Interactions filaire/poumon dans le modèle murin de filariose ...

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MUSEUM NATIONAL D’HISTOIRE NATURELLE Ecole Doctorale Sciences de la Nature et de l’Homme – ED 227

Année 2017 N°attribué par la bibliothèque

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THESE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DU MUSEUM NATIONAL D’HISTOIRE NATURELLE

Spécialité : Parasitologie/Immunologie

Présentée et soutenue publiquement par

Frédéric FERCOQ

Le 29 Septembre 2017

Interactions filaire/poumon dans le modèle murin de filariose

Litomosoides sigmodontis

Sous la direction du Dr. Coralie MARTIN

JURY :

Nom, prénom Qualité Lieu d’exercice

Dr. MILON Geneviève DR Institut Pasteur, Paris Président du jury

Dr. WOLOWCZUK Isabelle DR2 UMR8204-U1019 – CII, Lille Rapporteur

Dr. DELHAES Laurence PU-PH CHU de Bordeaux Rapporteur

Dr. HUEBNER Marc CR (Allemagne) IMMIP, Bonn Examinateur

Dr. LANDMANN Frédéric CR1 UMR5237 – CRBM, Montpellier Examinateur

Dr. MARTIN Coralie CR1 UMR 7245 – MNHN, Paris Directeur de Thèse

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Remerciements Je tiens tout d’abord à remercier les membres du jury d’avoir accepté d’évaluer le

travail effectué au cours de cette thèse.

Un grand merci ensuite :

A ma directrice de thèse, le Dr. Coralie Martin, pour m’avoir accueilli au sein du

laboratoire et encadré durant ces trois années, me permettant d’acquérir de nombreuses

compétences.

Aux Dr. Marc Huebner et Leo Carlin de m’avoir accueilli et guidé à plusieurs reprises,

dans leur laboratoire respectif, permettant ainsi l’initiation et le déploiement durable de

fructueuses collaborations

A Grégory qui, par ses résultats de thèse, non seulement a permis d’initier cette thèse

mais en outre, a transmis de nombreuses connaissances nécessaires à la mise en œuvre rapide

d’approches expérimentales délicates

A Emilie pour les pauses thé/café/bière qui ont ensoleillé mes deux premières années.

Merci aussi pour ses conseils inestimables en biologie moléculaire.

A Géraldine pour son aide précieuse avec la microscopie électronique à balayage et

Françoise pour les conseils en histologie.

A Joy pour s’être bien occupée de mes hordes de souris (et fait le café du matin).

A Christiane pour les moments passées à refaire le monde (et à parler science aussi !).

A Nathaly pour son aide précieuse et ses histoires rocambolesques.

A Estelle pour son aide lors de la dernière ligne droite.

Et à toutes les personnes de l’équipe : Linda & Linda, Brice, Dhikra, Lotfi,

Amandine... qui m'ont permis de passer trois années mémorables.

Enfin, je tiens à remercier Julie qui m'a toujours soutenu.

5

Table des matières

Remerciements ......................................................................................................................... 4

Table des figures ..................................................................................................................... 12

Liste et titre des tableaux ....................................................................................................... 15

Table des Annexes .................................................................................................................. 16

Liste des abréviations ............................................................................................................. 17

Résumé .................................................................................................................................... 20

Abstract ................................................................................................................................... 21

INTRODUCTION .................................................................................................................... 23

1. Filaires ................................................................................................................................. 25

1.1 Diversité des filaires ....................................................................................................... 25

1.2 Biologie .......................................................................................................................... 25

1.3 Programme de développement ...................................................................................... 27

1.4 Wolbachia ....................................................................................................................... 28

2. Filarioses humaines ............................................................................................................ 29

2.1 Epidémiologie et coendémicité ...................................................................................... 31

2.2 Programme de développement ...................................................................................... 33

2.2.1 Les filaires lymphatiques : Wuchereria bancrofti, Brugia/B. malayi et B. timori .. 33

2.2.2 Onchocerca volvulus ............................................................................................... 34

2.2.3 Loa loa ..................................................................................................................... 34

2.2.4 Les mansonelles ...................................................................................................... 35

2.3 Principales manifestations cliniques .............................................................................. 36

2.3.1 Filarioses lymphatiques ........................................................................................... 36

2.3.2 Onchocercose .......................................................................................................... 41

2.3.3 Loase ....................................................................................................................... 44

3. Les filarioses pulmonaires, cardio-pulmonaires et pleurales ......................................... 48

3.1 Dirofilaria immitis .......................................................................................................... 49

3.2 Mansonella perstans ...................................................................................................... 56

3.3 Litomosoides sigmodontis .............................................................................................. 57

6

4. Programmes multivalents visant à « traiter » les filarioses .... Erreur ! Signet non défini.

4.1 Traitements à grande échelle ou traitements de masse (Mass Drug Administration,

MDA) ................................................................................................................................... 61

4.1.2 Programmes de lutte contre l'onchocercose ............................................................ 63

4.1.3 Les traitements individuels ...................................................................................... 63

4.1.4 Considérations actuelles .......................................................................................... 64

4.2 Mode d'action des molécules ciblant les filaires ........................................................... 65

4.2.2 Diéthylcarbamazine ................................................................................................. 67

4.2.3 Albendazole ............................................................................................................. 67

4.2.4 Tétracyclines ........................................................................................................... 69

4.2.5 Traitements en cours d'évaluation ........................................................................... 69

5. Cinétique de la « réponse immunitaire » chez les souris infestées par L. sigmodontis . 71

5.1 « Réponse immunitaire » au site d'inoculation : apport des différents modèles ........ 73

5.2 Migration des larves de L. sigmodontis vers la cavité pleurale .................................. 74

5.3 « Réponses immunitaires » dans la cavité pleurale lors de la phase pré-patente ....... 75

5.4 « Réponse » dans la cavité pleurale au cours de la phase patente .............................. 77

6. Rappels anatomiques/histologiques sur les poumons, le cœur et les systèmes

vasculaires .............................................................................................................................. 81

6.1 Plèvre et mésothélium .................................................................................................... 81

6.2 Le poumon, les bronches, les bronchioles et les cellules alvéolaires de type I et II : .... 83

6.3 Vaisseaux sanguins et lymphatiques pulmonaires ......................................................... 85

6.3.1 Vascularisation sanguine pulmonaire:..................................................................... 85

6.3.2 Les lymphatiques des poumons et de la plèvre : le système pleuropulmonaire ...... 87

6.4 Espace périvasculaire ..................................................................................................... 90

6.5 Les macrophages pulmonaires ....................................................................................... 91

7. Dommages pulmonaires due aux anchylostomes ...................... Erreur ! Signet non défini.

7.1 Cycle de vie des anchylostomes ..................................................................................... 95

7.2 Neutrophiles et amplification de la pathologie pulmonaire. .......................................... 97

7.3 Macrophages : contrôle de sous populations de parasites et réparation des tissus......... 97

OBJECTIFS DE LA THESE ................................................................................................... 99

7

MATERIEL ET METHODES ............................................................................................... 101

1. Ethique .............................................................................................................................. 102

2. Parasites, souris et inoculation des larves /L3 de L. sigmodontis ................................. 102

2.1 Maintien du cycle de L. sigmodontis pour obtention des larves L3 ............................. 102

2.2 Les souris de laboratoire............................................................................................... 103

2.2.1 Souris BALB/c ...................................................................................................... 103

2.2.2 Souris BALB/c IL4R/IL5 KO ............................................................................... 103

2.2.3 Souris C57BL/6 S100A9-/- .................................................................................... 103

2.3 Inoculation aux souris .................................................................................................. 103

2.4 Suivi de la présence ou non de microfilarires chez les souris .................................... 104

3. Autopsie des souris, collecte des filaires, prélèvement et fixation des poumons. ........ 104

3.1 Exsanguination et préparation du sérum ...................................................................... 104

3.2 Lavage de la cavité pleurale ......................................................................................... 104

3.3 Evaluation du développement filarien .......................................................................... 105

3.4 Lavage bronchoalvéolaire ............................................................................................ 105

3.5 Dénombrement des L3 dans les poumons .................................................................... 106

3.6 Préparation et fixation des poumons pour différentes analyses. .................................. 106

4. Les analyses histologiques et immunohistologique.sur coupes fines 105

4.1 Déshydratation, inclusion en paraffine, préparation des lames .................................... 107

4.2 Colorations histologiques ............................................................................................. 108

4.2.1 Coloration à l'Hémalun-Eosine (HE) .................................................................... 108

4.2.2 Coloration au Trichrome de Masson ..................................................................... 109

4.2.3 Coloration à l'Acide Periodique-Schiff (PAS) ...................................................... 111

4.2.4 Colorations immunohistologiques avec révélation enzymatique .......................... 111

4.2.5 Marquage du S100A9 ............................................................................................ 112

4.2.6 Marquage de la cytokératine 7 .............................................................................. 114

4.2.7 Marquage de la podoplanine ................................................................................. 115

5. Immunohistochimie sur coupes épaisses ........................................................................ 117

5.1 Préparation des coupes épaisses de poumons (Precision Cut Lung Slices ou PCLS) .. 117

5.2 Colorations immunohistologiques en fluorescence ...................................................... 117

6. Analyse des images obtenues par microscopie confocale............................................. 119

8

7. Microscopie électronique à balayage .............................................................................. 120

8. Cytométrie en flux ............................................................................................................ 121

8.1 Préparation des cellules ................................................................................................ 121

8.2 Identification des populations leucocytaires. ............................................................... 121

9. Analyse de transcrits de cytokines inflammatoires dans le poumon ........................... 124

9.1 Extraction des ARN totaux et rétrotranscription .......................................................... 124

9.2 Obtention des profils d'expression cytokiniques .......................................................... 126

9.3 Analyse in silico de réseaux biologiques ..................................................................... 127

9.4 Validation des résultats de l'analyse transcriptionelle. ................................................. 128

9.4.1 Rétrotranscription .................................................................................................. 128

9.4.2 Conception des amorces ........................................................................................ 129

9.4.3 PCR quantitative ................................................................................................... 130

10. Purification des microfilaires à partir de sang de mérions hôtes de L. sigmodontis 131

11. Détection et quantification des microfilaires pulmonaires par PCR quantitative ... 132

11.1 Extraction de l'ADN ................................................................................................... 132

11.2 Préparation de la gamme ............................................................................................ 133

11.3 Détection des microfilaires et normalisation .............................................................. 133

12. Cultures cellulaires ......................................................................................................... 135

12.1 Purification des neutrophiles de souris ...................................................................... 135

12.2 Cultures de neutrophiles de souris ............................................................................ 136

12.3 Culture et stimulation des splénocytes de souris ........................................................ 136

13. Dosage des cytokines et autres molécules inflammatoires par une méthode ELISA137

14. Dosage de l'ADN extracellulaire ................................................................................... 138

15. Analyses statistiques ....................................................................................................... 138

9

RESULTATS ......................................................................................................................... 141

CHAPITRE 1 : La migration des larves infestantes/L3 de Litomosoides sigmodontis chez la

souris BALB/c révèle l’existence de dommages pulmonaires transitoires ... Erreur ! Signet non

défini.

Introduction .......................................................................................................................... 144

Résultats ................................................................................................................................ 147

1. Cinétique de la migration des L3; comparaison de différents modes d'inoculation. . 147

2. Le passage de L3 dans le poumon induit une inflammation caractérisée par des

hémorragies locales, des « granulomes » et une accumulation de neutrophiles dans les

espaces périvasculaires.......... .............................................................................................. 150

3. Des processus inflammatoires physiologiques se déploient quelques heures après

l'inoculation des L3. ......................................................................... Erreur ! Signet non défini.

4. Les neutrophiles murins exposés in vitro à des L3 peuvent produire des « NETs ». . 158

Discussion .............................................................................................................................. 161

CHAPITRE 2 : L'hétérodimère S100A8/A9 - calprotectine- favorise-t-il la survie de

Litomosoides sigmodontis ? .................................................................................................. 171

Introduction .......................................................................................................................... 172

Résultats ................................................................................................................................ 178

1. S100A9, un marqueur de l’inflammation aigue chez les souris BALB/c infestées par L.

sigmodontis ? ......................................................................................................................... 178

1.1 Augmentation précoce des transcrits s100a8 et s100a9 dans le poumon .................... 178

1.2 La protéine S100A9 dans les Lavages Broncho Alvéolaires/LBA et fluides des cavités

pleurales…………………………………………………………………………………..179

1.3 Augmentation du nombre de neutrophiles S100A9+ dans les poumons ..................... 181

2. S100A9, un acteur dans le contrôle de l’établissement des L3 de L. sigmodontis ?

Analyse des souris C57BL/6 déficientes en s100a9 ........................ Erreur ! Signet non défini.

2.1 L’absence de s100a9 se traduit par un moindre établissement des larves L3 ...... Erreur !

Signet non défini.

2.2 L’absence de S100A8/A9 se traduit par une moindre recrutement cellulaire dans le

LBA mais facilite celui dans la cavité pleurale .................................................................. 185

2.3 L’absence de S100A8/A9 augmente le nombre de cellules spléniques ....................... 187

10

2.4 Le profil cytokinique des cellules spléniques est caractérisé par une dominance pro-

inflammatoire en l’absence de S100A8/A9 ....................................................................... 188

2.5 Observation de dommages des vaisseaux sanguins pulmonaires et de processus

inflammatoires bronchiques indépendants du S100A8/A9 chez les souris C57BL/6 ........ 189

2.6 En l’absence de S100A8/A9, quelles fonctions pour les neutrophiles ? ..................... 193

Discussion .............................................................................................................................. 196

CHAPITRE 3 : Dommages pulmonaires prolongés chez les rongeurs chez lesquels est

générée la descendance des microfilaires de Litomosoides sigmodontis ...... Erreur ! Signet non

défini.

Introduction : ........................................................................................................................ 203

Résultats ................................................................................................................................ 206

1. Microfilarémie et dommages pulmonaires chez la gerbille .......................................... 206

2. Analyse cinétique de la phase patente chez la souris BALB/c, localisation des parasites

et distinction des souris en deux groupes selon la présence ou non de microfilaires ..... 210

3. Analyse de profils de biomolécules-transcrits et protéines- au niveau des poumons . 212

4. Production de mucus par l'épithélium bronchique de souris hôtes de microfilaires . 216

5. Les macrophages périvasculaires augmentent chez les souris microfilarémiques. .... 219

6. Dommages du mésothélium pleural chez les souris hôtes de microfilaires ................ 225

7. Inflammation pleurale/bronchoalvéolaire exacerbée chez les souris microfilarémiques.

................................................................................................................................................ 230

8. L'initiation des dommages pulmonaire chez les souris microfilarémiques signe-t-elle

un profil de type 2, ............................................................................ Erreur ! Signet non défini.

Discussion .............................................................................................................................. 239

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ................................................................................. 250

Valorisation des résultats ......................................................................................................

254

11

Annexes ................................................................................................................................. 260

Bibliographie ......................................................................................................................... 265

12

Table des figures

Figure 1. Diversité des filaires. ................................................................................................ 24

Figure 2. Phylogénie des filaires basée sur une analyse multigénique. ................................... 24

Figure 3. Cycle de vie des filaires et diversité d'hôte et de localisation. .................................. 26

Figure 4. Répartition des filarioses humaines. ......................................................................... 30

Figure 5. Evolution du lymphoedème filarien. ........................................................................ 37

Figure 6. Histopathologie du « poumon eosinophile tropical » .............................................. 38

Figure 7. Hypothèse mécanistique sur la pathogénèse des atteintes oculaires. ........................ 42

Figure 8. Synthèse des travaux sur la localisation de Dirofilaria. immitis. ............................. 50

Figure 9. Hypothèses de migration des stades infestants de D. immitis. .................................. 52

Figure 10. Progression de la dirofilariose pulmonaire chez le chien. ...................................... 54

Figure 11. Cycle de vie de Litosomoides sigmodontis. ............................................................ 58

Figure 12. Structure chimique de l'Ivermectine (A), du Diéthylcarbamazine (B) et de

l'Albendazole (C). ..................................................................................................................... 66

Figure 13. Structure chimique de la Doxycycline (A), du Flubendazole (B), et de

l'Emodepside (C). ..................................................................................................................... 68

Figure 14. Coupe transversale de la cavité cavité thoracique. ................................................. 80

Figure 15. Comparaison de la structure des voies aériennes murines et humaines.................. 82

Figure 16. Structure des alvéoles. ............................................................................................ 84

Figure 17. Circulations sanguines pulmonaire et bronchique. ................................................. 86

Figure 18. Réseau lymphatique de la cavité pleurale et drainage du liquide pleural. .............. 88

Figure 19. Résumé des principales pathologies pulmonaires. ................................................. 94

Figure 20. Réponses pulmonaires lors de l'infestation par Nippostrongylus brasiliensis. ....... 96

Figure 21. Stratégie d'analyse du contenu cellulaire de l'espace périvasculaire. ................... 119

Figure 22. Stratégie de discrimination des populations cellulaires. ....................................... 123

Figure 23. Obtention du cycle seuil (CT) après l'acquisition des PCR quantitatives. ............ 126

Figure 24. Purification des microfilaires sur gradient de Percoll. .......................................... 131

Figure 25. Gamme de détection de l’ADN de microfilaires pulmonaires.............................. 134

Figure 26. Voie de migration suggérée des L3 de L. sigmodontis. ........................................ 145

Figure 27. Cinétique de l’infestation post inoculation des L3au niveau de la peau. .............. 146

Figure 28. Localisation tissulaire des L3 lors de la phase de migration. ............................... 146

Figure 29. Cinétique de l’infestation post inoculation intraveineuse de L3 . ......................... 148

Figure 30. Hémorragies dans le poumon de souris où sont détectables les L3 ..................... 150

Figure 31. Granulomes dans les poumons des souris infestées. ............................................. 151

Figure 32. Présence d’infiltrats neutrophiliques dans l’espace périvasculaire des poumons des

souris infestées. ...................................................................................................................... 152

Figure 33. Quantification des neutrophiles dans les espaces broncho-alvéolaires et pleuraux.

................................................................................................................................................ 153

Figure 34. Quantification des éosinophiles et des macrophages dans les espaces

bronchoalvéolaire et pleural. .................................................................................................. 154

Figure 35. Inflammation pulmonaire précoce transitoire ....................................................... 155

Figure 36. Régulation de l’inflammation pulmonaire ............................................................ 157

Figure 37. Neutrophiles de souris C57BL/6 exposés in vitro à des L3 de L. sigmodontis. .. 158

Figure 38. L3 et Nétose de neutrophiles de souris C57BL/6 exposés à des L3 . ................... 159

Figure 39. Synthèse des voies de migrations des L3 après inoculation soit sous-cutanée (SC)

soit intraveineuse (IV). ........................................................................................................... 162

Figure 40. Lors de la migration des L3 de L. sigmodontis au sein des poumons- espaces

pleuraux compris- des processsus inflammatoires physiologiques opèrent-ils ? ................. 166

13

Figure 41. Les protéines de la famille S100, une famille détectée chez les vertébrés. .......... 173

Figure 42. Effets cellulaires potentiels de l’hétérodimère S100A8/S100A9. ........................ 174

Figure 43. Augmentation précoce et transitoire des transcrits s100a8 / s100a9 au niveau des

poumons de souris BALB/c hôtes de L. sigmodontis. ............................................................ 178

Figure 44. Augmentation précoce et transitoire du S100A9 dans les fluides broncho-

alvéolaires et pleuraux de souris BALB/c ............................................................................. 179

Figure 45. Augmentation précoce et transitoire de neutrophiles exprimant S100A9 dans les

poumons de souris BALB/c .................................................................................................. 181

Figure 46. Succès parasitaire en fonction du mode d’inoculation et de la souris C57BL/6 WT

ou S100A9- ............................................................................................................................ 182

Figure 47. Absence de S100A9 dans les granulomes pulmonaires (BALB/c) ...................... 182

Figure 48. Dénombrement - J12/13- des cellules dans les fluides pleuraux et le LBA ......... 184

Figure 49. Correlation entre le nombre de parasites dans la cavité pleurale et le nombre de

cellules dans le « Lavage Broncho-Alvéolaire (LBA) ». ....................................................... 184

Figure 50. Quantification des macrophages et des neutrophiles pleuraux et alvéolaires. ...... 186

Figure 51. Effectif accru des populations de leucocytes/lymphocytes spléniques chez les

souris C57BL/6 invalidées pour le gène s100A9 hôtes de L3 ............................................... 187

Figure 52. Comparaison de la concentration de cytokines dans les surnageants de cultures de

cellules spléniques .................................................................................................................. 188

Figure 53. Coupes histologiques de poumons de souris C57BL/6 s100A9-/- ......................... 190

Figure 54. Nbre de vaisseaux sanguins inflammés et de larves dans la cavité pleurale ........ 191

Figure 55. Nbre de larves dans la cavité pleurale et % de bronches contenant des cellules

caliciformes ............................................................................................................................ 192

Figure 56. Comparaison in vitro de neutrophiles prélevés de souris s100A9+/+ ou s100A9-/- 194

Figure 57. Anomalie du mésothélium pulmonaire de gerbilles hôtes de L. sigmodontis ...... 205

Figure 58. Structure « fibrotique de nodules » au niveau du mésothèlium de gerbilles ........ 207

Figure 59. Microfilaires à proximité de la plèvre viscérale de gerbilles hôtes de L.sigmodontis

................................................................................................................................................ 208

Figure 60. Dénombrement de L. sigmodontis dans la cavité pleuralep, le cœur et le sang de

souris BALB/c ........................................................................................................................ 209

Figure 61. Granulomes et microfilaires libres au jour 70 chez les souris BALB/c ............... 211

Figure 62. Profils de transcrits au niveau de poumons de souris BALB/c hôtes de

L.sigmodontis ......................................................................................................................... 213

Figure 63. Cytokines et chimiokines dans le LBA et la cp de BALB/c Mfposvs Mf neg ......... 214

Figure 64. Analyse de réseaux cytokiniques et fonctions biologiques potentielles. .............. 215

Figure 65. Présence de cellules PAS+/calicifomes mucus+ chez les souris BALB/c Mfpos ... 217

Figure 66. Cellules PAS+ : bronches/ bronchioles de souris BALB/c mfpos vs neg ................. 218

Figure 67. Présence de cellules CD169+ dans les espaces périvasculaires et péribronchiques.

................................................................................................................................................ 219

Figure 68. Les macrophages CD169+ expriment le CD68. .................................................... 220

Figure 69. Infiltrats périvasculaires de macrophages CD169+ détectés uniquement ches les

souris BALB/c microfilarémiques. ........................................................................................ 221

Figure 70. Quantification des infiltrats périvasculaires. ........................................................ 222

Figure 71. Présence de cellules CD169+ dans la plèvre viscérale.. ........................................ 223

Figure 72. Structures lymphoïdes associées aux bronches et à la plèvre. .............................. 224

Figure 73. Epaississement pleural des souris microfilarémiques. .......................................... 225

Figure 74. Hypertrophie des cellules mésothéliales chez les souris infestées........................ 226

Figure 75. Hyperplasie du mésothélium chez les souris microfilarémiques. ......................... 227

Figure 76. Surexpression de la podoplanine par le mésothélium hypertrophique. ................ 228

Figure 77. Fibrose du mésothélium hyperplasique. ............................................................... 229

14

Figure 78. Nbre de cellules dans la cavité pleurale et le LBA de BALB/c Mfposvs Mf neg .... 230

Figure 79. Augmentation des granulocytes et des macrophages pleuraux chez les souris

microfilariennes ...................................................................................................................... 231

Figure 80. Augmentation des éosinophiles et des lymphocytes T CD4+ dans l'espace

bronchoalvéolaire chez les souris infestées. ........................................................................... 232

Figure 81. Rendement filarien et taille des parasites dans les souris IL-4R-/-/IL5-/-............... 233

Figure 82. Fertilité des femelles et production de microfilaires. ........................................... 234

Figure 83. Détection des microfilaires pulmonaires. ............................................................. 235

Figure 84. Localisation des microfilaires chez les souris IL-4R-/-/IL5-/-. ............................... 236

Figure 85. Chez les souris Mfpos les dommages tissulaires sont dépendantes de l’IL4R et de

l’IL5. ....................................................................................................................................... 237

Figure 86. Le recrutement des éosinophiles et des neutrophiles est dépendant de l’IL-4R et de

l’IL-5. ..................................................................................................................................... 238

Figure 87. Synthèse des résultats et hypothèses mécanistiques. ............................................ 246

15

Liste et titre des tableaux

Tableau 1. Caractéristiques des filarioses humaines. ............................................................... 29

Tableau 2. Similarités entre TPE et asthme. ............................................................................ 38

Tableau 3. Filaires cardio-pulmonaires et pleurales. ................................................................ 47

Tableau 4. Comparaison entre M. perstans et L. sigmodontis. ................................................ 58

Tableau 5. Recommandations pour la distribution des traitements à grande échelle, les

traitements individuels et le contrôle des symptômes. ............................................................. 62

Tableau 6. Réponses cellulaires lors des différentes phases du programme de développment

de Litomosoides sigmodontis chez les rongeurs ....................................................................... 72

Tableau 7. Phénotype des macrophages pulmonaires. ............................................................. 92

Tableau 8. Protocole de coloration à l'Hémalun-Eosine. ....................................................... 108

Tableau 9. Protocole de la coloration au Trichrome de Masson. ........................................... 109

Tableau 10. Protocole de la coloration à l'acide périodique-Schiff. ....................................... 110

Tableau 11. Protocole de marquage de la protéine S100A9 .................................................. 113

Tableau 12. Protocole de marquage de la cytokératine 7 ....................................................... 114

Tableau 13. Protocole de marquage de la podoplanine .......................................................... 115

Tableau 14. Origine des anticorps utilisés pour l'immunofluorescence. ................................ 116

Tableau 15. Marquages utilisés en cytométrie en flux. .......................................................... 122

Tableau 16. Séquences des amorces utilisées pour les PCR quantitatives ............................. 129

Tableau 17. Cytokines testées. ............................................................................................... 156

16

Table des Annexes

Annexe 1. Liste des gènes pour l’étude des profils des transcrits pulmonaires à J4 et J70. .. 261 Annexe 2. Décollement des cellules mésothéliales de la plèvre viscérale. ............................ 263

17

Liste des abréviations

α-SMA : Alpha-Smooth Muscle Actin

γ-GT : γ-glutaryltranspeptidase

ADCC : Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity / Cytotoxicité cellulaire dépendante des

anticorps

ADN : Acide désoxyribonucléique

ADNc : ADN complémentaire

ALB : Albendazole

AM : Alveolar macrophage / Macrophage alvéolaire

ANOVA : Analyse Of Variance

APC : Allophycocyanine

APOC : African Programme for Onchocerciasis Control / Programme Africain pour le contrôle de

l'Onchocercose

Arg-1 : Arginine 1

ARN : Acide ribonucléique

ATP : Adénosine triphosphate

A.WOL : Consortium Anti-Wolbachia

BALT : Bronchus-associated lymphoid tissue / Tissus Lymphoïdes Associés aux Bronches

Bm : Brugia malayi

BSA :Bovine Serum Albumin / Albumine de sérum bovin

CCLX : C-C chemokine motif ligand X (CCL11 (Eotaxin-1), CCL5 (RANTES) , CCL3, CCL17 )

CCRX : C-C chemokine receptor type X (CCR2)

CD : Cluster of differentiation

CMHII : Complex majeur d’histocompatibilité de type II

ConA : Concanavaline A

COX-2 : Cyclo-oxygénase 2

CPA : Cellules présentatrices d'antigène

CT : Cycle Threshold / Cycle seuil

CTLA-4 : Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4

CXCLX : C-X-C chemokine motif ligand X (CXCL1 et CXCL2)

CXCRX : C-X-C chemokine receptor type X (CXCR4)

CX3CR1 : CX3C chemokine receptor 1

DAMP : Damage associated molecular pattern / Motifs moléculaires associés aux dommages

cellulaires

DC : Dendritic cell / Cellule dendritique

DEC : Déthylcarbamazine

DNDi : Drugs for Neglected Diseases initiative

DOX : Doxycycline

dsDNA : Double stranded DNA / ADN double brin

ECF : Extracellular fluid / Fluide extracellulaire

ECM : Extra-cellular matrice / Matrice extracellulaire

ECP : Eosinophil cationic protein / protéine cationique des éosinophiles

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay

EMT : Transition Epithélo-Mésenchymateuse

EPO : Peroxydase des Eosinophiles

FACS : Fluorescence-activated cell sorting

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC59708/

18

FALCs : Fat-associated lymphoid cluster / structures lymphoïdes associés aux graisses

Fc : Fragment crystallizable region

FC : Foldchange

FITC : Fluorescein isothiocyanate

FLBZ : Flubendazole

FSP-1 (S100A4): Fibroblast-specific protein 1

G: Granulome

GITR : Glucocorticoid induced TNFR-related protein

GPELF : Global Programme to Eliminate Lymphatic Filariasis / Programme mondial pour

l’élimination de la filariose lymphatique

HE : Hemalun-Eosine

HMDS : Héxaméthyldisylasane

HRP : Horse Raddish Peroxydase / Peroxydase de raifort

IFN-γ : Interferon-γ

Ig : Immunoglobuline (IgG, IgE IgG1, IgG4 IgM)

ILC : Cellules lymphoïdes innées (ILC2)

IL-X: Interleukine X (I IL-1β ; L-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-25, IL-33 IL-1β)

IL-1R1 : Interleukin 1 receptor, type I / Récepteur à IL-1 de type 1

IL-1Ra : Interleukin 1 receptor antagonist/ Antagoniste du récepteur à l'IL-1

IL-4Rα : Chaine alpha du récepteur à l'IL-4

IM : Interstitial macrophage / Macrophage interstitiel

iNOS : Oxyde nitrique synthase inductible

IPA : Ingenuity Pathway Analysis

IVM : Ivermectine

KO : Knock-Out

LBA : liquide de lavage bronchoalvéolaire

LPS : Lipopolysaccharide

LX : Stade larvaire X

MBP : Major Basic Protein / Protéine Basique Majeure

MCP-1 (CCL2) : Monocyte chemoattractant protein 1/ Protéine chimioattractive monocytaire 1

MDA : Mass Drug Administration / Administration médicale de masse

MDP : Muramyldipeptide

MEB : Microscopie électronique à balayage

Mf s: Microfilaires

Mfpos : Souris microfilarémique

Mfneg : Souris amicrofilarémique

MMP : Matrix metalloproteinase

MPO : Myelopéroxydase

MRP8 (S100A8) : Myeloid-related protein 8

MRP14 (S100A9) : Myeloid-related protein 14

NaCl : Chlorure de sodium

nd : Non décrit

NGS : Next-Generation Sequencing

NOD2 : Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2

OCP : Onchocerciasis Control Programme / Programme de lutte contre l'onchocercose

Pam3Cys : 3HCl, (S)-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2-RS)-propyl]-N-palmitoyl-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys4-

OH

OMS : Organisation mondiale de la santé

19

PAS : Acide périodique-Schiff

PBS : Phosphate-buffered saline / tampon phosphate salin

PCLS : Precision Cut Lung Slices

PD-1 : Programmed Death 1

PDPN : Podoplanine

PE : R-Phycoérythrine

PE-Cy5 : R-Phycoérythrine-Cyanine 5

PFA : Paraformaldéhyde

p.i. : post inoculation

PleCs : Cellules de l’exsudat pleural

PMA : Phorbol Myristate Acetate

PVS : PeriVascular Space / espace périvasculaire

RPMI : Roswell Park Mémorial Institute 1640

Siglec : Sialic acid-binding immunoglobulin-type lectin

SP-A : Surfactant protein A

SP-D : Surfactant protein D

ST2 : Récepteur à l'IL-33

SVF : Sérum de veau fœtal

Teff : Lymphocytes T effecteurs

TGF-β : Tumor Growth Factor β

Th1 : T helper cells type 1



TLR : récepteur Toll-Like (TLR-2, TLR-6, TLR-1)

TMB : 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine

TNF-α : Tumor necrosis factor α

TPE : Poumon éosinophile tropical

Treg : Lymphocytes T régulateurs

TSLP : Thymic stromal lymphopoietin

TX : Triton

VEGF : Vascular endothelial growth factor

WoLP : Wolbachia Lipopeptide

WSP : Protéine de surface de Wolbachia

20

Résumé

Les filaires sont des nématodes parasites transmis à des vertébrés par des arthropodes

hématophages. Les espèces filariennes qui s'installent dans les cavités cœlomiques, les

vaisseaux lymphatiques ou des tissus conjonctifs ont leur stades infestants (ou L3) qui migrent

via le système lymphatique après leur inoculation dans la peau. En utilisant le modèle murin

avec la filaire Litomosoides sigmodontis dont les adultes résident dans la cavité pleurale, deux

phases d'interaction des filaires avec les poumons des souris BALB/c sont décrites 1) lors de

la migration des L3 de la peau à la cavité pleurale ; 2) pendant la phase patente de l’infection

quand les adultes pondent des microfilaires dans la cavité pleurale.

Au cours de la phase précoce les L3 rejoignent le système sanguin pulmonaire puis

traversent les poumons pour entrer dans la cavité pleurale. Ce passage se traduit par des

processus inflammatoires transitoires : tout d'abord des hémorragies consécutives à la rupture

des capillaires pulmonaires, accompagnées d'une augmentation du nombre de neutrophiles

pulmonaires et de la libération transitoire d'IL-1β et des alarmines IL-33 et S100A9 dans la

cavité pleurale. Le S100A9 semble faciliter la survie des filaires, probablement en facilitant la

migration rapide des L3 lors du démarrage de la phase contre-inflammatoire initiée dans le

poumon. En témoigne le recrutement de macrophages et d'éosinophiles, la production d'IL-4,

de CCL2 et d'IL9, ainsi que l’atténuation/extinction de l’expression de molécules pro-

inflammatoires. La formation de granulomes est également observée dans le tissu pulmonaire.

Lors de la phase patente de l'infestation, la descendance transmissible

(Microfilaires/Mf) est générée uniquement chez 60% des souris BALB/c -souris Mf pos -. Une

telle observation a permis de comparer les cavités pleurales et les poumons de souris Mfpos et

Mfneg. Chez les souris Mfpos des processus inflammatoires prolongés au niveau de la plèvre -

dont témoigne une fibrose de la plèvre viscérale- sont couplés au niveau du poumon et des

bronches respectivement à une accumulation périvasculaire de macrophages et une

inflammation bronchoalvéolaire (en témoigne la productionon de mucus par les cellules

caliciformes et une éosinophilie). Le contrôle de la charge parasitaire (adultes et

microfilaires), mais aussi la mise en place de la pathologie sont dépendantes de l'IL-5 et des

axes de signalisation dépendants de l'IL-4R.

21

Abstract

Filariae are parasitic nematodes transmited to vertebrates by haematophagous

arthropods. The filarial species that settle in the coelomic cavities, the lymphatic vessels or

the connective tissues have their infectious stages (or L3) which migrate via the lymphatic

system after their inoculation into the skin. Using the murine model with the

filaria Litomosoides sigmodontis, whose adults reside in the pleural cavity, two phases

of interaction between filariae and the lung of BALB/c mice are described 1) during the L3

migration from the skin to the pleural cavity; 2) during the patent phase of infection, when

adults realease microfilariae in the pleural cavity.

During the 1st phase L3 join the pulmonary blood system and then cross through the

lungs to enter the pleural cavity. This passage induces a transient acute pathology: first

haemorrhages following the rupture of the pulmonary capillaries, together with an increase in

the number of pulmonary neutrophils and the transient release of IL-1β and the alarmins IL-

33 and S100A9 in the pleural cavity. S100A9 appears to facilitate the survival of the filariae

either by an anti-inflammatory effect or by facilitating the migration of L3. Neutrophils can

release NETs in response to L3. Within days following the infection, a regulatory response

takes place in the lungs, with recruitment of macrophages and eosinophils, production of IL-4,

CCL2 and IL-9, and downregulation of inflammatory molecules. The formation of

granulomas is also observed in pulmonary tissue. The passage of L3 also induces an

inflammation of pulmonary blood vessels, in C57BL/6 mice only.

During the patent phase of the infection, 40% of the mice do not develop blood

microfilaraemia. Comparison of responses of microfilaremic and amicrofilaremic mice shows

an exacerbation of pleural inflammation induced by microfilariae. In addition, microfilaremic

mice develop microfilaria-dependent pulmonary pathology consisting on fibrosis of the

visceral pleura, perivascular accumulation of macrophages and bronchoalveolar inflammation

(mucus production and eosinophilia). The control of the filariae (adults and microfilariae), but

also the establishment of the pathology are dependent on IL-5 and IL-4R.

23

INTRODUCTION

24

Figure 1. Diversité des filaires.

Chaque portion du cercle correspond à une sous-famille. Le premier chiffre représente le

nombre d'espèces de la sous-famille et le deuxième chiffre entre parenthèses indique le

nombre de genres. D'après [1].

Figure 2. Phylogénie des filaires basée sur une analyse multigénique.

Soixante spécimens de filaires (représentant 48 espèces) ont été analysés. Filaria latala et

Protospirura muricola ont été utilisées comme groupes externes. Les séquences de coxI, rbp1,

hsp70, myoHC et des ADN ribosomiques 12S, 18S et 28S ont été analysées en utilisant

l'inférence bayésienne. Les résultats supportent l'existence de cinq clades appelés ONC1 à

ONC5. Les sous-familles sont indiquées par couleur : bleu pour les Onchocercinae, vert foncé

pour les Dirofilariinae, pourpre pour les Splendidofilariinae, vert pâle pour les Setariinae,

jaune pour les Waltonellinae, orange pour les Icosiellinae et rouge pour les Oswaldofilariinae.

Issu de [2].

25

1. Filaires

1.1 Diversité des filaires

La famille des Onchocercidae regroupe des nématodes parasites plus communément

appelés filaires. Ces parasites présentent un large spectre d'hôtes : ils peuvent infester aussi

bien des squamates, des crocodiliens, des amphibiens, des oiseaux et des mammifères -y

compris l'homme [3,4]. Environ 600 espèces de filaires sont actuellement décrites [1,4] et Figure

1). L'adaptation des filaires au mode de vie parasite a conduit à une régression de la

morphologie, rendant difficile l'étude phylogénétique. Les filaires sont actuellement réparties

en 8 sous-familles incluant 87 genres [1,4,5]. Une phylogénie récente basée sur une analyse

multigénique [2] suggère l'existence de 5 clades monophylétiques et remet en cause la

délimitation de certaines de ces sous-familles (Figure 2).

1.2 Biologie

Comme tous les nématodes, les filaires adultes sont des vers ronds, longs (jusqu’à

plusieurs dizaines de centimètres pour certaines onchocerques), à corps non segmenté,

composés d'un hypoderme et d'une couche de muscles longitudinaux organisés en quadrants

recouverts par une cuticule [6]. Leur système digestif est composé d'une capsule buccale

antérieure, d'un œsophage divisé en une partie musculaire et une glandulaire, d'un intestin et

d'un rectum postérieur. Leur système nerveux est composé d'un anneau nerveux péri-

œsophagien associé à des ganglions et des cordons nerveux [6,7]. Les nerfs rejoignent des

récepteurs tactiles appelés papilles (céphaliques ou caudales) ou des chémorécepteurs

nommés amphides et phasmides. De plus, les filaires ont un système d'excrétion et

d'osmorégulation. Un dimorphisme sexuel de taille est plus ou moins marqué en fonction de

l'espèce, avec des femelles plus longues que les mâles. Le système reproducteur des femelles

est composé de deux ovaires reliés par un oviducte à un utérus bifurqué terminé en vagin

conduisant à une vulve antérieure. Le système reproducteur des mâles est constitué d'un

testicule relié à une vésicule séminale conduisant à un canal déférent s'ouvrant sur un orifice

génital fusionné avec l'anus appelé cloaque. L'appareil copulatoire des mâles est composé de

deux spicules [7].

26

Figure 3. Cycle de vie des filaires et diversité d'hôte et de localisation.

Les stades infestants filariens (L3) sont transmis d'un vecteur arthropode hématophage à un

hôte vertébré au cours d'un repas sanguin. Au sein de l'hôte les L3 effectuent 2 mues (Mues 3

et 4) pour atteindre le stade adulte. Les L3 migrent à travers le système lymphatique pour

rejoindre leur localisation, suivant l'espèce considérée : les tissus cutanés et sous-cutanés, le

système lymphatique, les cavités sériques, le système cardio-pulmonaire ou les tissus

conjonctifs. Les adultes mâles et femelles se reproduisent et les femelles produisent des

microfilaires (stade L1) qui vont rejoindre le sang ou les tissus sous-cutanés, suivant l'espèce

considérée, où elles sont accessibles aux vecteurs. Au sein du vecteur, deux mues (mues 1 et

2) permettent d'atteindre le stade infestant.

27

1.3 Programme de développement

Les filaires ont un cycle de vie dixène caractérisé par 5 stades incluant 4 stades

larvaires (L1, L2, L3, L4) suivis d'un stade adulte (mâles et femelles) (Figure 3). Le premier

stade larvaire (L1) est aussi appelé microfilaire (Mf). Dans les filaires femelles adultes, les

œufs présentent une fine membrane appelée gaine. Chez certaines filaires, les Mfs éclosent in

utero (Mfs nues) alors que d'autres conservent la membrane de l'œuf (Mfs gainées) [4]. Les

Mfs sont expulsées par les femelles et migrent, suivant les espèces filariennes, dans le sang ou

la peau de leur hôte ; elles peuvent alors passer dans un arthropode hématophage au moment

du repas sanguin de celui-ci [3,4]. Les vecteurs des filaires peuvent être des poux, des puces,

des diptères (moustiques, simulies, ceratopogonidés, tabanidés) mais aussi des tiques et autres

acariens [3,4] selon l’espèce filarienne considérée. Les microfilaires se retrouvent dans

l'estomac du vecteur après le repas sanguin et doivent traverser l'épithélium de ce dernier pour

poursuivre leur développement [8].

Le développement larvaire se poursuit dans le vecteur avec deux mues successives

amenant au troisième stade, le stade infestant (L3). Ce développement s'effectue, selon

l'espèce filarienne considérée, dans différents sites préférentiels : les tissus graisseux, les

muscles, l'hémocèle ou encore les tubes de Malpighi [4]. Les larves qui atteignent

l'hémolymphe vont ensuite migrer vers la tête de l'arthropode et les pièces buccales, les

glandes salivaires ou l'hémocèle [4,9]. La croissance de la filaire se poursuit lorsque

l'arthropode infecté transfère les L3 dans un nouvel hôte vertébré au cours d'un repas sanguin.

La localisation des filaires adultes est variable selon l’espèce considérée : certaines

espèces s'installent dans les tissus cutanés et sous-cutanés, mais d’autres résident dans le

système lymphatique, les cavités sériques, le système cardio-pulmonaire ou les tissus

conjonctifs [4]. Malgré cette diversité dans la localisation finale, un comportement identique

semble avoir été sélectionné chez les filaires : les L3 survivent en entrant dans un vaisseau

lymphatique de la peau et ils migrent à travers l'hôte en utilisant ce système vasculaire [3,10,11].

Au sein de l'hôte vertébré, le développement des L3 continue avec deux mues

supplémentaires permettant d'atteindre les stades adultes mâles et femelles [4].

28

1.4 Wolbachia

Wolbachia est une α-proteobacterie intracellulaire Gram-négative de l'ordre des

Rickettsiales. Elle est présente chez les arthropodes mais on la trouve aussi chez les filaires.

Sur les 85 espèces de filaires étudiées à ce jour, 52.9% sont infestées par une souche de

Wolbachia [12]. En l'absence de description formelle d'espèces, les différentes souches de

Wolbachia ont été classées en supergroupes représentant les subdivisions phylogénétiques

majeures [13]. Plus de 10 supergroupes de Wolbachia infectent exclusivement les arthropodes,

3 supergroupes infectent spécifiquement les filaires (groupes C, D et J) et un groupe infecte

les deux (groupe F) [12].

Au sein des filaires, Wolbachia a été identifiée principalement dans l'appareil

reproducteur des femelles et dans les chordes latérales de l'hypoderme. [12,14,15]. La densité en

Wolbachia varie en fonction des tissus colonisés et du stade de développement de la filaire.

Du stade microfilaire au stade infestant, la quantité de Wolbachia est faible et est restreinte à

quelques cellules des chordes latérales [15]. La quantité de Wolbachia augmente dans les

chordes latérales des larves de stade 4 et des jeunes adultes. Dans les femelles fécondées,

Wolbachia migre des chordes latérales vers les ovaires et les embryons [15,16]. La présence de

la bactérie dans les gonades des filaires femelles est liée à sa transmission verticale, de la

femelle à sa descendance.

Seules les espèces de Wolbachia appartenant aux supergroupes C et J semblent

présenter une coévolution stricte avec leur hôte [12]. Les clades filariens hébergeant les

supergroupes D et F présentent de nombreux cas de pertes secondaires et de transferts

horizontaux de la bactérie [12]. Lorsque la bactérie est présente, la symbiose entre Wolbachia

et les Onchocercidae est considérée comme mutualiste, car les deux partenaires bénéficient de

l'association [17]. Wolbachia est nécessaire à la survie et la fertilité des filaires [18]. En effet,

des traitements antibiotiques sur diverses espèces de filaires ont démontré que l'élimination de

Wolbachia est associée à une apoptose des cellules germinales adultes et des cellules

somatiques des embryons [19] ainsi qu'à une perte de la polarité antéropostérieure des

embryons [20]

.

29

2. Filarioses humaines

Parmi les 600 espèces de filaires décrites, 8 infectent les humains et ont des

localisations tissulaires distinctes. Wuchereria bancrofti (Cobbold, 1887), Brugia malayi

(Brug, 1927) et B. timori (Partono et al. 1977) s'installent dans la circulation lymphatique et

causent la filariose lymphatique. Onchocerca volvulus (Leuckart, 1893), Loa loa (Cobbold,

1894), Mansonella streptocerca (Macfie & Corson, 1922) et M. ozzardi (Manson, 1897) sont

retrouvés dans les tissus cutanés et sous-cutanés. Enfin, M. perstans (Manson, 1891) s’installe

dans les cavités sériques (cavités péritonéale pleurale, et péricardique). Toutes les filaires

humaines à l'exception de Loa loa abritent Wolbachia (tableau 1).

Tableau 1. Caractéristiques des filarioses humaines.

La 1ère colonne indique les espèces de filaires, la 2nde leur vecteurs. La troisième colonne

indique la localisation des parasites adultes et les 4ème et 5ème leur taille. Les colonnes 6 à 9

concernent les microfilaires (Mfs) : localisation des larves, présence ou non d'une gaine, taille

et périodicité. Enfin la 10ème colonne indique le supergroupe de Wolbachia hébergé par les

filaires et la dernière les pathologies principales induites par ces filaires.

Mfs : microfilaires. ? : information non connue. D'après [17,21,22].

30

A

B

Figure 4. Répartition des filarioses humaines.

A. Régions endémiques pour les filarioses lymphatiques, l'onchocercose et la loase.

D'après les cartes de l'OMS (2016) et [23].

B. Régions endémiques pour les mansonelloses à Mansonella perstans et M. ozzardi.

D'après [22,24].

31

2.1 Epidémiologie et coendémicité

Si des filaires animales sont présentes sur tout le globe, les filarioses humaines sont

restreintes aux régions tropicales et subtropicales. Dans certaines régions d'Afrique, la

filariose lymphatique, l'onchocercose, la mansonellose à M. perstans et/ou la loase sont co-

endémique et certains patients peuvent présenter des multi-infections. De même, en Amérique

latine, on peut retrouver des zones co-endémiques pour M. perstans et M. ozzardi, la filariose

lymphatique et/ou l'onchocercose (Figure 4). Ces coïnfections sont importantes à connaître

car elles peuvent entrainer des erreurs d'identification des parasites, soit parce qu’une espèce

est minoritaire et non identifiée, soit par réaction croisée des kits de détection. Le problème

majeur provient des coïnfections avec L. loa qui peut entraîner de graves complications lors

des traitements.

En 2014, la filariose lymphatique était endémique dans 73 pays tropicaux et

subtropicaux d'Asie, d'Afrique, d'Amérique centrale et du Sud et du Pacifique [25,26]. Environ 1

milliard de personnes vivent en zone d'endémie et les 68 millions de cas avérés de filariose

lymphatique comprennent 36 millions de personnes présentant des symptômes tels qu'un

hydrocèle ou un lymphoedème secondaire [26].

Onchocerca volvulus est endémique dans 31 pays d'Afrique et infecte environ 15,5

millions de personnes [27,28]. 99% des personnes infestées vivent en Afrique sub-saharienne,

mais il existe encore quelques foyers en Amérique Latine (à la frontière Brésil-Venezuela) et

au Yémen [29]. Il a été estimé que 187 millions de personnes vivent dans des zones où le

parasite peut être transmis dont 500 000 en Amérique Latine [27,30]. 26 pays en Afrique

présentent une coendémicité pour la filariose lymphatique et l'onchocercose [26].

Les infections par Loa loa sont restreintes aux forêts tropicales d'Afrique de l'Ouest et

du Centre ou elles représentent au moins 10 millions de cas [23,31-33]. Dans ces zones, de

nombreux cas de co-infection avec O. volvulus, W. bancrofti et/ou M. perstans sont décrits

[22,31,34,35].

32

Les mansonelloses sont relativement asymptomatiques et leur prévalence est, de ce

fait, méconnue [22,24]. Cependant la forte incidence des coinfections avec M. perstans ou M.

ozzardi, et la présence d’une Wolbachia du supergroupe F dans ces mansonelles [12,36,37] sont à

l’origine d’un regain d’intérêt pour ces filaires [22,24,38,39].

Les infections par Mansonella ozzardi sont localisées exclusivement en Amérique

Latine, du Mexique au Nord de l'Argentine et dans les Caraïbes. Suivant les régions, la

prévalence varie entre 0 et 50% de la population qui est infestée rendant difficile l'estimation

du nombre total de personnes infestées [24]. Au Brésil, M. ozzardi est retrouvée dans des

régions d'Amazonie où est présente O. volvulus et induit régulièrement des erreurs

d'identifications bien que les microfilaires soient morphologiquement très différentes ([4] et

Tableau 1).

M. perstans est largement distribuée en Afrique et présente aussi des cas en Amérique

latine. Au total, 33 pays d'Afrique subsaharienne semblent être endémiques pour la

transmission avec un total d'environ 580 millions d'habitants à risque (Banque mondiale,

2008). Simonsen [22] estime que 114 millions de personnes pourraient être infestées par M.

perstans en Afrique ce qui en ferait un des parasites les plus prévalent en Afrique. Au

Cameroun, la prévalence de M. perstans est hétérogène : les zones forestières humides

présentent une prévalence et une intensité de l'infection élevées, la prévalence pouvant

atteindre 70% de la population ; en revanche, la prévalence est faible dans les zones de savane

[40]. Au Ghana, plus de 30% de la population pourrait être infestée [41].

33

2.2 Programme de développement et biologie

2.2.1 Les filaires lymphatiques : Wuchereria bancrofti, Brugia malayi et

B. timori

La filaire W. bancrofti est responsable de 90% des cas connus de filariose lymphatique

et B. malayi est à l'origine de la plupart des cas restants (OMS et [18]). Les filaires sont

transmises par des moustiques des genres Culex, Anopheles, Mansonia et Aedes lors d'un

repas sanguin [42].

Après la piqure, les larves s'installent, muent et se reproduisent dans le système

lymphatique. Les adultes de Wuchereria bancrofti se retrouvent généralement dans les

vaisseaux lymphatiques ou les sinus des ganglions lymphatiques des membres inférieurs chez

les patients et aussi dans les vaisseaux lymphatiques du scrotum chez les hommes [4,43].

Brugia malayi s'installe préférentiellement dans le système lymphatique de l'aine et des

aisselles [44]. Les adultes peuvent survivre de 5 à 8 ans dans leur hôte [18].

Les microfilaires sont pondues dans les vaisseaux lymphatiques et migrent dans le

sang. Chez des singes Semnopithèques (Presbytis melalophos et Trachypithecus cristatus)

infestés avec des larves infestantes de W. bancrofti, la phase pré-patente dure 200-280 jours

[45-47]. Les microfilaires de W. bancrofti et B. malayi ont une grande gaine dépassant des deux

extrémités de la microfilaire [4] et mesurent entre 250 et 300µm de long. La partie postérieure

des Mfs de B. malayi présente un noyau qui est absent chez W. bancrofti [4]. Les Mfs

présentent également une périodicité circadienne qui a été associée au mode de vie du vecteur

[48]. Les microfilaires se réfugient dans les capillaires pulmonaires pendant la journée et sont

retrouvées dans le sang périphérique la nuit où elles sont accessibles au vecteur [49]. La

périodicité serait contrôlée par les différences de concentrations en oxygène dans le sang entre

les périodes de veille et de sommeil jouant sur la dilatation des capillaires sanguins [4,50]. Une

étude in vitro a montré que les Mfs de B. malayi peuvent adhérer aux cellules endothéliales

[50]. L'adhérence implique la gaine de la microfilaire et nécessite un environnement riche en

oxygène ainsi qu'un flux élevé, comme ceux trouvés dans l'hôte pendant la journée [50].

34

2.2.2 Onchocerca volvulus

Les vecteurs de O. volvulus sont des mouches hématophages faisant partie du

complexe Simulium damnosum. Ce complexe est composé d'espèces génétiquement

différentes, mais qui ont une morphologie identique [51]. 63 espèces ont été définies sur la base

de leurs variations chromosomiques [30]. Le vecteur nécessite des cours d'eau pour se

reproduire et par conséquent l'infection se produit à proximité des rivières.

Le vecteur effectue une morsure superficielle en dilacérant la peau et les capillaires

sanguins avec ses maxillaires et ses mandibules. Les L3 pénètrent dans la peau par la plaie

due à cette morsure. Les filaires femelles adultes restent dans le tissu sous-cutané et des

nodules cellulaires se forment autour d'elles, les onchocercomes. Les femelles adultes peuvent

vivre plus de 10 ans au sein de ces nodules onchocerquiens [52]. Les femelles s'accouplent et

sont fécondées par les mâles. Les microfilaires sont gainées et mesurent environ 300µm. Elles

sont pondues dans le nodule où elles sont retrouvées en grandes quantités [53]. Des vaisseaux

sanguins et lymphatiques irriguent le nodule [53]. Aucune microfilaire n'est retrouvée dans les

vaisseaux sanguins et quelques microfilaires sont retrouvées dans les vaisseaux lymphatiques

[53], suggérant qu'elles pourraient les utiliser pour rejoindre le derme où elles sont accessibles

aux simulies [53-55]. Dans le derme, les microfilaires ne sont pas observées dans les vaisseaux

lymphatiques même si ces derniers sont anormalement dilatés [53]. Les microfilaires peuvent

se retrouver dans les tissus sous-conjonctivaux de l'œil [56,57].

2.2.3 Loa loa

Les humains sont le seul hôte connu de Loa loa. Les mouches du genre Chrysops

(majoritairement C. silace et C. dimidiate) sont les vecteurs de la loase [4]. Ces mouches

vivent dans les forêts d'Afrique équatoriale et effectuent leur repas sanguin pendant la

journée.

Après infection, les filaires pénètrent dans les tissus sous cutanés et maturent

rapidement. Chez la gerbille, le stade adulte est atteint en 25 jours [58]. Ils migrent à travers les

tissus sous-cutanés pendant toute leur durée de vie (jusqu'à 17 ans) [59]. Les infections

expérimentales chez les primates non humains ont montré que la période pré-patente est

d'environ 140 jours [60]. Les microfilaires sont retrouvées dans la circulation sanguine. Les

microfilaires mesurent environ 290µm par 7.5µm et présentent une gaine et ont 3 noyaux

35

caractéristiques dans la région terminale [4]. De plus, comme W. bancrofti, les Mfs de L. loa

affichent une périodicité, mais celle-ci est inversée. Les microfilaires sont présentes dans le

sang périphérique pendant la journée et résident probablement dans le tissu pulmonaire

pendant la nuit bien que cela n'ait pas été formellement démontré [61,62]. Ces caractéristiques

aident à différencier les microfilaires sanguines de L. loa de celles de W. bancrofti et de

Mansonella perstans dont la distribution géographique chevauche celle de L. loa (Tableau 1).

2.2.4 Les mansonelles

Les trois espèces de mansonelles infectant les humains, Mansonella perstans

(synonymes : Dipetalonema perstans, Tetrapetalonemaperstans, Acanthocheilonema

perstans), M. ozzardi et M. streptocerca (synonymes : Dipetalonema streptocerca,

Tetrapetalonema streptocerca), varient par leur distribution, leur spécificité vectorielle et leur

site. Toutefois bien que les humains soient l'hôte principal, des infections ont été décrites chez

d'autres primates et M. ozzardi a aussi été trouvé chez des oiseaux et des amphibiens [22,63,64].

Le cycle de vie des mansonelles est mal connu. M. streptocerca est spécifiquement

transmis par la mouche Culicoides grahamii [65] mais plusieurs espèces de Culicoides peuvent

transmettre les larves de M. perstans et M. ozzardi [66]. Les adultes de M. ozzardi ont

initialement été décrits dans la cavité abdominale et dans les mésentères [4] mais leur

localisation exacte est toujours incertaine car l'inoculation de larves de M. ozzardi dans des

primates induit un développement sous-cutané du parasite [67]. Concernant M. streptocerca,

les adultes résident dans le derme de la peau. Les adultes de M. perstans sont rarement

observés, mais ils ont été occasionnellement récupérés dans les cavités sériques (péritoine,

plèvre, péricarde) lors de chirurgies ou d'autopsies [22].

Les microfilaires des trois espèces sont dépourvues de gaine. Les Mfs mesurent

environ 190-200µm de long par 4-5µm de diamètre. Les Mfs vivantes ont de fortes capacités

de contraction et d'élongation ce qui fait que les tailles décrites varient beaucoup [22,68]. Les

Mfs de M. streptocerca sont cutanées alors que celles de M. ozzardi et M. perstans sont

sanguines [69].

36

2.3 Principales manifestations cliniques

La plupart des infections filariennes chez les vertébrés non humains sont considérées

comme étant généralement asymptomatiques. Les signes cliniques n'apparaissent pas avant

que les parasites n’aient atteint le stade adulte et ils dépendent des espèces ainsi que de la

localisation des adultes et des microfilaires [17].

Les pathologies associées à W. bancrofti, B. malayi, O. volvulus et L. loa sont décrites

ci-après :

2.3.1 Filarioses lymphatiques

Les symptômes des filarioses lymphatiques sont majoritairement dus à la présence des

parasites adultes dans les vaisseaux lymphatiques. Certains patients présentent une filariose

dite "occulte" avec des adultes mais pas de microfilaires sanguines. Cependant chez ces

patients, des microfilaires sont parfois retrouvées dans les tissus où elles induisent des

symptômes cliniques.

Symptômes associés aux adultes

Après leur installation dans le circuit lymphatique, les parasites adultes induisent une

dilatation des vaisseaux lymphatiques, une baisse de la contraction des muscles des

lymphatiques et une perte de la fonction des valves lymphatiques [43,70,71]. Au fur et à mesure

que la filariose progresse et que les parasites meurent, une insuffisance lymphatique

chronique se met en place, caractérisée par un ralentissement du flux lymphatique. Les

symptômes se produisent le long d'un continuum allant de la dilatation lymphatique

asymptomatique (environ 2/3 des patients) aux hydrocèles et aux lymphoedèmes secondaires

(les lymphoedèmes primaires provenant de facteurs congénitaux) pouvant progresser vers

l'éléphantiasis [43,72].

Les fonctions principales du système lymphatique sont l'élimination des molécules de

haut poids moléculaire des espaces interstitiels et le transport des antigènes et des cellules

immunitaires vers les ganglions lymphatiques. L'insuffisance lymphatique induit donc la

rétention de protéines et l'augmentation du risque d'infections [73]. Le lymphoedème

secondaire se forme suite à l'accumulation des protéines, qui augmente la pression oncotique,

entraînant la formation d'un œdème riche en protéines qui stimule les fibroblastes. Ceux-ci

sont à l'origine d'une fibrose cutanée hyperplasique avec un épaississement du derme et une

37

accumulation de lobules graisseux dans l'hypoderme. Les infections bactériennes et fongiques

sont une complication fréquente des lymphoedèmes filariens (Figure 5). Ceci conduit à

l'éléphantiasis, un lympœdème irréversible même après la mort des parasites adultes 1995 [74].

L'hydrocèle est l'autre forme courante des infections par W. bancrofti chez des patients

masculins. Elle consiste en l'accumulation de fluide entre les deux couches de la tunique

vaginale dans le scrotum. Dans ce cas, l'élargissement des vaisseaux lymphatiques et leur

obstruction ultérieure conduisent à la pathologie indépendamment des infections bactériennes

[73,75]. Ces symptômes sont associés à la présence de parasites adultes dans les vaisseaux

lymphatiques du scrotum [76,77].

Figure 5. Evolution du lymphoedème filarien.

Les parasites adultes entrainent une dilatation lymphatique conduisant à des lymphoedèmes.

De nombreux facteurs participent à la pathogénèse et aggravent la pathologie comme la mort

des parasites, l'inflammation chronique et les infections secondaires. Différents stades

permettent de caractériser le lymphoedème : Stade 2 : gonflement non réversible pendant la

nuit; Stade 3 : plis superficiels de la peau à la cheville. Stade 4 : altération de la texture de la

peau et formation de boutons. Stade 5: plis profonds de la peau en plus des altérations de la

phase 4; Stade 6 : lichénification généralisée en plus des altérations de la phase 5. Étape 7:

incapacité du patient à effectuer un travail quotidien. D'après Dreyer et al. 2000 [70].

38

Symptôme TPE Asthme

Obstruction bronchique/mucus + +

Eosinophilie sanguine + +

Eosinophilie bronchoalvéolaire + +

Infiltrats pulmonaires d'éosinophiles + +

Infiltrats pulmonaires de mastocytes ? +

IgE et IgG circulants + +

Fibrose du tissu pulmonaire + +

Tableau 2. Similarités entre TPE et asthme.

Comparaison des symptômes (1ère colonne) observés lors du TPE (2ème colonne) et de l'asthme

(3ème colonne). + : symptôme observé. ? : information non connue. D'après [78-80] .

Figure 6. Histopathologie du « poumon eosinophile tropical ».

(A) Microfilaire (flèche) dans le parenchyme pulmonaire avec infiltrats de macrophages ; (B)

Infiltrats péribronchiques d'éosinophiles ; B : Bronche ; C. Fibrose pulmonaire : zone claire

avec forte concentration de fibres. Images issues de [78].

39

Symptômes associés aux Mfs :

Le poumon éosinophile tropical (TPE) est le principal symptôme des filarioses

occultes. Il est dû à une hyperréactivité immunitaire qui se développe chez certains individus

infectés par W. bancrofti et B. malayi [77].

Les symptômes sont proches de ceux de l'asthme avec des toux récurrentes et des

difficultés respiratoires (voir tableau 2). Ces patients ne présentent en général pas de

microfilaires circulantes mais des microfilaires ont été observées dans des biopsies

pulmonaires de patients TPE (Figure 6A), suggérant que les Mfs seraient piégées dans la

microcirculation pulmonaire [78,81]. Très peu d'études ont été effectuées pour comprendre les

mécanismes du TPE. La dégradation des microfilaires dans les capillaires pulmonaires

libèrerait des constituants antigéniques qui déclencheraient la réponse immunitaire observée,

caractérisée par une éosinophilie très élevée et des forts niveaux d'IgE et d'IgG sanguins et

alvéolaires spécifiques aux filaires [79,80]. Les patients présentent de plus une forte

concentration d'éosinophiles dans les alvéoles pulmonaires [80]. Ces réponses sont associées à

un défaut de ventilation avec obstruction des voies aériennes [80]. Les études de biopsies

pulmonaires ont mis en évidence des réactions histopathologiques constituées d'infiltrats

d'éosinophiles et/ou de macrophages dans les espaces interstitiels, péribronchiaux et

périvasculaires des poumons associés parfois à une fibrose interstitielle marquée [78] (Figure

6).

Des modèles de souris sensibilisées par des injections répétées d'antigènes ou de

microfilaires mortes de B. malayi développent les symptômes du TPE [82,83]. Chez ces souris,

le recrutement des éosinophiles est corrélé au développement de l'hypersensibilité aérienne et

de grandes quantités de MBP (Major Basic Protein, un constituant principal des granules

éosinophiles) sont retrouvées dans le liquide bronchoalvéolaire [83] et sur les cellules

épithéliales bronchiques [84]. De plus, l'expression de nombreux gènes anti-apoptotiques est

augmentée dans les éosinophiles entraînant une survie accrue de ces cellules [82]. Les souris

déficientes en IL-5 ne présentent pas d'infiltrats d’éosinophiles ni de symptômes asthmatiques

[83] indiquant un rôle prépondérant des éosinophiles et de leurs granules dans l'instauration de

la pathologie observée lors du TPE. Enfin, les macrophages alvéolaires prennent un

phénotype alternativement activé avec une hausse de l'expression de marqueurs spécifiques

tels que l'arginase 1 (Arg-1), Ym-1 et Relm-α [82] et pourraient participer à la pathologie. En

40

effet, les souris déficientes en IL-4, molécule importante dans polarisation des macrophages,

présentent des atteintes pulmonaires réduites [85].

D'autres études suggèrent une origine auto-immune de la maladie. Un antigène de B.

malayi, Bm23-25, a été identifié chez des patients atteints de TPE. Cette molécule est

majoritairement produite par les microfilaires et induit une production d’IgE après stimulation

de cellules sanguines de patients filariens TPE ou non [86]. Le sérum et le liquide

bronchoalvéolaire des patients TPE contiennent des IgE reconnaissant Bm23-25. Cet antigène

filarien est un homologue d'une sous-unité d'une enzyme humaine, la γ-glutaryl transpeptidase

(γ-GT) [87]. Les γ-GT de mammifères sont des enzymes transmembranaires présentes en

grande quantité sur la face apicale des cellules épithéliales, dont les cellules épithéliales

pulmonaires. Du fait de ce mimétisme moléculaire, les IgE antiᵧ-GT filarienne peuvent aussi

reconnaitre la γ-GT humaine présente sur les épithéliums pulmonaires et pourraient induire

une rupture de tolérance immunitaire [88]. Les niveaux d'IgE spécifiques pour le Bm23-25 sont

associés avec la pathologie pulmonaire chez les patients filariens ; les patients TPE présentent

des niveaux d'IgE spécifiques pour Bm23-25 environ 50 fois plus élevés que les autres

patients filariens [89]. Le mécanisme entraînant la pathologie n'a pas été étudié mais il est

probable que la sensibilisation des mastocytes par des IgE spécifiques pour la protéine

humaine entraîne leur activation et la dégranulation de protéines cytotoxiques. Des

mécanismes de cytotoxicité dépendante des anticorps (ADCC) pourraient aussi mettre en jeu

les éosinophiles et leurs granules cytotoxiques.

41

2.3.2 Onchocercose

Les manifestations cliniques de l'infection par O. volvulus sont liées à la réponse

immunitaire induite par la mort de microfilaires dans la peau et les yeux et très peu à la

présence des parasites adultes. Environ 30% des personnes infestées ne présentent pas de

signes cliniques d'infection.


La genèse des onchocercomes semble induite par les filaires femelles puisqu'on ne

retrouve jamais de nodule contenant un mâle seul [90]. Ils se trouvent dans des tissus

intramusculaires sous-cutanés ou plus profonds entourés d'un noyau fibreux qui contient des

vaisseaux sanguins et des vaisseaux lymphatiques néoformés [53]. Les vaisseaux sanguins

permettraient de faciliter l’arrivée de cellules immunitaires mais aussi de fournir des

nutriments aux vers [91-93]. Les filaires adultes dans les nodules contribuent peu à la

pathogenèse en dehors du fait qu'ils peuvent être douloureux et gênants [94]. Les microfilaires

sont libérées par les filaires femelles dans le nodule d'où elles peuvent migrer sur de longues

distances dans le corps de leur hôte [95,96].

Symptômes associés aux Mfs

La pathologie est essentiellement dermatologique. Il a été estimé que chez une

personne fortement infestée, plus de 100 000 microfilaires peuvent mourir chaque jour dans la

peau [97,98]. La pathologie de l'onchocercose est principalement une conséquence de réponses

inflammatoires chroniques de type Th2 [99,100]. La réponse cutanée aux Mfs présente un large

éventail clinique suivant la résistance/susceptibilité de l'hôte. Les patients présentant une forte

microfiladermie développent généralement une faible inflammation de la peau et de

nombreux marqueurs anti-inflammatoires comme l'interleukine (IL)-10 et le TGF-β (Tumor

Growth Factor β) [101-103]. Les patients infectés chroniquement peuvent présenter une perte

d'élasticité de la peau, probablement due à des protéases issues du parasite ou de l'hôte [104],

[105], ainsi qu'une dépigmentation de la peau (peau de léopard) [100]. De rares cas de réponses

hyper-réactives existent et sont appelées sowda, qui dérive du mot aswad, signifiant "de

couleur noire" en arabe [94].

42

Figure 7. Hypothèse mécanistique sur la pathogénèse des atteintes oculaires.

(1) Wolbachia est libérée des microfilaires mourantes dans le tissu sous-conjonctif et (2)

active les cellules résidentes : fibroblastes, cellules dendritiques et macrophages (3). Ces

cellules produisent des chimiokines CXCL2 et CXCL1.(4) CXCL1 induit un recrutement de

neutrophiles CXCR1 et CXCR2-dépendant, et les neutrophiles sont activés par Wolbachia

grâce aux TLR2 et 6 (5). Les neutrophiles produisent des chimiokines supplémentaires,

principalement CXCL2, induisant une migration supplémentaire des neutrophiles (6). Les

neutrophiles dégradent la matrice cornéenne, provoquant une opacification de la cornée et une

déficience visuelle. Repris de [57].

43

Ces réactions sont associées à une grave pathologie cutanée. Chez ces patients le

nombre de microfilaires dermiques est très faible et des infiltrats cellulaires massifs sont

observés dans les onchocercomes qui ne contiennent que peu de parasites [99]. Les quelques

microfilaires vivantes ou mortes se retrouvent principalement entourées d'éosinophiles et de

macrophages, et plus rarement de neutrophiles, formant de multiples micro-granulomes [99].

Les patients sowda présentent des niveaux plus faibles de TGF-β [102], et des réponses de type

Th2 et Th17 accrues [106]. De plus, les éosinophiles et des neutrophiles montrent des capacités

chimiotactiques plus importantes [107]. L'action de ces cellules permettrait une destruction

efficace des microfilaires, mais au prix d'une pathologie cutanée accrue. En effet, les patients

présentent des plaques hyperpigmentées sur la peau, d'intenses démangeaisons et des œdèmes

sévères. Des surinfections bactériennes peuvent également se produire en raison des plaies

dues aux démangeaisons [108].

Chez les patients présentant des charges importantes en microfilaires, celles-ci peuvent

migrer dans le tissu conjonctif des yeux et la cornée. Les yeux sont un organe immuno-

privilégié où en temps normal les cellules immunitaires ne peuvent pas pénétrer.

L'accumulation de microfilaires mortes induit une rupture de cette protection et une

inflammation de la cornée et une infiltration de macrophages, de neutrophiles et

d'éosinophiles. L'étude de modèles murins suggère que Wolbachia joue un rôle important

dans le développement des pathologies dues à O. volvulus. La mort des microfilaires dans la

stroma de la cornée permettrait la libération de la bactérie et sa détection par les cellules

résidentes de la cornée grâce au récepteur TLR2 [109]. Ensuite, la production de cytokines pro-

inflammatoires telles que l'IL-1β, l'interféron (IFN)-γ, CXCL1 et CXCL2 [57,109,110] entrainent

le recrutement de neutrophiles et de macrophages par l'intermédiaire des récepteurs CCR2 et

IL-1R1 [57,109-114]. La dégranulation des neutrophiles avec la libération d'oxyde nitrique, de

myelopéroxydase (MPO) et de réactifs de l'oxygène en association avec les molécules

produites par les éosinophiles pourraient participer à la mise en place de la pathologie. Si

l'inflammation perdure, cela peut entraîner une fibrose de la cornée conduisant à la perte

progressive de la vue [57,99].

44

2.3.3 Loase

De nombreux cas de Loa loa sont asymptomatiques et plus de 40% des personnes

infestées par L. loa présentent une loase occulte sans microfilaires détectables [94,115]. La

pathogénèse des infections à L. loa est encore largement méconnue. Cependant, contrairement

aux autres filarioses, L. loa n'héberge pas Wolbachia. Les symptômes observés ne sont donc

dus qu'à la présence du parasite et non à celle de la bactérie [116].


Les parasites adultes migrent continuellement dans les tissus sous cutanés où ils sont

palpables et ne causent pas de symptômes particuliers. Il arrive que les parasites migrent dans

les tissus sous-conjonctifs de l'œil où ils sont alors visibles [117-119]. Ce passage oculaire peut

durer de quelques minutes à plus d'une journée [62,115]. Il est associé à une inflammation

locale, des démangeaisons, une sensibilité à la lumière et une douleur sévère [115]. Après le

passage des parasites, les symptômes disparaissent rapidement sans laisser de séquelles.

Des œdèmes appelés "œdèmes de Calabar" sont souvent observés chez les personnes

infestées par L. loa. Ils ne sont pas persistants et sont associés à des démangeaisons localisées

ou généralisées. Ils peuvent se produire à distance des parasites adultes, et sont plus

fréquemment observés sur les membres, en particulier les avant-bras. Ils disparaissent

spontanément, généralement après plusieurs jours, et réapparaissent, à intervalles irréguliers

[62]. Ces œdèmes sont des angioœdèmes (c'est-à-dire d'un type allergique) et peuvent se

produire chez des individus amicrofilarémiques, suggérant qu'ils seraient dus à la présence

des adultes [62]. Ils sont observés chez 50% des patients vivant en zone endémique, mais

jusqu’à 80 et 90% des résidents temporaires [120-122]. La pathogénèse des œdèmes n'est pas

connue mais elle est associée aux éosinophiles. Les résidents temporaires présentent une

éosinophilie sanguine et des IgG spécifiques pour les filaires plus élevées que les personnes

vivant en zone d'endémie [121,123]. De plus, de nombreuses molécules issues des granules

éosinophiles sont retrouvées dans le sang des résidents temporaires [121]. Cette différence

pourrait être due à une tolérance au parasite chez les personnes vivant dans les zones

d'endémie entraînant de plus hautes microfilarémies mais des œdèmes moins intenses et

moins nombreux [62,121]. Les neutrophiles ne semblent pas participer aux réponses contre les

adultes de L. loa, peut-être à cause de l'absence de Wolbachia. En effet, l'étude de biopsies a

montré l'absence de neutrophiles à proximité des parasites [116].

45

Symptômes associés aux Mfs

Une des particularités de la loase est que les patients peuvent présenter des

microfilarémies considérables comparées aux autres filarioses [121]. Les individus présentant

une forte microfilarémie sont généralement asymptomatiques. Cependant, chez ces patients, la

prise d’ivermectine, utilisés contre W. bancrofti ou O. volvulus (voir 4.2), peut induire de

graves encéphalopathies pouvant conduire au coma et à la mort [122,124-126]. Toutes les

personnes présentant une forte microfilarémie ne développent cependant pas ces effets

secondaires après traitement [127] ; il est probable que d'autres facteurs, comme des

coïnfections, puissent participer au développement de l'encéphalopathie [128]. Une fois de plus,

très peu de données sont disponibles quand à l'origine de ce syndrome [128]. L'ivermectine

induit une paralysie des microfilaires en bloquant leurs canaux chlorure post-synaptiques [129].

La pathologie viendrait d'une embolie des vaisseaux sanguins cérébraux par les microfilaires

et de l'inflammation associée à la mort des parasites [127]. Les microfilaires peuvent aussi

traverser la barrière hématoencéphalique, entraînant une inflammation du tissu cérébral, avec

des infiltrats de macrophages et de lymphocytes [126] et la présence de microfilaires et de sang

dans le fluide cérébrospinal [125,130].

46

Sous famille Parasite Hôte

(expérimental/accidentel) Stade décrit Localisation pulmonaire Ref

Oswaldofilariinae Oswaldofilaria bacillaris

(Molin, 1858) Crocodylidae Adultes Poumons entiers [2]

Oswaldofilaria chlamydosauri

(Breinl, 1913)

Agamidae

(Agamidae) Adultes Poumons entiers [131]

Conispiculum flavescens

(Castellani et Willey, 1905) Agamidae Adultes Poumons entiers [132]

Piratuba queenslandensis

Mackerras, 1962 Varanidae Adultes Poumons entiers [131]

Piratuba varanicola Mackerras,

1962 Varanidae Adultes Poumons entiers [131]

Dirofilariinae Dirofilaria immitis

(Leidy, 1856) Canidae Adultes, mf Artères pulmonaires, Bronches [133]

(Humains) Adultes Poumons entiers [134]

Dirofilaria spectans

Freitas et Lent, 1949 Mustelidae Adultes Artères pulmonaires [135]

Foleyella dolichoptera

Wehr et Causey, 1939 Ranidae Adultes Tissu pulmonaire [136]

Onchocercinae Acanthocheilonema spirocauda

(Leidy, 1858) Phocidae Adultes

Poumons entiers,

Artères pulmonaires [137]

Acanthocheilonema viteae

(Krepkogorskaya, 1933)

nd,

(Rongeurs) L3, L4 Poumons entiers [10]

Bisbalia vossi

Bain & Guerrero, 2003 Geomyoidea Adultes Cavité pleurale [138]

Brugia pahangi

(Buckley & Edeson, 1956)

nd,

(Rongeurs) L3, L4, Adultes

Poumons entiers,

Artères pulmonaires [10,139,140]

Brugia malayi

(Brug, 1927) Humains mf Poumons entiers [81]

Brugia malayi

(Brug, 1927) (Rongeurs) L4, Adultes, mf

Poumons entiers,

Artères pulmonaires [10,140]

Brugia buckleyi Dissanaike et

Paramananthan, 1961 Leporidae Adultes Artères pulmonaires [141]

Cardiofilaria chabaudi

Dissanaike et Fernando, 1965 Cuculidae Adultes Poumons entiers [142]

Deraiophoronema evansi

(Lewis, 1882) Camelidae Adultes Artères pulmonaires [143]

Litomosoides petteri

Bain, Petit et Berteaux, 1980 Didelphidae Adultes Cavité pleurale [144]

Litomosoides sigmodontis

Chandler, 1931

Rongeurs

(Rongeurs) Adultes, L3, mf

Cavité pleurale

Tissu pulmonaire [10] [11]

Mansonella perstans

(Manson, 1891) Humains Adultes Cavité pleurale [22]

Molinema sprendi

(Anderson, 1953) Castoridae Adultes Cavité pleurale [2]

Monanema globulosa

(Muller et Nelson, 1975)

nd,

(Rongeurs) L4, Adultes

Poumons entiers

Artères pulmonaires [10]

Monanema martini

Bain, Bartlett et Petit, 1986

nd,

(Rongeurs) L3, L4, Adultes Artères pulmonaires [10]

Wuchereria bancrofti

(Cobbold, 1877) Humains Mf Cavité pleurale [145]

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47

Splendidofilariinae Chandlerella chitwoodae

Anderson, 1961

Psittacopasserae,

Galloanserae Adultes Artères pulmonaires [146]

Chandlerella bosei

(Chandler, 1924)

Corvidae, Certhidae,

Muscicapidae Adultes Poumons entiers [147]

Chandlerella sinensis

Li, 1933 Corvidae Adultes

Poumons entiers

Trachée [142]

Dunnifilaria ramachandrani

Mullin et Balasingam, 1973 Muridae Adultes Artères pulmonaires [148]

Elaophora sagitta

(Linstow, 1907) Bovidae Adultes Artères pulmonaires [149]

Paronchocerca ciconiarum

Peter, 1936 Ciconidae Adultes Artères pulmonaires [150]

Paronchocerca rousseloti

Chabaud et Biocca, 1951 Phasianidae Adultes Artères pulmonaires [150]

Paronchocerca francolina

(Jairajpuri et Siddiqi, 1970) Phasianidae Adultes

Poumons entiers

Sacs aériens [150]

Paronchocerca papillatus

(Ali, 1956) Phasianidae Adultes Poumons entiers [150]

Paronchocerca sonini

Borgarenko, 1984 Scolopacidae Adultes Poumons entiers [150]

Paronchocerca struthionus

Bartlett and Anderson, 1986 Struthionidae Adultes Poumons entiers [150]

Paronchocerca thapari

Deshmukh, 1969 Phasianidae Adultes Poumons entiers [150]

Splendidofilaria algonquiensis

(Anderson, 1955) Hirundinidae Adultes Artères pulmonaires [151]

Splendidofilaria caperata

Hibler, 1964 Corvidae Adultes Paroi des artères pulmonaires [152]

Splendidofilaria falconis (Sonin,

1966) Falconidae Adultes Poumons entiers [147]

Splendidofilaria periarterialis

(Caballero, 1948) Tyrannidae Adultes Paroi des artères pulmonaires [153]

Setarinae Setaria equina

(Abildgaard, 1789)

Equidae, Bovidae,

Camelidae Adultes Poumons entiers [154]

Setaria transcaucasica

Assadov, 1952 Bovidae, Cervidae Adultes Poumons entiers [154]

Tableau 3. Filaires cardio-pulmonaires et pleurales.

La première colonne indique la sous-famille à laquelle appartiennent les espèces de filaires ;

la seconde colonne indique le nom d'espèce suivie du nom d'autorité (qui suit les règles de

nomenclature internationale). Les hôtes naturels sont présentés dans la 3ème colonne, avec les

hôtes expérimentaux/accidentels entre parenthèses. Le stade filarien décrit dans les poumons

est indiqué dans la 4ème colonne et les détails sur la localisation pulmonaire sont donnés dans

la 5ème. nd = non décrit dans les poumons.

48

3 Les filarioses pulmonaires, cardio-pulmonaires et pleurales

La présence de filaires dans l'environnement pulmonaire (poumon sensu stricto et/ou

système cardio-pulmonaire et/ou cavité pleurale) a été décrite chez de nombreuses espèces de

filaires dans un large éventail d'hôtes comprenant des oiseaux, des crocodiles, des chiens et

les humains (Tableau 3). La plupart des études ont documenté la présence de vers adultes ou

de microfilaires, mais très rarement des L3 du fait de leur faible nombre et du caractère

transitoire de leur migration.

La/les voies de migration des filaires présentant des localisations pulmonaires ne sont

pas connues mais pourraient s'expliquer anatomiquement : lors de la migration lymphatique

les larves s'engageraient dans le canal thoracique et arriveraient ainsi dans la veine cave

supérieure, le cœur droit puis les artères pulmonaires. De là, suivant l’espèce filarienne

considérée, les L3 pourraient s'installer dans la circulation sanguine pulmonaire (comme

Dirofilaria immitis), pénétrer le tissu pulmonaire (comme certaines Oswaldofilariae de

reptiles) ou rejoindre la cavité pleurale (M. perstans ou des espèces des genres Litomosoides).

Chez d'autres espèces (par exemple B. malayi chez les rongeurs) la présence d'adultes dans les

poumons est parfois décrite, elle pourrait être accidentelle et résulter de parasites emportés par

le flux lymphatique à travers le canal thoracique jusqu'à la circulation sanguine pulmonaire

[10].

La présence de filaires dans l'environnement pulmonaire est souvent considérée

globalement asymptomatique comme chez M. perstans mais peut causer de graves

pathologies dans les dirofilarioses pulmonaires dues aux adultes de D. immitis ou dans le

Poumon Eosinophile Tropical induit par les microfilaires de W. bancrofti et B. malayi.

La biologie et les interactions avec les poumons de D. immitis et de M. perstans sont

développées ci-après, de même que celles de Litomosoides sigmodontis, le modèle murin

utilisé lors de cette étude.

49

3.1 Dirofilaria immitis

Biologie et cycle de vie

Les dirofilarioses sont dues aux filaires du genre Dirofilaria qui comprend une

trentaine d’espèces [155]. D. immitis (Leidy, 1856) et D. repens (Railliet et Henry, 1911) sont

les agents d’importantes filarioses canines en raison de leurs effets pathologiques et de leur

forte prévalence et incidence [134]. D. immitis et D. repens présentent un large spectre d’hôtes

comprenant de nombreuses espèces de mammifères [155] mais les chiens domestiques et

sauvages sont les hôtes privilégiés de ces filaires. Les vecteurs sont des moustiques de la

famille Culicidae [156] appartenant aux genres Culex, Aedes, Anopheles, Mansonia,

Armigeres, Ochlerotatus, et Coquillettidia [157].

Les infections par D. immitis ont lieu dans les régions tropicales et tempérées du

monde entier alors que la présence D. repens est restreinte à l'Europe, l'Afrique et l'Asie. De

nombreux cas zoonotiques ont été décrits chez l’homme pour ces deux espèces. D. immitis est

responsable des cas humains de dirofilarioses pulmonaires, majoritairement localisés en

Amérique [134]. Dans ces zoonoses, les filaires ne finissent pas leur développement et meurent

avant la production de microfilaires [158] [134] [155].

Chez le chien, les adultes de D. immitis vivent dans les artères pulmonaires et le

ventricule droit du cœur. Les adultes sont identifiables 70 jours post infection dans ces

localisations. Toutefois, la voie de migration qu'empruntent les L3 après inoculation dans la

peau pour s’y rendre n’est pas connue. Lors d'autopsies de chiens et de furets infestés

expérimentalement, la localisation des parasites à différents temps après infection a été

étudiée dans la peau, les muscles, les cavités thoraciques et abdominales, le cœur et l'artère

pulmonaire [159] [160] [161] [162]. La figure 8 synthétise les résultats de ces études. Le rendement

parasitaire est relativement stable dans ces organes pendant 70 jours après l'inoculation des L3

avec une moyenne de 30% des larves inoculées qui sont retrouvées (les rendements un peu

plus faibles dans les temps très précoces sont probablement dus au fait que les L3 sont plus

difficiles à trouver que les L4 et les adultes). Durant cette période, les parasites ont été

récupérés dans les tissus sous-cutanés et les muscles, parfois à distance du point d'inoculation,

où ils semblent pouvoir se développer jusqu'au stade jeune adulte.

50

Figure 8. Synthèse des travaux sur la localisation de D. immitis.

Les résultats des dissections de chiens [160,161] et de furets [162] ont été exprimés en % de

l'inoculât initial et regroupés. Les parasites ont été recherchés dans le tissus sous cutané

(rose), les muscles (bleu), les cavités sériques (violet) et les artères et le cœur (bordeau). Les

stades parasitaires retrouvés et leur taille à différents temps après infection sont indiqués dans

les flèches sous le graphe. Les résultats sont exprimés en moyenne + écart standard à la

moyenne (SEM). n=1-6 par temps.

51

A partir de 70 jours après infection, le nombre de filaires dans la peau et les muscles

chute alors que celui des parasites présents dans les artères pulmonaires et le cœur augmente

progressivement et peut atteindre plus de 70% de l'inoculât initial ([160] et Figure 8).

L'hypothèse qui a alors été émise (Kume et Itagaki 1955 [159], Kotani et Powers 1982 [161],

Figure 9 - Hypothèse 1) est que les L3 migreraient dans les tissus sous-cutanés et les muscles

où seraient réalisées les 3ème et 4ème mues. Après 60 à 90 jours, les parasites adultes entreraient

dans une veine et rejoindraient les artères pulmonaires et le cœur droit, portés par la

circulation veineuse. Cette hypothèse pourrait être étayée par le fait que des jeunes adultes,

récupérés après leur migration dans la circulation sanguine pulmonaire, sont capables de re-

migrer vers les artères pulmonaires après une transplantation dans les tissus sous-cutanés de

chiens non-infestés [159,163]. Il semble néanmoins étonnant qu'un parasite mesurant plusieurs

centimètres arrive à pénétrer l'épaisse paroi des vaisseaux sanguins, sans engendrer de fortes

hémorragies.

La limitation principale de ces études est que ni le système lymphatique, ni le tissu

pulmonaire n'ont été analysés. En effet, l'idée d'un passage lymphatique avait été rejetée par

Kume (1955) en argumentant que les larves du nématode Metastrongylus elongatus migrent

par les lymphatiques en causant des hémorragies des ganglions lymphatiques. On sait

aujourd'hui que de nombreuses filaires migrent à travers le circuit lymphatique sans induire de

tels dégâts [10,164]. Il est donc possible, comme l'a suggéré Wenk (1967 [11]) que les larves

pénètrent rapidement dans le système lymphatique avant de remonter le canal thoracique pour

rejoindre la circulation sanguine pulmonaire. Dans ce cas là, les 30% de larves observées dans

la peau/les muscles dans les temps précoces de l'infection correspondraient à celles qui ont

échoué à pénétrer les vaisseaux lymphatiques et qui périraient progressivement après leur

dernière mue; les 70% restants rejoindraient les artères pulmonaires où elle pourraient

atteindre la maturité sexuelle.

52

Figure 9. Hypothèses de migration des stades infestants de D. immitis.

Hypothèse 1 (Kume et Itagaki 1955 [159]) : après inoculation dans la peau, les L3 migrent dans

les tissus sous-cutanés et les muscles où elles effectuent leurs mues en L4 puis en adultes

avant de rejoindre la circulation veineuse qui transporte les parasites dans les artères

pulmonaires. Les hypothèses 2 et 3 privilégient un passage lymphatique. Hypothèse 2 : les L3

pénètrent dans le circuit lymphatique où elles effectuent leurs mues, avant de rejoindre la

circulation sanguine via le canal thoracique, puis les artères pulmonaires. Hypothèse 3 : les L3

pénètrent dans le circuit lymphatique et rejoignent rapidement la circulation sanguine. Les

mues ont lieu au niveau des capillaires pulmonaires dans lesquels les larves sont piégées. Une

hypothèse mixte entre de 2 et 3 est aussi envisageable.

53

Une fois dans le système lymphatique il existe encore au moins 2 options (Figure 9-hypothèse

2 et 3):

• Les parasites effectuent leurs mues dans le système lymphatique pour rejoindre la

circulation sanguine avant leur dernière mue. Cela est d'autant plus probable que la

migration d'adultes du circuit lymphatique vers la circulation sanguine a été décrite

chez Monanema martini¸ notamment après des traitements [10,165].

• Les larves peuvent rejoindre directement la circulation sanguine pulmonaire par le

canal thoracique et rester bloquées dans les capillaires pulmonaires. Ensuite les

parasites continueraient leur développement dans les capillaires ou les alvéoles avant

de remonter vers les artères pulmonaires. Cette hypothèse semble moins plausible car

dans ce cas, il est probable que des symptômes respiratoires apparaitraient avant la

dernière mue.

Ces deux hypothèses sont soutenues par la mue en L4 très précoce des larves de D.

immitis (vers 2-3 jours p.i.). En effet, la plus grande taille des L4 pourrait permettre

d'augmenter les chances qu'elles soient bloquées dans la circulation pulmonaire ou qu'elles se

maintiennent dans le flux lymphatique. Il est aussi possible que D. immitis puisse utiliser

différentes voies de migration pour atteindre les artères pulmonaires : une partie des larves

pénètreraient rapidement dans la circulation lymphatique pour poursuivre leur développement

et les autres matureraient dans la peau avant de migrer.

Pathologie pulmonaire

Les parasites sont tout d'abord retrouvés dans les artères pulmonaires profondes

(Figure 9), où ils induisent des embolies (obstruction des vaisseaux sanguins) et des lésions

vasculaires. La sévérité des lésions dépend du nombre de parasites présents dans les poumons,

pouvant aller de 1 à 250 [166]. Au fur et à mesure que le parasite croît en taille, il remonte à

contre-courant vers l'artère pulmonaire principale. Ceci est probablement rendu possible par le

fait que la circulation sanguine pulmonaire est une circulation à basse pression [167].

54

Une hypertrophie des cellules endothéliales se produit d'abord (endartérite, Figure 10),

entrainant un rétrécissement de la lumière vasculaire et des perturbations des jonctions

cellulaires [134]. Ces événements dans les petites branches périphériques des artères

pulmonaires sont la principale cause d'obstruction de la circulation sanguine et d'hypertension

pulmonaire. La migration de cellules musculaires lisses à travers la paroi induit la formation

de villosités intravasculaires [168,169]. La paroi artérielle devient rugueuse avec une réduction

de la lumière et de la flexibilité des artères pulmonaires [134]. La maladie pulmonaire se

développe à la suite de ces changements vasculaires. Les liquides et les protéines qui diffusent

à travers les parois vasculaires endommagées provoquent un œdème et une inflammation du

parenchyme pulmonaire. Les lésions vasculaires peuvent aussi entraîner la rupture des

vaisseaux pulmonaires.

Figure 10. Progression de la dirofilariose pulmonaire chez le chien.

(A) La présence des filaires induit une inflammation chronique des vaisseaux sanguins

(endartérite). (B) La mort des parasites induit des évènements aigus. (C) Les dégâts sont

d'abord restreints aux artères et au parenchyme pulmonaire (hypertension artérielle et

œdèmes pulmonaires) puis (D) progressent vers le ventricule droit du cœur, entraînant une

insuffisance cardiaque. D'après [134].

55

Parallèlement à la progression chronique de la maladie, la mort des adultes provoque

des événements aigus caractérisés par une thromboembolie (obstruction de vaisseaux dus à

des caillots sanguins et à des fragments de filaires mortes) et une inflammation sévère qui

peuvent être létale pour l'animal ([170,171] et Figure 10). L'altération de la paroi artérielle et la

réduction du diamètre de la lumière des artères pulmonaires, qui peuvent être occultées par les

villosités, les thrombus et/ou la présence de vers, en conjonction avec des médiateurs

inflammatoires, peuvent entraîner une hypertension pulmonaire. Cela génère une surcharge

sanguine dans le ventricule droit du cœur, induisant une insuffisance cardiaque congestive

[172].

La dirofilariose pulmonaire humaine se caractérise par la formation de nodules

pulmonaires autour de jeunes adultes morts. Lorsque les parasites atteignent une branche

petite ou moyenne de l'artère pulmonaire, ils en bloquent le passage, provoquant une embolie

et une inflammation localisée [173,174]. Des zones fibrotiques et nécrotiques ainsi que des

granulomes peuvent être observées dans les poumons autour des parasites morts [173-176].

Différents traitements existent pour éliminer les parasites des chiens atteints par D.

immitis. L’élimination des parasites n’est pas sans risque en particulier quand l’infestation est

importante du fait des effets secondaires liés à la destruction massive de vers dans la

circulation sanguine. Comme chez l'humain, des lactones macrocycliques, comme

l'ivermectine, sont utilisées pour éliminer les microfilaires et arrêter la transmission. Il existe

néanmoins un traitement capable de tuer les adultes. La mélarsomine hydrochloride

(Immiticide), est une composé organo-arsénié ayant une efficacité supérieure à 96% pour tuer

les parasites adultes [166] mais son mode d'action n'est pas connu. La thromboembolie

pulmonaire est une conséquence inévitable du traitement macrofilaricide et peut être grave

voire mortelle chez les chiens fortement infectés [166,177]. Les risques sont généralement

minimes chez les animaux porteurs d’un petit nombre de vers adultes car une embolie légère

peut passer cliniquement inaperçue [178]. Un choc anaphylactique (Hypersensibilité de type I)

peut aussi faire suite à la libération massive d’antigènes suite à la destruction des parasites

[166].

56

3.2 Mansonella perstans


Le cycle de vie de Mansonella perstans est mal connu. Plusieurs espèces de

Culicoides peuvent transmettre les larves de M. perstans [66]. Les adultes de M. perstans sont

rarement observés, mais ils ont été occasionnellement récupérés dans les cavités sériques

(cavités péritonéale, pleurale, et péricardique) lors de chirurgies ou d'autopsies [22].

Les microfilaires sont dépourvues de gaine et mesurent environ 190-200µm de long

par 4-5µm de diamètre. Les Mfs vivantes ont de fortes capacités de contraction de

d'élongation ce qui fait que les tailles décrites varient beaucoup [22,68]. Les Mfs sont sanguines

[69].


Les adultes de M. perstans s'installeraient majoritairement dans les cavités sériques,

dont la cavité pleurale. Les infections par M. perstans ne sont pas associées à un tableau

clinique précis. Pour cette raison, elles ne sont pas considérées comme un problème de santé

publique. Les rapports cliniques traitent majoritairement des expatriés qui retournent dans leur

pays d'origine ou des patients ayant accès à des établissement médicaux [22]. La plupart des

manifestations signalées suggèrent que les symptômes sont plutôt liées à la présence des

parasites adultes dans les cavités sériques et moins aux microfilaires ou à d'autres stades

larvaires [22]. M. perstans peut provoquer une éosinophilie sanguine [179] pouvant atteindre une

hyper éosinophilie chez les expatriés [180], des gonflements sous-cutanés, des douleurs et des

éruptions cutanées chez de nombreux patients [22]. Certains cas de pathologies associées aux

poumons ont aussi été décrits: une hypertension pulmonaire chez un enfant [180] mais surtout

des effusions pleurales associées à des microfilaires pleurales [181,182]. Si la présence d'adultes

dans la cavité pleurale n'a pas été démontrée dans ces cas, il est possible que les microfilaires

retrouvées aient été produites localement et soient responsables de l'inflammation pleurale.

Plus récemment, une tomographie assistée par ordinateur d'une patiente infestée par M.

perstans a révélé des infiltrats péribronchiques [183].

57

3.3 Litomosoides sigmodontis

Modèle murin de filariose- justifications

L'étude des filaires humaines et vétérinaires est limitée par le fait qu'aucune ne peut

effectuer son cycle de vie complet chez la souris immunocompétente. Il est préférable d’avoir

un modèle murin car peu d'outils immunologiques sont disponibles pour étudier la réponse

immunitaire chez d’autres rongeurs comme la gerbille dans laquelle peut se développer B.

malayi [184]. Chez la souris, les études de B. malayi sont limitées à l'injection ou à

l'implantation de L3, d'adultes ou de microfilaires, qui survivent de quelques semaines (larves

et microfilaires) à des mois (adultes), en fonction de la souche et du sexe de la souris [185-187]

[82,188].

Loa loa peut se développer partiellement chez des souris immunodéficientes avec

traitements par des corticostéroïdes [189] ou suite à des modifications génétiques [190]. Chez les

souris IL-4R/IL5 double déficientes, les parasites survivent au moins 70 jours et atteignent le

stade adulte, indiquant un rôle critique de ces molécules dans la résistance des souris à L. loa.

L'étude n'a pas été prolongée assez longtemps pour observer une éventuelle microfilarémie

[190]. La croissance d'Onchocerca volvulus et les réponses immunitaires de l'hôte ont été

étudiées chez la souris en implantant des chambres de diffusions contenant des L3 sous la

peau de souris [191-193]. Dans les chambres de diffusions, les larves effectuent leur mue en L4

et peuvent survivre plus de 3 semaines [193].

L'avantage de L. sigmodontis est que cette filaire peut effectuer son cycle de vie

complet chez la souris et permet donc une étude approfondie des relations hôte-parasite en

particulier pour la réponse immunitaire, des essais vaccinaux et des tests de drogues anti-

filariennes [55]. De plus L. sigmodontis se développe différemment dans la souris selon la

souche considérée. En effet, les souris BALB/c permettent un développement complet du

parasite jusqu'à la phase patente; les souris CBA/ca sont semi-résistantes car elles ne

développent pas de phase patente avec production de microfilaires mais les filaires atteignent

un stade adulte qui survit autant que dans les BALB/c; les souris C57BL/6 sont résistantes, les

adultes meurent rapidement entre 30 et 50 jours post infection [194-196]. L’analyse comparée de

ces différentes souches peut être utilisée pour caractériser les processus déterminants dans la

résistance et la susceptibilité aux parasites [195].

Enfin L. sigmodontis présente de nombreuses similarités avec Mansonella perstans,

dont la localisation pleurale des adultes (Tableau 4).

58

M. perstans chez l’humain L. sigmodontis chez

souris BALB/c

L. sigmodontis chez la

gerbille

Taille L3 600-900µm 750-800µm 750-800µm

Mue en L4 9 à 10 jours p.i. 9 à 10 jours p.i. 9 à 10 jours p.i.

Taille mâle adulte 35-45mm x 50-60µm 20±5mm x 130µm 25±5mm x 130µm

Taille femelle

adulte

50-80mm x 80-120µm 75±10mm x 220-255µm 90±10mm x 220-255µm

Localisation

adultes

Cavité pleurale, cavité

péritonéale, péricarde.

Cavité pleurale Cavité pleurale, cavité

péritonéale.

Taille Mfs ~ 190 x 4-5 µm ~ 80 x4-5µm ~ 80 x4-5µm

Localisation Mfs Sang Sang Sang

Gaine Mfs NON OUI OUI

Périodicité +/- NON NON

Wolbachia

(supergroupe)

OUI (F) OUI (D) OUI (D)

Tableau 4. Comparaison entre M. perstans et L. sigmodontis.

Des caractéristiques de L3, de L4, d'adultes et de Microfilaires (Mfs) pour M. perstans sont

présentées dans la colonne 1et la seconde celles de L. sigmodontis.

Figure 11. Cycle de vie de L. sigmodontis.

Les L3 sont inoculées dans l’hôte murin lors d'un repas sanguin et migrent jusqu’à la cavité

pleurale en 7-8 jours. À ce niveau elles vont muer vers 9-10 jours post infection (p.i.) en L4

puis vers 30 jours en adultes mâles et femelles qui se reproduisent et libèrent des microfilaires

dans la cavité pleurale qui rejoignent le sang environ 55-60 jours après infection. Les

microfilaires (L1) sont ensuite ingérées par le vecteur acarien lors d'un repas sanguin dans

lequel elles muent jusqu'au stade L3.

59


26 espèces sont actuellement décrites dans le genre Litomosoides [1]. Elles vivent dans

les cavités pleurale et/ou péritonéale des rongeurs, des chauves-souris et de petits marsupiaux

[4,197]. Litomosoides sigmodontis (Chandler, 1931) a pour hôte naturel Sigmodon hispidus (le

rat du coton) et son vecteur est l'acarien Ornithonyssus bacoti [194,198].

Les larves inoculées de L. sigmodontis migrent du site d’inoculation au système

lymphatique et se retrouvent dans la cavité pleurale en 7-8 jours [10,11,199]. Quelques larves

peuvent être retrouvées dans la cavité péritonéale chez le rat du coton et le mérion, mais pas

chez la souris ( [10,200] et Figure 11). La mue en L4 a lieu entre 9 et 10 jours après inoculation

puis une mue autour de 30 jours donne des adultes sexués capables de se reproduire [201-203].

La femelle fécondée pond des Mfs dans la cavité pleurale qui rejoignent le sang où elles sont

identifiables 55-60 jours après inoculation [201,203]). Dans le cycle naturel, les Mfs sont

ingérées par l'acarien pendant un repas sanguin. Les larves peuvent se développer dans de

nombreux organes de l'acarien comme le tissu interstitiel, les glandes salivaires ou les glandes

coaxales [198]. Elles muent en stade L2 en 5 à 7 jours, puis en L3 vers le douzième jour. Les

larves infestantes migrent alors vers l'hémocèle d'où elles s'échapperont et atteindront la peau

de l'hôte du vertébré lors d'un repas sanguin [9].


Lors de leur phase de migration, des L3 de L. sigmodontis ont été observées dans les

poumons dilacérés mécaniquement des souris BALB/c deux jours après inoculation [204] et

encore plus tôt dans leur hôte naturel, le rat du coton [11]. Des granulomes constitués de

lymphocytes T et de macrophages ont aussi été observés dans les poumons de souris infestées

7 jours p.i. [205]. Au cours du développement de la filaire dans la cavité pleurale le volume de

l’exsudat pleural augmente et il contient de nombreux leucocytes avec un pic de cellularité

observé à J30 p.i. [196], ce pic étant plus prononcé chez les souris C57BL/6 que chez les

BALB/c [195,196,202,206]. De plus une hypertrophie des cellules mésothéliales a été observée dans

les souris C57BL/6 30 jours après infection [196].

Plus tard lors de l'infection, les femelles pondent les microfilaires dans la cavité

pleurale; les Mfs rejoignent la circulation sanguine par une voie migratoire inconnue.

Les travaux de Wharton (1946 [207]) et Schneider (1968 [208]) ont décrit des lésions

pulmonaires chez le rat du coton (Sigmodon hispidus) et la gerbille (Meriones unguiculatus)

60

en phase patente d’infestation par L. sigmodontis. Ils ont observé une hyperplasie et une

prolifération des cellules mésothéliales avec la formation de nodules papillaires et une fibrose

de la plèvre. Des microfilaires ont été observées dans la vasculature pulmonaire, mais aussi

dans le parenchyme et des infiltrats cellulaires sont présents autour des bronches [207,208].

61

4 Programmes multivalents visant à « traiter » les filarioses

4.1 Traitements à grande échelle ou traitements de masse (Mass Drug

Administration, MDA)

4.1.1 Programme mondial pour l’élimination de la filariose lymphatique

(GPELF)

L'Organisation mondiale de la santé (OMS) a lancé en 2000 le Programme mondial

pour l’élimination de la filariose lymphatique (GPELF) avec comme objectif l’élimination de

cette maladie d'ici à 2020. La stratégie repose sur un arrêt de la propagation de la maladie

grâce à la chimiothérapie préventive par l’administration à grande échelle de médicaments

(Mass Drug Administration, MDA). Le traitement consiste en la prise unique de 2

médicaments par l'ensemble de la population à risque chaque année. L'albendazole (ALB), en

association avec de l’ivermectine (IVM) ou du déthylcarbamazine (DEC) sont utilisés. Ces

médicaments ne permettent pas de tuer les parasites adultes, mais éliminent efficacement les

microfilaires de la circulation sanguine et préviennent ainsi la propagation des parasites aux

vecteurs. Pour interrompre le cycle de transmission du parasite, l'administration des

traitements doit donc être menée chaque année pendant au moins 5 ans, avec une couverture

de toute la population à risque [209]. Aucun traitement macrofilaricide (éliminant les parasites

adultes) n'est actuellement disponible pour la MDA.

Lors des débuts du programme GPELF, 81 pays étaient considérés comme

endémiques pour la filariose lymphatique. De 2000 à 2015, plus de 6,2 milliards de

traitements ont été fournis à environ 820 millions d’individus dans 64 pays, ce qui a

considérablement réduit la transmission et a fait baisser le nombre de personnes infestées de

120 millions à 68 millions (OMS).

62

Tableau 5. Recommandations pour la distribution des traitements à grande échelle, les

traitements individuels et le contrôle des symptômes.

La 1ère colonne indique les différentes filarioses. Les colonnes 2 et 3 présentent les

recommandations pour la distribution à grande échelle de médicaments (MDA) en Afrique et

dans le reste du monde. La 3ème colonne contient les recommandation de traitements

individuels et les éventuelles conditions (coinfections, âge, charge parasitaire). Enfin, la

dernière colonne indique les stratégies de contrôle des symptômes. D'après [18,22,210]

63

4.1.2 Programmes de lutte contre l'onchocercose

En raison des importantes conséquences de l'onchocercose en Afrique de l'Ouest,

l'OMS a lancé en 1974 le Programme de lutte contre l'onchocercose en Afrique de l'Ouest

(OCP). Pendant des années, le programme a consisté en une lutte anti-vectorielle consistant à

la pulvérisation d’insecticides contre les larves de simulies. En 1987, Merck & Co a annoncé

qu'ils fourniraient gratuitement l’ivermectine pour le traitement de l'onchocercose pendant

aussi longtemps que cela serait nécessaire. A partir de ce moment, la distribution d'IVM à

grande échelle s'est ajoutée à la lutte anti-vectorielle. Lorsque l'OCP a pris fin en 2002, il avait

réussi à éliminer l'onchocercose en tant que problème de santé publique dans 10 des 11 pays

de son aire d’intervention. Basé sur ce succès, le programme Africain pour le contrôle de

l'Onchocercose (APOC) a été lancé entre 1995 et 2015 pour étendre l'OCP. APOC incluait 31

pays d'Afrique sub-saharienne et la stratégie consistait une fois de plus en l'administration à

grande échelle d'ivermectine.

A la clôture du programme en 2015, plus de 114 millions de personnes avaient bénéficié d’un

traitement en Afrique et entre 2005 et 2015 la prévalence de l'infection a chuté de 30% [28].

Trois pays semblent avoir réussi à arrêter la transmission d’Onchocerca volvulus : la

Colombie, l'Equateur et le Mexique [211].

4.1.3 Les traitements individuels

En plus des traitements à grande échelle à visée prophylactique, des traitements

individualisés existent pour les cas avérés d'infection. Ceux-ci utilisent généralement les

mêmes molécules mais avec des posologies pouvant différer (Tableau 5). De plus, des

stratégies visant l'endosymbiote Wolbachia peuvent être mises en place avec des traitements

antibiotiques comme la doxycycline (Dox).

Les stratégies de contrôle et d'élimination des filarioses lymphatiques et de

l'onchocercose sont compliquées dans les régions où une de ces filaires est co-endémique

avec Loa loa. Dans ce cas là, les patients nécessitent un suivi personnalisé. En effet, de graves

effets secondaires ont été observés chez des individus présentant de grandes quantités de

microfilaires de L. loa traités avec l'ivermectine ou la DEC qui peuvent développer des

méningoencephalopathies [33,212].

Seules l'onchocercose et la filariose lymphatique font l'objet de programmes

internationaux avec des distributions de médicaments à grande échelle. Il n'y a actuellement

64

pas de traitement adapté à une application à grande échelle pour traiter les infections à Loa

loa. Boussinesq (2012 [210]) a proposé une stratégie de traitements individuels dépendant de la

charge en microfilaires (Tableau 5). L'objectif de ces traitements est de faire baisser

progressivement la microfilarémie tout en évitant l'apparition d'effets secondaires. Le

problème de ce protocole est qu'il nécessite un suivi régulier voire une hospitalisation, ce qui

est difficilement applicable dans les pays endémiques à L. loa [210].

Dans le cas des mansonelloses, comme les infections sont considérées comme

asymptomatiques, elles sont rarement traitées. Peu d'essais ont été faits pour essayer de les

traiter et aucun programme international n'a été mis en place [213]. Mansonella perstans est

considérée comme une des filaires les plus difficiles à traiter. L'ivermectine, le

déthylcarbamazine et l'albendazole ont peu d'effet sur le parasite [214,215]. M. perstans

hébergeant Wolbachia, quelques essais de traitement par la doxycycline ont été réalisés,

rapportant un effet macrofilaricide de la doxycycline [183,216].

4.1.4 Considérations actuelles

Dans l'ensemble, les programmes de MDA ont conduit à une réduction significative de

la transmission des filaires et de la morbidité causée par les microfilaires. Cependant, les

traitements n'étant pas macrofilaricides (ils ne tuent pas les parasites adultes) et n'entrainant

pas une stérilisation durable des parasites, les traitements doivent être pris tous les ans

pendant des années jusqu'à la mort des parasites (durée de vie de jusqu'à 5 ans pour B. malayi

et jusqu'à 17 ans pour O. volvulus). Des études pilotes sont actuellement en cours pour tester

l'efficacité d'une trithérapie ALB, DEC et IVM en simple dose [217]. En particulier, une étude

pilote sur 12 individus a montré qu'un tel traitement entraîne une absence de microfilarémie

pendant au moins deux ans et ceci suggère une efficacité supérieure aux régimes actuels pour

le traitement des filarioses lymphatiques [218]. On ne sait pas encore si l'efficacité du

traitement est due à une stérilisation des femelles ou à leur élimination. Bien que le nombre de

patients inclus dans cette étude soit faible et malgré le peu de recul sur l 'utilisation de la

trithérapie, ce résultat et les succès des MDA ont conduit l'OMS et une partie de la

communauté scientifique à estimer que la filariose lymphatique pourrait être éliminée comme

problème de santé publique d'ici à 2020 [209]. L'utilisation de cette stratégie pour le traitement

de l'onchocercose semble plus compliquée du fait des effets secondaires oculaires décrits

après les traitements par la DEC [217,219,220].

65

Il est important de noter que l'utilisation massive des trois médicaments actuellement

disponibles (IVM, ALB et DEC) augmente le risque d'émergence et de propagation de la

résistance aux traitements (déjà avéré pour l'ivermectine [221]), ce qui peut constituer une

menace pour les programmes d'éliminations [222]. Comme il n'y a pas de vaccin disponible, il

est important de développer de nouveaux traitements. Parmi les objectifs actuels, l'un a pour

but de développer un traitement oral de courte durée macrofilaricide pouvant traiter à la fois

l'onchocercose et la filariose lymphatique.

4.2 Mode d'action des molécules ciblant les filaires

4.2.1 Ivermectine

L’identification de l’ivermectine comme principale arme thérapeutique pour les

programmes internationaux de lutte contre l’onchocercose justifie pleinement le fait que

Satoshi Omura et William Campbell aient reçu le prix Nobel de médecine 2015.

L'ivermectine est une lactone macrocyclique (Figure 12A) bloquant les canaux post-

synaptiques dépendant du glutamate transportant les ions chlorure (Glutamate-gated Chloride

Channels) [129]. L'intérêt de cette cible est que ces canaux ne sont présents que chez les

nématodes et les arthropodes, limitant ainsi les effets néfastes de l'IVM à ces organismes [223].

Le blocage des canaux inhibe la libération des Mfs par les vers femelles et immobilise les Mfs

circulantes [224]. Les Mfs sont alors drainées vers les ganglions lymphatiques, où les larves

immobilisées sont détruites [225]. L'IVM a donc un effet sur la fertilité des femelles et la

production des Mfs [225] mais cet effet est réversible. Une analyse transcriptomique de

femelles de B. malayi traitées avec de l'ivermectine in vitro a montré que le traitement a aussi

un effet sur de nombreux gènes impliqués dans la méiose et l'embryogénèse ainsi que le

métabolisme de ces parasites [226]. La limitation principale de ce traitement est qu'il est

exclusivement microfilaricide (il élimine les microfilaires et non les adultes) et que la

stérilisation est temporaire [227]. L'objectif du traitement à l'ivermectine est donc d'arrêter la

transmission, avec pour conséquence le fait que les patients doivent être traités durant toute la

vie du parasite. Il est à noter que l'usage à grande échelle depuis plus de 20 ans de

l'ivermectine seule pour traiter l'onchocercose semble avoir entraîné l'émergence de parasites

résistants à ce traitement [228] [222].

66

Figure 12. Structure chimique de l'Ivermectine (A), du Diéthylcarbamazine (B) et de

l'Albendazole (C).

67

4.2.2 Diéthylcarbamazine

La diéthylcarbamazine (DEC), un dérivé de la pipérazine (Figure 12B), a un effet sur

tous les stades filariens. Cependant, le mécanisme exact d'action de la DEC est mal connu.

L'exposition de microfilaires à de fortes concentrations de DEC in vivo n'est pas suffisant pour

les tuer, suggérant que la DEC n'aurait pas un effet direct majeur sur les filaires. Les

microfilaires disparaissent de la circulation sanguine quelques minutes après le traitement. Le

DEC interfère avec le métabolisme des acides arachidoniques chez les microfilaires et les

cellules endothéliales de l'hôte. Ceci pourrait induire une vasoconstriction et une

augmentation de l'adhésion des microfilaires aux cellules endothéliales [229]. Les microfilaires

immobilisées pourraient ensuite être détruites par les granulocytes [230]. De plus, la DEC peut

orienter la réponse immunitaire avec des effets anti-inflammatoires. Le traitement permet

d'inhiber l'activation du facteur de transcription nucléaire kappa B (NF-kB), un régulateur clé

de gènes pro-inflammatoires tels que TNF-α, IL-1β, ainsi que l'oxyde nitrique synthase

inductible (iNOS) et la cyclooxygénase 2 (COX-2) [231]. La DEC n'est pas recommandée dans

les zones endémiques d'onchocercose où elle peut induire une inflammation locale chez des

sujets présentant des Mfs oculaires [18].

4.2.3 Albendazole

L'albendazole (ALB) est un benzimidazole (Figure 12C) anthelminthique à large

spectre contre les plathelminthes, les cestodes et les nématodes ; il inhibe la polymérisation de

la β-tubuline des vers et la formation des microtubules [232]. De plus, l'ALB bloque

l'absorption de glucose dans les stades larvaires et adultes, entraînant l'épuisement du

glycogène et la réduction des stocks d'adénosine triphosphate (ATP) conduisant à

l'immobilisation et à la mort du parasite [222]. Enfin, chez W. bancrofti l'ALB conduit à une

interruption de la reproduction chez les filaires adultes (d’environ 9 mois) [222].

68

Figure 13. Structure chimique de la Doxycycline (A), du Flubendazole (B), et de

l'Emodepside (C).

69

4.2.4 Tétracyclines

Wolbachia est essentielle à la croissance et la survie des filaires humaines (sauf Loa

loa) ce qui en fait une cible thérapeutique. Lors d'essais cliniques [233-236], l'efficacité estimée

de la doxycycline (Dox, Figure 13A) à éliminer Wolbachia chez les femelles adultes d’O.

volvulus était de 91% à 94% en moyenne, quel que soit le schéma thérapeutique utilisé. La

durée de vie des filaires dans lesquelles la population en Wolbachia est fortement diminuée

est réduite de 70% à 80%, passant de 10 ans à 2-3 ans [235]. Un effet macrofilaricide a aussi été

observé chez les patients infectés par Wuchereria bancrofti [237], chez qui un traitement de 4

semaines avec 200mg de Dox permet d'éliminer 80% des adultes. De plus le traitement à la

doxycycline permet de diminuer les symptômes de lymphoedèmes indépendamment de la

présence de parasites adultes vivants en diminuant les infections bactériennes et

l'inflammation [238]. Cependant, son application généralisée dans le cadre des MDA est limitée

par des contre-indications chez les femmes enceintes et les enfants de moins de neuf ans [239]

et par la durée des traitements. La Dox est néanmoins conseillée pour les traitements

individuels (Tableau 5).

4.2.5 Traitements en cours d'évaluation

Flubendazole

Les benzimidazoles (flubendazole, mebendazole, oxfendazole, ciclobendazole,

albendazole, cambendazole, fenbendazole) fonctionnent en interférant dans la formation des

microtubules. Les benzimidazoles peuvent affecter la tubuline des hôtes aussi bien que celle

des parasites et causent une mauvaise séparation chromosomique pendant la mitose [240].

Cependant, les benzimidazoles affectent préférentiellement la tubuline des nématodes plutôt

que celle des mammifères. Ce sont aussi des agents antifongiques ce qui peut être important

lors de l'éléphantiasis qui implique souvent des surinfections fongiques [240].

Le flubendazole (FLBZ, Figure 13B), est actif contre un large spectre de nématodes

gastro-intestinaux chez l'homme et certaines espèces animales. Le FLBZ a aussi un effet

filaricide chez de nombreuses espèces de filaires [240]. Le FLBZ serait le benzimidazole le plus

puissant comme macrofilaricide [241]. Ce composé est déjà approuvé pour une utilisation chez

l’homme pour le traitement de nématodes intestinaux, ce qui peut être un avantage par rapport

aux autres candidats macrofilaricides. L'activité macrofilaricide du FLBZ nécessite cependant

une exposition systémique qui n'est pas atteinte après l'administration orale classique à cause

70

de sa solubilité réduite dans l'eau [242,243]. L'activité in vivo du FLBZ contre plusieurs espèces

filariennes a été rapportée après son administration intramusculaire dans des essais chez

l'animal et chez l'homme [244]. Cependant, des effets secondaires ont été signalés après

l'administration du FLBZ, majoritairement une inflammation du site d'injection et de la fièvre

[244,245]). De plus, le FLBZ a un effet perturbateur sur la mitose [246]. Des recherches sont en

cours pour améliorer la formulation du traitement et la biodisponibilité du traitement tout en

diminuant les effets secondaires [243,246] mais à l'heure actuelle il semble peu probable que le

FLBZ obtienne une autorisation de mise sur le marché pour les filarioses.

Emodepside

L'émodepside est un cyclooctadepsipeptide (Figure 13C) qui agit sur les jonctions

neuromusculaires. L'action principale de l'émodepside passe par l'activation d'un canal

potassique chez les filaires (SLO-1) entrainant la paralysie des parasites [247]. L'émodepside

est entrée en étude de phase I sur volontaires sain en 2016 pour le traitement des patients

atteints d'onchocercose (DNDi : https://www.dndi.org/diseases-projects/portfolio/emodepside/).

Tylosine

Le consortium Anti-Wolbachia (A.WOL), a pour objectif de mettre au point un

traitement ciblant Wolbachia. autre que les tétracyclines. Un dérivé de la tylosine, un

antibiotique vétérinaire ciblant Wolbachia est actuellement en développement préclinique

pour le traitement des filarioses. Il induirait un effet anti-Wolbachia plus robuste que la

doxycycline dans plusieurs modèles in vivo et serait efficace plus rapidement (http://dndi.org).

Une étude de phase I sera réalisée en 2017 pour évaluer la sécurité, la tolérance et la

pharmacocinétique du médicament.

71

5 Cinétique de la réponse immunitaire chez les souris infestées par L. sigmodontis

Réponses immunitaires associées aux filarioses

Lors d'une infection filarienne, une réponse immunitaire se met en place. Grace à de

nombreuses molécules sécrétées et à Wolbachia, les filaires sont capables d'orienter la

réponse immunitaire dès l'entrée dans l'organisme pour favoriser leur migration et leur survie.

Ainsi, les filaires sont capables de survivre de plusieurs mois à plusieurs années dans leur hôte

[248].

Un réseau complexe de cellules et protéines est impliqué dans la résistance et la

susceptibilité aux filaires. La réponse aux filaires est généralement définie comme une

réponse Th2 modifiée. Cette réponse implique la production des cytokines IL-4, IL-5, IL-9,

IL-10 et IL-13, la production des d'anticorps d'isotypes IgG1, IgG4 et IgE (chez l'homme) et

IgG1 et IgE (chez la souris) [248] et des quantités accrues d'éosinophiles et de macrophages

alternativement activés ainsi que des cellules lymphoïdes innées (ILC) [249]. De plus, les

cellules dendritiques ont des capacités de présentation de l'antigène réduites et les

lymphocytes prennent un phénotype régulateur anti-inflammatoire. Les nombreux

mécanismes régulateurs mis en place, s'ils permettent une survie accrue des parasites,

participent à la réparation des tissus et diminuent les risques de pathologies dues à une

réponse inflammatoire trop forte [250].

72

Tableau 6. Réponses cellulaires lors des différentes phases de l'infection par

Litomosoides sigmodontis chez les rongeurs.

Entre parenthèse sont indiquées des informations sur les rôles décrits des cellules ou les

conséquences de l'infection sur leur fonction.

: population cellulaire augmentée. - : pas de différences observées. ? rôle inconnu. Mϕ(IL-

4R) : macrophage alternativement activé par la mobilisation de l'IL-4R. Treg : Lymphocyte T

régulateur. Macro : macrophages. Eosino : Eosinophiles. Neutro : Neutrophiles.

73

5.1 Réponse immunitaire au site d'inoculation : apport des différents modèles

Le premier contact entre les filaires et leur hôte a lieu lors de l'entrée des L3 dans la

peau. Cette étape est commune à toutes les filaires et il est probable que la réponse

immunitaire cutanée initiale montre des similarités chez toutes les espèces. Dans les modèles

étudiés chez les rongeurs (B. malayi, L. sigmodontis, Acanthocheilonema viteae, ou

Monanema martini), la réponse inflammatoire détruit une grande quantité de L3 en quelques

heures dans le tissu cutané [10,55]. Cela implique une induction précoce des défenses de l'hôte,

avec le recrutement et l'activation de nombreuses cellules, comme les cellules présentatrices

d'antigène (CPA), les granulocytes et les mastocytes [251,252].

Neutrophiles

Dans la zone inflammatoire du site d'inoculation, de nombreux neutrophiles sont

recrutés [253-258]. Le recrutement des neutrophiles dans la peau est dépendant du récepteur

NOD2 (Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2) qui reconnait le

Muramyldipeptide (MDP) de la paroi de certaines bactéries, dont Wolbachia [258]. Les

neutrophiles ont un rôle important dans l'élimination des L3 dans la peau (Tableau 6). En

effet, dans des souris présentant un défaut de maturation des cellules B et de la production

d'anticorps (la souche µMT), la grande majorité des L3 sont détruites par une réponse

dominée par les neutrophiles [254]. La déplétion des neutrophiles avec des anticorps

monoclonaux avant l'inoculation des L3 conduit donc a un rendement parasitaire plus élevé

[257,258]. De plus, l'infection de souris présentant un nombre de neutrophiles constitutivement

plus élevé dans la peau (Cxcr4+/1013) conduit à une baisse importante du succès filarien. Cet

effet protecteur est perdu en évitant la phase de migration sous-cutanée des L3 par une

inoculation intraveineuse des larves [257].

Eosinophiles

L'immunisation de souris avec des L3 irradiées induit une réduction du rendement

filarien dans les premiers jours après l'infection avec des L3 saines (Tableau 6 et [259,260]).

Cette immunité protectrice est médiée dans la peau par les éosinophiles et les anticorps dans

les deux jours suivant l'infection [191,253,261]. Par conséquent, l'efficacité de cette méthode

d'immunisation est diminuée à la fois chez les souris μMT, dans lesquelles des éosinophiles

sont recrutés sur le site d'une infection mais ne libèrent pas leurs granules [254], et chez des

souris déficientes en éosinophiles ou en IgE [262]. Le mécanisme effecteur précis déployé par

74

les éosinophiles lors du ciblage des filaires n'est pas entièrement élucidé, l'élimination de

l'EPO ou du MBP entraînent une augmentation du rendement filarien de L. sigmodontis chez

la souris, ce qui suggère un rôle de ces protéines granulaires dans la défense contre les

parasites. On ne sait pas si cela est principalement dû à la réduction de la capacité effectrice

des éosinophiles à dégranuler ou à un mécanisme indirect impliquant des niveaux altérés d'IL-

10, d'IL-5 et / ou d'IL-4 [263].

Cellules dendritiques

Lorsque des L3 de L. sigmodontis sont injectées dans la peau des souris, la chimiokine

CCL17 est libérée par les cellules dendritiques (dendritic cell, DC) via un mécanisme

dépendant de Wolbachia et du TLR2 [264]. CCL17 limite la libération d'histamine par les

mastocytes, molécule qui augmente la perméabilité vasculaire et facilite l'échappement des

larves vers le système lymphatique. De plus, les L3 de B. malayi agissent sur les cellules de

Langerhans (des DC du tissus cutané) humaines conduisant à une diminution de la

prolifération des lymphocytes T CD4+ [265,266]. La stimulation in vitro de macrophages et de

cellules dendritiques par des extraits solubles de B. malayi induit une réponse majoritairement

Th2 et une baisse de leur production de cytokines inflammatoires comme IL-1β, IL-6, IL-12,

et TNF-α [267-269]. A l'inverse, la stimulation de ces cellules avec des composés de Wolbachia

tels que la protéine de surface (WSP) [270] ou des composés lipoprotéiniques diacétylés comme

WoLP (Wolbachia Lipopeptide) sont activés via un mécanisme dépendant de TLR-2/TLR-6

et dans une moindre mesure TLR-2/TLR-1 2006 [268] et ont un phénotype pro-inflammatoire.

5.2 Migration des larves de L. sigmodontis vers la cavité pleurale

Les L3 présentes dans la cavité pleurale sont celles qui ont quitté le site d'inoculation

en migrant via le système lymphatique en passant par les vaisseaux lymphatiques afférents et

les ganglions lymphatiques drainant [10,11] (Kilarski non publié :

http://www.wired.com/wiredscience/2011/08/nikon-small-world-vote-2011/?pid=1861). Des dosages

réalisés sur des surnageants de culture de cellules isolées de ces ganglions 60 heures après

l'inoculation des L3 ont montré une augmentation de la production d'IL-5 et d'IL-6après

restimulation par des extraits bruts filariens. Il semblerait que l'augmentation de l'IL-5

pourrait servir de signal à la filaire pour réaliser la suite de son développement [195,201]. Dès 6

heures après infection, un recrutement de neutrophiles est observé dans le tissu pulmonaire

[271].

http://www.wired.com/wiredscience/2011/08/nikon-small-world-vote-2011/?pid=1861

75

5.3 Réponses immunitaires dans la cavité pleurale lors de la phase pré-patente

Les L3 s'installent dans la cavité pleurale et y réalisent leur croissance et leurs mues

jusqu'au stade adulte. Si le rendement filarien final est établi 8 jours post-infection, des L3 ont

déjà été observées dans la cavité pleurale dès 2 jours après infection [204]. Rapidement, une

réaction inflammatoire de type Th2 se met en place. De nombreuses chimiokines telles que

IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, CCL2 (MCP-1), CCL11 (Eotaxin-1), CCL5 (RANTES) et CXCL12

sont retrouvées dans la cavité pleurale [196,272,273]. Un fort recrutement de cellules est observé

dès J10 [195,274] avec majoritairement des macrophages et des éosinophiles et de lymphocytes

B [195,273,275] (Tableau 6) et un pic trente jours après inoculation des L3. Les neutrophiles sont

très rares avant la phase patente [196].

Initiation de la réponse Th2 dans la cavité pleurale

Le mésothélium pleural réagit rapidement aux infections et peut participer au

recrutement cellulaire dans la cavité pleurale en produisant des cytokines [276]. Lors de

l'infection par L. sigmodontis, il peut produire CXCL12 qui est un chimioattractant des

neutrophiles, des monocytes, des lymphocytes T et des éosinophiles [196] ainsi que CCL11

(Eotaxine-1) et CCL5 (RANTES) qui sont des molécules extrêmement chimiotactiques pour

les éosinophiles [272].

Dès 5 jours après l'infection par L. sigmodontis, le nombre d'ILC2 (cellules

lymphoïdes innées) augmente dans la cavité pleurale, pour atteindre un maximum juste avant

la phase patente autour de 40 jours post-infection [273]. Les ILC2, productrices d'IL-13, d'IL-5

et d'IL-4 [277] pourraient être les initiateurs de la réponse Th2 dans la cavité pleurale.

7 jours après l'infection, une prolifération de Lymphocytes T régulateurs (Treg)

CD4+Foxp3+ a été décrite [278]. Ils sont capables de produire de l'IL-10 [103,279] et la molécule

immunosuppressive CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4) [280].

De plus l'inflammation de la cavité pleurale induite par L. sigmodontis provoque la

formation sur le médiastin et le péricarde de structures lymphoïdes, les FALCs, composées

majoritairement de lymphocytes B et d'ILC2 (FALC : Fat-associated lymphoid cluster /

structures lymphoïdes associés aux graisses) [281]. Les cellules stromales des FALCs

produisent de l'IL-33 qui active les ILC2. Celles-ci produisent ensuite de l'IL-5 induisant

l'activation des cellules B-1 pleurales et la sécrétion locale d'IgM polyréactifs [281]. Les souris

76

BALB.Xid, qui n'ont pas de lymphocytes B-1, sont plus susceptibles que les BALB/c à une

infection par L. sigmodontis [282].

11 jours après infection, une prolifération et une activation des macrophages pleuraux

par le récepteur à l'IL-4 (IL4Rα, qui fixe aussi l'IL-13) sont observées [281]. L'activation du

récepteurs à l'IL-33 (ST2) participe également à l'activation et à la prolifération de ces

macrophages [281]. L'augmentation du nombre de macrophages dans la cavité pleurale ne

provient pas d'un recrutement de monocytes sanguins mais d'une prolifération des

macrophages résidents [283]. Ces macrophages produisent de grandes quantités de molécules

anti-inflammatoires comme le TGF-β, PGE2, l'antagoniste du récepteur à l'IL-1 (IL-1RA) et

l'arginase [277].

L'action combinée des macrophages et des Treg induit une anergie des lymphocytes T

effecteurs (Teff) qui permet une survie accrue des parasites [268,279,284]. Les Teff expriment des

taux élevés d'IL10, de GITR (glucocorticoid induced TNFR-related protein), CTLA-4 et PD-1

(Programmed Death 1) [279,280,285].

Spécificité des souches murines : comparaison des souches BALB/c et C57BL/6

Le rendement filarien reste stable chez les souris BALB/c quasiment jusqu'au début de

la phase patente vers 50-55 jours post infection [196], indiquant que les mécanismes

d'immunosuppression induits par la présence des filaires sont efficaces. Il est aussi probable

que cette immunosuppression joue un rôle important dans la limitation des dommages

tissulaires qui résulteraient d'une trop forte réaction inflammatoire [277]. Chez les souris

C57BL/6, les parasites se développent jusqu'à effectuer leur dernière mue puis les jeunes

adultes meurent vers 40 jours, bien avant d'atteindre la phase patente [195,203].

La réponse immunitaire est différente dans les deux souches de souris. La cinétique du

recrutement cellulaire dans la cavité pleurale est lente mais de forte amplitude chez les souris

C57BL/6 alors qu’elle est rapide et d'amplitude intermédiaire chez les BALB/c [195]. A 30

jours p.i., aucune différence dans les proportions leucocytaires de la cavité pleurale n'est

observée entre les deux souches de souris mais le recrutement cellulaire pleural est plus

important chez les souris C57BL/6. Ceci est associé à une sécrétion plus élevée de

chimiokines inflammatoires comme CCL2, CCL3 et CCL11 et CXCL12 dans le liquide

pleural des souris C57BL/6 [195,196]. Les souris C57BL/6 présentant la mutation Rag2IL-2Rγ-/-,

déficientes en cellules T, B et NK, ont un phénotype semblable à celui des souris BALB/c,

77

atteignant la phase de production de microfilaires, indiquant un rôle important de ces cellules

dans la résistance à l'infection [286].

Chez les souris BALB/c, des granulomes réactionnels sont observés dans la cavité

pleurale à différent temps au cours de l’infection filarienne : entre 8 et 10 jours post-infection

ils sont essentiellement constitués de macrophages et d'éosinophiles; il n'y a que de rares

neutrophiles. Ces granulomes ne contiennent que des exuvies de L3 [202] et il a été suggéré que

ces exuvies pourraient jouer un rôle de leurre contre la réponse de l’hôte. D'autres granulomes

sont retrouvés entre J27 et J39 contenant de nouveau des exuvies, cette fois-ci post mue en

jeunes adultes, et ils sont composés majoritairement d'éosinophiles (70%) mais pas de

neutrophiles [202]. Chez les souris C57BL/6, des granulomes sont aussi retrouvés entre 27 et 39

jours après infection mais autour de jeunes vers adultes. Ils sont aussi composés

majoritairement d'éosinophiles [202].

5.4 Réponse dans la cavité pleurale au cours de la phase patente

Les souris BALB/c développent la phase patente avec production de microfilaires dans

la cavité pleurale environ 55 jours après infection par L. sigmodontis. Seule une partie des

souris infestées (inoculées avec un nombre connu de filaires ou par contact avec des acariens

infestés) devient patente (environ 50%). Il est intéressant de noter que dans les zones

endémiques des filarioses humaines, une fraction des patients concernés par la filariose

lymphatique, la loase et la mansonellose (à M. perstans) est aussi amicrofilarémique

(respectivement jusqu'à 40%, jusqu'à 70% et proportion inconnue) [18,22,62].

Des études chez des individus présentant des infections asymptomatiques par W.

bancrofti ont révélé que les individus Mfpos présentent des réponses immunitaires plus faibles

que les individus Mfneg [287]. Les infections chez les souris BALB/c avec L. sigmodontis

produisent également de animaux Mfpos et Mfneg et les réponses immunitaires entre ces

groupes sont différentes [276] : les souris Mfpos présentent des concentrations d'IL-5 et d'IL13

dans la cavité pleurale plus élevées [288]. La mise en place de la phase patente est déterminée

notamment par des réponses dépendant du TLR-4. En effet, l'infection de souris déficientes en

TLR-4 conduit à un plus grand pourcentage de souris microfilarémiques, sans différences

dans le nombre de microfilaires circulantes [288]. De même, L. sigmodontis dans les souris

C3H/HeJ naturellement déficientes en TLR-4 produit des microfilaires, comparé aux souris


78

C3H/HeN qui ne développent pas de microfilarémie malgré la présence d'adultes dans la

cavité [289].

Deux pics de libération d'histamine dans le sang sont observés lors de l'infection par L.

sigmodontis suivant l'injection sous cutanée de L3 dans des souris BALB/c : la première a lieu

30 minutes après infection, et coïncide avec l'échappement des filaires dans les lymphatiques;

la seconde a lieu après environ 55 jours [290], correspondant au début de la phase patente. La

libération d'histamine favorise la survie des parasites en diminuant les réponses éosinophiles

[290], mais on peut aussi imaginer que l'effet vasodilatateur de l'histamine aide à la sortie des

microfilaires de la cavité pleurale hors de la cavité pleurale par un mécanisme similaire à celui

observé pour les L3 dans la peau [264].

Les éosinophiles, via l'IL5 ont un effet protecteur pour l'hôte (Tableau 6). Les souris

BALB/c déficientes en IL-5 qui ne présentent quasiment aucun éosinophiles, ont un

rendement parasitaire ainsi qu'une microfilarémie plus élevées que les souris sauvages [255,291].

A l'inverse, le rendement parasitaire à J60 dans des souris éosinophiliques (CBA/Ca

surexprimant l'IL-5) est beaucoup plus faible que chez des souris contrôles [292]. L'action des

éosinophiles peut être directe par la sécrétion des protéines de leurs granules dont la

Peroxydase des Eosinophiles (EPO) et la Protéine Basique Majeure (MBP) ou être indirecte

en influençant la réponse cytokinique [263,292,293].

A partir de la phase patente, des neutrophiles sont observés dans la cavité pleurale [202]

et semblent liés à la formation d'un autre type de granulome. Les granulomes observés à partir

de J60 contiennent des filaires adultes mortes et sont composés de macrophages, de

neutrophiles et d'éosinophiles (Tableau 6 et [202,294]). L'arrivée des neutrophiles dans la cavité

pleurale et leur participation à la formation des granulomes semblent liées à leur capacité à

exprimer l'intégrine CD11b, indispensable au trafic des neutrophiles [202]. L'accumulation des

éosinophiles, mais aussi des neutrophiles dans la cavité pleurale est aussi dépendante de l'IL-5

[294]. Enfin la bactérie Wolbachia, relarguée lors de la mort des parasites pourrait aussi être

liée au recrutement et à l'activation des neutrophiles dans la cavité pleurale [17].

80

Figure 14. Coupe transversale de la cavité cavité thoracique.

Schéma représentant une coupe transversale du thorax humain positionnant les poumons, les

plèvres, les systèmes vasculaires et bronchiques et les principaux organes du médiastin. Issu

de [295].

81

6. Rappels anatomiques/histologiques sur les poumons, le cœur et les systèmes

vasculaires

La cavité thoracique contient le poumon et les plèvres et, dans le médiastin, d’autres

structures dont le cœur (Figure 14).

6.1 Plèvre et mésothélium

La plèvre est une membrane séreuse, fine, brillante, glissante, qui tapisse la paroi

thoracique et le médiastin (plèvre pariétale) puis, à partir du médiastin, elle se réfléchit sur

elle-même pour rejoindre le poumon (plèvre viscérale ou pulmonaire) [296]. La plèvre viscérale

recouvre les poumons et s’insinue dans leurs scissures.

L’espace virtuel qui existe entre ces deux feuillets est appelé « cavité pleurale », il

contient un film liquidien de moins de 20µm d'épaisseur, qui permet un glissement sans

friction entre eux [297]. Il joue un rôle important dans la respiration ; en effet la pression

intrapleurale est négative, ce qui permet l'expansion pulmonaire et maintient le couplage

mécanique entre le poumon et la paroi thoracique pendant tout le cycle respiratoire.

Ces plèvres sont bordées par une monocouche de cellules mésothéliales plates

(épithélium pavimenteux) constituant le mésothélium [298]. Il repose sur une mince membrane

basale supportée par des tissus conjonctifs, des fibroblastes et des vaisseaux sanguins et

lymphatiques [299]. Les cellules mésothéliales sont reliées entre elles par des jonctions serrées,

des jonctions communicantes et des desmosomes [297]. Les cellules mésothéliales fournissent

une barrière de protection continue contre les dégâts mécaniques et synthétisent les

glycosaminoglycans et les phospholipides (semblables à celles formant le surfactant

pulmonaires) nécessaires pour lubrifier la surface pleurale.

Le taux de renouvellement des cellules mésothéliales est très faible (moins de 0,5%)

[300]. Cependant, la prolifération cellulaire augmente après une lésion mésothéliale ou une

exposition à des agents inflammatoires, ce qui suggère un rôle des cellules mésothéliales dans

la cicatrisation des plaies et la mise en place de la fibrose pleurale [297].

82

Figure 15. Comparaison de la structure des voies aériennes murines et humaines.

Chez la souris, la trachée a un diamètre interne de ~ 1,5 mm. Les anneaux de cartilage (bleu)

ne sont présents que dans les voies aériennes extrapulmonaires alors que chez l'homme, le

cartilage s'étend sur plusieurs générations de bronches dans les poumons. Les glandes sous-

muqueuses, qui produisent des mucines et d'autres facteurs, se limitent à la trachée chez la

souris mais pénètrent profondément dans le poumon humain. Il y a plus de générations de

bronches intrapulmonaires l'homme. Les bronchioles terminales ne se divisent en bronchioles

respiratoires que chez l'homme avant de s'organiser en conduits alvéolaires et en alvéoles

(chez l'homme et la souris). Adapté de [301].

83

6.2 Le poumon, les bronches, les bronchioles et les cellules alvéolaires de type I et

II

La trachée va du larynx vers la cage thoracique où elle se ramifie en deux bronches

principales pénétrant dans chacun des deux poumons (droit et gauche) au niveau du hile. Les

deux bronches principales se divisent et vont subdiviser les poumons droit et gauche en

différents lobes [302]. Suivant les espèces, le nombre de lobes de chaque poumon diffère. Chez

l'homme le poumon droit présente 3 lobes et le gauche 2; chez la souris le poumon droit

présente 4 lobes et le gauche ne présente pas de lobation [303]. Après un certain nombre de

division successives (17-21 générations chez l'humain, 13–17 chez la souris) les bronches

cèdent la place aux bronchioles, qui sont plus petites. Les bronches ont une paroi épaisse

contenant des amas cartilagineux ainsi qu'une couche de cellules musculaires lisses. Les

bronches humaines présentent aussi des glandes séro-muqueuses sous-épithéliales absentes

chez la souris. Les bronchioles ont une paroi plus fine sans cartilage (Figure 15).

Les bronches et les bronchioles présentent un épithélium ciliaire, plus épais dans les

bronches, dont les cils battent de manière coordonnée pour pousser une couche de mucus vers

le pharynx, où elle est avalée ou éliminée par la toux. Ce système joue un rôle important dans

l'élimination de particules inhalées et de microorganismes qui se déposent sur les muqueuses

des voies aériennes [302]. La composition de cet épithélium varie suivant la taille des

bronches/bronchioles et présente des différences suivant les espèces. Globalement, les mêmes

types cellulaires forment l'épithélium des voies respiratoires, mais la proportion relative de

chaque type de cellule varie. Quatre types cellulaires composent l'épithélium des voies

aériennes : 1) les cellules ciliées sont prédominantes ; 2) les cellules caliciformes qui

produisent le mucus ; elles sont abondantes dans les voies aériennes inférieures chez l'humain

mais très rares chez la souris en condition homéostatique ; 3) les cellules Club (ou Clara) sont

des cellules sécrétoires qui produisent des composés antimicrobiens qui contribuent à la

défense de la muqueuse des voies respiratoires ; 4) les cellules basales ont la capacité de

proliférer en réponse à des dommages et de se différencier en d'autres types de cellules

épithéliales [304].

84

Les bronchioles terminales se divisent en bronchioles respiratoires (chez l'humain et

non chez la souris- Figure 15) puis en conduits alvéolaires et enfin en alvéoles. Les poumons

d'un homme de 70kg ont 300 millions d'alvéoles représentant une surface d'environ 143 m2

pour un volume pulmonaire moyen de 4,3L [296,302]. 200 ml de sang se trouvent dans le réseau

capillaire à tout moment. On estime qu'environ 90% de la surface alvéolaire est recouverte par

le réseau des capillaires pulmonaires, ce qui correspond une interface air-sang d'environ 126

m2 [302]. Chez la souris, il y a environ 2 millions d'alvéoles avec une surface alvéolaire de 82,2

cm2 pour un volume pulmonaire moyen de 0,3 mL [305].

Il existe deux types de cellules de revêtement

alvéolaire (Figure 16). Les cellules alvéolaires de type I,

ou pneumocytes de type I, ont un noyau plat central et un

grand cytoplasme qui atteint 50 μm de diamètre pour une

épaisseur de seulement 0,2-0,5 μm permettant les

échanges gazeux. Ces cellules constituent seulement 40%

des cellules alvéolaires mais couvrent 90% de la surface

alvéolaire. Les cellules de type II, ou pneumocytes de type

II, sont des cellules cuboïdales d'un diamètre d'environ 15

μm ; elles constituent 60% des cellules des alvéoles, mais

couvrent seulement 5% de la surface alvéolaire ; elles

deviennent hyperplasiques lors de dégâts alvéolaires [296].

La surface alvéolaire est recouverte d'une couche de

surfactant (composé majoritairement de phospholipides),

qui est synthétisé et libéré par la cellule alvéolaire de type

II.

Figure 16. Structure des alvéoles.

L'épithélium alvéolaire est composé de pneumocytes de type I présentant un noyau plat

central et un grand cytoplasme et de pneumocytes de type II, cellules cuboïdales produisant le

surfactant recouvrant la surface alvéolaire. La barrière alvéole-capillaire est très fine (environ

0,6µm) et permet les échanges gazeux. Les macrophages alvéolaires sont le type majoritaire

de l'espace alvéolaire à l'homéostasie.

85

6.3 Vaisseaux sanguins et lymphatiques pulmonaires

6.3.1 Vascularisation sanguine pulmonaire

La circulation sanguine pulmonaire est constituée de deux systèmes circulatoires

d'origine différente : la circulation pulmonaire et la circulation bronchique, les deux systèmes

étant communicants.

La circulation pulmonaire

Les veines caves supérieure et inférieure collectent le sang veineux au niveau du

ventricule droit qui rejoint l’artère pulmonaire qui se divise en artère pulmonaire gauche et

droite. Les artères pulmonaires apportent aux poumons plus de 90% de leur irrigation sous la

forme de sang de type veineux, peu oxygéné, perfusé sous basse pression. Les artères

pulmonaires suivent étroitement l'arbre bronchique et émettent des ramifications s'achevant

dans les sacs alvéolaires où elles forment de vastes réseaux capillaires enveloppant les

alvéoles, siège principal de l'hématose (oxygénation de sang) (Figure 17- points 1 à 5).

La paroi des capillaires est seulement constituée de quelques cellules endothéliales.

Les lames basales des cellules alvéolaires et de l'endothélium sont confondues, conduisant à

une barrière alvéole-capillaire d'une épaisseur moyenne de 0,6µm [296]. Le diamètre des

capillaires est compris entre 5 et 8 µm [306-308]. Les réseaux capillaires alvéolaires se

condensent ensuite en veines qui vont confluer vers les veines pulmonaires gauche et droite

qui se rejoignent dans l’oreillette gauche.

Les artères pulmonaires sont d'abord des artères élastiques avec une paroi relativement

mince et une adventice épaisse, puis des artères musculaires avec deux limitantes élastiques,

interne et externe. Ensuite, la couche musculaire s'amincit puis disparaît dans les vaisseaux

précapillaires de 30 à 40µm de diamètre. Il y a peu de différences entre artères et veines dans

la circulation pulmonaire, en raison de la minceur de la paroi artérielle, correspondant à la

faible pression sanguine. Les veines, cependant n'ont qu'une limitante élastique interne et elles

ne s'entourent de fibres musculaires qu'au dessus d'un diamètre de 100µm.

86

Figure 17. Circulations sanguines pulmonaire et bronchique.

Circulation pulmonaire : les veines caves supérieure et inférieure collectent le sang veineux au

niveau du ventricule droit (1) qui rejoint l’artère pulmonaire qui se divise en artère

pulmonaire gauche et droite. Les artères pulmonaires (2) apportent aux poumons plus de 90%

de leur irrigation sous la forme de sang de type veineux, peu oxygéné, perfusé sous basse

pression. Les artères pulmonaires suivent étroitement l'arbre bronchique dans la gaine

périvasculaire et émettent des ramifications s'achevant dans les sacs alvéolaires où elles

forment de vastes réseaux capillaires enveloppant les alvéoles (3), siège principal de

l'hématose (oxygénation de sang). Les réseaux capillaires alvéolaires se condensent ensuite en

veines (4) qui vont confluer vers les veines pulmonaires gauche et droite qui se rejoignent

dans l’oreillette gauche du cœur (5). Circulation bronchique : les artères bronchiques naissent

de l'aorte ou des artères intercostales. Elles conduisent du sang oxygéné à haute pression dans

le poumon. Les artères bronchiques suivent aussi les ramifications des bronches et se

terminent au niveau des bronchioles émettant tout au long de leur trajet des rameaux qui vont

former les réseaux capillaires péribronchiques (6) et sous-pleuraux (7). La majorité du sang

des capillaires péribronchiques est ensuite drainée vers les veines pulmonaires (8).

87

La circulation bronchique

Les artères bronchiques naissent de l'aorte ou des artères intercostales. Elles

conduisent du sang oxygéné à haute pression dans le poumon. C'est la circulation nutritive de

l'arbre bronchique (Figure 17- point 6-8).

Les artères bronchiques suivent aussi les ramifications des bronches et se terminent au

niveau des bronchioles émettant tout au long de leur trajet des rameaux qui vont former les

réseaux capillaires péribronchiques et sous-pleuraux. A leur extrémité, ces capillaires

communiquent avec le réseau capillaire alvéolaire, assurant ainsi une connexion (anastomose)

entre les réseaux artériels bronchique et pulmonaire. La majorité du sang des capillaires

péribronchiques est ensuite drainée vers les veines pulmonaires. Des veines bronchiques

autonomes existent seulement au niveau des plus grosses bronches ; les veines pulmonaires

collectent donc la majeure partie du sang des plexus péribronchiques [306].

6.3.2 Les lymphatiques des poumons et de la plèvre : le système

pleuropulmonaire

Les lymphatiques du thorax drainent les liquides du tissu interstitiel pulmonaire et de

la cavité pleurale. Pourvus de valves empêchant leur reflux, ils les conduisent vers la

circulation sanguine, soit directement dans les confluents veineux sous-claviers, soit via le

canal thoracique. Ils forment des courants ascendants pariétaux et viscéraux anastomosés

entre eux. Les courants pariétaux drainent la lymphe de la paroi thoracique et de la cavité

pleurale. Les courants viscéraux drainent celle des poumons et des organes présents dans le

médiastin. Le canal thoracique monte au niveau du médiastin postérieur et s’abouche en

général dans le confluent veineux sous-clavier gauche. Il reçoit une partie de la lymphe du

thorax et draine celle des membres inférieurs et du tronc. La moitié, voire les deux tiers, de la

lymphe du canal thoracique provient du foie et du tube digestif.

Réseau lymphatique de la plèvre diaphragmatique

Il est particulièrement riche et dense et les vaisseaux drainent la lymphe vers les chaînes

mammaires internes médiastinales et aussi vers les ganglions cœliaques à partir desquels ils

rejoignent l’origine du canal thoracique [309].

88

Figure 18. Réseau lymphatique de la cavité pleurale et drainage du liquide pleural.

Les vaisseaux lymphatiques de la plèvre pariétale fournissent un drainage des espaces

interstitiels mais aussi de la cavité pleurale, puisqu'ils s'ouvrent directement sur la plèvre

pariétale (stomates). Le réseau lymphatique de la plèvre viscérale ne se connecte pas avec la

cavité pleurale. Issu de [310].

89

Réseau lymphatique de la plèvre pariétale (paroi costale)

Le réseau lymphatique est très important notamment au niveau de la moitié inférieure et

postérieure de la paroi costale. Les vaisseaux lymphatiques sous-pleuraux se connectent

ensuite aux chaînes pariétales mammaires internes et aux courants ascendants latéro-

vertébraux.

Réseau lymphatique de la plèvre médiastinale (et péricardique)

Les capillaires et vaisseaux lymphatiques sont surtout facilement mis en évidence au niveau

du péricarde où les drainages se font vers les chaînes ganglionnaires du médiastin [311].

Réseau lymphatique de la plèvre viscérale pulmonaire

La plèvre viscérale possède un réseau lymphatique étendu. Les vaisseaux lymphatiques qui en

sont issus peuvent rejoindre les chaînes ganglionnaires du médiastin soit en restant sous-

pleuraux soit en se connectant au réseau lymphatique du poumon [312].

Réseau lymphatique et communications avec la cavité pleurale

Les vaisseaux lymphatiques de la plèvre viscérale ne se connectent pas avec la cavité pleurale

(Figure 18). En revanche, la plèvre pariétale et la plèvre diaphragmatique sont dotées de

stomates [313], orifices de 8 à 10 µm qui sont des abouchements directs des capillaires

lymphatiques sous-jacents. La cavité pleurale est ainsi directement drainée par le système

lymphatique (Figure 18).

Les lymphatiques du poumon

La lymphe issue de l’interstitium est véhiculée par des vaisseaux qui prennent

naissance au niveau des alvéoles pulmonaires sous forme de capillaires lymphatiques. Les

lymphatiques partent des segments pulmonaires et remontent le long des axes broncho-

artériels et des veines pulmonaires pour rejoindre le médiastin. Au long de ce parcours les

capillaires évoluent en vaisseaux collecteurs lymphatiques, valvulés et pulsatiles, et qui

véhiculent la lymphe de façon active. Dans le médiastin, ils poursuivent un trajet ascendant

pour aller s’aboucher dans la circulation veineuse au niveau de la veine sous-clavière. Ils

traversent des ganglions dans la plupart des cas. Toutefois, ces ganglions sont irrégulièrement

échelonnés le long de leur trajet et les lymphatiques peuvent avoir des trajets directs

aganglionnaires. Ainsi dans 20 à 35 % des cas, selon le segment pulmonaire drainé, la lymphe

se rend directement au médiastin sans traverser de ganglion intrapulmonaire [314].

90

6.4 Espace périvasculaire

Dans le poumon, les bronches, les artères pulmonaires, et les vaisseaux lymphatiques

passent dans une gaine interstitielle commune [306] ou espace périvasculaire (PVS,

« PeriVascular Space »). C'est un tissu conjonctif composé d'un ensemble de composants de

matrice extracellulaire (ECM) tels que du collagène, de l'élastine, de la fibronectine, des

protéoglycans comme le versican, et des polysaccharides comme de l'acide hyaluronique [315-

317]). Il contient aussi des fibroblastes et des macrophages [318]. Cet espace a un rôle évident de

structure dans le maintien de l'architecture du poumon mais semble aussi avoir un rôle

immunitaire important [317]. Une accumulation de leucocytes est souvent notifiée dans le PVS

dans des modèles animaux d'infections pulmonaires, de fibroses ou de réactions allergiques

[319-323].

Les fibres de collagène présentes dans le PVS pourraient offrir un point d'accroche

permettant aux leucocytes de traverser la paroi épaisse des artères et des veines pulmonaires

[321]. Au cours de l'inflammation pulmonaire aiguë, l’ECM se remodèle pour permettre

l'infiltration de leucocytes. Cette ECM provisoire implique l'accumulation d'acide

hyaluronique et de versican, qui, ensemble, forment une matrice permettant l'entrée des

leucocytes et l'expansion des cellules stromales résidentes [316,317]. Le blocage du principal

récepteur à l'acide hyaluronique, le CD44, induit une baisse de l'accumulation d'éosinophiles

dans un modèle d'asthme [324,325]. Les souris déficientes en versican ne présentent pas

d'infiltrats périvasculaires dans un modèle d'inflammation pulmonaire induite chimiquement

[316]. De plus, le versican aurait aussi un rôle dans le contrôle de l'inflammation : il peut fixer

de nombreuses chimiokines, ce qui permettrait de contrôler leur disponibilité [317,326,327].

91

6.5 Les macrophages pulmonaires

Au moins deux populations de macrophages sont présentes dans les poumons : les

macrophages alvéolaires (Alveolar macrophage, AM) et les macrophages interstitiels

(Interstitial macrophage, IM) [318,328,329] (Tableau 7).

Les AM sont localisés dans les alvéoles - où ils représentent 90 à 95% du contenu

cellulaire à l'homéostasie - ainsi que dans le mucus des voies respiratoires plus grandes [304].

Étant donné qu'il y a plusieurs millions d'alvéoles et seulement environ un à deux millions

d'AM dans un poumon de souris, toutes les alvéoles ne contiennent pas d'AM ; en effet, un

seul AM est détecté pour environ trois alvéoles. Cependant les AM peuvent se déplacer entre

les alvéoles à travers des pores de liaison dits "pores de Kohn" [328]. Leur rôle principal est de

cataboliser le surfactant, d'éliminer les particules, les cellules apoptotiques et les débris

cellulaires des alvéoles afin de maintenir la fonction pulmonaire [304,330]. Les AM reçoivent

constamment des signaux de régulation négative des cellules de l'épithélium alvéolaire ; Ces

signaux comprennent le CD200, une protéine membranaire exprimée par les cellules

épithéliales, le TGF-ß et l'IL-10, qui empêchent l'activation des macrophages alvéolaires

[304,331]. Les AM produisent aussi du TGF-β qui entraîne la génération de cellules Foxp3 +

iTreg à partir de cellules T CD4+ naïves, ces cellules induisant une tolérance aux antigènes

inhalés. Ce processus se produit dans le tissu pulmonaire et non dans les ganglions

lymphatiques drainants et dépend de la présentation de l'antigène par les AM, et non par les

DC [328]. Lors de l'infection, la régulation négative qui contraint normalement l'activation des

AM est perdue (en raison notamment de la mort des cellules épithéliales). Les AM mettent

alors en œuvre des mécanismes de signalisation [304] pour induire le passage d'un mode de

tolérance à un mode inflammatoire via la sécrétion d'IL-1, d'IL-6, de TNF-α et de TGF-β [328].

Les AM ont un rôle majeur dans la défense contre les infections et dans la prévention des

lésions pulmonaires aiguës par la limitation des dommages tissulaires et leur réparation après

l'infection. La capacité phagocytaire des AM augmente considérablement lors des infections,

grâce notamment aux collectines SP-A, SP-D et C1q, présentes dans le surfactant pulmonaire

qui peuvent se fixer sur les pathogènes et les cellules apoptotiques [332].

92

Macrophage

Marqueur Alvéolaire Interstitiel 1 Interstitiel 2 Interstitiel 3

CD68 + + + +

CD64 + + + +

F4/80 + + + +

CD206 + + + faible

CD169 + + + -

SiglecF + - - -

CD11c + - - +

CX3CR1 - ++ ++ ++

CD11b - + + +

CMHII - faible + +

Tableau 7. Phénotype des macrophages pulmonaires.

Expression relative de différents marqueurs de surface permettant de discriminer les

populations de macrophages pulmonaires. + : molécule exprimée ; ++ : molécule exprimée

fortement ; faible : molécule exprimée faiblement ; - molécule non exprimée. D'après [318].

CD68 : macrosialine, membre des récepteurs" Scavenger".

CD64 : récepteur à la partie Fc des IgG (FcγRIA).

F4/80 : EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1 (EMR1).

CD206 : récepteur au mannose.

CD169 : Siglec1/sialoadhesine, récepteur aux acides sialiques.

SiglecF : récepteur aux acides sialiques.

CD11c : intégrine αX, protéine d'adhésion.

CX3CR1 : récepteur de CX3CL1.

CD11b : intégrine αM, protéine d'adhésion0

CMHII : complexe majeur d'histocompatibilité de classe 2.

93

Les collectines présentent deux parties : une partie lectine qui se fixe sur les

polysaccharides et une queue collagéneuse, reconnue par le récepteur CD91 des macrophages

[328,332].

Les macrophages interstitiels (IM) ne sont pas bien caractérisés, en partie à cause des

difficultés d'identification et d'isolement [318,333]. Une étude récente suggère que les IM

pulmonaires sont situés dans l'interstitium bronchovasculaire (c’est-à-dire l’espace

périvasculaire ou le PVS) et non dans l'interstitium alvéolaire [318]. Cette étude décrit 3

populations d'IM qui s'auto-renouvèlent et présentent des marqueurs et des profils

transcriptomiques différents (Tableau 7). Deux de ces populations ont un phénotype assez

similaire, avec des capacités de phagocytose et une expression du marqueur CD169. Ces

populations de macrophages CD169+ s'accroissent lors de l'infection par Schistosoma mansoni

[334] et sont présentes à proximité des Tissus Lymphoïdes Associés aux Bronches (BALT) [335].

94

Figure 19. Résumé des principales pathologies pulmonaires.

De nombreux facteurs infectieux et non infectieux peuvent induire des pathologies

pulmonaires. Les pathologies infectieuses peuvent être d'origine virale, bactérienne, fongique

ou parasitaire. Les pathologies non infectieuses sont d'origine environnementale, génétique ou

tumorale.

COPD : Chronic Obstructive Pulmonary Disease / broncho-pneumopathie chronique

obstructive

ARDS : Acute respiratory distress syndrome / syndrome de détresse respiratoire aiguë

RSV : respiratory syncytial virus / virus respiratoire syncytial

TRALI : transfusion related acute lung injury / Œdème pulmonaire lésionnel post-

transfusionnel

95

7. Dommages pulmonaires dus aux anchylostomes

Les poumons, de par leur situation à l'interface entre le milieu extérieur et le sang sont

constamment exposés à des particules dangereuses ou des agents infectieux. Cependant, très

peu d'informations sont disponibles pour les filarioses mais de nombreuses pathologies sont

bien décrites (Figure 19), y compris des pathologies parasitaires à nématodes, dont les

anchylostomes.

7.1 Cycle de vie des anchylostomes

Les anchylostomes (dont Necator Americanus et Anchylostoma duodenale chez

l'humain, Anchylostoma caninus chez le chien et Nippostrongylus brasiliensis chez les

rongeurs) sont des nématodes gastro-intestinaux de mammifères [4]. Les larves infestantes

(L3) sont très mobiles. La contamination se fait par voie transcutanée et les larves migrent

dans l’organisme humain pour devenir adultes dans la région duodéno-jéjunale. La migration

des L3 vers les intestins de leur hôte implique un passage pulmonaire [336]. Les L3 pénètrent

activement dans la peau et il est suggéré que les L3 entrent dans les vaisseaux sanguins et sont

ainsi acheminées via le cœur droit aux poumons [277,337] ; toutefois une entrée dans les

vaisseaux lymphatiques de la peau a été décrite chez le chien [338], ce qui suggère que les L3

pourraient rejoindre la circulation sanguine via le canal thoracique. Les parasites seraient

bloqués dans les capillaires pulmonaires et ils en sortiraient activement pour entrer dans le

parenchyme ; en effet, des hémorragies (pétéchies) sont observées sur les poumons de souris

infestées par N. brasiliensis entre 1 et 3 jours après infection [277,339,340]. Les L3 sont

retrouvées dans des alvéoles partiellement détruites présentant des hémorragies. Là, elles

subissent une mue (L4) et, après 48 h, elles remontent les voies respiratoires et la trachée, où

elles sont toussées et avalées par l'hôte [336]. Elles continuent leur développement dans le tube

digestif où les adultes se reproduisent et pondent leurs œufs [277].

96

Figure 20. Réponses pulmonaires lors de l'infestation par Nippostrongylus brasiliensis.

Synthèse des résultats présentés dans ce chapitre :

Les L3 de Nippostrongylus brasiliensis pénétrant dans la peau rejoingent la circulation

sanguine, qui les achemine vers les capillaires pulmonaires. Les parasites bloqués dans les

capillaires en sortent activement pour rejoindre les alvéoles en induisant des hémorragies. La

rupture de l’endothélium et de l'épithélium alvéolaire est associée à la libération d’alarmines

et à la sécrétion d'IL-1β, conduisant au recrutement de neutrophiles qui amplifient les

hémorragies. Parallèlement au recrutement des neutrophiles, l’IL-33, l’IL-25 et TSLP

produites par les cellules épithéliales conduisent au recrutement et à l'activation des cellules T

CD4+ et des cellules lymphoïdes innées de type 2 (ILC2). Les cytokines de type 2 IL-4, IL-13

et IL-5 augmentent dans le tissu pulmonaire entraînant un afflux d'éosinophiles et de

macrophages. Les macrophages alvéolaires prolifèrent et deviennent alternativement activés

par l'engagement du récepteur à l'IL-4 (Mϕ(IL4)). Les Mϕ(IL4) produisent RELMα, Arginase

1 (Arg-1), et Ym-1. Si les premiers inhibent la production d'IL-17 limitant ainsi l'afflux de

neutrophiles et les dommages tissulaires, Ym-1 semble promouvoir la production d'IL-17A.

Ces molécules participent aussi à la réparation des tissus lésés. Dans les alvéoles, les

macrophages, les neutrophiles et les éosinophiles participent au contrôle des parasites en

association avec les protéines du surfactant (SP-A et SP-D).

Dans les alvéoles, les L3 muent en L4 et, après 48 h, elles remontent les voies respiratoires et

la trachée, où elles sont toussées et avalées par l'hôte.

97

7.2 Neutrophiles et amplification de la pathologie pulmonaire.

Au fur et à mesure que les larves traversent le poumon, la rupture de l’endothélium et

de l'épithélium alvéolaire est associée à la libération d’alarmines (« motifs moléculaires

associés au danger » ou DAMP) et à la sécrétion d'IL-1β par les cellules épithéliales des voies

respiratoires. Les niveaux d'IL-17A augmentent rapidement dans les poumons des souris

infestées par N. brasiliensis. La fixation de l'IL-17 sur son récepteur à la surface des cellules

épithéliales induit la production de chimiokines telles que l'IL-8 ou CXCL1, qui ont un fort

pouvoir chimiotactique sur les neutrophiles [341]. Il s'ensuit donc un recrutement important de

neutrophiles sur le lieu de l'infection [339,342] (Figure 20). La déplétion des neutrophiles avant

infection augmente le rendement parasitaire, mais diminue l'intensité des lésions tissulaires et

les hémorragies [339,343]. Ainsi, les neutrophiles ont un effet anti-parasitaire mais au prix d'une

pathologie pulmonaire accrue [342]. Les molécules impliquées dans l'exacerbation de la

pathologie induite par les neutrophiles ne sont pas connues, cependant la myelopéroxydase

(MPO, qui catalyse la formation d'espèces réactives de l'oxygène) des neutrophiles est

nécessaire à l'élimination des larves [343,344]. Ce stress oxydatif pourrait induire des dommages

collatéraux sur les tissus environnants. Le nombre de neutrophiles culmine 2 jours après

infection et retrouve son niveau normal dès 7 jours après infection [320].

7.3 Macrophages : contrôle de sous populations de parasites et réparation des

tissus

Parallèlement au recrutement des neutrophiles, l’IL-33, l’IL-25 et TSLP produites par

les cellules épithéliales conduisent au recrutement et à l'activation des cellules T CD4+ et des

cellules lymphoïdes innées de type 2 (ILC2) [340,345-347]. Les cytokines de type 2 IL-4, IL-13,

IL-9 et IL-5 augmentent dans le tissu entraînant un afflux d'éosinophiles et de macrophages 4

jours après infection, notamment dans l'espace périvasculaire [320,348]. Les macrophages

alvéolaires prolifèrent et deviennent alternativement activés par l'engagement du récepteur à

l'IL-4 (IL-4Rα / ces macrophages sont notés Mϕ(IL4)) [277,344,346,349]. De plus des molécules

comme les Protéines du Surfactant (SP)-A et SP-D augmentent dans le liquide alvéolaire. Ces

molécules participent à l'activation des macrophages mais aussi à l'élimination des parasites et

à la réparation des tissus [346,349]. SP-D peut se fixer aux carbohydrates présentes à la surface

des L4 et aide les macrophages alvéolaires à tuer les parasites en agissant comme une

opsonine [346]. De même, l'absence de SP-A entraîne des rendements parasitaires plus élevés

98

ainsi que des dommages tissulaires exacerbés [349]. SP-A augmente l'activation et la

prolifération des macrophages médiées par l'IL-4 et favorise la réparation des tissus [349].

Les macrophages sont indispensables à la réparation des tissus après une blessure [350].

La suppression des macrophages dans les souris infestées par N. brasiliensis exacerbe les

hémorragies causées par la migration du parasite et entraîne des lésions pulmonaires plus

sévères [339]. Les Mϕ(IL4) produisent RELMα, Arginase 1 (Arg-1), et Ym-1 [277]. Si les

premiers inhibent la production d'IL-17 limitant ainsi l'afflux de neutrophiles et les dommages

tissulaires, Ym-1 semble promouvoir la production d'IL-17A [339,342]. L'arginase convertit

l'arginine en ornithine, qui peut servir de précurseur pour la synthèse de la proline et

l'hydroxyproline, constituants centraux du collagène nécessaire à cicatrisation. L'arginase est

également anti-inflammatoire car elle est en concurrence pour l'arginine avec iNOS

(produisant l'oxyde nitrique) [350]. La phase de cicatrisation est caractérisée par une

prolifération et une différenciation cellulaires visant à remplacer les cellules détruites, ainsi

que par la création de matrice extracellulaire (ECM) et le dépôt de collagène par les

fibroblastes pour supporter les nouvelles cellules [350].

Cependant, malgré une réparation rapide des tissus, une inflammation pulmonaire persiste

pendant plus de 300 jours après l'infection, soit bien après que les parasites aient été éliminés

par les souris [351].

99

OBJECTIFS DE LA THESE

L'objectif principal de cette étude est de caractériser les interactions qu'entretiennent

les filaires avec l'environnement pulmonaire dans le modèle murin de filariose Litomosoides

sigmodontis lors de deux phases de l'infection :

1. Lors de la phase précoce de l'infection (0h - 12 jours post-infection)

2. Lors de la phase chronique de l'infection (55 jours - 100 jours post-infection)

Les objectifs spécifiques sont :

- Décrire la migration pulmonaire des L3 de L. sigmodontis

- Analyser la réponse inflammatoire/immunitaire associée à cette phase précoce de

l'infection

- Comprendre la fonction des neutrophiles dans cette réponse inflammatoire en étudiant

les NETs

- Préciser le rôle de l'alarmine S100A9 et de l'héterodimère S100A8/S100A9

(calprotectine) lors de la phase précoce et pré-patente de l'infection par L. sigmodontis

- Décrire la pathologie pulmonaire observée en phase patente

- Analyser la réponse inflammatoire/immunitaire associée à la phase patente de

l'infection

- Définir les différences entre souris microfilarémiques et souris amicrofilarémiques

101

MATERIEL ET METHODES

102

1. Éthique

Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées en conformité avec la Directive

UE 2010/63 / UE et la législation nationale, à savoir le Décret n ° 2013-118 du 1er février

2013, du Ministère de l'Agriculture, de l'Agroalimentaire et de la Forêt". Les protocoles ont

été approuvés par le comité d'éthique du Musée national d'histoire naturelle (68-002) et par la

Direction départementale de la protection des populations (n ° C75- 05-15).

2. Parasites, souris et inoculation des larves /L3 de L. sigmodontis

2.1 Maintien du cycle de Litomosoides sigmodontis

Le cycle de la filaire Litomosoides sigmodontis est maintenu au laboratoire en utilisant

comme vecteur l'acarien hématophage Ornithonyssus bacoti et comme hôte réservoir la

gerbille Meriones unguiculatus [9].

L'élevage d'O. bacoti est maintenu à une température de 26-28°C et une humidité

relative de 60-80% sur des gerbilles saines. Les gerbilles « réservoir » (males ou femelles, 6-8

semaines) sont infestées par une dose de 80 L3 injectées en intrapéritonéal sous 200µL de

RPMI 1640 additionné 25 mM d'Hépès (Eurobio) avec une aiguille 23G (Terumo, Neolus).

Après 3 mois d'infection, un prélèvement 10µl de sang au sinus rétro-orbital est réalisé pour

évaluer la microfilarémie (charge en microfilaires sanguines) ; le sang est étalé sur une lame

de verre, coloré au GIEMSA (solution d'azur éosine-bleu de méthylène, MERCK) à 10% et

les microfilaires sont comptées à l’aide d’un microscope optique. Les gerbilles présentant les

microfilarémies les plus fortes (>1000 mf/10µL) sont utilisées pour infecter les acariens. Pour

ce faire, des acariens sains sont prélevés et mis à jeûner 5 à 7 jours avant contact avec la

gerbille infestée. Le gorgement des acariens s'effectue sur une nuit. Les acariens sont ensuite

récupérés dans des tubes en verre fermés par du coton (50 acariens par tube) et placés dans

une chambre humide (28°C, 80% d'humidité) pendant au moins 12 jours pour obtenir des L3

et avant 19 jours pour limiter la mortalité des acariens infectés. Les acariens infestés de 12-19

jours sont placés dans une boite de Pétri en verre de 5cm de diamètre avec du RPMI 1640

contenant 25 mM d'Hépès et disséqués avec des pinces fines sous une loupe binoculaire pour

que les L3 soient libérées. Les L3 sont récoltées à l’aide d’une pipette Pasteur en verre effilée

pour constituer les doses infectantes.

103

2.2 Les souris

2.2.1 Souris BALB/c

Des souris femelles de la lignée consanguine BALB/c (Envigo) âgées de 6 à 8

semaines ont été utilisées. La lignée BALB/c est la plus sensible à l'infection par L.

sigmodontis et environ 50% des souris développe une phase patente (présence de microfilaires

dans le sang à partir de 55 jours après infection [203] suite à une injection en sous-cutané. Les

souris BALB/c femelles présentent une microfilarémie plus élevée que les souris BALB/c

mâles [194]. Les souris sont maintenues dans les installations du MNHN avec un cycle lumière

/ obscurité de 12 heures.

2.2.2 Souris BALB/c IL-4Rα-/-/IL-5-/-

Des souris BALB/c doublement déficientes en IL-5 et pour la chaîne α du récepteur à

IL-4 (IL-4Rα-/-/IL-5-/-) ont été utilisées [352-354]. Les souris mâles et femelles âgées de 6 à 10

semaines ont été retenues. Les couples reproducteurs initiaux proviennent de l’Université

clinique de Bonn en Allemagne (Dr Marc Huebner) et les souris sont maintenues et

reproduites dans les installations du MNHN. Ces souris sont extrêmement sensibles à

l'infection et présentent des microfilarémies très élevées (Marc Huebner, communication

personnelle).

2.2.3 Souris C57BL/6 S100A9-/-

Des souris C57BL/6 déficientes en S100A9 (S100A9-/-) [355] mâles et femelles, âgées

de 6 à 10 semaines, ont été utilisées à l’Institut de Microbiologie Médicale, d'Immunologie et

de Parasitologie de l'Université clinique de Bonn, où ont eu lieu les expériences en

collaboration avec le Dr Marc Huebner.

2.3 Inoculation aux souris

Les L3 ont été inoculées soit :

- par injection de 40 L3 en sous-cutané sous 0.2 mL de RPMI au niveau de la région lombaire

gauche

- par injection de 40 L3 en intraveineuse caudale sous 50 µL de RMPI.

- par transmission pendant le repas sanguin de l'acarien O. bacoti ("infection naturelle") : la

moitié d’un lot d’acariens est mis en contact avec un groupe de souris pendant 12heures [9]. La

deuxième moitié du même lot d’acarien a été disséqué sous une loupe binoculaire pour

104

évaluer le nombre moyen de L3 par acarien. Comme il a été démontré précédemment

qu'aucune L3 ne reste dans les acariens pendant leur repas sanguin [9], cela nous a permis

d'évaluer le nombre de L3 inoculées par souris.

La cinétique de l'infection a été suivie pendant 100 jours post infection. Les souris ont

été sacrifiées à 2 heures, 6 heures, 4 jours, 6 jours, 8 jours, 12 jours, 14 jours, 30 jours, 70

jours et 100 jours après l'inoculation (p.i.)

2.4 Suivi de la microfilarémie des souris

La microfilarémie est mesurée 60 et 70 jours post-infection. Une goutte de 10 µL de

sang est prélevée soit au sinus rétro-orbital (J60 p.i. et J70 p.i.) ou dans le cœur (J70 p.i. et

J100 p.i.) et déposée sur une lame en verre. La goutte est tournée énergiquement et étalée avec

le coin d'une lame en verre afin d'empêcher la coagulation (défibrination) pour créer une zone

d’environ 15mm de diamètre. La lame est ensuite séchée à l'étuve. Les hématies sont éclatées

en mettant les lames dans l'eau du robinet pendant 2 à 3 minutes et la goutte épaisse est fixée

par un court bain dans du méthanol.

Les lames sont ensuite colorées dans une solution de GIEMSA (solution d'azur éosine-

bleu de méthylène, MERCK) à 10% (solution tampon : hydrogénophosphate disodique à

0,5g/L + phosphate de potassium monopotassique à 0,2g/L), rincées à l'eau et séchées à

l'étuve.

3. Autopsie des souris, collecte des filaires, prélèvement et fixation des poumons

3.1 Exsanguination et préparation du sérum

Les souris sont euthanasiées par exsanguination totale au sinus rétro-orbital. Le sang

est recueilli dans des tubes de 1,5 mL. Après 30 minutes minimum et 1h maximum pour

permettre la coagulation, le sang est centrifugé (16 000g, 5min) puis le sérum est isolé et

conservé à -20°C pour doser ultérieurement différentes cytokines et autres molécules

inflammatoires.

3.2 Lavage de la cavité pleurale

Après avoir pratiqué une légère ouverture du diaphragme, la cavité pleurale de chaque

souris est rincée par flux et reflux de 10 x 1 ml de PBS 1X froid avec une pipette Pasteur en

plastique. Les 2 premiers ml sont déposés dans un tube de 15ml et les 8 ml suivants dans un

deuxième tube de 15ml sur glace. Après décantation de 20 min, 1 ml est prélevé du 1er tube,

105

centrifugé (5min, 500g) et le surnageant est congelé à -20°C pour analyses ultérieures

(cytokines) ; le culot est repris dans le ml restant du premier tube et l'ensemble est déposé

dans le deuxième tube. Les 9 ml obtenus sont décantés plusieurs minutes pour permettre aux

filaires de se déposer au fond du tube mais pas les cellules. Les 8ml supérieurs du deuxième

tube sont isolés dans un nouveau tube de 15ml, centrifugés (5min, 350g), et le culot de

cellules de l’exsudat pleural (PleCs) est repris dans 1mL de PBS- 2% SVF (EUROBIO) pour

phénotypage cellulaire par cytométrie en flux (voir paragraphe 8). Les filaires isolées sont

transférées dans une boite de Pétri en verre (5cm de diamètre) pour comptage et analyse

morphologique.

3.3 Evaluation du développement filarien

Les filaires isolées sont comptées et le rendement filarien (F/L3) est établi. Il

correspond à (100 x nombre de vers récupérés) / nombre de larves inoculées.

Plusieurs autres paramètres sont mesurés :

1. Le nombre de filaires vivantes et entourées d'un manchon de cellules inflammatoires.

Elles sont incluses dans le dénombrement des filaires (cF).

2. Le nombre de filaires mortes entourées de cellules réactionnelles constituant des

granulomes (G). Ces granulomes sont de taille variable ; les plus gros peuvent contenir

des filaires reconnaissables, les petits des débris de filaires. Ils ne sont pas inclus dans le

rendement parasitaire.

3. Le nombre de filaires femelles (nf)

4. Le nombre de filaires mâles (nm)

5. Le sex ratio (f/m +f)

6. La longueur des filaires (L)

7. La présence d'œufs et de microfilaires dans les femelles.

3.4 Lavage bronchoalvéolaire

La trachée est exposée et incisée à la jonction cervico-thoracique. Une canule est

insérée et fixée avec du fil. L'espace bronchoalvéolaire est lavé avec 10 fois 1 ml de PBS 1X

froid. Le premier ml est recueilli dans un premier tube, centrifugé (5min, 350g) et le

surnageant est congelé (-20°C). Le culot est repris dans les 9 ml restants du lavage. Après

centrifugation (5min, 350 g), le culot contenant les cellules du liquide de lavage

bronchoalvéolaire (LBA) est repris dans 1 ml de PBS - 2% SVF.

106

3.5 Dénombrement des L3 dans les poumons

Après avoir réalisé les lavages pleuraux et broncho-alvéolaires, les poumons sont

retirés de la cage thoracique (à H2, H6, J2, J4, J6 et J8 p.i.). Les poumons sont ensuite placés

dans des boîtes de Pétri de 5 cm de diamètre contenant 7 ml de PBS et déchirés en petits

morceaux (environ 1-3mm2) à l’aide de pinces fines. Les boîtes de Pétri sont examinées sous

une loupe binoculaire à différents temps entre 1 h et 24 h pour permettre aux L3 de sortir du

tissu. Les L3 isolées sont ensuite comptées.

3.6 Préparation et fixation des poumons pour différentes analyses

Pour l'observation des poumons en microscopie optique (voir paragraphe 4), les

poumons sont gonflés avec du formaldéhyde (VWR) à 4% dans du PBS, enlevés et plongés

dans du formaldéhyde 4%-PBS pendant 24h. Après 24h, le fixateur est renouvelé pour 24h

supplémentaires puis les poumons sont placés en éthanol 70%.

Pour l'observation des poumons en microscopie confocale (voir paragraphe 5), les

poumons sont remplis par la trachée avec de l'agarose à bas point de fusion à 2% (p / v dans

du PBS 1X, pH 7,4) chauffé à 40°C (Sigma-Aldrich). Après refroidissement de la souris sur

glace quelques minutes pour permettre à l’agarose de durcir, les poumons sont retirés du

thorax et transférés dans du PBS froid pour rinçage, puis fixés 2 h dans du paraformaldéhyde

(PFA, Electron Microscopy Science) froid à 4% dans du PBS et finalement stockés à 4°C

dans du PBS 1X.

Pour l'observation des poumons en microscopie électronique à balayage (voir

paragraphe 8), les poumons sont retirés du thorax et placés dans une boite de Pétri contenant

du PBS. Les poumons sont coupés au scalpel en tranches d'environ 3-4mm. Les sections sont

ensuite fixées pendant 1h dans une solution de glutaraldéhyde à 2.5%.

Pour l'analyse des transcrits pulmonaires à J4 et J70 p.i. (voir paragraphe 9), l'aorte est

coupée et les poumons sont exsanguinés par injection de 10mL de PBS froid dans le

ventricule droit du cœur puis immergés dans du RNAlater et congelés à -80°C.

Pour les extractions d'ADN afin d’évaluer la quantité de microfilaires pulmonaires à

J70 p.i. (voir paragraphe 10), les poumons sont gonflés avec de l'éthanol 70% via une canule

insérée dans la trachée puis ils sont extraits de la cavité et plongés dans un tube de

50mlcontenant de l'éthanol 70% puis stocké à 4°C.

107

4. Analyses histologiques et immunohistologique sur coupes fines

4.1 Déshydratation, inclusion en paraffine, préparation des lames

La paraffine n'est pas miscible à l'eau, les organes doivent donc être déshydratés avant

l'inclusion dans la paraffine. La paraffine n'est pas non plus soluble dans l'alcool utilisé pour

la déshydratation. On procède donc à une double substitution. On remplace l'eau par de

l'alcool (déshydratation) puis on remplace l'alcool par le toluène (substitution).

Les organes fixés au formaldéhyde sont déshydratés par une succession de 3 bains

d'alcool 70%, 3 bains d'alcool 95%, 3 bains d'alcool 100% puis 3 bains de toluène. Chaque

bain a une durée de 30 minutes. Enfin les organes sont mis dans un bain de paraffine liquide

(Leica-Paraplast PLUS) à 57°C pendant 2 jours pour bien imprégner les organes. Les blocs de

paraffine contenant les organes sont coulés dans des moules d'inclusion avec une station

d'inclusion en paraffine (Leica EG1150H) et une cassette permettant le montage sur le

microtome est collée sur le dessus du bloc. Le bloc est ensuit refroidi sur une plaque de

refroidissement (Leica EG1150C) pour figer la paraffine.

Les blocs sont coupés au microtome (Leica RM2245) pour obtenir des coupes d’une

épaisseur de 5µm. Les sections ainsi obtenues sont placées à la surface de l'eau d'un bain-

marie chauffant à 40°C afin de défroisser le tissu inclus dans la paraffine sans faire fondre

cette dernière. Une lame de verre est plongée dans le bain à la verticale puis, en remontant, les

coupes lisses s'attachent à la lame. Les lames sont ensuite égouttées pour chasser l'excès d'eau

puis séchées à l'étuve à 57°C toute une nuit.

Pour les colorations histologiques, des lames de verre de qualité standard ont été

utilisées. Les coupes pour les immunomarquages ont été étalées sur des lames Superfrost

(Superfrost plus, Thermo scientific). Ces lames sont chargées positivement, ce qui augmente

l'adhérence des tissus aux lames.

108

4.2 Colorations histologiques

Les lames sont déparaffinées par 3 bains de toluène, puis réhydratées par deux bains

d'alcool à 100% suivis d'un bain d'alcool à 95%, un bain d'alcool à 70% et d'un bain d'eau du

robinet. Tous les bains ont une durée de 10 minutes.

4.2.1 Coloration à l'Hemalun-Eosine (HE)

Les sections d'organes sont cerclées au Dakopen (DAKO) et colorées à l'hématoxyline

de Mayer filtrée (0,47µM) pendant 10 minutes, puis rincées rapidement à l'eau du robinet. Les

lames sont ensuite plongées dans de l’éosine à 1% (diluant : eau) pendant 1 minute, rincées

deux fois dans de l'eau du robinet puis déshydratées par un bain d'éthanol à 70% d'une minute

suivi d'un bain d'éthanol à 100% de 30 secondes. Enfin les lames sont plongées dans du

toluène pendant 1 minute pour fixer la coloration avant d'être montées avec du baume

d'Eukitt® (Polylabo).

Réactif Temps

d'incubation Fonction

Hematoxyline de

Mayer 10min

Complexation de l'hematoxyline aux

groupes phosphates des acides

nucléiques (coloration des noyaux)

Eau du robinet

Rinçage

constant pendant

20s

Réalisation d'une coloration bleu

intense par altération du pH

Eosine 1 % 1min Fixation de l'éosine sur les molécules

basiques

Eau du robinet 1min Rinçage


Ethanol (70%) 1min Rinçage et déshydratation

Ethanol (100%) 30s Rinçage et déshydratation

Toluène 1min Fixation

Eukitt® - Fixation and montage de la lamelle

Tableau 8. Protocole de coloration à l'Hemalun-Eosine.

109

4.2.2 Coloration au Trichrome de Masson

Le trichrome (Masson) est utilisé pour étudier le tissu conjonctif, les muscles et les

fibres de collagène. Il est donc particulièrement utile pour détecter des phénomènes de

fibrose. Le kit de Sigma-Aldrich a été utilisé.

Les lames sont plongées dans de la solution de Bouin préchauffée à 56°C pendant 15

minutes. Ce traitement améliore la qualité de la coloration ultérieure (on parle de mordant).

Les lames sont ensuite rincées pendant 5min dans de l'eau du robinet avant d'être colorées à

l'Hematoxyline de fer de Weigert pendant 5 minutes avant d'être rincées de nouveau. Les

lames sont colorées avec de la Fuchsine Acide de Biebrich Scarlet pendant 5 minutes, rincées

et placées dans une solution d'acide phosphotungstique / phosphomolybdique pendant 5

minutes avant d'être colorées avec une solution de bleu d'Aniline. Enfin, les lames sont

placées dans de l'acide acétique à 1% puis déshydratées par un bain d'éthanol à 70% d'une

minute suivi d'un bain d'éthanol à 100% de 30 secondes. Les lames sont plongées dans du

toluène pendant 1 minute avant d'être montées avec du baume d'Eukitt® (Polylabo).

Réactif Temps


Bouin à 56°C 15min Mordant

Eau du robinet Rinçage constant

pendant 5min

Refroidissement des lames et rinçage de

l'excès de Boin

Hematoxyline de fer de

Weigert 5 min Coloration nucléaire


pendant 5min Rinçage

Eau distillée 1 min Rinçage

Fuchsine Acide de

Biebrich Scarlet 5 min Coloration du cytoplasme et des muscles

Eau distillée 1 min Rinçage

Acide

phosphotungstique /

phosphomolybdique

5 min Mordant

Bleu d'Aniline 5 min Coloration du collagène

Acide acétique 1% 1 min Amélioration du rendu

Ethanol (70%) 1min Rinçage et déshydration

Ethanol (100%) 30s Rinçage et déshydration



Tableau 9. Protocole de la coloration au trichrome de Masson.

110

Réactif Temps d'incubation Fonction

Acide

periodique (1%) 15min

Oxydation des groupes diol des sucres

conduisant à la formation de groupes

aldéhyde


pendant 5min Dissolution de l'acide périodique

Eau distillée 2x2min Rinçage

Réactif de Schiff 20min Coloration due à la réaction de groupes

aldéhyde avec le réactif de Schiff


pendant 5min Dissolution du réactif de Schiff

Eau distillée 10s Rinçage

Hématoxyline de

Mayer 10min

Complexation de l'hématoxyline aux




pendant 5min

Réalisation d'une coloration bleu

intense par altération du pH

Ethanol (70%) 1min Rinçage et déshydration

Ethanol (100%) 30s Rinçage et déshydration



Tableau 10. Protocole de la coloration à l'acide périodique-Schiff.

111

4.2.1 Coloration à l'Acide Periodique-Schiff (PAS)

Les sections sont colorées selon la méthode de l'acide periodique-Schiff (PAS). Cette

coloration permet de détecter le glycogène et d'autres polysaccharides dans les tissus. Cette

méthode permet de colorer les cellules caliciformes, qui sont des cellules épithéliales

glandulaires remplies de mucine (une glycoprotéine). Ces cellules sont responsables de la

production de mucus (mucine dissoute dans l'eau), caractéristique de l'inflammation

pulmonaire.

Les sections d'organes sont cerclées au Dakopen (DAKO) et traitées à l'acide

periodique à 1% pendant 15 minutes. Les lames sont ensuite rincées à l'eau du robinet pendant

15 minutes, puis par deux bains de 2 minutes d'eau distillée. Les lames sont ensuite colorées

au réactif de Schiff (VWR) pendant 20 minutes, rincées et colorées à l'hématoxyline de Mayer

pendant 10 minutes. Elles sont enfin rincées 5minutes dans de l'eau du robinet et 10 secondes

dans de l'eau distillée puis déshydratées par un bain d'éthanol à 70% d'une minute suivi d'un

bain d'éthanol à 100% de 30 secondes. Enfin les lames sont plongées dans du toluène pendant

1 minute avant d'être montées avec du baume d'Eukitt® (Polylabo).

112

4.2.2 Colorations immunohistologiques avec révélation enzymatique

Les lames Superfrost ont été déparaffinées et réhydratées comme pour les colorations

histologiques. Pour tous les marquages, le démasquage des antigènes est réalisé avec une

solution de Protéinase K (10µg/mL) en tampon Tris-EDTA (TE) (50mM Tris Base, 1mM

EDTA, 0.5% Triton X-100, pH 8) à 37°C pendant 10 minutes en chambre humide. Les lames

sont ensuite laissées à refroidir pendant 10 minutes à température ambiante. Les peroxydases

et les phosphatases alcalines endogènes sont bloquées pendant dix minutes par ajout de

100µL de la solution DualEndogenous Enzyme Block (DAKO) sur les coupes pendant 10

minutes.

4.2.3 Marquage du S100A9

Un blocage des avidines puis des biotines endogènes est réalisé successivement

pendant 15 minutes grâce au kit Avidin/Biotin Blocking kit (Vector Laboratories). Les étapes

suivantes sont réalisées avec le kit Vectastain ELITE ABC (Vector Laboratories). Les sites

non spécifiques sont bloqués avec du sérum de rat à 5% (Vector Laboratories ; diluant : PBS)

pendant 20min. Le surplus de sérum est retiré puis l'anticorps primaire de rat monoclonal anti-

S100A9 (clone MU14-2A5, Hycult biotech) dilué au 1/200 dans le sérum de rat à 5%-PBS)

est ajouté. Les lames sont mises à incuber durant 1h à température ambiante en chambre

humide. L'anticorps secondaire anti-rat couplé à une biotine (Vector Laboratories), puis la

streptavidine (qui va se fixer sur la biotine) couplé à l'enzyme HRP (ABC reagent, Vector

Laboratories), sont ensuite respectivement mis à incuber 30 minutes chacun à température

ambiante. Puis une goutte de EnVision+ Dual Link System-HRP (Dako) est ajoutée pendant 1

minutes à température ambiante. Le marquage donne une coloration rouge vif. L’AEC forme

un produit final qui est soluble dans les composés organiques. Il est donc nécessaire, d’utiliser

un contremarquage non alcoolique et un milieu de montage aqueux. Le contremarquage est

réalisé à l'Hemalun de Mayer pendant 1 minute avant montage à l'Aquatex (Merck).

113


Avidin blocking solution 15min Blocage des Avidines endogènes

PBS 1 min Rinçage

Biotin blocking solution 15min Blocage des Biotines endogènes

PBS 2x2min Rinçage

Sérum de rat 5% 20min Blocage es sites non spécifiques

Anticorps primaire

(1/200)

1h en chambre

humide Fixation sur l'antigène d'intérêt

PBS 2x3min Rinçage

Anticorps secondaire

biotinylé

30min en chambre

humide Fixation sur l'anticorps primaire

PBS 2x3min Rinçage

Réactif ABC 30min en chambre

humide

Fixation du complexe avidine/peroxydase

sur la biotine de l'anticorps secondaire

PBS 2x3min Rinçage

AEC (substrat) 1min Oxydation du substrat par la peroxydase

Eau du robinet 2x1min Rinçage

Hématoxyline de Mayer 1min


groupes phosphates des acides nucléiques

(coloration des noyaux)


Aquatex - Montage et fixation

Tableau 11. Protocole de marquage de la protéine S100A9

114

4.2.4 Marquage de la cytokératine 7

Les sites non spécifiques sont bloqués avec du sérum de rat à 5%-PBS, puis l'anticorps

primaire monoclonal de souris anti-cytokératines humaines et de souris (clone AE1/AE3,

Dako) dilué au 1/50 dans du sérum de rat à 5%-PBS est mis à incuber 45 min à température

ambiante en chambre humide. Puis une goutte de EnVision+ Dual Link System-HRP (Dako)

est ajoutée pendant 10 minutes à température ambiante. Ce réactif consiste en des anticorps

secondaires couplés à des peroxydases se fixant aux anticorps primaires de lapin ou de souris

(Dual Link). Le réactif ne contient donc pas d'avidine et de biotine et limite les colorations

non spécifiques. Le substrat AEC+ High Sensitivity Ready-to-Use (Dako) est ajouté pour

5minutes. Le marquage donne une coloration rouge vif. Un contremarquage à l'Hemalun de

Mayer est ensuite réalisé pendant 1 minute avant montage à l'Aquatex (Merck).



Anticorps

primaire (1/50)

45min en chambre

humide Fixation sur l'antigène d'intérêt

PBS 2x3min Rinçage

EnVision+ Dual

Link System-

HRP

10min en chambre

humide

Fixation de la peroxydase sur l'anticorps

primaire

PBS 2x3min Rinçage

AEC (substrat) 5min Oxydation du substrat par la peroxydase


Hematoxyline de

Mayer 1min

Complexation de l'hematoxyline aux





Tableau 12. Protocole de marquage de la cytokératine 7

115

4.2.5 Marquage de la podoplanine

Les blocages des avidines puis des biotines endogènes sont réalisés successivement pendant

15min grâce au kit Avidin/Biotin Blocking kit (VectorLaboratories). Les étapes suivantes sont

réalisées avec le kit Vectastain ELITE ABC (VectorLaboratories). Les sites non spécifiques

sont bloqués avec du sérum de rat à 5%-PBS pendant 20min, puis l'anticorps primaire

monoclonal de rat anti-podoplanine de souris (Clone PMAB-1, Ls bio) dilué au 1/50 du sérum

de rat à 5%-PBS est mis à incuber 1h à température ambiante en chambre humide. L'anticorps

secondaire anti-rat couplé à une biotine, puis la streptavidine (qui va se fixer sur la biotine)

couplé à l'enzyme HRP (ABC reagent, VectorLaboratories), sont ensuite respectivement mis à

incuber 30 minutes chacun à température ambiante. Le substrat AEC+ High Sensitivity

Ready-to-Use (Dako) est ajouté pour 5 minutes à température ambiante. Un contremarquage à

l'Hemalun de Mayer est ensuite réalisé pendant 1 minute avant montage à l'Aquatex (Merck)

Réactif Temps


Avidin blocking solution 15min Blocage des Avidines endogènes

PBS 1 min Rinçage

Biotin blocking solution 15min Blocage des Biotines endogènes

PBS 2x2min Rinçage


Anticorps primaire (1/50) 1h en chambre

humide Détection de l'antigène d'intérêt

PBS 2x3min Rinçage

Anticorps secondaire

biotinylé

30min en

chambre humide Fixation sur l'anticorps primaire

PBS 2x3min Rinçage

Réactif ABC 30min en

chambre humide

Fixation du complexe

avidine/peroxydase sur la biotine de

l'anticorps secondaire

PBS 2x3min Rinçage

AEC (substrat) 5 min Oxydation du substrat par la peroxydase


Hématoxyline de Mayer 1min






Tableau 13. Protocole de marquage de la podoplanine

116

Coloration Anticorps

primaire Compagnie Origine Clone

Fluoro-

chrome

Anticorps

secondaire/

fluorochrome

M1

CD31 Life

technologies

Hamster 2H8 - Anti-

Hamster/Cy3

Ly6G Bio X-Cell Rat 1A8 - Anti-Rat/Cy5

M2

CD31 Life

technologies

Hamster 2H8 - Anti-

Hamster/Cy3

S100A9 Hycult

Biotech

Rat MU14-2A5 - Anti-Rat/Cy5

H3 ABCAM Lapin Polyclonal - Anti-

Lapin/AF488

M3

CD31 Biolegend Hamster 2H8 - Anti-

Hamster/AF488

CD68 Biolegend Rat FA-11 AF594 -

CD169 Biolegend Rat 3D6.112 AF647 -

Tableau 14. Origine des anticorps utilisés pour l'immunofluorescence.

La colonne 1 indique les associations d'anticorps effectuées pour les marquages. Les

colonnes suivantes présentent les anticorps primaires, leur origine et le clone. Dans la colonne

6 le fluorochrome est précisé pour les anticorps directement couplé à un fluorochrome. Dans

colonne 7 est précisé l'anticorps secondaire utilisé.

117

5. Immunohistochimie sur coupes épaisses

5.1 Préparation des coupes épaisses de poumons (Precision Cut Lung Slices ou

PCLS)

Les poumons gonflés à l’agarose (voir 3.6) fixés au paraformaldéhyde (PFA) et

stockés à 4°C dans du PBS sont préparés pour réaliser des coupes épaisses. Ces étapes ont été

effectuées dans l'équipe du Dr Léo Carlin (Impérial College de Londres, National Heart &

Lung Institute puis Beatson Institute, Leucocyte Dynamics, Glasgow).

Le poumon gauche est isolé et collé sur un bloc d'aluminium refroidi en utilisant de la

colle Superglue et le bloc est placé dans le vibratome (Microcut H1200 BioRad) avec la partie

supérieure du poumon (le hile) dirigée à l'opposé de la lame. En effet, les bronches principales

situées au niveau du hile sont plus rigides que le tissu environnant et rendent l'initiation de la

coupe plus difficile. Des coupes de 300 μm d'épaisseur sont préparées dans un bain de PBS /

BSA1% / Azide 0.05% refroidi. L'amplitude et la vitesse d'oscillation sont réglées au

maximum et l'avancée de la lame est d'1mm/sec.

5.2 Colorations immunohistologiques en fluorescence

Les coupes de chaque poumon sont perméabilisées et bloquées avec 300 μL de PBS /

NGS10% / BSA1% / TX-100 0,3% / Azide 0,05% (appelé "solution tampon" dans la suite)

dans un puits d’une plaque de 24 puits et placées sur un agitateur à température ambiante

pendant 30 minutes. Les coupes sont ensuite rincées une fois avec du PBS / BSA1% / TX-100

0,1% / Azide 0,05% puis 250 μL de solution d'anticorps primaires (dilution : 1/200 ; voir

Tableau 14 pour les différents marquages) dilué dans la solution tampon sont ajoutés pendant

3 heures sous agitation à température ambiante. Les coupes sont ensuite rincées avec la

solution tampon, puis 3 autres lavages de 2 minutes sont effectués sous agitation.

Les anticorps secondaires (dilution 1/200), les anticorps primaires directement couplé

à un fluorochrome (dilution 1/200) et le DAPI (dilution 1/1500) sont ajoutés sous 250 μL

pendant1 h à température ambiante sous agitation. Les coupes sont rincées 3 fois 2 minutes

avec du PBS / BSA1% / TX-100 0,1% / Azide 0,05% puis deux fois en PBS avant de finaliser

la fixation pendant 2 minutes dans de la PFA à 4% dans du PBS et rincer deux fois en PBS.

119

Les coupes sont placées sur les lames et recouvertes avec 150µL de Mowiol (Sigma-

Aldrich) additionné de 2,5% de DABCO puis recouvertes. Les lames ont été observées à

l'aide d'un microscope confocal (TCS-SP5, Leica à Londres ou Airyscann 880 ; Zeiss à

Glasgow).Des zones d'environ 1mm x1mm de côté par 100µm de profondeur contenant des

espaces périvasculaires ont été analyses. Au moins 3 images ont été obtenues pour chaque

poumon.

6. Analyse des images obtenues par microscopie confocale

Les images obtenues en microscopie confocale sont analysées grace aulogiciel

IMARIS (Bitplane). Les différents plans sont empilés pour obtenir une reconstitution en 3

dimensions des différents signaux de fluorescence. Le DAPI et l’anticorps anti-histone H3

(H3) permettent de visualiser le noyau des cellules. L’anticorps anti-CD31 colore les cellules

endothéliales et permet donc d'observer l'architecture générale des poumons (capillaires

pulmonaires, veines, artères et vaisseaux lymphatiques). Ly6G mais aussi S100A9 sont

utilisés pour observer les neutrophiles; les anticorps anti-CD68 et anti-CD169 reconnaissent

des macrophages.

Pour analyser l'espace péri-vasculaire, celui-ci est modélisé par un objet en 3 dimension

permettant d'obtenir son volume (en mm3). Ensuite le nombre de cellules présentes dans

l'espace (DAPI+ et DAPI+CD169+) est déterminé automatiquement grace aux algorithmes du

logiciel. En bref, les éléments dépassant un seuil de fluorescences et ayant une taille entre 10

et 20 µm sont retenus. Les comptages automatiques sont ensuite contrôlés manuellement. Le

nombre de cellules est ensuite normalisé par rapport au volume de l'espace (Figure 21).

<- Figure 21. Stratégie d'analyse du contenu cellulaire de l'espace périvasculaire.

Les images obtenues en microscopie confocale sont analysées grâce au logiciel IMARIS

(Bitplane). (A) Les différents plans sont empilés pour obtenir une reconstitution en 3

dimensions des différents signaux de fluorescence. Le DAPI (Bleu) permet de visualiser le

noyau des cellules. Le marquage du CD31 (vert) colore les cellules endothéliales et permet

donc d'observer l'architecture générale des poumons (capillaires pulmonaires, veines, artères

et vaisseaux lymphatiques). L'espace périvasculaire (PVS) contient un vaisseau sanguin et est

délimité par les bronchioles et les alvéoles. (B) Un objet 3D est crée manuellement pour

modéliser le PVS (fantôme blanc) permettant d'obtenir le volume V du PVS. (C) Le nombre

N de cellules (en rouge) est ensuite comptées par le logiciel (éléments mesurant entre 10 et 20

µm). Les cellules détectées apparaissent comme un point violet. Le nombre de cellules est

ensuite normalisé par rapport au volume du PVS, permettant d'obtenir la concentration de

cellules dans le PVS : N/V cellules/mm3.

120

7. Microscopie électronique à balayage

Les échantillons fixés au glutaraldehyde à 2.5% (voir 3.6) sont lavés 3 fois dans du

PBS pendant 5min puis déshydratés par des bains successifs d'éthanol de concentration

croissante. Le matériel biologique doit être séché avant d'être introduit dans l'enceinte sous

vide secondaire du MEB. Deux techniques ont été utilisées :

- la technique du point critique du CO2 : l'objectif est de substituer l'éthanol par du CO2

liquide, puis le CO2 liquide est éliminé par passage à l’état gazeux au point critique (Pression

= 74 bar, Température = 31°C)

- le traitement avec de l'héxaméthyldisylasane (HMDS) suivi d'un séchage à l'air libre


Glutaraldehyde

2.5% 1h Fixation/conservation structure

PBS 3x5min Rinçage

Ethanol 50% 5min Déshydratation



Ethanol 100% 3x5min Déshydratation

Point critique

ou

HMDS 2x5min Séchage

Air libre Toute une nuit

(sous sorbonne) Séchage

Les échantillons sont ensuite collés sur des supports métalliques, à l'aide de ruban

adhésif double face en carbone. Les échantillons sont enfin métallisés par pulvérisation

cathodique d'or pendant 70s. La métallisation a pour but de rendre l'échantillon conducteur

aux électrons évitant ainsi l'accumulation des charges parasites négatives à la surface de

l'échantillon au cours de son observation. La pulvérisation cathodique consiste à recouvrir les

échantillons d'une fine couche d'or (entre 20 et 40 nm) tout en respectant et en conservant leur

topographie. Les échantillons sont observés avec un microscope électronique à balayage

Hitachi SU3500 sur le Plateau Technique de Microscopie Électronique du MNHN.

121

8. Cytométrie en flux

8.1 Préparation des cellules

Les cellules isolées de la cavité pleurale et du liquide bronchoalvéolaire sont analysées

à l’aide d’un cytomètre en flux. Premièrement, les globules rouges présents dans les culots

cellulaires sont lysés par un choc hypotonique avec 5ml de NaCl 0.2% (puis équilibré avec

l’ajout de 5 ml de NaCl à 1.6%). Les suspensions cellulaires sont centrifugées à 400gpendant

4 min à 4°C, puis les culots cellulaires sont repris dans 1 ml de PBS contenant2% de SVF et

les cellules sont comptées en utilisant un hémocytomètre (KOVA® Glasstic Slide). Au moins

300 000 cellules sont utilisées pour le marquage des cellules pleurales. Pour les cellules du

liquide bronchoalvéolaire, leur quantité étant faible, la totalité des cellules est utilisée pour les

différents marquages. Les cellules sont lavées une fois par ajout de PBS-SVF 2% puis

centrifugées à 400g pendant 4 min à 4°C et le surnageant est éliminé (ces 3 étapes seront

appelées "lavage" par la suite). Les récepteurs aux régions Fc des anticorps sont ensuite

bloqués en incubant à 4°C les cellules pendant 15 minutes avec un anticorps anti-CD16/CD32

(dilution : 1/1000, eBiosciences) pour éviter la fixation non spécifique des anticorps

primaires. Après un lavage, les cellules sont prêtes pour les différents marquages.

8.2 Identification des populations leucocytaires.

Différents marquages avec des anticorps monoclonaux couplés à des fluorochromes

sont effectués pour identifier les populations de leucocytes. Les différentes populations sont

identifiées en utilisant les anticorps de rat anti-souris suivants: anti-F4/80-APC (dilution

1/200, eBioscience, clone BM8), anti-SiglecF-PE (dilution 1/200, BD Biosciences, clone E50-

2440), Ly6G-FITC (dilution 1/200, BD Biosciences, clone 1A8), CD3-PE (dilution 1/200, BD

Biosciences, clone 17A2), CD4-FITC (dilution 1/200, BD Biosciences, clone RM4-5), CD8-

APC/Cy5 (dilution : 1/200, BD Biosciences, clone 53-6.8 ), CD19-APC (dilution : 1/200, BD

Biosciences, clone 1D3) (Tableau 15). Un marquage intracellulaire avec anticorps primaire

polyclonal de lapin anti-Relm-α (1/400) suivi d'un anticorps secondaire couplé à de l'AF488

se fixant sur les anticorps de lapin (1/1000) a été effectué pour identifier les macrophages

alternativement activés (AAM) (Tableau 15). L'acquisition a été réalisée avec un cytomètre en

flux FACSVerse (BD Biosciences) et le logiciel FACSuite (BD Biosciences). Les doublets et

les débris sont exclus (Figure 22). Les analyses ont été effectuées avec le logiciel FACSuite.

La figure 22 présente la stratégie de discrimination des populations cellulaires mise en place

pour le marquage 1.

122

Marquage Anticorps Dilution Milieu Macrophage Eosinophile Neutrophile

M1

F4/80-APC 200 PBS, SVF2% + - -

SiglecF-PE 200 PBS, SVF2% +/- + -

Ly6g-FITC 200 PBS, SVF2% - - +

M2

Lympho CD4+ Lympho CD8+ Lympho B

CD3-PE 200 PBS, SVF2% + + -

CD4-FITC 200 PBS, SVF2% + - -

CD8-

APC/Cy5 200

PBS, SVF2% - + -

CD19-APC 200 PBS, SVF2% - - +

M3

Macrophage AAM Eosino

F4/80-APC 200 PBS, SVF2% + + -

SiglecF-PE 200 PBS, SVF2% +/- - +

Relm-α

+

400

PBS, SVF2%

Saponine 0.05% + ou -

suivant

activation

+ -

Anti-lapin-

AF488 1000

PBS, SVF2%

Saponine 0.05%

+ ou -

suivant

activation

+ -

Tableau 15. Marquages utilisés en cytométrie en flux.

La colonne 1 indique les associations d'anticorps effectuées pour les marquages. La 2ème

colonne indique les anticorps et les fluorochromes utilisés. Les colonnes 3 et 4 précisent la

dilution et le milieu de dilution. Enfin les colonnes 5 à 7 indique l'expression des différents

marqueurs étudiés dans les populations cellulaires recherchées.

123

Figure 22. Stratégie de discrimination des populations cellulaires.

(A) Lorsque des cellules seules passent devant le laser, le SSC-H corrélée avec le SSC-A. Les

cellules apparaissent alors sur une diagonale. Lorsque des cellules sont collées, cette

corrélation est perdue et il est possible de discriminer les doublets des singlets en excluant les

cellules hors de la diagonale.(B) Les débris cellulaires sont exclus de l'analyse grâce à leur

petite leur taille (SSC). (C-D) Les macrophages pleuraux ont été déterminés par leur

expression du marqueur F4/80, les macrophages alvéolaire grâce à la coexpression de F4/80

et de SiglecF, les Eosinophiles par l'expression de SiglecF mais pas de F4/80 et les

neutrophiles par l'expression de Ly6G.

R1 : exclusion des doublets de cellules. R2 : exclusion des débris cellulaires. R3 :

Eosinophiles. R4 : Cellules Non-Eosinophiles. R5 : Macrophages. R6 : Neutrophiles.

124

9. Analyse des transcrits de cytokines inflammatoires dans le poumon

9.1 Extraction des ARN totaux et rétrotranscription

Les poumons de souris prélevés 4 jours et 70 jours après infection et ceux des souris

contrôle non infestées (8 souris par groupe) ont été préservé en RNA later à -80°C.

L’extraction d’ARN est réalisée sur colonne (kit RNeasy Midi kit; Qiagen). Les poumons sont

placés encore congelés dans un microtube de 2mL contenant 3 billes de tungstène de 5mm de

diamètre et 300µL de tampon de lyse du kit (tampon RLT). Pour éviter toute contamination,

les billes sont préalablement nettoyées avec du RNase Away (VWR) et les tubes sont passés

10 minutes aux UV. Les poumons sont dissociés à l’aide du broyeur à billes Tissue Lyser II

(Qiagen) en effectuant 2 cycles de 1 min à 20 Hz. Le tube est brièvement centrifugé puis le

broyat est transféré dans un tube de 15mL. 4mL de tampon de lyse sont ajouté et le mélange

est vortexé 45-60sec avant de centrifuger 10min à 4000g. Le surnageant est transféré dans un

nouveau tube de 15mL et 4mL d'éthanol 70% sont rajoutés et le tube est secoué pour

resuspendre les précipités. L'échantillon est alors transféré dans une colonne du kit RNeasy

Midi kit (Qiagen) et centrifugé pendant 5 minutes à 4000g. Le liquide du tube collecteur est

jeté et 4mL de tampon RW1 (kit Qiagen) sont ajoutés pour laver la colonne; une nouvelle

centrifugation de 5 minutes (4000g) est réalisée. Puis deux lavages avec 2,5ml de tampon

RPE (Qiagen) sont effectués. Enfin, 250μl d’eau RNase-free sont ajoutés pour éluer l’ARN.

Cette dernière étape est répétée avec un nouveau volume d’eau RNase-free (250μl). Les ARN

sont conservés à -80°C.

La quantité et la qualité des ARN obtenus est vérifiée avec un spectrophotomètre à

spectre complet (Nanodrop2000, Thermo Scientific) et un bioanalyseur Agilent 2100.

Théoriquement le Nanodrop permet d'estimer la quantité d'ADN ou d'ARN (absorbance de

l'échantillon à 260nm) et le rapport des absorbances à 260 nm et 280 nm est utilisé pour

évaluer la pureté de l'ADN et de l'ARN. Un ratio de ~ 1,8 est généralement accepté comme

"pur" pour l’ADN ; Un ratio de ~ 2,0 est généralement accepté comme "pur" pour l'ARN. Si

le rapport est sensiblement inférieur dans les deux cas, il peut indiquer la présence de

protéines, de phénols ou d'autres contaminants qui absorbent fortement à près de 280 nm.

Pour les très petites quantités il est connu que le Nanodrop peut surévaluer la concentration.

Pour la qualité des ARN le bioanalyseur Agilent effectue une électrophorèse en

capillaires ce qui permet de contrôler l’intégrité de des ARN totaux. Un facteur d’intégrité ou

125

RIN (RNA Integrity Number) est attribué à chaque échantillon. Les échantillons présentant un

RIN< 8 (dégradés) ont été exclus.

Pour chaque condition, la retrotranscription est effectuée sur un pool de 6-8

échantillons (suivant leur qualité) en mettant la même quantité d'ARN pour chaque

échantillon. Les ADN complémentaires (ADNc) sont produits avec le kit First-strand cDNA

(Qiagen). Tout d'abord, les contaminations éventuelles avec de l'ADN génomique sont

éliminées avec le mix suivant.

Produit Volume (µL) pour 1 échantillon

ARN 0, 5µg

Tampon GE 2 µL

Eau RNase-free Variable

Volume total 10 µL

Le mélange est mis à incuber pendant 5min à 42°C dans un thermocycleur (Mastercycler®

nexus, Eppendorf) puis placé sur glace au moins 1min pour stopper la réaction. La

retrotranscription est effectuée en ajoutant 10 µL du mix suivant dans les tubes traités à la

DNase, avant d'incuber à 42°C pendant 15min exactement et d'inactiver la réaction en

incubant 5min à 95°C


Tampon BC3 5x 4µL

Contrôle P2 2 µL

Mix de Reverse Transcriptase RE3 2µL

Eau RNase-free 3µL

91µL d'eau RNase-free est ensuite ajouté à chaque échantillon qui sont alors prêt pour les

PCR en temps réel.

126

9.2 Obtention des profils d'expression cytokiniques

Pour l'analyse des transcrits de cytokines, des plaques "Mouse Cytokines & Chemokines RT²

Profiler PCR Array"(Qiagen) sont utilisées. Ces plaques de 96 puits contiennent des amorces

spécifiques pour 84 transcrits de cytokines sécrétées et 5 gènes de référence (dont l'expression

est considérée stable quelques que soient les conditions) permettant la normalisation des

résultats (liste des gènes en Annexe 1).

De plus, différents contrôles sont inclus dans les plaques :

• le contrôle positif (1 puits) consiste une séquence d'ADN artificielle présente dans la

plaque, permettant de tester l'efficacité de la PCR.

• des contrôles internes de l'efficacité de la retrotranscription (3 puits).

• des contrôles internes de contamination par de l'ADN génomique (3 puits).

Une plaque est préparée pour chaque condition (cDNA issus de poumons de souris

naïves et infestées à J4 et J70, donc 4 plaques) et les PCR quantitatives sont réalisées dans un

thermocycleur à plaque 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). L'expression de

chaque gène est associée à son cycle seuil (CT) à partir duquel le signal de fluorescence est

détecté (Figure 22).

Figure 23. Obtention du cycle seuil (CT) après l'acquisition des PCR quantitatives.

Saisie d'écran représentative du résultat d'une plaque. Chaque couleur représente soit une

cytokine d'intérêt, un gène de référence, soit un contrôle. Le CT est déterminé au cours de la

phase exponentielle et le seuil de fluorescence doit être le même pour toutes les plaques.

127

Les données obtenues pour chaque plaque sont traitées en utilisant le logiciel en ligne

"RT2 Profiler PCR Array Data Analysis 3.5" sur le site Web sabiociences.com (Qiagen).

Après vérification des contrôles, l'expression des gènes a été normalisée avec les 5 gènes de

référence (Actb, B2m, Gapdh, Gusb, Hsp90ab1), permettant d'obtenir le ΔCT :

ΔCT (gène X) = CT(gène X)−CT(gènes de ménage)

L'expression relative de chaque gène est ensuite déterminée grâce la méthode des ∆∆Ct :

2-ΔΔCT= 2 –(ΔCT(infesté)−ΔCT(naïf))

Les résultats sont exprimés par un rapport cible/contrôle. Ceci permet d'obtenir

l'augmentation ou la baisse relative (« Foldchange » ou FC) d'expression des différents gènes

entre deux conditions données, ici entre les poumons de souris naïves et ceux de souris

infestées. Un seuil (« threeshold ») d'augmentation/diminution de 90% a été placé (FC ≥ 1.9)

pour la suite des analyses.

9.3 Analyse in silico des réseaux biologiques

Les données transcriptionnelles ont été évaluées à l'aide du logiciel IPA (Ingenuity

Pathway Analysis, Systems Inc., États-Unis). IPA contient une base de données conséquente

(Ingenuity Knowledge Base) permettant de modéliser et d’analyser des systèmes biologiques

et chimiques complexes. Plus particulièrement, l'option « Core Analysis » est utilisée pour

interpréter des jeux de données dans le contexte de processus biologiques, de voies

métaboliques et de réseaux moléculaires. Les algorithmes d'IPA identifient les fonctions

biologiques impliquées dans les changements d'expression génique observés dans les données

analysées en les comparant à la littérature scientifique existante. A partir de cela, les

algorithmes peuvent aussi proposer des mécanismes et des molécules régulatrices pouvant

expliquer les résultats observés.

D'un point de vue pratique, le logiciel calcule un score d'activation (z-score) pour

chaque processus/réseau biologique en fonction des profils d'expressions géniques entrés et de

leur adéquation avec les données enregistrées dans les bases de données. Si le z-score est

supérieur à 2, le logiciel prédit que le processus est probablement activé, s'il est inférieur à - 2,

il serait inhibé.

128

9.4 Validation des résultats de l'analyse transcriptionelle

9.4.1 Retrotranscription

Les résultats des plaques étant obtenus à partir de pools d'échantillons, il est nécessaire

de valider ces résultats pour chaque individu. Pour cela, les ADN complémentaires (ADNc)

sont préparés pour chaque échantillon comme suit :

Les ARN ont été traités à la DNase (Turbo DNase, Ambion) à 37°C pendant 30min pour

éviter toute contamination par de l'ADN génomique en utilisant le mélange réactionnel

suivant :


Eau nucléase-free 19

10X turbo DNase Buffer (Ambion) 5

Turbo DNase (Ambion) 1

ARN 25

Ensuite, la réaction est stoppée en ajoutant 5µL de solution d'inactivation (Ambion).

L'échantillon est centrifugé (10000g, 1min30) et le surnageant est placé dans un nouveau tube

de 1ml.

4µL d'ARN traité à la DNase sont ensuite utilisés pour effectuer la retrotranscription des ARN

en ADNc. Le reste des ARN traités est congelé à -80°C.


Eau nucléase-free 6

OligodT (0.8µg/µL) (Roche)* 2

dNTP (10mM) 1

ARN traité à la DNase 4

Le mélange réactionnel est mis à incuber 5min à 65°C dans un thermocycleur (Mastercycler®

nexus, Eppendorf) pour permettre l'appariement spécifique des amorces sur les ARN puis

récupéré sur glace au moins une minute. Après une brève centrifugation, l’enzyme

Superscript III (Invitrogen) permettant la rétrotranscription est ajoutée :


5X buffer 4

0.1M DTT 1

RNase inhibitor (30U/µL) 1

Superscript III RT 1

Les tubes sont placés dans le thermocycleur à 50°C pendant 45min puis 15min à 70°C

(inactivation de l'enzyme). Enfin 40µL d'eau nucléase-free sont ajoutés avant dosage

(Nanodrop).

129

9.4.2 Conception des amorces

Les résultats obtenus à J4 p.i. ont été validés avec un gène candidat (CXCL1) et ceux à J70

avec 3 gènes (CXCL9, CCL2 et IL-13). Un ou deux gènes de référence ont été utilisés

(Actine-β et GAPDH).

Les amorces ont été conçues avec le logiciel AmplifX avec les conditions suivantes:

les amorces encadrent un intron afin de détecter les contaminations par de l'ADN génomique ;

les amorces mesurent entre 20 et 24 paires de bases (pb), température d'hybridation de

60±5°C, % GC entre 40 et 60%, produit de PCR entre 100 et 200pb ; les amorces ne doivent

pas d'hybrider entre elles ou former des boucles in silico (une double vérification est effectuée

en utilisant l'outil en ligne OligoCalc: http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html);

les amorces ne doivent pas s'apparier à des séquences existant chez des filaires. Pour cela, les

séquences ont été comparées aux génomes des bases de données du NCBI

(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

Amorce Séquence

IL 13 sens GGATATTGCATGGCCTCTGTAACC

IL 13 antisens GTGGCGAAACAGTTGCTTTGTG

CXCL9 sens CCATGAAGTCCGCTGTTCTTTTCC

CXCL9 antisens TGGGGCAAACTGTTTGAGGTCT

CCL2 sens ACTGCATCTGCCCTAAGGTCTTCA

CCL2 antisens TAAGGCATCACAGTCCGAGTCACA

ACTINE sens ATTGCTGACAGGATGCAGAAG

ACTINE antisens AGTCCGCCTAGAAGCACTTG

GAPDH sens ACTCTTCCACCTTCGATGCCG

GAPDH antisens ACCCTGTTGCTGTAGCCGTA

CXCL1 sens CACTGCACCCAAACCGAAGTCATA

CXCL1 antisens TCTCCGTTACTTGGGGACACCTTT

Tableau 16. Séquences des amorces utilisées pour les PCR quantitatives

http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

130

9.4.3 PCR quantitative

Les PCR quantitatives sont effectuées dans un thermocycleurLightCycler2.0 (Roche

Diagnostics, France).

Pour CXCL1, CXCL9, CCL2, l’Actine et la GAPDH, le kit MasterPlus SYBR (Roche

Diagnostics, France) a été utilisé et le mélange réactionnel de 10 µL contient :


Eau nucléase-free 4 µL

Amorces sens (5mM) 1 µL

Amorces antisens (5mM) 1 µL

Solution A+B 2 µL

ADNc 2 µL

Pour l’IL-13, le kit Master SYBR Green (Roche Diagnostics, France) a été utilisé et le

mélange réactionnel de 10 µL contient :


Eau nucléase-free 1.6 µL

MgCl2 (10mM) 0,4 µL

Amorces sens (5mM) 1 µL

Amorces antisens (5mM) 1 µL

Solution 10X 1 µL

ADNc 4 µL

Le programme d'amplification comprend une incubation initiale de 10 min à 95°C suivie de

40 cycles composés de :

- une étape de dénaturation : 10 sec 95°C

- une étape d'appariement des amorces de 8 sec à 60°C

- une étape d'amplification de 10sec à 72°C, au cours desquelles les données de fluorescence

sont recueillies.

Ce programme a été suivi d'une étape de fusion permettant d'obtenir la température de fusion

(Tm) des amplicons.

L'expression de CXCL1 a été déterminée par rapport à l'Actine-β et celle de CXCL9, CCL2 et

IL-13 par rapport à l'Actine- β et au GAPDH en utilisant la méthode 2-ΔΔCT.

131

10. Purification des microfilaires à partir de sang de mérion hôtes de L. sigmodontis

Le sang de mérions microfilarémiques est prélevé au sinus rétro-orbital et déposé dans

un tube contenant de l'héparine pour éviter la coagulation du sang (ratio : 1 µL d'héparine

pour 10µL de sang). Le sang est mélangé avec un volume égal de RPMI 1640. Les

microfilaires sont ensuite purifiées sur gradient de Percoll (Densité : 1,130, pH=9; Sigma

Chemical CO, St Louis, USA). Le Percoll est composé de particules de silice de 15-30 nm de

diamètre, recouvertes de polyvinylpyrrolidone et les gradients de Percoll permettent de

séparer les cellules en fonction de leur densité.

- Une solution de Percoll "100%" est préparée en mélangeant 9 volumes de Percoll pur

avec un volume de sucrose à 2,5M en RPMI 1640.

- Ensuite du Percoll "25%" est préparé en mélangeant 1 volume de Percoll« 100% »

avec 3 volumes de sucrose 0.25M en RPMI 1640.

4mL de Percoll « 25% » sont transférés dans un tube de 15 mL puis 4mL du mélange

Sang/RPMI est déposé délicatement et sans à-coup au dessus. Le tube est centrifugé 35min à

400g à température ambiante et sans frein. L'aspect des tubes avant et après centrifugation est

indiqué en figure 23.

Figure 24. Purification des microfilaires sur gradient de Percoll.

Représentation de l'aspect des tubes avant et après centrifugation avec la position de l'anneau

de Mfs.

La phase contenant le RPMI et le sérum est éliminée à l’aide d’une pipette pasteur en

plastique, puis l'anneau de microfilaires (Mfs) est récupéré délicatement dans un nouveau tube

et dilué avec du RPMI pour réaliser un lavage. Le tube est centrifugé 10 min à 400 g, le

surnageant est éliminé et le culot est resuspendu dans 1mL de RPMI. Le nombre de

microfilaires est déterminé à l’aide d’un hémocytomètre (KOVA® Glasstic Slide).

132

11. Détection et quantification des microfilaires pulmonaires par PCR quantitative

Pour estimer le nombre de microfilaires pulmonaires, une approche de détection par

PCR quantitative a été mise en place. Pour ce faire une gamme standardisée d’ADN extraits

de poumons de souris non infestées mises avec des quantités connues de microfilaires a été

réalisée. Dans un deuxième temps cette gamme a été utilisé pour déterminer le ratio

Mfs/poumons dans les ADN extraits de poumons de souris infestées microfilarémiques ou

non.

11.1 Extraction de l'ADN des poumons

Les poumons gonflés et fixés à l'éthanol à 70° (voir 2.8) sont rincés en PBS. Les

éventuels morceaux de filaires adultes et les granulomes adhérant à la plèvre viscérale

pulmonaire sont retirés. Les poumons sont placés dans un microtube de 2mL contenant 3

billes de tungstène de 5mm de diamètre et 500µL de PBS stérile. Pour éviter toute

contamination, les billes sont préalablement nettoyées avec du RNase Away (VWR - cette

solution élimine les contaminations par des RNases et de l'ADN) et les tubes sont passés

10minutes aux UV. Les poumons sont dissociés à l’aide du broyeur à bille Tissue Lyser II

(Qiagen) en effectuant 2 cycles de 1 min à 20 Hz. Les tubes sont brièvement centrifugés puis

100µL de la solution sont transférés dans un microtube de 1.5mL contenant 180µL de tampon

de lyse (Buffer ATL, Qiagen) et 20µL de protéinase K (Qiagen). Le mélange est vortexé

brièvement et mis à incuber toute une nuit à 56°C avec une agitation régulière. L'ADN est

ensuite purifié en utilisant le kit Qiagen DNA microkit en suivant les spécifications du

fabricant : 200µL de tampon de lyse (Tampon AL) sont ajoutés dans le tube avant de vortexer

par à-coup pendant 15s jusqu'à obtenir une solution homogène. 200µL d'éthanol absolu sont

alors ajoutés et le tube est vortexé à nouveau et mis à incuber 5min à température ambiante.

Le contenu du tube est transféré dans une colonne QiAamp MinElute et centrifugé pendant

1min (6000g). Deux lavages de la membrane de la colonne sont réalisés successivement en

ajoutant 500µL de tampon AW1 puis AW2 avant de centrifuger le tube pendant 1min

(6000g). La membrane est ensuite séchée en centrifugeant pendant 3min (2000g). Enfin, la

colonne est placée sur un nouveau tube collecteur et 75μl d’eau DNAse-free sont ajoutés pour

éluer l’ADN. Cette dernière étape est répétée avec un nouveau volume d’eau DNAse-free

(75μl). Les ADN sont conservés à -20°C.

133

11.2 Préparation de la gamme

Les poumons de dix souris naïves sont récupérés et broyés comme précédemment. Les

broyats sont mélangés puis répartis dans dix microtubes de 2mL pour homogénéiser la

quantité de matériel entre les échantillons. 4 millions de microfilaires sont ensuite broyées de

la même façon sous 500µL de PBS. Une gamme de dilution du broyat de microfilaires est

ensuite réalisée par dilutions successives et ajoutée sous 100µL aux tubes contenant les

broyats de poumons.

Quantité de Mfs/ tube

1000000 100000 10000 1000 500 250 125 0

De ces mélanges poumons-microfilaires 100µL sont transférés dans un microtube de 1.5mL

contenant 180µL de tampon de lyse (Buffer ATL, Qiagen) et 20µL de proteinase K. Le

mélange est vortexé brièvement et mis à incuber toute une nuit à 56°C avec une agitation

régulière. L'ADN est ensuite purifié en utilisant le kit Qiagen DNA microkit en suivant les

spécifications du fabricant (voir 11.1).

11.3 Détection des microfilaires et normalisation

Des PCR quantitatives sont effectuées sur chaque échantillon d'ADN en utilisant le kit

MasterPlus SYBR Green (Roche Diagnostics, France) dans un thermocycleur LightCycler 2.0

(Roche Diagnostics, France).

L'ADN filarien est détecté grâce à des amorces ciblant l'actine de L. sigmodontis et l'ADN

murin avec des amorces ciblant l'actine de Mus musculus.

L.s Actin sens ATCCAAGCTGTCCTGTCTCT

L.s Actin anti-sens TGAGAATTGATTTGAGCTAATG

M. m Actin S ATTGCTGACAGGATGCAGAAG

M. m Actin AS AGTCCGCCTAGAAGCACTTG

Le mélange réactionnel de 10 µL contient :


Eau nucléase-free 2 µL

Amorcessens (5mM) 1 µL

Amorcesantisens (5mM) 1 µL

Solution A+B 2 µL

ADNc 4 µL

134

Pour chaque échantillon, le ratio de signal (CT) de l'actine filarienne et de l'actine

murine a été effectué pour normaliser les résultats. R= CT (L.s Actine ) / CT (M.m Actine).

Une courbe standard est tracée avec les points de la gamme qui est utilisée pour estimer la

quantité de microfilaires chez les souris infestées (Figure 25). La gamme a été réalisée 2 fois.

Figure 25. Gamme de détection de l’ADN des microfilaires pulmonaires.

En abscisse sont indiquées le nombre de microfilaires ajoutées par poumon. En ordonnées le

ratio obtenu par PCR.

Les points de la gamme sont marqués en rouge et en vert les échantillons testés.

Test de corrélation (Pearson) entre le ratio de détection de l'ADN des microfilaires dans les

poumons et le nombre de microfilaires. r2=0,989.

135

12. Cultures cellulaires

12.1 Purification des neutrophiles

Les fémurs de souris C57BL/6 de type sauvage et de souris C57BL/6 S100A9ko sont isolés et

nettoyés pour enlever les tissus autour des os. Les condyles des os sont coupés avec un scalpel

et la moelle osseuse est poussée hors de l’os avec 5mL de PBS stérile (grâce à une seringue de

5mL et une aiguille 27G) ; elle est récupérée dans un tube de 15mL. Les morceaux de moelle

osseuse sont dissociés par des allers-retours avec la seringue. Le tube est centrifugé à 400g

pendant 4min à 4°C, le surnageant est éliminé et les cellules resuspendues

dans 3mL de PBS.

Les neutrophiles sont purifiés grâce à un gradient de Percoll en 3 couches.

Une solution de Percoll "100%" est préparée en mélangeant 9 volumes de

Percoll pur avec un volume de PBS 10X. Ensuite les différentes

concentrations de Percoll sont préparées comme suit :

Percoll 72% : 7,5mL Percoll 100 + 2,8 mL RPMI

Percoll 64% : 6,4mL Percoll 100 + 3,6 mL PBS

Percoll 52% : 5,2mL Percoll 100 + 4,8 mL RPMI

L'alternance de PBS et de RPMI pour la dilution du Percoll sert uniquement

à mieux visualiser les différentes couches.

Le gradient est ensuite monté à l'aide d'une pipette doucement et sans à-coup dans un

tube de 15mL en ajoutant 3mL de chaque concentration de Percoll pour finir avec le dépôt de

3mL de la suspension de cellules.

Le tube est centrifugé 30min à 1500g à température ambiante et sans frein.

Les neutrophiles matures sont retrouvés à l'interface entre les couches 72% et 64%, où ils sont

récupérés à l'aide d'une pipette pasteur molle. Les cellules sont lavées avec 10mL de PBS,

centrifugées à 400g pendant 4min à 4°C et le surnageant est éliminé. Les globules rouges

présents dans les culots cellulaires sont lysés par un choc hypotonique avec 5ml de NaCl

0.2% (puis équilibré avec l’ajout de 5 ml de NaCl à 1,6%). Après une nouvelle centrifugation,

les cellules sont resuspendues dans 1mL de PBS. Le nombre de cellules est déterminé à l’aide

d’un hémocytomètre (KOVA® GlassticSlide).

136

12.2 Cultures de neutrophiles

Pour étudier les réponses des neutrophiles à différents stimuli, 105 neutrophiles sont cultivés

en triplicats pour chaque condition sous 200µL de RPMI 1640 10% SVF, 1% L-Glutamine,

100U/mL Pénicilline-Streptomycine dans une plaque 96 puits à 37°C pendant 4, 6, 24 et 36h

à 37°C.

Les cellules sont cultivées avec les différents stimuli suivants :

- 10 ou 20 L3

- 100 nM de phorbolmyristateacetate (PMA)

- 100 ng/mL de LPS

- 10 µg/mL de Pam3Cys (un activateur du TLR4)

- 50 mg/mL d'antigène de filaires adultes

- 50 mg/mL d'antigène de filaires adultes traités à la tétracycline (sans Wolbachia)

- ne sont pas stimulées (contrôle)

Après l'incubation, le surnageant est récupéré et congelé à -20°C pour dosage ultérieur de

cytokines et de l'ADN extracellulaire et les cellules sont récupérées pour analyse en

cytométrie en flux. Les cellules sont utilisées pour étudier leur activation en cytométrie en

flux ou en microscopie électronique à balayage. Pour la microscopie électronique à balayage,

les cultures sont effectuées dans des inserts de culture cellulaires Millicell (Merck Millipore)

avec une membrane présentant des pores de 3µm. La culture en insert permet d'éviter de

perdre les échantillons lors des lavages et de la déshydratation.

12.3 Culture et stimulation des splénocytes

Les rates des souris infestées sont prélevées dans des conditions aseptiques. Elles sont

broyées par passage à travers les mailles d'un tamis cellulaires et récupérées dans un tube

15mL. Le tamis est rincé avec 5mL de RPMI 1640 + Pénicilline-Streptomycine (100 U/mL)

pour assurer la meilleure élution possible des cellules. Après centrifugation à 400g pendant

8min à 4°C et élimination du surnageant, les érythrocytes sont lysés à froid dans une solution

avec la solution RBC lysis buffer (Ebioscience). Après une nouvelle centrifugation à 400g

pendant 8min à 4°C, les cellules sont resuspendues dans 10mL de RPMI 1640 10% SVF, 1%

L-Glutamine, 100U/mL Pénicilline-Streptomycine et le nombre de cellules est déterminé avec

un compteur cellulaire (CASY Model TT, CellCounter and Analyzer, Roche).

137

Pour étudier les réponses de splénocytes après restimulation, 2.106 cellules sont

cultivées en triplicats pour chaque condition sous 1mL de RPMI 1640 10% SVF, 1% L-

Glutamine, 100U/mL Pénicilline-Streptomycine dans une plaque 24 puits à 37°C pendant

72h.

Les cellules sont cultivées selon les différentes conditions suivantes :

- 25mg/mL d'antigène de filaires adultes

- 2,5µg/mL de Concanavaline (ConA)

- Sans stimulus (contrôle).

Après l'incubation, le surnageant est récupéré et congelé à -20°C pour dosage ultérieur de

cytokines.

13. Dosage des cytokines et autres molécules inflammatoires par une méthode ELISA

Les molécules d’intérêt ont été mesurées dans le sérum, les liquides de rinçage du

lavage broncho-alvéolaire et de la cavité pleurale ainsi que dans les surnageants de cultures

cellulaires par une approche ELISA "sandwich". La technique ELISA (Enzyme Linked

ImmunoSorbent Assay) est une technique immuno-enzymatique de détection qui permet de

visualiser une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction colorée produite par l'action

sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée à l'anticorps. Différentes cytokines,

chimiokines et alarmines ont été mesurées en suivant les protocoles standards (IFN-ɣ, TNF-α,

IL-10, IL-4, IL-1β, IL-6 et IL-17 : kit Ready-set-go, Ebiosciences ; CCL2 et CXCL1 : ELISA

development kit, Peprotech ; MPO, S100A9 et IL-33: Duo-Set ELISA®, R&D). Le substrat

de l'enzyme est le TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine), entraînant une réaction chimique

colorée qui est bloquée avant saturation par ajout d'acide sulfurique dilué (H2S4, 2N). La

lecture des échantillons est réalisée sur un spectrophotomètre Multiskan MS (Labsystems) à

450nm. L’acquisition des données a été effectuée sur le logiciel Delta Soft JV.

Les limites de détection sont les suivantes :

- 4 pg / mL pour IL-4, IL-6 et IL-17 ;

- 8 pg / mL pour IL- 1ß, S100A9, CXCL1 et MCP-1 ;

- 15 pg / mL pour INF-y et IL-33 ;

- 30 pg / mL pour IL-10 ;

- 250 pg / mL pour MPO.

138

14. Dosage de l'ADN extracellulaire

L'ADN extracellulaire double brin été quantifié dans le surnageant de culture des

neutrophiles de souris C57BL/6 après 4, 24 et 36 h à l'aide du kit d'analyse dsDNA Quant-

iTPicoGreen (Life Technologies), conformément aux instructions du fabricant. En bref, les

échantillons sont mélangés avec le réactif PicoGreen (dilution 1 : 1) pendant 5 min à l'abri de

la lumière puis la fluorescence des échantillons est mesurée avec un spectrofluoromètre

(FL600 Microplate fluorescence reader, Bio-Tek) avec une excitation à 480 nm et une

émission à 520nm. Une courbe standard d'ADN est utilisée pour déterminer la concentration

d'ADN libre dans les échantillons.

15. Analyses statistiques

Le choix des tests statistiques a été effectué avant l'analyse sur la base de la taille de

l'échantillon, de la normalité (test de Shapiro-Wilk) et de l'homoscédasticité (test de Bartlett).

Les données provenant d'expériences indépendantes ont été regroupées lorsque cela était

possible. Lorsque la normalité et l'homoscédasticité étaient établis, les résultats ont été

analysés par :

• le test t pour déterminer si deux jeux de données sont significativement différents.

• l'ANOVA à un facteur afin de déterminer l'effet d'un facteur (groupe de souris ou

temps).

• l'ANOVA à deux facteurs afin de déterminer les effets de deux facteurs (groupe de

souris et temps). Des comparaisons multiples de Bonferroni ont été effectuées après

les tests.

En cas de non-normalité des jeux de données, les résultats ont été analysés par des tests non-

paramétriques :

• le test U de Mann-Whitney pour déterminer si deux jeux de données sont

significativement différents.

• le test de Kruskal Wallis suivi d'un test de comparaison multiple de Dunn a été utilisé

afin de déterminer l'effet d'un facteur (condition ou temps).

Les corrélations entre deux jeux de données ont été analysées en utilisant le test de Pearson.

La représentation et l'analyse des données ont été réalisées avec le logiciel GraphPadPrism 5.

141

RESULTATS

143

CHAPITRE 1 :

La migration des larves infestantes/L3 de Litomosoides

sigmodontis chez la souris BALB/c révèle l’existence de dommages

pulmonaires transitoires

144

Introduction

Les L3 des filaires sont injectées dans la peau de l'hôte lors du repas sanguin d'un

vecteur arthropode hématophage. La plupart des espèces filariennes migrent à travers le corps

de l'hôte, de la peau jusqu'à leur niche définitive où les adultes se reproduisent et libèrent des

microfilaires. Ce lieu est différent en fonction de l’espèce filarienne considérée mais 4

localisations sont généralement décrites : le système lymphatique, les cavités séreuses, le

système cardio-pulmonaire ou les tissus conjonctifs [195]. Les modèles de filarioses chez les

rongeurs ont été utilisés pour étudier les voies de migration des L3 en particulier pour décrire

le passage lymphatique des L3 ; de plus certains de ces modèles ont permis d’observer la

présence des L3 dans le poumon, ce qui est le cas pour le parasite humain Brugia malayi dans

la gerbille et pour les principaux modèles animaux de filariose à savoir Brugia pahangi,

Acanthocheilonema viteae et Litomosoides sigmodontis [10]. Cette dernière est la seule filaire

capable d'effectuer un développement complet chez les souris ce qui en a fait un modèle

particulièrement étudié [194]. En outre, L. sigmodontis partage diverses caractéristiques

biologiques avec la filaire humaine Mansonella persans telles que la mue en L4 ayant lieu

entre 9 et 10 jours après infection, les adultes vivant dans les cavités séreuses, dont la cavité

pleurale, et les microfilaires circulant dans le sang [55,194,202].

La biologie de M. perstans est mal connue. Notamment, la voie de migration de la

peau vers la cavité pleurale n'est toujours pas clairement identifiée pour M. perstans; c'est

également le cas pour L. sigmodontis. En 1967, Wenk [11] a émis l'hypothèse que les L3 de L.

sigmodontis et de M. perstans traverseraient les poumons pour atteindre la cavité pleurale.

Cette hypothèse semble en effet probable d'un point de vue anatomique : les L3 de L.

sigmodontis inoculées dans la peau pénètrent rapidement dans un vaisseau lymphatique [11,199]

(Kilarski non publié ; http://www.wired.com/wiredscience/2011/08/nikon-small-world-vote-

2011/?pid=1861) ; de là, les larves s'engageraient dans le canal thoracique et arriveraient ainsi

dans la veine cave supérieure, le cœur droit, puis les artères pulmonaires (Figure 26). Dans les

poumons, les L3 seraient bloquées dans les capillaires pulmonaires dont elles s'échapperaient

pour rejoindre la cavité pleurale en traversant le tissu pulmonaire.



145

En soutien à cette hypothèse, des L3 de L. sigmodontis ont été observées dans les

poumons dilacérés de souris BALB/c deux jours après inoculation [204] et plus tôt chez l'hôte

naturel, le rat du coton [11]. De plus, on observe également une augmentation transitoire des

neutrophiles dans les capillaires pulmonaires dans les premières heures de l'infection [271] et

des granulomes, principalement constitués de cellules T et de macrophages, dans les poumons

de souris infestées par L. sigmodontis huit jours après l'infection des souris [205].

L'objectif est d'analyser la cinétique de migration des L3 en focalisant sur leur

présence dans le poumon, et d'évaluer l'éventuelle réponse inflammatoire de l'environnement

pulmonaire (cavité pleurale, cavité bronchoalvéolaire, poumon) associée à cette phase précoce

de l'infection.

Figure 26. Voie de migration suggérée des

L3 de L. sigmodontis.

Les L3 inoculées dans la peau pénètreraient

dans un vaisseau lymphatique, s'engageraient

dans le canal thoracique et arriveraient ainsi

dans la veine cave supérieure, le cœur droit

puis les artères pulmonaires. Dans les

poumons, les L3 seraient bloquées dans les

capillaires pulmonaires dont elles

s'échapperaient pour rejoindre la cavité

pleurale en traversant le tissu pulmonaire.

Adapté de Wenk, 1967 [11]

146

Figure 27. Cinétique de l’infestation post inoculation des L3 au niveau de la peau.

Des souris BALB/c ont été infestées avec 40 L3 de L. sigmodontis par voie sous-cutanée (SC)

ou les L3 ont été transmises par l'acarien vectoriel O. bacoti (« infection naturelle »).

Rendement parasitaire de L. sigmodontis (F / L3= nombre de filaires récupérées / nombre de

L3 inoculées) après 2 heure (H2), 6 heure (H6), 4 jours (J4) et 8 jours (J8) après récupération

et comptage des L3 dans les poumons dilacérés (barres grises) et dans la cavité pleurale

(barres blanches) ; (A) Rendement parasitaire dans les poumons et cavité pleurale de souris

infestées naturellement (n = 8 par temps, pool de 2 expériences indépendantes) (B)

Rendement parasitaire dans les poumons et la cavité pleurale de souris infestées en SC (H2 : n

= 8, pool de 2 expériences indépendantes ; H6-J4-J8 : n = 19-24, pool de 5 expériences

indépendantes ; J6: n = . Les barres représentent la moyenne et l’écart standard à la moyenne

(SEM).

Figure 28. Localisation tissulaire des L3 lors de la phase de migration.

Synthèse des résultats de [10,11,204,356,357] et des données actuelles (Figure 27). Les L3 ont été

récupérées chez des souris, des gerbilles ou des rats du coton. Le nombre de L3 récupéré a été

normalisé en F/L3. SC : tissu sous-cutané ; Lymph : ganglions lymphatiques ; Pleural : cavité

pleurale. Les barres représentent la moyenne et l’écart standard à la moyenne (SEM).

147

Résultats

1 Cinétique de la migration des L3 ; comparaison de différents modes d'inoculation

Pour définir la cinétique d'arrivée des L3 dans la cavité pleurale, des souris BALB/c

ont été infestées par le vecteur acarien O. bacoti ("infection naturelle") ou par voie sous-

cutanée (SC). Les L3 présentes dans la cavité pleurale et dans les poumons ont été

dénombrées à différents temps entre 2 heures (H2) et 8 jours (J8) post-infection (p.i.) (Figures

27A et 27B).

Peu de L3 sont détectées à H2, H6 et J4 p.i. dans la cavité pleurale des souris infestées

en SC ou naturellement (rendement parasitaire <5% de l'inoculât initial). Entre J4 et J8, le

nombre de L3 dans la cavité pleurale augmente progressivement, pour atteindre près de 20%

(Figures 27A et B).

Des L3 sont également observées dans les poumons des souris infestées (infection

naturelle et SC) (Figures 27A et B). Ces résultats concordent avec les observations antérieures

de Wenk et de Bain, qui ont remarqué la présence de L3 de L. sigmodontis dans les poumons

de rongeurs dilacérés mécaniquement [10,11,204,356,357].

Mises ensemble, ces données et les nôtres permettent de proposer le schéma suivant montrant

la progression des L3 de la peau à la cavité pleurale (Figure 28).

Les L3 disparaissent de la peau en quelques jours. Elles sont observées dans les

lymphatiques dès quelques heures après infection avec un pic à J2 et J3 p.i., avant d'atteindre

la cavité pleurale et de s'y accumuler entre J4 et J6 p.i. Une fois dans la cavité pleurale, le

rendement parasitaire reste stable pendant une durée variable selon les espèces hôtes des

rongeurs, de 10 à 30 jours p.i.

La présence de L3 dans les poumons a été observée tout au long de la phase de

migration avec un pic à J6 p.i. (Figure 27B). Le nombre de souris présentant des L3 dans les

poumons augmente également au cours du temps de 25% à H2 p.i. jusqu'à 85% à J6 p.i.

148

Figure 29. Cinétique de l’infestation post inoculation intraveineuse de L3

Des souris BALB/c ont été infestées avec 40 L3 de L. sigmodontis par voie intraveineuse

(IV). Rendement parasitaire (F/L3) dans les poumons et la cavité pleurale des souris infestées

en IV (H2-H6, n = 8 ± 12 (pool de 2 expériences indépendantes) ; J4-J8, n (poumons) = 6-8

(pool de 2 expériences indépendantes), n (pleural)= 24 (pool de 5 expériences indépendantes).

Les barres représentent la moyenne et l’écart standard à la moyenne (SEM).

149

Afin de tester la possibilité d'un passage sanguin, les L3 ont été inoculées par voie

intraveineuse (IV). De plus, cette méthode permet d’éviter la peau, la phase de migration

lymphatique et potentiellement de limiter l'arrivée asynchrone des L3 dans la cavité pleurale.

Le rendement parasitaire est plus élevé dans la cavité pleurale après ce mode

d'inoculation (Figure 29). Il atteint presque le double de celui observé chez les souris infestées

en SC ou naturellement au même moment. Ceci indique d'une part que les L3 survivent dans

la circulation sanguine et d'autre part qu'elles peuvent utiliser ce moyen pour rejoindre la

cavité pleurale. Les larves sont observées dans la cavité pleurale dès H2 p.i., et s'accumulent

régulièrement jusqu'à J8 p.i. (environ 2% à H2, 4% à H6, 10% à J4 et 30% à J8). Au cours de

ce laps de temps, un équilibre entre les poumons et la cavité pleurale est observé : le taux de

récupération dans les poumons est maximal à H2 p.i. et diminue progressivement jusqu'à J8

p.i. (environ 30% à H2, 26% à H6, 13% à J4 et moins de 1% à J8).

Dans les deux modèles (inoculation dans la peau ou en IV), la localisation pulmonaire

suggère que les L3 quittent les capillaires pulmonaires (comme l'a suggéré Wenk [11])

probablement en migrant à travers le parenchyme pulmonaire et le mésothélium viscéral pour

arriver dans la cavité pleurale. L'observation d'une L3 sur une coupe histologique de poumon

d'une souris infestée en IV [271], associée à un recrutement de cellules dont de nombreux

neutrophiles, conforte cette hypothèse.

150

2. Le passage de L3 dans le poumon induit une inflammation caractérisée par des

hémorragies locales, des granulomes et une accumulation de neutrophiles dans

les espaces périvasculaires

Au cours de l’autopsie des souris infestées, des zones hémorragiques localisées

(pétéchies) ont fréquemment été observées à la surface des poumons chez les souris infestées

en IV (Figure 30B par rapport à la Figure 30A). Ce phénomène a été quantifié à H6, J4 et J8

p.i. chez les souris infestées en IV et en SC (Figure 30C).

Figure 30. Hémorragies dans le poumon de souris où sont détectables les L3.

Des souris BALB/c ont été infestées avec 40 L3 de L. sigmodontis soit par voie sous-cutanée

(SC), soit par voie intraveineuse (IV). Image représentative de (A) un poumon normal, (B) un

poumon avec de nombreuses hémorragies (cercles rouges bien délimités). (C) Nombre

d'hémorragies pulmonaires superficielles dans les poumons à six heures (H6), quatre jours

(J4) et huit jours (J8) après l'inoculation. n = 6, les barres représentent la moyenne ± SEM;

ANOVA bidirectionnelle suivie de Bonferonni, *** = p <0,001 (différence entre les souris

infestées en IV et SC), ## = p <0,01 (différence entre les points de temps chez les souris

infestées en IV). (D) Test de corrélation (Pearson) entre le nombre de L3 récupéré dans le

poumon et le nombre de hémorragies, r2 = 0,9148.

151

Les zones hémorragiques sont rarement observées sur le poumon des souris infestées

en SC, alors que le poumon de toutes les souris infestées en IV présente un nombre élevé

d'hémorragies à H6. Le nombre d'hémorragies diminue ensuite à J4 et est très bas à J8. Une

corrélation (r2 = 0,9148) est établie entre le nombre de pétéchies et le nombre de L3

récupérées dans les poumons, indépendamment du mode d'inoculation et du temps d'infection

(Figure 30D).

Comme cela a déjà été décrit [205], des granulomes sont observés à J8 dans les

poumons de 50% de souris infestées en SC. De tels granulomes sont également présents chez

des souris infestées en IV à J8 p.i. et chez les souris infestées en SC et IV à J4 p.i. mais en

moins grande quantité (Figure 31A et B).

Figure 31. Granulomes dans les poumons des souris infestées.


(SC), soit par voie intraveineuse (IV). Deux heures (H2) six heures (H6), deux jours (J2),

quatre jours (J4) et 8 jours (J8) après l'inoculation, une analyse histologique des poumons a

été effectuée. (A) Coloration à l'hématoxyline-éosine d'une section d'un poumon d'une souris

naïve présentant un parenchyme et un mésothélium normaux. (B) Coloration à

l'hématoxyline-éosine d'une section montrant un granulome chez des souris infestées en SC à

J8 p.i.

152

Figure 32. Présence d’infiltrats neutrophiliques dans l’espace périvasculaire des

poumons des souris infestées.


(SC), soit par voie intraveineuse (IV). Projection confocale d'une coupe épaisse de poumon

avec des capillaires CD31 + (rouges) entourant les bronches (Br) et un espace périvasculaire

(PVS) (dont les limites sont marquées par une ligne pointillée) contenant un vaisseau sanguin

(VS) et un vaisseau lymphatique (*). Ces images montrent (A) l'absence de neutrophiles

Ly6G + (clone 1A8) (vert) dans le PVS de la souris naïve; et (B) la présence d'infiltrats de

neutrophiles Ly6G + dans le PVS et autour des voies aériennes dans une souris infestée en IV

à J4 post-infection.

153

A 6h heures après infection, un recrutement de neutrophiles a été observé dans les

capillaires pulmonaires, et il était résorbé à J4 [271]. Dans les poumons des souris infestées aux

temps plus tardifs (J4 et J8), des infiltrats de neutrophiles Ly6G+ sont observés dans les

espaces périvasculaires et péribronchiques, indépendamment du mode d'inoculation des L3

(Figure 32A et B).

Une augmentation du nombre de neutrophiles est également observée dans le lavage

bronchoalvéolaire (Figure 32A) à J4 et J8 p.i. chez les souris infestées en SC et dans une

moindre mesure et uniquement à J4 p.i. en IV. Le nombre de neutrophiles augmente dans la

cavité pleurale à J8 p.i. après inoculation des L3 en SC et en IV (Figure 33B).

Figure 33. Quantification des neutrophiles dans les espaces broncho-alvéolaires et

pleuraux.

Des analyses phénotypiques en cytométrie de flux des neutrophiles Ly6G+ (clone 1A8) ont été

effectuées à différents moments (H2, H6, J4 et J8) après inoculation sur les cellules pleurales

(PleC) et les cellules isolées du lavage bronchoalvéolaire (LBA) de souris infestées en IV et

SC. (A-B) Nombre de neutrophiles Ly6G+ dans le lavage bronchoalvéolaire (A) et dans les

cellules pleurales (B). Le nombre de cellules dans les souris non infestées est représenté par

une barre horizontale pointillée. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM, n = 4-6,

Kruskal-Wallis suivi d'un Dunns (* p <0,05. ** p <0,01, *** p <0,001 entre les souris

infestées et naïves, #p <0,05 Différence entre les souris infestées par SC et IV pour un temps

donné).

154

De même, à J4 et/ou J8 p.i. une augmentation du nombre d'éosinophiles et de macrophages a

lieu dans le lavage bronchoalvéolaire (Figure 34C et E) et la cavité pleurale (Figure 34D et F).

Figure 34. Quantification des éosinophiles et des macrophages dans les espaces

bronchoalvéolaire et pleural.

Les analyses phénotypiques en cytométrie de flux des macrophages F4/80+ (clone BM8) et

des éosinophiles SiglecF+ (clone E50-2440) ont été effectuées à différents moments (H2, H6,

J4 et J8) après inoculation sur les cellules pleurales (PleC) et les cellules isolées du lavage

bronchoalvéolaire (LBA) de souris infestées en IV et SC. (A-B) Nombre (nb) de macrophages

F4/80+ dans le lavage bronchoalvéolaire (A) et dans les cellules pleurales (B) ; (C-D) Nombre

d'Eosinophiles SiglecF+ dans le lavage bronchoalvéolaire (C) et dans les cellules pleurales

(D). Le nombre de cellules dans les souris non infestées est représenté par une barre

horizontale pointillée. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM, n = 4-6, Kruskal-

Wallis suivi d'un Dunns (* p <0,05. ** p <0,01, *** p <0,001 entre les souris infestées et

naïves, #p <0,05 Différence entre les souris infestées par SC et IV pour un temps donné.

155

3. Des processus inflammatoires physiologiques se déploient quelques heures après

l'inoculation des L3

Les résultats obtenus suggèrent deux réponses différentes au cours de la phase de

migration des L3, une première qui se déroule dans les premières heures après l'infection, et

une autre qui se manifeste quelques jours après l'infection.

Différentes cytokines connues pour être impliquées dans l'inflammation ou les voies T

helper ont été testées dans les liquides pleuraux et broncho-alvéolaires recueillis à H6, J4 et J8

p.i. chez les souris infestées en SC et en IV (Figure 35 et Tableau 17). Dans le liquide pleural,

l’IL-1β et l’IL-33, deux molécules associées aux dommages tissulaires, augmentent à H6 p.i.

chez les souris infestées en SC et IV (Figure 35A et B). Ceci soutient l'hypothèse d'une

inflammation précoce due au passage initial des L3 par les poumons et leur arrivée dans la

cavité pleurale. Ces cytokines n'ont pas été détectées dans le LBA.

Figure 35. Inflammation pulmonaire précoce transitoire.

Dosage de l’IL-1β (A) et de l’IL-33 (B) dans le liquide pleural (PL) par ELISA, n = 4-8 (pool

de 2 expériences indépendantes). Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Les souris

non infestées sont représentées par une barre horizontale pointillée. Une ANOVA à deux

facteurs suivie d'un Bonferonni a été effectuée pour A et B, * p <0,05, ** p <0,01, *** p

<0,001 différences entre les souris infestées et naïve, ## p <0,01 différence entre les souris

infestées en SC et IV à H6 pour IL-1 β.

156

Tableau 17. Cytokines testées.


(SC), soit par voie intraveineuse (IV). Six heures (h6), quatre jours (d4) et 8 jours (d8) après

l'inoculation, les souris ont été sacrifiées et des lavages broncho-alvéolaires et pleurales ont

été effectués. Les ELISA ont été réalisés dans le liquide bronchoalvéolaire (LBA) et le liquide

pleural (LP). La première colonne indique les cytokines testées. La deuxième colonne donne

le mode d'inoculation L3 chez la souris (SC ou IV). Les troisième et quatrième colonnes

montrent les résultats pour le LBA et le LP respectivement. Ces deux colonnes sont

subdivisées en trois sous-colonnes selon le point de temps considéré (h6, j4 ou j8). Les scores

sont les suivants : 0, pas de détection ; = Détecté mais pas de différence entre les groupes non

infectés et infectés ; +, Détection (de faible + à forte +++). N = 5-6 pour le LBA (2 à 3

expériences indépendantes) ; N = 10-12 pour LP (pool de 2 à 3 expériences indépendantes).

157

Pour caractériser davantage l'environnement inflammatoire dans la deuxième phase,

c'est-à-dire quelques jours après l'infection, les transcrits pulmonaires de plusieurs cytokines

(Annexe 1) ont été analysés à J4 p.i. (Figure 36) chez les souris infestées en SC. Les transcrits

montrent une forte régulation négative de la réponse inflammatoire et des fonctions telles que

la chimiotaxie et le recrutement de neutrophiles et de phagocytes. Par exemple, l'expression

de transcrits de cytokines proinflammatoires comme l'IL-6, le CXCL1 et le CXCL5 sont

diminués. Les transcrits de CXCL1, un chimioattractant puissant pour les neutrophiles, sont

diminués dans le tissu pulmonaire des souris inoculées en SC et IV (Figure 36C). Les niveaux

de la protéine CXCL1 sont néanmoins augmentés dans le liquide pleural à J8 (Tableau 17) et

pourraient être associés au recrutement de neutrophiles observés à ce temps là (Figure 32).

Dans le même temps, l'expression de molécules régulatrices augmente comme les transcrits

d'IL-9 et d'IL-3 et les niveaux d'IL-4 et de MCP-1 dans le LBA (Tableau 17).

Figure 36. Régulation de l’inflammation pulmonaire

(A) Transcrits de cytokines/chimiokines (seuil : facteur d’augmentation/baisse d’expression

d’au moins 2) induite dans le poumon de souris infestées en SC à J4 p.i. et (B) fonctions

associées. Les effets des changements d'expression des gènes dans les poumons ont été prédits

en utilisant Ingenuity Pathways Analysis (IPA) ; la régulation des fonctions est indiquée par

des flèches. (C) Une q-RTPCR a été effectuée pour les transcrits de Cxcl1 pour valider les

résultats du tableau; N = 12 (SC) et 5 (IV). Un test t a été effectué pour Cxcl1, ** p <0,01.

158

4. Les neutrophiles murins peuvent produire des NETs après stimulation par des L3 in

vitro.

Après l'inoculation des filaires dans la peau, de nombreux neutrophiles sont recrutés

[253-258] et ont un rôle dans le contrôle des L3 dans la peau comme le montrent les expériences

avec des souris déplétées ou "enrichies" en neutrophiles [257,258]. Cependant, leur mécanisme

d'action est mal connu. Comme leur nombre augmente aussi dans les poumons

(capillaires/PVS/LBA/cavité pleurale) au cours de l'infection, ils pourraient avoir un rôle dans

le contrôle des L3 pulmonaires. Indépendamment du tissu peau/poumon, les interactions

neutrophiles/L3 ont été étudiées in vitro avec des neutrophiles purifiés à partir de la moelle

osseuse de souris C57BL/6.

Très rapidement, les neutrophiles stimulés par les L3 libèrent de la Myéloperoxydase

(MPO) dans le milieu extracellulaire (Figure 37A). La libération extracellulaire de MPO,

d'élastase neutrophilique (NE), d'histones, et de chromatine associée à de nombreuses

protéines actives, sont la signature de la formation des NETs (Neutrophil extracellular traps)

[358,359]. La présence d'ADN extracellulaire dans le surnageant des cultures a donc été mesurée.

La quantité d'ADN augmente avec le temps d'exposition aux L3 ou à la PMA, un activateur

chimique de la nétose (Figure 37B).

Figure 37. Activation in vitro des neutrophiles par les L3 de L. sigmodontis.

Des neutrophiles ont été purifiés à partir de la moelle osseuse de souris C57BL/6 et 105

neutrophiles ont été mis en culture sans stimulus (RPMI), avec 10 L3 vivantes (L3) ou 100

nM de PMA. (A) La concentration de Myéloperoxydase (MPO) extracellulaire a été mesurée

par ELISA dans le milieu de culture après 4, 24 et 36h ; (B) L'ADN extracellulaire dans le

milieu de culture a été analysé en utilisant le dosage PicoGreen après 4, 24 et 36h ; Les

résultats sont exprimés en moyenne +/- SEM de deux expériences indépendantes poolées

(nombre de souris: n = 3). ANOVA à deux facteurs puis Bonferroni. * : p <0,05 lors de la

comparaison du facteur de stimulation (RPMI, L3 ou PMA).

159

Les neutrophiles ont aussi été observés en microscopie électronique à balayage après

culture pour déterminer leurs modifications morphologiques. Si les cellules non-stimulées

sont normales (Figure 38A), certains neutrophiles cultivés avec des L3 produisent des

structures filamenteuse correspondant à des NETs (Figure 38B et C). Ces structures ont été

observées à distance (Figure 38B) et à proximité (figure 38C) des L3, mais jamais au contact

direct des parasites, ce qui suggère que des molécules sécrétées par les filaires pourraient

suffire à activer les neutrophiles.

Figure 38. L3 et Nétose de

neutrophiles de souris C57BL/6

exposés à des L3.

Des neutrophiles ont été purifiés à partir

de la moelle osseuse de souris C57BL/6

et 106 neutrophiles ont été mis en

culture sans stimulus (RPMI) ou avec

20 L3 vivantes (L3) sur inserts

Millicell. Les cultures ont été fixées

après 6h, déshydratées et recouvertes

par une fine couche d’or avant

observation au microscope électronique

à balayage (A) Aspect d’un neutrophile

non stimulé. (B) Neutrophile activé

produisant un filet d’ADN (NET) après

stimulation ; (C) Neutrophiles activés à

proximité d’une L3. Les points noirs

correspondent aux pores de la

membrane sur laquelle les cellules ont

été cultivées. Echelle : les pores noirs

mesurent 3µm de diamètre.

161

Discussion

Dans les 8 jours suivant leur inoculation cutanée, les L3 migrent du site d'inoculation

dans la peau, initialement via le système lymphatique, vers la cavité pleurale. Aucune larve ne

se transforme en L4 durant ce processus migratoire car la mue en L4 de L. sigmodontis a lieu

dans la cavité pleurale vers 9-10 jours post-inoculation chez les souris BALB/c [10,199].

Toutefois la taille de la L3 augmente pendant ces 8 jours de migration passant de 750µm de

long à 1400µm [360].

En raison de leur voie de migration complexe, les L3 sont donc confrontées à plusieurs

goulets d'étranglement anatomiques, ce qui entraîne une perte de leur synchronisation dans

l’inoculât initial et leur arrivée dans la cavité pleurale au "compte goutte". Les larves

s'accumulent ensuite pendant 6 à 8 jours après infection atteignant le rendement parasitaire

attendu vers J8.

Si les L3 sont transmises par le vecteur hématophage ou par injection sous-cutanée, la

plupart des larves sont retenues et détruites dans la peau du rongeur. Les L3 échapperaient à la

réponse inflammatoire de la peau en entrant dans le système lymphatique afférent [10,164]. Une

fois dans les lymphatiques, les L3 doivent passer les ganglions lymphatiques drainants pour

atteindre les vaisseaux lymphatiques efférents. La récupération des ganglions lymphatiques à

différents moments chez des rongeurs infectés par L. sigmodontis a révélé la présence

continue de L3 dans le système lymphatique dans les premiers jours de l'infection. Les L3

sont détectées dans les lymphatiques dès quelques heures après infection et pendant environ 5

jours, avec un pic entre 2 et 3 jours p.i. (Figure 28 et [10,11,204,356,357]).

162

Figure 39. Synthèse des voies de migrations des L3 après infection sous-cutanée (SC) et

intraveineuse (IV).

(A) Après injection SC, une grande quantité de L3 est éliminée dans la peau. Les L3 qui

échappent à cette réponse entrent dans les vaisseaux lymphatiques, rejoignent le canal

thoracique et de là la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Après un

passage à travers le ventricule droit du cœur les L3 sont entraînées dans les artères

pulmonaires puis dans les capillaires pulmonaires qui irriguent le poumon. Les L3 traversent

alors le tissu pulmonaire pour rejoindre la cavité pleurale. Il est possible qu'une partie des

filaires rejoigne la circulation générale et soient détruites ailleurs. (B) Après injection IV,

toutes les larves sont inoculées en même temps dans le sang veineux, qui rejoint directement

et de manière synchronisée la circulation sanguine pulmonaire, évitant les étapes

peau/lymphatiques. Plus de 50% des L3 ne sont néanmoins pas piégées dans les poumons.

163

Comprendre la migration des L3 de L. sigmodontis vers la cavité pleurale nécessite de

prendre en compte le système cardio-pulmonaire. L’anatomie de ce système représente une

voie logique d'arrivée dans la cavité pleurale comme le suggérait Wenk [11], et les résultats

d'autopsie semblent confirmer son implication. Des études antérieures [10,204] révélaient la

présence de L3 dans le compartiment cardio-pulmonaire dans les heures et les jours suivant

leur inoculation sous-cutanée. Cependant, la localisation précise (cœur ou poumons) n'avait

pas été déterminée spécifiquement. L'analyse du poumon nous a permis de démontrer la

présence de L3 dans ce tissu (Figure 27).

Comment expliquer la présence de L3 dans les poumons? La structure des valves

bicuspides des vaisseaux lymphatiques rend difficile les mouvements rétrogrades. Les valves

agissent comme des portes unidirectionnelles. Ainsi, une fois dans les vaisseaux

lymphatiques, les filaires n'auraient pas d'autre possibilité que de suivre le flux lymphatique.

Les vaisseaux lymphatiques se jettent dans le canal thoracique et le canal lymphatique droit

qui sont drainés dans les veines sous-clavières. Les L3 passeraient de la lymphe au sang à la

jonction du canal thoracique avec la veine sous-clavière. Après un passage à travers le

ventricule droit du cœur, le sang, et donc les L3, sont entraînés dans les artères pulmonaires

puis dans les capillaires pulmonaires qui irriguent le poumon, qui n'ont que 8-10 μm de

diamètre [305]. Les L3 sont des organismes de grande taille (750-800 μm de longueur pour un

diamètre de 10-12 μm à H0, le double à J8) affichant une musculature puissante permettant

leur motilité [361]. Ils peuvent également libérer des molécules excrétées/sécrétées [362], qui

pourraient faciliter leur passage des capillaires pulmonaires à travers le poumon jusqu'à la

cavité pleurale. Il est aussi possible qu'une partie des L3 arrivant dans les poumons y soit

piégée et soit incapable de se diriger vers la cavité pleurale. Une autre partie des L3 pourrait

ne pas être retenue dans les capillaires mais rejoidrait la circulation générale (Figure 39A).

Concernant cette deuxième hypothèse, aucune L3 n'a été retrouvée dans le sang, mais ces L3

pourraient être détruites dans les organes de nettoyage du sang tels que le foie ou la rate qui

sont fortement vascularisés. Il est aussi possible que ces L3 soient piégées dans les capillaires

des organes distants où elles ne pourraient pas se développer.

164

Pour contourner la peau et les étapes lymphatiques, un nouveau mode d'inoculation a

été utilisé pour infecter les souris (Figure 29). L'inoculation intraveineuse s'est révélée très

efficace comme le montre l'augmentation du rendement filarien. Deux fois plus de L3 ont été

récupérées dans la cavité pleurale des souris infestées en IV comparé à des souris infestées

naturellement ou en SC. Cependant, même chez les souris infestées en IV, plus de la moitié

des L3 est perdue après inoculation, ce qui étaye l'hypothèse selon laquelle une partie

importante des L3 est située ailleurs et ne se développe pas jusqu'au stade adulte. Il est aussi

possible que l'injection intraveineuse soit responsable d'une vasodilatation des capillaires

pulmonaires due à l'apport de liquide dans le sang, ce qui empêcherait certaines filaires d'être

bloquées. Dans le modèle IV, toutes les larves sont inoculées en même temps dans le sang

veineux, qui rejoint directement la circulation sanguine pulmonaire (Figure 39). Ceci explique

pourquoi tant de L3 sont observées dans les poumons dès les premières heures de l'infection.

En effet, en s'affranchissant des goulets d'étranglement que représentent la peau et le système

lymphatique, on favorise une arrivée rapide et synchronisée des L3 dans les poumons. Ce

modèle suggère également que la migration à travers le poumon peut être rapide car les larves

commencent à s'accumuler dans la cavité pleurale dès 2 heures après injection (Figure 29B)

Les différences observées entre les souris infestées en SC et IV pourraient être dues à

ce nombre plus élevé de L3 pulmonaires chez les souris IV. En ce qui concerne la pathologie,

il existe une forte corrélation entre le nombre d'hémorragies et le nombre de L3 récupéré dans

les poumons, le plus grand nombre d'hémorragies étant observé à H6 chez les souris infestées

en IV (Figure 30). L'obstruction des capillaires pulmonaires par les L3, ainsi que le

mouvement des L3, pourraient provoquer les zones hémorragiques observées dans les

poumons. Une telle corrélation n'est vraie ni pour la présence de granulomes ni pour

l'accumulation de neutrophiles dans l'espace périvasculaire des poumons. Ces deux

phénomènes sont observés beaucoup plus tard dans l'infection (J4 et J8), lorsque le nombre de

larves dans les poumons chez les souris infestées en IV ou SC est similaire.

Au cours de la migration des L3, deux phases distinctes peuvent être identifiées,

indépendamment du mode d'inoculation, et sans corrélation avec le nombre de filaires (Figure

40) :

La première, ayant lieu quelques heures après l'infection, se caractérise par une

augmentation des cytokines pro-inflammatoires (Figure 35 et Tableau 17) telles que l'IL-1β et

l'IL-33 (une cytokine cruciale pour la mise en place des réponses Th2 dans les muqueuses

[363,364]) et une augmentation des neutrophiles dans les capillaires pulmonaires [271]. Les

165

neutrophiles diminuent la survie dans les poumons des larves de Nippostrongylus brasiliensis

mais au prix d'une exacerbation des hémorragies et de l'inflammation pulmonaires [339]. Ces

différents effets sont probablement dus au choc oxydatif consécutif à l'activation des

neutrophiles, accompagnée par la libération de myéloperoxydase (MPO) [343].

La deuxième phase, qui se produit entre 4 et 8 jours après l'infection, se caractérise par

l'accumulation des L3 dans la cavité pleurale (Figure 27), la présence de granulomes

pulmonaires et de neutrophiles dans le PVS des poumons (Figures 31 et 32), et une

augmentation de neutrophiles, d'éosinophiles et de macrophages dans les espaces broncho-

alvéolaires et pleuraux (Figures 33 et 34). Ceci est associé à une augmentation des transcrits

pulmonaires de cytokines régulatrices telles que l'IL-9 ou les niveaux d'IL-4 et de MCP-1

(CCL2) dans le lavage bronchoalvéolaire. Les cellules lymphoïdes innées de type 2 (ILC2)

pourraient participer à la production de ces molécules et aux recrutements cellulaires : elles

sont présentes dans les poumons à l'homéostasie [365] et peuvent produire, après stimulation

par l'IL-33, de l'IL-4 et de l'IL-9 mais aussi de l'IL-5 et de l'IL-13 [366]. Elles participeraient

alors à l'activation alternative des macrophages et au recrutement des éosinophiles, qui ont des

effets antihelminthiques et un rôle dans la réparation des tissus [277,320,349,367].

Chez les souris infestées par L. sigmodontis, les infiltrats de neutrophiles observés

dans les capillaires pulmonaires à H6 sont résolus au plus tard à J4 [271]. Ceci concorde avec la

baisse observée à J4 de l'IL-1β et de l'expression des transcrits de cytokines pro-

inflammatoires chimiotactiques pour les neutrophiles, telles que CXCL1 et CXCL5 et dans

une moindre mesure l'IL-6 (Figure 35). Il a notamment été montré que le traitement par des

anticorps anti-CXCL5 atténue l'accumulation de neutrophiles pulmonaires dans un modèle

murin d'inflammation pulmonaire [368].

166

Figure 40. Lors de la migration des L3 de L. sigmodontis au sein des poumons- espaces

pleuraux compris- des processsus inflammatoires physiologiques opèrent-ils ?

Phase inflammatoire : en arrivant dans les poumons, les L3 induisent une rupture des

capillaires pulmonaires entraînant des hémorragies. Ceci s'accompagne de la libération de

DAMPs (motifs moléculaires associés au danger) comme l'IL-33, et d'IL-1β.

Dans cette réaction inflammatoire, plusieurs facteurs comme des chimiokines, des DAMPS ou

Wolbachia entraînerait alors le recrutement de neutrophiles dans les poumons. L'activation

des neutrophiles et la production de myéloperoxydase et de NETs pourrait participer au

contrôle des filaires, directement ou indirectement et à la pathologie.

Phase réparatrice : l’IL-33 activerait la production d'IL-4 par les cellules pulmonaires comme

les ILC2, entraînant l'activation alternative des macrophages et l'initiation de la réparation du

tissu pulmonaire. Dans le même temps, la diminution de l'expression de molécules

chimiotactiques pour les neutrophiles diminuerait leur recrutement.

167

Entre J4 et J8, les neutrophiles sont observés dans les espaces périvasculaires

pulmonaires et le liquide bronchoalvéolaire. Ces résultats suggèrent que les neutrophiles

circulent des capillaires vers les alvéoles et les PVS, et le rôle de ces espaces dans le contrôle

des populations de neutrophiles : après la migration des L3 de L. sigmodontis et la mise en

place des réponses régulatrices, les neutrophiles sanguins pourraient rejoindre les alvéoles et

les PVS pour être éliminés par les macrophages résidents. En effet, les macrophages

alvéolaires peuvent phagocyter les neutrophiles apoptotiques après l'inflammation pulmonaire

[369] et les macrophages interstitiels ont des capacités de phagocytose [318].

Après l'arrivée des L3 dans la cavité pleurale, les éosinophiles et les macrophages

pourraient cibler les larves infectantes. Cependant, ces cellules contribuent à la genèse du

granulome réactionnel contre les exuvies et non contre les L3/L4 [202]. De plus, le recrutement

des neutrophiles dans la cavité pleurale à ces temps précoces reste faible et n'est probablement

pas suffisant pour éliminer les L3.

Si les mêmes événements se succèdent chez les souris infestées en SC et en IV, la

cinétique de la réponse est légèrement différente : 1) les taux d'IL-1β mesurés à H6 dans la

cavité pleurale des souris IV sont plus élevés que ceux des souris infestées en SC. Ceci est

probablement la conséquence de l'afflux massif des L3 dans les poumons et de l'arrivée des

premières L3 dans la cavité pleurale ; 2) dans les poumons, la baisse plus importante des

transcrits de CXCL1 à J4 est accompagnée d'une baisse plus précoce du nombre de

neutrophiles dans le LBA, qui revient au niveau des souris naïves à J8. 3) Les infiltrats

d'éosinophiles sont détectés plus tôt chez les souris IV (J4 vs J8), ce qui indique que

l'initiation de la réponse pleurale est plus rapide chez les souris infestées en IV. Ces

différences suggèrent que la mise en place de la phase de régulation de l'inflammation serait

plus précoce chez les souris infestées en IV.

D'autres nématodes parasites présentent une migration pulmonaire similaire, en

particulier Nippostrongylus brasiliensis. Bien que N. brasiliensis soit un parasite gastro-

intestinal de rongeurs, ses L3 pénètrent dans la peau et migrent vers les poumons où se

produit la mue en L4. Des dégâts pulmonaires similaires à ceux que nous observons ont été

décrits chez les souris infestées par N. brasiliensis 23 h après infection, avec une résolution

vers le 7èmejour p.i. [320]. Une forte inflammation pulmonaire est observée dans l'infection par

ce nématode [320]. Elle est caractérisée par un recrutement de neutrophiles et la présence de

nombreuses cytokines inflammatoires comme l’IL-1β etl’IL-17 qui sont impliqués dans

168

l'augmentation du nombre de neutrophiles, mais aussi l’IL-4 et l’IL-5. Ces interleukines

pourraient modifier l’activation des macrophages alvéolaires en les orientant en AAM et ainsi

stopper l’avancée des lésions pulmonaires aiguës, notamment en limitant la production d'IL-

17 grâce aux molécules RELM-α, et Arginase-1 [342]. Il est intéressant de souligner que même

si ces deux espèces de nématodes sont très différentes (une filaire habitant dans les tissus vs

un strongle gastro-intestinal), une partie de la voie de migration des L3 est identique et semble

induire des réponses similaires (hémorragies et infiltrats de neutrophiles suivis d'une

réparation médiée par les macrophages AAM).

Les neutrophiles sont dotés d'un vaste répertoire de PRR (Pattern Recognition

Receptor/ récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires) permettant la reconnaissance

d'agents pathogènes ou de lésions tissulaires [370]. Parmi ces PRR, les neutrophiles expriment

tous les membres de la famille des récepteurs Toll-like (TLR), à l'exception du TLR3 [371] et

des capteurs cytoplasmiques tels que NOD-1, RIG1, MDA5 et IFI16 [370,372,373]. La détection

des agents pathogènes et des lésions tissulaires par ces PRR active les fonctions effectrices

des neutrophiles comme la phagocytose des micro-organismes, la production de réactifs

intermédiaires de l'oxygène, de cytokines, d'enzymes lytiques et de peptides antimicrobiens

[374]. Un autre mécanisme d'action des neutrophiles est la formation de NETs (Neutrophil

Extracellular Traps) ou nétose. La formation NETs ou nétose est un processus graduel

impliquant notamment la génération de réactifs de l'oxygène et la libération extracellulaire de

MPO et de la chromatine [375,376]. Les NETs peuvent capturer des bactéries, des protozoaires et

des virus [377]. Toutefois, les neutrophiles peuvent détecter la taille des microorganismes et

libérer des NETs en présence de pathogènes de grande taille comme les champignons [378]

[379]. Les NET peuvent également immobiliser les larves du nématode Strongyloides

stercoralis facilitant l'élimination des parasites par les cellules du système immunitaire [380].

La destruction des Mfs de B. malayi par des neutrophiles humains in vitro ne fait pas

intervenir la production de NETs [381]. Cependant, les neutrophiles murins en présence de

Litomosoides sigmodontis in vitro libèrent de la MPO et de l'ADN extracellulaire en quelques

heures (Figure 37) et génèrent des réactifs de l'oxygène [257], trois éléments signature de

nétose. L'observation des cultures en microscopie électronique à balayage (Figure 38) ou en

microscopie à fluorescence après marquage de l'ADN extracellulaire [257] montre

effectivement la libération de chromatine par les neutrophiles. Dans les conditions étudiées, la

présence des neutrophiles et la formation des NETs ne semblent pas suffisantes pour piéger

les filaires. En effet, les NETs sont observés à distance des filaires (Figure 38). Il semble

169

probable que les neutrophiles aient été activés par des molécules excrétées par les filaires, par

un contact direct avec les L3 qui sont très mobiles en culture ou via leur endosymbionte

Wolbachia. Un mécanisme de nétose induit par Wolbachia a en effet été démontré dans

l'onchocercose humaine [382].

En conclusion, ces résultats suggèrent que les L3 peuvent induire la nétose chez les

neutrophiles mais la présence de NETs in vivo n'est pas clairement démontrée.

171

CHAPITRE 2 :

L’héterodimère S100A8/A9 - calprotectine – favorise-t-il la survie de Litomosoides sigmodontis ?

172

Introduction

Le contenu en protéines du cytosol des neutrophiles est constitué pour 40% de deux

molécules : S100A8 et S100A9, qui sont donc les protéines les plus abondantes dans ces

cellules [383]. Ces molécules sont retrouvées en grandes quantités dans le milieu extracellulaire

lors de l'inflammation et sont souvent associées aux pathologies pulmonaires [384-387]. Elles ont

aussi été retrouvées dans les nodules onchocerquiens contenant des neutrophiles [57]. Dans les

poumons, l'inhalation de S100A9 entraîne un recrutement de neutrophiles en induisant une

augmentation de l'expression de CXCL-10 [388] ; à l'inverse, en cas d'inflammation pulmonaire

due au LPS, S100A9 et l'hétérodimère S100A8/S100A9 diminuent ce recrutement en

réduisant l'expression de gènes codants pour des cytokines comme le TNF-α, l'IL-1β ou l'IL-6

[388]. S100A8 diminue aussi les symptômes asthmatiques en contribuant à l’élimination des

réactifs de l'oxygène nécessaires à l'activation des mastocytes, lesquels en dégranulant libèrent

de l'histamine et de nombreuses cytokines inflammatoires chimiotactiques pour les

éosinophiles [389]. S100A8 et S100A9 sont également présentes dans les monocytes où elles

représentent 5% de leurs protéines ; elles sont absentes des macrophages et des lymphocytes

dans les tissus. L'expression de S100A8 et S100A9 peut être induite sous conditions

inflammatoires dans d'autres types cellulaires comme les kératinocytes ou les cellules

épithéliales [390-393]. De plus, une augmentation du S100A8 et du S100A9 est observée dans

les cellules tumorales de nombreux cancers [387,394-396].

Les protéines S100 tirent leur nom de leur parfaite solubilité dans une solution de

sulfate d’ammonium saturé à 100% [397]. Actuellement 25 protéines S100 ont pu être

identifiées et constituent une famille au sein des calciprotéines à motif EF-hand [398]. Les

motifs EF-hand, composés de deux hélices alpha reliées par une boucle, sont connectés par

une région intermédiaire faisant office de charnière [399] et permettent la fixation du calcium.

Les protéines S100 sont multifonctionnelles et jouent un rôle dans la régulation d’un grand

nombre d’activités cellulaires. Elles interagissent avec de nombreuses protéines effectrices

dans la cellule régulant ainsi des activités enzymatiques, des facteurs de transcription, la

phosphorylation de protéines, la dynamique du cytosquelette, la croissance des cellules et leur

différenciation ainsi que l’homéostasie du calcium. Dans le milieu extracellulaire, elles

exercent des fonctions proches des cytokines et montrent des activités régulatrices sur les

cellules inflammatoires, les neurones, les astrocytes, les microglies, les cellules endothéliales

et épithéliales. Les protéines S100 participent à la migration cellulaire et la chimiotaxie, ainsi

qu’au développement et à la réparation des tissus ([400-402] et Figure 41).

173

Figure 41. Les protéines de la famille S100, une famille détectée chez les vertébrés

Les protéines S100 sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires comme la

différenciation et la croissance cellulaire, la migration ou encore l'apoptose. D'après [403].

Jusqu’ici les protéines S100 ont été isolées à partir de vertébrés [404,405] et l’analyse des

génomes disponibles d’invertébrés ne révèle aucune séquence similaire aux gènes des

protéines S100 dans ces organismes. Ainsi, ces protéines représenteraient un groupe

phylogénétique récent. Chez l’homme, la plupart des gènes des protéines S100 sont regroupés

dans la région 1q21 du chromosome 1 [406]. La structure de ces gènes est hautement conservée

[427]. La proximité physique de ces gènes est à l’origine de leur nomenclature officielle [407] ; la

lettre A correspondant au complexe multigénique et le chiffre qui suit à la position relativ de

chaque gène [408].

174

Figure 42. Effets cellulaires potentiels de l’hétérodimère S100A8/S100A9

Sur les neutrophiles, S100A8/A9 favorise l'expression de molécules inflammatoires, de la

phagocytose et de la migration à travers l'endothélium vasculaire. De même, il favorise la

migration et le phénotype inflammatoire des monocytes. Les cellules endothéliales peuvent

exprimer S100A8/A9 après exposition à des stimuli inflammatoires, et quand S100A8/A9 est

exogène, il favorise l'expression de molécules d'adhésion, de cytokines et la perméabilité de la

couche endothéliale. S100A8/A9 inhibe la différentiation des cellules dendritiques, la

présentation antigénique et la libération de molécules inflammatoires. Enfin, S100A8/A9 peut

favoriser la prolifération des cellules musculaires lisses.

175

Les protéines S100 sont de petites protéines agencées en dimères [398] et dont le

poids moléculaire d’une sous-unité est compris entre 9 et 14 kilodaltons [409,410]. La plupart

des S100 (S100A4, A6, A7, A8, A10, A11, A12 et S100B) existent sous forme

d’homodimères. Cependant, elles peuvent aussi former des hétérodimères, comme c’est le cas

pour S100A1 et S100B, S100A1 et S100A4, S100A6 et S100B, S100A11 et S100B ainsi que

S100A8 et S100A9 [411-414].

S100A8 et S100A9 forment des hétérodimères associés de manière non covalente,

également appelés calprotectine [415].

Des souris déficientes en S100A8 (S100A8-/-) et en S100A9 (S100A9-/-) ont été produites

[355,416]. Si l'absence de S100A8 est létale pour les embryons [416], la perte de S100A9 conduit à

des souris viables et fertiles [355]. L'absence de S100A9 conduit à une diminution de 30% de

cellules exprimant le S100A8 dans la moelle osseuse et le S100A8 n'est détecté dans aucune

cellule périphérique. Les transcrits d'ARN messager de s100a8 sont détectés dans les cellules

des souris déficientes en S100A9 suggérant une régulation post-transcriptionelle de s100a8

[355]. L'hétérodimère S100A8/S100A9 est donc aussi absent de ces souris. Cependant

l’absence de S100A8 et de S100A9, qui représentent près de 40% des protéines cytosoliques

des neutrophiles normaux, n'affecte pas le développement de neutrophiles viables et matures

[355].

La calprotectine intracellulaire interagit avec le cytosquelette. En présence de calcium,

des tétramères (S100A8/S100A9)2 stabilisent les filaments de tubuline en favorisant la

polymérisation de la tubuline et le regroupement des microtubules [417]. Cette interaction joue

un rôle crucial dans le processus de migration des neutrophiles vers les zones inflammatoires

[418,419]. En plus de ces effets intracellulaires, S100A8 et S100A9 font partie des médiateurs

endogènes exprimés à la suite d'une agression d'origine septique ou non (alarmines) et ont une

activité pro-inflammatoire sur de nombreux types cellulaires, comme les cellules

endothéliales, les monocytes ou les neutrophiles (Figure 42). Les neutrophiles libèrent

S100A8 et S100A9 dans l'espace extracellulaire via des mécanismes passifs et actifs. Leur

libération passive est souvent la conséquence de dommages tissulaires, de la nécrose des

cellules, ou de la formation de NETs (Neutrophil extracellular Traps) [398,420,421]. En revanche,

la sécrétion des complexes S100A8/S100A9 par les phagocytes activés pendant les processus

inflammatoires est un processus spécifique qui est induit lors de leur contact avec

l'endothélium enflammé [398]. Le S100A8/S100A9 extracellulaire stimule l’adhésion et la

transmigration des neutrophiles à travers les cellules endothéliale de plusieurs manières :

176

(1) il active le TLR-4 des neutrophiles qui entraine l'expression des intégrines β2 à leur

surface [422-425]); (2) il contribue à augmenter l’expression d’ICAM-1 (qui fixe l'intégrine β2)

et de VCAM-1 à la surface des cellules endothéliales [418,426] (3) il entraîne la diminution de

l'expression des molécules de jonctions cellulaires, induisant une perméabilité accrue de la

monocouche endothéliale [427,428]. En outre, S100A8/S100A9 régule la survie cellulaire et le

nombre de neutrophiles par un effet anti-apoptotique [429].

Outre leurs propriétés pro-inflammatoires, S100A8/S100A9 présentent des propriétés

régulatrices pour limiter les réponses immunitaires exacerbées et les dommages associés. Les

neutrophiles activés produisent de grandes quantités de réactifs oxygénés pouvant mener à

d’importants dommages cellulaires et tissulaires. S100A8 et S100A9 possèdent des propriétés

antioxydantes et peuvent prendre en charge les ROS (Reactive oxygen species) et les NO

(oxydes nitriques) [430-436]). L'hétérodimère affiche aussi une affinité de liaison élevée pour les

ions Zn2+ et Mn2+ en plus de Ca2+ [437]. La liaison de S100A8/S100A9 à Zn2+ et Mn2+ pourrait

participer à son action antimicrobienne, en chélatant ces ions dans l'espace extracellulaire, les

rendant indisponibles aux bactéries [437,438].

S100A8/S100A9 peut aussi avoir un effet immunosuppresseur sur les cellules

phagocytaires : la pré-stimulation de monocytes avec du S100A8/S100A9 induirait leur

inhibition d'une manière TLR4-dépendante, entraînant l'absence de réponse à une stimulation

ultérieure avec du LPS [439]. De plus, des expériences sur des souris déficientes en

l'hétérodimère S100A8/S100A9 indiquent qu'il pourrait bloquer la différenciation des cellules

dendritiques, l'expression des molécules de co-stimulation (CD80 et CD86) et la présentation

antigénique, entraînant une diminution de la réponse des cellules T [440,441]. Dans la cavité

péritonéale, S100A9 induit une baisse des capacités phagocytaires des macrophages [442] qui

serait due, au moins en partie, à la production d'IL-10 par les cellules B1 [443]. Enfin, la

phagocytose des neutrophiles apoptotiques par les macrophages diminuerait leur activation

d'une manière S100A9 dépendante [444].

Des études de résonance plasmonique de surface indiquent qu’en présence de Ca2+ ou

de Zn2+, S100A9 possède une grande affinité pour le Receptor for Advanced Glycation End-

products (RAGE) alors que S100A8 n’en possède aucune [445]. Ces données suggèrent que

S100A9 pourrait être le ligand principal de RAGE. Plusieurs autres études ont révélé

l’association de S100A8 ou S100A9 avec d’autres récepteurs cellulaires. Les protéoglycans

avec des sulfates héparinés représentent un site de liaison potentiel pour S100A8/S100A9. En

effet, S100A9 possède une forte affinité pour les sulfates d’héparines/héparanes présents à la

177

surface des cellules endothéliales [446]. Le récepteur scavenger CD36 a également été proposé

comme récepteur possible de S100A8/S100A9 [447,448]). Enfin, le TLR-4 a été suggéré comme

récepteur principal de S100A8, alors que le complexe S100A8/S100A9 avait une activité

réduite [449,450]. Une étude a aussi montré que S100A9 se liait avec le CD147 à la surface de

mélanomes métastatiques, ce qui favorisait la production de cytokines inflammatoires et la

libération de MMP [451].

Le rôle de S100A8/S100A9 dans les infections filariennes n'est pas connu. Les

résultats récents de Karadjian [271] suggèrent que S100A8 et S100A9 pourraient être des

marqueurs d’inflammation dans l’infection filarienne avec L. sigmodontis chez la souris

BALB/c. Du S100A8/S100A9 est libéré par les neutrophiles lors de la nétose [379]. Il pourrait

donc participer aux réponses dans la peau et dans les poumons des souris infestées (Chapitre

1). De plus, l'infection par L. sigmodontis de souris déficientes en TLR4 (TLR4-/-), un des

recepteurs de S100A8 et S100A9, a montré un rôle de ce récepteur dans l'initiation de la

microfilarémie [288,289]. Or la stimulation in vitro avec des extraits de filaires de lignées

cellulaires transfectées avec différents TLR, ou de macrophages provenant de souris TLR2 ko

ou TLR4 ko a montré que les réponses à Brugia malayi et Onchocerca volvulus dépendent de

TLR2, mais pas de TLR4 [267]. S100A8 et/ou S100A9, par le biais du TLR4, pourraient donc

moduler les réponses antifilariennes.

Ce chapitre présente les résultats des expériences en cours visant à préciser le rôle de S100A9

lors de la phase pré-patente de l'infection par L. sigmodontis.

178

Résultats

1. S100A9, un marqueur de l’inflammation aiguë chez les souris BALB/c infestées par

L. sigmodontis ?

1.1 Augmentation précoce des transcrits s100a8 et s100a9 dans le poumon

Pour définir la cinétique des réponses S100A9 dans l’environnement pulmonaire, des souris

BALB/c ont été infestées par voie sous-cutanée (SC) ou intraveineuse (IV) par Litomosoides

sigmodontis. L'expression de s100a8 et s100a9 a ensuite été évaluée à H2, H6, J4 et J8 p.i.

dans le tissu pulmonaire des souris (Figure 43). Les transcrits des deux molécules augmentent

dès quelques heures p.i. avant de diminuer au cours des jours suivants chez les souris infestées

en SC et en IV (Figures 43A et B). Le pic d'expression est détecté plus tôt chez les souris

infestées en IV (H2 p.i. au lieu de H6 p.i. pour les souris infestées en SC), mais le niveau des

pics est légèrement plus élevé en SC.

Figure 43. Augmentation précoce et transitoire des transcrits s100a8 / s100a9 au niveau

des poumons de souris BALB/c hôtes de L. sigmodontis


(SC), soit par voie intraveineuse (IV). Deux heures (H2), six heures (H6), quatre jours (J4) et

8 jours (J8) après inoculation, les souris ont été sacrifiées puis les poumons ont été isolés et

congelés. L'ARN a ensuite été isolé et rétro-transcrit. Des q-RTPCR ont été effectuées pour

les transcrits de (A) s100a8 et (B) s100a9. La normalisation a été faite avec le gène de ménage

de la β-actine par la méthode 2-ΔΔCT, n = 5-6 (pool de 3 expériences indépendantes). Les

résultats sont exprimés en moyenne du facteur de changement ("fold change") ± SEM; Une

ANOVA bidirectionnelle suivie d'un Bonferonni a été effectuée, * p <0,05 différence entre les

souris infestées par IV et SC, ## p <0,01, ### p <0,001 différence entre les temps.

179

1.2 La protéine S100A9 dans les Lavages Broncho Alvéolaires/LBA et fluides des

cavités pleurales

Afin d'analyser plus avant la réponse S100A9 dans le poumon, le niveau de protéine

S100A9 a été déterminé à la fois dans les fluides broncho-alvéolaires et pleuraux (Figure 44).

La protéine est augmentée dans les deux fluides à H6 p.i. chez les souris infestées IV et SC.

Cependant, les niveaux sont beaucoup plus élevés dans le liquide pleural que

bronchoalvéolaire.

Figure 44. Augmentation précoce et transitoire du S100A9 dans les fluides broncho-

alvéolaires et pleuraux de souris BALB/c.

Des souris BALB/c ont été infestées avec 40 L3 L. sigmodontis soit par voie sous-cutanée

(SC), soit par voie intraveineuse (IV). Deux heures (H2), six heures (H6), quatre jours (H4) et

8 jours (H8) après l'inoculation, les souris ont été sacrifiées. Les liquides broncho-alvéolaires

et pleuraux ont été récupérés et des dosages du S100A9 ont été effectués par ELISA. (A-D)

Liquide bronchoalvéolaire (LBA) (A et B, respectivement souris SC et IV infestées, n = 6) et

liquide pleural (PL) (C & D, respectivement souris SC et IV infestées, n = 10-12, Pool de 3

expériences indépendantes). Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. ANOVA à un

facteur suivi d'un Bonferonni, ** = p <0,01, * = p <0,05 (différence entre les souris infestées

et naïves). Nt : non testé.

181

1.3 Augmentation du nombre de neutrophiles S100A9+ dans les poumons

Dans les premières heures suivant l'inoculation des L3, des neutrophiles sont observés

dans le tissu pulmonaire, le plus souvent dans les capillaires pulmonaires et plus rarement

dans l'espace alvéolaire (Figures 45A et B). Le comptage des neutrophiles révèle une

augmentation transitoire de ces cellules à H6 p.i. chez les souris infestées en SC et IV (Figure

3C). Le marquage spécifique de S100A9 sur des sections pulmonaires indique que toutes les

cellules positives pour S100A9 sont morphologiquement identifiables comme des

neutrophiles (Figure 45D et E) et qu'un grand pourcentage des neutrophiles exprime le

S100A9 (Figure 45F). On distingue deux états en fonction du contenu en S100A9 des

neutrophiles, qui est soit faible (Figure 45D, zoom), soit élevé (Figure 45E, zoom). Le

comptage des neutrophiles S100A9+ (Figure 45F) et de neutrophiles S100A9high (Figure 45G)

révèle un pic de neutrophiles S100A9+ à H6 p.i. chez les souris infestées en SC et IV avec une

majorité de neutrophiles S100A9high (74% et 70% respectivement). Les neutrophiles S100A9+

sont absents des granulomes pulmonaires précédemment décrits (Figure 46 et Chapitre 1)

mais sont présents dans le tissu environnant.

<- Figure 45. Augmentation précoce et transitoire de neutrophiles exprimant S100A9

dans les poumons de souris BALB/c.


(SC), soit par voie intraveineuse (IV). Des sections pulmonaires ont été analysées six heures

(h6), quatre jours (j4) et 8 jours (j8) après l'inoculation. (A) Immunomarquage du Ly6G/C

(clone NIMPR-R14) des sections pulmonaires a été réalisée montrant quelques neutrophiles

interstitiels chez des souris naïves (A) et une augmentation des neutrophiles chez la souris

infestée par h6 (B). Les neutrophiles ont été différenciés des monocytes par la forme de leurs

noyaux (B, zoom). (C) Nombre de neutrophiles par mm² sur les sections immunomarquées

pour le Ly6G/C; Les barres représentent la moyenne ± SEM, n = 4-6 (pool de 3 expériences

indépendantes), ANOVA à deux facteurs suivi d'un Bonferonni (** p <0,01, *** p <0,001).

Les souris non infestées sont représentées par une barre horizontale pointillée. (D-G)

Immunomarquage du S100A9 (clone MU14-2A5) sur des sections pulmonaires a été réalisée

montrant (D) une faible coloration de S100A9 dans les neutrophiles (flèches noires). Les

macrophages alvéolaires (flèches pointillées) sont S100A9-. Coin supérieur gauche: zoom sur

un neutrophile S100A9+, (E) coloration importante de S100A9 dans les neutrophiles. Coin

supérieur gauche: zoom sur un neutrophile S100A9high. (F) Nombre total de neutrophiles

S100A9+ et (G) nombre de neutrophiles S100A9high par mm² de poumon. Les souris non

infestées sont représentées par une barre horizontale pointillée. Les résultats sont exprimés en

moyenne ± SEM ; N = 4 souris, 2-3 lames par souris et 2 à 4 sections par lames ont été

analysées.

182

Figure 46. Succès parasitaire en fonction du mode d’inoculation et de la souris C57BL/6

WT ou S100A9-/-.

Des souris C57BL/6 de type sauvage (WT) et déficientes en S100A9 (S100A9-/-) ont été

infestées avec 40 L3 de L. sigmodontis par voie sous-cutanée (SC) ou par voie Naturelle. 12-

13 jours après inoculation, les larves ont été récupérées dans la cavité pleurale. Les résultats

sont exprimés en moyenne ± SEM ; SC : n= 16 par groupe, pool de 2 expériences

indépendantes. Naturelle : n= 5 par groupe, 1 expérience. Des tests de Mann Whitney ont été

effectués : *p<0,05, ** p <0,01.

Figure 47 : Absence de S100A9 dans les granulomes pulmonaires (BALB/c)


(SC), soit par voie intraveineuse (IV). Après deux heures (H2), six heures (H6), deux jours

(H2), quatre jours (H4) et 8 jours (H8) p.i., des sections pulmonaires ont été préparées

Projection confocale d'une coupe épaisse de poumon avec des neutrophiles S100A9+ à H8 .

(souris infestée en IV) montrant l'absence de neutrophiles et de S100A9 dans le granulome

mais leur présence dans le tissu environnant ; Marquage CD31 (vert) pour les cellules

endothéliales et histone H3 (rouge) pour le noyau des cellules. Echelle : 100µm.

183

2. S100A9, un acteur dans le contrôle de l’établissement des L3 de L. sigmodontis ?

Analyse des souris C57BL/6 déficientes en s100a9

2.1 L’absence de s100a9 se traduit par un moindre établissement des larves L3

Pour établir le rôle du S100A9 dans l'infection par L. sigmodontis, des souris

déficientes en S100A9 de fond génétique C57BL/6 ont été utilisées. La perte de S100A9

conduit à des souris viables [355]. L'absence de S100A9 conduit à une diminution de 30% de

cellules exprimant le S100A8 dans la moelle osseuse et le S100A8 n'est détecté dans aucune

cellule périphérique. Bien que les transcrits d'ARN messager de s100a8 soient détectés dans

les cellules des souris déficientes en S100A9, la protéine n'est pas produite [355].

L'hétérodimère S100A8/S100A9 est donc aussi absent de ces souris.

Des souris de type sauvages (WT) ou des souris déficientes en S100A9 (S100A9-/-) ont

été infestées soit par transmission des L3 par l'acarien vectoriel O. bacoti (infection

"Naturelle") ou par inoculation de 40 L3 en SC. Le succès parasitaire a été évalué vers 12-13

jours p.i., chez des jeunes L4 (Figure 47) et révèle une forte baisse du nombre de L4 dans la

cavité pleurale des souris déficientes en S100A9 dans les deux modes d’inoculation (infection

SC et Naturelle), suggérant un rôle du S100A9 favorisant la survie des parasites. Lors de

l'infection naturelle, le nombre de parasites inoculé n'est pas connu et dépend du taux

d'infection des acariens. Le nombre de parasites récupéré varie donc d'une expérience à

l'autre. Aucun parasite mort ni aucun granulome n'a été retrouvé à ce temps d’autopsie, ce qui

suggère que l’effet filaricide pourrait être antérieur, potentiellement pendant la phase de

migration des L3.

184

Figure 48. Dénombrement - J12/13- des cellules dans les fluides pleuraux et le LBA.


infestées avec 40 L3 de L. sigmodontis par voie sous-cutanée (SC) ou par voie naturelle

(NAT). 12-13 jours après inoculation, les cellules résidentes de la cavité pleurale et du LBA

ont été récupérées. (A) Nombre total de cellules dans la cavité pleurale (B) Nombre total de

cellules dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire. Les résultats sont exprimés en moyenne

+/- SEM. SC : n= 8 souris par groupe, 1 expérience. NAT : n=5 souris par groupe, 1

expérience. Des test de Mann Whitney ont été effectués *p<0,05 *** p <0,001.

Figure 49. Correlation entre le nombre de parasites dans la cavité pleurale et le nombre

de cellules dans le « Lavage Broncho-Alvéolaire (LBA) ».

Corrélation (Pearson) entre le nombre de cellules dans le liquide bronchoalvéolaire (LBA) et

le nombre de parasites retrouvés dans la cavité pleurale. r2=0,6965, p<0,0001. Les souris WT

sont indiquées en vert et les S100A9-/- en rouge. SC : n= 8 souris par groupe, NAT : n= 5

souris par groupe, 1 expérience par mode d'inoculation.

185

2.2 L’absence de S100A8/A9 se traduit par un moindre recrutement cellulaire

dans le LBA mais facilite celui dans la cavité pleurale

Les réponses cellulaires dans la cavité pleurale et dans l'espace bronchoalvéolaire ont

été étudiées chez les souris S100A9-/- (Figure 48).

Le nombre total de cellules chez les souris infestées en SC est toujours inférieur à celui des

souris infestées naturellement via les vecteurs, que ce soit dans la cavité pleurale ou dans

l’espace bronchoalvéolaire (Figure 48). Le nombre de cellules pleurales est plus important

chez les souris S100A9-/- (Figure 48A) alors que le nombre de cellules dans l’espace

bronchoalvéolaire est plus faible chez les souris S100A9-/- (Figure 48B), et ceci quel que soit

le mode d’inoculation.

En fait, le nombre de cellules dans le LBA est corrélé au nombre de parasites ayant

rejoint la cavité pleurale (r2=0,6965 et p<0,0001), indépendamment du mode d’inoculation et

de la souche murine (Figure 49). Comme les charges parasitaires sont plus élevées en

infestation naturelle ceci explique la différence observée. De plus les charges parasitaires

étant plus faibles dans les souris S100A9-/- le nombre de cellules est donc légèrement plus

faible dans le LBA des souris S100A9-/- (Figure 48B).

Une telle corrélation entre le nombre de cellules et le nombre de filaires n’est pas observée

dans la cavité pleurale (r2=0,0140 et p=0,5639) où malgré un nombre plus faible de parasites

chez les souris S100A9-/-, le nombre de cellules pleurales augmente.

186

Les pourcentages de macrophages et de neutrophiles dans la cavité pleurale et le LBA

sont similaires entre les souris WT et S100A9-/- ; de ce fait, les nombres de macrophages et de

neutrophiles varient comme le nombre total de cellules dans les deux espaces : le nombre de

macrophages est constant entre les souris WT et S100A9-/- pour un mode d’inoculation donné

mais est plus élevé après une infection NAT (Figure 50A-B et D E). Les neutrophiles (Figure

50B et E) sont présents en faible quantité dans la cavité pleurale et le liquide broncho-

alvéolaire.

Le nombre d'éosinophiles tend à augmenter chez les souris S100A9-/- dans les deux

espaces et suivant les deux modes d'inoculation. Les résultats dans la cavité pleurale après

infection naturelle ne sont pas encore disponibles (erreur de phénotypage).

Figure 50. Quantification des macrophages et des neutrophiles pleuraux et alvéolaires.

Des souris C57BL/6 de type sauvage (WT) et déficientes en S100A9 ont été infestées avec 40

L3 de L. sigmodontis par voie sous-cutanée (SC) ou par voie naturelle (NAT). 12-13 jours

après inoculation, les cellules résidentes de la cavité pleurale et du liquide bronchoalvéolaire

(LBA) ont été récupérées et phénotypées en cytométrie en flux. (A) Nombre de macrophages

dans la cavité pleurale ; (B) Nombre de neutrophiles dans la cavité pleurale ; (C) Nombre

d'éosinophiles dans la cavité pleurale. (D) Nombre de macrophages dans le LBA ; (E)

Nombre de neutrophiles dans le LBA. (F) Nombre d'éosinophiles dans le LBA. Les résultats

sont exprimés en moyenne +/- SEM d'une expérience. Cavité pleurale - SC : n = 7-8 souris

par groupe ; NAT : n = 5 souris/groupe. LBA - SC : n = 4 souris par groupe ; NAT : n = 5

souris par groupe. 1 expérience par mode d'inoculation. Des tests de Mann Whitney ont été

effectués *p<0,05

187

2.3 L’absence de S100A8/A9 augmente le nombre de cellules spléniques

Le nombre total de cellules spléniques est plus élevé dans la rate des souris S100A9-/-

que dans celle des souris WT (Figure 51A). Les pourcentages de lymphocytes T CD4+ et

CD8+, de neutrophiles, de macrophages et d'éosinophiles sont identiques entre les deux

groupes ; de ce fait, le nombre de cellules de ces populations cellulaires est plus élevé dans les

rates des souris S100A9-/- (Figure 51B-E).

Figure 51. Effectif accru des populations de leucocytes/lymphocytes spléniques chez les

souris C57BL/6 invalidées pour le gène s100A9 hôtes de L3.

Des souris C57BL/6 de type sauvage (WT) et déficientes en S100A9 ont été infestées avec 40

L3 de L. sigmodontis par voie sous cutanée. 12 jours après inoculation, les cellules spléniques

ont été comptées et phénotypées. (A) Nombre total de cellules spléniques ; (B) Nombre de

lymphocytes T CD4+ ; (C) Nombre de lymphocytes T CD8+ ; (D) Nombre de neutrophiles et ;

(E) Nombre de macrophages. Les résultats sont exprimés en moyenne +/- SEM ; n = 8 souris

par groupe. Des tests t ont été effectués *p<0,05 *** p <0,001.

188

2.4 Le profil cytokinique des cellules spléniques est caractérisé par une

dominance pro-inflammatoire en l’absence de S100A8/A9

Après restimulation pendant 72h par un mitogène (concanavaline A) ou de l’extrait brut de

filaires adultes, la capacité proliférative des splénocytes des souris S100A9-/- est supérieure à

celle des souris WT et en réponse au stimulus filarien ces splénocytes des souris déficientes

en s100a9 produisent davantage des cytokines inflammatoires IL-6, IL-13 ou KC (Figure 52).

Figure 52. Comparaison de la

concentration de cytokines dans les

surnageants de cultures de cellules

spléniques.

Des souris C57BL/6 de type sauvage (WT)

et déficientes en S100A9 ont été infestées

avec 40 L3 de L. sigmodontis par voie sous-

cutanée. 12 jours après inoculation, les

cellules de la rate ont été isolées et 2.106

cellules ont été mises en culture et

stimulées ou non pendant 72h avec de la

Concanavaline A (ConA) à 2.5 µg/mL ou

des antigènes filariens (LsAg) à 25 mg/mL.

Les cultures ont été faites en triplicat pour

chaque souris. Les surnageants de culture

ont été récupérés et des dosages de

cytokines ont été effectués par ELISA. (A)

dosage de l’IL-6 produit après restimulation

de cellules spléniques ; (B) dosage de l’IL-

13; (C) dosage de KC. n = 8 souris par

groupe. Les résultats sont exprimés en

moyenne +/- SEM. n = 8 souris par groupe.

Des tests de Mann Whitney ont été

effectués *p<0,05 ** p <0,01.

189

2.5 Observation de dommages des vaisseaux sanguins pulmonaires et de

processus inflammatoires bronchiques indépendants du S100A8/A9 chez les

souris C57BL/6

L’augmentation précoce de S100A9 dans les poumons (premier paragraphe de ce

chapitre) et l’inflammation bronchoalvéolaire observée chez les souris BALB/c infestées

(Chapitre 1), nous a conduit à réaliser une analyse histologique des poumons mais à un temps

plus tardif (J12-J13) et chez des souris de la lignée C57BL6, WT ou déficientes en S100A9.

Dans 100% des poumons des souris C57BL/6 infestées par voie naturelle et 30% des souris

infestées en SC, des atteintes pulmonaires ont été observées, aussi bien chez les souris WT

que S100A9-/- (Figures 53 et 54). La manifestation principale est une inflammation des

vaisseaux sanguins, qui apparaissent congestionnés et présentent de forts infiltrats

périvasculaires (Figure 53 et 54A-B). Les souris infestées en SC présentent moins de

vaisseaux sanguins enflammés que les souris infestées naturellement (Figures 53 et 54C) et

cette différence ne semble pas due au mode d'inoculation mais au plus grand nombre de

parasites ayant traversé les poumons. En effet, la quantité de vaisseaux sanguins

congestionnés est corrélée au nombre de parasites dans la cavité pleurale (r2=0,45, p>0,0001,

Figure 54D). Le nombre légèrement plus faible de vaisseaux sanguins congestionnés chez les

souris S100A9-/- après l'infection naturelle serait alors dû au rendement parasitaire plus faible

observé chez ces souris.

190

Figure 53. Coupes histologiques de poumons de souris C57BL/6 s100A9-/-.

Les poumons de souris C57BL/6 de type sauvage et déficientes en S100A9 infestées par voie

sous-cutanée ou par voie Naturelle ont été récupérés 12-13 jours p.i. et une analyse

histologique a été effectuée. (A) Lobe gauche d'une souris S100A9-/- infestée en SC et (B)

lobe droit d'une souris S100A9-/- infestée Naturellement. Colorations à l’acide périodique-

Schiff. SC : n = 8 souris par groupe. NAT : n = 5 souris par groupe. 2 sections de lobe ont été

analysées par souris.

191

Figure 54. Nbre de vaisseaux sanguins inflammés et de larves dans la cavité pleurale


infestées naturellement (NAT) ou par voie sous-cutanée (SC) avec des L3 de L. sigmodontis.

12 jours après infection, les poumons ont été récupérés et une analyse histologique a été

effectuée. (A-B) Aspect d'un vaisseau sanguin congestionné et de l'espace périvasculaire et

des bronches adjacentes chez (A) une souris WT infestée naturellement et (B) une souris

S100A9-/- infestée naturellement; (C) Quantification de l'inflammation vasculaire (nombre de

sections de vaisseaux sanguins congestionnés par mm2 de section pulmonaire). Les résultats

sont exprimés en moyenne +/- SEM. Des tests de Mann Whitney ont été effectués *p<0,05

**<0,01 ; (D) Corrélation (Pearson) entre le nombre de sections de vaisseaux sanguins

congestionnés et le nombre de parasites retrouvés dans la cavité pleurale. r2 = 0,545 ;

p<0,0001. SC : n = 8 souris par groupe. NAT : n = 5 souris par groupe. 2 sections de lobe ont

été analysées par souris.

192

Figure 55. Nbre de larves dans la cavité pleural et % de bronches contenant des cellules

caliciformes


infestées naturellement (NAT) ou par voie sous-cutanée (SC) avec des L3 de L. sigmodontis.

12 jours après infection, les poumons ont été récupérés et une analyse histologique a été

effectuée. (A-B) Aspect d'un vaisseau sanguin peu inflammé et de l'espace périvasculaire et

des bronches adjacentes chez (A) une souris WT infestée naturellement et (B) une souris

S100A9-/- infestée naturellement ; (C) Quantification de l'inflammation bronchique (% de

bronches présentant des cellules caliciformes). Les résultats sont exprimés en moyenne +/-

SEM. Des tests t ont été effectués *p<0,05 **<0,01 ; (D) Corrélation (Pearson) entre le % de

bronches enflammées et le nombre de parasites retrouvés dans la cavité pleurale. r2 = 0,410 ;

p=0,0001. SC : n= 8 souris par groupe. NAT : n = 5 souris par groupe. 2 sections de lobe ont

été analysées par souris.

193

La différenciation des cellules épithéliales bronchiques en cellules caliciformes (ou

métaplasie) et leur production de mucus est une des caractéristiques de l'inflammation

pulmonaire. Au niveau des vaisseaux sanguins présentant une inflammation importante,

aucune cellule productrice de mucus n'est observée dans l'épithélium bronchique (Figure 54A

et B). Une métaplasie des cellules caliciformes est néanmoins observée dans les bronches à

proximité d'espaces périvasculaires présentant de faibles infiltrats cellulaires (Figure 55A-B).

Comme pour l'inflammation des vaisseaux sanguins, l'inflammation bronchique est plus

élevée chez les souris infestées naturellement (Figure 55C) et est corrélée au nombre de

parasites dans la cavité pleurale (r2 = 0,410 ; p = 0,0001 ; Figure 55D).

2.6 En l’absence de S100A8/A9, quelles fonctions pour les neutrophiles ?

Les résultats précédents ne sont pas en faveur d’une destruction des larves après leur

arrivée dans la cavité pleurale car aucune L3 ou L4 morte, enkystée ou non, n’a été retrouvée

chez les souris S100A9-/-. Il est donc probable que la baisse du rendement parasitaire

s’établisse en amont de la cavité pleurale, soit au site d’inoculation dans la peau, soit pendant

la phase de migration des L3 y compris dans les poumons.

Dans les deux cas les neutrophiles pourraient être impliqués du fait de la présence

intracellulaire importante de S100A9.

Une expérience préliminaire a été effectuée, dans laquelle des neutrophiles matures

isolés de la moelle osseuse de souris S100A9-/- et WT ont été cultivés avec différents stimuli

pendant 6h, puis des marqueurs d'activations cellulaires ont été mesurés par cytométrie en

flux (Figure 56). Le LPS (ligand de TLR-4), le Pam3Cys (ligand de TLR-2), de l’extrait brut

de filaires adultes (Ls Ag) ou de l’extrait brut de filaires adultes traitées avec de la tétracycline

(Ls Tet), et donc déplétées en Wolbachia, ont été utilisés pour stimuler les cultures.

194

Le CD86 des neutrophiles non stimulé des souris S100A9-/- augmente après 6h de

culture (Figure 56A) ; aucun stimulus ne modifie cette expression. L'expression du CD40 des

neutrophiles est plus élevé chez les souris S100A9-/-, que les cellules soient ou non stimulées,

à l'exception des de Pam3Cys pour lequel le CD40 des neutrophiles augmente à H6 post

culture atteignant celui des cellules S100A9-/-. Un profil similaire à celui du CD40 est observé

pour le CD86 (Figure 56B). L'absence de contrôle à H0 rend nécessaire la reproduction de

cette expérience.

Les surnageants de culture ont été récupérés pour un dosage de molécules

inflammatoires et de marqueurs de nétose (Myéloperoxydase, Neutrophil élastase, ADN

extracellulaire, S100A9) qui restent à réaliser.

Figure 56. Comparaison in vitro de neutrophiles prélevés de souris s100A9+/+ ou

s100A9-/-.

Des neutrophiles de souris C57Bl/6 WT et S100A9-/- ont été purifiés à partir de la moelle

osseuse et 2.105 cellules ont été mises en culture avec soit du LPS, soit du Pam3Cys, soit de

l'extrait brut de filaire adulte (Ls Ag) ou soit de l'extrait brut de filaire adulte traitée à la

tétracycline (Ls Tet). Après 6h de culture, les cellules ont été récupérées et analysées en

cytométrie en flux pour leur expression de (A) CD40 ou (B) CD86. Les cultures ont été

effectuées en triplicat pour chaque souris. Les résultats sont exprimés en moyenne +/- SEM

d'une expérience. n = 3 souris par groupe. Pour chaque temps des tests de Mann Whitney ont

été effectués entre S100A9-/- et WT : *p<0,05.

196

Discussion

Dès les premières heures suivant l'infection par L. sigmodontis l’expression des

transcrits de s100a8 et s100a9 augmente dans les poumons des souris BALB/c de type

sauvage. Ceci est accompagné d’une augmentation transitoire du nombre de neutrophiles

pulmonaires exprimant S100A9 et des niveaux de la protéine dans le liquide

bronchoalvéolaire et le liquide pleural ; ces modifications sont observées 2-6 heures après

infection et elles sont résolues entre J4 et J8. Le même profil de réponse est observé chez les

souris infestées par voies sous-cutanée et intraveineuse, suggérant un effet probablement

distant et indépendant du nombre de parasites : en effet à H2-H6 p.i., très peu de parasites

sont présents dans les poumons des souris infestées en SC et aucun parasite n'a atteint la

cavité pleurale contrairement aux souris infestées en IV (Chapitre 1). Il est donc plus probable

que la libération de S100A9 dans l'environnement pulmonaire soit avant tout une réponse des

neutrophiles à des antigènes de filaires ou de Wolbachia drainés par le flux lymphatique et le

sang jusqu'aux poumons avant l'arrivée des premières filaires. De plus, S100A8 et S100A9

sont importants dans la réponse aux dommages vasculaires [452] et pourraient participer à la

réparation des capillaires pulmonaires après le passage des L3.

Pour étudier le rôle du S100A9 lors l’infection par L. sigmodontis, des souris C57BL/6

déficientes en cette molécule (S100A9-/-) ont été utilisées. Les souris déficientes en S100A9

sont viables et fertiles [355] contrairement aux souris déficientes en S100A8 [416], le partenaire

d'hétérodimérisation de S100A9. Malgré la présence des transcrits S100A8 dans divers

organes chez les souris S100A9-/-, une forte régulation négative de la protéine S100A8 a été

observée chez ces souris ; en effet l’absence de S100A9 entraîne une réduction de 30% des

cellules S100A8+ dans la moelle osseuse et cette valeur diminue drastiquement pendant la

culture de ces cellules ; de plus la protéine S100A8 n’est pas détectable dans les cellules

S100A9-/- du sang périphérique [355]. Cependant l’absence de S100A8 et de S100A9, qui

représentent près de 40% des protéines cytosoliques des neutrophiles normaux, n'affecte pas

le développement de neutrophiles viables et matures [355].

L’hétérodimère S100A8/A9 qui effectue une grande partie des fonctions biologique de

ces molécules - mais pas seulement - est donc aussi absent dans les souris S100A9-/-.

L'inoculation des filaires dans la peau de souris S100A9-/-, que ce soit après injection de L3

par voie sous-cutanée ou par la piqure du vecteur, se traduit par une baisse du succès

parasitaire dans les deux protocoles : les rendements filariens sont diminués 12 jours après

197

infection par rapport à des souris de type sauvage, suggérant que la présence de S100A9

augmenterait la survie des L3. Le recrutement de cellules dans la cavité pleurale des souris

S100A9-/- infestées est plus importants que chez les souris de type sauvage, mais cette

différence est essentiellement due aux macrophages et dans une moindre mesure aux

éosinophiles ; le recrutement des neutrophiles est semblable entre souris s100A9-/- et souris

WT. Ce résultat pourrait paraitre surprenant compte tenu que le S100A9 est avant tout connu

pour ses propriétés inflammatoires et son rôle favorisant le recrutement des neutrophiles

[418,419,453]). En effet, au niveau cellulaire, les neutrophiles S100A9-/- présentent un système de

microfilaments plus organisé et une réduction de la régulation de CD11b médiée par l'IL-8, ce

qui entraîne un potentiel réduit pour répondre aux molécules chimioattractantes in vitro [355] et

nous aurions pu nous attendre à une diminution du recrutement des neutrophiles dans la cavité

pleurale des souris S100A9-/- infestées. Néanmoins, aucun défaut de migration des

neutrophiles n’a été observé dans deux modèles inflammatoires in vivo (injection d’IL-8 ou de

thioglycolate) [355], ce qui suggère que les molécules S100A9 et S100A8 ne sont pas

indispensables au recrutement des neutrophiles dans ces modèles inflammatoires mais aussi

dans l’infection filarienne.

Un effet immunosuppresseur d’une pré-stimulation par le S100A9 sur les cellules

phagocytaires a été décrit dans un modèle d’inflammation au LPS et est dépendant du TLR4

[439-443]). La stimulation des macrophages pleuraux par le S100A9 en l'absence des parasites

dans les premières heures suivant l'infection pourrait être responsable de la mise en place d’un

phénotype tolérogène des macrophages limitant l’inflammation pleurale. La stimulation des

cellules B1 par S100A9 et leur production d'IL-10 pourrait aussi participer au phénomène,

comme cela a été décrit dans la cavité péritonéale [444].

Chez les souris C57BL/6, le rendement parasitaire est stable pendant au moins 20-30

jours [195,196]. A 12 jours post infection, l’augmentation cellulaire observée dans la cavité

pleurale des souris S100A9-/- est encore très inférieure à celle observée chez des souris

sauvages à J20 ou J30, temps auxquels des cellules adhérant aux filaires sont identifiées ainsi

que des granulomes. Il est donc peu probable que la différence de rendement parasitaire

provienne d’une réaction cellulaire filaricide dans la cavité pleurale. L’action de S100A9 sur

les filaires a probablement lieu plus tôt au cours de l’infection, lors de la phase de migration

des L3 de leur site d’inoculation cutané vers la cavité pleurale, donc dans la peau ou dans les

poumons.

198

L'analyse histologique des poumons des souris C57BL/6 a permis d'observer une

inflammation pulmonaire corrélée au nombre de parasites retrouvés dans la cavité pleurale

mais indépendante du S100A9. Cette réponse inflammatoire pulmonaire n'a pas été observée

jusqu'à présent chez les souris BALB/c, soit parce que l'événement est rare après l'inoculation

de 40 L3 et est passé inaperçu, soit parceque elle est due à la différence de susceptibilité entre

les souris C57BL/6 et BALB/c. Ces atteintes pulmonaires semblent être la conséquence du

passage des L3 dans la circulation sanguine pulmonaire qui entraînerait une réaction de

l'endothélium vasculaire. Une inflammation périvasculaire similaire à celle décrite avec L.

sigmodontis a été observée 4 jours après infection chez des souris infestées par

Nippostrongylus brasiliensis et elle était composée de macrophages et d’éosinophiles [320,339].

L’analyse du contenu cellulaire de l'espace périvasculaire et de la lumière des vaisseaux

sanguins congestionnés permettra de mieux caractériser cette inflammation pulmonaire. Des

mécanismes identiques pourraient être à l'origine de la pathologie des vaisseaux sanguins

pulmonaires ayant lieu chez les chiens infestés par Dirofilaria immitis. En effet,

l’inflammation des artères pulmonaires due à la présence de D. immitis dans la circulation

sanguine pulmonaire induit une obstruction progressive de la lumière vasculaire [134].

La réponse cutanée des souris S100A9-/- infestées avec L. sigmodontis n'a pas encore

été étudiée. L’hétérodimère S100A8/S100A9 a des propriétés antioxydantes [430] qui

pourraient diminuer le choc oxydatif produit par les neutrophiles et donc l’action filaricide des

espèces réactives oxygénées (ROS) sur les L3. L’infection avec des L3 de B. malayi diminue

l’action des cellules dendritiques de la peau [265],[266], or il a été décrit que la stimulation des

cellules dendritiques par du S100A9 peut aussi bloquer leur activation et la présentation

antigénique aux lymphocytes [440,441]. CD40 est une protéine costimulatrice trouvée sur les

cellules présentatrices d'antigène et qui est nécessaire pour leur activation. Les neutrophiles

S100A9-/- présentent des niveaux accrus de CD40, mais aussi de CD86. Une augmentation de

l'expression de ces molécules sur les neutrophiles a aussi été associée à leur apoptose [454] et le

S100A9 induit un effet anti-apoptotique sur les neutrophiles - normaux et allergiques - en

augmentant la sécrétion des cytokines MCP-1, IL-6 et IL-8 par les monocytes [429,455]. Pendant

la nétose S100A9 fait partie des molécules libérées par les neutrophiles [398,420,421] et pourrait

contribuer à contrôler la charge parasitaire dans la peau (cf. Chapitre 1). Enfin,

S100A8/S100A9 induit une perméabilité accrue de la monocouche endothéliale [427,428]. Dans

la peau, l'augmentation de la perméabilité vasculaire pourrait entraîner une augmentation du

199

drainage lymphatique et donc une entrée facilitée des parasites dans le système lymphatique

comme cela a été observé pour l’histamine [264].

S100A9 agit comme un DAMP (damage-associated molecular pattern) via TLR4 ou

RAGE et déclenche des réponses inflammatoires anormales [450,456,457]. La réponse

immunitaire en filariose est complexe, en particulier l'implication et le rôle fonctionnel joué

par TLR4. TLR4 et TLR2 sont capables de lier des produits de la bactérie endosymbiotique

Wolbachia comme WSP, la protéine de surface de Wolbachia, et d'induire une réponse

inflammatoire en sécrétant des cytokines pro-inflammatoires à partir de macrophages et de

cellules dendritiques [270]. Cependant, les filaires visent également TLR4 pour moduler la

réponse immunitaire de l'hôte [289]. L’ES-62, une glycoprotéine conjuguée à la

phosphorylcholine, lie le TLR4 et induit une réponse immunitaire anti-inflammatoire/Th2

favorable à la survie du parasite dans l'hôte [458]. En cas d'infection chronique, la filaire induit

l’apoptose des lymphocytes T pour réguler la réponse de l'hôte et ce processus fonctionne

aussi par TLR4 [77]. Les microfilaires de B. malayi modulent l'expression de TLR4 dans des

cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes pour induire un environnement

immunosuppresseur dans l'hôte qui bloque la production de cytokines proinflammatoires et

d'interférons de type 1 [459]. En plus de cet effet inhibiteur des microfilaires sur les cellules

dendritiques, une inhibition partielle de la fonction des cellules de Langerhans humaines a été

observée [459]. Enfin TLR4 est impliqué dans l'activation du système immunitaire conduisant à

l'inhibition de l'embryogenèse filaire ou à la destruction directe des microfilaires. TLR4 a

ainsi un rôle sur la phase patente car presque 100% des souris BALB/c TLR4-/- ont une

microfilarémie sanguine [288].

Les mécanismes inhibant l’embryogénèse de L. sigmodontis via le TLR4 ne sont pas connus.

Les neutrophiles pourraient être impliqués et en particulier leurs protéines S100A8 et

S100A9.

202

CHAPITRE 3 :

Dommages pulmonaires prolongés chez les rongeurs chez lesquels est générée la descendance de Litomosoides

sigmodontis

203

Introduction :

Peu après leur arrivée dans la cavité pleurale, les L3 muent en L4 puis, environ 30

jours après infection, en adultes. Les adultes mâles et femelles se reproduisent alors et à partir

de 55 jours, les femelles pondent les microfilaires qui vont rejoindre la circulation sanguine.

Le statut microfilarien est variable en fonction du rongeur hôte : la gerbille et le rat du coton

ont d’importantes microfilarémies sanguines (>100 Mf/10µL de sang, atteignant jusqu’à 3000

Mfs/10µL de sang) et plus de 90% des individus sont microfilariens. Chez la souris le statut

microfilarien dépend de la lignée [194] et seules les souris BALB/c peuvent être

microfilariennes ; cependant, seulement 40-60% des souris présentent une microfilarémie

après une inoculation en sous-cutanée de L3 ou via un mode d’infestation naturelle par les

vecteurs ; de plus les microfilarémies des souris BALB/c sont toujours faibles (1-20Mfs/10µl

de sang).

De nombreuses études ont comparé les statuts microfilarien et amicrofilarien de

différentes souches de souris [196,286,460-462] et ont mis en évidence l'importance de la réponse

immunitaire dans l'établissement la phase patente. Par exemple, des souches de souris

C57BL/6 immunodéficientes peuvent devenir microfilariennes [286,462]. Toutefois, peu d'études

ont comparé les réponses pleurales/pulmonaires des souris microfilarémiques (Mf+) et

amicrofilarémiques (Mf-) au sein des souris BALB/c. Il a récemment été montré que les

souris Mfpos présentent des concentrations plus élevées d'IL-5 et d'IL-13 dans la cavité

pleurale que les Mfneg [288].

Des études sur la distribution des microfilaires dans des modèles animaux de filariose

ont conclu que les microfilaires non-circulantes sont situées dans les vaisseaux sanguins des

organes profonds [187,460,463]. Chez les humains, des microfilaires ont été détectées dans la rate,

le foie, la moelle osseuse, les reins, la cavité pleurale, les bronches et les capillaires

pulmonaires [78,81,181,182,464-466]. De même, les microfilaires de L. sigmodontis peuvent

s'accumuler dans ces organes chez les rongeurs, et particulièrement dans les poumons

[196,463,467].

204

Les travaux de Wharton (1946 [207]) et Schneider (1968 [208]) ont décrit des lésions

pulmonaires chez le rat du coton (Sigmodon hispidus) et la gerbille (Meriones unguiculatus)

en phase patente d’infestation par L. sigmodontis. Ils ont alors observé une hyperplasie et une

prolifération des cellules mésothéliales avec la formation de "nodules papillaires" et une

fibrose de la plèvre. Des microfilaires ont été observées dans la vasculature pulmonaire, mais

aussi dans le parenchyme, et des infiltrats cellulaires étaient présents autour des bronches

[207,208]. Les atteintes pulmonaires lors de la phase patente n'ont pas été étudiées chez les souris

BALB/c.

L'objectif de ce chapitre est d’étudier la phase patente de l’infection filarienne dans

l’environnement pleural/pulmonaire chez la souris BALB/c, mais en discriminant les

informations relatives aux souris microfilarémiques de celles liées aux souris

amicrofilarémiques.

205

Figure 57. Anomalie du mésothélium pulmonaire de gerbilles hôtes de L. sigmodontis

Des gerbilles ont été infestées avec 80 L3 de L. sigmodontis par voie intrapéritonéale. 6 mois

après infection, les poumons ont été récupérés et analysés en microscopie électronique à

balayage. (A) Aspect normal du mésothélium d'une gerbille amicrofilarémique (B) aspect

pathologique du mésothélium d'une gerbille microfilarémique et (C) vue en coupe du lobe

gauche du poumon d'une gerbille microfilarémique montrant l'aspect pathologique du

mésothélium.

206

Résultats

1. Microfilarémie et dommages pulmonaires chez le mérion

Lors d'autopsies de gerbilles M. unguiculatus utilisées pour maintenir le cycle de vie

de Litomosoides sigmodontis au laboratoire, il a souvent été remarqué que les poumons des

animaux présentant une très forte microfilarémie ont un aspect granuleux à l'œil nu. Pour

caractériser ce phénomène, les poumons d'une gerbille infestée depuis 6 mois et

amicrofilarémique et ceux d'une gerbille présentant des microfilaires sanguines (environ 1000

mf/10µL) ont été observés en microscopie électronique à balayage (Figure 57). Comme cela a

été décrit précédemment [207,208], de nombreuses excroissances sont présentes sur la plèvre

viscérale des poumons de la gerbille Mfpos (que les auteurs avaient alors appelé "nodules

papillaires").

L'observation en coupe du tissu permet d'observer la structure interne de ces

excroissances (Figure 58A). Elles sont constituées de fibres (Figure 58B, flèches), ce qui

suggère un phénomène de fibrose. Sous ces excroissances mais parfois à très grande

proximité de la plèvre viscérale des microfilaires sont observées dans les alvéoles

pulmonaires (Figure 59 flèches).

207

Figure 58. Structure « fibrotique de nodules » au niveau du mésothèlium de gerbilles



balayage. (A) vue en coupe du mésothélium pleural (B) grossissement de la zone encadrée en

(A) montrant la structure fibrotique des "nodules" (Flèches).

208

Figure 59. Microfilaires à proximité de la plèvre viscérale de gerbilles hôtes de L.

sigmodontis.



balayage. Coupe du tissu pulmonaire montrant des microfilaires dans les alvéoles à proximité

de la plèvre viscérale pathologique (Flèches).

209

Figure 60. Dénombrement de L. sigmodontis dans la cavité pleurale, le cœur et le sang de

souris BALB/c.

Des souris BALB/c ont été infestées avec 40 L3 de L. sigmodontis par voie sous-cutanée. (A)

Rendement parasitaire des adultes dans la cavité pleurale au cours de la phase chronique de

l’infection; J70 : n= 25 ; J100 : n = 12. (B) Nombre de granulomes libres retrouvés dans la

cavité pleurale ; J70 : n= 25 ; J100 : n = 12. (C) Microfilarémie dans le sang périphérique. Le

pourcentage correspond au pourcentage de souris présentant des microfilaires sanguines; J60 :

n= 32 ; J70 : n= 13 ; J100 : n= 12 ; (D) Microfilarémie dans le sang cardiaque. J70 : n= 9 ;

J100 : n= 12. Les résultats sont exprimés en moyenne +/- SEM.

210

2. Analyse cinétique de la phase patente chez la souris BALB/c, localisation des parasites

et distinction des souris en deux groupes selon la présence ou non de microfilaires

Pour étudier les interactions entre L. sigmodontis et l'environnement pulmonaire

durant la phase patente, des souris BALB/c ont été infestées par voie sous-cutanée. A 60

jours, 70 jours et 100 jours post-infection, la microfilarémie a été mesurée. A J70 et J100 p.i.,

les parasites présents dans la cavité pleurale ont été comptés. La microfilarémie cardiaque

(dans le sang ventriculaire) a aussi été déterminée (Figure 60). Contrairement à la gerbille,

chez qui l'infection peut durer plus d'un an [201], les parasites sont éliminés vers 100 jours post-

infection chez la souris BALB/c (Figure 60A). Des granulomes sont régulièrement retrouvés

dans la cavité pleurale des souris infestées à J70 p.i., comme cela a déjà été décrit [202]. Ils

contiennent les parasites adultes morts en voie de dégradation [202]. A J100, très peu de

granulome sont retrouvés (Figure 60), suggérant une élimination relativement rapide (moins

de 30 jours) de ceux-ci. Le nombre de microfilaires augmente dans le sang périphérique entre

J60 et J70 p.i. et diminue à J100 (Figure 60C). A J60 p.i., des microfilaires sont détectées dans

le sang périphérique de la moitié des souris, et dans plus de 60% des souris à J70 p.i. Entre

J70 et J100 p.i., le pourcentage de souris dans lesquelles sont observées des microfilaires dans

le sang périphérique tombe à 16%. Etant donné les faibles microfilarémies observées dans le

sang périphérique, le nombre de microfilaires a aussi été mesuré dans le sang cardiaque lors

des autopsies pour exclure les faux négatifs. En effet, lors de l'exsanguination des animaux, le

sang restant se concentre dans les organes, dont le cœur. La microfilarémie y est donc

beaucoup plus élevée (Figure 60D). Cette technique permet de détecter des individus

microfilariens, non identifiés dans le sang périphérique. Le nombre de souris

microfilarémiques y est donc plus élevé à J70 mais surtout à J100 p.i. Par la suite, le statut

microfilarien est donc déterminé dans le sang cardiaque.

L’analyse macroscopique de la cavité pleurale et du bloc cardio-pulmonaire révèle la

présence de nombreuses filaires dégradées prises dans des granulomes attachés au médiastin.

La présence de parasite a donc été étudiée sur des coupes histologiques du tissu pulmonaire.

Des granulomes partiellement intégrés à la surface des poumons sont observés chez 30% des

souris (Figure 61A). Ces granulomes, comme les granulomes de la cavité, contiennent des

parasites adultes morts (dégradation plus ou moins avancée des tissus filariens, y compris de

la cuticule (Figure 61B)). Quelques microfilaires sont également observées dans les poumons

de 80% des souris Mf+, dans les vaisseaux sanguins (Figure 61C) et dans les espaces

périvasculaires (vaisseaux sanguins : 2,0±0,7 mfs/cm2 de section; PVS : 1,1±0,7 mfs/ cm2 de

section).

211

Figure 61. Granulomes et microfilaires libres au jour 70 chez les souris BALB/c.

Des souris BALB/c ont été infestées avec 40 L3 de L. sigmodontis par voie sous-cutanée ; 70

jours p.i., les poumons ont été récupérés et la présence de parasites pulmonaire a été étudiée

en histologie. (A) Granulome piégé dans le tissu pulmonaire du lobe droit. Coloration H&E ;

(B) Section d’un parasite adulte dans un granulome pulmonaire. Le diamètre d'environ 100µm

suggère qu'on est en présence d'un jeune adulte, et donc que l'encapsulement est ancien. Noter

la cuticule encore relativement intacte, les quadrants musculaires détachés et l'aspect dégradé

des structures internes. Coloration PAS ; (C) Microfilaire (flèche) dans un vaisseau sanguin

pulmonaire (les pointes indiquent l’endothélium). Coloration PAS.

212

3. Analyse de profils de biomolécules-transcrits et protéines- au niveau des poumons

Pour caractériser l'environnement inflammatoire pulmonaire dû à la présence des

parasites - adultes et/ou microfilaires - , une analyse des transcrits cytokiniques a été réalisée

sur un pool d'ADNc provenant des poumons de souris infestées à J70 p.i., indépendamment

de leur statut microfilarien (Figure 62A). Sur les 84 gènes compris dans l'analyse (Annexe 1),

30 gènes codant pour des cytokines voient leur expression augmenter lors de l'infection

filarienne (>100% d'augmentation) par rapport à des souris non infestées et 7 gènes sont

régulés à la baisse. L'expression de gènes impliqués dans les réponses de type Th2 sont

augmentés comme l'IL-13, l'IL-4, les eotaxines CCL11 et CCL5, ou l'IL-10 mais aussi de

nombreux gènes inflammatoires associés aux réponses de type Th1 (CXCL9, CXCL10, IFN-

γ, IL-6...). Pour valider ces résultats, des PCR quantitatives pour 3 gènes candidats fortement

régulés (CXCL9, CCL2 et IL13) ont été effectuées sur les ADNc de chaque individu utilisé

dans le pool (Figure 62B).

Ensuite, les protéines candidates ont été mesurées dans le sérum, le liquide pleural et

le liquide de lavage bronchoalvéolaire de ces souris en discriminant les souris Mfpos et Mf-.

CXCL9 et CCL2 sont augmentés dans les 3 fluides des souris Mfpos (Figures 63A et B). En

revanche, l'IL-13 n'a été détectée dans aucun de ces espaces. En plus de ces molécules, l'IL-10

et le TNF-α augmentent dans la cavité pleurale des souris Mfpos mais l'IL-10 diminue dans le

LBA de ces souris (Figures 63C et D). La production de cytokines semble plus faible chez les

souris Mfneg mais au vu du faible nombre de souris analysées, il est nécessaire d'accroitre leur

nombre pour conclure sur la situation des souris Mfneg (des échantillons ont été produits et

restent à analyser).

Pour évaluer les conséquences des changements d'expression de ces gènes, les

résultats de l'analyse des transcrits ont été interprétés avec Ingenuity Pathway Analysis (IPA),

un logiciel d'analyse des réseaux biologiques utilisant une vaste base de données. A partir des

profils d'expression des différents gènes, le logiciel prédit les fonctions biologiques

activées/réprimées et les pathologies associées. Parmi les conséquences prédites de l'infection

(Figure 64A), des pathologies pulmonaires sont suggérées comme l'asthme, la fibrose

pulmonaire et l'hypersensibilité aérienne. De plus, ces gènes sont impliqués dans la

chimiotaxie et l'activation des macrophages, des éosinophiles, des neutrophiles et des

lymphocytes T CD4+.

Particulièrement, l'IL-4 et l'IL-13 semblent avoir un rôle central dans la mise en place

de ces réponses (Figure 64B).

213

Figure 62. Profils de transcrits au niveau de poumons de souris BALB/c hôtes de L.

sigmodontis.

(A) Transcrits de cytokines/chimiokines (seuil : facteur d’augmentation/baisse d’expression

d’au moins 2 ) induite dans le poumon de souris infestées en SC à J70 p.i. Des pools d’ADN

complémentaire provenant de 8 souris naïves et 8 souris infestées (bleu : Mfpos et jaune : Mfneg

mélangées) ont été utilisés ; (B) Des q-RTPCR ont été réalisées sur chaque individu pour les

transcrits de CXCL9, CCL2 et IL13 pour valider les résultats. Les résultats sont exprimés en

moyenne +/- SEM d'une expérience. Mfneg : n = 3 ; Mfpos : n = 5.

214

Figure 63. Cytokines et chimiokines dans le LBA et la CP de BALB/c Mfposvs Mfneg.

Le liquide de lavage bronchoalvéolaire (LBA), le liquide pleural (CP) et le sérum de souris

utilisées pour l'analyse des transcrits ont été récupérés. Des ELISA ont été réalisés pour doser

(A) le CXCL9, (B) le CCL2, (C) l'IL10 et (D) le TNF-α. Les résultats sont exprimés en

moyenne +/- SEM d'une expérience. Les différences ont été testées par le test U de Mann-

Whitney (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001). N : n=8 souris. Mfneg : n=1-3 souris ; Mfpos : n = 8

souris/groupe.

215

Figure 64. Analyse des réseaux cytokiniques et fonctions biologiques potentielles

(A) Les effets induits par les changements d’expression génique ont été prédits en utilisant le

logiciel Ingenuity Pathway Analysis ; (B) Représentation graphique des effets de différentes

cytokines sur l'activation des macrophages, le recrutement des neutrophiles et la fibrose

pulmonaire. Noter le rôle central de l'IL-4 et de l'IL-13 dans les 3 processus. Flèche : le profil

d’expression du gène favorise la fonction; Râteau : le profil d’expression du gène inhibe la

fonction. Molécule rouge : expression augmentée. Molécule verte : expression diminuée.

Flèches rouge : le résultat amplifie la fonction; Flèches jaunes : le résultat inhibe la fonction;

Flèche grise : la molécule est impliquée dans le mécanisme.

216

4. Production de mucus par l'épithélium bronchique de souris hôtes de microfilaires

La différenciation des cellules épithéliales bronchiques en cellules caliciformes

(appelée métaplasie des cellules caliciformes) et leur production de mucus est une des

caractéristiques de l'inflammation pulmonaire. Afin de déterminer la conséquence de la

présence des filaires dans et autour du poumon, les cellules caliciformes ont été colorées sur

des sections de poumons de souris infestées ou non (J70 p.i.). En effet, l'analyse des transcrits

prédit des réponses asthmatiques dans le poumon avec une stimulation des cellules

épithéliales (Figure 64). La fixation de l'IL-4 mais surtout de l'IL-13 sur leur récepteur (IL-

4R) sont les principales causes de la métaplasie des cellules caliciformes [468,469].

Les bronches des souris non infestées ne contiennent aucune cellule caliciforme

(Figure 65A). A l'inverse, des cellules caliciformes sont observées dans l'épithélium

bronchique des poumons des souris infestées (Figures 65B et 65C). Chez les souris

microfilarémiques (Mf+), les cellules caliciformes sont majoritairement présentes à proximité

des espaces périvasculaires (PVS) (Figure 8C). Des bronches enflammées sont aussi

observées à proximité des granulomes pulmonaires (Figure 66C). La présence des cellules

caliciformes a été quantifiée chez les souris Mfpos et Mfneg (Figure 66D). Les bronches des

souris amicrofilarémiques présentent une faible inflammation bronchique (environ 10% des

sections de bronches contiennent des cellules caliciformes) comparé aux souris Mfpos (environ

35%).

La localisation privilégiée des cellules caliciformes en bordure de PVS pourrait être la

conséquence d'une production localisée d'IL-13 dans ce PVS. Ceci expliquerait pourquoi les

transcrits d'IL-13 étaient augmentés dans les poumons mais pas dans les espaces environnants

(liquide broncho-alvéolaire, sang et cavité pleurale). La présence de Mfs dans le PVS ou dans

les vaisseaux sanguins du PVS pourrait stimuler les cellules résidentes du PVS , comme les

macrophages interstitiels [318], qui produiraient alors de l'IL-13.

217

Figure 65. Présence de cellules

PAS+/calicifomes mucus+ chez les souris

BALB/c Mfpos.

Des souris BALB/c ont été infestées avec 40

L3 de L. sigmodontis par voie sous-cutanée.

70 jours après infection, le lobe gauche des

poumons a été récupéré et analysé pour la

production de mucus (Coloration PAS) (A-

C) Aspect d’une bronchiole chez une souris

naïve (A) chez une souris

amicrofilarémique; présence de quelques

cellules rose vif remplies de mucus (B) et

chez une souris microfilarémique; large

portion de l'épithélium bronchique rempli de

mucus à proximité du PVS (ligne pointillée)

(C). Représentatif de : naïves : n = 5; Mfneg :

n = 5 ; Mfpos : n = 7 souris. 1-2 sections de

poumons ont été analysées par souris.

218

Figure 66. Cellules PAS+ : bronches/ bronchioles de souris BALB/c mfpos vs mfneg.

Des souris BALB/c ont été infestées avec 40 L3 de L. sigmodontis par voie sous-cutanée. 70

jours après infection, le lobe gauche des poumons a été récupéré et analysé pour la production

de mucus (Coloration PAS). (A-B) des microfilaires sont parfois retrouvées à proximité des

bronchioles -Br- enflammées (A) dans la circulation sanguine ou (B) dans l’espace

périvasculaire - PVS (flèches) ; (C) l’inflammation est aussi observée à proximité des

granulomes -G- attachés aux poumons ; (D) quantification du pourcentage des bronches

totales d’une section comprenant des cellules caliciformes ainsi que leur localisation. naïves :

n = 5 ; Mfneg : n= 5 ; Mfpos : n = 7 souris. 1-2 sections de poumon ont été analysées par souris.

219

5. Les macrophages périvasculaires augmentent chez les souris microfilarémiques.

Le contenu cellulaire du PVS a été analysé. Cet espace, ainsi que le contour des

bronches, contient des cellules exprimant le marqueur CD169 chez les souris infestées ou non

(Figure 67 et [318]). Ces cellules ont une forme caractéristique très effilée. Elles expriment

également le marqueur de macrophages CD68 (Figure 68B et 69C). Les macrophages

alvéolaires expriment aussi ces marqueurs mais sont facilement différenciables par leur

localisation et leur forme arrondie (Figure 68).

Figure 67. Présence de cellules CD169+ dans les espaces périvasculaires et

péribronchiques.

Des souris BALB/c ont été infestées avec 40 L3 de L. sigmodontis par voie sous-cutanée.

Projection confocale à partir d’une coupe épaisse de poumon d’une souris Mfpos

immunomarquée pour le CD169 (vert) à J70 p.i.. Marquage du CD31 (rouge) pour les cellules

endothéliales et DAPI (bleu) pour le noyau des cellules. Des cellules CD169+ sont présentes

dans les espaces périvasculaires et péribronchiques des poumons des souris. Br : Bronches;

PVS : espace périvasculaire ; Vs : vaisseau sanguin ; Alv : alvéoles. Représentatif de n = 7

souris Mf+.

220

Figure 68. Les macrophages CD169+

expriment le CD68.

Des souris BALB/c ont été infestées avec 40

L3 de L. sigmodontis par voie sous-cutanée.

(A-C) Projection confocale à partir de coupes

épaisses de poumons immunomarquées pour

le CD169 (rouge), le CD68 (vert) et le DAPI

(bleu) à J70p.i. chez une souris Mf+.

Expression de CD169 (A), CD68 (B) et

colocalisation (C). Les macrophages

alvéolaires (pointes) et les macrophages

interstitiels (flèches) expriment CD169 et

CD68 mais peuvent être différenciés par leur

localisation et leur forme. Les macrophages

alvéolaires présentent une forme arrondie

alors que les macrophages interstitiels sont

effilés et sont dans l'espace périvasculaire

(PVS, ligne pointillée).

Représentatif de n = 7 souris Mf+.

221

Figure 69. Infiltrats périvasculaires de

macrophages CD169+ détectés uniquement

ches les souris BALB/c microfilarémiques.

Des souris BALB/c ont été inoculées avec 40 L3

de L. sigmodontis par voie sous-cutanée. (A-C)

Projection confocale à partir de coupes épaisses

de poumons immunomarquées pour le CD169

(rouge). Marquage du CD31 (vert) pour les

cellules endothéliales et DAPI (bleu) pour le

noyau des cellules. (A-B) Quelques macrophages

interstitiels CD169+ sont présents dans les

espaces périvasculaires et péribronchiques des

poumons des souris naïves et Mf-, (C) Forte

quantité des macrophages CD169+chez les souris

Mf+.

Echelle : 50µm

Représentatif de : souris naïve : n= 5 souris,

Mfneg : n= 5 souris, Mfpos : n=7 souris, 2-3

bronches ont été analysée par souris.

222

Bien que ces cellules CD169+ soient présentes chez les souris naïves et Mfneg (Figures

70A et B), leur quantité augmente fortement chez les souris Mfpos (Figures 69C et 70). La

quantification du nombre de cellules CD169+ dans les espaces périvasculaires montre que le

nombre de cellules est corrélé au volume de l'espace (Figure 70A), permettant la comparaison

des concentrations de cellules entre des PVS de différentes tailles (Figure 70B). Le nombre de

cellules CD169+ dans le PVS augmente chez les souris Mfpos mais pas chez les souris Mf-. De

même, le comptage des noyaux des cellules présentes dans le PVS (DAPI+) montre une

augmentation du nombre total de cellules chez les souris Mf+. De plus, la population de

macrophages CD169+correspond à environ la moitié des cellules de l'espace périvasculaire,

aussi bien chez les souris naïves qu'infestées (Figure 70B).

Figure 70. Quantification des infiltrats périvasculaires.

(A) Le nombre de macrophages CD169+ DAPI+ dans l’espace périvasculaire a été mesuré

ainsi que le volume de l’espace périvasculaire. La quantité de cellules dans le PVS est

corrélée (test de Pearson) à son volume, permettant la comparaison du nombre de cellules par

unité de volume entre les différentes bronches pour tous les groupes; (B) l’augmentation du

nombre de macrophages CD169+ a lieu dans les espaces périvasculaires de toutes tailles.

Quantification du nombre de cellules totales (DAPI+) et de macrophages interstitiels (DAPI+

CD169+) par mm3 d’espace périvasculaire ;

Les résultats sont exprimés en moyenne +/- SEM. N : n= 5 souris, Mfneg n= 5 souris, Mfpos

n=7 souris. 2-3 bronches ont été analysées par souris. Des Anova à 1 facteur ont été effectuées

pour CD169 et les cellules totales. *p<0,05 entre Mfpos et N; ** p<0,01 entre Mfpos et N; #

p<0,05 entre Mfpos et Mf-.

223

En plus des macrophages alvéolaires et ceux des espaces périvasculaires et

péribronchiques, des cellules CD169+ sont observées au niveau de la plèvre viscérale des

souris naïves et infestées (Figure 71).

Enfin, des cellules CD169+ ont été associées à la formation des Tissus Lymphoïdes Associés

aux Bronches (BALT) [335] et des structures similaires sont parfois (dans 15% des souris)

observées à proximité des bronches et sur la plèvre viscérale (Figure 72)

Figure 71. Présence de cellules CD169+ dans la plèvre viscérale..

Des souris BALB/c ont été infestées avec 40 L3 de L. sigmodontis par voie sous-cutanée. Les

poumons ont été récupérés J70 p.i. et des coupes épaisses ont été préparées. Projection

confocale de coupes épaisses de poumons immunomarquées pour le CD169 (rouge).

Marquage du CD31 (vert) pour les cellules endothéliales. (A) Présence de cellules CD169+ au

niveau de la plèvre viscérale d'une souris naïves. (B) Présence de cellules CD169+ au niveau

de la plèvre viscérale d'une souris Mf+.

(C) un isotype contrôle a été utilisé à la place du CD169 pour vérifier la spécificité du

marquage.

Représentatif de : souris naïve : n= 3; Mfpos : n=5; Mfneg : n=5; isotype : n=1. 1 image a été

analysée par souris.

224

Figure 72. Structures lymphoïdes associées aux bronches et à la plèvre.


et 100 jours après infection, les poumons ont été récupérés. (A) immunomarquage du S100A9

(rouge) d'une section de poumon d'une souris Mfneg à J70 p.i. montrant une structure

lymphoïde dans l'espace périvasculaire à proximité d'une bronche et d'un vaisseau sanguin;

(B) Coloration d'une section de poumon au trichrome de Masson d'une souris Mfneg à J100 p.i.

montrant une structure lymphoïde à la surface de la plèvre viscérale.

Les deux phénomènes ont été observés chez 4 souris/28, indépendamment du statu

microfilarien (Mfpos ou Mf-) et du temps d'infection (J70 ou J100). Echelle : 50µm.

225

6. Dommages du mésothélium pleural chez les souris hôtes de microfilaires.

Au vu de la pathologie pleurale observée chez la gerbille, l'état du mésothélium pleural

a été analysé chez les souris. L'observation de coupes histologiques montre un épaississement

partiel de la plèvre viscérale à J70 et J100 p.i. chez les souris Mf+, phénomène rarement

observé chez les souris Mfneg (Figure 73). L'observation des poumons en microscopie

électronique à balayage montre aussi un changement de morphologie des cellules

mésothéliales. Le mésothélium des souris naïves est lisse (pavimenteux) et il n'est pas

possible de différencier les limites des cellules (Figure 74A). A l'inverse, chez les souris

infestées (Mfpos et Mf-), les cellules mésothéliales sont hypertrophiées (leur volume

augmente) et elles prennent une forme "cubique" (Figure 74B). L'hypertrophie des cellules

mésothéliales est la conséquence de leur activation [470].

Figure 73. Epaississement pleural des souris microfilarémiques.


et 100 jours après infection, les poumons ont été récupérés et le mésothélium a été analysé.

(A) Aspect global du lobe gauche du poumon d’une souris naïve, (B) d'une souris

amicrofilarémique Mfneg et (C) d'une souris microfilarémique Mfpos montrant épaississement

du mésothélium pleural chez les souris Mf+. Représentatif de : naïve : n = 6 ; Mfneg : n = 7 ;

Mfpos : n = 10 souris.

226

Figure 74. Hypertrophie des cellules mésothéliales chez les souris infestées.


jours après infection, les poumons ont été récupérés et analysés en microscopie électronique à

balayage. (A) Aspect normal du mésothélium d'une souris naïve (B) aspect hypertrophique du

mésothélium chez une souris infestée. Echelle : 100 µm. n = 1 souris/groupe.

Le mésothélium sain est composé d'une monocouche de cellules pavimenteuses

exprimant la cytokératine 7 (Figure 75A). L'analyse du mésothélium pulmonaire des souris

infestées indique trois états possibles : 1) des cellules mésothéliales "normales"

pavimenteuses ; 2) des cellules mésothéliales hypertrophiques "cuboïdales" (Figure 75B); et

3) du mésothélium présentant une hyperplasie (épaississement de la plèvre du à une

augmentation du nombre de cellules) (Figure 75C). Dans les parties de mésothélium

hyperplasiques, seule la couche supérieure de cellules exprime le marqueur des cellules

mésothéliales (la cytokératine) (Figure 75C). Le périmètre des poumons des souris infestées

peut présenter les trois états mais l'hyperplasie est retrouvée majoritairement chez les souris

Mfpos : environ 40% du périmètre total du poumon des souris Mfpos est hyperplasique, contre

moins de 10% chez les souris Mfneg (Figure 75D). L'hypertrophie des cellules mésothéliales

est observée dès J30 p.i. [196], donc en phase pré-patente, mais à ce temps là, aucune

hyperplasie mésothéliale n'est visible. Les cellules mésothéliales semblent aussi présenter une

baisse d'adhérence à la lame basale. En effet, des zones de mésothélium décollé sont parfois

observées en microscopie électronique à balayage et sur les coupes histologiques (Annexe 2).

Cependant, ces zones pourraient aussi être des artéfacts dus à la manipulation des poumons

lors de la préparation des échantillons.

227

Figure 75. Hyperplasie du mésothélium chez les souris microfilarémiques.


jours après infection, les poumons ont été récupérés et le mésothélium a été analysé. (A-C)

marquage des cellules mésothéliales avec un anticorps anti-Cytokératine montrant (A) un

mésothélium normal, (B) un mésothélium hypertrophique et (C) un mésothélium

hyperplasique. Représentatif de : souris naïve : n = 2 souris, Mfneg : n = 5 ; Mfpos : n = 5 souris.

(D) Le périmètre des coupes a été mesuré et l’état du mésothélium a été qualifié. Les résultats

sont exprimés en moyenne +/- SEM. Souris naïve n = 6 ; Mfneg n = 7, Mfpos : n = 10 souris.

228

La podoplanine est une protéine de type mucine exprimée à la surface des

pneumocytes de type 1, des vaisseaux lymphatiques et des cellules mésothéliales [471] (Figure

76A et B). L'expression de cette molécule est souvent augmenté lors des cancers du poumon

et de la plèvre [472,473]. Dans les zones du mésothélium présentant des cellules hypertrophiques

(chez les souris Mfneg et Mf+), la podoplanine est fortement exprimée sur la face apicale des

cellules (Figure 76C). Dans les zones hyperplasiques, seule la couche supérieure de cellules

exprime la podoplanine (Figure 76D).

Figure 76. Surexpression de la podoplanine par le mésothélium hypertrophique.


jours après infection, les poumons ont été récupérés et l’expression de la podoplanine dans les

poumons a été analysée. (A) Coloration de la podoplanine dans les poumons d'une souris

naïve montrant une expression de la molécule dans un vaisseau lymphatique dans l'espace

périvasculaire (flèche) et par l'épithélium alvéolaire (les pneumocytes de type I, Ugorski et al.

2016[471]). Les vaisseaux sanguins (Vs) et l'épithélium des bronches (Br) n'expriment pas la

podoplanine. (B-D) expression de la podoplanine dans le mésothélium : (B) mésothélium

normal, (C) hypertrophique et (D) hyperplasique. Représentatif de : souris naïve : n=3 souris

par groupe.

229

La fibrose est une manifestation courante des infections chroniques pulmonaires

caractérisée par l'accumualation excessive de matrice extra-cellulaire, dont le collagène.

L’analyse transcriptomique des poumons de souris filariennes à J70 p.i. suggère la présence

d’une fibrose pulmonaire (Figure 64). Afin de visualiser les fibres de collagène, des

colorations au Trichrome de Masson de coupes fines de poumons ont été effectuées 70 jours

après infection. Dans les poumons, l'espace périvasculaire des souris contient

constitutivement du collagène et l'infection n'a pas d'impact visible sur sa quantité (Figure

77A, bleu). Si aucun dépot de collagène n'est visible au niveau des zones hypertrophiques du

mésothélium (Figure 77C), les zones hyperplasiques présentent un réseau dense de collagène,

indiquant une fibrose mésothéliale.

Figure 77. Fibrose du mésothélium hyperplasique.


jours après infection, les poumons ont été récupérés et le collagène pulmonaire été analysé par

des colorations au trichrome de Masson montrant (A) la présence de fibres de collagène dans

l’espace périvasculaire d’une souris naïve. (B-D) Les mésothéliums normaux (B) et

hypertrophiques (C) présentent de faibles quantités de collagène. (D) Les zones

hyperplasiques sont associées à une fibrose mésothéliale. Représentatif de : souris naïve n = 6

; Mfneg n = 12, Mfpos : n = 9 souris.

230

7. Inflammation pleurale/bronchoalvéolaire exacerbée chez les souris microfilarémiques.

Le mésothélium pleural et les espaces périvasculaires sont en contact direct avec,

respectivement, la cavité pleurale et l'espace bronchoalvéolaire (LBA). Les cellules présentes

dans ces espaces pourraient participer à la pathogénèse des atteintes pulmonaires observées.

Dans la cavité pleurale, un fort recrutement cellulaire a lieu à J70 p.i. chez les souris infestées.

Ce recrutement est d’autant plus important que les souris sont microfilarémiques (Figure

78A). De plus, une augmentation du nombre total de cellules dans le LBA n'est aussi observée

que chez les souris Mfpos (Figure 78B). 100 jours après infection, le nombre de cellules de

chaque espace redevient similaire à celui de l’espace équivalent chez des souris naïves. Dans

la cavité pleurale à J70 p.i., les cellules de l'exsudat comprennent majoritairement des

éosinophiles SiglecF+, des macrophage alternativement activés F4/80+ Relm-α+ et des

neutrophiles Ly6G+ (Figure 79B-E). Si le nombre de neutrophiles est similaire entre les souris

Mfpos et Mf-, les souris Mfpos présentent des quantités d'éosinophiles, de macrophages et de

lymphocytes T CD4+ significativement plus élevés.

Figure 78. Nbre de cellules dans la cavité pleurale et le LBA de BALB/c Mfposvs Mf neg


et 100 jours après infection, les cellules de la cavité pleurale et de l’espace bronchoalvéolaire

(LBA) ont été récupérées. (A) Nombre de cellules dans la cavité pleurale ; (B) Nombre de

cellules dans le LBA. Les résultats sont exprimés en moyenne +/- SEM.

Non infecté (N) : n = 11, pool de 2 expériences indépendantes, Mfneg : n = 12, pool de 3

expériences indépendantes, Mfpos : n = 14, pool de 3 expériences indépendantes. Kruskal-

Wallis suivi par un Dunns. (*p<0,05. **p<0,01, ***p<0,001, différences avec les souris

naïves; # p< 0,05, # #p<0,01, différences entre souris Mfpos et Mf ; ϕ p<0,05.différences entre

J70 et J100).

231

Figure 79. Augmentation des granulocytes et des macrophages pleuraux chez les souris

microfilariennes


et 100 jours après infection, les cellules de la cavité pleurale ont été récupérées et phénotypées

par cytométrie en flux. (A) Stratégie de discrimination des population cellulaires ; (B) nombre

d’éosinophiles SiglecF+ ; (C) nombre de neutrophiles Ly6G+ ; (D) nombre de macrophages

F4/80+ ; (E) expression de Relm-α par les macrophages pleuraux ; (F) Nombre de

lymphocytes CD4+. Les résultats sont exprimés en moyenne +/- SEM. J100 : n = 6

souris/groupe. J70 p.i. : souris Nnaives (N) : n = 11, pool de 2 expériences indépendantes,

Mfneg : n = 12, pool de 3 expériences indépendantes, Mfpos : n = 14, pool de 3 expériences

indépendantes. Test de Kruskal-Wallis suivi par un Post test de Dunns (*p<0,05, **p<0,01,

***p<0,001, différences avec les souris naïves; # p< 0,05, # #p<0.01, différences entre souris

Mfpos et Mf-; ϕ p<0,05, ϕϕ p< 0,01, ϕϕϕ p<0,001, différences entre J70 et J100).

232

Il est intéressant de noter que les populations cellulaires augmentant dans la cavité

pleurale correspondent à celles prédites par l'analyse des transcrits de cytokines (Figure 79).

Les poumons - probablement les cellules mésothéliales de la plèvre viscérale [196,272,276] -

pourraient produire une partie des cytokines retrouvées dans la cavité pleurale et participer

directement aux recrutements cellulaires.

Dans le LBA à J70, les quantités d'éosinophiles et de lymphocytes T CD4+

augmentent dans les deux groupes infectés Mfneg et Mf+, mais de manière plus significative

chez les souris microfilarémiques (Figure 80A et B). Les nombres de macrophages alvéolaires

et de neutrophiles restent identiques à ceux observés dans des souris naïves (Figure 80C et D).

Si le nombre d'éosinophiles retrouve un niveau normal à J100 p.i., les populations de

lymphocytes T se maintiennent entre ces deux temps (Figure 80B).

Figure 80. Augmentation des éosinophiles et des lymphocytes T CD4+ dans l'espace

bronchoalvéolaire chez les souris infestées.

Des souris BALB/c ont été infestées avec 40 L3 de L. sigmodontis par voie sous-cutanée. J70

p.i., les cellules de l’espace bronchoalvéolaire (LBA) ont été récupérées et phénotypées par

cytométrie en flux. (A) nombre d’éosinophiles SiglecF+ ; (B) Nombre de lymphocytes CD4+.

(C) nombre de macrophages F4/80+; (D) nombre de neutrophiles Ly6G+ ; Les résultats sont

exprimés en moyenne +/- SEM. Souris naives (N) : n = 14, pool de 3 expériences

indépendantes, Mfneg : n = 5, pool de 2 expériences indépendantes, Mfpos : n = 7, pool de 2

expériences indépendantes. Kruskal-Wallis suivi par un Dunns. *p<0,05. **p<0,01,

***p<0,001, différences avec les souris naïves ; ϕ p<0,05. différences entre J70 et J100.

233

8. L'initiation des dommages pulmonaire chez les souris microfilarémiques signe-t-elle

un profil de type 2 ?

L'IL-4, l'IL-13 et l'IL-5 sont indispensables à la mise en place de la réponse Th2. Pour

étudier l'implication de ces molécules dans les réponses anti-parasitaires et dans l'instauration

de la pathologie pulmonaire, des souris BALB/c déficientes en récepteur à l'IL-4 et en IL-5

(IL-4R-/-/IL5-/-) ont été utilisées. Ces souris favorisent le développement filarien car elles

permettent le développement de Loa loa jusqu'au stade jeune adulte [190] alors que le cycle

avorte très rapidement chez les souris BALB/c de type sauvages (WT). 70 jours après

infection de souris IL-4R-/-/IL5-/- par L. sigmodontis, le rendement parasitaire est environ 60%

plus élevé que chez des souris BALB/c WT (Figure 81A). Aucun granulome n’est observé

dans ces souris. Aucune différence dans le ratio mâle/femelles n'a été observée entre les deux

groupes mais les filaires femelles et mâles sont de plus grande taille (Figure 81B et C) chez

les souris KO. De plus, les femelles présentent de plus grandes quantités d’embryons et de

microfilaires dans les utérus (Figure 82A et C). Il est intéressant de noter que le contenu utérin

des filaires femelles est relativement semblable entre des filaires issues de souris BALB/c WT

amicrofilarémiques ou de souris BALB/c WT microfilarémiques, à une exception notable : la

charge microfilarienne intra utérine est plus souvent importante dans les filaires provenant de

souris WT Mfpos (Figure 82C). Dans le même temps, la microfilarémie des souris IL-4R-/-/IL5-

/- est 25 fois plus élevé que dans les souris WT microfilarémiques (Figure 82D).

Figure 81. Rendement filarien et taille des parasites dans les souris IL-4R-/-/IL5-/-.

Des souris BALB/c IL-4R-/-/IL5-/- (KO) et WT ont été infestées par voie sous-cutanée avec 40

L3 de L. sigmodontis. (A) Rendement filarien (F/L3) dans la cavité pleurale J70 p.i.. (WT : n

= 25, pool de 3 expériences indépendantes ; KO : n = 9) ; (B-C) Longueur des filaires mâles

(B) et femelle (C) dans les souris WT et IL-4R-/-/IL5-/- . Les résultats sont exprimés en

moyenne +/- SEM. WT : 20 femelles et 7 mâles provenant de 8 souris, KO : 34 femelles et 29

mâles provenant de 9 souris. Les différences ont été testées par le test U de Mann-Whitney (*

p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

234

Figure 82. Fertilité des femelles et production de microfilaires.

Des souris BALB/c IL-4R-/-/IL5-/- (KO) et WT ont été infestées par voie sous-cutanée avec 40

L3 de L. sigmodontis. (A-B) Contenu utérin montrant (A) des embryons, ou (B) des

microfilaires dans un utérus (filaire femelle obtenue à partir d'une souris double KO) ;

Microscopie optique, Olympus BX63, grossissement x40 avec contraste différentiel (DIC) ;

(C) Analyse du contenu utérin des filaires adultes à J70 p.i. chez WT et double KO. ++ :

l'utérus est rempli ; + : L'utérus n'est pas complètement rempli; - : absence de Mf (WT Mfpos :

13 femelles provenant de 4 souris, WT Mfneg : 6 filaires de 4 souris. IL-4R-/-/IL5-/- : 34 filaires

de 9 souris); (D) Nombre de microfilaires dans 10 µl de sang périphérique de souris IL-4R-/-

/IL-5-/- et WT au jour 60 et 70 de l'infection par L. sigmodontis (N = 6-9 souris / groupe). Les

résultats sont exprimés en moyenne +/- SEM. Le % correspond au pourcentage de souris

microfilariennes. Les différences entre souris IL-4R-/-/IL-5-/- et WT ont été testées par le test

U de Mann-Whitney *** p <0,001.

235

Un grand nombre de microfilaires est détecté dans les poumons par PCR chez les

souris microfilarémiques, et non chez les souris amicrofilarémiques (Figure 83A) et le nombre

obtenu par qPCR est corrélé au nombre de microfilaires mesuré dans le sang périphérique

(Figure 83B). Dans le même temps, les microfilaires sont observées dans le tissu pulmonaire

des souris Mfpos sur coupes histologiques (Figure 84). Etonnamment, les microfilaires sont

retrouvées dans tous les compartiments pulmonaires, ie les vaisseaux et capillaires sanguins

pulmonaires, les espaces périvasculaires et les alvéoles. Elles sont cependant observées

majoritairement dans les vaisseaux sanguins et le PVS. De plus, les microfilaires semblent

pouvoir migrer activement d'un compartiment à l'autre, des parasites étant observés traversant

l'endothélium des vaisseaux sanguins ou la bordure du PVS, le sens de migration étant

déterminé d'après la position de la tête des Mfs (Figure 84).

Figure 83. Détection des microfilaires pulmonaires.

Des souris BALB/c IL-4R-/-/IL5-/- et WT ont été infestées par voie sous-cutanée avec 40 L3 de

L. sigmodontis.

(A) L’ADN des poumons a été extrait et la quantité de microfilaires pulmonaires a été

estimée par PCR quantitative ; Les résultats sont exprimés en moyenne +/- SEM.

(B) Corrélation (Pearson) entre le nombre de Mf détectées par PCR et le nombre de Mf

sanguines. r2 = 0,9086.

WT Mfneg : n = 4 ; WT Mfpos : n = 6; IL-4R-/-/IL5-/- : n = 9.

236

Figure 84. Localisation des microfilaires chez les souris IL-4R-/-/IL5-/-.


L. sigmodontis. Les poumons ont été analysés en histologie (coloration PAS), pour observer et

déterminer la localisation des microfilaires pulmonaires. Echelles : 20µm

Les résultats sont exprimés en moyenne +/- SEM. WT MFneg : n = 4 ; WT Mfpos : n = 6 ; IL-

4R-/-/IL5-/- : n = 9.

237

Contrairement aux souris BALB/c, les souris IL-4R-/-/IL5-/- , qui présentent de très

fortes microfilarémies, ne développent pas d'hyperplasie mésothéliale (Figure 85A). Les

cellules mésothéliales sont néanmoins hypertrophiques (Figure 85B). Enfin, aucune

métaplasie des cellules caliciformes et aucun infiltrat périvasculaire n’ont été observés (Figure

85C). De plus, les infiltrats de neutrophiles et/ou d'éosinophiles sont absents dans la cavité

pleurale et dans le liquide bronchoalvéolaire et le nombre de macrophages est diminué par

rapport aux souris BALB/c microfilarémiques (Figure 86).

Figure 85. Chez les souris Mfpos les dommages tissulaires sont dépendantes de l’IL4R et

de l’IL5.


L. sigmodontis. (A) Aspect général d’un poumon de souris IL-4R-/-/IL5-/-. Aucun

épaississement du mésothélium n’est observable ; (B) Grossissement du mésothélium. Le

mésothélium est hypertrophié mais pas hyperplasique ; (C) Pas de production de cellules

caliciformes chez les souris IL-4R-/-/IL5-/-. Représentatif de n = 9 souris.

238

Figure 86. Le recrutement des éosinophiles et des neutrophiles est dépendant de l’IL-4R

et de l’IL-5.

Des souris IL-4R-/-/IL5-/- et des contrôles BALB/c (WT) ont été infestées par voie sous-

cutanée avec 40 L3 de L. sigmodontis. (A) Phénotypage en cytométrie en flux des cellules

pleurales et (B) du LBA.

Les résultats sont exprimés en moyenne +/- SEM.

Cavité Pleurale : IL-4R-/-/IL5-/- - n = 9 souris/groupe, 1 expérience ; WT- souris naïves : n=

11, pool de 2 expériences indépendantes, Mfneg : n=12, pool de 3 expériences indépendantes,

Mfpos : n= 14, pool de 3 expériences indépendantes.

LBA : IL-4R-/-/IL5-/- - n = 9 souris/groupe, 1 expérience ; WT - souris naïves: n= 14, pool de 3

expériences indépendantes, Mfneg : n=5, pool de 2 expériences indépendantes, Mfpos : n= 7,

pool de 2 expériences indépendantes.

239

Discussion

Chez les souris BALB/c, le rendement parasitaire est stable pendant environ 60-70

jours après infection [199]. La ponte des microfilaires commence vers J55 p.i. mais environ

40% des souris infestées ne présentent pas de microfilaires, malgré la présence d'œufs et

parfois de microfilaires dans les utérus des filaires femelles (Figure 82C). Les mécanismes

conduisant à l'absence de microfilaires chez les souris amicrofilarémiques (Mf-) ne sont pas

connus mais plusieurs hypothèses pourraient l'expliquer : la première est que certaines souris

pourraient n'être infestées qu'avec des filaires mâles ou femelles, ne permettant donc pas la

reproduction sexuée ; cependant, la quasi totalité des souris BALB/c infestées avec 40L3

présentent des parasites mâles et femelles à J30 p.i., après la dernière mue et donc au moment

de l’accouplement des filaires [274]. Cette hypothèse n'est donc pas suffisante. La deuxième

impliquerait un mauvais développement des embryons en microfilaires ce qui est possible au

vu des embryogrammes réalisés comparant le contenu utérin des filaires femelles issues soit

de souris Mfneg soit de souris Mfpos et montrant davantage de microfilaires utérines dans ces

dernières. La troisième hypothèse serait que les microfilaires soient détruites au fur et à

mesure de leur production mais aucun granulome réactionnel contenant des Mfs n’a été

observé. En fait, la fertilité accrue des filaires dans les souris immunodéficientes (Figure 82C)

conduit à privilégier l'hypothèse d'une baisse de la fertilité dépendant de facteurs

métaboliques et/ou hormonaux en interaction avec la réponse immunitaire. La quatrième

hypothèse impliquerait l’accumulation des microfilaires dans un ou des organes profonds tels

que le poumon, la rate ou le foie mais la quantification des microfilaires dans le poumon ne

montre pas de L1 dans ce tissu chez les souris amicrofilarémiques (Figure 83).

La réponse immunitaire de l'hôte joue en effet un rôle crucial dans l'établissement de la

phase patente comme le montre l'infection de différentes souris immunodéficientes de lignées

BALB/c ou C57BL/6. Dans les souris BALB/c IFNγ-/-, les filaires survivent plus longtemps et

la microfilérémie est plus forte [474]. Les souris C57BL/6, qui normalement éliminent les

parasites avant la phase patente, présentent une microfilarémie sanguine lorsqu'elles ont la

mutation Rag2IL-2Rγ-/- (entraînant une déficience en cellules T, B et NK) [286] ou lorsqu'elles

surexpriment l'IL-10 [462]. De même la mise en place de la phase patente serait déterminée par

des réponses dépendant du TLR-4. En effet, l'infection de souris BALB/c déficientes en TLR-

4 conduit à un plus grand pourcentage de souris microfilarémiques (Mf+), sans différence

dans le nombre de microfilaires circulantes [288]. Ceci pourrait être lié au S100A9 (voir

240

chapitre 2). Les souris BALB/c déficientes à la fois en IL-4R et en IL-5 (IL-4R-/-/IL5-/-)

utilisées dans cette étude présentent des microfilarémies très importantes. L'infection de ces

souris aboutit à 100% de souris Mf+, à une taille et une survie accrue des filaires ainsi qu'à

une fertilité exceptionnelle des femelles (Figures 81 et 82). Volkmann (2001 [475] et 2003 [291])

et Le Goff (2000 [253] et 2002 [476]) ont comparé les réponses de souris de fond génétique

BALB/c (permissif à l'infection) et C57BL/6 (résistant) déficientes soit en IL-5 (IL-5-/-) soit

en IL-4 (IL-4-/-) et/ou à son récepteur (IL-4-/-) au cours de l'infection par L. sigmodontis.

Premièrement les souris BALB/c IL-5-/- permettent le développement d'un plus grand

nombre de parasites adultes dans la cavité pleurale, ont une fécondité et une survie prolongée

des parasites (adultes et Mfs) et ont moins de granulomes pleuraux [291]. Les résultats sont

différents chez les souris C57BL/6 : le rendement parasitaire et la survie des parasites chez

des souris C57BL/6 IL-5-/- restent inchangés et les parasites sont éliminés avant la phase

patente [253]. Ces résultats apparemment contradictoires suggèrent que l'IL-5 n’est un facteur

limitant le développement des filaires que lorsque le parasite infeste un hôte permissif ; chez

un hôte résistant, le parasite serait capable d'éviter les mécanismes dépendants de l'IL-5 [476].

Deuxièmement, les souris BALB/c déficientes dans la signalisation de l'IL-4 (IL-4-/- et

IL-4R-/-) ne développent pas de différences dans la survie des adultes et la formation des

granulomes mais présentent des microfilarémies plus importantes que celles des souris

BALB/c WT [291,476]. Chez les souris C57BL/6 IL-4-/-, les parasites adultes survivent plus de

60 jours et présentent des microfilaires circulantes [476]. Ces résultats montrent que l'IL-5 est

important dans le contrôle de tous les stades parasitaires chez les souris BALB/c et que l'IL-4,

par le biais de son récepteur permet le contrôle des microfilaires chez toutes les souris mais

aussi celui de la survie des parasites chez les souris C57BL/6. Ainsi, les souris BALB/c IL-

4R-/-/IL-5-/- cumulent les deux effets entraînant le phénotype observé.

Les résultats obtenus lors de cette étude montrent une différence dans la réponse

immunitaire entre les souris Mfpos et Mfneg (augmentation des macrophages et des éosinophiles

pleuraux, Figure 79, augmentation de CXCL9 et CCL2 sériques et pleuraux, Figure 63). En

fait, la présence des microfilaires dans la cavité pleurale des souris Mfpos induit un

recrutement pleural plus important que la seule présence des filaires adultes (souris Mf-)

(Figure78A). Le recrutement de ces différentes populations cellulaires a déjà été décrit [202,263]

mais pas leur différentes proportions en fonction de la microfilarémie.

241

La formation de granulomes autour des filaires dans la cavité pleurale est un processus

bien décrit [202]. Cependant, ces granulomes peuvent adhérer à la surface des poumons

auxquels ils sont alors partiellement intégrés (Figure 61A). Des neutrophiles présents dans la

cavité pleurale participent à la formation de ces granulomes [202]. Leur recrutement peut être

dus à de multiples facteurs tels que la sécrétion de Wolbachia ou d'autres produits ES

chemoattractants pour les neutrophiles par les filaires femelles [14,362], ou l’exposition de

Wolbachia lors de la ponte, de la mort des microfilaires et de microfilaires avortées, et/ou de

la mort des adultes [17]. Les neutrophiles, mais aussi les éosinophiles, participent à la

formation des granulomes par un mécanisme dépendant de l'IL-5 [202,294], il est donc logique

que les souris IL-4R-/-/IL-5-/-ne présentent aucun neutrophile ni granulome.

La différence entre les souris Mfpos et Mfneg réside majoritairement dans les quantités

d'éosinophiles et de macrophages, qui sont nécessaires au contrôle des microfilaires [293,477].

Cette différence pourraient être associée à une augmentation de l'IL-13, de l'IL-5 et de l'IL-10

dans la cavité pleurale des souris microfilarémiques [288].

Les souris BALB/c ont éliminé tous les parasites adultes ainsi que la majorité des

granulomes et des microfilaires à J100 (Figure 60). A ce temps, les infiltrats cellulaires de la

cavité pleurale sont aussi résorbés (Figure 78A). Bien que dite « permissive », la résolution de

l’infection chez la souris BALB/c est très différente de celle observée dans le mérion, chez

qui l'infection peut durer plus d'un an. La persistance de l'infection pourrait être à l'origine des

différences de pathologies observées dans les deux modèles, à savoir que la présence des

nodules papillaires décrit chez le mérions n’existe pas chez la souris BALB/c.

La manifestation pulmonaire principale de l'infection à J30 [196] et chez les souris Mfneg

à J70 est une hypertrophie des cellules mésothéliales. Le mésothélium pleural réagit en effet

rapidement aux infections : lorsqu'elles sont activées par des signaux inflammatoires, les

cellules mésothéliales changent de forme, produisent de nombreuses cytokines et diminuent

l'expression des molécules d'adhésion [470]. Le mésothélium activé surexprime la podoplanine,

qui est connue pour induire une augmentation de la mobilité et de la prolifération des cellules

[471,478] et a été associée à la formation de métastases dans des cancers dont le mésothéliome

pleural [478,479]. Ces points pourraient expliquer le décollement du mésothélium parfois

observé (Annexe 2).

242

L'hypertrophie des cellules mésothéliales est associée chez les souris Mfpos à une

hyperplasie et une fibrose du mésothélium caractérisées par une accumulation de cellules et

de collagène dans le tissu sous-pleural (Figure 77). La fibrose se définit comme

l'accumulation excessive de composants de la matrice extracellulaire (ECM ; principalement

l'acide hyaluronique, la fibronectine, des protéoglycans et des collagènes) dans un tissu ou un

organe [480]. Les cellules présentes dans la zone épaissie du mésothélium n'expriment pas les

marqueurs de cellules mésothéliales (podoplanine et cytokératine, Figures 75 et 76) et

pourraient être des fibroblastes ou des myofibroblastes, qui sont les principales cellules

productrices de matrice extracellulaire. Des marquages spécifiques pour ces cellules, comme

l'actine des muscles lisses (α-SMA) pourraient permettre de confirmer leur nature. Les

myofibroblastes peuvent avoir différentes origines. Elles peuvent provenir de fibrocytes issus

de la moelle osseuse se différenciant en myofibroblastes [481]. Ces fibrocytes sont recrutés par

les chimokines CXCL12 et CCL2 [481-483], cette dernière étant fortement augmentée dans les

souris BALB/c infestées et Mf+. Elles peuvent également provenir de fibroblastes résidents

qui prolifèrent et se différencient en myofibroblastes sous l'action du TGF-β [484,485] ; ou, enfin

être issues d'une différenciation des cellules épithéliales alvéolaires ou bronchiques (pour les

voies aériennes) ou des cellules mésothéliales (pour la plèvre) [486]. Ce dernier mécanisme qui

s'appelle Transition Epithélo-Mésenchymateuse (EMT), dépend majoritairement du TGF-β et

de l'IL-13 [486-490] et impliquerait la podoplanine [490]. Les cellules envahissent alors

progressivement la lame basale en se redifférenciant (perte de l'expression de l'E-cadherine,

de la cytokératine, et de la polarité apico-basale et acquisition d'un phénotype de fibroblaste

avec l'expression de α-SMA ou FSP-1) [487,491,492]. Le fait que les souris IL-4R-/-/IL-5-/- ne

présentent pas d'hyperplasie ni de fibrose mésothéliale souligne le rôle de l'IL-13 dans la mise

en place de la pathologie pleurale chez les souris Mfpos (Figure 85). Il est probable que

l'accroissement du nombre de cellules, notamment des éosinophiles, observé chez les souris

Mfpos soit responsable d'une augmentation des cytokines pro-fibrotiques (IL-4, IL-13, TGF-β,

CCL2...) dans la cavité pleurale des souris, entraînant les phénomènes observés. Les dosages

de cytokines pro-fibrotiques dans la cavité pleurale des souris Mfpos et Mfneg permettra de

préciser leur implication et l'infection de souris déficientes en éosinophiles (Δdb/GATA-1)

permettra d'évaluer leur rôle.

Une fois pondues dans la cavité pleurale, les microfilaires rejoignent la circulation

sanguine. Leur voie de migration n'est pas connue. Cependant, deux options semblent

possibles. La plus simple est que les microfilaires s'échappent en utilisant les stomates

243

présents au niveau de la plèvre pariétale. Ces orifices de 8 à 10 µm abouchent directement

dans les capillaires lymphatiques sous-jacents [313]. De là, les microfilaires seraient drainées

par le flux lymphatique jusqu'à la circulation sanguine au niveau des veines sous-clavières.

L'autre possibilité est que les microfilaires traversent directement le mésothélium pleural pour

rejoindre le réseau sanguin pulmonaire. Les microfilaires circulent ensuite dans tout

l'organisme, portées par la circulation sanguine où elles peuvent être prises en charge par leur

vecteur au cours d'un repas sanguin. Une partie des microfilaires est retrouvée dans les

poumons (Figures 61, 66 et 83 et 84). S'il est attendu de les retrouver dans la circulation

sanguine (capillaires, veines et artères), des microfilaires ont aussi été retrouvées dans les

espaces périvasculaires. Dans les souris IL-4R-/-/IL-5-/- présentant des microfilarémies

sanguines extrêmement élevées, les microfilaires sont retrouvées en grande quantité dans les

poumons et sont observées dans tous les compartiments pulmonaires (alvéoles, circulation

sanguine, espaces périvasculaires : Figure 84). Il est probable que la distribution des

microfilaires soit identique chez les souris WT mais leur plus faible nombre pourrait expliquer

leur absence dans ces différents tissus, leur observation étant plus rare. Des microfilaires sont

aussi retrouvées dans l’espace bronchoalvéolaire des poumons de patients infectés par B.

malayi et W. bancrofti [493,494]. Pour rejoindre ces localisations, les microfilaires semblent

capables de traverser les endothéliums et de perturber les épithéliums alvéolaires (Figure 84).

Dans le cas des deux parasites humains, les Mfs sont capables d'adhérer à l'endothélium des

vaisseaux sanguins pulmonaires [50], ce qui pourrait permettre de résister au flux sanguin et

faciliter la traversée des endothéliums. En revanche, les Mfs de L. sigmodontis ne semblent

pas pouvoir faire de même [50]. Il est aussi possible d'imaginer que les Mfs, dans un contexte

inflammatoire favorisant la perméabilité vasculaire, puissent passer entre les cellules

endothéliales pour traverser les vaisseaux sanguins. Ce passage pourrait être facilité par des

molécules sécrétées par les microfilaires [362], ou par la libération de protéases (comme dans la

peau des individus infestés par O. volvulus [104,105]). Dans tous les cas, cette localisation

extravasculaire semble accidentelle car les microfilaires ne sont alors plus disponibles pour

une transmission au vecteur.

Les microfilaires, circulantes et pulmonaires, entraînent des réponses significativement

différentes dans les poumons des souris Mfpos comparés à ceux des souris Mf-. Ces réponses

partagent des caractéristiques observées lors du poumon tropical éosinophile dû aux

microfilaires de B. malayi et W. bancrofti : la présence d'éosinophiles broncho-alvéolaires,

des infiltrats périvasculaires de macrophages, la production de mucus et la fibrose pulmonaire

244

[78-80]. Si les symptômes chez L. sigmodontis paraissent moins sévères que lors du TPE, ces

résultats laissent penser que des mécanismes similaires sont en jeu et permettent de proposer

l'utilisation de l'infection chronique de L. sigmodontis chez des souris Mf+comme modèle de

TPE. Chez les souris Mf+, de nombreuses bronches contiennent des cellules caliciformes

produisant du mucus. Cette augmentation, n'est pas due à la prolifération de cellules

caliciformes préexistantes, mais plutôt à la transdifférenciation (métaplasie) des cellules

ciliées et Clara en cellules caliciformes [468]. La métaplasie des cellules caliciformes est

contrôlée par la fixation de l'IL-4 et l'IL-13 sur leur récepteur (IL-4R) à la surface des cellules

de l'épithélium bronchique [468,469]. Ceci explique pourquoi, chez les souris IL-4R-/-/IL-5-/-,

malgré la quantité importante de microfilaires, aucune inflammation de l'épithélium

bronchique n'est observée (Figure 86). Chez les souris WT Mf+, les cellules caliciformes sont

localisées sur la portion d'épithélium bronchique en contact avec l'espace périvasculaire

(PVS). Il est donc probable que l'IL-13 et l'IL-4 nécessaires à la métaplasie des cellules

caliciformes soient produites par les cellules du PVS. En effet, le contenu cellulaire du PVS

double chez les souris Mfpos et se compose pour moitié de macrophages interstitiels (Figure

70).

Ces macrophages interstitiels du PVS expriment le marqueur CD169 (aussi appelé

Siglec-1 ou Sialoadhesine) qui est aussi exprimé dans les poumons par les macrophages

alvéolaires et par des cellules sous-pleurales de la plèvre viscérale (Figures 67, 68, 69 et [318]).

Ces macrophages interstitiels CD169+ ont été observés dans une autre infection helminthique

avec Schistosoma mansoni et ces cellules augmentent précocement dans les poumons lors

d’une infection par les cercaires de ce parasite [334]. La fonction de ces macrophages CD169+

dans les poumons est cependant méconnue. Ces cellules auraient des capacités de

phagocytose et de prolifération permettant le renouvellement et l'augmentation des

populations sans recrutement de monocytes sanguins [318]. Ils auraient aussi un rôle important

dans le contrôle de l'inflammation : par exemple la suppression des cellules CD169+ chez des

souris CD169 DTR infestées par Plasmodium berghei entraîne une plus forte infection, des

dommages tissulaires et une inflammation importante de nombreux organes comme le foie, la

rate ou les poumons [495]. Lors de la rupture du schizonte, l'hémozoine, un produit de

détoxification du parasite, est normalement libérée dans la circulation et rapidement

phagocytée par les macrophages et les neutrophiles [496]. Dans ces souris CD169 DTR,

d’importants dépôts d'hémozoine sont encore présents dans les tissus [495]. La déficience en

245

CD169 de ces souris ne permet pas d’impliquer spécifiquement les macrophages alvéolaires

et/ou les macrophages interstitiels et/ou les cellules CD169+ de la plèvre.

De part leur localisation à proximité des vaisseaux sanguins, les macrophages

interstitiels présents dans le PVS pourraient avoir un rôle dans la prise en charge des

molécules exogènes circulant dans le sang. CD169 reconnait les acides sialiques [497] et la

gaine des Mfs de L. sigmodontis comporte de tels acides [498], il est donc possible que ces

cellules soient activées directement par les microfilaires ou leurs antigènes. Des macrophages

phénotypiquement proche des macrophages interstitiels pulmonaires CD169+ ont été décrits

dans d'autres organes, et pourraient avoir des fonctions similaires [318]. Dans les reins, les

macrophages périvasculaires CD169+ ont un rôle important dans le contrôle de l'inflammation

en diminuant l'expression de la molécule d'adhésion ICAM-1 des endothéliums et limitant

ainsi les afflux de neutrophiles dans le tissu [499]. Les macrophages interstitiels présents dans

le PVS participent probablement aux infiltrats cellulaires observés lors de toutes les phases de

l'infection (Figures 31, 53 et 70) notamment par leur production de cytokines. Ils pourraient

aussi participer au remodelage de la matrice extracellulaire nécessaire à l'infiltration des

leucocytes ([317] et chapitre 6.4 de l'introduction).

D'autres types cellulaires qui n'ont pas encore été analysés pourraient néanmoins être à

l'origine de la production d'IL-13 dans le PVS, notamment les ILC2 et les éosinophiles. En

effet, ces cellules sont présentes dans le PVS à l'homéostasie, en contact étroit avec la matrice

extracellulaire [365]. Dans l'infection par Nippostrongylus brasiliensis [345,365] ou dans des

modèles d'asthme [500-502], les ILC2 participent à la mise en place des réponses Th2

pulmonaires. Lorsqu'elles sont activées en réponse à la libération des alarmines IL-25, IL-33

et TSLP par les cellules épithéliales/endothéliales (en cas de dégât cellulaire ou de stimulation

par des allergènes), les ILC2 produisent de grandes quantités d'IL-4, d'IL-5 et d'IL-13

[501,503,504]. S'ensuit un recrutement et une survie accrue des éosinophiles entraînant une

accumulation de ces cellules dans les tissus et dans le liquide bronchoalvéolaire [322,323]. Dans

l'asthme, les éosinophiles produisent aussi de l'IL-4, de l'IL-5 et de l'IL-13 qui entretiennent

l'inflammation pulmonaire par des boucles autocrines [505-507].

Pour conclure, ces résultats remettent en question la qualification de Litomosoides

sigmodontis comme asymptomatique et soulignent le rôle des microfilaires et des réponses

Th2 dans l’aggravation de la pathologie pulmonaire (Figure 87).

246

Figure 87. Synthèse des résultats et hypothèses mécanistiques.

Double page suivante :

Dans la cavité pleurale (page de gauche), la présence des filaires adultes entraîne

l’hyperplasie du mésothélium et le recrutement d’éosinophiles, de neutrophiles et la

prolifération des macrophages, sous le contrôle de l’IL-4, de l’IL-5 et de l’IL-13. Des

granulomes composés de ces cellules se forment autour des parasites adultes. En cas de

présence de microfilaires (souris Mf+), les populations de macrophages et d’éosinophiles

s’accroissent, entraînant une augmentation de la sécrétion de cytokines pro-fibrotiques (IL-13,

CCL2, TGF-β). S’ensuit la fibrose de la plèvre viscérale du poumon. En cas d’absence d’IL-5

et de l’IL-4Rα, les recrutements d’éosinophiles et de neutrophiles ainsi que la fibrose sont

inhibés, et les parasites ont une survie et une fertilité accrue.

Dans les poumons (page de droite), l’infection filarienne chronique induit une accumulation

d’éosinophiles dans l’espace bronchoalvéolaire, qui est accrue chez les souris Mf+. Les

microfilaires peuvent rejoindre les espaces périvasculaires, dans lesquels une augmentation du

nombre de macrophages CD169+ est observée. La production d’IL-13 dans cet espace serait à

l’origine de la métaplasie des cellules caliciformes et de la production de mucus dans les voies

aériennes. Les réponses pulmonaires sont inhibées chez les souris IL-4R-/-/IL-5-/- qui

présentent pourtant de grandes quantités de microfilaires intrapulmonaires.

Eosino : éosinophile ; Neutro : neutrophile ; AAM : macrophage alternativement activé par

l'IL-4 ; Mf : microfilaire ; CAM : macrophage activé classiquement ; Fibro : fibroblaste. Colla

: collagène ; AM : macrophage alvéolaire ; IM CD169+ : macrophage interstitiel exprimant le

CD169.

250

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

252

Conclusions et perspectives

L’ensemble de cette étude a permis de mettre en évidence deux phases d’interaction de

la filaire Litomosoides sigmodontis avec l'environnement pulmonaire de ses hôtes rongeurs.

Premièrement lors de la phase de migration des L3, les résultats présentés démontrent que les

stades infestants filariens migrent dans le sang lorsque ceux-ci sont inoculés en intraveineuse

mais ont aussi une phase sanguine après leur migration lymphatique quand ils sont inoculés

dans la peau. De là, les L3 rejoignent la circulation sanguine pulmonaire et traversent les

poumons pour rejoindre la cavité pleurale. Ce passage induit tout d'abord des hémorragies

consécutives à la rupture des capillaires pulmonaires, accompagnées d'une augmentation du

nombre de neutrophiles pulmonaires et de la sécrétion transitoire d'IL-1β et des alarmines IL-

33 et S100A9 dans la cavité pleurale. Le S100A9 semble faciliter la survie des parasites, soit

par un effet anti-inflammatoire soit en facilitant la migration des L3. Dans les jours suivant

l'infection, une réponse régulatrice se met en place dans les poumons, avec le recrutement de

macrophages et d'éosinophiles, la production d'IL-4, de CCL2 et d'IL9, ainsi que la baisse

d'expression de molécules inflammatoires. Ces réponses visent probablement à réparer les

tissus lésés et conduiraient à la formation des granulomes observés dans le tissu pulmonaire.

Le passage des L3 induit néanmoins une inflammation durable des vaisseaux sanguins

pulmonaires.

Deuxièmement, lors de la phase patente de l'infection, les microfilaires, qui sont

présentes dans le sang de tous les mérions et dans environ 60% des souris BALB/c sont

responsables d’une l'inflammation pleurale forte. De plus, les souris développent une

pathologie pulmonaire dépendante des microfilaires consistant en : (1) la fibrose de la plèvre

viscérale, (2) une accumulation périvasculaire de macrophages et (3) une inflammation

bronchoalvéolaire (production de mucus et éosinophilie). Le contrôle des filaires (adultes et

microfilaires), mais aussi la mise en place de la pathologie sont dépendantes de l'IL-5 et de

l'IL-4R.

Ces résultats présentent donc les poumons comme une zone privilégiée d'interaction

hôte/parasite dans le modèle murin de filariose Litomosoides sigmodontis et ce lors des deux

phases - initiale et chronique - de l'infection. Cette interaction implique tous les

compartiments du poumon: le système sanguin (artères/veines/capillaires), les voies

respiratoires (alvéoles/bronches), les espaces périvasculaires (PVS), les plèvres et la cavité

pleurale. Jusqu'à présent, les réponses dans la cavité pleurale avaient été étudiées à de

253

nombreuses reprises, mais très peu les conséquences pulmonaires de l'infection filarienne,

jusque-là considérée comme asymptomatique.

Parmi les espaces pulmonaires affectés par l'infection, le PVS pourrait avoir un rôle

important dans la mise en place/régulation des réponses pulmonaires. En effet, des infiltrats

cellulaires y sont observés lors de la phase de migration, lors de la phase pré-patente et

lorsque les microfilaires circulent dans le sang. Cependant, la caractérisation de cet espace se

limite ici à quelques types cellulaires (neutrophiles lors de la phase de migration,

macrophages lors de la phase chronique). D'autres types cellulaires sont présents dans le PVS

des souris naïves et infestées mais n'ont pas encore été décrits. Au vu des réponses

pulmonaires (recrutements d'éosinophiles bronchoalvéolaires lors des différentes phases,

productions de cytokines de type Th2 et de mucus), il est probable que le contenu du PVS

reflète ces réponses.

Comment analyser l'espace périvasculaire ?

L'étude fonctionnelle des cellules de l'espace périvasculaire est complexe du fait de

leur localisation. L’analyse des poumons en microscopie confocale a permis d'obtenir des

informations nouvelles sur la localisation des cellules mais cette analyse est limitée à quelques

marqueurs. Une étude par cytométrie en flux sur les cellules des interstitium pulmonaires

(interstitium alvéolaire + périvasculaire + péribronchique) à différents temps après infection

pourrait être réalisée sur une suspension cellulaire obtenue par lyse du tissu préalablement

débarrassé des cellules bronchoalvéolaire (lavage bronchoalvéolaire) et de la circulation

sanguine (injection de PBS additionné d'héparine dans le ventricule droit du cœur). Une

analyse transcriptomique sur des cellules d’intérêt isolées de cette suspension cellulaire avec

un trieur cellulaire (comme réalisé par Gibbings et al 2017 [318]) permettrait ensuite de

préciser leurs fonctions lors des différentes phases de l'infection. Une autre possibilité, serait

d'isoler le PVS par microdissection laser sur des coupes épaisses et de réaliser une analyse

transcriptomique de cette zone. Des microdissections sur coupes épaisses de poumons ont

déjà été effectuées sur des coupes de 200µm d'épaisseur pour isoler le canal alvéolaire [508].

Ceci permettrait d'obtenir des informations sur les réseaux biologiques mis en place dans cette

zone au cours de l'infection.

254

Rôle des ILC2 dans les réponses anti-filariennes ?

Différentes études ont montré que la majorité des cellules produisant des cytokines de

types Th2 dans les poumons de souris naïves ou traitées par l'IL-33 sont les ILC2, et ces

cellules étaient responsables de maintenir et réguler les populations d'éosinophiles [365,509-511].

Contrairement aux lymphocytes T et B, les ILC ne possèdent pas de récepteurs spécifiques

aux antigènes (le TCR et le BCR respectivement). Elles ne requièrent donc pas de phase de

contact avec l'antigène ni de sélection clonale et répondent rapidement aux signaux

cytokiniques. Les ILC ont été classées en 3 groupes dont la diversité fonctionnelle est proche

de celle des lymphocytes T CD4-helper (Th) [512]. Les ILC2 sont stimulées par l'IL-25, l'IL-

33, le TSLP, le TL1A ou le PGD2 et sont capables de produire de l'IL-4, de l'IL-5, de l'IL-9 et

de l'IL-13. De par leur production de cytokines, elles sont donc prépondérantes dans

l'initiation des réponses de type Th2 [512].

La quantité d'ILC2 augmente précocement dans la cavité pleurale et dans les organes

lymphoïdes associés aux graisses (FALC) lors de l'infection par L. sigmodontis [273,281] mais

leur dynamique dans les poumons n'a pas encore été étudiée. Des études dans d'autres

modèles suggèrent qu'une partie de nos résultats pourraient être dus à cette population : tout

d'abord, dans les modèles d'asthme, les ILC2 pulmonaires, par leur production d'IL-13,

contribuent de manière importante à la métaplasie des cellules caliciformes et à la production

de mucus [513]. De plus, des souris traitées pendant 3 semaines avec de l'IL-33 présentent des

infiltrats périvasculaires d'ILC2 produisant de grandes quantités d'IL-5, ce qui entraîne des

accumulations d'éosinophiles et une obstruction des artères pulmonaires semblable à celle

observée dans le chapitre 2 [509]. Enfin, les ILC2 sont importantes dans l'activation alternative

des macrophages pulmonaires et le contrôle des parasites dans les poumons des souris

infestées par Nippostrongylus brasiliensis [345].

255

Les poumons dans le contrôle des parasites ?

Le système capillaire pulmonaire semble jouer un rôle crucial dans la migration des L3

et des microfilaires. Nous avons montré que les L3 migrent jusqu'à la cavité pleurale en

utilisant la circulation sanguine pulmonaire. Cependant, plus de 50% des filaires n'atteignent

pas la cavité pleurale malgré une injection en intraveineuse, alors que celle-ci les achemine

directement vers les capillaires pulmonaires. De plus, une accumulation de microfilaires dans

les poumons est souvent observée lors de l'infection de souris par des microfilaires [196,463,467]

et cette accumulation a été associée à la clairance des microfilaires par les poumons [196,461]

[504]. La disparition de la circulation sanguine de microfilaires inoculées prend des jours ou des

semaines en fonction du fond génétique des souris utilisées [196,461]. Chez les souris BALB/c,

les microfilaires circulent dans le sang pendant plusieurs semaines alors qu'elles disparaissent

en quelques heures chez les souris CBA/Ca ou les C57BL/6 [196]. Les microfilaires

s'accumulent alors dans les poumons et sont éliminées en moins de 4 jours [196]. Les

mécanismes permettant la séquestration et l'élimination des microfilaires dans les poumons

pourraient être analysés en comparant les réponses endothéliales et de l'espace périvasculaire

des différentes souches de souris. Dans le cas de la migration des L3 comme des microfilaires,

le piégeage des filaires dans les capillaires pulmonaires pourrait être modulé par des

traitements vasodilatateurs (papaïne et metformine) ou vasoconstricteurs (phenylephrine).

Enfin la localisation des L3 perdues lors de l'injection IV mais certainement aussi une

partie des L3 inoculées dans la peau (donc celles qui ne sont pas détruites dans la peau et qui

n’arrivent pas à la cavité pleurale) reste inconnue. Cependant le faible nombre inoculé, la

profondeur des tissus concernés, l’absence de filaires GFP, l’impossibilité d’utiliser un

anticorps de surface sur une longue période du fait des mues, rendent difficile une approche

de type tomographie en 3D. Une étude récente [514] a réussi à suivre les stades infestants de

Brugia pahangi pendant quelques jours en suivant la réponse immunitaire élicitée par les

filaires. Pour cela du luminol a été injecté dans les souris. Le luminol produit une lumière

bleue lorsqu'il est activé par la MPO des neutrophiles [515]. Dans cette étude, l'imagerie a

permis de détecter la réponse immunitaire provoquée dans la peau par 5 à 50 L3, 5 jours après

infection. L'utilisation de la lucigenine, qui nécessite une activité NADPH, caractéristique des

macrophages pourrait aussi être envisagée [516].

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257

Valorisation des résultats

Publications :

Fercoq F, Remion E, Frohberger S, Vallarino N, Hoerauf A, Huebner M, Carlin L, Martin C.

Microfilaremia in Litomosoides sigmodontis infected BALB/c mice is associated with lung

pathology. Manuscrit en préparation.

Karadjian G*, Fercoq F*, Pionnier N, Vallarino-Lhermitte N, Lefoulon E, Nieguitsila A,

Specht S, Carlin L, Martin C. Migratory phase of Litomosoides sigmodontis filarial infective

larvae is associated with pathology and transient increase of S100A9 expressing neutrophils

in the lung. PLOS Neglected Tropical Diseases, 2017. * contribution égale.

Pionnier N, Brotin N, Karadjian G, Hemon P, Gaudin-Nomé F, Vallarino-Lhermitte N,

Nieguitsila A, Fercoq F, Aknin M, Marin-Esteban V, Chollet-Martin S, Schlecht-Louf G,

Bachelerie F, Martin C. Neutropenic mice provide insight into the role of skin-Infiltrating

Neutrophils in the host protective Immunity against Filarial Infective Larvae. PLOS

Neglected Tropical Diseases, 2016.

Congrès:

Presentations orales:

Fercoq F, Karadjian G, Pionnier N, Vallarino-Lhermitte N, Lefoulon E, Nieguitsila A, Specht

S, Carlin L, Martin C. New insights into filarial biology : What Litomosoides sigmodontis

model has taught us about larval migration into lymphatics and lungs? 26th International

Conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology.

Kuala Lumpur 4-8 septembre 2017.

Fercoq F, Karadjian G, Pionnier N, Vallarino-Lhermitte N, Specht S, Carlin L, Martin C.

Filarial infection and pulmonary inflammation in the Litomosoides sigmodontis murine model

of filariasis. EMOP XII – The European Multicolloquium of Parasitology, Turku,

Finlande. 20-24 Juillet 2016.

Karadjian G, Fercoq F, Pionnier N, Vallarino-Lhermitte N, Specht S, Carlin L, Martin C.

Migration des stades infestant de la filaire murine Litomosoides sigmodontiset réponse

inflammatoire associée chez la souris BALB/c. Congrès de la Société Française de

Parasitologie. Grenoble. 23-24 Mars 2016.

258

Posters:

Karadjian G*, Fercoq F*, Pionnier N, Vallarino-Lhermitte N, Specht S, Carlin L, Martin C.

Litomosoides sigmodontis filarial infective larvae migrate through the lungs increasing

S100A9 in neutrophils. Molecular and Cellular Biology of Helminth Parasites IX. Hydra,

Grèce. 31 Aout– 5 September 2015.

Karadjian G*, Fercoq F*, Vallarino-Lhermitte N, Specht S, Carlin L, Kilarski W, Swartz M,

Martin C. Unravelling the filarial larvae migrations : lessons from Litomosoides

sigmodontis mouse model. Molecular and Cellular Biology of Helminth Parasites IX.

Hydra, Grèce. 31 Aout– 5 September 2015.

260

ANNEXES

261

Annexe 1. Liste des gènes pour l’étude des profils des transcrits pulmonaires à J4 et J70.

262

Annexe 1 : (suite)

263

Annexe 2. Décollement des cellules mésothéliales de la plèvre viscérale.


jours après infection, les poumons ont été récupérés. (A) Observation en microscopie

électronique à balayage du mésothélium d'une souris Mfneg montrant des zones desquamées

(flèches) ; (B) Immunomarquage de la cytokératine sur une coupe de poumon d'une souris

Mfpos montrant une portion de mésothélium partiellement décollé.

265

BIBLIOGRAPHIE

266

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Interactions filaire/poumon dans le modèle murin de filariose ...

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