независящими от времени свойствами 1, 2 – жидкости с пределом текучести и нелинейной кривой течения,

3 – пластическая жидкость Бингама, 4 – псевдопластическая жидкость (с разрежением сдвига),

5 – ньютоновская жидкость, 6 – дилатантная жидкость (со сгущением сдвига). Справа – жидкости

с зависящими от времени свойствами: 7 – тиксотропная жидкость, 8 – реопектическая жидкость

26

2.1.4. Модели жидкости

Характер жидкости формализовано определяется характеристическим числом

Шмидта: D

Sc

. Принято считать, что для водоподобных жидкостей это число поряд-

ка 1000 (в некоторых работах принято ~2450). Кроме того, кинематическая вязкость

имеет порядок 10-2 см2/сек.

Удобной реологической моделью для жидкостей, не имеющих предельного напря-

жения сдвига и с независящими от времени свойствами является модель степенной жидко-

сти Оствальда- де Вилля (Оствальда), хорошо зарекомендовавшая себя на практике. Она

характеризуется эмпирическими параметрами: β – консистентность смеси или коэффици-

ент совместимости) и N (параметр неньютоновости или показатель степени жидкости). N

характеризует отклонение от ньютоновской жидкости (вода, N =1): для дилатантных жид-

костей (концентрированной суспензии) N >1, а для псевдопластичных жидкостей (полиме-

ров) N<1. При таком подходе связь между касательными напряжениями в среде и скоро-

стью конвективного движения имеет вид:

1

N

z

u

z

u .

Вязкость жидких сред во многом определяет режимы их течения и возникающие

при этом сопротивления, что играет важную роль при лабораторных исследованиях про-

точных систем, при экспресс-анализе и динамических измерениях.

Для количественной оценки режимов движения широко используют различные без-

размерные характеристики, например число Рейнольдса.

2.1.5. Межфазовые взаимодействия

Большое значение в микрофлюидике имеют межфазовые взаимодействия жидких

сред с твердыми материалами и газами (граничное натяжение, возникновение граничных

слоев, электрокапиллярные, электрокинетические и другие поверхностные явления). Под

действием поверхностных сил поверхности раздела между фазами стремятся к минимуму

площади. Для характеристики этого явления вводится величина поверхностного натяже-

ния , которая определяется работой, затрачиваемой на изотермический обратимый про-

цесс образования единицы площади поверхности раздела двух равновесных фаз. Поверх-

ностные (граничные) натяжения на границах жидкость-газ, как правило, бывает больше,

чем на границах жидкость-жидкость. В случае многокомпонентных систем, когда возмож-

на адсорбция компонентов Гk на межфазной границе, поверхностное натяжение определя-

ется уравнением Гиббса:

1

k

kk ,

где – свободная удельная поверхностная энергия, k – химические потенциалы компо-

нентов, k – номер границы между компонентами.

27

Избыток поверхностной энергии, повышенная активность молекул и различные

межфазные физико-химические взаимодействия в поверхностном слое приводят к возник-

новению разнообразных поверхностных явлений. Тенденцией многофазных систем к

уменьшению их поверхностной энергии объясняются капиллярные явления, диспергиро-

вание, коалесценция (слияние) капелек или пузырьков в эмульсиях и пенах, коагуляция

частиц дисперсной фазы в суспензиях, различные виды адсорбции, приводящей к измене-

нию химического состава поверхностного слоя, и др.

2.1.6. Диффузия. Закон Фика

Перенос материала в жидкости, известный как конвекционно-диффузионный

транспорт, может происходить либо путем конвекции благодаря макроскопическому пото-

ку, либо с помощью диффузии вследствие броуновского движения. При конвекционной

транспортировке материал следует по основным потокам жидкости со средней скоростью

жидкости и распределением скорости, соответствующим потоку Пуазейля. Такой поток

обычно рассматривается как наиболее важный физиологический транспортный механизм в

человеческом организме. Аналогичные процессы имеют место в микрожидкостых (мик-

рофлюидных) устройствах, где перенос вещества рассматривается также и в пределах раз-

личных фаз и через межфазные границы. Как правило, такие процессы лимитируются

диффузией молекул, ионов, атомов, свободных радикалов, частиц дисперсной фазы.

Диффузия – процесс, при котором группа частиц, сконцентрированная в объеме, в

соответствии с Броуновским движением, распространяется через какое-то время так, что

средняя концентрация частиц во всем объеме становится постоянной. Диффузионные ха-

рактеристики, в свою очередь, зависят от свойств среды, распределяемого компонента,

температуры и давления. Величина коэффициента диффузии D может быть определена из

выражения первого закона Фика:

dn

dctSDM ,

где М – масса продиффундировавшего компонента через площадь сечения S за время t,

dc/dn – градиент концентрации диффундирующего компонента.

В случае жидких сред коэффициенты диффузии различных компонентов составля-

ют менее 10-9 м2/с. Для интенсификации массобмена широко используется явление кон-

векции (конвективный перенос). Суммарная массопередача вследствие диффузии и кон-

вективного массопереноса называется конвективной диффузией.

Частица, находящаяся в жидкости, постоянно сталкивается с окружающими моле-

кулами. Если бы скорости всех молекул были одинаковыми, то среднее значение смеще-

ния частицы было бы равно нулю. Однако молекулы имеют различные скорости при дан-

ной температуре, а распределение их описывается некоторым распределением вероятно-

сти. Поэтому время от времени плавающая частица получает конечный импульс непред-

сказуемого направления и величины. Вектор скорости частицы постоянно меняется, что

приводит к видимому зигзагообразному движению, называемому броуновским. При бро-

уновском движении среднеквадратичное смещение частицы радиуса a, находящейся в

жидкости с вязкостью и температурой Т за время наблюдения t:

ta

kTDtx

3

22 ,

где k – постоянная Больцмана.

28

Диффузия становится важной в микромасштабе. Например, миоглобину (D = 11*10-

7 см2·сек-1) в воде требуется всего 0.44 секунды, чтобы сместится на 10 мкм. Частицы при

соударении испытывают вращательное броуновское движение вокруг беспорядочно ори-

ентированных осей со среднеквадратичным углом вращения (рад):

ta

kT3

4 .

Итак, чтобы перемещать изолированную частицу в определенную область в течение

этого периода, смещение ее из-за действия направленной силы должно быть большее, чем

из-за случайного движения. Это соображение правомерно только для отдельных изолиро-

ванных частиц. Для совокупности частиц применяется другой подход.

В микрофлюидике можно подобрать такие условия, когда два потока в контакте не

будут смешиваться при параллельном течении, а из одного потока в другой будет проис-

ходить диффузия молекул, если состав потоков различен.

Согласно теории конвективной диффузии, конвекция вблизи поверхности твердого

тела, соприкасающегося с жидкой средой, затруднена, и преобладает диффузия. Толщина

диффузионного пограничного слоя , в котором локализован процесс диффузии, зависит

от гидродинамических характеристик системы и коэффициента диффузии диффундирую-

щего компонента. Толщина диффузионного слоя при естественной конвекции существен-

но больше, чем при вынужденной, величина же диффузионного потока при естественной

конвекции соответственно меньше. Изменение скорости конвективного движения от неко-

торого значения в глубине раствора до нулевого происходит в пределах пограничного гид-

родинамического слоя толщиной гр (пограничного слоя Прандтля). В слое Прандтля, ха-

рактеризующемся повышенной вязкостью, турбулентное движение сменяется ламинар-

ным. Связь между гр и может быть найдена из сопоставления процессов передачи рас-

творенного вещества и передачи движения жидкости, определяемой величиной кинемати-

ческой вязкости:

гр

mD

,

где m=1/3 для систем жидкость-твердое тело, m=1/2 для систем жидкость- жидкость и

жидкость-газ. Отношение

D есть

1Sc .Учитывая порядок величин D и , нетрудно найти,

что при Sc=1000 толщина диффузионного слоя для системы жидкость – твердое тело со-

ставляет около 0.1гр. Для оценки отношения масс вещества, перемещаемых путем конвек-

тивного переноса и диффузии, используют число Пекле.

2.1.7. Капиллярные эффекты и течение жидкостей

Теория макромасштабной капиллярности достаточно хорошо изучена. При контакте

жидкости с твёрдыми телами на форму её поверхности существенно влияют явления сма-

чивания, обусловленные взаимодействием молекул жидкости и твёрдого тела. На рис. 7, а

показан профиль поверхности жидкости, смачивающей стенки сосуда. Смачивание озна-

чает, что жидкость сильнее взаимодействует с поверхностью твёрдого тела (капилляра),

чем находящийся над ней газ. Силы притяжения, действующие между молекулами твёрдо-

29

го тела и жидкости, заставляют её подниматься по стенке сосуда, что приводит к искрив-

лению примыкающего к стенке участка поверхности. Это создаёт отрицательное (капил-

лярное) давление, которое в каждой точке искривленной поверхности в точности уравно-

вешивает давление, вызванное подъёмом уровня жидкости. Если сближать плоские стенки

сосуда таким образом, чтобы зоны искривления начали перекрываться, то образуется во-

гнутый мениск – полностью искривленная поверхность. В жидкости под мениском капил-

лярное давление отрицательно, под его действием жидкость всасывается в щель до тех

пор, пока вес столба жидкости (высотой h) не уравновесит действующее капиллярное дав-

ление p. Жидкость, не смачивающая поверхность, образует выпуклый мениск, что вызы-

вает её опускание в капилляре ниже уровня свободной поверхности (h < 0). Движение

жидкости в капиллярах может быть вызвано разностью капиллярных давлений, возника-

ющей в результате различной кривизны поверхности жидкости. Поток жидкости направ-

лен в сторону меньшего давления: для смачивающих жидкостей – к мениску с меньшим

радиусом кривизны (рис. 7, б).

Рис. 7. Жидкость в капилляре (а); перемещение жидкости в

капилляре под действием разности капиллярных давлений (r1 > r2);

в – стягивающее действие капиллярного давления (б)

Капиллярные явления обусловлены действием сил поверхностного натяжения на

границе раздела несмешивающихся сред. При капиллярных явлениях в жидких средах

обычно происходит искривление поверхности жидкости, граничащей с другой жидкостью,

газом или собственным паром. Искривление поверхности ведёт к появлению в жидкости

дополнительного капиллярного давления p, величина которого связана со средней кри-

визной r поверхности уравнением Лапласа:

p = p1 – p2. = 212/r , где 12 – поверхностное натяжение на границе двух сред; p1 и

p2 – давления в жидкости и контактирующей с ней среде. В случае вогнутой поверхности

жидкости (r < 0) давление в ней понижено по сравнению с давлением в соседней фазе: p1 <

p2 и p < 0. Капиллярное давление создаётся силами поверхностного натяжения, действу-

ющими по касательной к поверхности раздела. Искривление поверхности раздела ведёт к

появлению составляющей, направленной внутрь объёма одной из контактирующих фаз.

Для плоской поверхности раздела (r = ) такая составляющая отсутствует и p = 0.

На границах раздела сред твердое тело/жидкость/газ формируется мениск, его ха-

рактеристикой является краевой угол, (угол контакта мениска с твердой поверхностью)

(рис. 8). Этот угол является показателем равновесия сил адгезии между жидкостью и по-

30

верхностью и когезии в пределах поверхности жидкости. Если этот угол < 90°, адгезия

сильна, и жидкость "смачивает" поверхность, а если угол > 90°, адгезия сравнительно сла-

ба, и жидкость "несмачивающая". На границе воздух/стекло такие жидкости, как спирт,

глицерин и чистая вода, имеют ~ 0°, тогда как скипидар имеет ~ 17°, а загрязненная

вода – ~ 25°; все они смачивают поверхность. С другой стороны, ртуть на стекле имеет

= 140°, а для воды на парафине = 109°; обе эти жидкости являются несмачивающими.

а б

Рис. 8. Краевой угол на границе раздела сред: а – малый угол – высокая поверхностная энергия;

б – большой – низкая поверхностная энергия

В классическом примере капиллярности один конец трубки малого диаметра 2rcap

открытой с обеих сторон вертикально погружают в жидкость. Жидкость смачивает стенку

трубки и поднимается по ней до тех пор, пока на некоторой высоте hcap сила, обусловлен-

ная поверхностным натяжением (Fcap) и тянущая жидкость вверх, не сравняется с силой

тяжести (Fgrav), толкающей жидкость вниз, согласно соотношению:

22 capglcapcaplggravcapc grhr)cos(FFF ,

glcap

lg

capgr

cosh

2,

где – краевой угол,

lg

sg slcos

(формула Юнга), – поверхностное натяжение

на границе раздела твердое тело/газ (sg), твердое тело/жидкость (sl) или жидкость/газ (lg);

l и g – значения плотности жидкости и газа; g – ускорение свободного падения и rcap –

внутренний диаметр трубки.

Чистая вода при нормальных давлении и температуре в стеклянной капиллярной трубке с

rcap = 1 мкм может подняться на высоту hcap = 15 м, что соответствует среднему давлению

pcap = hcap (l – g) = 1,5 атм.

Как показывают результаты расчетов, капилляры с внутренним диаметром >(2-4)

нм наполненные водой должны функционировать в соответствии с моделями сплошных

сред. По прогнозам ранних теоретических расчетов, открытые с одного конца углеродные

нанотрубки диаметром 0,8 нм могли бы всасывать молекулы из паровой или жидкой фазы.

Последующие эксперименты подтвердили, что жидкости с lg ≤ 190•10-3 Н/м, в том числе

жидкая сера, жидкий селен и азотная кислота, легко втягиваются капиллярными силами

внутрь углеродных нанотрубок диаметром (4-8) нм. Этот высокий предел означает, что

нанотрубка будет смачиваться водой (lg ~ 72•10-3 Н/м), большинством органических рас-

творителей и жидкими кислотами, которые могут использоваться как носители с низким

поверхностным натяжением для ввода растворенного вещества в нанотрубки. Жидкости с

высоким значением lg можно ввести в нанотрубки посредством приложения гидростати-

ческого давления pforce.

31

2.1.8. Отношение площади поверхности к объему

Отношение площади поверхности к объему (SAV) – фактор, который становится

важным в микромасштабе. Например, чашка Петри 35 мм диаметром, наполовину запол-

ненная водой объемом 2.5 мл, имеет отношение (SAV) = 4.2 см -1, а микроканал 50 мкм вы-

сокий, 50 мкм шириной и 30 мм длиной имеет объем 75 нл, т.е. SAV = 800 см-1. При пере-

ходе от макромасштаба к микромасштабу SAV увеличивается. Очень большое SAV отно-

шение делает капилляр или канал более эффективным, позволяя быстро отводить (рассеи-

вать) тепло. К сожалению, при транспортировке жидкостей, использующих электрокине-

тический поток, большое SAV отношение определяет не только возможность макромоле-

кулам быстро распространяться, но и адсорбироваться на поверхности канала, уменьшая

эффективность переноса жидкости.

2.2. Моделирование в микро- и нанофлюидике

При моделировании процессов в микроразмерных системах основополагающим яв-

ляются следующие базовые принципы:

1) гипотеза ламинарности потоков (иногда, ее полагают само собой разумеющейся,

если речь идет о микрофлюидике),

2) гипотеза сплошной среды (выявление границ применимости),

3) законы формирования скоростного конвективного профиля, массопереноса, рас-

пределение электрического и теплового полей,

4) граничные условия, связанные с геометрией элементов конструкций (стенки

каналов, зоны смесителей потоков и т.д.) и с физическими процессами, протекающими

на них.

Поскольку рассматриваются физико-химические процессы переноса вещества и

энергии, математические модели, в большинстве случаев, имеют форму систем дифферен-

циальных уравнений второго порядка в частных производных. В большинстве случаев ис-

пользуются так называемые уравнения параболического типа: производная первого поряд-

ка по времени, второго порядка по пространственной координате (координатам). Методы

решения таких уравнений или аналитические (Фурье и его модификации, например, метод

Гринберга, Галеркина, в ряде случаев, метод Даламбера и функций Грина, операторный

метод Лапласа и т.д.), или численные (явные или, что более эффективно, неявные конечно-

разностные схемы) – традиционны. Развитие методов моделирования затрагивает, в ос-

новном, численные методы и идет по пути экономии использования вычислительных ре-

сурсов и увеличения быстродействия современной вычислительной техники.

Ламинарность потока

Ламинарный поток – состояние, в котором скорость частицы в жидком потоке

является не случайной функцией времени. Малые размеры микроканалов (характерные

размеры от 5 до 300 мкм) и низкая шероховатость поверхности создают хорошие усло-

вия для формирования ламинарного потока. Традиционно представление о характере

потока дают безразмерные характеристические числа: число Рейнольдса и фактор тре-

ния Дарси. При движении жидкостей в микроразмерных каналах достаточно редко до-

стигается турбулентный режим. В то же время, движение газов, в ряде случаев, турбу-

лентное.

32

2.2.1. Подобие гидродинамических явлений. Характеристические числа

При изучении сложных физико-химических процессов, например, массоперенос ве-

щества в микроканалах при реализации сепарационных методов анализа, можно использо-

вать т.н. теорию подобия гидродинамических явлений. В частности, это дает возможность

изучения (в т.ч. методами имитационного моделирования) модельных аналогов исходной

конструкции микроканала и режима (условий) анализа. Требуется равенство некоторых ха-

рактеристических чисел исходного (реального) и модельного объектов. В этом случае

найденные для модели закономерности обоснованно переносятся на реальный объект.

К основным характеристическим числам, связанным с процессами конвективно-

диффузионного массо- и теплопереноса смесей химических и биологических веществ в

микроканалах следует отнести: число Рейнольдса, число Пекле, число Фурье, число

Прандтля (Шмидта), число Боденштейна, число Кнудсена и ряд других.

Одним из базовых безразмерных параметров теории подобия является число Рей-

нольдса (Re), которое позволяет характеризовать поток как ламинарный (безвихревой) или

турбулентный. Следует заметить, что положение о ламинарности конвективного потока

вещества – ключевое для определения микрофлюидики.

cdu

Re ,

где – объемная плотность вещества (кг/м3), u – характерное значение линейной (конвек-

тивной) скорости, dc – характерный размер системы, – динамический коэффициент вяз-

кости (кг/мHс).

При достижении Re некоторого критического значения, поток становится турбу-

лентным. В некоторых источниках переход от ламинарного к турбулентному режиму опи-

сывается более сложной схемой: при достижении первого критического числа происходит

потеря ламинарности и наступление переходного режима, а при превышении второго кри-

тического значения поток становится турбулентным. В этом случае для макроканалов

круглого сечения первое критическое число Рейнольдса имеет значения 2100-2300, а вто-

рое – около 10000.

Рассмотрим оценки первого критического числа Рейнольдса.

А) понятие характерной скорости допускает различные толкования – средняя по се-

чению, максимальная, скорость на уровне толщины вытеснения (или на уровне толщины

потери импульса) и т.д. Естественно, что разные варианты скорости приводят к различным

оценкам критического значения числа Рейнольдса. В подавляющем большинстве случаев

используется среднее значение скорости.

Б) характерный размер объекта – также по-разному трактуемое понятие. В реаль-

ных объектах следует брать, по крайней мере, два характерных размера: характерная длина

(например, рабочая длина канала) и характерный размер сечения. Соответственно чисел

Рейнольдса, как характеристик объекта, будет два: продольное и поперечное.

Понятие характерный размер сечения нуждается в пояснении. В случае круглого

сечения этим размером может быть диаметр, для плоской щели размер связан с ее шири-

ной, для коаксиала размер связан с шириной зазора и т.п. В общем случае вводится общее

понятие – гидравлический (гидродинамический) диаметр сечения, определяемый как

P

Sdc

4 . Здесь S и Р – площадь и периметр сечения сепарационного канала. Нетрудно

убедиться в том, что в простейших случаях сечений гидродинамический диаметр совпада-

33

ет с естественно выбираемым характерным размером. Например, в случае круглого сече-

ния gd=2r (диаметр круглого канала), плоской щели gd=2 (удвоенная высота щели), коак-

сиального капилляра gd=2(r2-r1), прямоугольного сечения gd=2ab/(a+b) (гармоническое

среднее ширины и высоты сечения), равностороннего треугольника gd=2ml/3, где ml – ме-

диана (т.е. совпадает с расстоянием от вершин треугольника до его центра тяжести).

При реализации электрофореза (и других сепарационных методов) на микрочипе в

жидкой среде, поперечные характеристические числа, как правила, не превосходят 0.1,

продольные – 10-100. Таким образом в большинстве случаев условие ламинарности вы-

полнено. Превышение критических чисел Рейнольдса возможно для некоторых случаев

использования газообразной среды разделения.

Фактор трения Дарси соотносит эффекты трения и давление в канале:

Lu

pdf

2,

где L – длина канала, p – разность давлений.

Число Фурье 0 – это отношение времени миграции неудерживаемого вещества из

капилляра t0 ко времени диффузии молекулы от стенки к стенке капилляра dc2/Dm (т.е.

среднее число столкновений со стенкой за время движения в капилляре). Можно выразить

u/Lt 0 , и тогда число Фурье для процесса массопереноса выразится следующим обра-

зом

,d

Dt

c

m

2

00

или 0=(L.Dm)/(u.dc

2).

Для аналогичного процесса теплообмена число Фурье определяется как: 2

00

cd

t , при-

чем, – коэффициент молекулярной температуропроводности, t0 – постоянная времени

переходных процессов.

Число Шмидта для диффузии:

m

m

DSc

.

Это число в значительной степени определяет характер жидкости. Принято считать, что

для водоподобных жидкостей это число порядка 1000.

Число Прандтля – аналог числа Шмидта с учетом замены коэффициента диффузии

на коэффициент температуропроводности.

Число Пекле традиционно определяют как

ScRe/Pe .

То есть, число Пекле – это средняя линейная скорость u, деленная на скорость ортогональ-

ной потоку диффузии Dm/dc, то есть, отношение объемного движения к радиальному мас-

сопереносу. Очевидно, что это число должно характеризовать степень размывания элек-

трофоретических пиков компонент анализируемых смесей.

В качестве меры подобия профиля скорости и концентрации в процессах массопе-

редачи применяют диффузионное число Прандтля:

34

DRe

PePr

.

Число Боденштейна характеризует влияние продольного перемешивания на гради-

енты концентрации веществ в потоке. По форме аналогично числу Рейнольдса с заменой

коэффициента кинематической вязкости (отношение /m) на коэффициент продольной

диффузии Dm.

Число Фруда Fr есть мера отношения сил инерции и тяжести. По-существу, опреде-

ляет необходимость учета сил тяжести при анализе движения вещества. В явном виде

Fr=u2/(gdc), где g – ускорение свободного падения. (Чем больше величина Fr, тем менее

существенный вклад сил тяжести).

2.2.2. Гипотеза сплошной среды

Хотя жидкости – квантованы в масштабе длины межмолекулярных расстояний (по-

рядка 0.3 нм для жидкостей и 3 нм для газов), они предполагаются непрерывными в боль-

шинстве случаев микрофлюидики. Гипотезы континуума (непрерывности, сплошной сре-

ды) предполагает, что макроскопические свойства флюида, состоящего из молекул, те же

самые, как если бы флюид был совершенно непрерывен (структурно однороден). Физиче-

ские характеристики: масса, импульс и энергия, связанные с объемом флюида, содержа-

щего достаточно большое количество молекул, должны быть приняты как сумма соответ-

ствующих характеристик всех молекул.

Гипотеза континуума ведет к концепции жидких частиц. В отличие от идеальной

точечной частицы в обычной механике, жидкая частица в флюидной механике имеет ко-

нечный размер. В атомном масштабе (используя современный СЗМ) мы столкнулись бы

большими флуктуациями из-за молекулярной структуры флюидов, но при увеличение

объема пробы, достигаем уровня, где возможно получение устойчивых измерений. Такой

объем пробы должен содержать достаточно большое количество молекул, для получения

достоверного воспроизводимого сигнала с маленькими статистическими колебаниями.

Например, если определить требуемый объем как куб со стороной 10 нм, то такой объем

содержит приблизительно 4x104 молекул и определяет уровень флуктуаций порядка 0.5%.

Важнейшим положением, нуждающимся в проверке, является допустимость анали-

за массопереноса вещества на основе модели сплошной среды, что позволяет использовать

концентрационные зависимости вместо статистического анализа ансамбля отдельных ча-

стиц. Положение о модели сплошной среды рассматривается как необходимое условие

микрофлюидики.

Анализ применимости гипотезы проводится на основе сравнения длины свободного

пробега частицы с характерным геометрическим размером d. Отношение этих длин – чис-

ло Кнудсена:

dKn / ,

где – длина свободного пробега в газе или жидкости.

На основе оценок числа Кнудсена определяются два важных положения: а) при Kn

менее 10-3 гипотеза сплошной среды обоснована, б) при Kn до 10-1 допустимо применение

условия прилипания частиц к жестким стенкам канала. Сама формулировка последнего

условия также может быть различна: как в форме U=0, так и в более сложной форме, свя-

занной с касательными напряжениями. Расчет можно осуществить как 3 Na/V ,

35

где V – молярный объем, Na – число Авогадро. При определенных геометрических ап-

проксимациях частиц вещества длина свободного пробега может быть вычислена как

)Nar/( s

221 , если использовать в качестве rs радиус Стокса, как следствие сфери-

ческой аппроксимации частицы. С другой стороны, для модели жесткоцепной молекулы rs

следует заменить на характерный размер частицы – радиус инерции Rg, вычисляемый как

6

lig

nR

. Здесь l – длина одного фрагмента цепочки (звена), ni – число звеньев.

Разумеется, гипотеза сплошной среды неприемлема, когда рассматриваемая си-

стема приближается к молекулярному масштабу. Это встречается в нанофлюидике,

например, при жидком транспорте через nanoпоры в мембранах клеток или в искус-

ственно изготовленных наноканалах.

2.2.3. Базовые теоретические положения

Теоретическую основу для реализации электрофореза и других сепарационных ме-

тодов составляют: а) уравнение неразрывности с системой уравнений Навье-Стокса (для

ввода вещества давлением), б) система уравнений Пуассона-Больцмана для электростати-

ческого потенциала и для скоростного профиля (для электрокинетического управления по-

токами), в) дополнительно к предыдущему, теория двойного электрического слоя, г) при

наличии нескольких источников движения потока, например, давление и электрокинетика,

соответствующие конвективные скорости складываются. Такая аддитивность следует из

принципа суперпозиции только при условии линейности скоростей.

При управлении давлением распределения конвективной скорости в цилиндриче-

ском микроканале и коаксиальном капилляре определяются геометрией сечений, и описы-

ваются выражениями соответственно,

)R/r(*Vu22

1 и

1

2

1

2

12

r

rln

r

r

Wr

Vu .

Здесь r – радиальная координата сечения микроканала (коаксиала), R – радиус канала, r1,2 –

внутренний и внешний радиусы коаксиала, максимальная V* и средняя <V> скорости про-

порциональны градиенту давления; вспомогательные параметры определяются геометрией

коаксиала 1);ln(/)1(;/ 22

12 krWrkrkrrrkr . Выражение для профиля кон-

вективной скорости в плоской щели аналогично выражению для профиля скорости в круг-

лом капилляре с учетом замены r и R на координату сечения y и полуширину щели h соот-

ветственно.

Формирование скоростного профиля происходит в соответствии с уравнениями На-

вье-Стокса и неразрывности: система уравнений Навье-Стокса для компонент скорости vi,

i=1,2,3 представляется в форме

321 v,v,vv;vvvt

vii

i

.

Здесь v – вектор скорости конвективного движения, и -- обозначения вектора гради-

ента и дифференциального оператора Лапласа соответственно. В прямоугольных декарто-

вых координатах их явные выражения

36

z

u,

y

u,

x

uu и

2

2

2

2

2

2

z

u

y

u

x

uu

.

В криволинейных координатах, в т.ч. цилиндрических и сферических их вид более сложен.

Соответствующие выражения можно найти в любом учебном пособии по математической

физике.

Чаще всего в прямолинейных каналах микрофлюидных систем конвективная ско-

рость имеет только одну аксиальную составляющую. Систему Навье-Стокса традиционно

дополняет уравнение неразрывности (сплошности) 0 v . Присутствие в этом урав-

нении позволяет учитывать неоднородность жидкости по пространству (различие плот-

ностей).

Для расчета массопереноса (профиль концентраций C=C(x,y,z,t)) и теплопереноса

(профиль температур Т=Т(x,y,z,t)) используется аналогичные уравнения с заменой коэф-

фициента динамической вязкости на коэффициент диффузии (D) или термодиффузии

(). В правой части уравнений производится замена «вязкого» слагаемого v на диффу-

зионное CD или термодиффузионное T соответственно, и также могут быть допол-

нительные источниковые/стоковые слагаемые, связанные с выработкой или расходованием

вещества или тепла. Заметим, что такой вид имеют уравнения при предположении о по-

стоянстве коэффициентов динамической вязкости, диффузии и термодиффузии.

Рассмотрим уравнение Пуассона-Больцмана для распределения потенциала по се-

чению канала в случае симметричного электролита с двумя моновалентными ионами:

Tk

)z(elsh

cFl

dz

d

b

ii

0

2

22

.

Здесь li – валентность i-го иона, е – заряд электрона (1.6.10-19 Кл), F – постоянная Фарадея

(9.65.104 Кл/моль), с0 – молярная концентрация ионов компонент (моль/м3), Т – температу-

ра (К), кb – постоянная Больцмана (1.38.10-23 Дж/К), – потенциал, z – нормированная про-

странственная координата сечения, sh – функция гиперболического синуса.

На границе раздела сред жидкость-твердое тело (поверхность канала) выделяют два

пристеночных слоя: слой Штерна (Stern layer) и Гоуи-Чепмена (Gouy-Chapman layer), при-

чем толщина второго связана с Дебаевской длиной электролита D. В большинстве случаев

допускается линеаризация уравнения Пуассона-Больцмана (т.к. при малости аргумента ги-

перболического синуса последний заменяется аргументом, т.е. sh(x)x) и использование

так называемого приближения Дебая-Хюккеля.

А. Дебаевская длина

0

2

0

2 ceFl

Tk

i

b

D

и уравнение Пуассона-Больцмана для рас-

пределения потенциала в канале преобразуется к уравнению гармонических колебаний.

2

1

D.

Б. Для линеаризации требуется выполнение 10 )RT/()F( и )(sh . (F и

R обозначают, соответственно, постоянную Фарадея и универсальную газовую постоян-

ную). Линеаризованное уравнение Пуассона-Больцмана, описывающее распределение по-

37

тенциала по сечению канала, решается аналитически: 2

2

2

dz

d. Решением должна быть

комбинация вещественных экспонент или гиперболических функций. Граничные условия:

симметрии 00 zdz

d (заметим, что по форме это условие совпадает с условием непро-

ницаемости) и электростатического баланса 11z , так как на стенке потенциал совпа-

дает с дзета-потенциалом. Параметр есть обратная величина от дебаевской длины.

Распределение относительной величины потенциала описывается выражением

)(ch/)z(ch .

Следствием линеаризации уравнения Пуассона-Больцмана для потенциала будет

уравнение для скорости электроосмотического потока (скоростного профиля) в форме:

)(shCEFh

dz

ud

0

2

2

22

с граничными условиями симметрии профиля на оси канала и

прилипания к стенке канала (u=0). Здесь Е=U/L – напряженность электрического поля.

Качественные закономерности формирования профиля конвективной скорости: а) по-

скольку вторая производная (радиус кривизны) скоростного профиля пропорциональна

потенциалу, неравномерность распределения потенциала приведет к усилению неравно-

мерности скорости по сечению канала, б) аппроксимировав профиль выражением

)z(um

max 1 , где m – показатель, характеризующий клиновидность профиля, можно свя-

зать m c заданными условиями, а именно, дзета-потенциалом 0, шириной канала 2h,

напряженностью электрического поля Е, концентрацией буфера С0, коэффициентом дина-

мической вязкости m.

Согласно методу размерностей нетрудно заметить, что размерность квадрата Деба-

евской длины 2

D будет )ceFl/(Tk ib 0

2

0 или, в явном виде,

2

3

32

2

//1

/1)/(м

м

м

ммольКлмольКл

ККДжмДжКл

. Т.е. указанная формула позволяет вычислить

Дебаевскую длину в метрах.

При типичной биохимической концентрации буфера (1-10) мМоль/л, эта величи-

на составляет несколько нанометров. Характерной величиной дзета-потенциала являет-

ся 10-50 мВ. Толщина двойного электрического слоя (EDL) составляет несколько D. В

ряде работ говорится о четырехкратной Дебаевской длине при D=3 нм. Количественно

эта толщина при традиционных условиях анализа оценивается около 10 нм, т.е. едини-

цы-десятки нм по сравнению с микрометровыми размерами канала. Типичным для

электрофореза на микрочипе и, тем более, для его макроаналогов (капиллярного элек-

трофореза), является отношение 4

10

dD g/ . Т.о. вклад двойного электрического

слоя в формирование профиля конвективной скорости достаточно мал, и практически

для всего сечения конвективная скорость постоянна (т.н. клиновидная форма профиля).

В степенной аппроксимации такому профилю будет соответствовать большой показа-

тель степени m и, как следствие, максимальная скорость u* будет практически совпа-

дать со средним значением скорости.

Некоторые решения уравнения Пуассона-Больцмана в приближении Дебая-

Хаскелла приведены далее. Например, для скоростного профиля в круглом микроканале

радиуса r=a:

38

)a/r(I

)/r(IE)r(u D

0

01

,

где I0 – цилиндрическая функция Бесселя нулевого порядка первого рода (модифициро-

ванная функция или функция мнимого аргумента). Качественно схожим, будет выражение

для скорости электроосмотического потока в плоской и прямоугольной щели:

)(ch

)z(ch*V)z(u

1 ,

где коэффициент пропорциональности выражается по-разному. Например, уравнение

для скоростного профиля в плоской щели примет вид:

)(

)(1

)(2)( 0

ch

zchchEzU ,

где )RT/(CFh 00 . Аппроксимация скоростного профиля уже для прямоугольно-

го сечения в вертикальном (вдоль оси z) поле имеет вид:

)a/(ch

)a/z(ch)y(U)z,y(U

3

31 ,

где а – глубина прямоугольного сечения. При всем отличии механизмов формирования

скоростного профиля, его аппроксимации качественно одинаковы.

Распределение концентраций в микроканалах в общем случае может описываться

уравнением Навье-Стокса при условии, что гипотеза сплошной среды применима.

В некоторых простых случаях возможно получение аналитических решений для

профиля концентраций при упрощающем положении о том, что конвективная скорость

имеет лишь одну составляющую. Обычно это характерно для прямолинейных каналов.

Решение осуществляется известными методами разделения переменных (Фурье).

Во многих случаях существует более простой подход, позволяющий получать при-

ближенные аналитические («оценочные») решения. В качестве примера рассмотрим кон-

вективно-диффузионный массоперенос в прямолинейном микроканале прямоугольного

сечения. Сечение интерпретируем как совокупность одинаковых плоских щелей, т.е. полу-

чим плоскую пространственно двумерную задачу.

Уравнение Навье-Стокса примет вид

.y

C

x

CD

x

C)y(U

t

C

2

2

2

2

Здесь C=C(x,y,t) распределение концентрации вещества, U(y) – профиль аксиальной со-

ставляющей конвективной скорости (других составляющих аксиальная скорость не имеет),

x – аксиальная (маршевая) координата, вдоль которой осуществляется конвективное дви-

жение вещества, y – ортогональная координата сечения, D – коэффициент диффузии.

39

Приближенные аналитические решения при дополнительных упрощающих предпо-

ложениях, можно получить на основе метода моментов. Предполагаем, что вещество не

может перемещаться на бесконечно большие расстояния по аксиальной координате.

Введем моменты порядка n, определяемые как

dx)t,z,x(Cx)t,z(n

n при 01

00

z

)t,(,

z

)t,( nn .

Данная формула содержит граничные условия 2-го рода, являющиеся следствиями

непроницаемости стенок для вещества и симметричности канала (плоской щели). Учиты-

вается естественное условие недоступности вещества в форме

,...,,p;x

)t,y,(Cp

p

2100

. Последнее условие говорит о невозможности ухода ана-

лизируемого вещества на бесконечное (очень большое) расстояние от зоны анализа.

Начальные условия связаны с характером заполнения канала пробой и с объемом пробы.

Подобный метод решения – метод моментов, оперирует уже не концентрациями

вещества, а концентрационным пиком. Нетрудно убедиться, что по аналогии с теорией ве-

роятностей, момент 0 имеет смысл общего количества вещества, отношение CT=1/0

определяет центр тяжести аналитического пика, его дисперсия определяется как 2

02

2CT/ .

Для моментов в нормированных параметрах получится следующее рекуррентное

соотношение:

...,,,n;*D)n(n)z(*nuz

*Dt

nn

mnn 321011 212

2

.

Здесь h/u*u,h/D*D 2

; h – полуширина щели, D, u – коэффициент диффузии и

максимальная конвективная скорость, z=y/h – относительная координата сечения, отсчи-

тываемая от оси (z=0 на оси щели, z=1 на стенке). Предварительно получена степенная ап-

проксимация профиля конвективной скорости (т.е. найден параметр m).

Исходное предположение также включало следующее начальное условие: в началь-

ный момент времени анализируемое вещество имеет вид компактной короткой «пробки»

длины 2 или нормированной длины 0=/h. Очевидно, что решения n зависят не только

от времени t, но и от координаты сечения z (т.е. концентрационные пики в разных сечени-

ях сдвинуты относительно друг друга – имеют различные центры тяжести и дисперсии,

т.е., ширину).

Получены формулы для усредненных по сечению микроканала координаты центра

тяжести аналитического пика компоненты и дисперсии пика:

tB*uCT0

14

22

2

0

12

222

2

3

32

j

j

j

j

)j(

BPet*D

)j(

BPe

.

40

Здесь Pe=u*/D*, Bj – коэффициенты разложения конвективного скоростного про-

филя (1-zm) в ряд Фурье по косинусам, т.к. профиль симметричен. Обозначив

,)j(

BS

j

j

1

2

2

1

1

4

2

2

j

j

)j(

BS

можно показать, что для профилей с большей клиновидностью (большими m) суммы S1 и

S2, входящие в выражение для дисперсии уменьшаются. Для m – целых на основе таблиц

можно получить следующие численные оценки:

Таблица 1

Численные оценки S1 и S2 для разных параметров m

m S1*102 S2*103 m S1*102 S2*103

2 1,693 1,693 4 1,108 1,057

3 1,389 1,357 5 0,890 0,829

Таким образом, при конвективном профиле с большей клиновидностью мы полу-

чим существенно более узкие (менее размытые) пики. В принципе распределение конвек-

тивной скорости в прямоугольной щели можно аппроксимировать не только степенной

зависимостью: при u(z)=u(z) с (1)=0 получим коэффициенты Bj согласно формуле:

1

0 )cos()(j

j jzBBz

.

Поскольку прямоугольный канал и плоская щель – геометрически различные объ-

екты, то оценки дисперсии пика получаются заниженными на 30-40%, поскольку при мас-

сопереносе в прямоугольном канале существует дополнительная диффузия в вертикальном

направлении (массообмен между разными плоскими щелями). Эта дополнительная не-

учтенная диффузия и вызывает дополнительное размывание пика.

2.2.4. Гидравлическое сопротивление в канале

Жидкость может быть приведена в движение по каналам путем создания давления

или разряжения в каналах. При этом, очевидно, что скорость жидкости на стенках канала

должна быть равна нулю. Это приводит к параболическому скоростному профилю по се-

чению канала. Постоянное давление в канале p вызывает поток жидкости Q. В соответ-

ствии с законом Хагена-Пуазейля:

QRp hyd ,

где Rhyd – гидравлическое сопротивление, зависящее от формы сечения и длины канала.

Значения для гидравлического сопротивления для каналов простых сечений приведены

в табл. 2.

41

Таблица 2

Гидравлическое сопротивление в каналах разных сечений

Гидравлическое сопротивление Сечение канала

4

8

r

LR

Круглое

3

12

wh

LR

Прямоугольное

4

45428

a

L,R

Квадратное

4

751184

a

L,R

Треугольное

42

3. ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В МИКРО- И НАНОФЛЮИДИКЕ

Перенос зарядов в растворах происходит в результате направленного движения носи-

телей заряда – ионов. Существуют разные механизмы такого переноса, но обычно выде-

ляют конвекцию, миграцию и диффузию.

Конвекцией называют перенос вещества макроскопическими потоками. Миграция –

движение заряженных частиц под действием электростатического поля. Скорость движе-

ния ионов зависит от напряженности поля. В микрофлюидике особую роль играют элек-

трокинетические процессы, которые могут быть условно разделены на четыре типа: элек-

троосмос, электрофорез, струящийся потенциал и потенциал седиментации. Эти процес-

сы могут быть качественно описаны следующим образом:

a) Электроосмос – движение объема жидкости в ответ на прикладываемое электрическое

поле в канале с электрическими двойными слоями на его смоченной поверхностях.

b) Электрофорез – вынужденное движение заряженных частиц или молекул, находящихся

в растворе с действующим электрическим полем.

c) Струящийся потенциал – электрический потенциал, который распространяется по кана-

лу с заряженными стенками, в случае когда жидкость движется под действием сил давле-

ния. Электрический ток Джоуля, связанный с этим эффектом переноса заряда называется

струящимся потоком.

d) Потенциал седиментации – электрический потенциал, который создается, когда заря-

женные частицы приведены в движение относительно постоянной жидкости. Движущая

сила для этого эффекта – обычно гравитация.

3.1. Двойной электрический слой. Электроосмотический поток в микро- и наноканалах

При создании микроаналитических приборов используются такие материалы, как

стекло, кварц и кремний. Важными являются процессы, происходящие на границе раздела

двух фаз: внутренней поверхности капилляра (канала) и водного раствора электролита, за-

полняющего канал.

При приложении продольного электрического поля в канале формируются электро-

кинетические потоки: электрофоретический и электроосмотический. Природа электроос-

мотического потока обусловлена явлениями, возникающими на границе жидкость-твердое

тело. При контакте жидкости с твердой поверхностью канала возникает определенное ори-

ентирование полярных молекул и ионов в области границы раздела фаз, приводящее к по-

явлению в поверхностных слоях зарядов противоположного знака и равной величины. В

результате взаимодействия твердой и жидкой фаз образуется система пространственно

разделенных зарядов противоположного знака, называемая двойным электрическим слоем

(ДЭС). На поверхности канала находятся отрицательно заряженные остатки силанольных

групп, к которой примыкает неподвижный слой катионов и диффузный слой, образован-

ный катионами в объеме жидкости. Распределение катионов между неподвижным и диф-

фузным слоями, а, следовательно, и толщина двойного электрического слоя зависит, в

частности, от общей концентрации электролита в растворе. Отрицательный заряд на по-

43

верхности канала обуславливает потенциал между поверхностью и раствором, называемый

дзета-потенциалом. Этот потенциал пропорционален плотности заряда на поверхности при

определенной величине рН раствора.

Впервые теория строения ДЭС была предложена Гельмгольцем (Helmholtz) в 1853 г.

Было предположено, что двойной электрический слой подобен плоскому конденсатору, а

на границе фаз заряды располагаются в виде двух рядов разноименных ионов. Со стороны

твердой фазы формируется ряд потенциалопределяющих ионов, и на расстоянии, равном

радиусу частиц, к нему прилегает ряд противоионов. Толщина электрического слоя близка

к молекулярным размерам, а электрический потенциал φ, появляющийся в результате об-

разование ДЭС, линейно уменьшается в пределах толщины электрического слоя до нуля

(рис. 9, а). Такое строение двойного слоя возможно при отсутствии теплового движения

ионов. В реальных же условиях распределение зарядов на границе раздела фаз зависит не

только от сил электростатического притяжения ионов, но и от тепловой диффузии. Гуи и

Чепмен (Guoy-Chapman, 1910-1913 г.) предположили, что ДЭС имеет диффузное (размы-

тое) строение и все противоионы составляют диффузионный слой (рис. 9, б), а изменение

потенциала электрического слоя φ по мере увеличения расстояния от границы раздела фаз

происходит нелинейно. Основы современной теории двойного электрического слоя были

разработаны О. Штерном (1924 г).

Адсорбционные силы действуют на очень коротких расстояниях, поэтому за бли-

жайшим к поверхности слоем противоионов их влиянием можно пренебречь. Предполага-

ется, что как бы ни были малы противоионы, они все же имеют конечные размеры. Следо-

вательно, первый слой противоионов – адсорбционный слой, начинается не у самой по-

верхности, а на некотором расстоянии δ (рис. 10, линия АА), соответствующем удвоенно-

му радиусу ионов. Соотношение между электростатическими и адсорбционными силами

определяет концентрацию и заряд ионов у поверхности. За пределами адсорбционного

слоя начинается диффузный слой (слой Гуи). Формирование диффузного зависит от двух

противоположных процессов: тепловой диффузии и притяжения ионов к поверхности за

счет электростатического взаимодействия. В результате диффузионный слой имеет об-

ласть высокой концентрации противоионов вблизи поверхности раздела фаз, а по мере

удаления от границы раздела концентрация противоионов приближается к значениям кон-

центрации их в растворе, так как тепловое движение ионов стремится равномерно распре-

делить их по всему объему жидкости.

В пределах адсорбционного слоя происходит линейное уменьшение электрического

потенциала от потенциала твердой поверхности φs до φδ адсорбционного потенциала

(рис. 10, линия MN). В диффузионном слое потенциал изменяется по экспоненциальному

зако-ну от φδ до нуля. Потенциал плоскости скольжения диффузной части ДЭС (рис. 10,

линия BB) обычно обозначается греческой буквой ζ (дзета) и называется

электрокинетическим потенциалом или дзета-(ζ)-потенциалом. Величина ζ-потенциала

может быть определена выражением:

CpHpK

kTeee

kT

)(

/

)10ln(ln ,

где k – постоянная Больцмана; e – заряд электрона; σ – поверхностный заряд; Γ – плотность

заряда поверхности; pK – константа диссоциации буферного раствора.

Т.к. ζ-потенциал пропорционален заряду частиц и концентрации электролита, то для

определения приближенного значения ζ-потенциала, используют следующую зависимость:

,))C(log)(.)pH(log.(.021

1010 02600580

где С – концентрация буферного раствора, моль/л.

44

Распределение концентрации ионов в слое может быть описано формулой:

kT

)y(eZexpc)y(c i

i

,

где с – концентрация ионов вдали от слоя, (y) – электрический потенциал, ассоциирую-

щийся с зарядом слоя, Zi – валентность иона, Т – температура жидкости.

Рис. 9. Строение ДЭС. Модели: а – Гельмгольца; б – Гуи и Чепмена; в – Штерна. Вверху схемы

расположения противоионов, внизу зависимость потенциала электрического слоя от расстояния

Рис. 10. Двойной электрический слой по Штерну.

Потенциалопределяющие (отрицательные) ионы находятся в плоскости границы раздела твердой

и жидкой фаз и образуют внутреннюю обкладку, а противоионы (положительные) –

наружную обкладку ДЭС

45

Толщина диффузного слоя (Гоуи-Чепмена) связана с дебаевской длиной электроли-

та D. Общая толщина электрического слоя составляет несколько D.

Свернём (мысленно) рассматриваемую поверхность в виде трубки (капилляра) с

внутренним диаметром 50...100 мкм, тогда окажется, что почти вся жидкость, заполняю-

щая её, будет представлять собой диффузную часть двойного электрического слоя. Если в

такой системе вдоль оси капилляра приложить электрическое поле, то в капилляре возник-

нет продольное движение свободных носителей электрических зарядов (разнополярных

ионов) во взаимно противоположных направлениях, а поскольку в диффузной части двой-

ного электрического слоя присутствует избыточная концентрация катионов, то число

ионов, перемещающихся к катоду будет значительно больше, при этом их движение будет

увлекать за собой всю остальную массу жидкости в капилляре (вследствие молекулярного

сцепления и внутреннего трения). Возникает так называемый электроосмотический поток

(ЭОП), направленный к катоду, который будет осуществлять пассивный перенос раствора

внутри капилляра. Вследствие этого процесса в электролите, заполняющем капилляр, воз-

никает направленное перемещение массы жидкости, которое вызвано приложенной разно-

стью потенциалов, при этом вся масса жидкости (за малым исключением приповерхност-

ного слоя) перемещается с одинаковой скоростью, т.е. формируется плоский профиль ско-

ростей. Это важное обстоятельство, которое позволяет получить чрезвычайно высокую

разрешающую способность метода, поэтому на него надо обратить особое внимание.

При приложении электрического потенциала скорость ионов в круглом капилляре

радиуса а:

E

rra

P)r(u Dz

1

4

022,

где r – расстояние от центра капилляра, Pz – градиент давления в направлении потока z,

– динамический коэффициент вязкости флюида, – диэлектрическая проницаемость, D –

Дебаевская длина, – потенциал в капилляре, Е – напряженность электрического поля.

В случае отсутствия градиента давления:

E

y,x)y,x(uEO

10

,

а если пренебречь влиянием слоев, то:

EuEO

0 .

Скорость ЭОП зависит от плотности отрицательного заряда на поверхности канала

и, следовательно, от рН раствора. Обычно ЭОП наблюдается при рН>2.5, чем выше рН тем

больше скорость ЭОП. Путем химической модификации поверхности канала ЭОП можно

уменьшить, подавить или даже повернуть в противоположном направлении.

Если бы ЭОП не было, то при приложении напряжения все положительно заряжен-

ные ионы двигались бы к катоду, отрицательно заряженные – к аноду. Однако ЭОП вызы-

вает перемещение к катоду всего объема раствора.

Электроосмотическая подвижность определяется как отношение величины электро-

осмотического потока к напряженности электрического поля:

46

0EO .

Поток через сечение канала Ach, вызванный ЭО: EOchuAW , этот поток переносит

заряд, тем самым, определяя осмотический ток:

0EOchuAI ,

где 0 – электрическая проводимость раствора.

Движение потока ионов через канал вызывает: образование внешнего потенциала

V и создает перепад давления в канале p. Для достаточно больших цилиндрических ка-

налов радиуса a (D<<a) можно записать следующее уравнение переноса потока:

pL

aV

L

apRVaQQQ hydEOPEO

8

422

,

где V – разность потенциалов.

Если предположить равновесие и что поток в существенном объеме в каналах не

переносится, а движутся только ионы, то получим выражение для оценки ЭО давления:

VaR

Qp

hyd

EOEO

2

8

На все частицы в буфере, перемещающемся под влиянием электрического поля,

действует ЭОП. Сам поток не является причиной разделение молекул в растворе. Однако,

присутствие электрического поля приводит к направленному движению заряженных ана-

литов в буфере, это явление известно как электрофорез.

В наноканалах, когда размер канала соизмерим с толщиной ДЭС, наблюдается ряд

явлений, приводящих к формированию профиля потока скоростей отличного от плоского

(рис. 11).

Рис. 11. Профили скоростей формирующиеся в микро- и наноканалах

47

ЭОП является эффективным средством для прокачки жидкостей. Если стенки мик-

роканала имеют электрический заряд, то вблизи поверхности стенок формируется двойной

электрический слой встречных ионов. При приложении электрического поля ионы в двой-

ном слое движутся к электроду противоположной полярности. Это создает движение жид-

кости около стенок и через вязкие силы происходит движение остальной жидкости. Если

канал открытый вблизи электродов, то скоростной профиль однороден поперек ширины

канала. Однако если электрическое поле приложено в закрытом канале (или существует

противодавление), то формируется более сложный профиль – жидкость по центру канала

перемещается в направление противоположному перемещению жидкости у стенок. В за-

крытых каналах, скорость по центру канала может достигать 50 % скорости у стенок.

3.2. Электрофоретическое разделение проб. Электрофоретическая подвижность

Электрофоретические методы, идеально поддающиеся автоматизации, применяют-

ся для разделения биологических молекул в однородном электрическом поле (ионы, белки,

ДНК). В основе метода лежит явление миграции ионов, т.е. их движения в электрическом

поле. Классический метод электрофореза (Тизелиус А., Нобелевская премия 1948г.) реали-

зован как процесс перемещения ионов вблизи границы контакта двух растворов – исследу-

емого и буферного. Следующая модификация метода – электрофорез на носителе (бумага

или гель): здесь ионы перемещаются в неподвижном слое носителя, пропитанного раство-

ром инертного электролита. Исследуемый раствор наносят узкой полосой вблизи одного

из концов носителя. В процессе электрофореза различные ионы образуют отдельные зоны

– зонный электрофорез. И, наконец, современным методом анализа широкого круга объек-

тов является капиллярный электрофорез. Метод капиллярного электрофореза (КЭ) основан

на разделении компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием прило-

женного электрического поля.

На заряженную сферическую частицу (с зарядом Ze) в жидкой среде (с вязкостью

) и в электрическом поле напряженностью E будут действовать следующие силы: элек-

тростатические (FEP) и силы сопротивления в потоке (FD). Если частица движется равно-

мерно, то:

06 EP

auZeED

FEP

FF ,

а скорость движения можно определить как:

EEa

Zeu EPEP

6,

где a – радиус частицы, uEP – скорость движения частицы, EP –электрофоретическая по-

движность.

Электрофоретическая подвижность является величиной, характерной для данного

вещества и позволяет соотнести заряд частицы с ее гидродинамическим размером (про-

порциональным массе частицы). Различают абсолютную и относительную электрофорети-

ческую подвижность. Абсолютная электрофоретическая подвижность – соотношение ско-

рости частицы к напряженности электрического поля, вызывающей движение частицы.

48

Относительная электрофоретическая подвижность – это отношение подвижности исследу-

емого вещества к подвижности другого вещества, принятого за стандарт.

Если в растворе имеются частицы разных размеров и с разными зарядами, то они

будут двигаться в постоянном электрическом поле с различными скоростями:

ii Eu ,

где i – подвижность i-го иона.

В случае, когда требуется разделить два вещества А и В с различными подвижно-

стями, то приблизительное значение требуемой длины канала (капилляра) Lr может быть

найдено по формуле:

BA

Asr LL

,

где Ls – длина «пробки» образца (пробы), A и B – подвижности разделяемых ионов.

Здесь под термином «пробка» пробы подразумевается некоторый объем жидкости с

анализируемым образцом, который под действием различных сил перемещается по каналу.

При приложении внешнего электрического поля образуются два независимых и

различных потока – электроосмотический (движение потока буфера и находящихся в нем

частиц аналита) и электрофоретический – перемещение заряженных молекул аналита. Не-

заряженные частицы движутся с одинаковой скоростью и не могут быть разделены. Одна-

ко их разделение становится возможным, если ввести в раствор поверхностно-активные

вещества, образующие мицеллы (например, додецилсульфат натрия). В водных растворах

ядро мицеллы гидрофобно и может захватывать нейтральные молекулы. Внешний слой

мицелл заряжен. Поэтому в электрическом поле мицелла перемещается унося с собой за-

хваченную молекулу. Такой метод разделения веществ получил название мицеллярной

электрокинетической капиллярной хроматографии.

Так как в растворе пробы содержится достаточно много аналитов, то положительно

заряженные аналиты будут двигаться быстрее, чем общий поток, потому что они притяги-

ваются к катоду. Перемещение анионов будет отставать от движения общего потока, так

как они будут притягиваться к аноду, но они фактически не двигаются туда, а просто со-

противляются ЭОП (рис. 12).

Рис. 12. Движение положительно заряженной (А), нейтральной (В)

и отрицательно заряженной (С) частиц в канале (а)

и примерное распределение частиц по размерам и заряду (б)

49

Электроосмос и транспортный электрофорез прямо пропорциональны напряженно-

сти электрического поля, а их суперпозиция называется электрокинетическим потоком.

Идеальный электрокинетический поток – случай объединенного транспорта, в котором

электрокинетическое поле скорости (uEK) пропорционально локальному электрическому

полю (E):

EuuEu EPEOEPEOEKEK ,

где EK, EO, EP – электрокинетическая, электроосмотическая и электрофоретическая по-

движности.

В идеальном электрокинетическом потоке частицы движутся вдоль линий электри-

ческих полей.

Факторы, влияющие на величину скорости, и в некоторых случаях, на направление

ЭОП: pH, концентрация, температура, величина дзета- потенциала, вязкость, и т.д. Темпе-

ратурные изменения, наиболее часто связываемые с Джоулевым теплом, из-за больших

напряжений в каналах, порождают дополнительные потоки, искажающие распространение

«пробки» пробы.

Одно из преимуществ электрокинетического потока – клиновидный скоростной

профиль, что позволяет избежать неоднородностей и нелинейностей потока, которые при-

сущи при управлении давлением. Преимуществом является и относительная простота

управления электрокинетическими потоками. Однако необходимость высоких напряжений

приводит к нагреву жидкости, и, следовательно, изменению свойств потока. Другое не-

удобство электрокинетического потока – зависимость его характеристик от свойств по-

верхности, которые могут меняться при адсорбция веществ на поверхность канала. Осо-

бенно это касается биологических проб.

3.3. Особенности вклада составляющих электрического поля

Следует отметить существенную особенность, связанную со вкладами продольной

(аксиальной Еaks) и поперечной (Еrad) составляющих электрического поля. Типичными зна-

чениями напряженности управляющего (продольного) электрического поля при электро-

кинетическом управлении являются 20-50 кВ/м, в отдельных случаях до 75 кВ/м. Вместе с

тем, на отдельных стадиях анализа напряженность продольного электрического поля не

превосходит 200В/см. То есть, характерным масштабом напряженности электрического

поля является 104 В/м. Вклад поперечного электрического поля можно оценить косвенно,

основываясь на уравнении Пуассона-Больцмана. Поскольку потенциал на оси микроканала

может быть достаточно близок к нулю, а на стенке он равен дзета-потенциалу, то прибли-

женной оценкой напряженности электрического поля можно считать r/Erad , где r –

радиус (или полуширина) канала. Величина дзета-потенциала имеет порядок 10-100 мВ

(10-2-10-1 В), типичная полуширина микроканала – 10-5-10-4 м (10-100 мкм). Следовательно,

Erad =102-104 В/м, и эта составляющая может быть соизмерима с продольной. При этом, ме-

тоды управления составляющими электрического поля принципиально разные.

Продольное поле регулируется выбором управляющих потенциалов; для попереч-

ного поля требуется управление (модификация) поверхности канала с подбором величины

дзета-потенциала. Кроме того, поперечное распределение потенциала еще зависит от тем-

пературы.

50

4. УПРАВЛЕНИЕ ДВИЖЕНИЕМ И РАЗДЕЛЕНИЕ ЧАСТИЦ В ЖИДКОСТИ. ОСОБЕННОСТИ ВОЗДЕЙСТВИЯ ВНЕШНИХ ПОЛЕЙ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ МИКРООБЪЕКТЫ

При разделении и анализе микрочастиц (молекул, ионов) используются разновидно-

сти методов микрохроматографии, фильтрации, электрофореза. Что касается разделения

макромолекул или крупных биологических частиц (ДНК, белков), то здесь возможно при-

менение только ограниченного количества способов, например, импульсный электрофорез

и седиментационные методы. При комплексных исследованиях обычно большие молекулы

пытаются «расчленить» на фрагменты и исследовать каждый фрагмент отдельно. Такой

подход, конечно, является продуктивным, но при этом важная часть информации утрачи-

вается. Часто оказывается необходимым изучить микрочастицу как индивидуальную ча-

стицу, чтобы выявить ее специфические функции, корректно и полно определить ее свой-

ства и характеристики. Наиболее сложными объектами для исследования являются живые

клетки. Анализ содержания и поведения отдельных клеток важен для фундаментального

понимания их функций в окружающей среде: сложных процессов взаимодействия клеток,

химического повреждения, ответа на внешние воздействия. Клетки содержат большое раз-

нообразие компонентов от маленьких молекул до белков. Многие из этих компонентов

присутствуют в мельчайших количествах и чрезвычайно маленьких объемах. Таким обра-

зом, аналитические инструменты для изучения клеток должны позволять проводить анализ

не только малых объемов образцов, но и следовых уровней разнообразных аналитов. В

технике микрофильтрации используются различия в размерах микрочастиц, а их движение

обеспечивается гидродинамическим давлением. С помощью микро- и нано- технологий

можно создать в органических и неорганических материалах разнообразные конструкции

фильтров, например, множество постов, извилистых или ступенчатых каналов с целью

эффективного разделения одних частиц от других. Преимущество микрофильтрации со-

стоит в том, что этот процесс не требует создания специальных буферных условий разде-

ления. Но необходимо, чтобы существовало различие в размерах между разделяемыми ти-

пами частиц.

Для изучения клеток традиционно используются электрокинетические методы. Нали-

чие особых свойств клетки (например, двойной электрический слой, окружающий клетку)

приводит к тому, что электрокинетическое движение клеток происходит по несколько

иным принципам, чем в случае высокомолекулярных микрочастиц (ДНК, белки). Элек-

трофорез не позволяет воспроизводимо разделить клетки по каким-либо характеристикам,

кроме разности их подвижностей. Поэтому, при разделение клеток обычно применяют

разные варианты диэлектрофореза (ДЭ) (Dielectrophoresis – DEP).

В основе диэлектрофореза лежит явление взаимодействия частиц с неоднородным

электрическим полем в среде, что является активным подходом к разделению. В перемен-

ном электрическом поле клетки проявляют разные диэлектрические свойства в зависимо-

сти от характеристик этого поля, а именно, частоты, фазы, амплитуды. Поэтому, выбирая

соответствующие характеристики поля для образца можно разделить различные типы

клеток и сосредоточить их в различных областях микроэлектродов в зависимости от их

индивидуальных диэлектрических откликов на прикладываемое электрическое поле. Из-за

простоты ДЭ широко используется в микрочиповых приборах для разделений бактерий,

раковых клеток, стволовых клеток, субпопуляций лейкоцитов. В отличие от микрофиль-

трации, диэлектрическое разделение не ограничено различиями в размерах между клетка-

ми или частицами. В принципе, различные типы клеток могут быть отделены с одной и

51

той же конструкцией электрода при подборе соответствующей частоты для каждого типа

клетки. Таким образом, преимуществом ДЭ является гибкость, полная контролируемость,

удобство для автоматизации. Но реализация диэлектрических разделений требует подбора

сепарационного буфера с низкой проводимостью, а это означает, что клетки не могут быть

непосредственно отделены в исходном образце.

В настоящее время существуют и развиваются следующие эффективные способы

управлением движением и разделением частиц в жидкой среде: а) с помощью силовых по-

лей (давление, разряжение, гравитация, центробежные силы); б) электрических полей (по-

стоянные – электроосмос, электрофорез и переменные – диэлектрофорез, электроротация и

т.д.); в) магнитных полей (магнитофорез); г) электромагнитных полей (фотофорез, опто-

форез, электромагнитофорез); д) лазерного излучения (оптический пинцет); е) ультразву-

ковых полей (сонофорез) и т.д.

4.1. Диэлектрофорез

Диэлектрофорез – перемещение микрочастицы в неоднородном электрическом по-

ле, вызванное взаимодействием между вынужденным (индуцируемым) диполем в микро-

частице и внешним электрическим полем. При воздействии электрического поля на поля-

ризуемую частицу в частице индуцируется дипольный момент. Если электрическое поле

изменяется, то на частицу действует сила, которая может перемещать ее к области с высо-

кой или низкой напряженности поля в зависимости от поляризационных способностей ча-

стицы по сравнению с окружающей средой. Если поляризуемость частицы выше, чем сре-

ды, то сила направлена к области с высокой напряженностью поля (положительный ДЭ). В

противном случае – к области с более низкой напряженностью (отрицательный ДЭ).

4.1.1. Основные принципы диэлектрофореза

Если рассматривать микрочастицу (в частности, биологический объект – клетку,

сложные молекулы, ДНК) как конгломерат молекул, представленных в виде диполей, то на

каждую молекулу, помещенную в электрическое поле с напряженностью Е, действует сила

F. Суммарная сила, приводящая к движению микрочастицы складывается из отдельных

электрокинетических сил. Кроме этого для подобных микрочастиц характерны особые

свойства, например двойной электрический слой, который окружает микрочастицу и сме-

щается во внешнем электрическом поле.

Суммарная электрическая сила, действующая на частицу с распределенным зарядом q в

неоднородном электрическом поле E может быть определена:

EmEqF ,

где – векторный набла-оператор, m – дипольный момент частицы.

В случаях, когда частица не имеет заряда или при частотах поля выше 1кГц (когда

электрофоретические эффекты незначительны) второе слагаемое уравнения (содержащее

дипольный момент и градиент электрического поля) преобладает и поэтому усредненную

по времени силу можно выразить как:

52

EEmF 2/Re 2 ,

где – частота колебаний поля.

Можно показать, что диэлектрофоретическая сила, действующая на сферическую ча-

стицу, определяется:

RMSrmDEP EVF 22

,

где V – объем частицы, ERMS – средняя величина напряженности электрического поля (в

предположение синусоидальной зависимости от времени), ar – реальная часть фактора

Клаузиуса-Мосотти (Clausius-Mosotti), который связан с диэлектрическими постоянными

частицы p и среды m.

*

m

*

p

*

m

*

p

r Re

2.

Здесь (*) обозначает, что диэлектрические постоянные – комплексные величины. Для

гомогенных частиц и среды комплексная диэлектрическая постоянная:

j

mp

mpmp

,

,*

, .

Эта зависимость от частоты поля важна при моделировании движения биологических

клеток, так как клетки – сложные объекты, состоящие из разных компонентов и структур.

Разные же материалы имеют различные электрические свойства, что приводит к разнооб-

разным поляризационным эффектам, в том числе и поляризации на границах клеточных

структур.

Диэлектрофоретическая сила зависит от размера частицы, от величины и степени

неоднородности приложенного электрического поля (градиент амплитуды или фазы). По-

лярность этой силы зависит от полярности вынужденного диполя, которая в свою очередь

определяется проводимостью и поляризацией микрочастицы и окружающей ее среды. Эта

сила вызывает движение частицы в направлении градиента поля или против него, в зави-

симости, является ли частица более полярной, чем среда в которой она находится (рис. 13).

Диэлектрофоретическая сила возникает только в случае неоднородных полей. В остальных

случаях сила равна нулю.

Движение частицы является результатом баланса приложенной ДЭ силы, вязкого

трения, гравитационных сил, сил инерции, поверхностного трения/прилипания и притяже-

ния между частицами, а также последующего влияния конвекции жидкости из-за давле-

ния, электротермического или электроосмотического потоков.

В случае низких чисел Рейнольдса (Re<10-5) инерционностью потока можно прене-

бречь. Часто предполагается отсутствие конвекции и малость поверхностных сил. Таким

образом, баланс между силой ДЭ и вязкой силой определяет кинетику нейтрально плава-

ющих частиц радиуса R:

0'

'

dt

dxFxF DDEP ,

dt

dxRdKFD

'6 ,

где – динамический коэффициент вязкости, K – масштабирующий фактор, равный еди-

нице для твердых частиц, движущихся, вдали от стенки, но увеличивающийся около стен-

ки (отражающий влияние вязких сил), d – расстояние между электродами.

53

Скоростной профиль частиц может быть определен по формуле:

)'('12

'4

22

xFd

R

K

aV

dt

dxDEP

rRMSm

,

здесь <F’DEP> – средняя величина ДЭ силы.

Для частиц, не обладающих нейтральной плавучестью, действует гравитационная

сила:

,0'

'

GDDEP F

dt

dxFxF ggRFG

3

3

4,

где – различие в плотности частицы и флюида, g – ускорение свободного падения, g –

единичный вектор по оси x’.

В этом случае скоростной профиль:

gd

R

K

gxF

d

R

K

aV

dt

dxDEP

rRMSm 2

4

22

9

2)'('

12

'

В отличие от электрокинетического потока, диэлектрофоретическое движение –

вдоль градиента электрического поля, может концентрировать и разрежать частицы. Ди-

электрофоретическая скорость пропорциональна градиенту электрического поля.

Для растворов поток частиц j в изолированных каналах, включая диффузию, электрокине-

тический поток и диэлектрофорез:

DEPEK uuuccDj ,

где D – коэффициент диффузии, с – концентрация частиц, u – неэлектрокинетическая ком-

понента скорости.

Поскольку размер частицы мал, то значительное влияние оказывают эффекты Бро-

уновского движения. Чтобы диэлектрофоретическая сила была эффективной, она долж-

на преодолеть Броуновское движение. Поэтому, для диэлектрофоретической манипуляции

с частицами микро- и наноразмеров, необходимо уменьшать характерные размеры систе-

мы управления (электродов управления) и увеличивать электрическое поле. Однако, высо-

кая величина электрического поля приводит к нагреву буфера и может вызывать электро-

химические процессы на электродах.

Наиболее простым способом создания неоднородного электрического поля является

применение электродов различной формы. Современные методы микро- и нано- технологий

позволяют получить любую геометрию электродов требуемых размеров. Самыми распро-

страненными конструкциями являются сочетание пластинчатых и игольчатых электродов.

Вблизи пластинчатого электрода формируется электрическое поле с меньшей напряженно-

стью, в то время как у игольчатого – формируется поле с большей напряженностью (рис. 13).

К настоящему времени разработаны стратегии разделения частиц, которые могут

быть реализованы в микрочиповых системах: разделение частиц в потоке; диэлектрофо-

ретическое фракционирование в поле потока (DEP-FFF: DEP-Field Flow Fractional); по-

шаговое разделение в потоке (stepped flow separation), диэлектрофорез «бегущей волны»

(traveling wave dielectrophoresis) и другие.

54

Простейшая реализация первого способа разделения – использование площадки с

множеством электродов, через которую проходит поток жидкости со смесью частиц. Два

вида частиц (светлые и темные) движутся поперек множества электродов (рис. 14). Тем-

ные частицы тормозятся положительным диэлектрофорезом, в то время как легкие части-

цы проходят через площадку. Затем электрическое поле снимается, и темные частицы по-

током вымываются и могут быть отдельно собраны.

При диэлектрофоретическом фракционировании в поле потока используют отрица-

тельный диэлектрофорез, как источник силы, обеспечивающий нахождение частицы на

некотором расстояние от поверхности электродов. При этом на частицу действуют сила

тяжести, гидродинамическая и диэлектрофоретическая силы, что позволяет распределить

частицы в соответствии с их свойствами послойно над поверхностью электродов. Иногда

этот принцип называется принципом гиперслойного разделения. Подобные устройства ис-

пользовались для демонстрации фракционирования латексных шариков, бактерий и рако-

вых клеток.

Рис. 13. Частица в неоднородном электрическом поле. Частица подвергается действию

неоднородного электрического поля и движется силой, обусловленной: а – градиентом амплитуды поля,

б – градиентом фазы поля

Рис. 14. Разделение частиц в потоке

55

Пошаговое разделение в потоке осуществляется с помощью специальных ди-

электофоретических шаговых сепараторов – конструкций электродов в виде гребенки

(рис. 15). Частицы с большей проводимостью сосредоточиваются в областях с высокой

напряженностью поля (положительный ДЭ), образуя скопления в виде бус. Частицы с

меньшей проводимостью скапливаются в областях с низкой напряженностью поля, обра-

зуя при этом характерные дельтовидные скопления. Чередование циклов подачи и снятия

напряжения с потоками, вымывающими частицы, позволяет проводить эффективное раз-

деление частиц.

Рис. 15. Разделение частиц с использованием гребенчатых электродов

При разделении частиц способом ДЭ «бегущей волны» применяется изменение гра-

диента фазы электрического поля, обеспечиваемое конструкцией подводящих электродов,

выполненных в виде спиральных электродных площадок (рис. 16).

Рис. 16. Разделение частиц способом диэлектрофореза «бегущей волны». На электроды подается сигнал

с одинаковыми амплитудами и частотой, но со сдвигом фаз на 900 на каждом электроде

Электроды сформированы так, что создают четыре соединенных в спираль элек-

трода, на которые подаются электрические сигналы со сдвигом фаз. Это дает возможность

получить управляемое электрическое поле. Частицы внутри такой конструкции испыты-

вают силу, продвигающую их или к центру спирали или от центра. Такое устройство по-

лезно для обнаружения редких частиц, поскольку они могут быть перемещены к центру и

сконцентрированы из сравнительно небольшой области, другие же частицы могут быть

удалены.

Диэлектрофоретическое разделение частиц может осуществляться и другими спо-

собами, например, вдоль канала расположены электроды, формирующие переменное элек-

трическое поле перпендикулярно направлению движения потока частиц (рис. 17). Части-

56

цы, смещающиеся в сторону большей и меньшей напряженности электрического поля, по-

падают в области с разными скоростными профилями и, следовательно, двигаются с раз-

личной скоростью. Сочетание ламинарного потока частиц с положительным или отрица-

тельным диэлектрофорезом частиц приводит к тому, что одни из них замедляются (поло-

жительный ДЭ) у стенки канала, а другие – ускоряются в центре канала (отрицательный

ДЭ). Вышеизложенные стратегии разделения частиц в микрочипах, конечно, не охватыва-

ют все способы, которые применяются в настоящее время.

Рис. 17. Принцип диэлектрофоретического разделения при использовании

квадрупольного электрода (Е1-Е4) в капилляре или в микроканале

4.1.2. Электроротация

Заряженная частица, представляющая собой диполь, может вращаться в электриче-

ском поле. Это явление называется электроротацией, а вращающей момент может быть

определен исходя из уравнения:

---- EmT

.

Вращающий момент зависит только от вектора электрического поля и не зависит от

градиента напряженности. Абсолютное значение разницы фаз между диполем (m) и векто-

ром напряженности электрического поля (E) определяет абсолютное значение вращающе-

го момента, достигая максимума при различии фаз в 90o и минимума при 0. Таким обра-

зом, частица, находясь в ротационном электрическом поле, будет поворачиваться в проти-

вофазе с полем. Вращающий момент зависит только от мнимых компонент дипольного

момента.

Полярные молекулы, частицы и клетки можно вращать с помощью однородного

знакопеременного электрического поля. Для создания такого поля необходимо как мини-

мум 4 электрода, расположенных крестообразно. На противоположно расположенные

электроды подается знакопеременное напряжение, при этом на смежные электроды пода-

ется такое же напряжение, но со сдвигом фаз в 90о.

Совместное действие ротационных и электрофоретических сил позволяет реализо-

вать очень чувствительные методики разделения микрочастиц различных типов и клеток.

Но для этого необходимо создавать специальные устройства с набором микроэлектродов.

57

4.1.3. Диэлектрофорез клеток

Клетки, находящиеся в электролите, благодаря наличию на своей поверхности элек-

трического заряда притягивают противоионы из окружающей среды, которые стремятся при-

близиться к ионизированным группам клеточной мембраны за счет межмолекулярного взаи-

модействия. Но диффузия и тепловое движение молекул не позволяет образовываться боль-

шим скоплениям противоионов вокруг клетки. Вблизи поверхности клетки сила электроста-

тического притяжения преобладает так, что противоионы и диполи воды образуют двойной

электрический слой. Поэтому вокруг клетки ионы статически распределяются таким образом,

что вблизи поверхности число противоположно заряженных ионов в среднем (по времени)

будет больше, а число одноименно заряженных – меньше, чем в окружающей среде, в которой

их концентрации равны. Вокруг частицы образуется ионная атмосфера с избыточным диф-

фузным зарядом, который является наружной оболочкой двойного слоя. Толщина двойного

электрического слоя частицы зависит от ионной силы раствора. Однородное электрическое

поле приводит к деформации двойного электрического слоя клетки. Так как частица и окру-

жающая ее среда различаются по электрическим характеристикам (по проводимости и ди-

электрической константе), то при воздействии электрического поля на границе раздела двух

фаз скапливаются наведенные электрические заряды. Происходит вынужденная поляризация

клетки из-за различия ее электрических характеристик и окружающей среды. Смещение

двойного электрического слоя и образование заряда на границе раздела фаз придают клетке

свойства электрического диполя, величина которого значительно больше, чем у диполей обра-

зующихся на небольших молекулах. Величина диполя зависит от расстояния между противо-

положно заряженными частями частицы, даже при небольшом разделенном заряде дипольный

момент достигает больших величин из-за размеров клетки.

При решении ряда задач возникает необходимость разделения живых и мертвых

клеток. Для мертвой клетки или клетки с малым емкостным сопротивлением мембраны

(это случается при повреждении мембраны, например вирусами) электрическое поле сво-

бодно проникает внутрь клетки. Цитоплазма клетки, содержащая больше солей и веществ,

имеет более высокую проводимость, чем окружающая среда. В проводящей среде проис-

ходит более сильная поляризация клетки, а индуцируемый дипольный момент противопо-

ложен полю. Направление движения такого диполя определяется полем большей напря-

женности. В результате мертвые клетки движутся по направлению электрического поля.

При помещении живой клетки в электрическое поле неповрежденная мембрана является

барьером для проникновения поля внутрь клетки. Значительный вклад в общий дипольный

момент вносит смещение двойного электрического слоя вокруг клетки – дипольный мо-

мент клетки совпадает с направлением поля. Направление движения диполя осуществляет-

ся из области высокой напряженности поля в область низкой напряженности, против

направления силовых линий поля.

Электроротация используется для выяснения электрических характеристик клетки,

которые зависят от внешних воздействий и по изменению которых можно судить о физио-

логическом состоянии клетки. Эта техника может быть использована, например, для био-

логического тестирования загрязненности окружающей среды. Если поместить клетку в

неблагоприятную для нее среду, то клетка реагирует на это изменением метаболизма, что

приводит к изменению дипольного момента и влияет на характер движения клетки в элек-

трическом поле. Явление электроротации также можно использовать для выявления спе-

цифичности белков, антител и других биологических молекул.

При диэлектрофорезе происходит нагревание жидкости, в которой осуществляется

процесс разделения частиц. В случае биологических частиц важно контролировать и

управлять температурой среды, так как значительный нагрев может привести к поврежде-

нию и разрушению частиц.

58

Итак, достоинствами диэлектрофореза являются: простота метода и возможность

создания любых конструкций с электродами любой формы, простота управления градиен-

том поля и использование относительно низких напряжений. Среди недостатков следует

выделить следующие: необходимость подбора среды с требуемыми свойствами (проводи-

мостью), контакт образца с электродами и неизбежный нагрев в процессе разделения.

4.2. Управление движением частиц с помощью световых полей

4.2.1. Фотофорез

Профессор Феликс Эренхафт (Ehrenhaft) наблюдал и изучал движение частиц

пыли, взвешенной в воздухе, под воздействием светового потока от мощной лампы.

Некоторые частицы двигались навстречу световому потоку, что нельзя было объяс-

нить действием светового давления. Эренхафт назвал это явление фотофорезом (Pho-

tophoresis). При поглощении света частицей происходит перераспределение электро-

магнитной энергии по объему частицы. Внутри частицы возникают источники тепло-

вой энергии, неоднородно нагревающие частицу. Молекулы газа (воздуха), после со-

ударения с частицей отражаются от нагретой стороны частицы с большей скоростью,

чем от холодной. В результате этого частица получает нескомпенсированный им-

пульс, направленный от горячей стороны частицы к холодной. В зависимости от раз-

меров, формы, оптических свойств материала частицы более горячей может оказаться

как освещенная, так и теневая сторона частицы. Поэтому может иметь место движе-

ние навстречу световому потоку и от него (отрицательный и положительный фото-

форез) (рис. 18). Если поток неоднороден по сечению, то может возникнуть и попе-

речное относительно направления распространения электромагнитного излучения

движение частицы в газе. Эффект изучался в ряде работ, но первоначально не имел

практического применения. Появление и широкое внедрение лазеров вновь вызвало

интерес к этому явлению.

Теоретические методы, используемые при выводе выражений для фотофоретиче-

ской силы и скорости фотофореза частиц, основанные на кинетической теории газов,

предполагают, что радиус частицы a во много раз меньше длины свободного пробега ,

т.е. частица является «малой». В случае «крупных» частиц (малых чисел Кнудсена) теория

фотофореза строится на основе гидродинамического метода (совместно решаются уравне-

ния гидродинамики и уравнения переноса тепла). При малых числах Рейнольдса уравнение

гидродинамики заменяется лианеризованным уравнением.

С другой стороны, в зависимости от размера частиц может иметь место релеев-

ское рассеяние света или рассеяние Ми (Mie), что также оказывает влияние на фото-

форез частиц.

В ходе изучения фотофореза были предложены многочисленные варианты его при-

менения: разделение частиц в жидкости, оптическая левитация частиц в вакууме и в газе,

захват, удержание и перемещение частиц в лазерном луче и т.д.

59

Рис. 18. Фотофорез частиц: а – прямой фотофорез – отклонение частицы из-за импульса фотона;

б – положительный фотофорез (для частиц с высоким поглощением); в – отрицательный фотофорез

(для частиц с малым поглощением)

4.2.2. Принципы лазерного фотофореза

Сила рассеяния радиационного давления (результат рассеяния и/или поглощения света

частицей) редко используется для целей миграционного анализа микрочастиц, хотя Эшкин

(Ashkin) открыл существование такого явления в 1970 г. Эта сила позволяет осуществить ми-

грацию любых частиц, имеющих показатель преломления, отличный от такового среды окру-

жения. Другая особенность лазерного фотофореза – то, что этот процесс позволяет обеспечи-

вать перемещение индивидуальных частиц к биологическим объектам и/или непосредственно

в них. Кроме того, если частица поглощает свет, наблюдаются некоторые экстраординарные

эффекты поведения из-за повышения температуры частицы и окружающей жидкости при фо-

тотепловом конверсионном процессе. Фототепловой эффект дает дополнительный способ фо-

тофоретического разделения светопоглощающих частиц. Лазерный фотофорез является пер-

спективным методом изучения характеристик и свойств отдельных микрочастиц, а также для

перемещения и разделения микрочастиц в жидких и газообразных средах.

Если на частицу падает световой поток с гауссовым распределением интенсивно-

сти, то фотофоретическая сила, оказывающая действие на сферическую частицу, находя-

щуюся в центре потока, определяется соотношением:

Qc

PnrFP 2

22

,

где P – мощность падающего излучения, n – показатель преломления частицы, r – радиус

частицы, c – скорость света в вакууме, – радиус светового потока лазера в плоскости

нахождения частицы, Q – безразмерный коэффициент фотофоретической эффективности.

Коэффициент Q представляет долю падающего потока, которая идет на образование фото-

форетической силы. Для случая потока, падающего на полностью отражающую или пол-

ностью поглощающую свет сферическую частицу Q=1. Для оптических сил, действующих

на маленькие диэлектрические частицы, Q может варьироваться от 0.03 до 0.1.

60

Если сферическая твердая частица в жидкости под действием фотофоретической

силы движется со скоростью v, то она подвергается противодействию сил вязкости среды.

При состоянии равновесия, фотофоретическая скорость частицы в жидкой среде может

быть выражена как:

2

3

2

c

nPQrv .

Из уравнения следует, что различие в размерах частиц ведет к различной скорости их пе-

ремещения, что может использоваться для их разделения по размерам. Важно оценить ве-

личину Q для интересующей частицы, чтобы анализировать и предсказывать фотофорети-

ческую скорость частиц. Происхождение лучевой силы – передача импульса света к ча-

стице из-за отражения, преломления и поглощения лазерного света частицами, то есть рас-

сеивания света частицами. Предложены два способа вычислений величины Q: методами

лучевой оптики для прозрачных частиц и теории рассеяния Ми. Однако, для лучевой оп-

тики затруднительно учитывать эффекты поглощения частицей света. В теории рассеяния

Ми, падающий световой поток представлен как электромагнитная волна, и взаимодействие

между лучом и сферической частицей определяется уравнениями Максвелла, что позволя-

ет оценить влияние длины волны лазера и светового поглощения на величину Q.

4.2.3. Оптофорез

При взаимодействии оптического излучения с частицей величина воздействующей

силы зависит от физических свойств частицы (например, показателя преломления, матери-

ала частицы, морфологии и размера). Оптофорез (Optophoresis) – неразрушающая методи-

ка анализа частиц (в том числе – живых клеток), основанная на взаимодействии частиц с

градиентом оптических полей, обычно создаваемых лазерным излучением. Эта методика

предполагает измерение движения или изменения в движение частицы в градиенте поля.

Некоторые оптофоретические методы измерения были развиты и применены для анализа

клеток в стеклянных микрочипах.

Разновидностью оптофоретических методов является время пролетный оптофорез

(Time-of-flight optophoresis – TOF optophoresis) в микрофлюидном устройстве, при котором

измеряется время прохождения частицей заданного расстояния с и без лазерного излуче-

ния. Эта технология позволяет сортировать различные частицы (клетки) без специфичных

маркеров и красителей. Система, в которой был использован стеклянный микрофлюидный

чип с каналами шириной 50 мкм, глубиной 20-25 мкм, испытана при анализе и разделении

здоровых и злокачественных раковых клеток. Наблюдалось, что при движении биологиче-

ских объектов (живых клеток) в световом потоке от лазера различия в скорости движения

частиц в канале микрочипа связаны с ее биологическими свойствами. Техника время-

пролетного оптофореза, выполненная в канале микрофлюдного чипа, иллюстрируется

рис. 19. Три одинаковых области: PI, P2 и P3 регистрируются отдельными фотодатчи-

ками, позволяющими обнаружить присутствие и положение частиц, движущихся в кана-

ле. Градиент оптического поля от сфокусированного лазерного луча (в ближней инфра-

красной области) создается между второй (P2) и третьей (P3) областью. Лазерный луч

фокусируется в микроканале по оси z. Время прохождения частицы из позиции (PI) к

(P2) определяется как t1, а время прохождения от позиции (P2) к (P3) – как t2. В отсут-

ствии градиента оптического поля и в случае стабильного потока t2 = tl. Когда градиент

присутствует, силы, действующие на частицу, изменят время прохождения t2. Луч лазера

с небольшой мощностью освещает центр канала по направлению движения потока, так,

61

что только частицы, движущиеся в центре канала и освещенные этим лучом, регистри-

руются фотодатчиками. В случае, изображенном на рис. 19, только частица К1 будет об-

наружена, в то время, как частица К2, будет игнорироваться. Отметим, что маломощное

лазерное освещение не производит никакого существенного оптического воздействия на

частицу по сравнению с мощным ИК лазерным излучением. Также на рис. 19 показаны

силы, действующие на частицу.

Рис. 19. Принцип время-пролетного оптофореза. Градиент оптического поля (в ИК-области спектра)

формируется между областями Р2 и Р3. Маломощный световой поток лазерного излучения

для «подсветки» частиц создается по центу канала в направлении движения потока

В октябре 2000 г. для разработки оптических технологий и методов анализа клеток

была сформирована компания Genoptix (Сан Диего, США). Genoptix создала технологиче-

скую платформу для исследования биологических свойств живых клеток без маркеров,

меток и т.п., основанную на методе оптофореза. Оптофорез считается единственной тех-

нологией, способной одновременно анализировать и разделять клетки, основываясь на

фундаментальном различии откликов разных клеток. Эти технологии предполагают новые

подходы при изучении биологических систем в фармацевтических исследованиях, клини-

ческой диагностики, биотерапевтических исследованиях.

Итак, достоинствами оптофореза являются возможности: измерять микрочастицы и

клетки в их естественном состоянии; идентифицировать и сортировать микрочастицы и клет-

ки в режиме реального времени; изучать взаимодействие клеток с другими частицами (напри-

мер, с лекарствами); осуществлять неоднократные измерения на одном и том же образце.

4.2.4. Оптический пинцет

Американский физик А. Эшкин предложил конструкцию лазерной ловушки для

нейтральных частиц, позднее реализованную исследователями из Стенфордского Универ-

ситета под руководством профессора Стивена Чу, которым удалось создать установку для

перемещения микрообъектов. Идеология, воплощенная в этих установках получила назва-

ние laser (optical) tweezers – лазерный (оптический) пинцет.

62

Идея оптического пинцета основана на силе, возникающей в сфокусированном све-

товом луче, которая позволяет удерживать и перемещать микроскопические количества ве-

щества. При фокусировке лазерного излучения линзой с большой числовой апертурой ча-

стица захватывается вблизи фокальной точки градиентной силой, известной как оптический

пинцет. В то же время, если поток не сфокусирован, частица движется вперед силой рассея-

ния радиационного давления (фотофорез). В случае падения фотона на непрозрачную (по-

глощающую или отражающую) поверхность ей сообщается импульс, т.е. поверхность испы-

тывает световое давление. Если осветить лазером прозрачную частицу, то световой пучок

преломляется на ней, т.е. изменяется направление вектора скорости света и, следовательно,

направление импульса. При этом возникает изменение силы, которое подействует на части-

цу так, что она будет двигаться в сторону наибольшей интенсивности лазерного пучка. Ин-

тенсивность лазерного пучка максимальна на его оси и плавно спадает к краям. Поэтому ча-

стица удерживается на оси пучка, а при фокусировке пучка линзой она "втягивается" в точку

фокуса и оказывается "пойманной" в трех измерениях (рис. 20). Чтобы создать силы, спо-

собные осуществить такую "трехмерную ловушку", требуется излучение мощностью поряд-

ка нескольких милливатт. Размер захваченных частиц может колебаться от долей длины

волны до нескольких десятков микрометров. Перемещением фокуса можно передвигать ча-

стицы, выстраивая из них самые разнообразные конструкции.

Технология оптического пинцета хорошо изучена и широко используется для за-

хватывания, поднятия или манипуляции с микрочастицами или биологическими объекта-

ми в жидких средах.

Вычисление сил захвата в лазерном пинцете может быть выполнено в рамках гео-

метрической оптики или с помощью электромагнитной теории света. В первом случае

объекты должны иметь размер >10 (длин волн лазерного излучения), для частиц имею-

щих размер меньший, чем длина волны, используется электромагнитное приближение.

Оптический пинцет обладает рядом недостатков. Во-первых, чем сильнее стянут

пучок в фокус, тем быстрее он расходится после него. Это означает, что сила, удерживаю-

щая частицу, быстро падает по мере удаления от зоны захвата, и уже на расстоянии не-

сколько десятков микрон от фокуса оказывается недостаточной, чтобы снова захватить ча-

стицу. Однопучковая ловушка эффективна лишь для захвата одиночной частицы в области

фокуса. Во-вторых, лазерный пучок после взаимодействия с объектом будет отличаться от

исходного из-за дифракции, преломления, отражения и поглощения, что также ограничи-

вает расстояние, на котором он может действовать как оптический пинцет. Кроме того,

влияние оказывает расходимость светового потока: чем сильнее он расходится, тем хуже

его фокусирует оптическая система, а получить идеально параллельный пучок принципи-

ально невозможно из-за дифракции.

В 1987 г. физики Дж. Дарнин, Дж. Майсели и В. Эберли показали, что существует

класс световых пучков, фактически свободных от дифракции. Их проекция на экран вы-

глядит как яркое пятно, окруженное системой концентрических колец (такое распределе-

ние интенсивности описывает цилиндрическая функция Бесселя, и поэтому сами пучки

называют бесселевыми). Существуют технические способы превращения гауссова пучка в

бесселевый, основанные на использовании конических линз, голограмм или простран-

ственных модуляторов света. Бесселеву пучку присущи полезные свойства, которые ис-

пользуются для оптического пинцета – среди которых способность пучка захватывать ча-

стицы, разнесенные на расстояние до нескольких мм.

Новые возможности открывает техника оптического пинцета перед химиками, био-

логами и биофизиками, поскольку принципы захвата атомов применимы к частицам мик-

ронных размеров, например, полистирольным шарикам, которые можно присоединить к

одиночным молекулам. Профессор С. Чу изучал таким способом мышечное сокращение на

молекулярном уровне, упругие свойства ДНК и другие биополимеры. При экспериментах

63

с отдельными молекулами ДНК, обычно концы молекул химически модифицируют, и

один из них фиксируется на поверхности или микрочастице полимерного носителя. Вто-

рой присоединяется к поверхности полимерной частицы, но не фиксируется, и с незакреп-

ленным концом производят эксперименты, удерживая его оптическим или магнитным

пинцетом. Это дает возможность прилагать к индивидуальным молекулам ДНК внешнюю

силу. В результате были изучены структурные переходы двойной спирали ДНК.

Рис. 20. Преломление света диэлектрической частицей и силы, действующие на нее:

а – при несимметричном освещении возникает сила, в результате которой частица оказывается

в центре лазерного пятна, где удерживается за счет компенсации действующих сил (б)

При воздействии на биологические объекты важно, чтобы частица, которая будет

поймана в ловушку, являлась прозрачной для лазерного излучения, поскольку поглощение

света приводит к нагреву и, следовательно, к оптическому повреждению образца. Биоло-

гические частицы хорошо поглощают излучение в ультрафиолетовом и видимом спек-

тральном диапазоне поэтому, для захвата биологического материала часто выбирается об-

ласть ближнего инфракрасного диапазона (700-1300 нм), так как дальний инфракрасный

диапазон поглощается частицами воды.

Сочетая метод оптического пинцета с использованием других лазерных пучков,

можно, например, захватить отдельную частицу и разрезать ее на кусочки для дальнейше-

го анализа. Для захвата частиц часто применяют инфракрасное излучение с длиной волны

λ=1,064 мкм, а вторую гармонику этого излучения – зеленый свет (λ=0,532 мкм) – можно

использовать для разрезания частиц: биологические объекты почти прозрачны в инфра-

красной области, но поглощают зеленый свет.

Для успешного использования «лазерного пинцета» необходимо точно подбирать

мощность излучения, создающую необходимую силу захвата. Воздействие лазерного из-

лучения приводит к изменениям, происходящим в биологических микрообъектах, что тре-

бует особого тщательного изучения. В литературе приводятся достаточно скудные данные

о зависимости силы захвата от мощности лазерного излучения и о влиянии излучения на

биологические объекты.

Микрочастицы, захваченные в фокусе лазерного луча, имеют склонность вращать-

ся. Угловой момент вращения может быть обусловлен как самим светом (поляризация, фа-

64

зовая структура), так и свойствами захваченной частицы. Используя этот эффект можно

измерить упругость скручивания молекулы ДНК, измерять микроскопическую вязкость,

манипулировать микроскопическими объектами.

К достоинствам методов управления движением частиц с помощью световых по-

лей следует отнести высокую эффективность их воздействия на частицы и простоту ре-

ализации методов в микрочиповых устройствах. Наиболее привлекательными для ре-

шения целого ряда задач являются комбинированные методы, использующие, напри-

мер, диэлектрофорез и технику оптического пинцета, диэлектрофорез и фотофорез (или

оптофорез).

Одной из проблем, возникающей при применении оптического пинцета, является

недостаточная изученность влияния лазерного излучения на биологические объекты, что

создает трудности при использовании излучения для управления и анализа биочастиц.

Световые поля могут вызывать фототепловой эффект, который может приводить к силь-

ному нагреву и к повреждению образца. Поэтому, важно учитывать этот эффект, соответ-

ствующим образом выбирая длины волн и мощность воздействующего излучения. С дру-

гой стороны, фототепловой эффект, так или иначе оказывает дополнительное влияние на

частицы, что также следует учитывать, например, в случае фотофоретического разделения

частиц. Трудности возникают при использовании техники оптического пинцета для мани-

пуляций с объектами, размеры которых меньше длины волны зондирующего излучения.

Существуют также ограничения, определяющие минимальный диаметр светового пятна

при фокусировке лазерного излучения.

4.3. Управление движением частиц с помощью магнитных полей. Магнитофорез

Магнитная сортировка и извлечение частиц носит название – магнитофорез

(Magnetophoresis). В основе этого процесса лежит явление направленного движения частиц

с магнитными свойствами в магнитном поле.

В 1950 году Крик и Хьюис сообщили о демонстрации технологии магнитного пин-

цета в биологии. Они использовали малые магнитные частицы в комбинации с постоян-

ными магнитами для тестирования физических свойств клеток. С тех пор макроскопиче-

ские и микроскопические магнитные пинцеты широко используются благодаря своим низ-

кой стоимости и разносторонним возможностям. Они применяются, в частности, для пе-

ремещения феррожидкостей, для тестирования среды, окружающей клетку.

Комбинируя множества магнитов, можно создавать сложные магнитные поля

даже в размере микрона. В этом контексте важно дифференцироваться между гомоген-

ными и неоднородными магнитными полями. В гомогенном магнитном поле плотность

линий потока постоянна, нет градиента в плотности потока, а в неоднородном магнит-

ном поле – градиент в плотности линий потока по расстоянию x. Неоднородные обла-

сти с высокими магнитными полевыми градиентами желательны, когда необходимо за-

манить в ловушку частицы или транспортные материалы в пределах малых объемов

жидкости. В практике применяются магниты разной формы или даже слоистые струк-

туры (рис. 21).

65

Рис. 21. Магнитные поля постоянных NdFeB магнитов (http://www.femm.foster-miller.net):

a – гомогенное поле на расстоянии 1 мм от поверхности магнита; b – неоднородное поле

на расстоянии 100 мкм от игольчатого магнита; c – магнитное поле с локальными минимумами

и максимумами на 100 мкм расстоянии, чередование железных и алюминиевых блоков

Существуют магниты двух разных видов: постоянные магниты, изготовляемые из

«магнитно-твердых» материалов и электромагниты с сердечником из «магнитно-мягкого» же-

леза. Если в первом случае магнитные свойства не связаны с использованием внешних источ-

ников или токов, то во втором случае создаваемые магнитные поля обусловлены тем, что по

проводу обмотки, охватывающей сердечник, проходит электрический ток. Постоянные маг-

ниты сохраняют магнитные свойства, при удалении внешнего поля намагничивания.

По своим магнитным свойствам все вещества можно разделить на три класса в за-

висимости от их магнитной восприимчивости . К первому относятся вещества с резко

выраженными магнитными свойствами, подобными свойствам железа – ферромагнитные,

их магнитное поле заметно на значительных расстояниях. Во второй класс попадают ве-

щества, называемые парамагнитными, магнитные свойства их в общем аналогичны свой-

ствам ферромагнитных материалов, но гораздо слабее. К последнему, третьему классу от-

носятся так называемые диамагнитные вещества. Они отталкиваются электромагнитом,

т.е. сила, действующая на диамагнетики, направлена противоположно той, что действует

на ферро- и парамагнетики.

Магнитная восприимчивость вещества или среды характеризует связь между намагни-

ченностью вещества М и напряженностью магнитного поля Н в этом веществе: H

M . Часто

пользуются также дифференцированной магнитной восприимчивостью = dM/dH.

Диамагнитные материалы (<0) ослабляют магнитное поле. Большинство материалов

– слабо диамагнитные, включая воду, белки, ДНК, клетки, полимеры, древесину и стекло.

Иногда такие материалы называют немагнитными. Отрицательная намагниченность, свя-

занная с диамагнетизмом обычно невелика (=10-8–10-4). В отсутствии внешнего магнитного

поля молекула не обладает магнитным моментом: магнитные моменты диамагнетиков вза-

имно скомпенсированы. Под действием магнитного поля электроны в заполненных элек-

тронных оболочках начинают прецессировать (электронная прецессия – может быть рас-

смотрена как круговой ток), а их движение электрического заряда вызывает магнитное поле,

которое по правилу Ленца направлено так, чтобы уменьшить воздействие внешнего поля.

66

Парамагнитные материалы (>0) усиливают магнитное поле и испытывают не-

большие силы при воздействии магнитных полей. Примеры парамагнитных материалов:

кислород, платина и т.д. Парамагнетизм обусловлен неспаренными электронами, их соб-

ственный магнитный момент (спин) не уравновешен, спины же спаренных электронов

направлены в противоположные стороны и уравновешивают друг друга. В магнитном поле

спины стремятся выстроиться по направлению поля, усиливая его. Но этот порядок может

нарушаться тепловым движением. Т.е. парамагнитная восприимчивость зависит от темпе-

ратуры – чем ниже температура, тем выше значение m. В простейшем случае это выража-

ется зависимостью, которая называется законом Кюри:

T

C или законом Кюри-Вейсса:

T

C,

где С – константа Кюри, – поправка Вейсса.

Диа- и парамагнетики слабо реагируют на внешнее магнитное поле. Но существуют

вещества, способные сильно намагничиваться даже в небольших полях – ферромагнетики.

Ферромагнитные материалы (железо, кобальт и никель) имеют >>0 и значительно

усиливают внешнее магнитное поле. Зависимость намагниченности M от напряженности

магнитного поля H у ферромагнетиков оказывается нелинейной, т.к. магнитная восприим-

чивость у ферромагнетиков не является константой и зависит от H ( достигает 104 – 105).

Степень намагничивания ферромагнитного вещества можно характеризовать не только

вектором намагниченности М, но и величиной магнитного поля в данном веществе (векто-

ром магнитной индукции В):

MHB 0 .

В случае, когда намагниченность М пропорциональна Н ( HM ):

HHB 00 1 ,

=(1+) – магнитная проницаемость вещества, 0 – магнитная постоянная.

Другой случай парамагнетизма – суперпарамагнетизм. Суперпарамагнитные частицы

имеют ядро маленьких железных окисных кристаллов, заключенных в оболочку полимера.

Частицы намагничиваются магнитным полем. Однако, они не имеют никакой магнитной

памяти. Как только внешнее поле удалено, частицы повторно рассеиваются и ведут себя

подобно немагнитному материалу.

Постоянные магниты, используемые в микрофлюидике – обычно небольших разме-

ров из сплава (Nd-Fe-B) с высоким удельным магнитным потоком у поверхности полюса.

Это позволяет осуществлять манипуляции с магнитными частицами или клетками внутри

микроканала, даже если магнит помещен на расстоянии в несколько мм от канала.

Проблема, связанная с применением электромагнитов – значительные размеры и

большое количество джоулева тепла, выделяемое при работе.

Для транспортировки пробы в микрофлюидике используются магнитные частицы с

размерами от несколько нм до сотен мкм. Большинство таких частиц – суперпарамагнит-

ные, то есть они не имеют магнитной памяти. Коммерчески доступными являются также

различные типы магнитных частиц с модифицированной поверхностью. Некоторые ком-

пании предлагают магнито- меченные биомолекулы (www.dynalbiotech.com,

www.micromod.de, www.bangslabs.com, www.polysciences.com, www.seradyn.com,

www.estapor.com ).

http://www.micromod.de/

http://www.seradyn.com/

67

Магнитные жидкости или феррофлюиды – другой класс материала, который мо-

жет использоваться в микрофлюидных устройствах. Феррофлюид – устойчивая добавка

магнитных наночастиц в жидкость типа воды или органического растворителя. Частицы

покрыты специальным материалом, чтобы предотвращать их скопление. Феррофлюиды

могут быть перемещены через каналы и принимать любую геометрию. Даже в интенсив-

ных магнитных полях они сохраняют текучесть.

4.3.1. Основные принципы магнитофореза

Потенциальная энергия частицы объемом V и объемной магнитной восприимчиво-

стью p под действием магнитного поля B может быть выражена как:

2

02VBU

mp

,

где 0 – вакуумная магнитная проницаемость, m и p – объемная магнитная восприимчи-

вость среды и частицы.

Магнитная сила, действующая на частицу:

BBVgradUF mp )(

.

Если сферическая частица движется в жидкости, то она испытывает силу сопротив-

ления (Стокса), а в случае равномерного движения магнетофоретическая скорость:

BBrvmp

2

09

2

.

Магнитофоретическая скорость непосредственно пропорциональна (p-m), r2, и гра-

диенту магнитного поля (B)B.

4.3.2. Магнитные частицы

Типичная магнитная наночастица, используемая в биологических и медицинских

исследованиях, состоит из магнитного ядра, окруженного немагнитным покрытием для

селективного закрепления биообъекта (например, клетки, белка, или ДНК фрагмента). В

качестве ядра применяются наночастицы диаметром (5-100) нм окиси железа (Fe3O4, -

Fe2O3). Кривая намагничивания ансамбля таких супермагнитных частиц должна быть без

гистерезиса (по крайней мере, при не слишком высоких частотах), что является важным

требованием при аналитическом и транспортном применении магнитных частиц.

Большие магнитные частицы (0.5-5 мкм в диаметре) могут иметь отдельное магнитное яд-

ро или ядро из нескольких магнитных взаимодействующих наночастиц в немагнитной

матрице (рис. 22, a). Такие частицы имеют гистерезисную характеристику намагничивания

(рис. 22, b). Это означает, что после удаления поля они держат намагничивание отличное

от нуля Mrem, приводя к кластерам магнитных бусинок (группировке) (рис. 22, c).

68

Рис. 22. Магнитные наночастицы и их свойства

Во многих применениях, магнитно-меченный материал отделяется от жидкости при

пропускании смеси через область с градиентом магнитного поля.

Рассматривая частицу радиуса r в жидкой среде, движущуюся под действием пото-

ка, и предполагая, что магнитное поля вызывает силу, при которой частица может проти-

востоять этому потоку (остановлена магнитной силой, что соответствует максимальной

величине скорости, которая может быть вызвана магнитной силой в статической жидко-

сти), для скорости частицы можно получить:

BB

BBrv

00

2 1

9

2,

где

r

Vr

69

2 2

– магнитофоретическая подвижность частицы, характеризующая

способность движения частицы под действием магнитного поля

4.3.3. Применения магнитофореза

А. Феррофлюидные материалы могут использоваться при создании магнитных

насосов для прокачки жидкости. Пример конструкции такого насоса приведен

на рис. 23. В микрофлюидный канал введена магнитная жидкость, часть которой рас-

полагается напротив неподвижного магнита М. Второй магнит двигается по окружно-

сти, вовлекая в движение часть феррофлюидной жидкости, которая, в свою очередь,

двигает жидкость в канале. Таким образом осуществляется циклическая прокачка

жидкости в канале.

Б. Магнитные поля могут применяться при транспортировке магнитных частиц

в микроканалах. Магнитные частицы перемещаются от одного полевого максимума до

следующего. В первых микрофлюидных конструкциях, проба с микрочастицами пе-

ремещалась по каналу последовательным переключением нескольких внешних элек-

тромагнитов, тот же самый принцип использовался в меньшем масштабе, чтобы

транспортировать частицы вдоль перемещающихся проводов из проводящего матери-

ала (золота) (рис. 24, a). Магнитные поля с выраженными максимумами были получе-

ны с пилообразной формой электродов, изготовленных из золота (рис. 24, b). Пере-

ключая ток между проводами с некоторой частотой можно перемещать частицу от од-

ного элемента к другому со скоростью в несколько десятков мкм в сек. Петли и ре-

шетки из проводов также могут быть применены для перемещения магнитных частиц

размером около нескольких мкм (рис. 24, с).

69

Рис. 23. Принцип действия феррофлюидного насоса

Рис. 24. Транспортировка магнитных частиц путем изменения электромагнитных полей во времени

Г. Микрофлюидный чип с H-топологией каналов может использоваться для маг-

нитного разделения частиц. Примеры таких конструкций приведены на рис. 25. Включе-

ние и выключение электромагнитов А и Б приводит к перераспределению частиц между

каналами, и таким образом могут быть отделены и изолированы выбранные частицы. Дру-

гое устройство с двумя входными каналами, переходящими в более широкий канал, кото-

рый разветвляется в два выходных канала, предложено для разделения магнитных частиц

(рис. 25, b). Поток с частицами вводится в одно из входных отверстий, а в другое – буфер,

потоки выводятся через противоположные отверстия. Без магнитных сил эти два потока

оставались несмешанными и выходили через соответствующие выходные каналы. Гради-

ент магнитного поля вызывал отклонение магнитных частиц в «нижний» канал с буфер-

ным раствором, а немагнитные следовали по начальной траектории.

70

Рис. 25. Конструкции микрофлюидных чипов с H-топологией: a – для изоляции частиц

в отдельные потоки и b – для непрерывного разделения частиц

Д. Непрерывный метод разделения в потоке, позволяющий отделить магнитные ча-

стицы от немагнитных или отделить различающиеся магнитные частицы от друг друга,

назван магнитофорез в свободном потоке на чипе. Ламинарный поток смеси частиц бу-

ферным раствором переносится в камеру, где создан градиент магнитного поля перпенди-

кулярно к направлению потока (рис. 26, а). Немагнитные частицы в магнитном поле не

меняют траекторию, а магнитные частицы, меняя траекторию, перемещаются к другим

выходным каналам (рис. 26, b). Отклонение частицы зависит от ее магнитной восприимчи-

вости и размера. Магнитофоретическая скорость пропорциональна объемной магнитной

восприимчивости микрочастицы. Следовательно, измеряя скорость можно определять

магнитную восприимчивость, и получать большее количество информации.

Рис. 26. Принцип магнитофореза в свободном потоке

71

4.4. Электромагнитофорез (Electromagnetophoresis)

Электромагнитофорез – явление, при котором частицы в растворе электролита ми-

грируют в перпендикулярном направлении и к магнитному полю и электрическому току

при пропускании электрического тока через жидкость. Общая концепция электромагнито-

фореза – применение силы Лорентца для анализа перемещения.

Если ток плотностью j течет через проводящую жидкость объема V перпендикулярно к

магнитному полю, жидкость испытывает действие силы Лорентца:

HjVF 0 ,

где 0 – вакуумная магнитная проницаемость, – магнитная проницаемость жидкости и H

– напряженность магнитного поля.

Если сила, проявляющаяся в жидкости равна силе действующей на частицу, то пе-

ремещения нет, но различие сил вызывает перемещение частиц. Силы, действующие на

частицу (рис. 27) называются электромагнитным весом (EMW) и электромагнитной пла-

вучестью (EMB). Сила электромагнитофореза, действующая на частицу в закрытой ячейке

с внутренней площадью S:

S

iBVFFF

fP

fP

EMBEMWEMP

22 ,

где B – магнитная плотность потока, p – электрическая проводимость частицы, f – элек-

трическая проводимость среды, и i – сила тока. Электромагнитофоретическая скорость

(VEMP) сферической частицы в жидкости выражается:

Wfp

fp

EMPCS

iBrv

2

29

4

,

где – вязкость жидкости, r – радиус сферической частицы и Cw – коэффициент вязкости

у поверхности канала.

Рис. 27. Силы, действующие на частицу в электрическом и магнитном полях

72

5. АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБ

В этом разделе будут рассмотрены некоторые методы и приборы для анализа био-

логических проб в которых применяются отдельные устройства, элементы и системы, со-

зданные с применением микро- и нанотехнологий.

5.1. Сенсоры и биосенсоры

5.1.1. Состав и принцип работы сенсора. Мультисенсорные системы

Сенсоры химические (от лат. sensus – чувство, ощущение) – чувствительные эле-

менты небольших размеров, генерирующие аналитический сигнал, зависящий от концен-

трации определяемого компонента в анализируемой смеси.

Химические сенсоры предназначены для прямого определения искомого вещества в

заданном диапазоне содержаний при фиксированных способах введения пробы и обработ-

ки полученной информации. Они могут входить в состав аналитических приборов или

других контрольно-аналитических систем, содержащих устройства для ввода пробы, обра-

ботки сигнала и выдачи информации о концентрации определяемого компонента. Досто-

инствами таких приборов являются малые размеры и масса, небольшая потребляемая

мощность, способность работы в автоматическом автономном и непрерывном режиме.

Обычно в состав сенсора входят (рис. 28):

распознающий элемент (рецепторный слой) – вещество, способное селективно вза-

имодействовать с аналитом;

трансдьюсер (англ. transducer – преобразователь, датчик) – преобразователь хими-

– ческого или биологического взаимодействия в электрический сигнал;система сбора

и обработки данных.

Рис. 28. Состав сенсора

73

По принципу работы и в зависимости от вида аналитического сигнала выделяют

электрохимические (потенциометрические, вольтамперометрические, кулонометрические,

кондуктометрические), оптические (фотометрические, люминесцентные и др.), электриче-

ские сенсоры, а также сенсоры, чувствительные к изменению массы и других характери-

стик.

В основу работы электрохимических сенсоров положены превращения определяе-

мого компонента в электрохимической ячейке, вырабатывающей аналитический сигнал.

В оптических сенсорах осуществляется измерение поглощения или отражения све-

тового потока, люминесценции или теплового эффекта при поглощении света.

К электрическим сенсорам относятся полупроводники с электронной проводимо-

стью, органические полупроводники и полевые транзисторы. Измеряемыми величинами

являются проводимость, разность потенциалов, заряд или емкость, изменяющиеся при

воздействии определяемого вещества.

Действие сенсоров, чувствительных к изменению массы, основано на изменении

частоты колебаний пьезореэлементов или скорости распространения акустических волн

при селективной сорбции определяемого вещества на электродах или на чувствительной

поверхности.

В настоящее время уделяется внимание созданию интеллектуальных сенсорных си-

стем (электронный нос и электронный язык), основанных на принципах, сходных с орга-

низацией биологических систем – массивов неспецифичных рецепторов с распознаванием

образов с помощью аналогов нейронной сети.

Электронный язык – аналитический прибор, состоящий из массива неселективных

(перекрестно-чувствительных) химических сенсоров, обладающих перекрестной чувстви-

тельностью к различным компонентам в растворе, в котором используются специализиро-

ванные методы обработки данных – распознавания образов (искусственные нейронные се-

ти, анализ по главным компонентам, нечеткая логика и т.п.) и многомерные калибровки.

Важными характеристиками сенсора являются стабильность отклика и перекрестная чув-

ствительность, которая может быть определена как воспроизводимый отклик сенсора к

максимально большому числу компонентов раствора. Откалиброванная мультисенсорная

система может быть использована для многокомпонентного количественного анализа рас-

творов, а также распознавания (классификации, идентификации) сложных жидкостей раз-

личной природы. Уникальная особенность системы при анализе пищевых продуктов –

возможность установить корреляцию между результатами анализа и человеческим воспри-

ятием вкуса.

Разновидностью химических сенсоров являются биосенсоры – компактные устрой-

ства/приборы, содержащие анализирующий элемент биологической природы (биорецеп-

тор), работа которого основана на использовании ферментов, клеток, антител, клеточных

рецепторов и т.д., и который сопряжен с физическим преобразователем, проводящим реги-

страцию сигналов биологического элемента.

Определение по IUPAC: биосенсор – устройство, состоящее из трансдьюсера и

иммобилизованного биологического элемента, в котором определение и идентификация

аналита происходит в два этапа. 1 этап действия биосенсора: “узнавание” биоэлемен-

том специфического для него вещества из многокомпонентной смеси. 2 этап – преобразо-

вание информации о протекании биохимической реакции в форму электрического или дру-

гого (например, оптического) сигнала.

Основная область применения биосенсоров – анализ жидких объектов в медицине,

биотехнологии, пищевой и химической промышленности.

Недостатками биосенсоров являются: невысокая стабильность, трудность получе-

ния биоорганических материалов постоянного состава, чувствительность к действию вы-

соких и низких температур, бактерицидных загрязнений и др.

74

Кроме очевидных требований, предъявляемых к сенсорам, таких как простота экс-

плуатации, дешевизна, высокая точность, долговечность, селективность и скорость анали-

за, добавляются еще требования миниатюризации, возможность работать в непрерывном

режиме, а в некоторых случаях – возможность внедрения в человеческий организм.

Используемые в биосенсорах трансдьюсеры разнообразны. Наиболее часто приме-

няются электрохимические преобразователи, в которых трансдьюсером является электрод,

помещенный в исследуемый раствор. Оптические биосенсоры достаточно часто основаны

на явлениях полного внутреннего отражения, поверхностного плазмонного резонанса, лю-

минесценции. Гравиметрические сенсоры используют изменение массы при связывании

аналита и обычно основаны на акустических волнах или пьезокварцевых микровесах.

Биосенсоры удобно классифицировать как по типу трансдьюсеров, так и по типу

элемента, осуществляющего “биоузнавание”. Типы трансдьюсеров определяются физико-

химическими основами их действия и позволяют разделить биологические сенсоры на ос-

новные категории: электрохимические, оптические и гравиметрические.

5.1.2. Основные аналитические характеристики сенсоров. Иммобилизация биологического материала

Каждый сенсор имеет рабочие диапазоны температур, давлений и pH. Так как сен-

сор измеряет концентрацию аналита, то важными характеристиками являются точность,

воспроизводимость, рабочий диапазон измерений. Чувствительность сенсора показывает

отношение аналитического сигнала к концентрации аналита, вызвавшего этот сигнал. Бо-

лее строго чувствительность определяется как максимальное значение производной вели-

чины отклика по концентрации. Важнейшей характеристикой сенсора является селектив-

ность, она отражает способность детектировать данный аналит в присутствии посторон-

них веществ.

Для количественной оценки селективности используются два основных метода:

построение калибровочных кривых для аналита и для посторонних примесей при

одинаковых условиях эксперимента. При этом селективность выражается как отно-

шение величины сигнала, вызываемого аналитом к величине сигнала, вызываемой

примесью той же концентрации;

в ячейку, содержащую аналит, вводят примеси в концентрациях, которые ожидают-

ся в реальных образцах, а селективность определяется как изменение сигнала в

процентах.

К временным характеристикам сенсоров относятся следующие: время отклика, вре-

мя жизни и время регенерации. Время отклика – время необходимое для возникновения

равновесия между анализируемым образцом и рецепторным слоем. Время жизни – это

длительность воспроизводимой работы сенсора, которая ограничена деградацией рецеп-

торного слоя. Время регенерации – это время, требуемое для восстановления работоспо-

собности распознающего элемента.

Наиболее часто распознающими элементами биосенсоров являются ферменты –

высокоспецифичные катализаторы биохимических реакций. В состав фермента входит од-

на или несколько белковых молекул, иногда присутствует небелковая часть. Каталитиче-

ская активность ферментов значительно выше, чем у любых искусственных катализаторов,

ферменты увеличивают скорость реакции в 103-107 раз.

В некоторых случаях ферменты используются непосредственно в составе тканей

организмов животных или растений (иммобилизованные на электроде ткани грибов). К

биосенсорам на основе тканей идеологически близки устройства с использованием клеток

в качестве распознающих элементов.

75

Биосенсоры, использующие ферменты в рецепторном слое, иногда называют ката-

литическими. Существуют аффинные биосенсоры (affinity biosensors), использующие ан-

титела, нуклеиновые кислоты и рецепторы. В ферментативных сенсорах происходит реак-

ция по общей схеме (рис. 29):

PEESES

Субстрат S связывается с ферментом E, образуя комплекс ES, затем субстрат пре-

вращается в продукт P и высвобождается.

Рис. 29. Реакции в ферментативных (а) и аффинных биосенсорах (б)

В случае аффинных биосенсоров в рецепторном слое происходит реакция вида:

ABBA

В таких реакциях не образуется новых продуктов, а происходит связывание реаги-

рующих молекул в комплекс АВ. Реакции этого типа также называют реакциями непро-

дуктивного связывания. Акт непродуктивного связывания сложнее зарегистрировать.

К аффинным биосенсорам относятся сенсоры на ДНК, на антигены и антитела и сенсоры

с использованием рецепторов.

Антитела – это сложные белковые молекулы, построенные из нескольких субъединиц,

вырабатывающиеся в организмах позвоночных в ответ на проникновение чужеродных агентов

(антигенов), например, токсинов, вирусов или чуждых организму макромолекул. Циркули-

рующие в крови антитела связываются с антигенами, деактивируют их и выводятся из орга-

низма. Кроме того, связанные антитела служат метками для микроорганизмов, подлежащих

уничтожению. Взаимодействие антиген – антитело считается наиболее селективным для

применения в биосенсорах. Это взаимодействие осуществляется теми же по природе силами,

что и взаимодействие фермента с субстратом: вандерваальсовыми силами, ионными, гидро-

фобными и гидрофильными взаимодействиями, водородными связями. Сложность примене-

ния антител в биосенсорах состоит в том, что акт связывания антигена трудно зарегистриро-

вать. Это является общим недостатком аффинных биосенсоров и приводит к необходимости

применения специальных способов, например, использования меток. Другая сложность со-

стоит в том, что аффинные взаимодействия часто имеют высокие значения константы ассоци-

ации, т.е. слабо обратимы, и использующие их распознающие элементы часто являются одно-

разовыми или требуют специальных методов регенерации.

Рецепторы – это мембранные белки, способные связывать определенные лиганды и

вызывать определенный физиологический отклик в ответ на акт связывания. Рецепторы

76

обычно используются в биосенсорах в составе клеток, так как в очищенном виде они недо-

статочно стабильны.

Распознающий элемент биосенсора находится в непосредственном контакте с ис-

следуемым образцом, именно он отвечает за химические и биохимические реакции, проте-

кающие в процессе анализа. Наиболее универсальным направлением развития являются

биосенсоры, использующие антитела, т.к. могут быть изготовлены для связывания чрезвы-

чайно широкого класса веществ. Существенным является закрепление (иммобилизация)

распознающего элемента – биологического материала – на трансдьюсере. Основные тре-

бования, предъявляемые к методам иммобилизации:

а) закрепленный биологический материал должен сохранять свою активность в те-

чение как можно более продолжительного времени;

б) перенос молекул аналита к распознающему элементу не должен быть затруднен,

а если в распознающем элементе осуществляется каталитическая реакция, то должен быть

обеспечен отвод продуктов реакции;

в) метод иммобилизации должен быть применим в достаточно широких диапазонах

температур, значений pH и давлений;

г) метод иммобилизации должен обеспечивать хорошую воспроизводимость.

Основными методами иммобилизации являются (рис. 30):

адсорбция,

включение (внедрение) в полимер, в частности в гель,

сшивка,

ковалентное связывание,

капсулирование или изоляция с помощью мембран.

Адсорбция является наиболее простым методом, практически не требующим подго-

товки компонент сенсора и использования специальных химических реагентов. При физи-

ческой адсорбции частицы удерживаются на подложке под действием сил Ван-дер-Ваальса

(рис. 30, а), которые по своей природе делятся на диполь-дипольные, индукционные и

дисперсионные взаимодействия, а также под действием водородных и ионных связей. По-

лученные методом адсорбции элементы обычно характеризуются низкой чувствительно-

стью и существенной зависимостью от температуры и pH.

Рис. 30. Методы иммобилизации биологического материала

77

Включение биологического материала в полимерную матрицу является универсаль-

ным методом, применимым для разных типов распознающих элементов. Обычно исполь-

зуются такие полимеры, как полиметилметакрилат, крахмал, нейлон, желатин, коллаген и

другие. Если матрица состоит из синтетического полимера, его получение проводится в

присутствии биологического материала. Обычно добавляется сшиватель, чтобы отдельные

полимерные нити объединились в трехмерную сетку. При этом биологически активные

молекулы оказываются захваченными внутрь полимера (рис. 30, б). Достоинством этого

метода является его универсальность; его недостаток в том, что сетка затрудняет диффу-

зию и мешает проникновению аналита. Кроме того, если включаемые в сетку молекулы не

связаны с ней химически, то они могут выходить из нее через поры.

В тех случаях, когда молекулы биологического материала связаны между собой или

связаны с опорной сеткой, говорят о методе сшивки. Фактически сшитые распознающие мо-

лекулы могут использоваться без подложки, если обладают достаточно хорошими механиче-

скими характеристиками (рис. 30, в). Сшивка обычно используется в сочетании с другими ме-

тодами. Например, она может стабилизировать элементы, полученные адсорбцией.

Метод ковалентного (химического) связывания является наиболее распространен-

ным в различных приложениях. Он предполагает создание ковалентной связи между био-

материалом и подложкой (рис. 30, г). Выбор химических реагентов для его реализации за-

висит от типа связываемых молекул и материала подложки. Обычно метод реализуется в

три этапа: очистка и модификация поверхности подложки, т.е. формирование на ней слоя

из необходимых функциональных групп, затем нанесение биоматериала, и, наконец, смы-

вание слабо закрепленных молекул чистыми растворителями. Материалы подложек, ис-

пользуемые в сенсорах: металлы (золото, серебро, платина), стекло, кремний, углерод, по-

лисахариды, нейлон, полимеры и т.д. Главные достоинства метода ковалентного связыва-

ния состоят в том, что, с одной стороны он обеспечивает надежную связь биоматериала с

подложкой и предотвращает его утечку, а с другой позволяет создавать сенсоры с дли-

тельным временем жизни.

Один из распространенных методов, используемых при создании сенсоров, состоит в

том, что ферменты отделены от остального раствора полупроницаемой мембраной, через ко-

торую могут проходить молекулы аналита и продукты каталитической реакции (рис. 30, г).

Практически ферменты находятся в свободном состоянии, но они локализованы в одной части

измерительной ячейки. Этот метод также иногда называется микрокапсулированием.

В ДНК-биосенсорах (еще их иногда называют биочипами) распознающим элемен-

том обычно являются одноцепочечные ДНК, которые связывают комплементарные цепи.

Природа этого взаимодействия – водородные связи между парами нуклеотидов. Биочипы

представляют собой системы различных распознающих элементов, собранные на малой

площади; каждый тип распознающих элементов занимает свой участок (сайт). Примени-

тельно к ДНК, это означает, что на одной твердой подложке собрано большое количество

различных типов одноцепочечных олигонуклеотидов. В процессе анализа каждый из них

связывает комплементарный участок молекул из образца. Каждый тип олигонуклеотидов

занимает сайт диаметром ~100 мкм; детектирующая система считывания обрабатывает

сигналы от разных участков и регистрирует присутствие различных последовательностей в

исследуемом образце. Для иммобилизации олигонуклеотидов применяются различные ме-

тоды, среди которых наиболее популярным является ковалентное связывание на золотой

поверхности. При этом используются олигонуклеотиды с привитыми группами –SH, спо-

собными непосредственно связываться с золотом. Размещение распознающих элементов

на подложке осуществляется тонкими иглами и капиллярами при помощи контактной (pin

printing) или бесконтактной (ink-jet printing) микропечати. Малые порции биоматериалов

наносятся на определенные точки подложки.

78

5.2. «Микросистемы полного анализа» и «лаборатория на чипе»

Ранее уже упоминалось о концепции создания новых аналитических систем – "мик-

роаналитических систем" (-TAS – micro-Total Analysis System) и "лабораторий на чипе"

(LOC – Lab-on-a-Chip). Основой таких систем является миниатюрное устройство – анали-

тический микрочип. В общем случае в аналитическая система на микрочиповой платформе

состоит из:

Микрочипа,

Вспомогательных устройств,

Высокочувствительной системы детектирования,

Микропроцессора (контроллеры, электроника),

Программно-математического обеспечения,

Методик анализа,

Базы данных.

В микросистеме все аналитические стадии (загрузка пробы, транспортировка пробы

и реагентов, фильтрация и концентрирование пробы, химические реакции, разделение

продуктов, детектирование аналита и т.д.) можно проводить на одной, полностью автома-

тизированной платформе, выполненной на микрочипе. Стоимость такой системы на насто-

ящий момент времени является весьма высокой, поэтому для ее создания нужна веская мо-

тивация. Одной из целей создания приборов для анализа биологических проб на основе

микрочиповых устройств является получение доступных, надежных и относительно недо-

рогих систем диагностики, не требующих специальных условий эксплуатации и высокой

квалификации персонала. В ряде случаев оказывается достаточным реализовать на микро-

платформе отдельные стадии анализа, например, выделение или разделение компонентов

пробы и т.д..

Существующие микрочипы условно можно разделить на несколько классов: мат-

ричные (гибридизационные), микрофлюидные (к ним же можно отнести и нанофлюид-

ные) и гибридные микрочипы.

В матричных чипах (биочипах) осуществляется локальная иммобилизация селек-

тивно чувствительных веществ (рецепторов) на небольшом участке инертной подложки,

что дает возможность проведения качественного, а в некоторых случаях и количественно-

го экспресс-анализа.

Микро/нанофлюидные чипы представляют собой устройства, в которых с помощью

современных технологий на небольшой площадке сформированы различные функцио-

нальные элементы: смесители, нагревательные камеры, фильтры, реакционные камеры,

сепарационные и разделительные устройства, камеры сбора фракций, датчики, насосы и

т.п. В этих устройствах обеспечена возможность проведения манипуляций с изучаемым

объектом – пробой: ввод, дозирование пробы, перемешивание, смешивание с реагентами,

специфические реакции, разделение полученного продукта на компоненты, сбор разделен-

ных компонентов, обнаружение и регистрацию компонентов.

В гибридных микрочипах пытаются объединить достоинства матричных чипов (вы-

сокая селективность и экспрессность определения) и преимущества микрофлюидных чи-

пов (проведение измерений в непрерывном режиме, расширенные манипуляции с пробой

и т.д.).

79

5.2.1. Биочипы (матричные чипы)

Биочип – это микроматрица различных соединений, главным образом биополиме-

ров, иммобилизованных на поверхности инертного материала, в микрокаплях геля, в мик-

рокапиллярах и т.п. Эффективность биочипов обусловлена возможностью параллельного

проведения множества специфических реакций и взаимодействий молекул биополимеров,

таких как ДНК, белки, полисахариды и др. Биочип позволяет получить огромное количе-

ство биологической информации.

На пластине биочипа наносится до нескольких тысяч различных микротестов (био-

логические макромолекул – ДНК, белков, ферментов), способных избирательно связывать

вещества, содержащиеся в анализируемом растворе. Обычно технология биочипа основана

на принципе высоко специфического взаимодействия нуклеиновых оснований. В ходе ре-

акции происходит взаимодействие комплементарных цепей ДНК: одна из них (ДНК-

проба) с известной последовательностью нуклеотидов зафиксирована на подложке, а дру-

гая одноцепочечная ДНК-мишень (зонд), меченная флуоресцентной меткой, вносится в

ДНК-чип. На рис. 31 показан принцип действия ячейки ДНК или олигонуклеотидного

биочипа, основанный на комплементарных взаимодействиях основания аденина (А) с ти-

мином (Т) или/и гуанина (G) с цитозином (С) в двух нитях ДНК. Если последовательность

оснований в одной нити ДНК (или олигонуклеотида) полностью комплементарна последо-

вательности другой нити, то образуется стабильная двухнитчатая спираль – дуплекс. Од-

нако присутствие в дуплексе даже одной неправильной пары, например G-G, предотвра-

щает образование дуплекса. Если иммобилизовать в одном из элементов микрочипа спе-

цифическую одноцепочечную ДНК или, положим, олигонуклеотид (пробу) содержащий 20

оснований, то при добавлении к микрочипу меченных флуоресцентными красителями

фрагментов ДНК, например генома человека, будет происходить их высокоспецифичное

взаимодействие. Заданный олигонуклеотидный элемент биочипа специфически свяжет

только одну комплементарную последовательность из 4201.09*1012 всех возможных по-

следовательностей этой длины в ДНК. В результате флуоресцентное свечение наблюдает-

ся только на этом комплементарном элементе биочипа. Таким образом, один элемент био-

чипа производит одну выборку примерно из множества возможных вариантов.

Рис. 31. Принцип функционирования ДНК-биочипа

80

Стандартный процесс получения биочипов иллюстрируется рис. 32.

Развиваемые в последние годы биологические микрочипы позволяют реализовать

сложные принципы геномики, протеомики и методов анализа клетки.

Детектирование происходящих на биочипах взаимодействий осуществляется с по-

мощью флуоресцентных, хемилюминисцентных и масс-спектрометрических методов.

Хемилюминисцентные методы, хотя и уступают по чувствительности люминес-

центным, позволяют упростить и удешевить регистрирующую аппаратуру. Кроме того,

разработан специальный метод прямого анализа соединений непосредственно в гелевых

элементах с помощью методов масс-спектрометрии. Этот важный в протеомике метод поз-

воляет осуществлят дополнительную идентификацию взаимодействующих с биочипами

соединений по их массе.

Детекция сигнала проводится специально разработанными флуоресцентными ска-

нерами. Например, система детекции компании Affymetrix – лазерное конфокальное скани-

рующее устройство (НP), позволяет регистрировать участки чипа с разрешением в не-

сколько мкм. Система детекции Genetic MicroSystems имеет разрешающую способность ~

10 мкм и чувствительность ~ 1 молекула флуоресцентного красителя на 1 мкм2.

Характерные размеры ячеек микрочипов лежат в интервале от 50 до 200 мкм, объе-

мы отдельной ячейки от 1 нл до 1 мкл, значения характерных концентраций анализируе-

мых макромолекул в пределах 1 пM−10 мкM. Общее число ячеек на чипе ~ 103−105, при

линейных размерах чипа примерно 1х1 см.

Рис. 32. Основные стадии изготовления биочипов

Протеомный анализ

Слово "протеом" образовано от слова "протеин" (белок) и окончания слова "ге-

ном", так что в самом названии как бы слиты воедино белок и геном. Протеом – набор бел-

ков данной клетки в данной фазе ее развития в данный момент времени – меньше генома

по общему объему информации.

Протеом – понятие динамическое, тогда как геном стабилен и постоянен, иначе бы-

ло бы невозможно передавать наследственные свойства от поколения к поколению. обес-

печивая сохранение видов и т.д.

Протеомика – изучение белков и их взаимодействия в живых организмах, в том

числе, в человеческом. Часто можно прослеживать связь между изменениями протеи-

нов и их взаимодействием и болезненными состояниями. Таким образом, протеомика

может значительно ускорять разработку эффективных лекарственных средств. Сегодня

более 95% всех фармакологических средств на рынке нацелены на воздействие на про-

теины.

81

Протеины служат для выполнения огромного числа функций в организме.

Например: энзимные протеины служат катализаторами таких функций как пищеваре-

ние; транспортные протеины, такие как гемоглобин, переносят кислород из легких к

другим частям тела; структурные протеины, такие как колаген и эластин, обеспечивают

фиброзную основу соединительных тканей в животных; гормональные протеины, такие

как инсулин, помогают регулировать концентрацию сахара в крови; рецепторные про-

теины встраиваются в мембраны нервных клеток и детектируют химические сигналы,

передаваемые другими нервными клетками и т.д. Протеины производятся рибонуклеи-

новой кислотой (РНК), которая определяется ДНК в генах. Каждый протеин – это це-

почка аминокислот выстраиваемых бесчисленным количеством способов. Порядок или

последовательность. аминокислот играет огромную роль а определении функции кон-

кретного белка в организме. Другим определяющим фактором является структура про-

теина. Порядок, в котором выстраиваются аминокислоты, диктуется определенными

фрагментами ДНК, называемыми нуклеотидами. Каждый нуклеотид содержит сахар-

ную группу, фосфатную группу и одно из четырех соединений, называемых базовыми

(аденин, тимин, цитозин и гуанин). Спирали ДНК состоит из цепочки нуклеотидов. Три

нуклеотида в ряд образуют кодон и порядок базовых веществ в кодоне диктует какая из

20 аминокислот будет производиться. Таким образом, цепочка ДНК производит много-

численные аминокислоты, которые, затем связываются друг с другом для формирова-

ния протеинов. Приоритетным направлением в биомедицине является создание нано-

устройств для клинической протеомики. Основной целью клинической протеомики яв-

ляется обнаружение, идентификация белков и их комплексов, анализ белок-белкового

взаимодействия для создания новых систем диагностики заболеваний и их лечения. Ос-

новная проблема протеомики заключается в низком концентрационном пределе обна-

ружения и идентификации белков в биологическом материале существующими тради-

ционными методами – на уровне не ниже 10-12 М. Так, например, концентрационная

чувствительность протеомных методов, основанных на комбинации диэлектрофореза

или хроматографии с масс-спектрометрией – 10-9 М, иммуноферментных методов ана-

лиза – порядка 10-12-10-14 М. Необходимость повышения концентрационной чувстви-

тельности на несколько порядков связана с тем, что подавляющее количество типов

функциональных белков, которые могут быть и маркерами заболеваний, присутствуют

в плазме крови, согласно оценкам, в концентрациях гораздо более низких, вплоть до

нескольких молекул. Применение нанотехнологий позволяет существенно повысить

концентрационную чувствительность, а также быстродействие аналитических систем

измерения при снижении их стоимости.

5.2.2. Микро- и нанофлюидные чипы

Топология (архитектура) и конструкция микро/нанофлюидных чипов определя-

ется методом и стадиями анализа, которые требуется реализовать на чипе. При анализе

компонентов жидкой пробы должны быть реализованы следующие операции: загрузка

и дозирование пробы, манипуляции с пробой (очистка, обработка или преконцентриро-

вание пробы), транспортировка пробы в реакционную зону, химические или иные реак-

ции, разделение полученного продукта на компоненты, термическое или иное физиче-

ское воздействие на пробу (реагенты), детектирование компонентов, сбор полученных

фракций. Движение потоков жидкости может осуществляться под действием центро-

бежных сил (например в CD – чипе); электрических полей (например, электрокинети-

ческий способ); давления или разряжения; ультразвуковых полей; капиллярных

сил и т.д.

82

5.2.3. Конструкции аналитических микрочипов и функциональные элементы

В микрофлюидном чипе (МФЧ) наиболее эффективными и широко распространен-

ными способами управления микропотоками вещества являются электрокинетический и

гидравлический при этом наиболее технологичным и автоматизируемым считается элек-

трокинетический. Варьируя величины управляющих потенциалов, можно обеспечить ре-

жимы: загрузки пробы, дозирования и смешивания ее с реагентами, а также сепарации по-

лученного продукта.

При вводе пробы и буфера используются различные гидравлические интерфейсы,

соединяющие чип с внешними системами, таковыми могут являться разнообразные капил-

ляры (с внутренним диаметром от 5 до 500 мкм), микрорезервуары (сосуды) самого чипа,

куда помещается проба и раствор буфера и.т.д.. Размеры транспортных каналов МФЧ

должны определенным образом соотносится с размером гидравлических интерфейсов, так,

чтобы не вызывать резких перепадов давления в каналах. В общем случае для микроканала

сечением S количество введенной пробы Q (при вводе электрокинетическим способом) за-

висит от величины приложенного напряжения U, времени t, в течение которого было при-

ложено напряжение, и подвижности компонентов пробы :

cL

tUSQ

,

где c – концентрация пробы в растворе, L – длина канала.

Количество введенного вещества определяется суммарными электрофоретической и элек-

троосмотической подвижностями . Существенное влияние на количество вводимой про-

бы оказывает электроосмотический поток. При определенных условиях возможна ситуа-

ция, когда ЭОП полностью определяет перенос ионов в растворе пробы.

При гидродинамическом способе ввода за счет разности давлений в канале круглого

сечения или капилляре, объем вводимой пробы Vc:

L

tdPVc

4

128

4,

где P – разность давлений, d – диаметр канала, t – время инжекции, – коэф

фициент динамической вязкости.

Электрокинетический ввод пробы имеет недостатки. Например, при таком вводе

образца осуществляется частичная сепарация компонентов пробы. Кроме того, электро-

кинетический способ ввода пробы вследствие невысокой скорости движения потока зани-

мает много времени. Поэтому, обязательным условием при реализации электрокинетиче-

ского метода ввода пробы является минимальная длина подводящих каналов. В некоторых

случаях оправданным является сочетание гидравлического способа ввода и дозирования

пробы с электрофоретическим методом разделения. Дозирование пробы обычно включает

процессы транспортировки и загрузки пробы на участке канала определенных размеров,

что позволяет воспроизводить с высокой точностью дозируемый объем.

Топология дозаторов МФЧ при электрокинетическом (в некоторых случаях – при

гидравлическом) управлении микропотоками вещества не отличается разнообразием,

наиболее часто используются варианты дозирования по схемам, приведенным в табл. 3.

При инжекции по схемам «Т» и «простой крест» удается достигнуть предельно малых

объемов вводимой пробы – до нескольких пл, при инжекции по схемам «двойного Т», «П»

83

и «двойного креста» объем пробы может составлять сотни и тысячи пиколитров. Варианты

дозирования по схемам «простой крест» и «двойной крест» поясняются рис. 33.

Таблица 3Топология инжекторов и схемы контроля потоков

Схемы контроля

Тип инжектора Т Двойной Т П Крест Двойной

крест

Схема инжекции 2 стадии 2 стадии 2 стадии

3+ стадии

2 стадии

3+ стадии

2 стадии

Максимальная

концентрация С max

высокая высокая высокая средняя средняя

Равномерность

«пробки»

низкая высокая средняя Средняя-

высокая

высокая

Примечание Используется

редко

Часто исполь-

зуется

Используется

редко

Очень часто

используется

Распространен

Одно из следствий миниатюризации – малые объемы вводимого образца. Это может

быть как существенным преимуществом, например, в случае клинического мониторинга,

так и создавать определенные проблемы, например, приводить к недостаточной чувстви-

тельности детектирования.

Андреас Манц (A. Manz) и его группа проанализировали возможности использова-

ния очень малых объемов образца и пришли к выводу, что использование микроаналити-

ческой техники возможно при решении многих задач диагностики, так как ряд диагности-

чески значимых соединений присутствуют в пробах в концентрациях от 108 до 1021 ед/мл

и, исходя из формулы, могут детектироваться при объеме образца в пределах 10-12...10-6 л.

Однако большинство диагностически значимых веществ присутствуют в пробе в более

низких концентрациях (от нескольких единиц до 107 ед/мл) и их детектирование выходит

за пределы области теоретически достижимой чувствительности. Эта проблема решается

использованием концентраторов.

Рис. 33. Дозирование по схеме: а – «простой крест»

и б – «двойной крест» (Z-образная схема дозирования)

84

Несмотря на ряд имеющихся недостатков, электрокинетический ввод пробы широко

используется как в приборах на основе микрофлюидных чипов. Возможно такая ситуация

сложилась благодаря разработанной процедуре сжатия пробки пробы, позволяющей кон-

центрировать пробу в десятки и сотни раз. Это дало возможность значительно снизить по-

рог обнаружения ряда веществ.

Существует множество методов преконцентрирования (предварительного концен-

трирования) образца с применением стэкинга, которые, так или иначе, сводятся к измене-

нию движения потока аналита (или скорости движения) вдоль канала перемещения.

Стэкинг всегда происходит на границе, где есть изменение в скорости движения, вызван-

ное различными факторами. Он может быть классифицирован по механизмам: электроки-

нетического фокусирования и абсорбции. В первом случае протекают электрофоретиче-

ские процессы, которые управляются путем изменения напряженности электрического по-

ля или вязкости между зонами, что оказывает воздействие на местную проводимость и

концентрацию разноименно заряженных частиц, и, соответственно – на изменение скоро-

сти. Стэкинг образца может быть проведен при использовании его абсорбционных свойств

– как правило, с применением хроматографических методов или использованием физико-

химических реакций для изменения подвижности аналита. Концентрирование пробы также

может осуществляться с применением различных фильтрующих элементов (фильтров),

внешних полей и других технических приемов.

Смешивание – один из основных процессов, необходимый для многих биологиче-

ских применений. В микромасштабе, ламинарное движение потоков, характеризующееся

низкими числами Рейнольдса (< 10), даже в случае соприкосновения их друг с другом,

препятствует смешиванию. Однако при длительном распространении потока осуществля-

ется диффузия и наблюдается медленное перемешивание слоев. В микрофлюидных

устройствах есть два пути эффективного смешивания жидких потоков: пассивные и ак-

тивные. Пассивные смесители используют геометрию канала, чтобы изменить траекторию

движения последних, обеспечив максимальную область их перемещения и соприкоснове-

ния. Примерами пассивных смесителей являются смесители распределения, статический

смеситель, смеситель T-типа, вихревой смеситель, хаотический смеситель. Поток может

делиться на несколько частей, чтобы увеличить эффект молекулярного распространения.

Используется эффект Coanda, при котором создается конструкция наподобие крыла для

расслаивания потока жидкости, а затем для объединения полученных слоев (рис. 34). Тем

самым стимулируется активное перемешивание потоков.

Рис. 34. Примеры конструкций смесителей (реакторов):

а – смеситель серпантинного типа; b – смеситель на эффекте Coanda

85

Активные миксеры используют внешние источники, чтобы увеличить область вза-

имодействия между жидкими потоками. Выбор типа смесителя зависит от перемешивае-

мых реактивов в реализуемом режиме смешивания, от ламинарности потоков на входе и

выходе смесителя (то есть, числа Re). Некоторые смесители эффективны с более быстрыми

потоками на входе, другие работают более эффективно с медленными потоками. Однако

не существует единого подхода для оценки эффективности микросмесителей вследствие

противоречивых мнений о том, как правильно определить количество и качество смеши-

вания в микромасштабе.

Разделение (сепарация) пробы при реализации капиллярного электрофореза на мик-

рофлюидном чипе осуществляется в канале. Если в первых конструкциях МФЧ использо-

вались сравнительно простые одноканальные топологии и линейные каналы (например,

рис. 35, а), то по мере развития микроаналитических приборов появились и стали исполь-

зоваться более сложные топологии чипов (рис. 35, б, в, г). Существенными характеристи-

ками для достижения необходимого разрешения при разделении пробы являются: длина

канала, параметры используемой среды разделения, параметры и режимы разделения.

Рис. 35. Топологии МФЧ для электрофоретических методов разделения пробы:

а – одна из первых конструкций МФЧ; б – МФЧ с серпантинным каналом;

в – МФЧ с пост-колоночной дериватизацией; г – многоканальный МФЧ

для генетического анализа с референтными каналами

86

Для улучшения качества разделения в канале МФЧ могут использоваться дополни-

тельные элементы (наноструктуры), концентрирующие определенные фрагменты или из-

меняющие их подвижность. Так для разделения длинных ДНК молекул может быть ис-

пользован чип с каналом, состоящим из множества ступенчатых элементов с нанометро-

выми размерами (рис. 36). Канал содержит узкие зоны сжатия пробы ДНК и более широ-

кие области, которые позволяют создавать различия в электрофоретической подвижности

компонентов, осуществляя, таким образом, эффективное разделение без использования

гелевых матриц или импульсных электрических полей. Пойманные в узких зонах ДНК мо-

лекулы в конечном итоге мигрируют, с вероятностями, пропорциональными сечениям пе-

рекрытий молекул

Другим примером использования наноструктур в МФЧ является конструкция чипа

с регулярными наноструктурами для разделения ДНК, приведенная на рис. 37.

Кроме перечисленных элементов топологии МФЧ используются и другие элементы

и структуры, позволяющих проводить различного вида операции с пробой. Некоторые ти-

пичные схемы операций с пробой в МФЧ приведены на рис. 38.

Рис. 36. МФЧ со ступенчатым наноразмерный канал для разделения фрагментов ДНК:

А – продольный профиль канала; B – вид канала сверху, C – экспериментальная установка

Клапаны, способные управлять движением жидкости, являются важными элемен-

тами во многих микрофлюидных устройствах. Существуют два типа клапанов: пассивные,

которые не требуют никакой энергии и активные клапаны, которые используют энергию.

Тип клапана, используемого в устройстве, зависит от решаемых задач. Активные клапаны

применяются с внешними макро- устройствами, которые обеспечивают поступление энер-

гии и, в принципе, управляют клапаном. Некоторые конструкции содержат микроклапаны,

приводимые в действие электромагнитами или пневматическими элементами. Другие ак-

тивные клапаны используют энергию двигающейся жидкости, исключая потребность во

внешней энергии. В последнее время ведутся разработки по созданию фоточувствитель-

87

ных полимеров, меняющих свою форму и свойства, эти особенности полимеров использу-

ются при создании фотоуправляемых микро/наноклапанов и насосов.

Современные технологии электронной техники позволяют создавать микронагрева-

тели, микродатчики и другие функциональные элементы для МФЧ.

Рис. 37. МФЧ с регулярными наноструктурами для разделения ДНК

Рис. 38. Схемы реализации типичных операций на МФЧ: а – смешивание

и взаимодействие пробы и реагента; б – образование фазовой границы; в – твердофазная экстракция;

г – молекулярный транспорт и экстракция из растворителя;

д – фазовое разделения; е – лазерный нагрев пробы или реагентов

В последнее время проявляется тенденция создания аналитических систем на мик-

рочиповой платформе, в которых разработчики пытаются объединить все основные стадии

анализа. При этом используются различные системы детектирования, позволяющие полу-

чить информацию о компонентах пробы на разном уровне: микро- и нано. Вариант такой

88

интегрированной платформы приведен на рис. 39. В общем случае в интегрированной

микрочиповой платформе для исследования биологических проб должны быть элементы,

обеспечивающие концентрирование и сортировку биологических микрообъектов (клеток

или бактерий), выделение и отделение анализируемых объектов, возможно – их лизис, вы-

деление компонентов (РНК или ДНК), амплификацию нуклеиновых кислот, детектирова-

ние полученных продуктов.

Рис. 39. Интегрированная микрочиповая платформа

для исследований биологических проб

В самом простом случае аналитического микрочипа необходимо, чтобы в чипе были:

резервуары, в которые помещается транспортный буферный раствор и анализируемая проба;

резервуары для слива отработанного материала; система каналов, соединяющих эти резервуа-

ры; элементы, обеспечивающие транспорт буфера и пробы. Если выбрать электрокинетиче-

ские способы управления движением потоков и метод капиллярного электрофореза, как метод

разделения пробы, то наиболее простая топология микрочипа представляет систему двух пе-

ресекающихся каналов оканчивающихся резервуарами – отверстиями (рис. 40). Эти отвер-

стия снабжаются электродами, на которые подается напряжение с целью обеспечения процес-

сов ввода и транспорта пробы. Конструкция такого МФЧ будет состоять из двух герметично

соединенных пластин: пластины с микроканалами и отверстиями соединенной с защитной

пластиной. При использовании оптических методов детектирования необходимо применять

оптически прозрачные материалы: стекло, кварц, полимеры.

Если для работ по синтезу веществ критично поперечное сечение каналов, опреде-

ляющее производительность за единицу времени, то при аналитическом использовании

сечение канала может определять предел детектирования компонента. Чтобы создать эф-

фективную миниатюрную аналитическую систему на основе МФЧ, необходимо оптимизи-

ровать массоперенос веществ, тепловыделение, использовать максимальную возможность

увеличения плотности физических и химических процессов на единице поверхности МФЧ

и обеспечить требуемую аналитическую чувствительность (или разрешение).

Подготовка МФЧ осуществляется следующим образом: в резервуар 1 вносится бу-

ферный раствор, который под действием капиллярных сил заполняет каналы. Далее в ре-

зервуар 3 добавляется исследуемая проба, а затем на электроды, подведенные к резервуа-

рам 3 и 4 на определенное время подается напряжение, под действием которого осуществ-

ляется массоперенос пробы по каналу инжекции к резервуару слива пробы 4. При этом

часть пробы оказывается на участке, где каналы пересекаются. Затем это напряжение вы-

ключается и подается высокое напряжение на электроды 1 и 2 (чтобы обеспечить эффек-

тивное разделение пробы на компоненты, обычно напряженность поля 200-500 В/см).

89

Рис. 40. Топология простейшего МФЧ для электрофоретического разделения пробы (а)

и укрупненный фрагмент пересечения каналов с Z-образной системой дозирования пробы (b)

Участок пробы («пробка» пробы), оказавшийся в месте пересечения каналов под

действием электрического поля в сепарационном канале начинает двигаться к резервуару

2, причем заряженные компоненты пробы движутся с различными скоростями, распреде-

ляясь в процессе движения в соответствии с величиной своей электрофоретической по-

движности. Области детектирования (область вблизи резервуара слива 2) сначала достиг-

нут компоненты, имеющие малые размеры и большой отрицательный заряд, затем – ча-

стицы с другими соотношение заряда и размеров. Оптический детектор осуществляет ре-

гистрацию сигнала, причем амплитуда (площадь) регистрируемых пиков пропорциональна

концентрации соответствующего компонента, а время миграции (время выхода пика) – со-

держит информацию об электрофоретической подвижности компонента.

5.2.4. Методы детектирования в микрофлюидных чипах

Особенностью электрофореза в микрочиповом формате является относительно не-

большая длина сепарационного канала (до нескольких см), что значительно ускоряет про-

цесс разделения; отличные от КЭ условия ввода и дозирования пробы); меньший объем

дозируемой пробы, что обуславливает проявление ряда специфических эффектов и во

многих случаях низкий уровень аналитического сигнала. Последнее приводит к необходи-

мости использования высокочувствительных систем детектирования. В табл. 4 приведены

сравнительные характеристики методов детектирования, наиболее часто используемые в

микрофлюидных аналитических системах.

В МФЧ объем области детектирования в ряде случаев определяет величину ана-

литического сигнала. Сигнал фотометрического детектора зависит от длины оптическо-

го пути (глубина или ширина канала), флуорометрического детектора – зависит от де-

тектируемого объема, в то время как сигнал амперометрических детекторов пропорци-

онален площади сечения канала. Для потенциометрических и рефрактометрических де-

текторов аналитический сигнал почти не зависит от объема (Ca2+-селективный элек-

трод, RI-детектор). В нанофлюидных системах создаются условия, при которых осу-

ществляется детекция отдельных частиц, и в этом случае регистрируется сигнал от от-

дельной молекулы или частицы.

90

Таблица 4

Характеристики методов детектирования

Метод

Предел детектирова-

ния по концентрации

(моль)

Преимущества Недостатки

Фотометрический

(УФ-Видимый-ИК диапа-

зоны)

10-5 – 10-8 Универсальность,

получение спектральной

информации

Малая длина оптического пути –

низкая чувствительность

Флуоресцентный 10-7 – 10-9 Высокая чувствитель-

ность

Необходимо, чтобы компонент

обладал флуоресценцией (или

используется метка)

Лазер-индуцируемой флу-

оресценции

10-14 – 10-16 Предельная чувстви-

тельность

Необходимо, чтобы компонент

обладал флуоресценцией (или

используется метка)

дороговизна

Амперометрический 10-10 – 10-11 Чувствительность используется для электроактив-

ных аналитов,

требуется специальная электро-

ника, необходима модификация

каналов

Кондуктометрический 10-7 – 10-8 Универсальность требуется специальная электро-

ника, необходима модификация

каналов

Масс-спектрометрический 10-8 – 10-9 Чувствительность,

информация о структуре

Дороговизна,

значительные габариты,

разработка специальных методик

5.3. Твердофазная, жидкостная и микрофлюидная экстракция. Идеология Т-сенсора и Н-фильтра

Экстракция (от лат. extraho – извлекаю) – процесс извлечения вещества из раствора

с помощью подходящего растворителя, который не смешивается с раствором, но в котором

вещество растворяется лучше, чем в первом растворителе. Наиболее распространенными

являются жидкостная и твердофазная экстракция.

Жидкостная экстракция – экстракция, заключающаяся в перераспределении компонентов

между несмешивающимися жидкими фазами, одна из которых содержит экстрагент.

Твердофазная экстракция – метод, состоящий в концентрировании и отделении от матри-

цы целевого вещества для анализа (аналита) с использованием твердых сорбентов, с по-

следующим вымыванием (экстракцией) подходящими растворителями.

Многие микрофлюидные технологии хорошо работают только при анализе гомо-

генных проб. Наибольшие трудности представляет анализ сложных и гетерогенных реаль-

ных проб, таких как цельная кровь или загрязненные пробы окружающей среды. Поэтому

в ряде случаев размеры каналов МФЧ ограничивают снизу, делают большими, чем разме-

ры пылинок и микрочастиц в пробах, способных блокировать каналы чипа. Важное значе-

ние приобретает инсталляция в чип устройств, отделяющих раствор от частиц. Обычно

этой цели достигают методами фильтрации или центрифугирования, которые не всегда

применимыми в интегрируемых микросистемах. Фирмой Micronics (США) был предложен

91

компонент, позволяющий одновременно осуществлять функции сепарации и детектирова-

ния. Это устройство, в последствии названное «Т-сенсор», представляет чип (рис. 41) с

тремя отдельными входами: для пробы, для раствора с индикатором и для сравнительного

раствора. После объединения в тройнике потоки в ламинарном режиме движутся парал-

лельно, диффузионно обмениваясь компонентами в реакционной зоне (на границе раздела

реагирующих потоков). Малые частицы (молекулы) быстро диффундируют из потока про-

бы в центральную область, в то время как большие частицы (макромолекулы) диффунди-

руют значительно медленнее (например, органический краситель с МВ = 350 дальтон

диффундирует на расстояние 10 мкм за 0.2 сек, а частице диаметром 0.5 мкм для этого

требуется 200 сек). Диффузионные потоки формируют соответствующие реакционные зо-

ны, в которых продукты взаимодействия пробы с индикатором и вещества сравнения с ин-

дикатором могут использоваться для определения концентрации аналита оптическими ме-

тодами по изменению абсорбции света или интенсивности флуоресценции индикатора в

диффузионной зоне между потоками. При регистрации сигналов могут быть определены:

(а) флуоресценция (абсорбция) раствора пробы и сравнительного раствора, (б) фоновая

флуоресценция (абсорбция) индикатора, (в) распределение интенсивности диффузионных

профилей контроля и пробы, (г) координаты максимумов флуоресценции (абсорбции) кон-

троля и пробы. Параметры (а) – (в) используются для калибровки и расчета концентрации

аналита. Параметр (г) дает информацию о вязкости потока в канале.

Рис. 41. T-сенсор фирмы Micronics с тремя отдельными входами: а – для пробы;

б – для детектируемого раствора с индикатором; в – для сравнительного раствора; г – слив. 1 – границы

потоков; 2 – сравнительный поток; 3 – поток, содержащий частицы; 4 – диффузия детектируемой

субстанции в сравнительный поток; 5 – диффузия аналита сравнения в детектируемый поток;

6 – детектируемый поток; 7 – диффузия пробы в детектируемый поток; 8 – диффузия детектируемой

субстанции в пробу; 9 – поперечное сечение детектора

Сравнение интенсивностей и позиций диффузионной реакционной зоны в одном

или нескольких сечениях позволяет получить безкалибровочное значение аналитической

концентрации, независимое от вариаций экспериментальных условий. При этом компен-

сируются такие эффекты, как вариация геометрии проточной ячейки, температурная зави-

симость реакционной кинетики, нестабильности источника излучения, оптической систе-1 2 3

92

мы и электроники, мутность флюида, нестабильность концентрации реагентов детектиро-

вания, перекрестная чувствительность к другим реагентам пробы, нестабильность вязкости

и скорости потока. Поскольку все потоки в Т-сенсоре ламинарные, а реагенты и проба по-

стоянно обновляются, повышение чувствительности может быть достигнуто путем инте-

грирования во времени флуоресцентных изображений без опасения фотообесцвечивания,

деградации реагентов, засорения сепарационных мембран и влияния других отрицатель-

ных эффектов, типичных для традиционных сенсоров.

Возможности применения T-сенсора продемонстрированы для различных клиниче-

ских анализов: определения рН, содержания кислорода, электролитов, белков, энзимов и

лекарственных препаратов в крови – с использованием для детектирования флуоресценции

и абсорбции света. Интерес вызывает новый формат иммуноанализа, основанный на диф-

фузионно-сепарационных особенностях T- сенсора для изоляции и детектирования связан-

ных и несвязанных комплексов антиген–антитело. Измерение интенсивности флуоресцен-

ции (абсорбции света) вдоль канала может использоваться для наблюдения кинетики реак-

ции (не как функции времени, а как функции расстояния от стартовой точки диффузион-

ного взаимодействия). Таким образом, дополнительно к разделению и детектированию

аналита в сложных растворах проб T-сенсор дает возможность иммуноанализа и кинетиче-

ского анализа в формате, требующем минимального количества пробы.

Развитием идеологии Т-сенсора стал так называемый Н-фильтр – микрофлюидное

устройство для экстракции аналита из жидкости, содержащей частицы (например, клетки

крови, бактерии, микроорганизмы, пыль, и вирусы) (рис. 42). В устройстве отсутствует

мембранный фильтр или подобный элемент, требующий регулярной очистки или замены.

Устройство было разработано для фильтрации сверхмалых объемов жидкости (нанолитро-

вых объемов), хотя может быть использовано и при больших расходах жидкости.

Принцип работы устройства заключается в разделении смеси частиц из-за разницы в диф-

фузионных свойствах. В канал 1 вводится жидкая проба – смесь частиц, а в канал 2 посту-

пает выбранный реагент. Жидкости (их подбирают определенным образом) при контакте в

центральном канале, создают граничную область и, не смешиваясь, в ламинарном режиме

двигаются по каналу. В процессе движения происходит диффузия мелких частиц из потока

1 в поток 2. При подходящей длине канала и подборе состава жидкостей могут быть со-

зданы благоприятные условия для извлечения аналита из пробы. Затем поток 2 может быть

перенаправлен в специальный микрорезервуар для дальнейшего анализа. В центральном

канале H-фильтра можно создать градиент поля (электрического, гравитационного, маг-

нитного и т.д.) так, что частицы будут подвергаться действию этого поля, и таким образом

управлять их движением и распределением между потоками.

Рис. 42. Н-фильтр: 1 – канал ввода пробы; 2 – канал ввода реагента; 3 – канал слива;

4 – канал вывода реагента и аналита

93

5.4. Седиментационный метод анализа. Разделение на CD-чипе

Седиментация – направленное движение частиц в поле действия гравитации или

центробежных сил. Скорость седиментации зависит от массы, размера и формы частицы,

вязкости и плотности среды, а также от действующих на частицы центробежных сил. Се-

диментационный анализ – совокупность методов определения размеров частиц в дисперс-

ных системах и молекулярной массы макромолекул в растворах полимеров по скорости

седиментации в условиях седиментационно-диффузного равновесия.

Флотация – способ разделения смесей твёрдых мелких частиц, принадлежащих

различным веществам, а также выделения капель дисперсной фазы из эмульсий, основан-

ный на их различной смачиваемости и способности накапливаться на поверхности раздела

фаз. Флотация возможна только при неполном смачивании поверхности выделяемых ча-

стиц жидкостью. Обычно это достигается путём добавления небольших количеств специ-

альных веществ – флотореагентов.

Первоначально седиментационный анализ был основан на использовании движения

частиц в гравитационном поле. В 1923 г. Т. Сведберг предложил применить для анализа

специально сконструированную ультрацентрифугу. В процессе экспериментальных иссле-

дований оказалось, что для аналитических целей достаточно ультрацентрифуги с ускоре-

нием 40-50 тыс. g. Применение центрифуги позволяет значительно ускорить анализ и дает

возможность разделить смеси, содержащие частицы, вплоть до коллоидных размеров и

осаждать молекулы высокомолекулярных соединений. Скорость осаждения зависит от ин-

тенсивности центробежного поля, а степень осаждения – от времени центрифугирования.

Для характеристики центрифуг применяется величина, называемая фактором разде-

ления, которая показывает, во сколько раз ускорение центробежного поля больше ускоре-

ния свободного падения g:

g

RFr

2

,

где – угловая скорость вращения ротора; R – внутренний радиус ротора центрифуги; g –

ускорение свободного падения.

Для точных расчетов необходимо учитывать, что ускорение, действующее на ча-

стицу в центробежном поле, увеличивается по мере оседания частиц, т.е. удаления их от

оси вращения ротора. Поэтому уравнение Стокса должно быть выражено в дифференци-

альном виде:

xrdt

dxr

23

3

46 ,

где x – расстояние от частицы до оси вращения.

После интегрирования в пределах от x0 (начальное расстояние от частицы до оси

вращения) до R (конечное расстояние – внутренний радиус ротора центрифуги) и соответ-

ственно по времени, от 0 до t, получаем

trx

Rln

22

0 9

2,

где t – время центрифугирования; – вязкость среды; – разность плотностей дисперс-

ной фазы и дисперсионной среды; R – внутренний радиус ротора центрифуги; x0 – началь-

ное расстояние от частицы до оси вращения.

94

Необходимость высокоскоростного анализа большого количества проб привела к

созданию многоканальных линейных микрофлюидных чипов, а в 1999 г. появились ради-

альные микрочипы (CD –чипы). Идеология CD – чипов заключается в следующем: круглая

пластина (на подобие CD-диска) используется как основа для создания микроструктур, в

которых происходит аналитическая реакция. По сути дела это может быть диск с системой

каналов, реакторов, смесителей, микрососудов (рис. 43, а, б) или диск с чувствительными

зонами биомолекул (антигенами, антителами, олигонуклеотидными зондами и т.п.)

(рис. 43, в). На рис. 43 приведена конструкция микрофлюидного CD-чипа (а) для электро-

форетического анализа пробы с конфокальным детектором лазер-индуцированной флуо-

ресценции (б). В формате CD можно реализовать анализ большого количества проб

(например, для электрофоретических методов созданы микрочипы с 96 и 384 – каналами

радиального формата). При вращении диска на жидкость, находящуюся в каналах, дей-

ствуют центробежные и кориолисовы силы, которые вызывают движения потоков жидко-

сти. В сочетание с гидрофобными барьерами и другими элементами, расположенными в

каналах и играющими роль своеобразных клапанов (при увеличении скорости вращения

диска эти барьеры становятся проходимыми для потоков), можно организовать движение

жидкости по сложным траекториям, создать условия для эффективного перемешивания

реагентов, транспорта и разделения пробы. Можно даже создать условия для капельного

движения пробы в транспортном жидком потоке.

в)

Рис. 43. Микрофлюидный CD-чип для электрофоретического анализа пробы (а)

с ситемой система детектирования (б) и гибридизационный CD – чип (в)

95

Конструкции в формате CD могут быть самыми разнообразными и зависят от вы-

бранного метода анализа. Например, при выборе методов анализа, основанных на специ-

фических взаимодействиях аналита пробы с реагентом, конструкция CD-чипа может быть

такой, как показано на рис. 44. Проба вводится в ячейку, находящуюся вблизи центра вра-

щения диска. В резервуары, обозначенные как «реагенты», «буфер», «в-1» и «тест», загру-

жены реагенты, буферные, вспомогательные и тестовые растворы. При вращение диска

проба движется по каналу, вступая во взаимодействие с растворами из резервуаров. Через

зону детектирования последовательно проходят калибровочные (тестовые) растворы и

продукты взаимодействия аналита, содержащего в пробе, с реагентом. Сравнивая величи-

ну аналитического сигнал от пробы и тестового раствора можно с высокой точностью

осуществлять количественное определение аналита в пробе.

Рис. 44. Конструкция CD-чипа для анализа биопроб

5.5. Анализ нуклеиновых кислот

Важными направлениями в биологических и медицинских исследованиях являются

изучение генетических мутаций и полиморфизмов, которые могут видоизменять функции

гена и, по-видимому, являться причиной унаследованных болезней и других заболеваний.

Для экспресс-анализа ДНК в настоящее время применяются методы: капиллярного элек-

трофореза и электрофореза на микрофлюидном чипе, масс-спектрометрии; гибридизаци-

онного анализа на микрочипе ("биочип"), методы полимеразной цепной реакции. Исполь-

зование МФЧ позволяет проводить анализ малых объемов пробы с высокой производи-

тельностью и быстродействием на компактных устройствах, которые могут быть встроены

в другие системы.

5.5.1. Электрофоретическое разделение ДНК на микрофлюидном чипе

В основе метода электрофоретического разделения ДНК лежит тот факт, что в вод-

ном растворе ДНК является анионом. Если к раствору приложить потенциал, то фрагмен-

ты ДНК направятся к плюсу. При использовании полимерных сред и гелей на водной ос-

нове скорость движения фрагментов ДНК обратно пропорциональна их длине: маленькие

фрагменты быстрее пройдут через полимерную (гелевую) сетку, а длинные – медленней.

96

Фрагменты ДНК, которые изначально находились в одном объеме, через некоторое время

выстроятся по размеру. Метод электрофореза применяется почти всегда, когда требуется

рассортировать куски ДНК по длине, от большого к маленькому.

Первые работы по использованию электрофореза на микрочипах появились в 1990-

х годах, а уже в 1994 г. было продемонстрировано (Woolley, Mathies) быстрое (~120 с) раз-

деление фрагментов ДНК на многоканальном микрочипе с длиной канала 35 мм. По срав-

нению с традиционным КЭ в МФЧ короткие сепарационные длины в сочетании с высокой

напряженностью электрического поля дают возможность осуществить очень быстрое раз-

деление компонентов пробы (до нескольких секунд). При этом реализуется полный кон-

троль всех стадий процесса и параметров анализа. Кроме того, существует возможность

интеграции в микрочип отдельных функциональных элементов, датчиков и устройств,

обеспечивающих необходимые режимы фракционирования и их контроль.

В настоящее время микрофлюидные чипы для электрофоретического разделения

(МФЧЭ) применяются: для анализа неорганических и органических веществ; иммунного

анализа; для анализа биомолекул, в том числе ДНК, РНК, белков; анализа продуктов по-

лимеразной цепной реакции; результатов секвенирования ДНК; обнаружения мутаций и т.

п. Наиболее успешно электрофоретические методы используются при разделении фраг-

ментов ДНК. При электрофоретическом разделении чрезвычайно важной задачей стано-

вится правильный выбор сепарационной среды разделения – полимерной матрицы, т. к.

необходимо разделить фрагменты ДНК, обладающие почти идентичной электрофоретиче-

ской подвижностью в свободном состоянии. При электрофоретическом разделении ДНК

для получения качественного высокоскоростного разделения помимо влияния электриче-

ского поля критическими являются следующие факторы: среда разделения, концентрация,

состав и pH буфера.

Для эффективного разделения образцов ДНК используются полимерные матри-

цы состав которых должен быть оптимизирован с учетом химической природы полиме-

ра, физических характеристик полимера (молекулярно-массовое распределение) и кон-

центрации полимера в буферном растворе. Чтобы добиться эффективного разделения

фрагментов ДНК, в методических работах уделяется особое внимание получению по-

лимера с заданной молекулярной массой. Подвижности молекул ДНК различных раз-

меров в свободных растворах почти не различаются из-за одинаковых соотношений за-

ряд/поверхность (размер). В таких условиях трудно достигнуть разделения по молеку-

лярным весам. Поэтому для анализа таких биополимеров, как РНК и ДНК методом КЭ

применяют среды с ситовыми свойствами, как в традиционном гель-электрофорезе.

Разбавленные растворы полимеров имеют физические свойства, близкие к свойствам

растворов малых молекул, а когда концентрация полимера в растворе возрастает и до-

стигает порогового значения, молекулы полимера начинают переплетаться. Спутанные

полимерные цепи образуют нестойкую сетку, размер пор которой не зависит от моле-

кулярной массы полимера. Образовавшаяся сетка обладает ситовыми свойствами. Та-

кие растворы спутанных полимеров используют в КЭ для достижения разделения по

молекулярным размерам. Способы и механизмы миграции молекул ДНК при электро-

форетическом разделении в растворах спутанных полимеров достаточно сложны, но

практически все они описаны в научной литературе. Сила взаимодействия с полимер-

ной матрицей больше для больших молекул ДНК. На этом и основано разделение по

молекулярным размерам. В зависимости от конформации и размеров молекул анализи-

руемого вещества, а также от характеристик пористой структуры полимерного раствора

можно придти к различным механизмам разделения. Как правило, для подвижности

анализируемых веществ в разделяющем полимере находят зависимость от их размеров.

97

5.5.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

В современной клинико – диагностической лабораторной практике применяются

методы ДНК/РНК – диагностики, среди которых, безусловно, первое место занимает по-

лимеразная цепная реакция (ПЦР). В начале 1970-х годов норвежский ученый Къелл

Клеппе (Kjell Kleppe) высказал идею о том, что можно амплифицировать ДНК с помощью

пары коротких одноцепочечных молекул ДНК – синтетических праймеров. Но только в

1983 г, Кэри Б. Мюллису (Kary B. Mullis) (Нобелевскому лауреату по химии 1993 г) уда-

лось создать метод амплификации ДНК в ходе многократных последовательных удвоений

исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы.

На текущий момент, кроме медицинской диагностики, ПЦР применяется в крими-

налистике; в научных исследованиях при клонировании генов, ссеквенировании ДНК; при

ггенетическом анализе; анализе особо опасных инфекций; обнаружении генетически моди-

фицированных продуктов и т.п. ПЦР представляет собой процесс контролируемого “моле-

кулярного копирования” определенного участка ДНК in vitro, позволяющий нарабатывать

(амплифицировать) сколь угодно большое число интересующих последовательностей

ДНК.

Для проведения ПЦР обычно требуются следующие компоненты (рис. 45, а):

анализируемый образец: ДНК-матрица, содержащая участок ДНК, который тре-

буется амплифицировать;

праймеры – парные искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие,

как правило, размер от 15 до 30 пар нуклеотидов, комплементарные концевым участкам

изучаемого фрагмента ДНК. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфич-

ность и чувствительность тест – системы. После гибридизации матрицы с праймером (от-

жиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной

цепи матрицы. Важнейшая характеристика праймеров – температура плавления (Tm) ком-

плекса праймер-матрица, которая определяется, как температура, при которой праймер

присоединился к половине возможных сайтов связывания;

термостабильная ДНК – полимераза – фермент, который катализирует реакцию

полимеризации ДНК. Фермент достраивает с 3’ – конца вторую цепь ДНК согласно прин-

ципу комплементарности;

дезоксинуклеотидтрифосфаты (дАТФ, дТТФ, дГТФ и дЦТФ) – материал необхо-

димый для достраивания второй цепи ДНК;

буферный раствор, создающий оптимальные условия для реакции (рН, ионная си-

ла раствора).

ПЦР – это циклический процесс (рис. 45). Обычно каждый цикл амплификации со-

стоит из трех этапов. На первом этапе происходит денатурация (denaturation) ДНК – ми-

шени. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95оС, в результате чего нарушаются

водородные связи между цепями ДНК, и двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с

образованием двух одноцепочечных молекул. Иногда перед первым циклом (до добавле-

ния полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение не-

скольких минут для полной денатурации матрицы и праймеров (горячий старт), что поз-

воляет снизить количество неспецифичных продуктов реакции. На втором этапе при по-

нижении температуры праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК – мишени. Этот

процесс носит название “отжиг” (annealing) и происходит в соответствии с правилом ком-

плементарности Чаргаффа, означающим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив

аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина – цитозин. При отжиге формируются

участки ДНК, которые будут копироваться. Температура отжига зависит от состава прай-

меров и обычно выбирается на 4–5°С ниже их температуры плавления. Время стадии от-

жига (0,5–2) мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому

http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A0%D0%B5%D0%BF%D0%BB%D0%B8%D0%BA%D0%B0%D1%86%D0%B8%D1%8F_%28%D0%B1%D0%B8%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8%D1%8F%29

http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%94%D0%9D%D0%9A-%D0%BF%D0%BE%D0%BB%D0%B8%D0%BC%D0%B5%D1%80%D0%B0%D0%B7%D0%B0

http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BC%D0%BF%D0%BB%D0%B8%D1%84%D0%B8%D0%BA%D0%B0%D1%86%D0%B8%D1%8F

98

связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в

неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

На третьем этапе температуру реакционной смеси доводят до оптимума работы фермента

ДНК – полимеразы, которая достраивает праймеры, присоединяя к ним нуклеотиды. По-

лимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей,

и движется вдоль матрицы. Этот этап называется – элонгация (elongation). Температура

элонгации зависит от полимеразы, а время элонгации определятся типом полимеразы и

длиной амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным од-

ной минуте на каждую тысячу пар оснований. Этапы денатурации, отжига и элонгации

многократно повторяются (до 30-40 циклов), что позволяет нарабатывать нужное количе-

ство продукта реакции (ограниченного праймерами). После окончания циклов проводят

дополнительную стадию финальной элонгации (7-10 мин), чтобы достроить все одноцепо-

чечные фрагменты.

Рис. 45. Компоненты ПЦР-смеси (а) и основные стадии ПЦР (б)

При обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более

3000 пар оснований, а с помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок

99

и при определенных условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар

нуклеотидов.

Дальнейшим развитием метода ПЦР явилось создание мультипраймерной (мульти-

плексорной) ПЦР. В этой реакции осуществляется одновременная амплификация несколь-

ких ДНК матриц в одной реакционной среде с использованием нескольких пар праймеров,

что позволяет проводить скрининг сразу по нескольким инфекционным возбудителям,

определять одновременно наличие в биопробе комплекса факторов вирулентности и рези-

стентности к антибактериальным и противовирусным препаратам и т.д. Известны и другие

разновидности методов, основанных на ПЦР, например, гнездовая ПЦР (Nested PCR), In

Situ PCR, метод молекулярных колоний (Polony – PCR Colony) и др.

Количественная оценка и верификация полученного продукта ПЦР может быть

проведена разными методами, наиболее эффективными и широко распространенными яв-

ляются электрофоретическое разделение ампликонов в агарозном или полиакриламидном

гелях, гибридизационные методы (мечение пробы, дот-блоттинг), непосредственное мар-

кирование нуклеотидов или праймеров, иммунологические методы и исследование в ре-

альном времени. В наиболее благоприятном случае продукты амплификации единичных

молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены методом электрофореза после 30-35 цик-

лов. Но, так как на эффективность амплификации значительное влияние оказывает степень

чистоты исходного образца, т.е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов,

от которых избавиться иногда бывает крайне сложно, не всегда удается амплифицировать

нужное количество мишеней, чтобы правильно оценить исходное количество ДНК.

В коммерческом оборудовании (амплификаторах) ПЦР выполняется одновременно в

десятках полипропиленовых пробирок (объем каждой от 0,2 до 1,5 мл), размещенных в спе-

циальном устройстве, обеспечивающем необходимые циклы нагрева и охлаждения. Суще-

ствующие устройства для проведения ПЦР характеризуются низкими скоростями нагрева и

охлаждения реакционной смеси при термоциклировании, что значительно удлиняет время

анализа и повышает вероятность синтеза нежелательных побочных продуктов. Объемы ре-

акционной смеси достаточно велики, что приводит к высокой стоимости анализа. Поэтому

возможность уменьшения времени амплификации и объемов пробы представляет большой

интерес. Современные микро- и нанотехнологии, микроэлектронная и микрофлюидная тех-

ники позволяют успешно создавать микроустройства и компактные приборы для реализации

всех стадий ПЦР. К преимуществам таких приборов можно отнести портативность; возмож-

ность создания однородных температурных полей в рабочей смеси; высокие скорости

нагрева/охлаждения при термоциклировании, позволяющие увеличить экспрессность опре-

деления; значительное снижение расхода реагентов и образцов; меньшее потребление энер-

гии; возможность объединения с микросистемами полного анализа и др.

5.5.2.1. ПЦР в реальном времени

Развитие методов диагностики генетического материала на основе ПЦР связано с

созданием методов ПЦР с регистрацией продукта в реальном времени (Real-Time PCR).

Методы позволяют детектировать продукты амплификации в процессе реакции и осу-

ществлять мониторинг кинетики накопления ампликонов. В качестве детекторов, в основ-

ном, применяются высокочувствительные люминесцентные приборы, регистрирующие

сигналы эмиссии флуоресцентных зондов. Большинство созданных методов основано на

гибридизации искусственно синтезированных зондов с продуктами амплификации. Реги-

стрируя интенсивность флуоресценции на каждом цикле амплификации можно осуще-

ствить количественную оценку накапливаемых копий. Коммерческие приборы для ПЦР в

реальном времени содержат, помимо устройств нагрева и охлаждения, специальные детек-

торы, позволяющие регистрировать аналитический сигнал образца, помещенного в поли-

100

мерные пробирки. Как правило, такие приборы позволяют одновременно проводить анализ

множества образцов.

Гомогенные методы, использующие ПЦР, могут быть разделены на два основных

типа: неспецифические и специфические методы, которые также различаются по способам

генерации флуоресценции. К неспецифическим методам относятся методы с применением

интеркалирующих флуоресцентных агентов, флуоресценция которых возрастает при свя-

зывании с двуцепочечной ДНК (рис. 46, а) и аналогичные.

В специфических методах используются меченые флуоресцентными агентами оли-

гонуклеотидные пробы, комплементарные участку PCR-продукта (технологии TaqMan,

Molecular Beacons, LightCycler, Scorpions, HyBeacons, Eclipse и др.).

Технология TaqMan ПЦР основана на использовании 5'-экзонуклеазной активности

полимеразы (рис. 46, б). В реакционную смесь добавляют ДНК-пробы, комплементарные

участку амплифицируемой области и меченые на 5'-конце флуоресцентным красителем, а

на 3'-конце – фосфатной группой и тушителем флуоресценции. Так как тушитель распо-

ложен близко к флуоресцентной метке, то вследствие ферстеровского переноса энергии

флуоресценция отсутствует, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу.

При отжиге праймеров проба связывается с комплементарным участком ДНК. Во время

стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участ-

ка, гибридизованного с пробой, начинает расщеплять пробу за счет 5'-экзонуклеазной ак-

тивности. В результате флуоресцентная метка пространственно отделяется от гасителя, и

ее свечение может быть зарегистрировано. Чем больше ПЦР-продукта наработано, тем бо-

лее интенсивной будет флуоресценция. Этот метод позволяет достигнуть высокого уровня

аналитического сигнала, достаточно прост в применении, но имеет высокий уровень фона

и не всегда позволяет различать близко расположенные последовательности.

Рис. 46. Принципы действия SYBR Green I, TaqMan и Molecular Beacons в ПЦР

Особенность технологии Molecular Beacons является то, что концы пробы (на кото-

рых находятся метка и тушитель флуоресценции) комплементарны друг другу. При темпе-

ратуре отжига праймеров они «схлопываются» и образуют замкнутую структуру типа пет-

ли таким образом, что зона комплементарности пробы с матрицей находится внутри петли

(рис. 46, в), при этом обеспечивается тушение флуоресценции метки. При гибридизации

пробы с матрицей вторичная структура разрушается, метка и тушитель расходятся в раз-

ные стороны, и возбужденная метка начинает флуоресцировать. Недостатком метода явля-

ется относительно медленная кинетика процесса, приводящая к низкому уровню сигнала.

101

5.5.2.2. Аналитический сигнал ПЦР в реальном времени

ПЦР – биохимическая реакция, в ходе которой циклически происходит образование

продукта. Теоретическое количество получаемого продукта возрастает пропорционально

2n, где n – число циклов реакции. Но в ходе ПЦР происходит истощение реагирующих

компонентов, инактивация фермента и т.п. Поэтому в действительности эффективность

цикла амплификации меньше 100% (по некоторым данным – 78-98%), а в присутствии ин-

гибиторов реакции – и того меньше. Фактически количество специфического продукта А

может быть выражено уравнением:

А = М (1+Е)n,

где М – начальное количество ДНК-мишеней, Е – значение эффективности цикла реакции

(амплификации).

Процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической

прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность падает, что связано

с так называемым эффектом «плато».

Образование специфического продукта вызывает изменение аналитического сигна-

ла (обычно – интенсивности флуоресценции). Изменение интенсивности флуоресценции в

процессе ПЦР характеризуется кинетической кривой флуоресценции (изменение флуорес-

ценции в зависимости от количества циклов амплификации). В общем случае кривая имеет

сигмовидную форму (рис. 47) и на ней можно выделить:

1) стадию инициации (ground phase, baseline),

2) экспоненциальную стадию (exponential phase),

3) плато (plateau phase).

4)

Рис. 47. Зависимость сигнала флуоресценции от количества циклов амплификации

Если на полученной экспериментальной зависимости выражены все три стадии, то это дополнительно может

свидетельствовать о правильности измерений (анализа), хотя в некоторых случаях возможно отклонение

формы кривой от сигмовидной (например, отсутствие стадии насыщения может проявляться

при работе со сверхмалыми концентрациями субстрата)

102

На первой стадии продукты реакции еще не детектируются, регистрируемый сигнал

примерно соответствует уровню наблюдаемого фона. В большинстве случаев этот сигнал

может быть описан линейной зависимостью. На второй стадии наблюдается экспоненци-

альная зависимость флуоресценции от количества циклов. В некоторых случаях она разби-

вается на две стадии – early exponential phase и log-linear phase. Третий участок зависимо-

сти отражает стадию насыщения. Сигнал меняется слабо, иногда даже уменьшается.

5.5.2.3. ПЦР на микрочипе

Разработка и изготовление микрочиповых устройств связано с рядом технических и

методических проблем, которые уже решены в той или иной степени. Так, например, зна-

чительное уменьшение объемов анализируемой пробы приводит к существенному ухуд-

шению соотношения сигнал/шум, к проблемам ввода пробы в реакционную камеру, влия-

нию поверхности реакционной камеры на ход реакции и т.д.

Используя микроструктуры (каналы, реакторы, сосуды), полученные методами

микро- и нанотехнологий, для рабочих камер ПЦР микрочипов удается получить высокое

соотношение поверхность/объем, что делает возможным осуществлять быстрый и эффек-

тивный теплообмен. Однако, при этом существенное влияние на ход ПЦР оказывают свой-

ства поверхности реактора.

Микроустройства для проведения ПЦР условно можно разделить по принципу и

механизму нагревания реакционной смеси (прямое нагревание камеры, нагрев смеси в по-

токе, конвективное нагревание, нагревание электромагнитным (световым) излучением) и

способам транспортировки реакционной смеси. К первому типу относятся системы со ста-

ционарными реакционными камерами. Температура таких камер меняется в течение одно-

го цикла амплификации (рис. 48 А). Чтобы повысить производительность, были разрабо-

таны мультикамерные ПЦР чипы (рис. 48 Б). Пожалуй, самыми важными проблемами

функционирования таких систем являются получение однородных управляемых темпера-

турных полей и необходимость предотвращения перекрестного переноса материала (кон-

таминации) между образцами из соседних камер.

Рис. 48. Микроустройства для ПЦР со стационарными реакционными камерами

103

Neuzil et al. предложили совершенно иной подход при создании камер для проб ма-

лого объема, используя специально организованную гидрофобную/олеофобную поверх-

ность, таким образом, чтобы копия ПЦР смеси оказалась внутри другой капли большего

объема, служащей в качестве реакционной камеры. В этом случае каждую каплю ПЦР об-

разца, помещенную на такую поверхность, покрывали каплей минерального масла, созда-

вая виртуальную реакционную камеру (рис. 48 В).

Ко второму типу ПЦР-чипов относятся проточные микрофлюидные чипы, в кото-

рых амплификация происходит, когда реакционная смесь прокачивается по микроканалу

через соответствующие температурные зоны. Один из таких проточных вариантов чипов

для проведения ПЦР, основанный на использовании микроканала, проходящего через три

различные температурные ванны, был предложен Nakano et al. в 1994 г (рис. 49, а).

В 1998 г. Kopp et al. сообщили о микрофлюидном ПЦР чипе с серпантинным каналом, ко-

торый проходит через три термостабильных блока (рис. 49, б). В отличие от ПЦР микро-

чипов со стационарными камерами в микрофлюидных ПЦР чипах тепловая инерция си-

стемы сведена к минимуму, т.к. определяющей является термическая масса ПЦР смеси.

Время изменения температуры зависит только от скорости потока реакционной смеси и

времени достижения термического равновесия. Созданию стабильных во времени и высо-

коскоростных потоков жидкости уделяется особое внимание. Применение насосов, как

правило, шприцевых, приводит к удорожанию систем. Поэтому предпринимаются усилия

по созданию доступных и простых микроустройств формирующих потоки. Проточный ва-

риант ПЦР имеет ряд недостатков: образование пузырьков воздуха в микроканалах небла-

гоприятно влияет на ход ПЦР; управляемый давлением поток имеет параболический про-

филь, что приводит к размытию образца; скорость, с которой реакционная смесь переме-

щается между различными температурными зонами, достаточно трудно регулировать и

контролировать. Для преодоления этих недостатков используют различные приемы, а ино-

гда – альтернативные подходы. В проточных ПЦР микрочипах с каналами в виде спирали

или серпантина трудно реализовать одновременную амплификацию большого числа проб,

т.к. это значительно усложняет архитектуру и конструкцию чипа. Микрочип с линейным

каналом, по которому поток циклически прокачивается в прямом и обратном направлени-

ях, каждый раз проходя через три температурные зоны (рис. 49, в) позволяет реализовать

идеологию многоканального амплифицирования.

Рис. 49. Варианты проточных микрофлюидных чипов для ПЦР. Образец последовательно проходит

через три температурных зоны: 1 – денатурация, 2 – отжиг, 3 – элонгация

Большинство ПЦР микрочипов изготавливают из кремния, стекла или в сочетании

кремний-стекло. В настоящее время наметилась устойчивая тенденция широкого примене-

104

ния полимерных материалов в конструкциях микрочипов для ПЦР. Наиболее применяе-

мыми являются: полидиметилсилоксан (ПДМС), поликарбонат (ПК), полиметилметакри-

лат (ПММА), полиэтилентерефталат (ПЭТ), полиимид (ПИ), SU-8, парилен и т.д. Каждый

материал обладает различными свойствами и поэтому имеет свои преимущества и недо-

статки.

Кремний. Основным преимуществом кремния является его высокая термопровод-

ность, что обеспечивает высокую скорость термоциклирования при амплификации. Спо-

собы обработки кремния хорошо известны (например, в микроэлектронной промышленно-

сти), а процессы изготовления изделий из кремния достаточно отработаны для того, чтобы

получать любые сложные структуры микрометровых размеров с необходимой точностью.

Но высокая теплопроводность (~163 Втм-1К-1) этого материала приводит к необходимо-

сти хорошей термоизоляции, что усложняет конструкцию микрочипа. Кроме того, чистый

кремний ингибирует ПЦР. Поэтому необходимо применять специальные меры по предот-

вращению ингибирования, например, использовать специальные покрытия (силанизация

поверхности и динамические покрытия). Непрозрачность кремния накладывает ограниче-

ния на использование методов оптического детектирования, а его электропроводность за-

трудняет применение электрокинетических способов разделения пробы в случае объеди-

нения процессов амплификации и электрофоретического разделения на одном чипе.

Методы оптического детектирования позволяют осуществлять высокочувствитель-

ное обнаружение и количественную оценку продуктов ПЦР непосредственно в процессе

реакции, что является весьма привлекательным при создании аналитических приборов и

систем. В этом случае используются прозрачные материалы, такие как стекло, кварц, по-

лимеры.

Кварц и стекло. Эти материалы являются оптически прозрачными в достаточно

широкой области спектра, что позволяет использовать практически все оптические методы

детектирования, в том числе и флуоресцентные методы. Обработка кварца несколько

сложнее, чем стекла. К тому же, электроосмотические свойства кварца и стекла позволяют

реализовать электрофоретические методы разделения пробы или продукта реакции в од-

ной конструкции микрочипа. Технологии обработки кварца и стекол схожи с технология-

ми обработки кремния.

Встречаются конструкции гибридных чипов, в которых используются кремниевые

пластины с микрореакторами и каналами, а в качестве защитной пластины используется

стеклянная пластина, соединяемая с кремниевой методом анодного связывания. В таких

конструкциях необходимой является обработка поверхности с целью предотвращения ин-

гибирования. Существенным недостатком ПЦР -микрочипов, как на основе кремния, так и

на основе кварца и стекла является их высокая стоимость. Поэтому такие микрочипы

обычно многократно используются после специальных методов очистки – регенерации. В

случаях, когда необходимо однократное применение микрочипа, более целесообразным

является использование полимерных материалов.

Полимеры. Получили широкое распространение в приборостроении благодаря не

только низкой себестоимости, но также простоте и относительно низкой стоимости при

массовом производстве. Это позволяет создавать одноразовые чипы. Использование поли-

мерных материалов также упрощает процессы утилизации отработанных изделий. Для по-

лимерных материалов разработано множество доступных технологий формирования мик-

роструктур.

105

5.5.3. Секвенирование ДНК

Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот – ДНК и РНК) – опре-

деление их первичной аминокислотной или нуклеотидной последовательности.

Зная последовательность гена и генетический код, можно определить аминокислотную по-

следовательность кодируемого им белка. В некоторых случаях бывает проще определить

структуру белка через нуклеотидную последовательность, чем с помощью прямого секве-

нирования. Если секвенирование белка занимает длительное время – месяцы, то ДНК уда-

ется секвенировать за несколько недель. Определение последовательности ДНК привело к

тому, что были обнаружены области, которые не кодируют белки, но принимают участие в

регуляции экспрессии генов и репликации ДНК. Сразу вслед за разработкой быстрых ме-

тодов секвенирования появились быстрые и простые методы синтеза сравнительно длин-

ных олигонуклеотидов с определенной, заранее заданной последовательностью.

Для секвенирования применяются методы Эдмана, Ф. Сэнгера и другие, а в настоя-

щее время уже существуют методы секвенирования «нового поколения». В некоторых из

них широко используются микро- и нанотехнологии для создания приборной основы се-

квенаторов.

5.5.3.1. Метод Сэнгера

Метод Эдмана (Edman) секвенирования биополимеров (белков и нуклеиновых кис-

лот) – последовательное отщепление аминокислот или нуклеотидов по одному с конца мо-

лекулы белка или нуклеиновой кислоты. Сейчас почти не применяется из-за ряда недо-

статков, в том числе метод не позволяет определить нуклеотидную или белковую последо-

вательность более чем 20 нуклеотидов (остатков аминокислот).

Широко распространенным методом секвенирования нуклеиновых кислот является

метод Сэнгера.

Метод Сэнгера – основан на присоединении к однонитчатой секвенируемой моле-

куле ДНК прямого или обратного секвенирующего праймера и синтезе молекулы нуклеи-

новой кислоты с применением, например, дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddNTP). При

этом синтезируются молекулы разной длины с определенным дидезоксинуклеотидом на

конце. После разделения синтезированных молекул методом электрофореза определяют их

последовательность.

Особенность метода заключается в использовании химически модифицированных

разновидностей четырех дезоксирибонуклеотидов, составляющих цепи ДНК. Каждая раз-

новидность «помечена» флуоресцентной молекулой-маркером. Короткий фрагмент ДНК,

называемый затравкой или праймером, инициирует синтез ДНК в определённой точке це-

пи ДНК-матрицы. Синтезирует комплементарную цепь особый фермент – ДНК-

полимераза. При этом видоизменённые разновидности нуклеотидов, которые присутству-

ют в реакционной смеси в значительно меньших количествах, чем обычные нуклеотиды,

обрывают синтез, когда один из них оказывается на конце растущей ДНК-цепи, т.к. видо-

измененные нуклеотиды не имеют той химической группы, к которой должен присоеди-

няться следующий нуклеотид для продолжения цепи. В результате получается смесь, со-

держащая полный набор синтезированных фрагментов ДНК, каждый из которых начина-

ется в одном и том же месте, но заканчивается во всех возможных положениях вдоль цепи

ДНК-матрицы. Автоматизированные секвенаторы разделяют эти фрагменты методом КЭ в

геле и регистрируют их. Таким образом определяется последовательность ДНК. Примене-

ние специального программного обеспечения позволяет из относительно коротких участ-

ков (до ~750 пар) выстроить полную последовательность генома.

106

Большинство новых разработок в области секвенирования направлено на миниатю-

ризацию, мультиплексирование (параллельное соединение низкопроизводительных блоков

системы для повышения общей производительности), автоматизацию процесса и умень-

шение стоимости секвенирования. Все они могут быть условно разделены на два класса.

Первый объединяет методы «секвенирования синтезом», в которых основания определя-

ются по мере того, как они встраиваются в растущую цепь ДНК. Ко второму классу отно-

сятся технологии расшифровки последовательности оснований единичной молекулы ДНК.

Некоторые из них достаточно экзотичны – как, например, чтение нуклеотидных остатков

ДНК электронным или оптическим способом по мере того, как молекула «протискивается»

через нанопору.

5.5.3.2. Высокопроизводительное пиросеквенирование ДНК (по Маргулису–Эгхольму–Ротбергу)

Этот метод секвенирования был создан под руководством Марселя Маргулиса и

Майкла Эгхольма из 454 Life Science Corporation в Коннектикуте. Кроме этой компании в

работе участвовали Калифорнийский университет, Рокфеллеровский университет и Рот-

берговский институт детских болезней. Технология, разработанная компанией 454 Life

Sciences, называется пирофосфатным секвенированием или пиросеквенированием.

Метод основан на технологии () – секвенирования. При последовательном добав-

лении к ДНК-полимеразному комплексу дезоксинуклеозидтрифосфатов, их включение в

синтезируемую нить зависит от нуклеотидной последовательности матрицы. Полимераз-

ный синтез ДНК сопровождается выделением пирофосфата, который в присутствии суль-

фурилазы и аденозинфосфосульфата преобразуется в АТФ и запускает окисление люцефе-

рина люциферазой, сопровождающееся биолюминесценцией. Сигнал люминесценции ре-

гистрируется фотоприемником. В первоначальном варианте использовался проточный ка-

пилляр, содержащий несколько иммобилизованных ферментов и анализируемую ДНК.

Технология, разработанная компанией 454 Life Sciences, позволяла проводить одно-

временное секвенирование сотен тысяч препаратов ДНК. Основные этапы технологии:

ультразвуковая фрагментация анализируемой ДНК;

пришивка адаптеров и денатурация ДНК (рис. 50, I);

получение эмульсии, содержащей в микрокаплях единичные фрагменты ДНК и по-

листирольные шарики с пришитым праймером (рис. 50, II);

проведение эмульсионной ПЦР;

отмывка микрошариков от реагентов и удаление несвязанных с шариками нитей

ДНК;

загрузка шариков в лунки проточной камеры (PicoTiterPlate) (рис. 50, III);

загрузка микрошариков с иммобилизованными ферментами (рис. 50, IV);

прокачка реагентов и регистрация сигналов люминесценции.

Весь геном, все его молекулы ДНК, случайным образом фрагментируются на ку-

сочки по 300–500 пар оснований. Затем комплементарные цепи фрагмента разделяются, а

к каждой цепи фрагментов пришивается одинаковый для всех олигонуклеотид-«адаптер»

(рис. 50, а), который позволяет отдельным цепям налипать на полимерные бусинки разме-

ром около 28 мкм (рис. 50, б). (Последовательность этого олигонуклеотида позволяет

позднее в процессе секвенирования распознавать ДНК-матрицу.) При этом смесь разъеди-

нённых на комплементарные цепи фрагментов разбавляют таким образом, что каждая бу-

синка получает лишь по одной индивидуальной цепи. Каждая бусинка оказывается заклю-

чённой в капельку, окруженную маслом и содержащую смесь для осуществления полиме-

разной цепной реакции (ПЦР) (рис. 50, в), которая и проходит отдельно в каждой капельке

107

эмульсии (так называемая эмульсионная ПЦР – эПЦР) (рис. 50, г). Это приводит к «кло-

нальной амплификации» цепей ДНК (на поверхности бусинки удерживается уже не одна, а

около 10 млн. копий уникальной ДНК-матрицы). Эмульсионная ПЦР позволяет амплифи-

цировать без всяких предпочтений единичные молекулы ДНК, заключая их в капельку

эмульсии и устраняя конкуренцию со стороны других ДНК-матриц за ограниченное число

ДНК-полимераз. Далее эмульсия разрушается, вновь двуцепочечные фрагменты ДНК (об-

разовавшиеся в ходе ПЦР) разделяются (рис. 50, д), и бусинки, несущие одноцепочечные

копии ДНК-матрицы, помещаются в ячейки слайда особой конструкции (рис. 50, е). Каж-

дая ячейка такого слайда образует отдельный пиколитровый «реактор», в котором и будет

происходить реакция секвенирования.

Рис. 50. Схема пиросеквенирования: а – ДНК фрагментируется, а к фрагментам пришиваются

олигонуклеотиды-«адаптеры»; б – одноцепочечные молекулы ДНК прикрепляются к бусинкам; в – бусинки

заключаются в капли реакционной смеси, изолированные маслом; г – в результате ПЦР на поверхности

бусинок образуется множество копий фрагмента; д – разрушение эмульсии и отделение бусинок;

е – размещение бусинок в ячейках слайда и добавление бусинок с ферментами для пиросеквенирования;

ж – реакция пиросеквенирования: присоединение очередного нуклеотида вызывает вспышку

хемилюминесценции, при присоединении нескольких нуклеотидов вспышка более яркая. I – прикрепление

одноцепочечных ДНК к бусинкам; II – изображение эмульсии с «пустыми» каплями и каплями с бусинками:

1 – капля (100-мкм), 2 – бусинка (28-мкм); III – перенос бусинок с копиями ДНК в слайд;

IV – добавление бусинок с ферментами и запуск ферментной реакции

108

Слайд представляет собой матрицу ячеек-реакторов глубиной около 50 мкм, с рас-

стоянием ~50 мкм между центрами соседних. Объём таких «реакторов» – 75 пиколитров;

плотность размещения на поверхности слайда – 480 ячеек на квадратный миллиметр. Каж-

дый слайд состоит примерно из 1,6 миллионов ячеек, в каждую из которых попадает одна

бусинка с ДНК-матрицей. Слайд помещается в проточную камеру таким образом, что над

отверстиями лунок создаётся канал высотой 300 мкм, по которому в лунки поступают не-

обходимые реактивы. Доставляемые в проточную камеру реактивы текут в слое, перпен-

дикулярном оси ячеек. Такая конфигурация позволяет одновременно осуществлять реак-

ции на бусинках, несущих ДНК-матрицы, внутри отдельных ячеек. Добавление и удаление

реагентов и продуктов реакции происходит за счёт конвекционного и диффузионного пе-

реноса. Помимо бусинок с ДНК-матрицей, в каждую ячейку «насыпают» ещё бусинок по-

мельче – каждая с «сидящими» на её поверхности (иммобилизованными) ферментами, не-

обходимыми для пирофосфатного секвенирования (рис. 50, IV). Нуклеотиды (одного ви-да

за раз) и другие реактивы, необходимые для реакции секвенирования, подаются после-

довательно в проточную камеру, куда помещается слайд. Каждый раз, когда определённый

нуклеотид (T, C, A, G) встраивается в растущую цепь ДНК в какой-нибудь из лунок, в ней

высвобождается молекула пирофосфата, которая является необходимым предшественни-

ком компонента другой ферментативной реакции. Её катализирует особый фермент, лю-

цифераза светлячка Photinus pyralis. Но для её осуществления необходим аденозинтри-

фосфат (АТФ). Новообразованный пирофосфат превращается в лунке в АТФ под действи-

ем ещё одного фермента – АТФ-сульфурилазы. Тогда люцифераза окисляет люциферин до

оксилюциферина, а эта реакция сопровождается хемилюминесценцией (рис. 50, ж). Дно

слайда находится в оптическом контакте с оптико-волоконным световодом, сопряженным

с высокочувствительным фотоприемным устройством, которое регистрирует излучаемые

фотоны от каждой индивидуальной ячейки, где произошло встраивание известного нук-

леотида.

Регистрируя вспышки хемилюминесценции от каждой ячейки в зависимости от ти-

па нуклеотида, присутствующего в проточной камере в данный момент времени, компью-

тер последовательно отслеживает рост цепочек ДНК во всех лунках одновременно. После

поступления в проточную камеру каждого нуклеотида, она промывается раствором, со-

держащим фермент апиразу. Таким образом, перед тем, как «запустить» в камеру следую-

щий нуклеотид, из всех лунок удаляются любые нуклеотиды, остававшиеся там от преды-

дущей реакции. Включение того или иного нуклеотида в результате высвобождения неор-

ганического пирофосфата сопровождается излучением света, которое регистрируется фо-

топриемным устройством.

Определить ячейки, содержащие бусинки с ДНК-матрицей, можно, прочитав «по-

следовательность-ключ» адаптерного олигонуклеотида, пришитого к началу каждой ДНК-

матрицы. Интенсивность регистрируемого сигнала для каждой ячейки во время поступле-

ния в проточную камеру определённого нуклеотида пропорциональна числу встроенных

нуклеотидов. При таком секвенировании синтезом небольшое число ДНК-матриц на каж-

дой бусинке теряет синхронизм, т. е. вырываются вперёд или начинают отставать от дру-

гих матриц. Причиной этого являются остающиеся в ячейке нуклеотиды или неполное

удлинение цепи. Потеря синхронизма создаёт кумулятивный эффект снижающий качество

прочтения при увеличении его длины. Поэтому был разработан алгоритм, позволяющий

оценивать и вносить поправки на учитывающие эти эффекты и неполную достройку цепи,

происходящие в отдельных ячейках.

Перед составлением полной последовательности прочитанной ДНК из всего масси-

ва данных на основе специальных правил отбираются высококачественные прочтения и

отбрасываются некачественные. Высокая точность расшифровки последовательности до-

стигается тем, что система осуществляет многочисленное прочтение одного и того же

109

фрагмента. Отдельные прочтения одного и того же участка ДНК выравниваются относи-

тельно друг друга исходя из интенсивности сигналов в момент протекания через камеру

того или иного нуклеотида, а не на основе последовательности этих прочтений. Соответ-

ствующие сигналы усредняют, и только тогда записывают полученную последователь-

ность. Такой подход улучшает качество расшифровки последовательности и предоставляет

возможность оценки её качества.

Для пиросеквенирования была создана коммерческая высокопроизводительная си-

стема – секвенатор Roche 454 Genome Sequencer FLX. Прибор Roche 454 GS20 использо-

вался для анализа 13 млн. пар оснований последовательности генома 28000-летнего ма-

монта и применяется в проекте расшифровки генома неандертальца. Количество выделяе-

мой из образцов древней ДНК неандертальца составляет всего лишь 5% от количества

ДНК, получаемого из «свежего материала», поэтому секвенировать приходится в 20 раз

больше.

На клеточном уровне новые методы секвенирования синтезом позволяют учёным

идентифицировать мутации в любом организме для всего генома.

Однако метод пиросеквенирования и его техническая реализация имеют определен-

ные недостатки, на устранение которых направлены усилия ученых и инженеров, занима-

ющихся этой технологией. В частности, для пиросеквенирования нужны однонитевые ку-

сочки ДНК, а не двунитевые, как при секвенировании по Сэнгеру, что усложняет состы-

ковку фрагментов. Чтение приходится повторять по нескольку раз, с различными набора-

ми перекрывающихся небольших кусочков, а потом реконструировать участок с помощью

компьютерных программ.

Улучшение технологии связывают с: а) снижением стоимости системы и расходных

реагентов; б) уменьшением процента ошибок секвенирования; в) увеличением длины чи-

таемых фрагментов.

Следует упомянуть о конкурирующих методах, среди которых можно выделить ме-

тод полони-секвенирования (polony sequencing). Название метода происходит от слов

«polymerase colony» – «полимеразная колония». Десятки миллионов индивидуальных

ДНК-фрагментов амплифицируются в тонком слое полиакриламидного геля. Поскольку

гель ограничивает диффузию, образуются сферические колонии ДНК – полонии, которые

напоминают бактериальные колонии. Затем двунитевую ДНК денатурируют, а на остав-

шихся однонитевых матрицах начинают секвенирование в реальном времени. К растущей

цепи присоединяются флуоресцирующие аналоги нуклеотидов. Колония, присоединившая

очередной нуклеотид, начинает светиться. Затем свечение нового нуклеотида гасят, отры-

вая и отмывая флуоресцентную группу. Повторяя циклы, регистрируя получаемое флуо-

ресцентное изображения, которое затем обрабатывается соответствующими программами,

можно считывать последовательность сразу во всех этих миллионах точек. Метод исполь-

зует очень маленькие фрагменты ДНК, следовательно, лучше подходит для повторного

чтения.

5.5.3.3. Секвенаторы «нового» поколения

Для снижения стоимости секвенирования и увеличения производительности в но-

вых методах определения нуклеотидной последовательности (Next-Generation Sequencing –

NGS) проводится секвенирование миллионов фрагментов ДНК одновременно. Существу-

ют разные подходы при создании секвенаторов. Для платформ «GS FLX», «SOLiD» и

«PGM» используется вариант эмульсионной ПЦР на микрошариках, на поверхности кото-

рых прикреплен один вид праймеров, комплементарных одному из адаптеров, располо-

женных на концах фрагментов ДНК. Секвенирование осуществляется в несколько этапов.

Начальный этап представляет собой фрагментацию длинных молекул ДНК, осуществляе-

110

мую ультразвуковым воздействием или ферментами, до размеров 50-1000 пар нуклеоти-

дов. Затем осуществляется обработка концов ДНК-фрагментов, в результате которой уда-

ляются или достраиваются выступающие концы, а затем лигируются адаптерные олиго-

нуклеотиды. Полученная таким образом исходная библиотека амплифицируется для уве-

личения представительности каждого фрагмента ДНК. Заключительный шаг – создание

молекулярных колоний путем клональной амплификации каждого фрагмента библиотеки

на твердой поверхности (подложка или микросфера). В случае использования микросфер

стремятся создать условия, при которых в каждой микрокапле с реакционной смесью в со-

ставе водно-масляной эмульсии содержалось бы не более одной микросферы и одного

фрагмента ДНК. Клональная амплификация необходима для усиления сигнала при детек-

тировании, т. к. после нее сигнал будет детектироваться от множества копий одного анали-

зируемого фрагмента ДНК. Созданная библиотека ДНК помещается в секвенатор, где че-

редуются стадии подачи реактивов для секвенирования со сканированием поверхности и

детектированием сигналов флуоресценции.

Развитием технологий и приборов секвенирования является создание компактных

систем – «персональных геномных машин-секвенаторов» (Personal Genome Machine –

PGM) Ion PGM и MiSeq фирмами Ion Torrent и Illumina. Обе системы имеют малые разме-

ры и высокую скорость, но ограниченную производительность, предназначены для не-

больших лабораторий и ориентированы на клинические приложения. Ion PGM был выпу-

щен в конце 2010 года и использует технологию ионного полупроводникового секвенирова-

ния (Ion Semiconductor Sequencing), основанную на регистрации эффекта выделения прото-

на при соединении нуклеотида с молекулой ДНК [96]. Эта технология также называется

рН-индуцированным секвенированием. PGM является первой коммерческой системой се-

квенирования, которая не использует методы флуоресценции, в результате чего достигает-

ся более высокая скорость, низкая стоимость и меньший размер прибора. В настоящее

время система PGM позволяет считывать 200 п. о. (пар оснований) за 2 часа, время подго-

товки образца составляет менее 6 часов. Примером эффективного применения системы Ion

Torrent PGM является выявление патогенных микроорганизмов. В мае и июне 2011 года в

Германии обнаружилась вспышка заболевания, вызванная токсином (Shiga-toxin), произ-

водимым Escherichia coli, в результате которой было заражено более 3000 человек. Секве-

нирование генома на системах Ion Torrent PGM и MiSeq Illumina помогли ученым опреде-

лить тип кишечной палочки и выявить ее устойчивость к антибиотикам. Обнаруженный

штамм оказался неизвестным гибридом двух штаммов. При этом система PGM продемон-

стрировала возможность выявления нового патогена.

На текущий момент времени существует третье поколение секвенаторов, отличаю-

щееся следующими особенностями: а) проведение ПЦР не требуется до стадии секвениро-

вания, что сокращает время на подготовку ДНК; б) сигнал регистрируется в реальном вре-

мени, не зависимо от того, люминесцентный он (секвенатор PacBio) или электрический

(секвенатор Nanopore) и контролируется в процессе ферментативной реакции при добав-

лении нуклеотидов в комплементарной нити. Методы секвенирования третьего поколения

(Next-Next-Generation Sequencing – NNGS) должны устранить основные недостатки мето-

дов второго поколения: сложную пробоподготовку, небольшую длину единичных прочте-

ний, необходимость амплификации каждого из анализируемых фрагментов ДНК, длитель-

ное время цикла, необходимость повторного секвенирования.

В системе секвенирования третьего поколения Nanopore применяется биопора

(α-гемолизин – αHL)) с нанометровым диаметром, которая образована в канале белка,

встроенного в липидный бислой, облегчающий ионный обмен. Если по обе стороны нано-

поры приложено напряжение, то из-за биологических особенностей нанопор, любое дви-

жение частиц может влиять на ток в канале (рис. 51).

111

Рис. 51. Одноцепочечная ДНК (ssDNA) транслоцируется через нанопору (белок α-гемолизин)

с помощью фермента ДНК-полимеразы бактериофага phi29 (phi29DNAP)

Основная концепция нанопористого секвенирования предполагает, что нить одно-

цепочечной ДНК проходит через поры α-гемолизина. Этот белок может выдерживать

напряжения до 100 мВ при токе 100 пА. В нанопоре при секвенировании ионный поток

течет постоянно. Изменение тока обнаруживается стандартными методами. Каждому типу

нуклеотидного основания соответствует свое изменение электропроводности из-за разли-

чия в размерах. Преимущества нанопорового секвенирования: возможность потенциально

достигнуть большой длины чтения > 5000 п. о. со скоростью 1 п. о./нс; нанопоровое секве-

нирование менее чувствительно к изменению температуры в течение всего процесса. Опе-

рации пробоподготовки в этом случае, такие как амплификация, могут быть значительно

сокращены. Однако подобная технология имеет серьезные недостатки, например, отсут-

ствие надежного контроля движения ДНК через нанопоры.

112

6. НАНОЧАСТИЦЫ И НАНОСТРУКТУРЫ В АНАЛИТИЧЕСКИХ МИКРОЧИПАХ

Микрофлюидные чипы можно характеризовать размерами структур – каналов, ре-

акторов или сосудов. Эти размеры составляют от нескольких микрометров до нескольких

сотен микрометров, что значительно больше размеров многих биологических структур и

молекул. Наноструктуры имеют хотя бы один характерный размер в интервале от 1 до 100

нм. А этому интервалу принадлежат размеры многих биологических частиц (рис. 52). Та-

ким образом, переход от микрофлюидики к нанофлюидике позволяет эффективно воздей-

ствовать на единичные биологические объекты. Но, с другой стороны нанофлюидика под-

разумевает и применение микрофлюидики – хотя бы потому, что необходимо использо-

вать некие промежуточные системы, например, гидравлические и пневматические интер-

фейсы при вводе пробы извне. Поэтому, скорее корректнее говорить об использовании

наноструктур в микрофлюидике.

Рис. 52. Биологические структуры и наночастицы

Итак, если мы имеем дело со структурами нанометрового размера, следует выде-

лить ряд особенностей:

В наномасштабе жидкости имеют свойства, которые не могут быть рассмотрены

в рамках модели сплошной среды,

Наблюдается доминирование эффектов, связанных с поверхностью (взаимодей-

ствие между поверхностью и молекулами более существенно, чем между молекулами и

растворителем),

Существенно проявляются эффекты поверхностного натяжения,

Значительны явления, связанные с двойным электрическим слоем (особенно в

наноканалах, нанопорах, мембранах и т.п.),

Проявляются размерно-зависимые явления, связанные с соотношением размеров

молекул и наноструктур,

Наблюдаются явления, связанные с энтропией и т.д.

113

Например, законы диффузии наночастиц существенно отличаются от соответству-

ющих законов и для молекул, и для броуновских частиц. Это, должно означать, что сила,

действующая со стороны жидкости, не будет описываться классическими соотношениями.

Изучение силы сопротивления, действующей на наночастицу в молекулярной среде, явля-

ется достаточно сложной задачей. В большинстве из известных работ сила сопротивления

F не измеряется, а восстанавливается по коэффициенту диффузии D с помощью соотно-

шения Эйнштейна:

D

TvkF B

,

где v – скорость частицы, T – температура среды, а kB – постоянная Больцмана.

Наноструктуры в микрофлюидике могут быть использованы для:

управления движением молекул и частиц (электроосмотические нанонасосы,

клапаны и т.д.),

концентрирования, разделения и извлечения частиц (нанопористые мембраны,

колонки, сетки и т.д.),

создания большой активной поверхности (смешивание пробы и реагентов, про-

ведения реакций, теплообмене и т.п.).

Некоторые вопросы применения наноструктур для разделения компонентов уже

рассматривались ранее. Отметим, что развитие технологий получения нанопористого

кремния и стекла с заданными характеристиками привело к возможности их использова-

ния в качестве своеобразных фильтров и сред разделения при анализе биологических проб.

Внедрение нанопористых структур в микрофлюидный канал позволяет получить своеоб-

разную высокоэффективную колонку для разделения пробы.

Для извлечения и концентрирования искомых компонентов используются различ-

ные методы и способы, которые непрерывно совершенствуются. Следует упомянуть спо-

соб извлечения с помощью пересекающихся микрофлюидных каналов, разделенных мем-

браной с нанопорами, позволяющими осуществлять извлечение компонентов и последую-

щее их концентрирование. Если между каналами существует электрический потенциал, то

включаются дополнительные эффективные механизмы переноса частиц.

Важными функциональными устройствами микрофлюидики являются смесители и

реакторы. Существуют современные технологии с применением фотоотверждаемых ком-

позиций и специальных шаблонов, позволяющие создавать трехмерные структуры с доста-

точно узкими «протоками» (50-350 нм). Подобные структуры используются как реакторы

и высокоэффективные смесители в микрофлюидных чипах.

Наноматериалы имеют достаточно широкое применение в биологии и медицине,

они могут использоваться:

– как флуоресцентные метки,

– как транспортные частицы при доставке лекарств и других объектов,

– при обнаружении белков, болезнетворных микроорганизмов и т.д.,

– при исследовании структуры ДНК,

– при создании биосовместимых материалов (тканей),

– при разрушении опухоли посредством нагревание (hyperthermia),

– при разделении и очистке биологических молекул и клеток,

– для повышения контраста при медицинских исследованиях (контрастирующие

вещества),

и т.д.

Например, в лабораторных исследованиях и клинической практике для диагностики

и лечения раковых опухолей применяются методы фотодинамической терапии (ФДТ) и

114

магниторезонансной томографии (МРТ), которые основаны на введение в организм неко-

торых специальных веществ. В случае ФДТ это красители (сенсибилизаторы), вызываю-

щие выработку активных форм кислорода в ответ на облучение светом; для МРТ – контра-

стирующие агенты, такие, как суперпарамагнитные частицы оксида железа. Так как иногда

красители для ФДТ бывают токсичны для клеток, то их заключают в частицы из биосовме-

стимого материала (например, диоксида кремния). В настоящее время наблюдается тен-

денция синтеза наночастиц,с различными свойствами и хорошей биосовместимостью.

В микрофлюидике наночастицы могут быть использованы как:

специфические метки биологических молекул (квантовые «точки», флуоресцент-

ные, электрохимические и т.д.),

транспортные частицы для переноса иммобилизованных объектов (магнитные

наночастицы и подобные системы),

среды для разделения и фильтрации пробы,

элементы для воздействия на пробу (локальный нагрев пробы).

6.1. Обнаружение отдельных молекул и частиц. Наночастицы – носители иммобилизованных объектов

Для обнаружения отдельных молекул и частиц часто используются устройства с

нанопорами. На рис. 53 приведен пример устройства для флуоресцентного детектирования

меченых энзимов в стеклянном микрочипе с нанопорами. На микрочип с металлической

тонкопленочной маской, в которой изготовлены нанопоры, с помощью объектива фокуси-

руется возбуждающее излучение. Излучение проникает через нанопоры только на неболь-

шую глубину, где возбуждает флуоресценцию. Световой поток флуоресценции тем же

объективом через дихроичное зеркало передается на фотоприемное устройство. Таким об-

разом, реализуется возможность регистрации молекул в тонком слое.

Рис. 53. Устройство для флуоресцентного детектирования меченных молекул

в стеклянном микрочипе с нанопорами

115

Нанопоры успешно применяются и при электрохимическом детектировании. При

невысоких концентрациях, транспорт молекул через нанофлюидные каналы (нанопоры)

может быть обнаружен методом электрохимического детектирования с разрешением на

уровне отдельных частиц, что позволяет создать новые типы биосенсоров. На рис. 54 при-

веден вариант планарного микрочипа для одномолекулярного детектирования. В этом

устройстве ионный ток через нанопору подавлен закрывающей нанотрубкой, соединенной

с кантеливером атомно-силового микроскопа. Меняя частоту колебаний кантеливера,

можно открывать и закрывать транспортный канал через пору. Кроме этого, такое устрой-

ство позволяет изучать взаимодействия молекула-нанотрубка-нанопора.

Другой пример микрофлюидного устройства для анализа молекул ДНК с использо-

ванием нанопор приведен на рис. 55. В полидиметилсилоксановый микрофлюидный чип

встроена мембрана из нитрида кремния с диаметром отверстия ~4 нм. По обе стороны от-

верстия расположены резервуары и электроды, к которым приложено внешнее напряже-

ние. Перемещение молекулы ДНК через это отверстие (нанопору) под действием электри-

ческого поля вызывает изменение тока в цепи. Длительность регистрируемого сигнала за-

висит от длины молекулы. Таким образом, измеряя параметры электрического сигнала,

можно получить информацию о размерах молекулы ДНК.

Рис. 54. Устройство для электрохимического детектирования

Однако существенным недостатком при использовании нанопор является достаточ-

но быстрое «забивание» пор, что приводит к необходимости предварительной очистки

пробы и контроле за текущим состоянием поры.

Рис. 55. Микрофлюидное устройство с нанопорой для анализа молекул ДНК: а – прохождение ДНК

через нанопору; б – схема эксперимента по регистрации молекул ДНК; в – СЭМ – изображение нанопоры

116

Устройства, в которых применяются нитевидные нанокристаллы, лишены этого не-

достатка и позволяют создавать новые ультрачувствительные электрические датчики для

прямого обнаружения биологических и химических молекул (Charles M. Lieber, 2004). Ме-

ханизм нанокристаллических датчиков основан на полевом эффекте, используемом в тран-

зисторах. Полупроводник p-типа, на котором мобилизованы антитела (или иные рецепто-

ры), связан с металлической поверхностью и электродами, через которые подается потен-

циал. В этой цепи измеряется изменение проводимости полупроводника, которая резко

меняется при специфическом взаимодействии рецепторов с определяемым компонентом

(антигеном, белком) (рис. 56). То есть химические или биологические взаимодействия

преобразуются непосредственно в электрические сигналы. Применение линейки таких

электродов с различными рецепторами интегрированной в канал микрофлюидного чипа

позволяет осуществлять комплексный анализ пробы. Метод предложен для обнаружения

белков, вирусов и ДНК. Так как размер наночастицы соизмерим с размерами белка, то это

делает наноматериалы удобными для биомаркировки. Чтобы обеспечить взаимодействие с

биологическим объектом, наночастица должна иметь соответствующее внешнее покрытие

(слой), который обеспечивает специфическое взаимодействие. Примерами таких слоев мо-

гут являться антитела, биополимеры, монослои молекул, делающие наночастицы биологи-

чески совместимыми. Если используются оптические методы регистрации этих частиц, то

частица должна обладать соответствующими оптическими свойствами (высоким поглоще-

нием, рассеянием, флуоресценцией). Если частица выполняет только транспортные функ-

ции, то важными становятся ее магнитные и электрические свойства, способность «вме-

щать» определенное количество «перевозимого» материала, устойчивость к проявлению

внешних воздействий.

Рис. 56. Принцип действия электрического датчика

для прямого обнаружения биологических и химических молекул

В настоящее время множество применений нашли магнитные наночастицы

(рис. 57), в том числе для изучения клеток. Поскольку химия металлических поверхностей

хорошо развита, то к металлическим наночастицам могут быть присоединены различные

компоненты. Более того, можно пометить частицу даже несколькими флуоресцентными

зондами так, что спектр флуоресценции будет нести информацию о том, какая реакция

117

произошла. Магнитные свойства частицы могут использоваться при управлении их дви-

жением – перемещением в нужную область.

Рис. 57. Магнитные наночастицы

6.2. Применение квантовых точек при обнаружении биологических объектов

Квантовая точка (quantum dot – QD) – фрагмент проводника или полупроводника,

ограниченный по всем трём пространственным измерениям и содержащий электроны про-

водимости. Точка должна быть настолько малой, чтобы были существенны квантовые эф-

фекты.

Диагностика заболеваний с помощью квантовых точек основана на отслеживании

перемещения внутри организма различных веществ (лекарств, токсинов и т.д.). Определив

эти движения, области накопления метки можно узнать степень распределения и введения

новых препаратов. До применения квантовых точек вместо них использовали маркеры на

основе органических красителей, что приводило к негативным побочным эффектам. В от-

личие от них квантовые точки как полупроводниковые кристаллы нанометрового размера

лишены этого недостатка.

Квантовые точки (КТ) составных полупроводников успешно используются как за-

мена органических флуоресцентных меток в различных биоаналитических применениях, а

возможность объединения нескольких точек в одной конструкции – микрочастице, позво-

ляет обеспечить флуоресценцию частицы на разных длинах волн. Такой подход позволяет

реализовать различные комбинаторные методы исследования. Основной проблемой явля-

ется создание вокруг КТ инертной стабильной оболочки, препятствующей прямому кон-

такту КТ с биологическим образцом. Эта же оболочка должна позволять проводить иммо-

билизацию специфичных молекул или биологических маркеров, т.е. квантовые точки

должны быть химически связаны с биологическими молекулами (антителами, пептидами,

белками или ДНК), что позволит КТ избирательно соединяться с аналитом.

Примером практического использования квантовых точек для детектирования ис-

комых объектов могут служить разработки Американской Военно-морской Научно-

118

исследовательской лаборатории (The U.S. Naval Research Laboratory – NRL). В этой лабо-

ратории были созданы люминесцентные детекторы на основе полупроводниковых нано-

кристаллов или квантовых точек. КТ (CdSe или CdTe) имеют следующие привлекательные

свойства для оптического обнаружения в видимой области спектра: возбуждение в широ-

кой полосе и фотолюминесценцию с узкой полосой эмиссии (ширина в 0.5 максимума ~

25-45нм). При этом удается одновременно возбуждать несколько частиц. К тому же КТ

обладают исключительной фотохимической стабильностью и высоким квантовым выхо-

дом. Созданный в NRL наносенсор состоит из КТ, окруженных меченым белком. При ре-

акции с меченым белком аналит замещает окрашенный меченый комплекс, изменяя флюо-

ресценцию наносенсора, что может быть зарегистрировано оптическими методами. В NRL

разрабатываются наносенсоры на КТ с целью получения высокоселективных и чувстви-

тельных детекторов патогенов и взрывчатых веществ.

В Корнельском университете (Cornell University) ученые занимаются созданием КТ

для исследований живых тканей и клеток. Предложенная технология заключается в обра-

ботке КТ специальными покрытиями для придания нужных свойств. "Cornell dots" или

"CU dots" – наночастицы, состоящие из ядра диаметром 2,2 нм, помещенного в кремние-

вую оболочку с флуоресцирующими молекулами. Такие КТ были успешно использованы

при визуализации раковых клеток в образцах ткани человека, больного лейкемией.

7. Медицинские наномашины

7.1. Нанороботы

Нанороботы или наноботы – управляемые устройства, размер которых сопоставим

с размерами молекул (в некоторых случаях допускается – до микронных размеров), со-

ставленные из наноразмерных компонентов и обладающие функциями движения, обработ-

ки и передачи информации, а также исполнения программ.

Нанороботостроение – мультидисциплинарная область, в которой сосредоточены

совместные усилия физиков, химиков, биологов, программистов, инженеров и других спе-

циалистов для получения положительных результатов (рис. 58).

Существуют и другие определения, которые описывают наноробота как машину,

способную точно взаимодействовать с наноразмерными объектами или способную мани-

пулировать объектами в наномасштабе. Иногда даже крупные аппараты, такие как атомно-

силовой микроскоп, считают нанороботами, т. к. они производит манипуляции с объекта-

ми на наноуровне.

В то время как микророботы, при создании которых используются технологии

МЭМС, состоят из миллиардов атомов, нанороботы, вероятно, будут изготавливаться пу-

тем сборки индивидуальных атомов или молекул.

Существует множество сходств и различий между микро- и нано- размерными ро-

ботами. Различия, главным образом, касаются основных законов динамики. Макроразмер-

ные роботы по существу подчиняются законам ньютоновой механики, тогда для наноро-

ботов имеют место законы молекулярной квантовой механики. Кроме того, принципы не-

определенности играют существенную роль в наноразмерных системах. Неопределенность

положения наносистемы определяется правилами квантования и тепловыми полями.

119

Рис. 58. Взаимосвязь различных дисциплин при создании

бионанороботов (C. Mavroidis, 2008)

Так как нанороботы невидимы для невооруженного глаза, то для работы с ними

необходимо использовать методы высокоразрешающей микроскопии (сканирующей элек-

тронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии, микроскопии ближнего поля). Для

получения более полной информации о наноструктурах применяются методы моделирова-

ния виртуальной реальности (ВР) на основе получаемых сигналов от наноструктур. Эти

методы в настоящее время отрабатываются в нанотехнологии и биотехнологии, как способ

усилить восприятие оператора (визуальное и осязательное) для более адекватного пред-

ставления о наноструктурах. Методы ВР также могут позволить: а) развить технологии

сборки нано- и био- компонентов роботов, обслуживания и ремонта наноструктур; б) по-

лучить новые знания о процессах движения и взаимодействия на наноуровне.

Нанороботы с полностью искусственными компонентами пока еще не созданы и

находятся в стадии научно-исследовательской разработки, но, тем не менее, имеются не-

которые прототипы молекулярных машин. Исследования в этой области, в основном, со-

средоточены на молекулярных машинах, идея которых подсказана природой.

Малые размеры нанороботов требуют большого их количества для выполнения

микроскопических и макроскопических работ. Это приводит к необходимости рассмотре-

ния некоторой колонии (стаи) роботов, их взаимодействия между собой и процессов

управления. Выделяют нанороботов: а) способных к самостоятельному воспроизводству

(репликации) в окружающей среде ("серая слизь" и др.) и б) не способных к репликации

("сервисный туман").

Серая слизь (термин впервые был использован Э. Дрекслером в его книге «Машины

созидания», 1986 г.) – гипотетический сценарий конца света, связанный с разработкой мо-

лекулярных нанотехнологий и предсказывающий, что неуправляемые самореплицирую-

щиеся нанороботы поглотят всю биомассу Земли, выполняя программу саморазмножения

(сценарий известен также под названием «экофагия»). Дрекслер отмечает, что размноже-

ние в геометрической прогрессии из-за самовоспроизводства, по своей природе ограниче-

но доступностью подходящего сырья.

Другой известный исследователь и эксперт в области нанотехнологий Р. Фрейтас

для описания возможного сценария развития биосферы при выходе нанотехнологий из-под

120

контроля предложил термин экофагия (от греч. Οικος – дом и Φαγος пожирающий). Сцена-

рий предполагает, что никем не контролируемые самовоспроизводящиеся нанороботы

«съедят» всё живое вещество на планете. Термин экофагия может применяться по отно-

шению к любому явлению или процессу, способному изменить биосферу – ядерной войне,

космическим катаклизмам, резкому сокращению биоразнообразия, чрезмерному размно-

жению одного вида. Такие события могут привести к экоциду – нарушению способности

биосферы к самовосстановлению.

Э. Дрекслер в своих работах описал некоторые методы лечения и диагностики на

основе нанотехнологий. Ключевой проблемой этих методов является создание машин для

ремонта клеток, прототипами которых являются нанороботы (ассемблеры или репликато-

ры). Медицинские нанороботы должны диагностировать болезни, доставлять лекарства и

проводить хирургические операции. Кроме того, представляется актуальным проводить с

помощь нанороботов анализ деятельности нервной системе, а также корректировку ДНК.

Типичный медицинский наноробот, по видимому будет иметь микронные размеры,

которые дают возможность двигаться по капиллярам, и состоять (на базе нынешних взгля-

дов) из высокопрочных и химически инертных материалов на основе углерода и его про-

изводных. В качестве основных источников энергии предполагается использовать локаль-

ные запасы глюкозы и аминокислот в теле человека. Лечение будет заключаться во введе-

нии нанороботов в человеческое тело для анализа ситуации и принятия решения о выборе

метода лечения. Для коммуникации нанороботов в жидких средах могут быть использова-

ны акустические сигналы, световые (электромагнитные) излучения, химические процессы.

Химические реакции могут быть полезными для ближней ориентации и коммуникации

нанороботов. Акустические сигналы являются более предпочтительными на дальних рас-

стояниях, а оптическая связь, хотя и является более быстродействующей, потребляет зна-

чительное количество энергии.

Существует классификация медицинских роботов в зависимости от выполняемых

программ на микрофагоциты, респироциты, клоттоциты, васкулоиды и другие.

Микрофагоциты являются искусственными иммунными клетками, предназначен-

ными для очищения крови от вредных микроорганизмов, обеспечения свертывания крови,

транспорта кислорода и углекислого газа и расширения возможностей иммунной системы.

Микрофагоциты будут находить в организме человека чужеродные элементы и перераба-

тывать их в нейтральные соединения.

Респироциты – аналоги эритроцитов (красных кровяных телец, доставляющих кис-

лород к клеткам), которые должны иметь большую функциональность, чем природные

эритроциты.

Клоттоциты – аналоги тромбоцитов (клеток, участвующих в свертывании крови).

Эти машины позволят быстро прекращать кровотечения. Их функция заключается в опе-

ративной доставке к месту кровотечения связывающей сети, которая должна задерживать

кровяные клетки, останавливая ток крови. Время и место выброса сети задается внешними

сигналами или определяется по парциальному давлению газов.

Васкулоид – механический протез, созданный на основе микрофагоцитов, респиро-

цитов и клоттоцитов, и входящий в состав проекта по созданию робототехнической крови

("Roboblood", разработанный К. Фениксом и Р. Фрайтасом). В этом проекте описан ком-

плекс медицинских нанороботов, способных жить и функционировать в теле человека, вы-

полняя все функции естественной кровеносной системы.

В настоящее время развиваются разнообразные направления проектирования нано-

роботов: создаются элементы для зондирования, навигация, инструментарий для манипу-

ляций, двигательные аппараты, молекулярные моторы и процессоры, предназначенные для

решения медицинских задач. Хотя большая часть проблем наноизготовления не решена и

отсутствуют детальные инженерные подходы, но уже создано «Сотрудничество по разра-

121

ботке нанофабрик» (основанное Р. Фрейтасом и Р. Меркле в 2000 году). Деятельность

«Сотрудничества» связана с разработкой практической программы исследований по со-

зданию контролируемой алмазной механосинтетической нанофабрики, которая будет спо-

собна производить медицинские нанороботы на основе алмазных соединений. Существу-

ют и другие подходы к созданию нанороботов, основанные на использовании биологиче-

ских молекул и структур.

Предполагается, что нанороботы могут составлять любую пассивную или активную

структуру (в наномасштабе) способную к некоторым действиям, чувствительности к ком-

понентам, передаче сигналов, обработке информации, интеллектуальному поведению роя

роботов. Поэтому уместно привести некоторые характерные способности, желательные

для функционирования нанороботов:

1. Интеллект роя (кооперативный и распределенный интеллект),

2. Совместное (взаимоувязанное) поведение,

3. Самосборка и репликация,

4. Обработка информации и программируемость (важно для автономных наноробо-

тов),

5. Наличие соответствующей архитектуры интерфейсов от нано- к макро, позволя-

ющей получить мгновенный доступ к нанороботу для его управления и обслуживания.

Эксперты выделяют следующие потенциальные сферы применения наноробо-

тов в недалеком будущем:

диагностика рака и целенаправленная доставка лекарств в раковые клетки,

биомедицинский инструментарий,

хирургия,

фармакокинетика,

мониторинг больных диабетом,

производство посредством молекулярной сборки нанороботами устройства из

отдельных молекул по его чертежам,

военные технологии,

космические исследования и разработки.

7.2. Био- нанороботы

Био- нанороботы – нанороботы, при создании которых используются биологиче-

ские материалы (в том числе белки, ДНК и т.д.). Например, К. Мавродис (Constantinos

Mavroidis) полагает, что при разработке био- нанороботов следует руководствоваться сле-

дующими принципами:

использование модульной организации и иерархии;

применение концепции универсального шаблона, из которого можно создать

любую требуемую систему;

создание информационных модулей, в том числе для хранения, обработки ин-

формации и программирования;

объединение информационных модулей с функциональными возможностями

роста и развития (основа био- нано- интеллекта).

Модульная организация определяет фундаментальные правила и иерархию построения

био- наноробототизированных систем. Построение осуществляется через устойчивую инте-

грацию индивидуальных био- модулей или нано- компонентов, которые впоследствии и со-

122

ставят наноробот. Модульная организация позволяет био- нанороботам с определенными

свойствами организовывать рои, что является желательным для некоторых применений.

Модульная организация дает возможность создавать достаточно сложные мно-

гофункциональные био- нанороботы, например, состоящие из био- модулей A, B, C и D

(рис. 59). В модуле А (SPHERE) могут быть расположены система энергоснабжения и ин-

формационный блок робота. Элемент DISC представляет некоторую пространственную

область, определенную для Модуля D и для возможных его связей с другими внутренними

ядрами. Окружающее ядро кольцо представляет пространственную область, определенную

на внутреннем ядре для закрепления Модуля B и Модуля C.

Модульная конструкция предполагает наличие универсального шаблона для био-

нано- систем и элементов, которые возможно трансформировать в любую наносистему с

требуемыми свойствами. Эта концепция повторяет природную концепцию развития эм-

бриональных стволовых клеток, которые являются своего рода примитивными клетками,

но дают начало всем другим специализированным тканям человеческого тела.

Чтобы точно управлять биомолекулами необходимы инструменты, которые могут

взаимодействовать с этими объектами в нано масштабе в естественных окружающих сре-

дах. Существующие био- нанометоды манипуляции могут быть классифицированы как

бесконтактные манипуляции, включая методы оптического и магнитного пинцета, и кон-

тактные манипуляции, например, взаимодействия через зонд АСМ.

Управление наноробототехническими системами может осуществляться: i) внут-

ренними механизмами управления, ii) внешними механизмами управления или гибридом

внутренних и внешних механизмов управления.

Внутренний механизм управления может быть активным и пассивным. Пассивный

механизм – традиционный тип управления, который зависит от биохимической чувстви-

тельности и селективности связей биомолекул с другими элементами. Этот механизм эф-

фективен, если известно как различные биомолекулы влияют на целевую молекулу. Ак-

тивный механизм управления является более сложным, так как предполагает изменение

свойств элементов наноробота в зависимости от внешнего окружения (или от ситуации). В

этом случае полезным является использование концепций молекулярных компьютеров.

Внешний механизм управления предполагает воздействие внешних полей на нано-

робот, приводящее к изменению динамики его движения в среде. Аналогичный подход ис-

пользуется, например, при управлении движением и ориентацией магнитных наночастиц в

градиенте магнитного поля.

Рис. 59. Модульная организация био- наноробота

123

7.3. Молекулярные машины. Наноразмерные исполнительные механизмы

В современной инженерии (в том числе и роботостроении) достаточно часто и

успешно используется биомиметика, позволяющая создавать эффективные конструкции.

Биомиметика (от лат. bios – жизнь, и mimesis – подражание) – подход к созданию техноло-

гических устройств, при котором идея и основные элементы устройства заимствуются из

живой природы.

Важным элементом наноробота является механизм, позволяющий ему перемещать-

ся в пространстве. В природе встречается множество отработанных в течение столетий

нанотехнологических механизмов и конструкций, принципы действия которых успешно

используются в технике. Например, в некоторых конструкциях применяется принцип

«ресничного» движения, встречающийся в природе (рис. 60, а). За счет колебания упругих

элементов – «ресничек» осуществляется перемещение предметов или же движение объекта

по поверхности (рис. 60, б).

Биологические системы имеют совершенные молекулярные машины, действующие

по адаптивной программе, зачастую поражающей своей эффективностью, а порой – и

сложностью. К таковым следует отнести и молекулярные двигатели. Большинство есте-

ственных молекулярных механизмов в природе создано на основе белков, которые служат

для решения задач транспорта, катализа реакций и т.д., в то время как ДНК выполняет в

основном роль информационного хранилища.

Молекулярные двигатели – наноразмерные машины, способные осуществлять вращение

при приложении к ним энергии. Традиционно термин "молекулярный двигатели" приме-

няется, когда речь заходит об органических белковых соединениях. Однако, в настоящее

время его применяют и для обозначения неорганических молекулярных двигателей и ис-

пользуют в качестве обобщающего понятия. Возможность создания молекулярных мото-

ров впервые была озвучена Р. Фейнманом в 1959 году.

7.3.1. АТФ-синтаза

АТФ-синтаза – фермент, осуществляющий реакцию синтеза АТФ из АДФ и фос-

фат-аниона за счёт энергии трансмембранного протонного градиента, преобразуя её, таким

образом, в энергию химических связей, которая может быть использована клеткой в био-

химических реакциях. В случае, если фермент проводит обратный процесс: формирует

трансмембранный протонный градиент за счёт гидролиза АТФ – его называют аденозин-

трифосфатазой, или АТФ-азой. Было установлено, что при гидролизе АТФ одна из частей

энзима совершает вращательное движение, что может быть использовано при создании

молекулярного двигателя.

Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ, аденинтрифосфорная кислота) – нуклео-

тид, играет исключительно важную роль в обмене энергии и веществ в организмах; в

первую очередь соединение известно как универсальный источник энергии для всех био-

химических процессов, протекающих в живых системах. Главная роль АТФ в организме

связана с обеспечением энергией многочисленных биохимических реакций. Являясь носи-

телем двух высокоэнергетических связей, АТФ служит непосредственным источником

энергии для множества энергозатратных биохимических и физиологических процессов.

Все это – реакции синтеза сложных веществ в организме: осуществление активного пере-

носа молекул через биологические мембраны, в том числе, для создания трансмембранно-

го электрического потенциала; осуществления мышечного сокращения.

124

АТФ-аза состоит из двух отдельных частей: (1) F0, гидрофобной части, связанной с

мембраной, ответственной за транспорт протонов, и (2) F1, гидрофильной части, ответ-

ственной за синтез и гидролиз АТФ (см. рис. 61). Размер комплекса АТФ-азы ~ 12 нм в

диаметре. По мере того как протоны протекают через F0 часть энзима, γ-субъединица ча-

сти F1-ATФазы вращается по часовой стрелке и идет синтез АТФ.

Рис. 60. Принцип «ресничного» движения: a – система перемещения объекта, используемая

в природе; б – изображение микроконвейера, основанного на принципе «ресничного» движения

[H. Fujita, Университет Токио, Японии]

Рис. 61. Строение и модель энзима АТФ-аза

125

Гидролиз АТФ происходит при вращении γ-субъединицы против часовой стрелки;

при этом направление протекания протонов меняется на обратное. Субъединицы a, b, и c

части F0-АТФ-азы формируют канал переноса протонов через клеточную мембрану. Места

катализа и присоединения нуклеотидов были обнаружены исследователями (Kinosita и др.,

1998) на трех α и трех β субъединицах части F1-ATФ-азы. γ-субъединица расположена в

центре гексамера α3β3 и вращается при синтезе или гидролизе АТФ. Итак, АТФ-аза пре-

вращает движение протонов внутри клетки в механическое вращение по оси, помогая об-

разовывать АТФ. Причем действие АТФ-азы обратимо: если на этот цилиндрический мо-

торчик подавать АТФ, он будет "сжигать" ее, и ось придет во вращение. Японские биохи-

мики из Токийского технологического института смогли наблюдать это движение, при-

крепив к концу оси флуоресцирующую молекулу. Исследователи заключили, что кпд тако-

го двигателя близок к ста процентам.

7.3.2. Кинезин, миозин, жгутиковый молекулярный двигатель

Другой известный биологический двигатель – молекула белка кинезина. Представи-

тели семейства кинезинов играют важную роль во многих клеточных процессах. Молекула

кинезина может двигаться вдоль полимерных нитей, используя в качестве "топлива" моле-

кулы АТФ. К подобным двигателям относятся белки актомиозинового комплекса, входя-

щего в состав сократительного аппарата мышц. Движение микроворсинок (жгутиков и

ресничек бактерий и простейших) определяется взаимодействием другой пары моторных

белков – динеина и тубулина. Смещение головок динеина относительно тубулиновых мик-

ротрубочек белков обеспечивает волнообразные движения микроворсинок. Среди большо-

го числа моторных белков миозин скелетных мышц и кинезин из клеток мозга являются

наиболее изученными молекулярными моторами. Несмотря на то, что функции миозина и

кинезина в клетке различаются, они похожи по своему строению и механизмам действия.

Совместно с микротрубками цитоскелета молекула кинезина выполняет транспорт

веществ внутри клетки и перемещение везикул. Микротрубки играют роль своеобразных

направляющих, по которым перемещаются молекулы белков кинезина с полезным грузом.

Один конец этой молекулы прикрепляется к везикуле, которую необходимо транспортиро-

вать, а другой – к микротрубке, которая направляет движение (рис. 62).

Молекула кинезина представляет собой димер, образованный двумя одинаковыми

полипептидными цепями. С одной стороны каждой полипептидной цепи кинезина форми-

руется глобулярная головка, соединенная со сравнительно длинным хвостом. Линейные

размеры головки составляют 7,5 х 4,5 х 4,5 нм. Длина молекулы около 50 нанометров.

Рис. 62. Схема молекулы кинезина и стадии перемещения молекулы

кинезина вдоль микротрубочки, состоящей из мономеров тубулина

126

Хвосты двух мономерных цепей сплетены вместе, а наклоненные в разные стороны

головки образуют своеобразную V-образную структуру, взаимодействующую с глобуляр-

ными мономерами микротрубочки, вдоль которой перемещается кинезин. Молекула, пе-

ремещаясь вдоль микротрубки, делает дискретные 8-нм шаги. Коэффициент полезного

действия кинезинового двигателя около 50%. В процессе перемещения молекула кинезина

может расщепить за одну секунду до 100 молекул АТФ, сместившись на 800 нанометров.

Одноклеточные организмы, типа бактерий Escherichia coli имеют оригинальный

способ передвижения в вязкой среде с помощью молекулярных двигателей в виде «жгути-

ков» приблизительно 45 нм в диаметре. Подвижность является критической для клеток,

поскольку они часто должны перемещаться от области не благоприятной до более прием-

лемой для существования окружающей среды. «Жгутики» представляют собой винтовые

нити, которые ввинчиваются из клетки в среду и выполняют функцию, аналогичную винту

или штопору. Вращение двигателей «жгутиков» стимулируется потоком ионов через них,

который является результатом изменения трансмембранного транспорта ионов (рис. 63).

Когда «жгутики» начинают синхронно вращаться против часовой стрелки, они сплетаются

в единый пучок, который образует своеобразный винт. Вращение винта (скорость 300 обо-

ротов в секунду, вращающий момент ~550 пН•нм) создает движущую силу. После того как

направление вращения «жгутиков» изменяется на противоположное, пучок расплетается и

бактерия останавливается. Вместо поступательного движения она начинает хаотически

вращаться, меняя ориентацию. Такие двигатели позволяют бактериям перемещаться со

скоростями около 25 мкм/сек. Подобными механизмами оснащены различные виды бакте-

рий.

Рис. 63. «Жгутиковый» двигатель

7.3.3. Неорганические (химические) молекулярные двигатели

Химические технологии, в частности молекулярный синтез, также позволяют создавать

различные виды молекулярных двигателей. Многие из них имеют явное подобие с макромас-

штабными механизмами и содержат молекулы углерода, азота, водорода, ионы металлов и т.д.

Соединение элементов в единую конструкцию основано на электростатических взаимодействи-

ях, ковалентной и водородной связях. Химические механизмы управляются различными спосо-

бами: с помощью химических, электрохимических и фотохимических реакций.

127

7.4. Самосборка нанороботов

Наиболее привлекательным, конечно, является использование биологических моле-

кул для реализации управляемого процесса «самосборки». При этом необходимо решить

следующие проблемы: как спроектировать молекулу или систему с желаемыми характери-

стиками и как собрать эту конструкцию с минимально возможными ошибками. Для реше-

ния этих проблем в природе используются различного рода реакции (для всех существую-

щих реакций в природе имеются соответствующие ферменты) и технология мутаций, в ре-

зультате которой происходит репродуктивный отбор систем с наиболее «удачными» (по-

лезными) свойствами. Последнее создает очередную проблему: как опознать, идентифи-

цировать и воспроизвести молекулы с желательными характеристиками.

Множество белков достаточно быстро могут спонтанно свернуться в трехмерную

структуру и собраться в большие сложные механизмы с определенными функциями.

Например, рибосома – биологическая машина, которая функционирует как программируе-

мая нанофабрика. Рибосома "читает" последовательность транспортной молекулы РНК и

синтезирует белок в соответствии с этой программой. Но, в настоящее время нерешенны-

ми остаются многие проблемы, в том числе, каким образом можно предсказать трехмер-

ную структуру от линейной последовательности аминокислот.

7.5. «Дорожная карта» развития био- нанороботов

Профессор Рутгерского университета К. Мавродис прогнозирует в ближайшем бу-

дущем четыре стадии развития био- нанороботов для применений в медицине, космиче-

ских исследованиях и военной технологии (рис. 64).

Стадия 1: Био- нано- компоненты.

Развитие био- нано- компонентов от биологических систем – это первый шаг к про-

екту создания бионаноробота. Так как сложные системы и устройства будут составлены из

этих компонентов, мы должны иметь полное и ясное понимание того, как они ведут себя и

как могут управляться. К нано- компонентам можно отнести: ДНК, геммаглютинин виру-

са, углеродные нанотрубки, белки (например, типа родопсина и бактериородопсина) и т.д.

Молекулы родопсина могут применяться для сбора световой энергии, которая затем может

быть использована другими компонентами, например, для движения. ДНК может исполь-

зоваться как структурный элемент и источник энергии, геммаглютинин вируса – как дви-

гатель, бактериородопсин – как детектор света или источник энергии.

Стадия 2: Сборка био- нанороботов.

Предусматривает сборку функционально устойчивых компонентов в сложные изде-

лия и механизмы. Например, на рис. 65, а) изображен бионаноробот с «ногами» из винто-

вых пептидов, телом из углеродной нанотрубки и с биомолекулярным двигателем

(рис. 65, б) показывает концептуальное представление модульной организации био- нано-

робота. Модульная организация определяет правила иерархии и пространственные постро-

ение различных модулей робота: внутреннее ядро (мозг/источник энергии для робота);

элемент приведения в действие; сенсорный элемент; устройство передачи сигналов и эле-

мент обработки информации. К началу этой фазы должна быть развита “библиотека био-

нано компонентов”, которая будет включать различные категории, функциональные эле-

менты, источники энергии, сенсоры, процессоры и т.д.

128

Кроме того, некоторые био- нанороботы будут иметь способность сборки различных био-

компонентов и нано- структур на местах хранилищ ресурсов, в то время как другие будут

только управлять существующими структурами, восстанавливая поврежденные элементы

или делая другие реконструкции.

Рис. 64. «Дорожная карта» развития био- нанороботостроения (C. Mavroidis)

Рис. 65. Конструкция и модульная организация био- наноробота: а - гипотетическая

конструкция био- наноробота: углеродные нанотрубки составляют главное тело, пептиды

используются для передвижения и манипуляции объектами; б – модульная

био- наноробота

129

Стадия 3: Распределенный Интеллект, Программирование и Управление.

Для полного выполнения всех своих функций каждый био- наноробот должен взаи-

модействовать с другим. Проектирование роев био- нанороботов, способных к принятию

решений, выполнению сложных задач и к групповому взаимодействию является сложной

задачей и предполагает развитие вычислительных алгоритмов, методов моделирования и

прогнозирования, электронных аппаратных средств. Кроме того, должны быть созданы

соответствующие интерфейсные системы для взаимодействия с макро-миром, т.е. должна

быть обеспечена полноценная возможность управления и контроля действий роя наноро-

ботов и получения от них сенсорных данных.

Стадия 4: Автоматизированное изготовление, системы обработки информации.

Для выполнения сложных миссий, например, сенсорика, передача сигналов и хра-

нения информации, должны быть созданы колонии био-нанороботов. Поэтому очередным

шагом в проектировании нанороботов является создание методологий масштабного изго-

товления роботов в естественных и специальных условиях. Способность обработки ин-

формации и принятия решения являются ключевым на этом этапе проектирования. Это

позволило бы роям реализовать возможность саморазвития и адаптации к окружающей

среде. Рои могут быть запрограммированы для поиска дополнительных источников энер-

гии и иметь способность приспособиться в соответствии с обнаруженным ресурсом.

7.6. Устройства адресной доставки лекарств

Адресная доставка лекарств к пораженным клеткам позволяет медикаментам попа-

дать только в больные органы, избегая здоровые, которым эти лекарства могут нанести

вред. Например, лучевая терапия и химиотерапевтическое лечение, уничтожая больные

клетки, губит и здоровые. Решение этой проблемы может заключаться в создание управля-

емого "транспорта" для лекарств, варианты которого уже предложены некоторыми уни-

верситетами и научными организациями.

В качестве транспортных структур для поставки лекарственного препарата в пора-

женную область используются полимеры, дендримеры, кремниевые структуры, биологи-

ческие молекулы, углеродные структуры (в том числе, фуллерены), металлические наноча-

стицы в оболочке и т.д.

Некоторые полимерные материалы обладают требуемыми свойствами для исполь-

зования их в качестве структур для доставки лекарств в организме: имеют хорошую био-

логическую совместимость, могут быть разложены микроорганизмами и позволяют вклю-

чить молекулы лекарства в свою структуру. Полимер может иметь макропористую струк-

туру. В этом случае в поры вводятся молекулы лекарства.

Дендримеры являются уникальным классом полимеров с разветвленными макромо-

лекулами, размером и формой которых можно управлять. Их структура, стабильность

свойств, возможность разместить на поверхности молекулы других веществ делает при-

влекательным использование дендримеров для транспорта лекарств и других биологиче-

ских молекул. Молекулы лекарств включаются в дендримеры через реакции комплексооб-

разования или путем своеобразного капсулирования, как показано на рис. 66.

Структуры на основе кремния могут быть изготовлены с высокой точностью раз-

личными методами, обычно используемыми в изготовлении полупроводников и микро-

электромеханических систем. Традиционными материалами являются пористый кремний,

кварц или диоксид кремния. При этом, в частности, получают структуры в виде наносфер с

пористой поверхностью. Так как используемые технологии позволяют управлять пористо-

130

стью и размером пор, то это дает возможность точного дозирования лекарственного пре-

парата в каждой наносфере. В такие структуры достаточно просто загрузить лекарства – их

необходимо поместить в раствор препарата, а затем – высушить (рис. 67). Таким образом в

пораженную зону можно доставлять строго дозированное количество лекарств.

Рис. 66. Включение препарата в структуру дендримера: а – ковалентное

комплексообразование; б – герметизация препарата внутри дендримера

Рис. 67. Кремниевые пористые наносферы для транспорта препарата: а – подготовка

частиц; б – загрузка лекарств; в – сушка частиц

Полые металлические оболочки нанометровых размеров также используются для

транспортировки препаратов. Материалом в этом случае являются такие металлы, как зо-

лото, серебро, платина и палладий. Лекарства присоединяются к металлическим наноча-

стицам методами силанизации (рис. 68, а) или электростатическим способом (рис. 68, б). В

месте доставки препарата осуществляют нагрев наночастиц (инфракрасным излучением

или переменным электромагнитным полем), в результате которого происходит высвобож-

дение препарата.

Рис. 68. Методы присоединения молекулы лекарства к наночастице:

а – силанизация; б – электростатическое связывание

131

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК (приведены источники не ранее 2005 г.)

Книги 1. G. Plopper. Principles of Cell Biology. 2nd Ed. 2016. 566 p. 2. G. Plopper, D. Sharp, E. Sikorski. Lewin's CELLS, Third Edition. 2015. 1056 p. 3. A. van den Berg, L. Segerink. Microfluidics for Medical Applications. 2015. 323 p. 4. B. Fadeel. Handbook of Safety Assessment of Nanomaterials: From Toxicological Testing to Personalized

Medicine. 2015. 555 p. 5. S. Soni, A. Salhotra, M. Suar. Handbook of Research on Diverse Applications of Nanotechnology in Biomed-

icine, Chemistry, and Engineering. 2015. 857 p. 6. V.V. Zhirnov, R.K. Cavin III. Microsystems for Bioelectronics. Scaling and Performance Limits. Second Edi-

tion. 2015. 298 p. 7. B.P. Jena, D.J. Taatjes. NanoCellBiology: Multimodal Imaging in Biology and Medicine. 2014. 392 p. 8. A. Tiwari, A.P.F. Turner. Biosensors Nanotechnology. 2014. 552 p. 9. V. Torchilin. Handbook of Nanobiomedical Research: Fundamentals, Applications and Recent Developments

(in 4 Volumes) 2014. 2348 p. 10. Clement Kleinstreuer. Microfluidics and Nanofluidics. Theory and Selected Applications. 2014. 456 p. 11. J. Castillo-León, W.E. Svendsen. Micro and Nanofabrication Using Self-Assembled Biological Nanostruc-

tures. 2015. 117 p. 12. E. Lagally, K. Iniewski. Microfluidics and Nanotechnology: Biosensing to the Single Molecule Limit. 2014. 284 p. 13. L.M. Moretto, K. Kalcher. Environmental Analysis by Electrochemical Sensors and Biosensors. Vol. 1. Fun-

damentals. 2014. 714 p. Vol. 2. Applications. 2015. 455 p. 14. S. Thomas, N. Kalarikkal, W. Yang, S.S. Babu. Biomaterial Applications: Macro to Nanoscale. 2015. 221 p. 15. H. Altenbach, G.I. Mikhasev. Shell and Membrane theories in Mechanics and Biology. From Macro- to

Nanoscale Structures. 2015. 325 p. 16. M. Akashi, T. Akagi, M. Matsusaki. Engineered Cell Manipulation for Biomedical Application. 2014. 271 p. 17. J.X.J. Zhang, K. Hoshino. Molecular Sensors and Nanodevices. Principles, Designs and Applications in Bio-

medical Engineering. 2014. 500 p. 18. D.G. Capco, Y. Chen. Nanomaterial: Impacts on Cell Biology and Medicine. 2014. 284 p. 19. R.P. Schaudies. Biological Identification. DNA Amplification and Sequencing, Optical Sensing, Lab-on-chip

and Portable Systems. 2014. 478 p. 20. Y. He, Y. Su. Silicon Nano-biotechnology. 2014. 113 p. 21. J. Callejas-Fernández, J. Estelrich, M. Quesada-Pérez, J. Forcada, Soft Nanoparticles for Biomedical Applica-

tions. 2014. 411 p. 22. B. Lin, B. Ratna. Virus Hybrids as Nanomaterials, Methods and Protocols. 2014. 234 p. 23. K.C. Honeychurch. Nanosensors for chemical and biological applications: Sensing with nanotubes, nanowires

and nanoparticles. 2014. 373 p. 24. V. Weissig, T. Elbayoumi, M. Olsen. Cellular and Subcellular Nanotechnology. Methods and Protocols, 2013. 368 p. 25. K. Turksen. Stem Cell Nanotechnology. Methods and Protocols. 2013. 190 p. 26. R.T. Kelly. Advances in microfluidics. 2012. 250 p. 27. J. Berthier. Micro-Drops and Digital Microfluidics Second Edition. 2013. 545 p. 28. G. Jenkins, C.D. Mansfield. Microfluidic Diagnostics: Methods and Protocols. 2013. 541 p. 29. X. Li, Y. Zhou. Microfluidic devices for biomedical applications. 2013. 706 p. 30. S.K. Mitra, S. Chakraborty. Microfluidics and Nanofluidics Handbook. Chemistry, Physics, and Life Science

Principles. 2012. 1102 p. 31. S.K. Mitra, S. Chakraborty. Microfluidics and Nanofluidics Handbook. Fabrication, Implementation, and Ap-

plications. 2012. 624 p. 32. R Mauri. Multiphase Microfluidics: The Diffuse Interface Model. 2012. 180 p. 33. Микрофлюидные системы для химического анализа. Под ред. Золотова Ю.А., Курочкина В.Е. 2011. 528 с. 34. С.Ю. Зайцев. Супрамолекулярные наноразмерные системы на границе раздела фаз. Концепции и пер-

спективы для бионанотехнологий. 2010. 35. Г. Эхуд. Нанобиотехнология. Необъятные перспективы развития. (Фундаментальные основы нанотех-

нологий: лучшие зарубежные учебники). 2011 36. Р.П.Барыкина, Т.Д. Веселова, А.Г. Девятов, Х.Х. Джалилова, Г. М. Ильина, Н.В. Чубатова. Справоч-

ник по ботанической микротехнике. Основы и методы - М.: Издательство МГУ, 2004. - 312 с. 37. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. Ed. D. Li. With 1636 Figures and 152 Tables. Springer.

2008. 2242 p. 38. Nanorobotics. Current Approaches and Techniques. Ed.: C. Mavroidis, A. Ferreira. Springer; 2013. 467 p.

132

Наиболее часто цитируемые статьи 39. G.M. Whitesides. The origins and the future of microfluidics // Nature 442, 368-373 (2006). Cited by 3643. 40. J. El-Ali, P.K. Sorger, K.F. Jensen. Cells on chips // Nature 442, 403-411 (2006). Cited by 1462. 41. H. Song, D.L. Chen, R.F. Ismagilov. Reactions in Droplets in Microfluidic Channels // Angew Chem Int Ed

Engl. 45 (44), 7336–7356 (2006). Cited by 1119. 42. S.M. Moghimi, A.C. Hunter, J.C. Murray. Nanomedicine: current status and future prospects // The FASEB

Journal 19 (3), 311-330 (2005). Cited by 1227. 43. S-Y. Teh, R. Lin, L-H. Hung, A.P. Lee. Droplet microfluidics // Lab Chip, 8, 198-220 (2008). Cited by 1166. Новые направления микрофлюидики 44. R. Seemann, M. Brinkmann, T. Pfohl, S. Herminghaus. Droplet based microfluidics // Rep. Prog. Phys.

75 016601 (2012). 45. D. Christakis, R. Davis, F. Rivara, J. Wright. Point of care // U.S. Patent Application 09/760,372, filed Janu-

ary 11, 2001. Пожалуй, первый патент по сторожкам. 46. П.И. Белобров. Сторожок (point-of-care POC), биочастицы и диагностика. презентация для семинара

МОЛПИТ Лабочип → Сторожок 22/6/13. http://molpit.org/blog/PIT00033 47. P. Craw, W. Balachandran. Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a

critical review // Lab on a Chip 12 (14), 2469-2486 (2012). 48. B. Muha, S. Canic. A nonlinear, 3D fluid-structure interaction problem driven by the time-dependent dynamic

pressure data: a constructive existence proof // Commun. Inform. Systems (CIS) 13 (3), 357-397 (2013). 49. M. Geertz, D. Shore, S.J. Maerkl. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a mi-

crofluidic platform // PNAS 109 (41), 16540-16545 (2012). Эта статья была первой по микрофлюидной плат-форме для массивных параллельных измерений!

50. D. Siegal-Gaskins, V. Noireaux, R.M. Murray. Biomolecular resource utilization in elementary cell-free gene circuits // American Control Conference (ACC), IEEE-2013, 1531-1536. (2013).

51. J.L. Garcia-Cordero, SJ. Maerkl. Multiplexed surface micropatterning of proteins with a pressure-modulated microfluidic button-membrane // Chem. Commun. 49 (13), 1264-1266 (2013).

52. D.L. Piet, A.V. Straube, A. Snezhko, I.S. Aranson. Viscosity control of the dynamic self-assembly in ferro-magnetic suspensions // Phys Rev Lett 110, 198001 (2013).

53. Y. Zhang, S. Park, K. Liu, J. Tsuan, S. Yang, T-H. Wang. A surface topography assisted droplet manipulation platform for biomarker detection and pathogen identification // Lab on a Chip 11 (3), 398-406 (2011).

54. W. Timp, U.M. Mirsaidov, D. Wang, J. Comer, A. Aksimentiev, G. Timp. Nanopore sequencing: electrical measurements of the code of life // IEEE Transactions on Nanotechnology 9 (3), 281–294 (2010).

55. И.Н. Курочкин, Б.С. Народицкий, Г.Г. Борисенко, Л.Н. Нестеренко. Словарь нанотерминов: нанобио-технология. http://thesaurus.rusnano.com/wiki/article1253

56. А.И. Арчаков. Нанобиотехнология и наномедицина. Доктрины развития в Российской Федерации ра-бот в области нанотехнологий http://media.council.gov.ru/files/journalsf/item/20070420103645.pdf (дополнение к проекту).

57. R.A. Freitas Jr. Nanomedicine, v. I. Basic capabilities. 1999. 533 p.; v. IIA. Biocompatibility. 2003. 357 p. Много новой информации есть на Freitas Homepage: http://www.rfreitas.com/

58. V. Gubala, L.F. Harris, A.J. Ricco, M.X. Tan, .D.E. Williams. Point of care diagnostics: status and future // Analytical chemistry 84 (2), 487-515 (2011).

59. Y-C Chen, S.G. Allen, P.N. Ingram, R. Buckanovich, S.D. Merajver, E. Yoon. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations // Scientific reports 5, 9980 (2015).

60. S. Danworaphong, M. Tomoda, Y. Matsumoto, O. Matsuda, T. Ohashi, H. Watanabe, M. Nagayama, K. Gohara, P.H. Otsuka, O.B. Wright. "Three-dimensional imaging of biological cells with picosecond ultrasonics // Appl Phys Lett 106 (16), 163701 (2015).

61. T. Dehoux, M.A. Ghanem, O.F. Zouani, J-M. Rampnoux, Y. Guillet, S. Dilhaire, M-C. Durrieu, B. Audoin. All-optical broadband ultrasonography of single cells // Scientific reports 5, 8650 (2015).

62. W. Jung, J Han, J-W. Choi, C.H. Ahn. Point-of-care testing (POCT) diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologies // Microelectronic Engineering 132, 46-57 (2015).

63. A. Oskooei, A. Günther. Bubble pump: scalable strategy for in-plane liquid routing // Lab on a Chip 15 Ac-cepted (2015).

64. И.В. Кухтевич, К.И. Белоусов, А.С. Букатин, М.В. Дубина, А.А. Евстрапов. Микрофлюидный чип с гидродинамическими ловушками для микроскопических исследований одиночных клеток in vitro // Письма в ЖТФ, 41 (5), 103-110 (2015).

65. A.K. Tay, M. Dhar, I. Pushkarsky, D. Di Carlo. Research highlights: manipulating cells inside and out // Lab Chip, 15 (12), 2533-2537 (2015).

http://thesaurus.rusnano.com/wiki/article1253

http://www.rfreitas.com/

Нанотехнологии в биологии и медицине

Documents

Transcript of Нанотехнологии в биологии и медицине