Long-term neuroprotective effects of glycosaminoglycans-IGF-I cotreatment in the motor neuron...

10
Long-term neuroprotective effects of glycosaminoglycans± IGF-I cotreatment in the motor neuron degeneration (mnd ) mutant mouse A. Gorio 1 *, E. Germani 1 *, E. Lesma 1 *, G. Rossoni 1 , E. E. Muller 2 and A. M. Di Giulio 1 * 1 Laboratory for Research on Pharmacology of Neurodegenerative Disorders, Department of Pharmacology, Chemotherapy and Medical Toxicology, Via Vanvitelli 32, 20129 Milano, Italy 2 Laboratory of Endocrinology, Department of Pharmacology, Chemotherapy and Medical Toxicology, Via Vanvitelli 32, 20129 Milano, Italy Keywords: heparin sulphate, dermatan sulphate, muscle denervation, muscle atrophy, motor neuron loss Abstract This study shows that cotreatment with insulin-like growth factor-I (IGF-I) and glycosaminoglycans (GAGs) prevents the onset of neuromuscular de®cit in the m/m mutant mouse. These mice show a mid-to-late-life onset of progressive paralysis of the hind limb, that is correlated with altered innervation and reduced nerve-evoked isometric twitch tension in the extensor digitorum longus (EDL) muscle. Almost 50% of EDL nerve endings are negative for antisynaptophysin staining, while retrograde labelling with b-cholera-toxin coupled to type IV horseradish and quantitative histological analysis show a small loss of EDL and lumbar cord motor neurons. At 10 months of age also forelimb function evaluated as grip strength is signi®cantly reduced. Animals treated either with glycosaminoglycans alone or with IGF-I alone at low and high doses showed only a partial improvement of their condition. However, cotreatment of m/m mice with IGF-I and GAGs fully prevented the neuromuscular abnormalities, the twitch tension loss, the motor neuron decrease and the reduction of forelimb grip strength. Introduction The motor neuron degeneration (Mnd) mutant mice (thereafter called mnd/mnd or m/m) show a mid-to-late-life onset of paralysis that, between 6 and 11 months, progressively involves the hindlimbs and then the forelimbs (Messer & Flaherty, 1986). The spinal cord motor neurons of m/m mice show ubiquitin deposits and changes in neuro®lament distribution (Callahan et al., 1991; Mazurkiewicz, 1991) suggesting a similarity with human amyotrophic lateral sclerosis (Perl et al., 1982; Messer et al., 1987). However, various other regions of m/m brain are also affected (Messer et al., 1987). Another major m/m neuronal alteration consists of sudanophilic, auto¯uorescent intraneuronal inclusions containing the adenosine triphosphate synthase subunit c, as observed in human ceroid lipofuscinosis or Batten's disease, a fatal inherited disorder of the nervous system (Bronson et al., 1993; Pardo et al., 1994; Rowan & Lake, 1995). Thus, it has been suggested that m/m mice may also provide a model for studies on Batten's disease (Faust et al., 1994; Price et al., 1994). On the other hand, m/m mice motor neurons show an alteration of the calpain/calpstatin system (Li et al., 1998). These pathological changes might be particularly important in retina, where from the early stages of the disease there is a loss of photoreceptors with degeneration of retinal cells (Messer et al., 1993). Thus m/m mice do not represent a speci®c animal model for human motor neuron disease, but they may still be a useful model for studying long-term neuroprotective therapies over periods as long as 10 months (Price et al., 1994). In recent years a large number of reports have proposed neurotrophic factors as candidates for the treatment of neurodegen- erative disorders (Oppenheim, 1989; Thoenen, 1991; Lindsay et al., 1993; Henderson et al., 1994; Mitsumoto et al., 1994; Vaught et al., 1996). Among them, insulin-like growth factor-I (IGF-I) was very interesting because of its ability to promote survival and differentia- tion (Daughaday et al., 1972; Bothwell, 1982; Lund et al., 1986; Recio-Pinto et al., 1986; Aizenman & De Vellis, 1987; Bohannon et al., 1988; Smith et al., 1988). Local administration of IGF-I in vivo stimulates nerve sprouting and regeneration (Caroni & Grandes, 1990; Kanje et al., 1989). We had previously reported that administration of glycosamino- glycans (GAGs) promoted neuritogenesis, peripheral nerve regenera- tion and muscle reinnervation following sciatic nerve lesion in neonatal and adult rats (Gorio et al., 1996; Lesma et al., 1996; Gorio et al., 1997; Gorio et al., 1998a; Losa et al., 1999). GAG treatment promoted a marked increase of IGF-I levels in the denervated muscle and in blood (Gorio et al., 1998a; Losa et al., 1999). In addition, treatment with GAGs alone or IGF-I alone slowed the onset (Hantai et al., 1995; Vergani et al., 1997) of progressive forelimb dysfunction typical of the wobbler mouse (Duchen & Strich, 1968; Mitsumoto et al., 1994), while IGF-I and GAG cotreatment arrested motor neuron loss (Gorio et al., 1998b; Vergani et al., 1999). Thus we have evaluated the long-term neuroprotective effects of IGF-I and GAGs in the m/m mouse. Correspondence: Dr Alfredo Gorio, at present* address below. Email: [email protected] *Present address: Laboratory for Research on Pharmacology of Neurodegen- erative Disorders, Pharmacological Laboratories, Dept of Medicine, Surgery and Odontoiatry, Faculty of Medicine, H. S. Paolo, Via A. di Rudini 8, 20142 Milano, Italy Received 15 February 1999, revised 19 April 1999, accepted 10 May 1999 European Journal of Neuroscience, Vol. 11, pp. 3395±3404, 1999 ã European Neuroscience Association

Transcript of Long-term neuroprotective effects of glycosaminoglycans-IGF-I cotreatment in the motor neuron...

�������� ����������� �� ������� �� ������� ��������������� ���������� � ��� ���� ����� ��������� ������ � ���� ���

�� ��� ��� !� ����� �� !� ������ �� "����� � !� !� #����$ ��� �� #� % � � ������������ ��� � � ���� �� ����������� �� � ���� � � ���� ������ ��� � ���� � �� ������������ �� ��� ��� ���� ����� ���������� �� ���� ��� !"� "#�"$ ������� %��"�������� �� &������������ � ���� � �� ������������ �� ��� ��� ��� � ����� ���������� �� ���� ��� !"� "#�"$������� %��

��������' � ����� ������ � � ����� ������ � ����� � � ������� ����� ������ ���� � ���� ����

�&������

'� � ���� ���(� ���� ���������� ( �� ��� ��� )� ���(�� �������� ������� ��� ������� ��������� ������ �������� ��� ����� ����������� ��*� � � ��� �+� ���� ���� '���� �� ���( � ����������� �� ����� �� �������� �� ������� � �� ��� � �� � & ���� � ���������� ( �� ������� ������� �� ��� ������ ���������)�� ����� � �( ��� ���� �� � ��� �,������ � � ��� ����� �!%������� ����� -./ �� !%� ����� ��� ��� ��� ����� �� ��� ��� ����������� � ��� � �� (� �� ���������� ��&��� �� ( �� ������������, ������� �� ���� �0 �������� �� ��� 1��� ��� �� � ������ ��� ������ � ���( � ���� ���� �� !%� ��� �&�� ���� ���� ������� ���. ����� �� ��� ���� ����� & ���� �� �������� �� �� � �������� � � �� *������ ������� �� ��� ������� � ���� ( ��������� ��������� ����� �� ( �� ����� ����� �� ��( ��� � �� ����� ���(�� ���� � ���� �� �������� �� ��� � ���� � ���2�(���� ���������� �� �+� �� ( �� ����� ��� ���� ���� ��������� ��� ��������� �&����� � �� ��� �( ��� ���� �� ���� ������� ����� �������� ��� ��� ����� �� �� ����� & �� � ���������

�������� ��

��� ����� ����� �������� �� ����� ����� � �� ����������� �����

������� �� ���� ���� � � ���������� �� ����� �� ������� � �����

������� � �� ��������� �������� ���� ������� ��� � �� ��� ��

���� ��� ����� ��� ������� � �������� �!"��# ��� �� ��� ��� �����

������ �� ��� � �� ���� � $ � � ���� �� �� ������� �

����%������ ��� �� �� �&������� �� ��#� �!!�' ��(�) �� �(�

�!!�� ������ �� � � � ��� �� � �� ���� ��������� � �������

������� � �*��� �� ��#� �!"+' ������ �� ��#� �!",�# -������� ��� ��

����� ��� ��� �� ��� ��� � ��� ���� ������� ������� �� ��#� �!",�#

.������ ��/�� ��� ������� ������� �� ���� ��� �� ������ � ��

���0�������� ����������� ���� ��� ����� � �� ��� ����� ��

�� ��������� �������� ��� � � �� ������� � ���� ����

� ����� ��� � �� 1�����2� ������ � ����� ���� �� ����� �� ���

������ ������ �1������ �� ��#� �!!3' *��� �� ��#� �!!4' 5���� �

6�)�� �!!7�# ���� � ��� ���� ������� ���� ��� � �� ��� ����

���� � � ���� ��� �� �� �� 1�����2� ����� � ��� �� ��#� �!!4'

*� �� �� ��#� �!!4�# 8� ��� ����� ���� ��� � �� ����� ������ ����

�� ������� �� �� ��� ����� ���������� � ������ �6 �� ��#� �!!"�# �����

�������� ��� ������� � ��� �� ���� ������ �������� � ��� ��� �����

���� ��� ����� ������ �� ��� ����� ����� � � ���� �� ��������������

� �� �������� �� �� ��� ��� ����� ������� �� ��#� �!!3�# ��� ���

� �� � ��� ��������� � ���� %� �� ��� ���� ��� ���� �����

����� ������ �� ���� ��� �� �� �� � ���� ���� ��� ��� ��

��������� ����������� �� ������ �� ���� ��� �� �� ���� ��

�9������ �*� �� �� ��#� �!!4�#

:� ������ ����� � ����� ����� �� ������� ���� �������

��������� � ������� �� ��� ���� ��� ��� ��������� �� ���������

���� �� ������ �8������ �� �!"!' �������� �!!�' 6 ���� �� ��#�

�!!3' -������� �� ��#� �!!4' � ������ �� ��#� �!!4' ;���� �� ��#�

�!!��# .���� ����� ��� ��� )� ������ �������: �:< �:� ��� ����

������� �� ������ �� �� �� � �� �� ������� ��� ��� �� ������� ��

� �� �=������ �� ��#� �!,+' 1�������� �!"+' 6� �� ��#� �!"�'

5�� ��* ��� �� ��#� �!"�' . (����� � =� ;��� �� �!",' 1�������

�� ��#� �!""' >� �� �� ��#� �!""�# 6���� �� � ����� �� �� :< �: � ���

�� ������ ����� ����� �� �� ��������� �� �&���� � <������

�!!9' ?��/� �� ��#� �!"!�#

@� �� ���� ���� ������� ���� �� � ����� �� �� �������� ���

������� �<.<�� ������� ��� ������� �� ��� ������ ����� ���������

� �� �� ����� �� ������� �� ������ �� �� �� � ����� ��� �� �

�������� �� ��� ���� �<�� � �� ��#� �!!�' 6���� �� ��#� �!!�' <�� �

�� ��#� �!!,' <�� � �� ��#� �!!"�' 6��� �� ��#� �!!!�# <.< ���������

������� � ���)� ������� �� :< �: ������ � ��� �������� �����

�� � ���� �<�� � �� ��#� �!!"�' 6��� �� ��#� �!!!�# :� � � ���

��������� � �� <.<� ����� �� :< �: ����� ����� ��� ����� �-����

�� ��#� �!!7' ;����� �� ��#� �!!,� �� �������� �� ����� �� ������ ��

��� ��� �� ��� ������� ���� �=���� � >�� ��� �!�"' � ������

�� ��#� �!!4�� �� �� :< �: �� <.< ����������� ������� �����

����� ���� �<�� � �� ��#� �!!"�' ;����� �� ��#� �!!!�# ��� �� ����

������� ��� ��������� ����������� �� ������� �� :< �: �� <.<� �

��� ��� ����#

������������A =� .����� <�� �� �� �������B ����� �����#C�� �A ����� �D � ���#�� #� � # �

B������� �������A 6��������� ��� 5������� �� *����������� �� E������������ �� = ������� *���������� ��� 6�������� ��� =��� �� �� � ��� >������� 8���� ����� ����� �� �� � ��� -# ># *����� ; � .# 5 � "� +9�4+� ����� :����

������ �� �������� ����� ������ �� ���� ����� ������ �� ��� ����

�������� ������� �� ��������� !��" ��� ��" ##��$#%�%� ���� � �������� �������� ��������

#���� ��� ��� ������

���� �� ������ ��� ���� �� � �� ���� ������� ���� F��)���

6�������� �� �1�� -������ �C� G>.� �� ��� � �� � ����������#

> H�������� � ������ &7,16�� F � �� ���� ������� ���� -�����

E����� �&����((���� � ����� :����� �� ����� � �� ��� � � �� ���

������ ��� �� ��� � ��� �++� + �&� �7I �� ��� ��� %� ��

� ���� ���� 9�#99 �� +9#99 ��# . ������ �� �� �� ����� ����

��� ����� �� �����# &���� �� �� ���� � �� ������� �� �����

��� ����� �� ��� �� ��� ������ �� ��� ���� �� ����� �������

� �� ���� � �) �� �����#

.� 3������ �� ��� ��� �� � ������ � �� �� � ���� ��H ����

������� ��� ��� �� ��� �� � H ��������� ����� ���� ���� ���

������� ����� � �� ���� �� +9���)� :< �: ������ ����)� :< �:

������ ����)� <.<� ������ +9���)� :< �: �� ����)� <.<

���� �� ��������� �� ��������� � ������ �� ��� ���# ��� ������

��� �� � ����� �� � ������ �� ��� ���� �� ��� � ��# =���

���� � ��� �� � �� ��������� �/��� ��� �<.<� �� ��� ���) ��

:< �: �� ��� ���������� �����# ��� ��� ��� �� � � �� ��

������# =�� ��������� ����� +4 � �� �� �� ) �� �� �� , �� �9������

�� ���#

1�� �� ��� ����� ��� �� �� ��� $��� ��� �� ���������� ��

����� �� ���� �� ���� �������� ������� � ��� � ��� ���

����� ���� �� �� ����� �� ��� %��� ����� �� � �� ���� �� �0�

��� �� ����� ���)# <� � �������� �� ��� �������� ��� ������� �� ���

�� �� ���� � �� ������� � ��� (����� ���� � ���� ������ �� ����

����� ���� �� � ����� �� ������ ����� �� ���� � �� ��� �� �' ��� ����

��� �������� �� � ���� ���������� �1�� ��� <��������� ;������

:�����# . ����� ��� �� ����� �� ��� �� � �������� ��� �� ����� ���

� �� �� ����� ��� ��� �� � ������ ��� �� ���� � �� �� ����� ��

47� �� �� ������ ��� ��� �� � �� �� ���� ���� ���� �� �;����� �� ��#� �!!!�# .� , �� �9������ �� ���� ��� � �� ��� �� �� �� ���

��� ���������� �� ���� ��� �� ����� ����� ����� ��� ��� ����

����� ��������� (� � �� ��������� ��� �� ) ��� �� ������ �� ��

��� �� ��� ���# ��� � ���� �� �H������ � ���� ����� �C=6�

������ ���� ������� ��� �� ���(��� ���� ��� �� ��� �� � ��

�������H�� � �� ��� �# �� ����� ��� �� �� ��� ��� �� �� ��

����� %��� � (�� J �999 %���� ���� ������� ������� �� ��� %���

������ ��� �������� � �� � ���������� � ������� �E:- :�.<C

�#44� �� ���� �� @���� 5������ �� � � ���� �������� ��� ���

������ �� ��������� �����# ��� C=6 ����� ������� �� �������

��� ������� $��� ��� ���� � �� � ���� �� � ����K���� ���������

����� $� �<�� � �� ��#� �!"3�' �!!"�� �� �� ������� � �� ��

���������� ����� �������� �� ���� ���� � �� ���� � ����������

��� �� �� �� � ��9 999�=� ����%������ ��� � �> ���

:�������� ����� >� 6� �� � ���� � G>.� �� � �� ����������

:<# �# >�� �� �� � �������� ���� �� C=6 ����� %��� ������ � ,� �� �9��������� � ������ �� ��� � ��# ��� $��� ��� �� ��� �� ���� �� ��������� �� ��� ����� � ����� �# :� � ����� ���� � ��� ���������� ��� � ������� � � �������� �� �� �� �� ��� ���� �� ��� %��� � (� ��� �� ��# ��� ������� � �������� �� :< �:K<.< �����������#

:<# +# >�� �� �� � �������� ���� �� � ���� ����� %��� ������ � ,� ���9��������� � ������ �� ��� � ��# ��� $��� ��� �� ��� �� ���� �� ��������� �� ��� ����� � ����� +# ����� � � ���� �� ������� � ��� ������������� � �� ���� � �������� �� :< �:K<.< �����������#

33!� <�� � �� ��#

� �!!! C������ E����� ���� .���� �� ��� �������� ������� �� ��������� ��� 33!7K3494

�.16C�# C=6 �����A ������ �� %���� � ���� ������ �����

.�� ���� @ � ���� ���� ���� ���� ���� ����= ������ ���� ��� ��� ��� ��� :< �: �+9���)�� :< �: �����)�� <.<� :< �: L<.<�

,��������� ���9K! �3 ,"�� 7,� 7�� �3� ,"���

!K�7 ++9 4"���� +9���� +�4��� +�9��� ++4����

�7K+� 3,! 4!"�� 497���� 3!����� 4�4���� 4�7����

+�K+, 447 +""��� 44���� 479��� 479��� 47����

+,K33 +�+ �+9��� +77��� +�!��� +49���� +79���

33K3! !� 39�� �+3��� ��9��� �9"���� 7"��������

3!K47 34 9 �"�� �9� �7�� �!�

����� �799 �799 �799 �799 �799 �799�9��������� ���9K! �� +,"��� �,+��� ��"������ ��9������ "9������������

!K�7 +�� 479��� 4�,����� 4�9����� 43+���� +3�������������

�7K+� 4+� 4+4 47!�� 444�� 4�7� 44+����

+�K+, 44, ++"��� +�"������ +3+��� +�"��� 4+4�������������

+,K33 +�, ,+��� ��7����� �,+����� �7!����� +7+������������

33K3! �9 4"� �9� �,� 7, 7+�

3!K47 �" 9 !� ,� !�� �4�

����� �799 �799 �799 �799 �799 �799

����� ��� ��� ��# � � ����# ����� :< �: �+9���)�� ��# � � ����# ����� :< �: �����)�� ��# � � ����# ����� <.<� ��# � � ����# ����� :< �: L <.<���# � � ����# ����� :< �: �+9���)�� ��# ��� ��� ���# ����� :< �: �����)�� ��# ��� ��� ��� ����� <.<� ��# ��� ��� ��� ����� :< �: L <.<� ��# ������ ���# ����� :< �: L <.<� ��# ��� :< �: �+9���)�� ����� :< �: L <.<� ��# ��� :< �: �����)�� ����� :< �: L <.<� ��# ��� <.<��� �� �� �� �� �� �� �� �� �� �� �� �M9#97# ��� ��� ��� ���� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� �M9#9�# ���� ���� ���� ���� ���� ���� ���� ���� ���� ����

���� ���� �M 999�#

�.16C+# 1 ���� �����A ������ �� %���� � ���� ������ �����

.�� ���� @ � ���� ���� ���� ���� ���� ����= ������ ���� ��� ��� ��� ��� :< �: �+9���)�� :< �: �����)�� <.<� :< �: L<.<�

,��������� ���9K! 4� !3�� !!�� !9�� �9"��� 34���������

!K�7 �7" 497��� +43����� +77����� +�4����� �,4�������������

�7K+� 34� 79���� 4�4���� 4+,���� 44,���� 3,3��������

+�K+, 4�+ 39!�� 37,����� 34!����� 4�4����� 477��������

+,K33 3+� �,���� +""����� +"������ �!7���� 3�+��������

33K3! �4" +���� "4����� ""����� �3����� �34����������

3!K47 �, 9 �7� �9� !� �"�

����� �799 �799 �799 �799 �799 �799�9��������� ���9K! 47 ++"��� �4"����� �39����� �7������ 7"������������

!K�7 �79 4+���� +,������� +7!������ +�,������ ���������������

�7K+� 37+ 444�� 437��� 47���� 479�� 3""�����������

+�K+, 47! +77��� 3�"���� 377���� 3�3������ 44�����������

+,K33 3+, �97��� �"!����� �!,����� �!7����� 3���������������

33K3! �49 4+��� ,7���� "������ �9���� �+4����������

3!K47 +, 9 !�� �,� !�� �+��

����� �799 �799 �799 �799 �799 �799

����� ��� ��� ��# � � ����# ����� :< �: �+9���)�� ��# � � ����# ����� :< �: �����)�� ��# � � ����# ����� <.<� ��# � � ����# ����� :< �: L <.<���# � � ����# ����� :< �: �+9���)�� ��# ��� ��� ���# ����� :< �: �����)�� ��# ��� ��� ���# ����� <.<� ��# ��� ��� ���# ����� :< �: L <.<� ��# ������ ���# ����� :< �: L <.<� ��# ��� :< �: �+9���)��# ����� :< �: L <.<� ��# ��� :< �: �����)��# ����� :< �: L <.<� ��# ��� <.<�# �� �� �� �� ��

�� �� �� �� �� �� �� �M 9#97#��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� �M9#9�# ���� ���� ���� ���� ���� ���� ���� ���� ���� ���� ���� ���� �M 999�#

�.16C3# CH���� �� C=6 �� � ���� ����� ������� �� � �9���������� � �� ������ �� ���� �� � �������������� ��������� ��� � ��

@ � ���� ���� ���� ���� ���� ��������� ��� ��� ��� ��� :< �: �+9���)�� :< �: �����)�� <.<� :< �: L<.<�

C=6 ��+��7� �4"�,,! ��9�"99 �+7�,�4 �4"�,7! ,3+�,"9�!4I� �"3#+I� �"+#7I� �"�I� �"7#4I� �!3#"I�

1 ���� 747�7!" 4"���9� 7+"��3� 79+��+3 4!���99 �4+��!��!�#�I� �"9#"I� �"3#�I� �"9#7I� �"�#"I� �!+#!I�

��� �H���� �� ���������� /��� �� ������� �� � �H������ �� ��� ��� � �� �������� �� ������ �� ��� ����� ����� �� ���������� ������������� �� ��������#

:< �:� <.<� �� ����� ����� ����� � ��� ��� ���� 33!,

� �!!! C������ E����� ���� .���� �� ��� �������� ������� �� ��������� ��� 33!7K3494

:<# 3# > ����K���������� ��������� ���� �� ��� � �� �� C=6 ����� �� �9��������� � ������ �.� �� ��� � �� �1K �# >��� ���� ���� ��� � �� ������ � ����� ��� �� ������ ���� ����� �������� � �� :< �: �� <.<�# :� ��� ���������� ��� � �� ��� � ���� �������� �� ������� �� ���� ���������� �H��� �1� �� �� �������� ��� �� ���� ��� �H��� �C�# ����� � ���� �� �H���� �� �H���� ������ �� ��� ���� ���� ��� ���������� /��� ��� �=�# :� ��� :< �:K<.<��������� ���� �� ������� ��� �� ���� ��� �H��� ��� �� �)�� �& �� �# ��� ���� ����� � ����� �H�� ������ �� �� ��� �1� = �� �# ���� %��� ��A � �3� �.�� � +"9 �1��� 449 �&�� � �3� �=�� � �3�9 �C �� �#

:<# 4# C=6 ����� ���������� ����� �������� �.� &� = �� C� �� ����� ���� ���� �1 �� � ������� �� ����� �� ����%������ ��� ��� ����� ��0������ �� �.� &� = �� C� �� �� ��� ����������� � ����� �� ����� �� �1 �� �� ������� ����# C=6 ������ ���� ���� � ������ �. �� 1�� ��� ���������� �&� �� :< �:K<.<��������� �=� C �� � �9��������� ��� � ��# .�� �����%������ ��� � �� ���� ����� ���� ��� ����������� � ������� ��� ��������� ���� �. �� C�# ��� ������� ��� �H�� �� ��� ����� �� ����� � . � ��� ������� ������ � )��� ���� ��� ��� ����� %��� ����� ��� �� �����# E������ ���� �� � ������� ��� �H��� ������� � ��� C=6 ����� �� ��� ���������� ��� � �� �&�� ���� ��� �� �)�� � :< �:K<.<��������� � �� �= �� C�# :� C � � � ��� � ������� ��� �H���� ����� �� ��� �� ���� ���� ����� ������� ������� �� � ����� ����� %���� �� � � � � ��� �� ���� ����� � �# 3 #���� %��� ��A � 379 �.K �#

33!" <�� � �� ��#

� �!!! C������ E����� ���� .���� �� ��� �������� ������� �� ��������� ��� 33!7K3494

:< �:� <.<� �� ����� ����� ����� � ��� ��� ���� 33!!

� �!!! C������ E����� ���� .���� �� ��� �������� ������� �� ��������� ��� 33!7K3494

��� �� �� �� ����������� �� ������� ���� �1���� ���� ������ ��

� ����� :�����# @� �� ��� ����� $� ���� �� ���� ���� ���� �� �

��� � �=� &�� �� �� ��#� �!""�� ��� ���������� ��� ����������� �

��� ������ ������� � �� ����� �� �� �� ��� ����%������ ���

���������� �� 0������ �����/���� ���� ��� ���� � :�<� �=�)��

� ����� :�����# =���� ������� � �� ��� �������� �� �������#

���� ���������� ����� �������� ���� ������� � �� ����%������

��� �� �� �� �� � ���� ����0������ � ������� �=� &�� ��

�� ��#� �!"3�� ���� ����� ���� ���� ���� ������� �� ������� ��

�39� �� � �� ����� ������/���� ��� ����������� � �=� &�� ��

�� ��#� �!""�# =� �� ��� � �� ���� �� ��� �� �� �� �������������

��� ������������ ���� �� �� ���� ����� ��� ���� �� � ������

�� �&� � �� �� �&� � �� �������� � �� :< �: �� <.<�# ���

����� ����� �� �������� ����� ��������� ������ �� ���� �����

����� ��� �����# .� ����� �99 ������� ��� %���� ��������� ���

����� �� � ����� �� ��� ������ ��� �H��� ������ ���� ����

�H�� �� ������ ��� ��� � ��������# =���� ���� �� �� ���

���� ��������� ��� �������� ��� �� �� ��� ����� ���� �������

�� ����� �� �� �<�� � �� ��#� �!!"��# :������ � ���� �� ��� �������

�� ����� �� ������ ����� $�� ����� C=6 ����� ����� �� ��

���� ���� ���� �� � ��� � ��������� �<�� � �� ��#� �!"3�' 6��� �

�� ��#� �!",' <�� � �� ��#� �!!,�# =� �� ���� ��� ���� �� ���� ���

�� �� ��� ����� ����H � �� �� ��� �� ��� ���� �� ����#

��� ��� ��� �� ���� ��� �� ����� ����� ������ �� �� ������ ����

������� �� ���� %� ������ ��� ������� �� ��������� ������ �� ��

����� �� �� ���� �� � �� �� C=6 ����� ������# ��� �� ���� ��

C=6 ������ ���� �/���� � �� +#9�6 �� ���� :; ������� ��

����H ��� ����� �� ��������� ��H � ����/�����)� �� ��#� �!"+�

��&���-5*' > ���� >� 6� �� � ���� � G>.�# ��� ����� � (� ������

��� ������ �� ��������� �� ��� ������ �> ��� ������� ��

������ �� �/���� �� ���# ������ ��� ���� ������ ��� �� ���� ����

����� ��������� (� � �� ��������� ��� �� ������ ������� ����

� �� +I �������������� L +#7I ����������� � ����� �

��������� �����' ��� �� ��� ��� ��� ���� ������ �� ������

��� � ������ + � � ��� ���� %H�� �� ����/�����)� �� ��#� �!"+�# .����

� �� �� � ����� � ��������� ������ ��� ���� ���� ���� )���

����� ��� � ����� � ��������� ����� ����� � �� 39I ������ ��

����$����� ���(��� ���� � ����� ���� ��� �� �������� ���

����� ������ ��� %��� �� �� ���� ���� ���� �� �6��� � �� ��#�

�!",�# ��� ����� ����� �� ������� � (� �� ����� ������ ���

������� � ��� 64 �� 67 ����� �� ��� ��� �������� �� , �� �9�

�������� � ��# .� ���� ���� ������ �� ��� �� ��� ���

�������� �� ���� �� ������ ���(�� ���� ���� ���� ��� ����

���� ��� �� ������ ������� �� E ��� ��� � ��# G� �� ��� E:-

:�.<C ���� ������� �� ����� �� ������ ���� ������� ����

������ � �� � ������ �� J +9�� �� ���� �� � ����� �������#

5����� ���� ���� :< �: ��� � ) � � �� �� *������ � � G�/���

�>���)����� >����� �� <.<� ���� � ������� � �� �� &� ��� >�.

�.16C4# .�� ����������� ����� � �� ����� ���� ���� � C=6 ������ ������������ � �� ��� �� �� �� ��� ��9 999�=� ����%������ ��� � ������������� �

.�� @ ������� ��� ��� ���� ��� ��� ���� :< �: L <.<�

,���������� 343�49� �"7#7I� 3�+�4�4 �,7#3I� 33��4+� �,,#,I��9���������� 3!��4"9 �"�#4I� ++��49" �77#4I� 3"+�4�" �,4#9I�

��� �H���� �� ��� � �� ����� ���� ���� � �H������ �� ��� ��� � �� �������� �� ����������� ��������� ���� ���� �� ��� ����� ����� �� �������� ��� %� �� ����� �� ��� ��� ����%������ �����#

�.16C7# :������ � ���� �� ������� �� C=6 ������ ���� �9����������� �� � �� �������$���� �� ����� � �� ���� �� �� ��� �� �� � �����

:������ � ���� �� ���

+�-( �� ���� �� +9�-( �� ���� ��

@ ������� ��� ��� �"#+� 9#� +9#7� �#!���� ��� ��� ,#"� 9#+BBB "#"� 9#4BBB���� <.<� �+#�� �#3N �+#�� 9#"N���� :< �: �+9���)�� ��#"� �#+N ��#,� �#3N���� :< �: �����)�� �+#�� �#�N �3#�� �#9N���� :< �: L <.<� �,#!� �#" �"#9� �#7

BBB�M 9#99�� ���L ��� ��� ��# @ ������ �� ��� �������� � �� :< �:�� <.<�# N�M 9#97� ���L <.<�� �� L :< �: �+9���)��� �� L :< �: �����)�� ��# ��� ����� �����#

�.16C�# E����� �� C=6 �� �� ���� ����� ������ ��� %� � �9���������� � �� �� ��������� ������ �� � �� ��������� ��H ������� �� ���� :;������� �� ����H ��� �/���� ��� ��� ���� %� �����

@ � ���� ��� ���� ���� ���� ���� ��������� ��� ��� ��� ��� :< �: �+9���)�� :< �: �����)�� <.<� :< �: L<.<�

C=6 7,� 4 47� 7B 44� 3B 4�� 4B 44� 4B 4,� 3 7�� 4�� ���� �7+� �+ �7!� �9 �4"� �� ��9� ! �7�� ! �47� ! �4"� !

B�M 9#97 ������������ ����� +9 ����)�� �� � ����)�� :< �:������� ��� � �� ��# � � ����#

�.16C,# E ������� �� ������ �� 64K67 �� ��� ��� ����� �� , �� �9��������� � ��

@ � ���� ��� ���� ���� ���� ���� ����*�������� ��� ��� ��� ��� :< �: �+9���)�� :< �: �����)�� <.<� :< �: L<.<�

,��������� � ������� ����� �+!,� !" �9!�� "! ��3"� �9, �9!7� ��+ ���,� !7 ��7!� �9� ��!"� ,4= ������ ���� 3,#"� +#, 3+#"� +#! 3�#!� +#7 3+#9� 3#, 3�#!� �#, 3+#,� 3#! 34#+� +#3

�9��������� � ������� ����� �3��� "7 !3+� 77B !"7� ,7B !!"� ,�B !�,� !4B �9�7� ",B ��+!� !�= ������ ���� 3�#4� 3#9 +3#7� �#3B ++#7� �#,B ++#!� 9#!B +3#�� �#�B +7#9� +#�B 3�#�� +#"

B�M 9#97� ��������� ��� �����+9���)�� �� �����)�� :< �:�� �� <.<�������� ��� � �� ��# � ������ �� :< �: L <.<�������� ��� � ��#

3499 <�� � �� ��#

� �!!! C������ E����� ���� .���� �� ��� �������� ������� �� ��������� ��� 33!7K3494

�; ������ �� &���� :�����# <.< �������� �� ��4#4I ����� �

�������� +"#"I ������� �������� �#,I ������ � � ������� .

�� &� �� ��� ������� � �� ����������� �� ������� � � ��� ��

����� �� ����� � �<�� � �� ��#� �!!�' 6���� �� ��#� �!!��# :� ���

������ ��� �� ���� ��� �������� ��� � �� �� �� � �� ��� � � ��

�� ������� ������� �� ������ � � ������� �� ����� � �<�� �

�� ��#� �!!�� �!!,' ;����� �� ��#� �!!,' �!!"��# ��� ��� ��� ��� :< �:

�� <.< �������� ��� ��� 9#!I ���� �� ��� ��#

=��� ��� �H������ �� ��� ����� � >= �� �� ����� � H �������

�����# ��� ��� ���� ����� ���� �H��� ����� ��� �H������ ��

����� � >C �� �� ����� � H �� ����# ��� ��� ���� ������ ���� ��

��� ��������� � $��� ��� �� ����������� ���� ��� �� ������ �

�� ��� ���� �.E8;.� ������� �� =�����2� ������# >��� �� ���

� �� %����� ��� ������� �� ��� �M 9#97 �����#

.�� �H��� ������ ��������� ���� ������� �� ��� 5�� ��

&��� ���� �� ��� =��������� �� *������������ �� ��� ��� :��� ��

� �� ��� ��� ���������� �� ���� �� �� ������� � �� ��� C������

&���� � �� = ���� �� �� E������� �!"� �"���9!�CC&�#

"�����

��� ,����������� ��������� �� ��� � �� � �� <.<�� :< �: �� ��� �

���� ��� �� ��� ���� ������ �������# :���� ��� �����������

��� ������� ����%� �� �� �������� ��������� ��� �� ���� ����

���� ���� �� �� ��� ���������� ������# :� ��� ��� ����������

������� ��� � �� ��� � � � �� C=6 ����� ��� ������ ������� ��

,������� ��� ����� %��� ������� ������ ��������� � �� � �� �� ��

�9������ � ��� ������ ���)�� � �� � �� �� �� ������� %��� �������

� �# �' ����� ��# ��� ����� �� � ���� ����� ���� ������ ����

� ��� �������� �� �� � ��� �� ��� ���� ����� ��� #�# �� �9������

� �# +' ����� +�# ��������� � �� <.<� ����� �� � �� � ���� ��� ��

:< �: ����� ���� ���� ������ ��� �������� �� ������� �� ����

������# -������� � ��� ���� ���������� �� :< �:K<.<

����������� � �� � �� +' ������ � �� +�# &��� ����� � �� ���

����� ������� � �9���������� ��� � ��� ����� ��� � ������

������� �� �� C=6 ����� ������� �� �� ����� �� ���� ��

���������� ���������K� ���� ��� � �� � �# 3�# ����� ��� �� ��������

������� �� ������ 3�� �� ��� ��������� � ����� ���� ���� ��

������� ��� ����� �������� ���� ����� ���������� �� � ������ ��

������ �H���� �������������� �� �H���� �� ����� �� � �����

������� �� � �# 3�# :������������ ��� ��� � �� �� �H��� � ��

��� �� �� �� ��� ��9 999�=� ����%������ ��� �� �� �� ���

��������� � ���� ���� � �� ��� ����������� � � �# 4�� ������� ���

��� ��������� �� ��������� � �������� � ��# :� ��� ���������� ���

� ��� ��� ���������� �H��� ��� �� � �� ��� ��� ����%������

��� �� �� ���� ����� �� ���� ���� ����� � ������� � ������ � ���

�� ��� ��� � �� �� ����� ���� ���� � �� ��� ����������� � ��� �����

:<# 7# ���� �� � �������� ��� �� �� ������� � ��� ���������� ��� � ��������� " �� !������ �� � ��# ��� ������� �� <.<> ����� �� :< �: ����� ������ ���� ��� ������� ��� �� �� :< �:K<.< ����������� �������� ��� ����# B�M 9#97 �� BB�M 9#9�� ��� L ��� ���� ��� L :< �: �9#9+���)��� ���L :< �: �����)��� �� ��� L<.<� ��# � ������ �� ��� L :< �: L<.<�#

:<# �# -�� �� � �� � ���)��� ����� � ��� � �� ������ � �� ��� ����<.<� ����� �� :< �: �����# :< �:K<.< ����������� �������� ��� ���� ��#B�M 9#97 �� BB�M 9#9�� ��� L ��� ���� ��� L :< �: �9#9+���)��� ���L :< �: �����)��� �� ��� L<.<� ��# � ������ �� ��� L :< �: L<.<�#

:< �:� <.<� �� ����� ����� ����� � ��� ��� ���� 349�

� �!!! C������ E����� ���� .���� �� ��� �������� ������� �� ��������� ��� 33!7K3494

����� �� ���� ����� ��� ��� ����%������ ��� � �� ������� ����

��� ����� %��� ��� �������� ������ 4�# ��� �H���� �� �����

�������� � �� ��� ���� ���)� � �9��������� � ��# :< �:K<.<

����������� �������� ��� ���� �� ��������� � ��� ����������� �

��� � �� �� ������� ��� �H�� �� �� �� �� ����� ������� ����� ��

�� �� ������� �� �H���� ������������� �� ��� ���������� �����

� �# 4' ����� 4�#

E���� ����� �������� � �� ������� � ��� � �� ���� ���%���

�� ��� ���� �� C=6 ����� ������ � �� ��� ���� �� �� � �� �� �� �� �

����� �� ���� ��# :� ��� ���������� ��� � �� ����� ��� J 79I ����

�� ���������)� C=6 ����� ���� �� ������� � �� � ������ � ��'

��� ���� ��� ���� � ���� �� � ������$���� �� ���� �� ������ 7�#

<.<� ����� �� � ���� ��� �� :< �: ����� ���� ���� ������ ���

������ � �� ��� ���� ��# -������� � ��� � � ��� �� ���� �� � ������

� ��� � �� �������� � �� :< �: �� <.<� ������ 7�# ��� �����

�� ����� ������ ����������� ������� �� �/��� �� ��� C=6 �����

� �� ��&���-5* ��� �� ����� ���� � ��� � �� ������ � ��

��� ��� �� �� � �� :< �: ������ �� �� �� ������� ���� ������ �

��� �� ���� ����� ����� ����� ������ ��# ��� ���� ����� ��

������� ����� ������ � ��� �� � �� ��� �� ������ ���)� �� ���

�������� ����� ���� ���� ����� �� ����� ����� �������� �� ��

������� �� ������ �� ��# ��!",�# ��� ����� ���� �� �� 64 �� 67

������� ���� �� ��� ������ ����� ���� � �9��������� ��� ����

������ �� ������� ��� � �� ����� � � � �� %���� +9I ���� ��

������� ���� � �������� ���� �� :< �:K<.< ����������� ������ ,�#

��� ������� ���� � ��������� � �� � ���� �� � ��� ������� � (� ��

������� ���� ��� ���� ���� ���������� �� ��� ������������ �� ��

� ���� ���������� ���� ������� �� ������ ,�# ��� ���� �� � �������

� (� ��� ��������� (� �� � ���� � �� ������� � ������ �� +9K

39�� ������ �� � ������� ��� � ����� �� 49K79��� ������������ ��� � ���� � ��� � ��� ����� �� 39K49�� ������#

&������ � ����� �� ���� �� ���� ������� ���� � ��� ���� ������

�� ��� ��� �� ������� �� ��� ����� ���� ���� ������� ���� ��

�� ����� �� �� ��� ���� � � �� ��� � ��� � �� ��� ���� ���� �

���� � ��� �%� �# :� ��� ���������� ��� � �� � �������� ��

���� �� �� �� � �������� ��� �� %��� ������ �� !������ �� � ��

� �# 7�# . � � ��� ���� ��� ������� ��� ��� ��� �� � �� � �# ��#

:< �: ����� �� <.<� ����� �� ����� ���� ��� ����� ����

���� ���� ��# -������� � ��� ���� �������� �� :< �:K<.<

����������� � �� 7 �� ��#

% ���� ��

�� � ��� ����� ��� ��� %��� � �� ����� � � ���� ���� ��

������������ �� ������� :< �: ����������� �� ��� � �� �

���� �� ��� ������� ������ ���� :< �: � ���� � ����� � ��

<.<�# ��� :< �:K<.< ���� ��� �� ��������� ��� ���� �� �������

��� ����� � ���������� �%� � ���� �������� ���� ��� �� � ��

���� �� � ��� ����� � ��# @� �� � ��� ������� �� � ����� ����

��� � �� ��� �� �� �� ��� ���� ��� ��� ���� ��������� �

������� ������� � ������� �� ��#� �!",�� ����� �� �� �����������

���� �� � � ��� �� ���� ���� � ����� ��� � ��� ������� ����

���� ��� �� � ���� ��� 1�����2� ������ � ����� ���� �� �����

�� ��� ������ ������ �*� �� �� ��#� �!!4�# 8� ��� ����� ���� �����

������� �� �� ��� ��� � ������ ���� ��� � �� ��� ������� �� �

������������ �� ����� � �� ������ ���������� �� �����

������� �� ���� ��� ���� ������ ���� ������ ��� ����� �������

���� ������� ������� �� ���� ���� ��� � ����� ��� ���� �� ��� ������� ��

��������� ����������# �� � ��� �� ���� ������ �������� ��� ����� �

�������� ����� ����� ������� ��� ��� ���� � �� � �� �;�/���

�� ��#� �!!7�# ��� ��� � �� ��� ��������� � ��������� ���� ���

������ �� ��� ����������� �� ������� �� <.<K:< �: �����������

�<�� � �� ��#� �!!"�' ;����� �� ��#� �!!!�# ��� ��� ����� � ��

���� � �������� �� ����� ������� �� ���� ������� ��� � � � ���

� � ���� �� ���� ��� ����� ���� ��� � � � ��� ����� ������ ��

����� &E> ������ ����� ������� �� �� � $ � � �� ������� ���

� ����%������ ��� �� �� ������� � �������� �!"�' ������ �� ��#�

�!",' &������� �� ��#� �!!�' ��(�) �� �( �� ��#� �!!��#

. �������� �� ����� %��� ������� ������� ��� � � � �� %���� ��

���� �� ��� ��� C=6 ������ �� ���� �� ����� ������ ��� ����� ��#

��� ����� �� C=6 ����� ������� ��� �� ��� � ,��������� ���

� ��� �� � ������ ���� ������ �� �9������# �� � ����� ���

����� ��� � �� ������� ��� � ��� ������� �� ����� ������� �� ��

������� �� � ���� ��� � ��� �� �� ��������� � ������ �� ��� ����%���

����� �� ����������� � ���������� ��� �������� �� � �����

����� �� �� � ������� ��� �H��� �� � � �� ���������� ��

��������� � ����� ���� ���� ���� ���� ����� �� ��� ��� ������ �

����� �# ��� ������� �� �� � ������� ��� �H��� ������� ���� � ���

� � � �� ������ �� ��� � �� ����� � � ������ ������������� ��

����� ������� ��# ����� ��������� ��� �������� � �� ���� ������

���� � �� � ���)� ��� ����� � �� �� � ���������)� C=6 �����

�� ��� ���� �� �� ���� ���� �� � ������$���� ����� �� ���� ��# ���

� ���� ����� ��� ������� ���� ��� � �� ���� �9������ ��� ��

�� � ��� ��������� � �� � � � ���� � ����� �� �������� �� � ����

�� ��� ����� ���� �����# .� ������� �� ��������� ������ �� � �� ��&���-5*� ��� � ����� ���� ���� ���� ���������� ���� �� � �����

������� � ��� ����� �� ����������� ������� ����� ������� ����

������ ���� �������� ��� C=6 ������ ��� ���� �� ���� ���

���� �� � ��� ����� ���� � ���� ���)� �� ��� �������

��������� � ����� ���� ���� ������ ���� ���� � ���� %� ���� �� �����

������# 8� ��� ����� ���� � ��� �� ��� ��� �� �9��������� ���

� �� ����� � � ������ � �� ���������� �� �������� �� ����� ������

������� �� ��#� �!",�� ����� � � ���� ��� ����� � � � �� �� ���

�������� � �� �� ����� ������� ��� ��� � �� � ��� ���� ����

������� �� ��� ���� �� ����� ������ �� ��� ���� ������� ������

��� �� C=6# �� � � ������� �� �� ������ �� �� ��� ����� �����

�� ������ � ��� ������� ���� �� �� ��� �������� 64K67� �� �� �

� �� %������ ���� � �9��������� ��� � ��# ��� ���� �� ������

� �������� � �� ��� � �������� �� �������# :� ��� ��� � �� ������

� �� :< �: ����� �� � ���� ��� �� � �� <.<� ����� ����� ��� ���� �

���� �� ����������� ������� � ����� ���� � �� :< �:K<.<

����������� ����� ��� �������� ������� �� �� ��� ����������

��������� ��� �� ���� ���� ����� �� �� �������� �� ��� ������

��� �� ����� ������ �� ������� �� ��������� ������ �� �� �� �����

���� �� �� E ������� �� 64K67 �� ��� ��� ������#

*��� �� �� �� �� ����� ���� <.< ����������� �� �� ���

����� �� � �� *&�+ �� ������������ ����� �������

��� ������� �� �� ������ �� � ���� �� <.< ��� ����� �� � ��

���� � ���� ::: �6���� �� ��#� �!!�' <�� � �� ��#� �!!,�� �� �� O� ���2

�� � ����� �� �� <.<� �� ����� ����� ��������� �� �� �����

�� ������� ��� �� �������� ��������� �������� �� ����� ��� ������

����� �H����� �<�� � �� ��#� �!!�� �!!,' �!!"�� ��# ����� �������

���� �������� � �� ������� �H����� �� �� ��������� �� � ���

�� �� � ����� �<�� � �� ��#� �!!��# ��������� <.< ���������

���)��� ������� :< �: ������ � ���� �� �������� ������

�<�� � �� ��#� �!!"�� �� � �� � ,9���� ������� � ��� ����� �����

�6��� �� ��#� �!!!�#

. ��� ��� �� ����� � ������� � ������� � ��� �H���������� ���� H�

�� ��� � ��� ������ ������� �� ��� �� �� ����� � ������ ����� �����

� ��� ��� �� ������� ������ ��� � � ���� ��� ��� �� ���������� �

�!""' 6 �� ��#� �!!9' ���� �� ��#� �!!�' >���%� �� ��#� �!!4�# ���

����� � ������� ��� ��� ��� �������� ����� ������ � � �� �� ��� �

���������� ���� ����� ��� �H���������� ���� H ��� ���� � ?��) �8/�

F#� �!!,' P������ � �!!3�# �� �������� ����� ��� )� ��������

349+ <�� � �� ��#

� �!!! C������ E����� ���� .���� �� ��� �������� ������� �� ��������� ��� 33!7K3494

� � %�������� ������ ������ �� ������� �� ����� ��� � ��

���������� � �!""�# �� � �������� ��� �� � � )��� ���� ��������

��� ����� %���� �� ����� ���� ���� ���� ��� ������ �� � �� �)

���� H �� �� � ����� ��� ��# ���� � � ���� ��� ���� ��� ������ ��

���������� � �� ��� � �� <.< �� :< �: ����������� � ������

�� ��� �������� � ��� ����� ��� �� �� ��� ��� )� ������ ������

� � �� ����� ��� �� �� ������ ��� � � �� �� :< �: �� �� ���� %�

�������� �F���� �� ��#� �!!3' �!!4�' .�� �� ��#� �!!4�' Q���� �!!7'

P��� �� ��#� �!!��# -���� �� ������� ������� �� ������� ��������

�� ���� �� :< �: � � �� �� ��� ��� )� ������ ������ � � ��

����� �� �.�� �� ��#� �!!4�' F���� �� ��#� �!!3' P��� �� ��#� �!!���

��� ������� :< �: ��� ��� � �� �� ��� �������� � ��# 6����

����������� �� �� :< �: �� ������ ���������� ����� ����� ��

�� ����� ��������� �� �?��/� �� ��#� �!"!' &���� � <������ �!!9�#

-����� � � � )��� ���� ��� ������ �� ������ �� ��� ���� �� :< �:K

<.< ��������� �� ��� ���������� ������ �� ��� � �� � ��� ��

� �� ������� ��� ��� � �� �� :< �: �� ��� ��������� � �����

���� ��� ���������� ����� �� ��� �� ��)�� ������ ��� ������� ��

������� ��� �H�� �� �� �� �� �� ����� �� ����� ������� ��# 8� ���

����� ���� ��� �� ���� � �� �� :< �:K<.< ��� �� � ��� �� ���

����� ����� ����� ����������� �����' �� � ����� ����� � ��� ����

���� �� ����������� �� ��� ����� ������� � �� ��������� � �������#

����� ��� ���������� ������� �� �� ���� � ������ ����� ��

����� ������ ������ ���� ������� �� ��� C=6 ����� �� ����� ��

��������� ������ �� � �� ��&���-5*# ��� ��� ������ �� �� � ���� � � �� ��� ���� ��� ���� �� :< �

:K<.< ��������� ������� ������� ��� ��%���� �� :< �:� �� ���� �

��� �� ��� �� 9#9+���)� � ��� �� ������ ��� � ���� ���� ���� ��

����)� :< �: �����# . � � ��� ������ ��� ������� �� � � ���

������� ����� ����� ��� ���� ����������� �������� ��� ���� ��

����� ������ �� ��� ����� �� ���� ���� ���� �<�� � �� ��#� �!!"�'

;����� �� ��#� �!!!�# :� ��� ������� ���� ���� ��� ������� ����

��� ���� � �� !���)� �� � ��' ��� ������ ��� ���� �� � ��� ���

���� ������ ��� ��%���� �� ����� � ��������� �� ��� ���� � � �� ��

�H�������� �� �� ���� �������#

��)��(���������

��� %���� �� ������ �� �������� �� :���� �<���� !,4� � �����������)�������#

�&&��� �� ���

��&���-5*� 1����������� ��H � ����� �� ������� �� ����H ���' C=6��H������ � ���� �����' <.<� �������� ��������' :< �:� ��� ��� )������� �������:' ���� ����� ����� �������� �� ����� ����' ������������� ����� �������� �� ����� ����' *&�+� ���������������� �����#

"���������

. (������ P# � =� ;��� �� F# ��!",� 1�� � ������ ������ � � ���� ���� �� ���� ��� �������A ������� �� ��������� �� ��� ��� )� ������ �������:�� ����� ������� �� ������� ��� ���� ������ �� ������� �� ��# '������"� ���� 3+K4+#

.�� � �#� .�� � .#� 1���� @#-# � &�������� =#5# ��!!4��<������� ��������� �� � � ������ �� �� ��� ��� )� ������ �������� � �� ����� ��7# ���������(�� ���� +37"K+3�3#

.�� � �#� *��)��� .#� 1���� @#-# � &�������� =#5# ��!!4�� -���� ��������� ������� �� ������� ������ ������� ������ �� �� ��� ��� ��� )������� �������: �� ��� ��� )� ������ �������� � �� ����� � ������H��# �"'��" )��"� ���� +93""K+93!3#

1�������� E#F#� &���� C#>#� @ ���H� 1#F#� ���� �(� =#*#� =����� =#�# �1��) �� =#<# ��!""� 6���� (�� �� �� � � �� � ��� ��� ��� ��� )� �������������: �:< �:� � ��� ��� ��� � �� $��� ��� �� ����� �������# '��� ���"����� +97K+�3#

1�������� �# ��!"+� :��� � �� �������� � �>. ������� ����� ������

������� �������� ��� �� ������ �� �� ����� �� �) ����� ��������� �� � ������� ������# �" �����" ���"� � ++7K+3�#

1������� 5#�#� 6�)�� E#=#� &��)� >#� ������� ># � =�� ����� �#�# ��!!3������ ����� �������� �� �� � �� � � ���� �� ������� ���� � ����� ��� � �1�����2� ������# ���" �����"� ��� 3"�K3"7#

&�������� 6#�#� @����� C#6#� ������� .# � ��(�) �� �(� F#C# ��!!��E���%������ ��� �� �� � ������ � ��� ��� ������ ������������� ��� ����# �" �������)��" �*�" �����"� ��� 4!�K794#

&���� � *# � <������ *# ��!!9� E���� ����� �� � �������� ��� �)����������� ��� �� �H����� �� ������� ������ �� ��� ��� )� �������������# �" ��� '��"� ���� �39,K�3�,#

=������� @#-#� -���� ?#� 5����� �#>#� >������ F#6#� ;�� �� 1���� F#6# �;�� @�)� F#F# ��!,+� >������� �A ������� �� ���� �� ��� ������ ��������# ������ ���� �9,K�9!#

=� &�� �� � *#� &������� 5# � <�������� *# ��!"3� >����� � :� � ��������� �������� %� ������������ �# :# :�� ������� ��� �� �� � �������� ����� ������� �� ��� ������ ������ ������ ���������� �� ����0��������� � ���(�� �� ����� � ���� ���# �" ��� '��"� ����33�K�374#

=� &�� �� � *#� ; ������� �#� &���� � � �#*#� Q���� � 5#� F���� 5# � <�� �� .#��!""� ��� ������ � ��� ��� ����� �� ������ � : �� ����������� � ������ ��3"� ��� ����������� ���� � �������� �� �������� ����� �� ��� �� ����)������ �����# �" �����"� � ��+7K��3�#

=����� 6#@# � >�� ��� >#F# ��!�"� .� ���� ���� ����� ����� ����� � ���������� �� ������� �� �� ����� � ��� ����A ��� ����� O�������2# �" �����" �������("� ��� 737K74+#

���� F#5#� 5����� F#>#� =�� ��� *# #� = ��� F# # � 1������� 5#�# ��!!4� ��������� ������� � � �� �� ������ �)� �� ��������� �� �������� ������ ����� �������� �� � �� �������� � ���� ��� ������� ���� � ����� ��� �# �" '��" )��"� ���� �9�79K�9�77#

<�� �� .#� &��� ������ <#� ������ �#� *������ *# � E�( � �#<# ��!"3������� �� ������� ��# ::# >���� ��� ������� ������ �� �� ������� ��# ��������� � 493K4��#

<�� �� .#� 6����� C#� ;����� � 6# � = < � �� .#�# ��!!,�<������� �������� ����������� �� �������� ����� ��������� �� ������� �� ������� ��# ���" �" �����"� �� �,4"K�,73#

<�� �� .#� ��� � � *# � Q���� � 5# ��!"3�� ����� �� ������� ��# :::#��������� ����� �� ����� ��� ����������� �� �H������ ����� �� ��# ��������� � 4�,K4+!#

<�� �� .#� ;����� � 6#� =� ���� �� .#� = < � �� .#�#� ��������� .#� &��������6# � ������ C#C# ��!!"�� ����� �� ������� �� ������ �� �������� ���������# :������� �� ������� �� �������� ��������� �� ��� ��� )� �������������:# ��������� �� �9+!K�93,#

<�� �� .#� ;����� � 6#� ����� 6#� *� ��� <# � = < � �� .#�# ��!!��<������� ��������� � ����� �/��# ::# C������ �� ���������� �� ��������� �� �� �� ��� �H����� �� �� ��������� � �������# �" �����"���"� ��� 7,+K7"9#

<�� �� .#� ;����� � 6#� 6���� �#� ��������� .#� ������ C#C# � = < � �� .#�#��!!"�� ����� ������� �� �� ����� ����� ���� ������� ���������� ��������� �� ��� ��� )� ������ �������: ���� ��� �����������# +�" �����" �����"� �� ,�4#

-���� � =#� .)������� �#� 6����� &#� �����)�� �#� -����� 6#F#� ������� 1#@#� ;����� F#6#� 5 ����� # � 1������ 1# ��!!7� 1���%� ��������� �� ��� ��� )� ������ �������: �� ������� ���� ��������� �����# �" �����" +" +����"� ���� �++K�+�#

-�������� &#C#� *� �� ��� -#>#� *�����)� 5#.#� =�� ��� .#�#� 6������� &#�.���� � � �#� > ������ 6#&#� ������� 1#� ;�����5#.#� ?�� ������ ;#C# �5��������� .# ��!!4� <=E A � ������ ��� ��� ������ ��� ����������������� � ��� ������ ����� �� �����# +���� ���� �9�+K�9�4#

F����� F#:#� <��)������ .#� 1���� @#-#� &�������-����� &# � &��������=#5# ��!!3� CH���������� ���� H ����� �� ��� ��� )� ������ �������� � ������� ��7A ������ �� �� �� ��� ������� �� :< �:# �" ��� '��"� ���� �,!K�",#

?��/�� �#� >)������� .#� >/������ F# � 6������ <# ��!"!� :��� ��� )� �������������: �:< �:� �� ������ ��������� �� �� ��� ��� �� �� � �����# '��� ���"���� 3!�K3!"#

6����� C#� = < � �� .#�#� ����� 6#� *� ��� <# � <�� �� .# ��!!��<������� ��������� � ����� �/��A �# 6�� ���� �� �������� ���������������� ��� �� ������ ��# �" �����" ���"� ��� 7�7K7,�#

6 � P#>#� � ����� *#<#� &����� ?#� @������ �#.#� -������� 5#�#� ?�����&#�#� � ������� F# � =���� �# # ��!!9� &��� �� �� �H����� �� �� ��������������� ������� ����� � ���� ���� � ����� � �� ��� ���������� ��� � ��# +���� ���� ��!9K��!4#

6 � F#� E H��� 5#� ������� .#� 1������ ># � 1��(��/�� ># ��!!"� .����� �����H����� �� ��� ����� ���������� � ������ � ����� ����� �������� ������� ����� ���� ��� � �� �� ��� ���# ���" '��� ���"� ��� �,4K�"�#

:< �:� <.<� �� ����� ����� ����� � ��� ��� ���� 3493

� �!!! C������ E����� ���� .���� �� ��� �������� ������� �� ��������� ��� 33!7K3494

6 ����� 5#�#� .����� &#.#� &������� F#�#� -����� &# � @ ����� >#F#��!!3� ��� �������� � ������ �� �� ��������� � ������� � ��� ��������� ��*��) ����2� �����# �*�" �����"� ���� �93K��"#

6���� �#� ;����� � 6#� 6����� C#� 5����� � <#� = < � �� .#�#� ;������ � .#���������� .#� ������ C#C#.# � <�� � ��!!!� <������� ��������� ��������� �������� :< �: ����� ������ �� ���������� ����� ����� ����A � ����������� �������� ��� ��# �" �����" ���"� ��� 4!�K793#

6��� �� �#1#� >������ ��� ?# � ;������ <# ��!",� *�������� ������� ������ �� ����������� ��� �� ����� �/�� � �� � �� � ��� ��� ��� ���������� �� ��� ���# ,��" '��� ���"� ��� !�K�9�#

6��� *#?#� �������>������ 1#�#� -����� �#.#� > ������ F#<#� F������ �#�=2������� .#F# � ;��@�)� F#F# ��!"�� >������� ��&� ��� ��� )� �������������: �� ��� ��� )� ������ �������:: �5E.� � ��� ����� �� ���� ����# �" '��" )��"� ���� �473!K�4744#

��(�) �� �(� F#C# ��!!�� G� $ � � ���� �� ��� ������� � �� ��� ����������� � ��� ������ �� ��� ����� � ��� ����� ����� �������� �� ���������� �� ����# �����" -���"� ��� �"+K�"�#

������� .# � �������� 6# ��!"�� .������� �� ����� � � ���� ������ ���������� ����� � ����# �" ����(����"� �� 347K377#

������� .#� *������ F#� @���� ;# � 6��� �� �#�# ��!!3� 5�� ����������� �� � ����� ����� �������� �� ���� ����� � ��# �*�" ������"� �� �3,K�4�#

������� .#� >���� ����� E#6# � ��(�) �� �(� F#C# ��!",� - ������������ ������������ ����� ����� �������� �� ���� ����� � ����# �" ����(����"� �� +9�K+�3#

� ������� -#� :)��� ?#� ?� �)��(� 1#� &������� F#�#� @���� ;# �6 ����� 5#�# ��!!4� .����� �� ����� ����� ����� � ������� � ���������� � �� &E� �� 1=E # +���� ���� ��9,K���9#

��������� � =# ��!""� ������� �� �� ������������ �� ���� H���� ��� �%�������� ������ ������ �� ��� �� ��� ����� ������� �� �����# �" ��� '��"���� ,73K,7,#

8������ �� 5#@# ��!"!� ��� ��������� � ������ �� �������� ����� ����������� ����# .����� �����"� ��� +7+K+77#

*���� &#.#� 5�� �� 1#.#� *������ =#E# � *� ��� =#6# ��!!4� .������ �� ����� ����� �� �� ��������� �������� ��� � � ��� �� ����� � ��# .���� ��� ������� ���� � ����� ��� �# ��" �" ���)��"� ���� �K,#

*���� =#*#� <�/��)� =#&#� <������ 5#�#� P���� ����� 5#�# � < ���� F#�#&#F#��!"+� :����������� ��� � � ������� �� � ��������� � �������������� � �� ���) ���� �� ����� � �� <��# +���� ��� �973K�977#

*� ��� =#6#� &�������� =#@# � ?�� ����� ;#C# ��!!4� ����� ����� ������� �� ��� �����# �������" ,�"� �� 3K��#

5�� ��* ���� C#� 5������� �#�# � :�� � =#E# ��!"�� C������ �� ��� �� ��� ��� )� ������ �������::� �� ����� ������ ������ �� ��� �� ������ �� ��

��� ��� � ����� ��������� � �� ������� ������# �" �����"� �� �+��K�+�!#

5����� >#.# � 6�)�� 1#=# ��!!7� � ��� �� ������� ��� �� �� �� ��� � �� .�* �������� � 1����� ����� �������� ���� �� ����� ��� ��# ��" �"���" /����"� �� �,+K�,�#

>���%� � �#� ?������ �#C#� <��)�� �#F#� � �(����� &#� F������ �#�# � ���� ���6�� ���� �# ��!!4� ��� ���� �� �%�� � ��� �� �� �H�� ��������������� �� ����� �� ��������� �� " ���(��� GE&��# ���� � 49!K4+4#

>� ��� �#� &������� F#� ?�������� <#.# � ���������� 6#<# ��!""� ��� ��� ��� )� ������ �������:: �:< �::� �������� �� ��� ��� �A ��� ���� ��� �� �� � ��� (� �� ����� �������# '��� ���"� ���� +4�K+4�#

�� ����� F# � ?��) �8/�� F# ��!!,� <����� ������� � ��� �H���������� ���� H#��+�'� ��� 7�K7!#

�������� -# ��!!�� ��� ����� �� ����� �� ��������� � �������# .����� �����"� ��� ��7K�,9#

���/�����)�� F#R#� <������� F#8# � <������� E#?# ��!"+� -������ ������H ��� �-5*� ���/����� �� ������� ��H � �� ���� �� ��� ���� ���� � ������������� ���������� ���)��� ���� ���� -5*# '��� ���"� ���� 33K79#

���� � F#� G������ ?#� ?������� ?#� ��������� ># � �������� �# ��!!��. ��� ��� �� �� ����� ��� � �� �������A ������ ��������� �� �� � ) ����?� ��$����� ������� ��� ���� �� ��� ����# '�)��" '��)��" ���" ���"� ��� ,!+K,!,#

;����� F#6#� &��������� *#&#� <� �)����� �#.# � E���� E#�# ��!!�� *����� ��� � �� �� ��:< �: � ���������� ����� �������� �� ������# 0'���������� +���"� ���� �"K+,#

;�/���� 5#� >���� P# � ?���� .#&# ��!!7� R��� ��� �� ������ ��� �� �������� ��� ����� ������� �� ��������� � ������� �� �H���� (� ���������� � � ��# ���" �" �����"� � �9"K��7#

;����� � 6#� ���� &#� = < � �� .#�#� ������ C#C# � <�� �� .# ��!!,�C������ �� ��� ���� �� �������� ��������� �� ��� ��� )� ������ �������:�� ����� ����� ����� � ������� ����# �����" -���"� ��� 4�K44#

;����� � 6#� 6���� �#� 6����� C#� = < � �� .#�#� ��������� .#� ������ C#C#� <�� �� .# ��!!!� <������� ��������� ����� ��� ��� )� ������ �������:�������� ����������� ��# 1���)�� �� ����� ����� ���� � ��� �����������# ��������� ��� 7�7K7,+#

P������ � P# ��!!3� *�����������K������ ������ ������� ��# .�����/����" /�����)���"� �� 4+"K43,#

P���� P#@#� P���� �� ��� �# � 5������� �#�# ��!!�� -���� � �� � � �� �� ��� ��� )� ������ �������� � �� ����� ��3 �� ���� %�������� �� ����� ��� �����A ���� �� ������� ������ �������������# ���������(�� ���43�3K43,�#

Q���� F# ��!!7� *��� ���� ��� ���� �� ��� ��� ��� )� ������ ������ � � ������� ��# ���" �" ��������"� ���� �47K�74#

3494 <�� � �� ��#

� �!!! C������ E����� ���� .���� �� ��� �������� ������� �� ��������� ��� 33!7K3494