Guilherme Mayrink Barandas Dissertacao completa.pdf

Universidade do Estado do Rio de Janeiro

Centro Biomédico

Faculdade de Ciências Médicas

Guilherme Mayrink Barandas

Caracterização de Bacilos Gram-Negativos Não Fermentadores não

usuais em bacteremias pelas técnicas de Matrix-Assisted Laser

Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry,

Sequenciamento de DNA e método fenotípico convencional

Rio de Janeiro

2013


Caracterização de Bacilos Gram-Negativos Não Fermentadores não usuais em

bacteremias pelas técnicas de Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–

Time of Flight Mass Spectrometry, Sequenciamento de DNA e Método

fenotípico convencional

Dissertação apresentada, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre, ao Programa de Pós-graduação em Microbiologia, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Área de concentração: Microbiologia Médica Humana.

Orientadora: Profa. Dra. Elizabeth de Andrade Marques

Rio de Janeiro

2013

CATALOGAÇÃO NA FONTE UERJ/REDE SIRIUS/BIBLIOTECA CB-A

Autorizo, apenas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial

desta dissertação, desde que citada a fonte.

_____________________________________ _____________________

Assinatura Data

B225 Barandas, Guilherme Mayrink. Caracterização de Bacilos Gram-Negativos Não Fermentadores não

usuais em bacteriemias pelas técnicas de Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization– Time of Flight Mass Spectrometry, sequenciamento de DNA e método fenotípico convencional / Guilherme Mayrink Barandas. – 2013.

94f. Orientadora: Elizabeth de Andrade Marques. Dissertação (Mestrado) – Universidade do Estado do Rio de

Janeiro, Faculdade de Ciências Médicas. Pós-graduação em Microbiologia.

1. Infecção hospitalar. 2. Infecções bacterianas gram-negativas. 3.

Complexo Burkholderia cepacia. I. Marques, Elizabeth de Andrade. II. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.

CDU 616-022.1


Caracterização de Bacilos Gram-Negativos Não Fermentadores não usuais em

bacteremias pelas técnicas de Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–

Time of Flight Mass Spectrometry, Sequenciamento de DNA e método

fenotípico convencional

Dissertação apresentada, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre, ao Programa de Pós-graduação em Microbiologia, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Área de concentração: Microbiologia Médica Humana.

Aprovada em 30 de julho de 2013.

Orientadora: Profa. Dra. Elizabeth de Andrade Marques

Faculdade de Ciências Médicas - UERJ

Banca Examinadora:

_____________________________________________

Profa. Dra. Mara Lúcia Penna Queiroz


_____________________________________________

Prof. Dr. Robson de Souza Leão


_____________________________________________

Profª. Dra. Ana Paula D´Alincourt Carvalho-Assef

Fundação Oswaldo Cruz

_____________________________________________

Profª. Dra. Maria Cristina Maciel Plotkowsi – Suplente


Rio de Janeiro

2013

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho ao meu sobrinho Felipe e seu irmãozinho ou irmãzinha

que está para chegar. Nada dá maior sensação de renovação e de esperança que a

chegada de uma nova vida. Que vocês façam do mundo um lugar melhor.

AGRADECIMENTOS

À minha família. Palavras jamais refletirão o tamanho do orgulho e gratidão

que tenho pelo convívio, amor e educação. Sou o que sou hoje por que tenho os

melhores exemplos. Em cada passo dado vocês são o Norte, e cada nova conquista

é com vocês, por vocês e para vocês!

À minha orientadora, Profa. Beth, pelo exemplo, pela orientação, pela

liderança, pelo conhecimento transmitido, pelas broncas e por me desafiar com um

projeto ambicioso que, por vezes, pensei ser demais. Obrigado por acreditar em

mim.

À querida companheira diária de laboratório Márcia Jones, que com amor de

mãe me ensinou boa parte do que precisava para desenvolver este trabalho. Muito,

mas muito obrigado mesmo, pelo tempo, disponibilidade, paciência e alto-astral

infinitos. Não “tá” fácil para niguém, mas com você junto facilita muito!

À todos os amigos do Laboratório 2, pela fundamental ajuda e conhecimento

trocado, além do convívio e risadas compartilhadas.

Aos amigos da turma de mestrado de 2011, por tornar a rotina mais

agradável, pelos momentos de descontração e companheirismo, e pelos almoços,

nos quais o que menos importava era a qualidade da comida!

Aos professores do Departamento de Microbiologia, Imunologia e

Parasitologia da UERJ, pelo estímulo à construção do conhecimento tanto quanto

pelo conhecimento passado.

Aos técnicos do Departamento de Microbiologia, pelo importante apoio com

os mais de 3 mil tubos, centenas de placas e tantos outros insumos usados.

Ao Prof. Rodolpho e Denise, do Laboratório de Genômica do Departamento

de Bioquímica do IBRAG/UERJ, pela ajuda com o sequenciamento e por estarem

sempre disponíveis em seu laboratório.

Aos membros LAPIH/FIOCRUZ, em especial à Drª. Ana Paula e a querida

amiga Polyana, pela gentileza na cooperação com o PFGE. Muito obrigado pelo

auxílio!

Ao Pedro Peloso, do Laboratório Richet, pela imensa presteza na colaboração

com o MALDI-TOF MS.

E a todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para o

desenvolvimento deste trabalho.

Procure ser uma pessoa de valor antes de procurar ser uma pessoa de sucesso; o

sucesso é consequência do valor.

Albert Einstein

RESUMO

BARANDAS, Guilherme Mayrink. Caracterização de Bacilos Gram-Negativos Não Fermentadores não usuais em bacteremias pelas técnicas de Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry, sequenciamento de DNA e método fenotípico convencional. 2013. 92f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) – Faculdade de Ciências Médicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2013.

Alguns Bastonetes Gram-negativos não fermentadores (BGNNF) costumam ser considerados clinicamente pouco significantes e a sua implicação em infecções é subestimada. Devido à similaridade fenotípica, mudanças taxonômicas, baixa reatividade bioquímica e limitações nos bancos de dados em sistemas comerciais, a identificação de BGNNF é frequentemente equivocada, culminando com a denominação de diferentes micro-organismos apenas como “BGNNF”, por falta de melhor diferenciação. O objetivo desse estudo foi avaliar, por métodos fenotípico convencional, proteômico e molecular, a identificação de BGNNF incomuns isolados em hemoculturas de pacientes atendidos em um hospital universitário no Rio de Janeiro. Foram selecionadas 78 amostras isoladas de hemoculturas caracterizadas no laboratório clinico como BGNNF para a identificação por sequenciamento dos genes 16S RNA e recA, por um conjunto amplo de testes fenotípicos manuais e por MALDI-TOF MS. Os micro-organismos predominantes na amostragem foram genotipados pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Pelo sequenciamento do gene 16S rRNA, a maioria das amostras (n=31; 40%) foi incluída no gênero Burkholderia, seguido de Pseudomonas stutzeri (10%) e Delftia acidovorans (4%). Os demais isolados foram agrupados em 27 diferentes espécies. O sequencimento do gene recA identificou a maioria das espécies de Burkholderia como Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Os testes fenotípicos incluíram as 31 amostras apenas no CBc e para as outras 47 amostras, a concordância com o sequenciamento do gene 16S rRNA em nível de espécie foi de 64% (n=30) e apenas em gênero a concordância foi de 17% (n=8). A análise comparativa geral da identificação por MALDI-TOF MS com o sequenciamento do gene16S rRNA mostrou que 42% (n=33) das 78 amostras foram concordantes em nível de espécie e 45% (n=35) apenas em gênero. Excluindo as amostras do CBc, houve um aumento da concordância em nível de espécie para 60%. As discordâncias parecem ser devido às diferenças nos perfis proteicos das amostras em relação às amostras-referência do banco de dados do equipamento e podem ser aprimorados com a atualização de perfis no sistema. A análise do polimorfismo genético de B. contaminans mostrou a ausência de um clone disseminado causando surto, além da provável origem ambiental das infecções. Os setores de nefrologia e hemodiálise contribuíram com maior número de pacientes com amostras positivas (5 pacientes e 9 amostras). Os grupos clonais BcoD e BcoE foram encontrados em pacientes assistidos no mesmo setor com diferença de quatro meses (BcoD, nefrologia) e 1,5 ano (BcoE, hemodilálise), entre as culturas, respectivamente. As discordâncias entre as técnicas ocorreram principalmente devido a dificuldade de identificação das espécies do CBc. Os BGNNF incomuns são de difícil caracterização independente da metodologia usada e nenhum método por si só foi capaz de identificar todas as amostras.

Palavras-chave: BGNNF. Complexo Burkholderia cepacia. Identificação fenotípica. Sequenciamento. MALDI-TOF MS.

ABSTRACT

Some nonfermenting Gram-negative Bacilli (NFGNB) are considered of low clinical significance, and their implication in infections is usually underestimated. Due to their phenotypic similarities, frequent taxonomic changes and low biochemical reactivity, as well as to limitations of bacterial identification commercial system databases, these NFGNB are frequently misidentified and are collectively referred to as “NFGNB group”, in the lack of a better differentiation. The aim of the present study was to evaluate the performance of the conventional phenotypic method, the proteomic matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectometry method (MALDI-TOF MS) and of molecular methods (16S RNA and recA gene sequencing) in the identification of 78 unusual NFGNB isolated from blood cultures of pacients treated at an university hospital in Rio de Janeiro. Clonality of the predominant species identified within these isolates was determined by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). By the 16S rRNA gene sequence analysis, most strains (n = 31; 40%) were included in the Burkholderia spp. followed by Pseudomonas stutzeri (n = 8; 10%), Delftia acidovorans (n = 3; 4%) and Stenotrophomonas maltophilia (n = 3; 4%). The remaining bacterial isolates were included in 27 different species. By the recA gene sequencing technique, most bacteria from the Burkholderia cepacia complex (BCC), samples were classified as Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Phenotypic tests provided accurate identification of all 31 isolates included in the BCC by the 16S rRNA gene sequence analysis. For the other 47 samples, agreement of the results obtained with these two techniques in species and genus level identifications occurred in 30 (63,8%) and 17 samples (36,2%), respectively. The results obtained by the MALDI-TOF MS and 16S rRNA gene sequencing methods agreed at species and genus levels in 33 (42%) and 35 isolates (45%), respectively. When bacteria from the BCC were excluded from the analysis, the agreement between the two techniques at species level increased to 60%. Misidentification by the MALDI-TOF MS method may be due to differences in protein spectra between the samples and the reference strains in the equipment database. PFGE analysis of B. contaminans isolates revealed the absence of a disseminate clone causing an outbreak, and the probable environmental source of infections. The nefrology ang dialisis sectors contributed to the greatest number of patients with positive cultures (5 pacients and 9 isolates). Clones BcoD and BcoE were found in blood cultures of pacientes treated in a same sector with differences of 4 months (BcoD, nefrology) and 1.5 year (BcoE, dialisis). The misidentifications occurred mainly due to the hard differentiation of BCC species. Unusual NFGNB are of difficult characterization whatever the methodology used and no method alone was able to identify all the isolates.

Keywords: NFGNB. Burkholderia cepacia Complex. Identification. Sequencing. MALDI-TOF MS.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Aplicação de matriz HCCA em amostras inoculadas em uma placa do sistema MALDI-TOF MS ..............................................

43

Figura 2 – Fluxograma representando o processamento de amostras pelo sistema MALDI-TOF MS.............................................................

44

Figura 3 – Alinhamento de sequências das amostras de CBc com sequências de amostras padrão das 17 espécies do complexo.

50

Figura 4 – Distribuição das espécies do CBc em amostras de BGNNF identificadas por sequenciamento do gene recA........................

51

Figura 5 – Espectros proteicos de 4 amostras gerados pelo sistema

MALDI-TOF-MS: (A) A. xylosoxidans; (B) B. contaminans; (C) D. acidovorans; e (D) P. stutzeri.................................................

57

Figura 6 – Gel representativo dos padrões de PFGE para 13 amostras da espécie B. contaminans .............................................................

64

Figura 7 – Dendrograma considerando 85% de similaridade entre os perfis de PFGE obtidos de amostras de B. contaminans ....................................................................................................

65

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Compilação dos dados de três estudos de vigilância em bacteremias por BGNNF incomuns.............................................

19

Tabela 2 – Estudos de descrição das espécies do Complexo Burkholderia cepacia ………….........................................................................

21

Tabela 3 – Espécies de BGNNF identificadas por sequenciamento do gene codificador do rRNA 16S....................................................

48

Tabela 4 – Análise comparativa da identificação pelo método fenotípico em relação ao método molecular................................................

53

Tabela 5 – Índices de concordância da identificação de 78 amostras de BGNNF obtida no MALDI-TOF MS em relação ao método molecular.....................................................................................

54

Tabela 6 – Índices de concordância da identificação de 47 amostras de BGNNF (exceto CBc) obtida no MALDI-TOF MS em relação ao método molecular........................................................................

55

Tabela 7 – Índices de concordância da identificação das 31 amostras de Burkholderia spp. obtida no MALDI-TOF MS em relação ao método........................................................................................

55

Tabela 8 – Análise comparativa da identificação por MALDI-TOF MS em relação ao método molecular......................................................

58

Tabela 9 – Análise comparativa da identificação pelo método fenotípico e por MALDI-TOF MS em relação ao método molecular...............

61

Tabela 10 – Resultados de identificação incorreta por ambos os métodos fenotípicos em relação ao sequenciamento................................

63

Tabela 11 – Distribuição cronológica dos grupos clonais determinados por PFGE para a espécie B. contaminans encontrada nos pacientes atendidos nos diversos setores do HUPE..................

66

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ARDRA Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis

ATCC American Type Culture Collection

BGNNF Bastonetes Gram-negativos Não Fermentadores

BHI Brain Heart Infusion

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

BTS Bacterial Type Standard

CHEF Contour-clamped Homogeneous Electrical Field

CLED Cystine Lactose Electrolyte Deficient

FDA Food and Drug Administration

HUPE Hospital Universitário Pedro Ernesto

ICS Infecção de Corrente Sanguínea

LABAC Laboratório de Bacteriologia

LPSN List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature

MALDI-TOF MS

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight

Mass Spectrometry

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis

PYR Pirrolidonil Arilamidase

rRNA Ácido Ribonucleico Ribossomal

SIM Sulfeto-Indol-Mobilidade

UERJ Universidade do Estado do Rio de Janeiro

UPGMA Unweighted Pair of Group Method of Arithmetic mean

UTI Unidade de Tratamento Intensivo

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO .............................................................................................. 13

1 OBJETIVOS .................................................................................................. 30

1.1 Objetivo geral ............................................................................................... 30

1.2 Objetivos específicos .................................................................................. 30

2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 31

2.1 Seleção da amostragem ............................................................................ 31

2.2 Identificação fenotípica .............................................................................. 31

2.3 Identificação molecular de BGNNF por sequenciamento dos genes

16S rRNA e recA ..........................................................................................

38

2.3.1 Extração do DNA bacteriano por lise térmica .......................................... 38

2.3.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) .................................................. 39

2.3.3 Eletroforese em gel de agarose ................................................................. 39

2.3.4 Purificação do DNA ..................................................................................... 40

2.3.5 Reação de Sequenciamento ....................................................................... 40

2.3.6 Purificação, precipitação do DNA e análise .............................................. 41

2.4

2.5

Espectrometria de massa de proteínas pela metodologia de Ionização

por dessorção a laser assistida por matriz – tempo de voo - MALDI-

TOF- MS.........................................................................................................

Perfil de Fragmentação do DNA Cromossômico por Eletroforese em

Campo Pulsado (PFGE) ..............................................................................

42

45

2.5.1 Suspensão de células ................................................................................. 45

2.5.2 Preparação dos blocos de agarose (plugs) .............................................. 45

2.5.3 Digestão do DNA nos plugs de agarose ................................................... 46

2.5.4 Corrida eletroforética .................................................................................. 46

2.5.5 Coloração do gel de agarose e análise dos resultados do PFGE .......... 47

2.6 Aspectos éticos ........................................................................................... 47

3 RESULTADOS .............................................................................................. 48

3.1 Identificação molecular de BGNNF por sequenciamento dos genes

16S rRNA e recA ..........................................................................................

48

3.2 Identificação fenotípica de BGNNF............................................................. 51

3.3 MALDI-TOF MS ............................................................................................ 54

3.4 Comparação entre os resultados das identificações fornecidas pelas

metodologias fenotípica, molecular e MALDI-TOF-MS.............................

59

3.5 Tipagem das amostras de B. contaminans por PFGE ............................. 63

4 DISCUSSÃO ................................................................................................. 67

4.1 Identificação molecular e identificação fenotípica manual de BGNNF 68

4.2 MALDI-TOF-MS ............................................................................................ 73


metodologias fenotípica, molecular e MALDI-TOF-MS ............................

78

4.4 Tipagem das amostras de B. contaminans por PFGE ............................. 79

5 CONCLUSÃO ............................................................................................... 82

REFERÊNCIAS.............................................................................................. 84

13

INTRODUÇÃO

Bacteremias

A circulação de bactérias no sangue define uma bacteremia. A presença

desses micro-organismos contaminando o tecido sanguíneo pode resultar em uma

infecção de corrente sanguínea (ICS), que pode ser classificada como silenciosa ou

subclínica, quando não há reflexos sintomáticos no paciente, ou ainda como sepse,

caracterizada por ser uma síndrome clinica complexa e potencialmente fatal. Em

casos extremos pode ocorrer o óbito por choque séptico, decorrente de reação

inflamatória sistêmica descontrolada, consequente a grande diminuição da pressão

sanguínea e falência múltipla de órgãos e sistemas. Os sintomas da sepse são

resultado da agressão dos microoganismos e da resposta inflamatória do

hospedeiro, e ocorrem quando a capacidade de remoção dos fagócitos é superada

pela taxa de multiplicação dos patógenos (ANVISA, 2004; ANVISA, 2009; Al Mohajer

& Darouiche, 2012). As bacteremias são geralmente causadas por um único agente

infeccioso, e raramente polimicrobianas. Podem ser transitórias, intermitentes ou

contínuas, de acordo com o mecanismo de entrada da bactéria na corrente

sanguínea. As bacteremias transitórias, com pequena duração, são as mais comuns

e ocorrem após pequeno trauma em tecido colonizado ou manipulação de tecido

infectado, tais como pequenos procedimentos médicos e odontológicos. Já as

intermitentes se manifestam em intervalos de tempo variados e estão geralmente

relacionados a processos infecciosos em outros sítios do corpo, como abscessos e

celulites. Quando resultantes de infecções intravasculares, do endocárdio ou de

dispositivos infectados (como cateteres) são denominadas contínuas (ANVISA,

2004).

As principais fontes de bacteremia são geralmente relacionadas a infecções

como meningites, pneumonias, peritonites e pielonefrites, bem como a entrada direta

de micro-organismos no sangue, via feridas cirúrgicas, acessos venosos, drenos e

outros equipamentos médicos e cirúrgicos contaminados, sendo as infecções

relacionadas a cateteres o exemplo mais notório (ANVISA, 2004; Al Mohajer, 2012).

As ICS no ambiente hospitalar geralmente são indicativas de eventos graves,

com letalidade atribuída em torno de 35%, prolongamento da internação hospitalar e

custos adicionais elevados por paciente (Hugonnet et al, 2004; Silva et al, 2006;

14

Leão et al, 2007). As culturas de sangue quando positivas permitem identificar uma

população de alto risco de morte, sendo a probabilidade de óbito durante a

internação 12 vezes maior que em pacientes com hemoculturas negativas (Silva et

al, 2006).

Uma tendência de aumento das ICS tem sido descrita nos últimos tempos,

especialmente pelo aumento do uso de recursos invasivos como cateteres (National

Nosocomial Infections Surveillance System, 1991; Weinstein et al, 1997; Diekema et

al, 2003). Apesar de extensa literatura internacional sobre ICS, sobretudo nas

últimas décadas, os estudos brasileiros ainda são escassos diante da demanda por

informação no assunto (Leão et al, 2007).

Bacteremia é uma das maiores causas de morbidade e mortalidade na

população em geral e em pacientes hospitalizados, representando 15% de todas as

infecções hospitalares. Afeta aproximadamente 1% dos pacientes hospitalizados,

com enorme impacto em seus prognósticos. Em países desenvolvidos, causa de 77

a 92 hospitalizações por 100,000 pessoas por ano, com mortalidades de 13 a 19%

dentro de 30 dias. Sua incidência tem aumentado ao longo dos últimos 15 anos

(Gales et al, 2005), sendo a 11ª maior causa de morte nos Estados Unidos da

América (EUA), atualmente (Heron, 2012). Entretanto, ainda há poucos estudos

sobre sua incidência ou tendências em países em desenvolvimento, embora tais

informações sejam essenciais ao planejamento do uso de recursos de prevenção,

controle e assistência a saúde (Kanoksil et al, 2013).

No Brasil, um país de dimensões continentais, de população heterogênea e

acesso desigual aos serviços de saúde, medidas para diminuir a prevalência de ICS

e a mortalidade associada, guiada por dados confiáveis, deveriam ser incluídas em

qualquer política nacional de saúde (Silva et al, 2004).

Portanto, é notória a importância do monitoramento diário dos laudos de

hemocultura, visto que informações armazenadas em bancos de dados dos

laboratórios clínicos podem ser usadas para gerar estimativas acerca desse tipo de

infecção na população. Porém, ainda são pouco aproveitados para tais fins,

tampouco para alimentar os sistemas de vigilância em saúde (Silva et al, 2006;

Kanoksil et al, 2013).

Micro-organismos associados a ICS

15

De acordo com uma pesquisa de vigilância microbiológica sobre ICS

nosocomiais em 49 hospitais dos EUA, ao longo de 7 anos, foi observada maior

incidência de ICS por bactérias Gram-positivas (65%) que por Gram-negativas (25%)

e fungos (9,5%) (Wisplinghoff et al, 2004) .

Em unidades de cuidado não intensivo, os principais agentes etiológicos

dessas infecções foram: Staphylococcus coagulase-negativo, responsáveis por

26,6% dos casos, seguidos por Staphylococcus aureus (23,7%), Enterococcus spp.

(9%), Candida spp. (7,9%), Escherichia coli (7,6%), Klebsiella spp. (5,5%),

Pseudomonas aeruginosa (3,8%), Enterobacter spp. (3,1%), Serratia spp. (1,3%) e

Acinetobacter baumannii (0,9%). Nas unidades de cuidados intensivos, esse perfil

epidemiológico apresentou pequenas mudanças, especialmente para algumas

bactérias Gram-negativas. Apesar de Staphylococcus coagulase-negativo (35,9%) e

Staphylococcus aureus (16,8%) figurarem como os principais causadores de ICS,

Candida spp. (10,1%) foi mais frequente que Enterococcus spp. (9,8%),

Pseudomonas aeruginosa (4,7%), Enterobacter spp. (4,7%), Klebsiella spp. (4%),

Escherichia coli (3,7%), Serratia spp. (2,1%) e Acinetobacter baumannii (1,6%)

(Wisplinghoff et al, 2004).

No Brasil, um estudo de vigilância conduzido entre os anos 2007 e 2010 em

16 hospitais traçou um perfil epidemiológico das ICS nosocomiais, e apontou que as

ICS foram causadas principalmente por bactérias Gram-negativas, responsáveis por

58,5% dos casos. Bactérias Gram-positivas e fungos incidiram sobre 35,4% e 6,1%

dos pacientes bacteriêmicos (Marra et al, 2011). Nos ambientes de cuidados não

intensivos, os mais frequentes causadores desse tipo de infecções foram

Staphylococcus aureus (17,9%), Klebsiella spp. (14,5%), Staphylococcus coagulase-

negativos (11,2%), Acinetobacter spp. (10%), Pseudomonas aeruginosa (7,9%),

Enterobacter spp. (6,4%), Candida spp. (3,9%), Serratia spp. (3,8%), Enterococcus

spp. (3,6%) e Proteus spp. (1,6%) (Marra et al, 2011). Nas unidades de

tratamento intensivo (UTI), ocorreu perfil microbiológico diferente: Staphylococcus

coagulase-negativos (16,6%), Acinetobacter baumannii (15,2%), Staphylococcus

aureus (12,8%), Klebsiella pneumoniae (11,8%), Pseudomonas aeruginosa (10%),

Candida spp. (7,4%), Enterobacter spp. (5,8%), Enterococcus spp. (5,5%), Serratia

spp. (3,2%) e Proteus spp. (1,8%) (Marra et al, 2011).

16

Nos Estados Unidos, a etiologia de bacteremias apresenta diferente

distribuição, com menores percentuais de enterobactérias de forma geral, com

Escherichia coli (5,6%), Klebsiella spp. (4,8%) Enterobacter spp. (3,9%) e Serratia

spp. (1,7%) figurando entre os mais comuns. Dentre as bactérias do grupo dos

Bastonetes Gram-Negativos Não fermentadores, P. aeruginosa (4,3%) e

Acinetobacter baumannii (1,3%) foram as apareceram em maior percentual

(Wisplinghoff et al, 2004).

A faixa etária dos pacientes também influencia no perfil microbiológico das

bacteremias. Em uma revisão de estudos de cobrindo mais de 4000 hemoculturas,

além dos micorganimos mencionados, foram encontrados Salmonella spp. (8%),

Streptococcus pneumoniae (9%) e Haemophilus influenzae (4%), juntos

responsáveis por 21% dos casos pediátricos de sepse (Downie et al, 2012).

Bacteremias por bastonetes Gram-negativos não fermentadores

Bastonetes Gram-negativos não fermentadores da glicose (BGNNF) são

ubíquos, ocorrendo principalmente na água e no solo, devido a sua capacidade de

metabolizar os mais diversos compostos. São também encontrados, embora mais

raramente, na microbiota humana, o que os torna um grupo de patógenos

vastamente distribuídos nos ambientes comunitário e hospitalar (Enoch & Ludlam,

2007; Yoshino et al, 2011). São considerados patógenos oportunistas e raramente

causam infecções em indivíduos saudáveis (Ladhani & Gransden, 2002; Gales et al,

2005; Özdemir et al, 2011; Hsu et al, 2011). Trata-se de um grupo extenso, que

compreende uma grande quantidade de gêneros como Pseudomonas,

Acinetobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, dentre outros, e mais uma

infinidade de espécies. (Enoch & Ludlam, 2007)

Condizentes com seu caráter oportunista, ameaçam majoritariamente

pacientes hospitalizados e já debilitados. Fatores predisponentes para ICS por

BGNNF são leucopenia, neutropenia, doenças malignas e imunossupressoras,

tratamento quimioterápico, antibioticoterapia de amplo espectro e uso de cateteres

intravasculares (Ladhani & Gransden, 2002; Detrait et al, 2008; Özdemir et al, 2011;

17

Garazi et al, 2012). Os BGNNF constituem um grupo de patógenos especialmente

importantes em indivíduos com Fibrose Cística (FC), doença de ordem

cromossômica responsável por um distúrbio nas secreções de glândulas exócrinas

ou produtoras de muco (Jacquier et al, 2011). Dentre as espécies de BGNNF nesses

pacientes destacam-se a Pseudomonas aeruginosa e o Complexo Burkholderia

cepacia (CBc), por sua associação com alta mortalidade e transmissibilidade.

Entretanto, os quadros são majoritariamente pulmonares e bacteremias são raras

(Zemanick, Sagel & Harris, 2011).

Possíveis fontes para aquisição de BGNNF no ambiente hospitalar incluem a

microbiota ambiental e normal humana, além dos equipamentos intravasculares de

terapia, fluido de diálise, sistemas de água, água destilada, ventiladores mecânicos,

nebulizadores e soluções antissépticas (Holmes, Snell & Lapage, 1977; Shigeta et

al, 1978; Oie et al, 2005). A mortalidade associada a contaminações dessa natureza

pode variar de 0% para produtos como gel de ultrassom e ranitidina até 49% para

nutrição parenteral e 56% para células vermelhas para transfusão, com uma média

de 11% quando considerados produtos sanguíneos, nutrição parenteral, drogas e

substâncias desinfetantes (Vonberg & Gastmeier, 2007).

Bacteremias sem complicações representam a forma clínica mais comum de

infecções por esses organismos, apesar de também serem observados casos

secundários a dispositivos intravasculares, pneumonias, peritonites, nefrites,

endocardites, osteomielites, artrites sépticas, empiema pulmonar, abscessos, dentre

outros. Meningites por BGNNF são mais raras e encontradas principalmente em

crianças (Aisenberg, Rolston & Safdar, 2004; Eom, Cheong & Kim, 2009; Lin et al,

2010).

ICS usualmente se apresentam como quadros de risco de morte, com

significativa morbidade e mortalidade – pelo estado fragilizado de saúde e pela

múltipla resistência a antibióticos comumente prescritos, que complicam a terapia

(Ladhani & Gransden, 2002; Hsu et al, 2011, Jacquier et al, 2011). Desde os anos

1990 é observado um aumento significativo de episódios bacterêmicos por BGNNF,

paralelamente ao aumento de pacientes imunossuprimidos ou em uso crônico de

cateteres intravasculares, o que pode representar um desafio terapêutico e atraso na

administração de terapia antimicrobiana adequada (Ladhani & Gransden, 2002; Lin

et al, 2010; Gales et al, 2005; Fihman et al, 2012).

18

Predominam amplamente na literatura pesquisas sobre ocorrência dos

BGNNF mais comuns, notadamente P. aeruginosa e A. baumannii. Porém, são

escassos os dados sobre a ocorrência de outras espécies de BGNNF em

bacteremia.

Em um trabalho de vigilância em bacteremias por BGNNF incomuns (exceto

P. aeruginosa), realizado na Espanha entre 1991 e 2000 por Vidal e colaboradores,

Pseudomonas putida e o grupo Alcaligenes-Achromobacter foram detectados em

14% das amostras cada um. Por ordem descrescente de frequência, seguiram

Acinetobacter johnsonii e Burkholderia spp. (ambos com 13% cada), Pseudomonas

fluorescens (9%), Pseudomonas stutzeri (8%), Ralstonia pickettii (6%), Comamonas

spp., Pseudomonas oryzihabitans (5% cada) e Sphingomonas paucimobilis (4%).

Outros BGNNF foram isolados dos 9% dos pacientes restantes (Vidal et al, 2002).

Em outro estudo de vigilância conduzido por Gales e colaboradores, com

abrangência latino americana no período de 1997 a 2002, foi observada maior

ocorrência de Burkholderia spp. responsáveis por 44% das bacteremias por BGNNF

incomuns, acompanhado por Achromobacter spp. e Ralstonia picketti (14% cada),

Chryseobacterium spp. (5%), Alcaligenes spp. (3%) e ainda 21% de outros BGNNF

incomuns (Gales et al, 2005). Neste estudo, foram considerados BGNNF incomuns

os não pertencentes às espécies P. aeruginosa, A. baumannii e S. maltophilia.

Mais recentemente, Jacquier e seu grupo publicaram uma pesquisa de

caráter semelhante com amostras de BGNNF (excetuadas A. baumannii e P.

aeruginosa) obtidas de dezembro 2008 a maio de 2009, em nove hospitais na

França. Os autores detectaram um predomínio de Pseudomonas oryzihabitans e

Acinetobacter junii, cada um destes responsáveis por 15% das hemoculturas

positivas estudadas seguido de Acinetobacter lwoffi (12%) e Pseudomonas spp.

(8%). Varios outras espécies foram encontardas em percentuais menores (Jacquier

et al, 2011). Nesta análise também foram desconsideradas as amostras de S.

maltophilia incluídas no estudo.

Na tabela 1 estão compilados todos os dados dos trabalhos supracitados.

19

Tabela 1: Compilação dos dados de três estudos de vigilância em bacteremias por BGNNF incomuns.

Micro-organismo Vidal et al., 2002 Gales et al., 2005 Jacquier et al., 2011

Achromobacter spp. 14%

Alcaligenes-Achromobacter (grupo) 14%

Achromobacter xylosoxidans 4%

Acinetobacter spp. 13%

Acinetobacter johnsonii 4%

Acinetobacter junii 15%

Acinetobacter lwoffii 12%

Acinetobacter radioresistens 4%

Alcaligenes sp. 3% 4%

Brevundimonas diminuta 4%

Burkholderia spp. 13%

Burkholderia cepacia (complexo) 44%

Burkholderia gladioli 4%

Comamonas spp. 5%

Chryseobacterium spp. 5%

Cupriavidus pauculus 4%

Elizabethkingia meningoseptica 4%

Ochrobactrum anthropi 4%

Pseudomonas spp. 8%

Pseudomonas fluorescens 9%

Pseudmonas stutzeri 8% 4%

Pseudomonas luteola 4%

Pseudomonas mossellii 4%

Pseudomonas oryzihabitans 5% 15%

Pseudomonas putida 14% 4%

Ralstonia pickettii 6% 14%

Sphingomonas paucimobilis 4%

Outros 9% 21%

20

Os poucos estudos que relatam casos de bacteremias por BGNNF incomuns

consideram diferentes conjuntos de micro-organismos como “BGNNF incomuns” e

utilizam diferentes metodologias para a identificação, tornando difícil a compilação

de dados em uma forma única e padronizada. De toda forma, existem relatos de

cerca de 10 casos causados por B. vesicularis (Shang et al, 2011), 68 casos por

Chryseobacterium indologenes (Lin et al, 2010b, Chou et al, 2011) e 20 por

Sphingomonas paucimobilis (Ryan & Adley, 2010), geralmente ligados a pacientes

previamente debilitados.

Bacteremia pelo Complexo Burkholderia cepacia (CBc)

O CBc é um grupo de espécies de BGNNF intimamente relacionadas,

tipicamente ambientais, extremamente similares genética e bioquimicamente

(Vandamme et al., 1997). Seu extenso genoma (7,5 - 8,5 Mb) confere características

fenotípicas que dificultam sua classificação em espécies bem definidas(Vandamme

e Dawyndt, 2011).

Burkholderia cepacia foi primeiramente isolada por Walter Burkholder, um

microbiologista e patologista botânico na década de 1940, que reportou, à época,

uma doença em bulbos de cebola, propondo o nome Pseudomonas cepacia para o

agente etiológico (Burkholder, 1950). Somente em 1992, após estudos de homologia

de DNA em espécies do gênero Pseudomonas, algumas espécies foram transferidas

para um novo gênero, Burkholderia, em homenagem ao pesquisador que as

descreveu (Vandamme e Dawyndt, 2011). O gênero compreende atualmente 74

espécies, segundo o List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature

(LPSN)1.

O sequenciamento do gene recA, que codifica uma recombinase essencial

para os sistemas de reparo e recombinação do genoma, é atualmente o método de

referência utilizado para a tipificação das espécies do CBc. O gene codificador do

rRNA 16S, apesar do uso difundido para identificação molecular bacteriana, é

1 Disponível do endereço eletrônico da LPSN: <http://www.bacterio.cict.fr/b/burkholderia.html>, acessado em 10/06/2013.

21

limitado para a identificação em nível de espécie, visto a gigantesca similaridade em

suas sequencias de nucleotídeos. Como alternativa, o gene recA foi escolhido, por

seu alto poder discriminatório na biologia molecular de bactérias tão proximamente

relacionadas (Mahenthiralingam et al., 2000).

Hoje, o CBc é composto por 17 espécies denominadas como demonstradas

na tabela a seguir, de acordo com autor e ano de descrição ou inclusão no CBc.

Tabela 2: Estudos de descrição das espécies do Complexo Burkholderia cepacia.

Espécie do CBc Referência(s)

1 B. cepacia Vandamme et al., 1997

2 B. multivorans Vandamme et al., 1997

3 B. cenocepacia Vandamme et al., 1997

4 B. stabilis Vandamme et al., 1997

5 B. vietnamiensis Vandamme et al., 1997

6 B. dolosa Vermis et al., 2004

7 B. ambifaria Coenye et al., 2001

8 B. anthina Vandamme et al., 2002

9 B. pyrrocinia Vandamme et al., 2002

10 B. ubonensis Yabuuchi et al., 2000; Vanlaere et al., 2008

11 B. latens Vanlaere et al., 2008

12 B. diffusa Vanlaere et al., 2008

13 B. arboris Vanlaere et al., 2008

14 B. seminalis Vanlaere et al., 2008

15 B. metallica Vanlaere et al., 2008

16 B. lata Vanlaere et al., 2009

17 B. contaminans Vanlaere et al., 2009

22

O CBc consiste de um grupo de microrganimos de grande importância

em infecções pulmonares em pacientes com FC e raramente associado a infecção

sistêmica nesse grupo. Todavia, é um grupo de patógenos pouco conhecidos em

populações não portadoras de FC, apesar de terem sido relatados casos de

bacteremias em indivíduos não-fibrocísticos, quase sempre associados a surtos.

Nesse contexto, assim como outros BGNNF, atingem pacientes previamente

debilitados, imunossuprimidos ou ainda em diálise, e estão amplamente distribuídos

no ambiente. Portanto, o isolamento de espécies do CBc em espécimes clínicos

pode sugerir contaminação de origem ambiental (Magalhães et al, 2003; Gómez et

al, 2008; Christiansen, 2011). Vonberg e Gastmeier, em revisão bibliográfica

recente, encontraram 15 relatos na literatura de infecções hospitalares por CBc, com

diferentes origens de contaminação, como toalhas, soluções desinfetantes e líquido

de diálise (Vonberg & Gastmeier, 2007).

Na literatura, também há relatos de surtos em pacientes com e sem FC, nos

quais foi considerada a ocorrência de contaminação cruzada entre pacientes

(Holmes et al,1999; Siddiqui et al,2001; Agodi et al, 2002).

Os fatores de risco mais significantes para o desenvolvimento de bacteremias

por CBc são: dois ou mais procedimentos broncoscópicos, traqueostomia ao início

da infecção por CBc, uso de cateter venoso central, doença renal que requeira

diálise e cirurgia abdominal recente (Bressler et al, 2007).

A gravidade da infecção pelo CBc, em particular quando em ICS, se deve à

sua virulência, à delicada situação do hospedeiro e à sua notória resistência a

múltiplos antimicrobianos e agentes desinfetantes. À vista disso, é crescente a

preocupação com CBc enquanto agentes patogênicos em bacteremias (Saika et al,

2002; Woods et al, 2004; Ibarguren et al, 2011).

Um estudo conduzido em 2006, três hospitais brasileiros localizados no Rio

de Janeiro (um universitário, um particular e um público), encontrou 21 casos de

bacteremias por CBc, dos quais 71% foram confirmados microbiologicamente. O

restante foi interpretado como sepse clínica. A investigação da existência de uma

possível origem comum das bacteremias revelou tratar-se de frascos de bromoprida

contaminados pelo patógeno em questão, contaminação esta comprovada por

cultura laboratorial do contaminante. Após a notificação, a ANVISA retirou o produto

do mercado e o número de casos de bacteremias por CBc reduziu drasticamente

(Martins et al, 2010).

23

A investigação de 33 casos de ICS por CBc em um hospital universitário na

Espanha, nos anos de 1993 a 2009, mostrou a ocorrência de dois diferentes surtos:

um de 9 casos, em 1994 e outro de 12 casos, em 2006. Foram investigados também

casos esporádicos de ICS por CBc. Todos os pacientes envolvidos nos surtos

fizeram uso de antibiótico no mês prévio à ocorrência de bacteremia ou durante

mesma, enquanto 67% dos casos esporádicos fizeram uso de antimicrobianos no

mês anterior ao registro de bacteremia. Outros dados mostraram que 67% dos

pacientes dos surtos e 92% dos casos esporádicos apresentavam comorbidades

como diabetes mellitus, neoplasias, transplantes e cirrose hepática, indicando a

importância desses patógenos quando acometem pacientes com doenças de base.

Nesse estudo, as maiores fontes de bacteremia, dentro dos surtos ou nos casos

esporádicos, foram cateteres, secreções respiratórias e infecção aguda de ferida.

Todavia, só houve mortalidades durante os surtos – 14% (Ibarguren et al, 2011).

As constantes mudanças taxonômicas no CBc e a descrição de novas

espécies ,tão intimamente relacionadas, podem dificultar a construção de um perfil

epidemiológico adequado sobre a ocorrência de infecções por esse grupo de

bactérias. Há apenas cinco anos, foram descritas sete novas espécies do CBc, as

últimas apenas em 2009, nomeadamente Burkholderia lata e Burkholderia

contaminans, antes pertencentes a um grupo denominado Taxon K (Vanlaere et al,

2009).

De toda forma, bactérias desse grupo tem sido isoladas de espécimes

clínicos, como escarro de pacientes com FC e amostras ambientais, como água,

solo, raízes, de animais e produtos de uso doméstico ou de cuidados pessoais

(Miñán et al, 2009, Martina et al, 2013). Recentemente, foi reportado um surto de

ICS por B. contaminans originado por toalhas contaminadas, que resultou, em 4

pacientes, na evolução para sepse (Martin et al, 2011). Na literatura aparece,

também, a descrição de um caso de sepse biliar por B. contaminans após a

realização de colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (Ohji et al, 2013).

Na prática laboratorial, e até mesmo em muitas publicações cientificas, as

espécies do CBc são tratadas de maneira unificada,como um grupo, apesar de

estudos taxonômicos moleculares revelarem características epidemiológicas e

potencial patogênico distintos entre as espécies (Coenye et al, 2001).

24

Identificação de BGNNF

A caracterização laboratorial de ICS é feita a partir da realização da cultura de

amostras de sangue (hemocultura). Para obtenção e teste destas amostras, são

utilizadas técnicas e metodologias especiais, que possibilitam uma detecção precisa,

tomando todas as precauções para minimizar o número de hemocultivos

contaminados (Silva et al, 2006).

Recomenda-se coletar, por punção venosa, duas ou três amostras por

episódio bacterêmico, de forma a se facilitar o isolamento de um possível agente

etiológico do quadro infeccioso ou detecção de um contaminante em até 95% dos

casos. As amostras podem ser processadas por metodologias manuais ou

automatizadas, sendo estas últimas, atualmente, plenamente difundidas pelos

hospitais brasileiros, embora com maior custo por apresentarem melhores resultados

em menor tempo e com menor risco de contaminação (ANVISA, 2004).

O sangue é um material nobre em que qualquer crescimento microbiano deve

ser valorizado. Há então a possibilidade de um contaminante externo à corrente

sanguínea do paciente gerar uma falsa positividade para ICS. Esse fenômeno é

denominado pseudobacteremia. Suspeita-se de pseudobacteremia quando um

conjunto de hemoculturas positivas ocorre com um micro-organismo incomum ou

quando as características microbiológicas não são consistentes com os sinais

clínicos. Possíveis causas incluem má assepsia na coleta de sangue do paciente;

contaminação nos fracos de hemocultura, insumos e meios de cultura

microbiológicos; erros na execução das técnicas de preparo e processamento das

amostras no laboratório clínico. Dados confiáveis sobre esses episódios são muito

difíceis de serem encontrados, mas especula-se que contaminantes possam ser

responsáveis por até 50% das hemoculturas positivas e 11% de surtos falsos. Os

BGNNF são um grupo particularmente frequente em pseudobacteremias, por se

tratar de organismos amplamente distribuídos no ambiente (Jumaa &

Chattopadhyay, 1994; Noskin et al, 2001; Eom, Cheong & Kim, 2009).

A rotina de hemocultura na maioria dos laboratórios clínicos atualmente

emprega equipamentos automatizados, como os sistemas Bactec (Beckton

Dickinson), BacT/Alert e Vital (bioMerieux), baseadas em métodos colorimétricos,

25

fluorescentes ou de pressão (ANVISA, 2004). A identificação de agentes etiológicos

de bacteremias é mais comumente realizada por métodos fenotípicos,

automatizados ou não. Alguns dos exemplos mais conhecidos para BGNNF incluem

metodologias manuais, como a semeadura em uma série de meios escolhidos de

acordo com a estrutura ou necessidade do laboratório, ou em kits comerciais

contendo uma miniaturização de um conjunto de provas específicas, como o API 20

NE (bioMerieux), BBL Crystal (Bekcton Dickinson), EPM-MILI-CITRATO (NewProv) e

Kit NF (Probac). Dentre os sistemas automatizados e disponíveis comercialmente no

Brasil, temos os sistemas Vitek-2 (bioMerieux), Phoenix (Beckton Dickinson) e

MicroScan (Siemens) que testam uma série de substratos pré estabelecidos em

escala reduzida e em menor tempo (O’Hara, Weinstein & Miller, 2003; Jacquier et al,

2011).

As características microbiológicas e epidemiológicas de P. aeruginosa e de A.

baumannii estão vastamente descritas, tornando sua identificação facilitada.

Todavia, pouca informação ainda está disponível sobre os outros BGNNF, por vezes

considerado clinicamente pouco significante. Dessa forma, sua implicação em

infecções hospitalares pode ser subestimada pelos frequentes erros na identificação

por métodos fenotípicos empregados em laboratórios clínicos. De fato, devido à

similaridade fenotípica, muitas mudanças taxonômicas, sua baixa reatividade

bioquímica e limitados bancos de dados em kits comerciais e sistemas

automatizados, a identificação de BGNNF incomuns é complexa, pouco confiável e

por vezes equivocada. Por representar um desafio na microbiologia clinica, com

frequência diferentes micro-organismos com características epidemiológicas e de

resistência a antimicrobianos são referidos apenas como BGNNF, por falta de

melhor diferenciação (Bosshard et al 2006; Zbinden et al, 2007; Ryan & Adley, 2010;

Fihman et al, 2012).

Para sobrepor as limitações supracitadas, foram desenvolvidas metodologias

baseadas no genótipo microbiano, como o sequenciamento dos genes 16S rRNA,

considerado atualmente como padrão ouro na identificação da maioria dos micro-

organismos, e recA, considerado referência na identificação de espécies do CBc.

Esses métodos podem atingir índices de precisão de até 89-92%, comparados a 53-

87% e 54-75% dos sistemas de identificação fenotípica Vitek-2 e API 20NE,

respectivamente. No entanto, técnicas moleculares ainda são pouco acessíveis, e

por serem onerosas, não são utilizadas na rotina da maioria dos laboratórios

26

clínicos. Cabe, no entanto, ressaltar que alguns já utilizam métodos moleculares, em

geral para sequencimento de trechos do gene do 16S rRNA. (Bosshard et al 2006;

Zbinden et al, 2007; Jacquier et al, 2011)

Outras técnicas moleculares representam avanços na identificação de

BGNNF. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método rápido, sensível e

eficaz quando direcionada para sítios genômicos intrínsecos a determinadas

espécies bacterianas, como blaOXA-114-like de Achromobacter xylosoxidans, blaOXA-

258-like de Achromobacter ruhlandii e blaOXA-51-like de A. baumannii. Porém, ainda

não é uma metodologia amplamente difundida nos laboratórios clínicos por seu

custo elevado frente ao das técnicas tradicionais (Turton et al, 2006; Turton et al,

2011; Papalia et al 2013).

A análise de restrição do DNA ribossomal amplificado (amplified ribosomal

DNA restriction analysis - ARDRA) é mais uma alternativa ao sequenciamento.

Nesta, se amplifica o gene 16S rRNA e posteriormente realiza-se a digestão com

enzimas de restrição. Tem sido utilizada na identificação de Inquilinus spp.,

Pandoraea spp., Acinetobacter spp., S. maltophilia e outros BGN-NF (Vaneechoutte

et al., 1995; Segonds et al., 1999; Ribbeck-Busch et al., 2005).

Apesar da vasta aplicação de métodos moleculares nos últimos tempos, a

identificação fenotípica dependente de culturas permaneceu na rotina laboratorial

até mesmo nos laboratórios mais modernos. Por sua simplicidade, é improvável que

métodos baseados no fenótipo do organismo desapareçam da prática clínica num

futuro próximo. Recentemente, um novo método baseado em proteômica tem se

mostrado promissor nesse cenário: a espectrometria de massa pelo tempo de voo e

dessorção/ionização a laser assistida por matriz – MALDI-TOF MS. (Patel, 2013)

O conceito do uso de espectrometria de massa para identificar bactérias foi

proposto nos anos 1970. Com a invenção do MALDI-TOF-MS apenas nos anos

1980, feito premiado com o prêmio Nobel, a identificação proteômica de organismos

passou a ser possível. Apenas nos anos 1990 foi possível o desenvolvimento das

bases de dados de espectros proteicos de referência, e apenas nos últimos anos a

tecnologia ficou disponível para comercialização (Melmann et al, 2008; Seng et al,

2009; Patel, 2013).

O MALDI-TOF MS, método automatizado e capaz de processar grandes

volumes de amostras, consegue identificar bactérias e fungos, a partir de apenas 1

colônia, com precisão estimada superior a 90%. Oferece um grande potencial para a

27

identificação rotineira de bactérias de forma mais rápida (6-8,5 min. / amostra) e

precisa, com menores custos comparado as metodologias fenotípicas hoje

empregadas – cerca de 20% do custo em relação ao sistema Vitek-2 e 23% quando

comparado ao sistema API, por exemplo (Degand et al, 2008; Seng et al, 2009;

Bizzini et al, 2010; Jacquier et al, 2011; Marko et al, 2012).

Os protocolos mais simples envolvendo essa metodologia consistem na

aplicação de um esfregaço a partir de uma colônia microbiana em um dos espaços

de uma placa-alvo de MALDI-TOF MS, seguido ou não de uma etapa de extração de

proteínas com ácido fórmico. Os esfregaços são, então, cobertos por uma matriz,

que tem como função auxiliar na dessorção e ionização das proteínas, quando

energizadas por um laser de gás nitrogênio. As proteínas ionizadas são então

medidas quanto a sua massa pelo tempo que levam para atravessar um tubo

vacuolizado – as menores o fazem antes das maiores – atingindo um detector de

íons, que registra o perfil de proteínas de cada amostra, gerando um espectro

proteico. Cada espectro proteico é confrontado, pelo software do aparelho, com

diversos espectros de referência das mais variadas espécies e cepas microbianas,

que estão cadastrados em sua base de dados. Feita essa análise, o sistema aponta

as identificações mais prováveis, baseadas na similaridade desses perfis proteicos,

juntos de suas porcentagens ou índices de confiabilidade (Patel, 2013).

O estudo do perfil de proteínas celulares gerado por MALDI-TOF MS tem

mostrado resultados sólidos para identificação espécie-específica de amostras

clínicas, incluindo os BGNNF incomuns. Uma pesquisa sobre a eficácia de MALDI-

TOF-MS na identificação de 187 BGNNF incomuns apresentou resultados de 100%

de precisão em nível de espécie para Acrhomobacter xylosoxidans (n=24),

Pseudomonas stutzeri (n=4) e S. maltophilia (n=72), a despeito de 0% para

Psychrobacter phenypiruvicus (n=1), Roseomonas mucosa (n=1) e Shewanella

algae (n=1). Para a identificação de amostras do CBc, a precisão foi de 78%,

utilizando uma sub-base de dados específica de espectros proteicos de referência

para aprimorar a eficácia (distribuição BGNNF). Em outro estudo similar, sobre a

sensibilidade do método para identificação de diferentes espécies do CBc –

Burkholderia cepacia (n=12), Burkholderia cenocepacia (n=29), Burkholderia stabilis

(n=12) e Burkholderia vietnamiensis (n=5) – houve identificação correta em nível de

espécie em todos as amostras analisados (Lambiase et al, 2012).

28

A implementação de algumas modificações nas fases pré e pós analíticas é

capaz de aprimorar o desempenho global desta metodologia. Esfregaços mais

densos e cobertos por ácido fórmico mostraram resultados equivalentes ou

superiores a outras condições de aplicação das amostras. Além disso, a otimização

dos pontos de corte nos índices de confiabilidade dos resultados aumentou a

precisão da identificação em 7% para enterobactérias e em 4% para BGNNF,

quando comparados aos pontos de corte sugeridos pelo fabricante do sistema (Ford

& Burnham, 2012).

O principal fator limitante à identificação microbiana por MALDI-TOF-

MS é a possível ausência do espectro proteico da bactéria correspondente em sua

base de dados. Contudo, é possível aprimorar a sensibilidade do método com o

cadastramento de novos perfis proteicos pelos operadores do sistema, elevando sua

eficácia. Melmann e colaboradores, ao utilizarem uma base de dados com 248

espectros proteicos de cepas de referência, abrangendo 37 gêneros, avaliaram com

sucesso 80 amostras clínicas relevantes. Os autores demonstraram a ótima

reprodutibilidade do método, mesmo com o uso de diferentes meios de cultura e

equipamentos (Melmann et al, 2008; Melmann et al, 2009).

Outras limitações do MALDI-TOF MS passam pelo alto custo do instrumento,

a incapacidade de prover informações sobre a suscetibilidade a antimicrobianos, a

necessidade de disponibilidade de colônias microbianas isoladas para o teste, a

ocasional necessidade de repetição de testes, variação das bases de dados e não

diferenciação de organismos intimamente relacionados. Além disso, os órgãos

regulatórios de vigilância sanitária, como a Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(ANVISA) e o United States Food and Drug Administration (FDA) ainda não

validaram seu uso em laboratórios clinicos (Patel, 2013).

Apesar dessas limitações, o MALDI-TOF MS tem o potencial para substituir

técnicas de identificação microbiana convencionais para a maioria dos

microrganismos isolados em laboratório de microbiologia clínica, por ser uma técnica

de simples execução, rápida e confiável. O custo das análises diminuirá com o

avanço da tecnologia e aumento no consumo de reagentes. Há também a

possibilidade futura de identificação em nível de cepa ou sorotipo e determinação de

perfis de resistência antimicrobiana em minutos. Todas essas características, aliadas

a aprimoramentos adicionais na preparação da amostra e disponibilidade de bases

de dados específicas para a identificação de microrganimos de relevância clínica

29

contextualizadas epidemiologicamente, deverão tornar esta metodologia uma

referência em laboratórios clínicos nos próximos anos (Seng et al, 2009; Bizzini et al,

2010).

A grande dificuldade da identificação de BGNNF incomuns é de importância

notória na Microbiologia Clínica, quaisquer sejam as metodologias empregadas.

Visto que pouco ainda se conhece sobre esse assunto, esse estudo objetivou

contribuir para o conhecimento existente sobre a identificação desses micro-

organismos sob as metodologias de sequenciamento de 16S rRNA e recA,

identificação fenotípica manual e MALDI-TOF-MS.

30

1 OBJETIVOS

1.1 Objetivo geral

Avaliar diferentes metodologias para a identificação de BGNNF incomuns em

hemoculturas de pacientes atendidos no Hospital Universitário Pedro Ernesto, da

Universidade do Estado do Rio de Janeiro.

1.2 Objetivos específicos

Identificar as espécies de BGNNF por sequenciamento dos genes rRNA 16S

e recA;

Identificar as espécies de BGNNF por método fenotípico convencional;

Identificar as espécies de BGNNF pelo método MALDI-TOF-MS;

Comparar o desempenho das três metodologias usadas para a identificação;

Analisar as relações de clonalidade das amostras de BGNNF com maior

ocorrência dentre a amostragem.

31

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Seleção da amostragem

Foram selecionados 78 amostras de BGNNF da coleção de culturas do

Laboratório 2 da Disciplina de Microbiologia e Imunologia – UERJ, provenientes de

hemoculturas de pacientes atendidos no Hospital Universitário Pedro Ernesto –

UERJ (HUPE) entre janeiro de 2008 a dezembro de 2011, previamente identificadas

pelo Laboratório de Bacteriologia do HUPE (LABAC) apenas em nível de grupo

como BGNNF. A partir dos registros do LABAC, foram coletados dados

referentes às amostras selecionadas, tais como data do exame, nome e matrícula do

paciente e setor onde esteve hospitalizado.

As amostras bacterianas foram estocadas em solução de leite desnatado a

10% (Skim Milk; Difco Laboratories, Detroit, Michigan, EUA) contendo glicerol a 20%

e mantidas a -70oC até a realização dos testes.

2.2 Identificação fenotípica

Uma alíquota das amostras em estoque foi reativada em caldo Luria-Bertani

(DIFCO, Hants, Inglaterra) sob agitação para facilitar a aeração, por 18 a 20 horas, a

352ºC. Seguiu-se o cultivo em agar Columbia (OXOID, Hampshire, UK), acrescido

de 5% de sangue de carneiro e em agar cisteína lactose eletrólito deficiente – CLED

(DIFCO) por 18-24 horas a 352ºC. Quando necessário, para avaliação quanto à

pureza e características das colônias bacterianas, as placas foram reincubadas por

mais 18-24 horas.

Após essa etapa, as amostras foram enriquecidas em agar Columbia

acrescido de 5% de sangue de carneiro e incubadas por mais 18-24 horas para

serem submetidas a um amplo conjunto de provas fenotípicas (Schreckenberger,

2007). Os testes se deram, em maioria, com incubação a 352ºC em aerobiose. As

exceções estão descritas de forma diferenciada nos testes relacionados abaixo.

32

Após 24h de incubação nessas condições, as seguintes provas foram

avaliadas:

Características morfo-tintoriais após coloração pelo método de Gram;

Detecção da produção de oxidase: uma alçada da amostra foi colocada

sobre papel filtro e então expostos ao reagente tetrametil-p-fenileno

diamina (INLAB, São Paulo, Brasil) solubilizado em água. A mudança

de cor da massa bacteriana para púrpura de 10 a 30 segundos após a

exposição ao reagente indicou produção de oxidase. Como controle

positivo foi usada a cepa P. aeruginosa ATCC 27853 e como controle

negativo A. baumannii ATCC 19606.

Produção de pirrolidonil arilamidase – teste PYR (Bombicino et al.,

2007): colônias foram colocadas sobre discos de papel filtro

impregnados com L-pirrolidonil-β-naftilamida previamente embebidos

em água. Após incubação à temperatura ambiente por 2 minutos,

adicionou-se uma gota do reagente p-dimetilamino-cinamaldeído

(PROBAC, São Paulo, Brasil). Resultados positivos apresentaram

mudança da cor do disco para um avermelhado, fruto da combinação

de p-dimetilamino-cinamaldeído com beta-naftilamida liberada pela

hidrólise do substrato contido no disco. Como controles positivo e

negativo, foram usadas as cepas Ralstonia picketti ATCC 27511 e

Burkholderia cepacia ATCC 17759, respectivamente.

Produção de β-galactosidase: colônias das amostras-teste foram

inoculadas em tubos contendo 1mL de água peptonada a 1% (ISOFAR,

Rio de Janeiro, Brasil) suplementado de o-nitrofenil-β-D-

galactopiranosídeo (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA), um análogo da

lactose que a enzima é capaz de quebrar, liberando como produto final

o-nitrofenol, de coloração amarela. Como controles foram usadas as

33

amostras B. cepacia ATCC 17759 (positivo) e P. aeruginosa ATCC

27853 (negativo).

Crescimento nos meios agar MacConkey e Salmonella-Shigella

(DIFCO) após semeadura e 24h de incubação a 352ºC. Foram

utilizadas as cepas P. aeruginosa ATCC 27853 e B. cepacia ATCC

17759 como controles positivo e negativo, respectivamente.

Após 48h de incubação nas mesmas condições também ocorreu a avaliação

das provas de:

Metabolismo Oxidativo/Fermentativo: as colônias-teste foram

incoculadas em profundidade em dois tubos contendo meio semisólido

OF segundo Hugh Leifson (Beckton Dickinson, Maryland, EUA)

acrescido de 1% de glicose (Sigma-Aldrich). A um dos tubos foi

acrescentado óleo mineral, para incubação em anaerobiose. Bactérias

não fermentadoras da glicose foram incapazes de utilizar a glicose no

tubo contendo óleo mineral (de fermentação), acidificando somente o

meio exposto ao ar, assim comprovando seu metabolismo oxidativo.

Resultados somente foram considerados negativos quando não houve

mudança no aspecto do meio após o período de incubação

supracitado. Como controle positivo do teste foi utilizado a cepa P.

aeruginosa ATCC 27853 e como controle negativo, a cepa S.

maltophilia ATCC 13637.

Utilização dos carboidratos lactose, manitol, maltose, sacarose e xilose

(Sigma-Aldrich): as amostras foram inoculadas de forma semelhante

ao teste supracitado em meio semisólido OF segundo Hugh Leifson

suplementado de 1% dos açúcares mencionados (exceto lactose,

usado em concentração de 10%). A utilização dos carboidratos pelos

micro-organismos resulta na acidificação do meio, mudando sua cor de

verde para amarelo. Caso contrário, este teste foi reavaliado a cada 24

34

horas por até 7 dias de incubação, quando foi confirmado o resultado

negativo.

Descarboxilação dos aminoácidos L-lisina, L-arginina e L-ornitina

(Sigma-Aldrich): uma alçada com inóculo denso de cada amostra foi

inoculada em tubos contendo meio de Moeller (Moeller’s

Decarboxylase Medium, DIFCO) suplementado de 1% de cada um dos

aminoácidos, além de um tubo sem aminoácido. A descarboxilação de

um aminoácido resultou na alcalinização do meio-base, com

mudandança de sua cor quando comparado ao tubo sem aminoácidos.

Os controles positivo e negativo para L-arginina foram P. aeruginosa

ATCC 27853 e B. cepacia ATCC 17759, respectivamente. Para L-

lisina, foram empregados os mesmos controles, porém de forma

inversa. Para L-ornitina, foram usados os controles Enterobacter

cloacae ATCC 13047 (positivo) e P. aeruginosa ATCC 27853

(negativo).

Redução de nitrato e produção de gás a partir do nitrato: um inóculo

denso de cada amostra foi semeado em caldo nitrato (Beckton

Dickinson) contendo um tubo de Durham invertido. A visualização de

bolhas dentro do tubo de Durham determina que a amostra foi capaz

de produzir gás a partir do nitrato do meio. Para avaliação de redução

do nitrato, adicionou-se os reagentes A (solução de ácido sulfanílico

em ácido acético) e B (solução de dimetilnaftilamina em ácido acético).

A mudança da cor do segundo reagente de negro para a cor cereja

indicou positividade para o teste. A cepa controle positivo destas

provas foi P. aeruginosa ATCC 27853, e como controle negativo foi

usado B. cepacia ATCC 17759.

Hidrólise de gelatina: um inóculo denso das amostras foi feito em

solução salina 0,9%. Seguiu-se a colocação de uma fita de filme de

radiografia (KODAK, São Paulo, Brasil). A hidrólise da gelatina foi

caracterizada quando da mudança da aparência da fita de verde opaco

35

a translúcido. O controle deste teste foi realizado com a cepa P.

aeruginosa ATCC 27853 (positivo) e B. cepacia ATCC 17759

(negativo).

Produção de catalase: as amostras foram semeadas em caldo infuso

de cérebro e coração – BHI (DIFCO). Após 48 horas de incubação,

como previamente descrito, foram expostas a peróxido de hidrogênio.

Nas culturas de amostras produtoras de catalase, imediatamente

apareceram bolhas de gás no meio. Como cepa controle, foi utilizada a

cepa A. xylosoxidans ATCC 27061, positivo para a prova.

Produção de urease: uma alçada de cada amostra foi semeadas em

caldo ureia de Chistensen (DIFCO) e incubadas como já descrito.

Seguiu-se a pesquisa de mudança de pH decorrente da hidrólise de

ureia, responsável pela muda da cor do indicador vermelho de fenol

para um forte tom de rosa, em caso de positividade. Como controles,

foram utilizadas as cepas Roseomonas mucosa ATCC BAA-692

(positivo) e A. xylosoxidans ATCC 27061 (negativo).

Utilização de citrato: as amostras foram inoculadas, com uma estria

simples, em meio de Simmons (HIMEDIA, Paraná, Brasil) inclinado em

tubo, meio este que contém apenas citrato de sódio como fonte de

carbono. Quando utilizado, os produtos do metabolismo dessa

substância alcalinizam o meio, virando o indicador de pH azul de

bromotimol de verde para azul. Foram utilizadas as cepas Klebsiella

pneumoniae ATCC 13883 e Escherichia coli ATCC 25922 como

controle positivo e negativo, respectivamente.

Avaliação da tolerância a NaCl: um pequeno inóculo de cada amostra

foi semeado em dois diferentes tudos de caldo BHI, um livre de NaCl e

o outro contendo 6% de NaCl. Seguiu-se a incubação por tempo e em

condições previamente descritas. Micro-organismos tolerantes a 6% de

36

NaCl cresceram em ambos os tubos, enquanto aqueles intolerantes

não cresceram no tubo contendo NaCl. Os controles utilizados foram

as cepas Pseudomonas putida ATCC 12633 (positivo) e S. maltophilia

ATCC 13637.

Produção de indol pelo método de Erlich: as amostras foram

inoculadas, com o auxílio de uma agulha, em tubos contendo meio

semisólido sulfeto-indol-mobilidade – SIM (DIFCO) e incubadas

juntamente a uma fita impregnada com o reagente de Erlich (p-

dimetilaminobenzoaldeído). O indol, se produzido, interagiu com o

reagente de Erlich, ocasionando mudança na cor da fita com reagente,

que assumiu coloração rosa ou roxa. Como controle positivo foi

utilizada a cepa E. coli ATCC 25922 e como controle negativo a cepa

P. aeruginosa ATCC 27853.

Utilização de acetamida: teste similar ao da utilização do citrato, porém

executado com acetamida como fonte essencial de carbono em meio

agar acetato (VETEC, Rio de Janeiro, Brasil). Os controles utilizados

para esse teste foram P. aeruginosa ATCC 27853 (positivo) e S.

maltophilia ATCC 13637.

Produção de pigmentos (King, Ward & Raney, 1954): cada amostra foi

semeada, com o auxílio de alça bacteriológica, em dois tubos com os

meios King A e King B (DIFCO, Hants, Inlaterra) inclinados. O primeiro

meio evidenciaria a produção de piocianina e piorrubina, enquanto o

segundo facilitaria a detecção de pioverdina. As cepas P. aeruginosa

ATCC 27853 e B. cepacia ATCC 25416 foram utilizadas como controle

positivo e negativo, respectivamente.

Após até 72h, nas mesmas condições de incubação descritas no início desta

seção, foram observadas:

37

Hemólise em agar Columbia suplementado de 5% de sangue de

carneiro;

Mobilidade pelo meio Motility (Beckton Dickinson) suplementado de

0,01% cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC, Merck, Darmstadt,

Alemanha): com o auxílio de uma agulha, inoculou-se cada amostra

com uma picada até ¾ da profundidade do meio. O crescimento

bacteriano através do meio semi-sólido é destacado pela viragem do

TTC, que adquire tom avermelhado, evidenciando possível padrão de

crescimento e mobilidade do micro-organismo. P. aeruginosa ATCC

27853 e A. baumanii ATCC 19606 foram respectivamente, os

controles positivo e negativo para esta prova.

Hidrólise de esculina (Merck, Darmstadt, Alemanha): cada amostra foi

inoculada com alça microbiológica em tubo contendo ágar esculina

inclinado. Amostras produtoras de esculinase hidrolisaram a esculina

produzindo esculetina e glicose. A produção de esculetina foi

observada quando, ao reagir com o citrato férrico presente no meio,

houve a formação um complexo marrom escuro ou negro. Os

controles utilizados foram S. maltophilia ATCC 13637 (positivo) e

P.aeruginosa ATCC 27853 (negativo).

Produção de DNase: as amostras foram semeadas em spot numa

placa de ágar DNase (Beckton Dickinson, Maryland, EUA) com alça

microbiológica. Após incubação, a superfície do meio foi coberta com

ácido clorídrico 1N que provocou a precipitação do DNA da fórmula,

tornando o meio opaco. Os organismos produtores de DNase

despolimerizaram o DNA molecular da fórmula, produzindo uma zona

transparente em volta da área de crescimento. Foram utilizadas as

cepas S. maltophilia ATCC 13637 e B. cepacia ATCC 25416 como

controles positivo e negativo,respectivamente.

38

Produção de H2S, detectadas em tiras de papel filtro impregnadas de

acetato de chumbo, que enegreceram ao reagirem com o gás

produzido após a incubação em meio SIM. Cada amostra foi inoculada

em profundidade com agulha microbiológica. Foram utlizadas como

controles as cepas Proteus mirabilis ATCC 12453 (positivo) e E. coli

ATCC 25922 (negativo).

2.3 Identificação molecular por técnica de sequenciamento dos genes 16S

rRNA e recA

2.3.1 Extração do DNA bacteriano por lise térmica

As amostras bacterianas foram semeados em agar Columbia (OXOID),

acrescido de 5% de sangue de carneiro e incubadas a 35±2oC por 18-24h. Ao

término deste período, uma colônia isolada foi semeada em 3mL de caldo BHI. Após

incubação a 35±2oC por 18-24h sob agitação, 200μL do crescimento bacteriano

foram adicionados a 2mL de água destilada (1:10) para a leitura da densidade ótica

(D.O.) em espectrofotômetro (B295 II Micronal, SP, Brasil) (λ= 580nm). A partir desta

leitura foi determinado o volume da cultura necessário para se obter a D.O. 580nm de

0,5.

As amostras foram distribuídas em tubos tipo eppendorf nos volumes

especificados pela D.O. e, a seguir, centrifugadas por 2 min. a 14.000 rpm (Hermle,

Z 233M-2). Após a centrifugação, o sobrenadante foi desprezado completamente e o

sedimento foi ressuspenso em 600μL de água deionizada estéril. O DNA foi obtido

após aquecimento destas suspensões à 100ºC por 10 min e subseqüente

centrifugação por 10s a 14.000 rpm. Uma vez extraído, o DNA permaneceu em

banho de gelo durante a preparação da mistura de reação.

39

2.3.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

O PCR foi realizado para a amplificação dos marcadores genéticos 16S

rRNA, para todos os BGNNF, ou do gene recA, para micro-organismos pertencentes

ao gênero Burkholderia. Os iniciadores utilizados para a amplificação foram: BCR1,

5’-TGA CCG CCG AGA AGA GCA A-3’ e BCR2, 5’-CTC TTC TTC GTC CAT CGC

CTC-3’, para amplificação recA (Mahenthiralingam et al, 2000). Para a amplificação

do gene 16S rRNA foram utilizados os iniciadores 27, 5’-AGA GTT TGA TCA TGG

CTC AG-3’ e 1492, 5’-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’ (Hirashi, 1992). Os

amplicons das duas reações apresentam aproximadamente 1.043 bp e 1.500 bp, em

ordem.

Nesta etapa, 2μL do DNA bacteriano de cada amostra foram adicionados a

tubos tipo eppendorf contendo 48μL da mistura de reação, composta de: 20 pmol de

cada iniciador que compõe o par corresponde aos genes 16S rDNA e recA, 250 M

de cada dNTP (Invitrogen, Brasil) , 1 U de Taq polimerase Platinum (Invitrogen,

Brasil), tampão PCR 1X (200 mM de Tris-HCl, pH 8,0 e 500mM de KCl), 1,5 M de

MgCl2.

As condições da reação para amplificação de 16S rRNA foram adaptadas a

partir da descrição de Hirashi, 1992: desnaturação inicial a 95˚C por 5 min, seguida

de 35 ciclos a 95˚C por 1 min e 30 seg, 1 min e 30 seg à temperatura de anelamento

específica (52˚C), 2 min a 72˚C e extensão final a 72˚C por 15 min. Para a

amplificação de recA, após a mesma desnaturação inicial, a reação seguiu com 35

ciclos de 95˚C por 45 seg., anelamento em 58˚C por 45 seg., 72˚C por 1,5 min. e

extensão final por 10 min. a 72˚C em termociclador (GeneAmp PCR System 9700 –

Applied Biosystems, Foster City, EUA).

2.3.3 Eletroforese em gel de agarose

Os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese a 100V, durante

aproximadamente 30 min em gel de agarose (Invitrogen, Brasil) a 1,2%, com

solução 1X de tampão TBE (Tris-Base, Ácido bórico, EDTA 0,5M, pH 8,0) e 0,01%

de SYBR Safe. Em seguida, foram visualizados em transiluminador de luz ultra-

40

violeta (Cole Parmer 96W Instrument Co. Vernen Hills, Illinois, EUA) e fotografado

(Kodak Digital Sciense, Electrophoresis Documentation and Analysis System 120).

2.3.4 Purificação do DNA

Os produtos de amplificação foram submetidos à purificação através do kit de

purificação Ilustra GFX PCR e Gel Band Purification Kit (GE Healthcare Life

Sciences). As suspensões contendo os produtos de amplificação foram misturadas a

500 μL do tampão de captura em um sistema composto pelos tubos coletores e

colunas GFX, onde o DNA fica retido, e em seguida centrifugadas a 14.000 rpm por

30 seg. Seguiu-se o descarte do tampão, a adição de 500 μL do tampão de

lavagem, e nova centrifugação a 14.000 rpm por 30 seg. Os tubos coletores foram

descartados e a coluna GFX foi transferida para tubos tipo eppendorfs, sendo

adicionados 40 μL do tampão de eluição, que retira o DNA retido na coluna GFX.

Após incubação por 1 min e novamente centrifugado a 14.000 rpm por 1 min, o DNA

purificado foi submetido à eletroforese, a 100V, por cerca de 30 min em gel de

agarose (Invitrogen, Brasil) a 1,2%, com solução 1X de tampão TBE. A visualização

do DNA foi feita em transiluminador de luz ultra-violeta, para confirmação da pureza,

manutenção e qualidade do DNA purificado. Este foi, então, conservado congelado

(-20°C) até a realização da reação de sequenciamento.

2.3.5 Reação de Sequenciamento

O sequenciamento dos gene codificador do rRNA 16S foi realizado pelo

método de terminação com dideoxinucleotídeos (Sanger, Nicklen & Coulson, 1977)

utilizando-se os iniciadores 27, 5’-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3’; 532, 5’-CGT

GCC AGC AGC CGC GGT AA-3’; 907, 5’-CCG TCA ATT CTT TGA GTT T-3’ e 1492,

5’-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’ e o kit BigDye Terminator v3.1 Cycle

Sequencing kit (Applied Biosystems). A reação continha 3µL de DNA (180ng/µL),

4µL de água ultrapura, 2µL do mix de terminação (Applied Biosystems, Foster City,

EUA) e 2,5pmoles/µL do iniciador em cada poço de microplaca de PCR (96 poços,

41

saia elevada, Axygen). Após uma centrifugação rápida, a placa foi submetida à

reação de sequenciamento. Os sequenciamentos foram realizados em triplicata. A

reação consistiu de 1 minuto de desnaturação inicial a 96ºC, seguidos de 35 ciclos

de 15 segundos a 96ºC, 15 segundos a 50ºC e 2 minutos a 60ºC. (Veriti 96 Well

Thermal Cycler – Applied Biosystems). Não foi aplicada extensão final. Seguindo as

orientações do fabricante, a rampa de temperatura foi ajustada, no intuito de impedir

mudança brusca de temperatura (>1°C/seg), evitando, assim, a geração de ruídos

na leitura dos nucleotídeos.

O mesmo protocolo foi usado no sequenciamento do gene recA, com a

ressalva dos diferentes iniciadores usados: BCR1 e BCR2, previamente descritos,

BCR3 (5´-GTCGCAGGCGCTGCGCAA-3´) e BCR4 (5´-

GCGCAGCGCCTGCGACAT-3´).

2.3.6 Purificação, precipitação do DNA e análise

Em seguida, o DNA marcado (volume de 10 µL) foi purificado, utilizando o

seguinte protocolo: 40 µL de isopropanol 75% foram adicionados, seguido de

homogeneização, incubação em temperatura ambiente por 20 minutos e

centrifugação a 13000 rpm por 20 minutos. O isopropanol foi removido e adicionados

200 µL de etanol 70%. Seguiu-se de centrifugação a 13000 rpm por 5 minutos. Após

remoção do etanol, as amostras secaram em temperatura ambiente e a elas foram

adicionados 10 µL de formamida para posterior leitura no sequenciador Genetic

Analyzer 3500 (Applied Biosystems), onde os eletroferogramas foram obtidos na

medida em que as amostras passavam por capilares contendo o Polímero de

Performance Otimizada (POP7 – Applied Biosystems).

A análise das sequências do gene 16S rRNA foi realizada a partir de

comparações com dados do GenBank, por intermédio da ferramenta BLAST,

constante na base de dados do NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),

considerando-se a identificação em nível de espécie confiável a partir de percentuais

iguais ou superiores a 97% de similaridade entre as amostras estudadas e as

constantes na base de dados.

42

Após obtenção das sequências do gene recA, estas foram alinhadas com o

auxílio dos softwares MEGA5.05 e CLUSTAL W. Árvores filogenéticas foram

desenhadas com o auxílio do software MEGA5.05, de acordo com os alinhamentos

obtidos e as sequências do gene recA representativas do CBc disponíveis no

GenBank.

2. 4 Espectrometria de massa de proteínas pela metodologia de MALDI-TOF-

MS

A identificação das amostras de BGNNF por espectrometria de massa de

proteínas foi feita no equipamento MALDI Biotyper microflex LT (Bruker Daltonics,

Bremen, Alemanha) de acordo com as especificações do fabricante. As amostras

foram recuperadas a partir do estoque e semeadas em agar Columbia, acrescido de

5% de sangue de carneiro e incubadas a 35±2oC por 18-24h, ou ainda por mais um

período de 18-24h, quando a bactéria apresentava crescimento lento.

Inicialmente procedeu-se à preparação das placas de ensaio (target) com 96

espaços, previamente calibradas com uma cepa padrão de teste bacteriano (BTS –

Bruker Daltonics), uma solução composta de uma cepa controle de Escherichia coli

DH5α suplementada de outras proteínas, cedida pelo fabricante e de conhecido

espectro proteico. Uma alíquota de 1µL de BTS foi colocado em um dos espaços

disponíveis na placa, seco em ar ambiente e coberto de matriz HCCA (solução

saturada de ácido α-ciano-4-hidroxi-cinâmico em solução de acetonitrila a 50% e de

ácido tri-fluor-acético a 2.5%; Bruker Daltonics), seguido de nova secagem em ar

ambiente. A target foi inserida no equipamento e operada através do software de

controle flexControl (versão 3.3 – Bruker Daltonics) para calibração. Uma vez que o

espectro de proteínas do BTS é testado e compatível com o esperado do controle, a

target é validada para teste de amostras.

Com agulhas microbiológicas, colônias das amostras a serem testadas foram

tocadas e transferidas em esfregaços para um dos espaços da target. Após a

secagem dos esfregaços em ar, estes foram cobertos com 1µL de matriz HCCA,

seguido de nova etapa de secagem. Todos as amostras foram testadas em duplicata

(figura 1).

43

Figura 1: Aplicação de matriz HCCA em amostras inoculadas em uma placa do

sistema MALDI-TOF MS

A target contendo as amostras foram então inseridas no equipamento de

análise e comandados pelo software de controle flexAnalysis (versão 3.3 – Bruker

Daltonics, Bremen, Alemanha) para identificação das amostras. O sistema então

procedeu com a geração de espectros da relação massa/carga das proteínas

através da medição do tempo de voo das mesmas quando ionizadas após 240 tiros

de laser e os confronta com seu banco de dados (Maldi Biotyper OC 3.1 – Bruker

Daltonics, Bremen, Alemanha), apontando os 2 micro-organismos mais prováveis e

seus respectivos índices de precisão (scores).

Os resultados gerados foram classificados de acordo com as seguintes

recomendações do fabricante:

a) score acima de 2300: alta probabilidade de identificação em espécie;

b) score de 2000 a 2299: identificação segura em nível de gênero e provável

identificação em espécie;

c) score de 1700 a 1999: provável identificação em nível de gênero;

d) score 0000 a 1699: identificação inadequada.

44

A figura 2 ilustra o processamento de amostras no sistema MALDI-TOF-MS

Figura 2: Fluxograma representando o processamento de amostras pelo sistema

MALDI-TOF MS (Fonte: Patel, 2013)

45

2.5 Perfil de Fragmentação do DNA Cromossômico por Eletroforese em Campo

Pulsado (PFGE)

Para a espécie de BGNNF mais prevalente na amostragem testada foi feita a

a análise dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico conforme descrito por

Ribot e colaboradores (2006), disponível no site do CDC/Fort Collins – Colorado –

USA2. No entanto, algumas modificações foram realizadas nas diferentes etapas do

procedimento.

2.5.1 Suspensão de células

As amostras foram inoculadas em tubos contendo agar nutriente (OXOID)

inclinado. O crescimento foi recolhido e transferido para 1 mL de tampão de

suspensão de células (BSC; Tris 100 mM, EDTA 100 mM, pH 8,0), até obtenção de

turvação correspondente ao padrão 3 de McFarland. Uma alíquota de 200 µL foi

transferida para um microtubo contendo 5 µL de solução de proteinase K 50 mg/mL

(Sigma-Aldrich), sendo este invertido de 5 a 6 vezes para homogeneização.

2.5.2 Preparação dos blocos de agarose (plugs)

Os blocos de agarose foram preparados com agarose Seakem Gold a 1%

(Lonza, Atlanta, EUA) em tampão TE (Tris 10 mM, EDTA 1mM, pH 8,0),

suplementados de 5% de solução de dodecil sulfato de sódio (Sigma-Aldrich, St.

Louis, EUA). Em seguida, 200 µL da mistura de agarose foram adicionadas à

suspensão bacteriana e homogeneizadas gentilmente, antes de serem

imediatamente dispensadas dentro dos moldes para blocos de PFGE. Os blocos

2 Endereço eletrônico do PulseNet: < www.cdc.gov/pulsenet>, acessado em 03/01/2013.

46

permaneceram em temperatura ambiente por 10 minutos até solidificarem e foram

removidos dos moldes diretamente para um tubo cônico de polipropileno de 15 mL,

contendo 2 mL de solução de lise TE com 1% de sarcosil (Sigma-Aldrich, St. Louis,

EUA), além de 5 µL de proteinase K (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) 50 mg/mL. As

amostras foram incubadas em banho-maria a 50ºC por 2 horas.

Os tubos foram removidos do banho-maria e a solução de lise foi

descartada. Essa etapa foi seguida de três lavagens com 10 mL de água reagente

tipo I estéril. A cada etapa de lavagem o tubo permaneceu em banho-maria a 50ºC

por 10 minutos. Após as lavagens com água, foi realizada lavagem com tampão TE

estéril. Após a remoção do tampão TE, 2 mL do mesmo tampão foram adicionados

aos tubos para servirem de meio de estoque para os blocos de agarose. Os blocos

foram estocados a 4ºC até o momento de sua utilização.

2.5.3 Digestão do DNA nos plugs de agarose

Cortes de aproximadamente um centímetro foram realizados com o auxílio de

um bisturi e colocados em um microtubo contendo 50 µL do tampão 1X da enzima

SpeI (Fermentas). Após 30 minutos a 4ºC, a solução foi removida e substituída por

solução contendo 20U da enzima SpeI (Fermentas) em cada microtubo. A incubação

foi realizada por 3 horas a 37ºC.

2.5.4 Corrida eletroforética

O gel para a corrida eletroforética foi preparado com agarose Seakem

Gold a 1,1% em tampão TBE (Tris 89 mM, Ácido Bórico 89 mM e EDTA 2,5 mM, pH

8,3) 0,4X. Na primeira e última posições foram adicionadas fatias de agarose

contendo padrão de peso molecular para PFGE (Pulse MarkerTM 50-1.000 kb –

Sigma-Aldrich). Nas demais posições foram adicionadas as amostras. As condições

eletroforéticas utilizando o sistema CHEF DR III (Bio-Rad, Berkeley, EUA) foram as

47

seguintes: pulso inicial de 5 segundos e pulso final de 35 segundos. A

miliamperagem utilizada para as corridas foi de 6.0V/cm. O tempo de corrida foi de

17 horas em tampão TBE 0,4X, mantendo-se temperatura controlada de 14ºC.

2.5.5 Coloração do gel de agarose e análise dos resultados do PFGE

Após corrida, os géis foram corados com brometo de etídeo (1 mg/mL)

e as imagens foram capturadas sob iluminação UV usando o fotodocumentador L-

Pix EX (Loccus Biotecnologia) e o software de captura de imagem L-Pix Image

(Loccus Biotecnologia). Os resultados obtidos foram analisados em forma de

dendrograma gerado através do programa Bionumerics, versão 6.6, desenvolvido

pela Applied-Maths. O grau de homologia entre as amostras tipadas pela técnica de

PFGE foi determinado pelo coeficiente de Dice (Dice, 1945) e a correlação para

agrupamento foi calculada por UPGMA (Unweighted Pair Group Method with

Arithmetic Mean), com otimização de 1,5% e tolerância de 1,5%. Foram

considerados clones idênticos aqueles com percentuais de similaridades iguais ou

superiores a 85%.

2.6 Aspectos éticos

As amostras bacterianas incluídas neste estudo foram obtidas a partir de um

banco de amostras provenientes de espécimes clínicos encaminhados para culturas

de rotina no Laboratório de Bacteriologia do HUPE e para o Laboratório 2 da

Disciplina de Microbiologia da UERJ. Assim, os exames bacteriológicos foram

executados independentes deste estudo. Em nenhum momento foi solicitado dos

pacientes algum exame extra. Os dados foram divulgados através de códigos que

não identificaram os indivíduos. Deste modo, não foram necessários o Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido e o registro do Comitê de Ética da Instituição.

48

3 RESULTADOS

3.1 Identificação molecular de BGNNF por sequenciamento dos genes 16S

rRNA e recA

Após as reações de biologia molecular e alinhamentos das sequencias de

nucleotídeos dos marcadores genéticos para o gene rRNA 16S com sequencias

depositadas no GenBank pelo BLAST, foi possível determinar os gêneros/espécie

de BGNNF na amostragem estudada. Do total de 78 amostras, a maioria

(n=31;40%) foi incluída no gênero Burkholderia, seguido de Pseudmonas stutzeri

(10%), Delftia acidovorans (4%) e Stenotrophomonas maltophilia (4%). As demais

amostras foram distribuídas em 27 diferentes espécies correspondendo a uma, duas

ou três amostras por espécie (tabela 3).

Tabela 3: Espécies de 78 amostras de BGNNF identificadas por sequenciamento do

gene codificador do rRNA 16S.

Microrganismos n %

Burkholderia spp 31 40

Pseudomonas stutzeri 8 10

Delftia acidovorans 3 4

Stenotrophomonas maltophilia 3 4

Achromobacter xylosoxidans 2 3

Acinetobacter baumannii 2 3

Acinetobacter ursingii 2 3

Alcaligenes faecalis 2 3

Bordetella holmesii 2 3

Chryseobacterium indologenes 2 3

Elizabethkingia meningoseptica 2 3

Pseudomonas oryzihabitans 2 3

Pseudomonas putida 2 3

Wautersiella falsenii 2 3

Acinetobacter calcoaceticus 1 1

Acinetobacter lwoffii 1 1

Brevundimonas diminuta 1 1

Brevundimonas vesicularis 1 1

Chryseobacterium haifense 1 1

Moraxella catarrhalis 1 1

Moraxella osloensis 1 1

Paenibacillus amylolyticus 1 1

Pannonibacter phragmitetus 1 1

Pseudomonas aeruginosa 1 1

Pseudomonas mendocina 1 1

Pseudomonas mosselii 1 1

Rhizobium radiobacter 1 1

49

As 31 amostras pertencentes ao gênero Burkholderia tiveram o operon recA

amplificado e sequenciado, e seus nucleotídeos comparados às sequencias de

cepas representativas das 17 espécies do CBc (Figura 3). Assim, foi possível

identificar as espécies: a maioria foi identificada como Burkholderia contaminans

(n=19;24%) seguido de Burkholderia cenocepacia (n=9,12%). Na figura 4 está

representada a distribuição de todas as espécies identificadas.

50

Figura 3: Alinhamento de sequências das amostras de CBc com sequências de

amostras padrão das 17 espécies do complexo.

AM922301_Burkholderia_contaminans_XVI

8308

7324

7319

9503

8303


9987

10385

9504

8234

8185

10317

8233

9742

8199

AF143781_Burkholderia_cenocepacia_IIIA

10016

8200

8198


8169

8168





7174

7168

7454

7394

AM905033_Burkholderia_lata_XVII

AM905032_Burkholderia_lata_XVII

AM748095_Burkholderia_arboris_XIII



AM748094_Burkholderia_metallica_XV

AF456007_Bambifaria_VII



AM748103_Burkholderia_diffusa_XII

AM748099_Burkholderia_latens_XI

AY619683_Burkholderia_ubonensis__X

AM922300_Burkholderia_latens_XI

AM748096_Burkholderia_seminalis_XIV




AJ544692_Banthina_VIII

AF456060_Banthina_VIII

7204

7177

AF143787_Burkholderia_cepacia



AF143783_Burkholderia_cenocepacia_IIIB

AF143785__Burkholderia_cenocepacia_IIIB

10312

10137

AF143784__Burkholderia_cenocepacia_IIIB

AF143789_Burkholderia_stabilis

AF143790_Burkholderia_stabilis

AF143794_Bpyrrocinia_XIX

AY392090_Bpyrrocinia_XIX

AF456032_Bpyrrocinia_XIX

AF456033_Bdolosa_VI

AF323971_Bdolosa_VI

AY324808_Bdolosa_VI

AY780511_Burkholderia_ubonensis_X

AF143776_Burkholderia_multivorans





AF143791_Burkholderia_vietnamiensis

8532



10318

99

99

99

96

94

88

88

80

79

97

69

99

68

66

66

64

99

64

62

61

93

89

59

45

45

46

50

99

44

99

46

37

37

69

99

36

98

30

28

44

46

26

41

28

25

17

16

14

31

48

48

31

10

9

20

9

8

8

7

6

6

6

4

3

2

4

13

99

9

2

59

30

90

0

0

1

51

Figura 4: Distribuição das espécies do CBc em amostras de BGNNF identificadas

por sequenciamento do gene recA.

3.2 Identificação fenotípica de BGNNF

O perfil fenotípico obtido pela submissão dos 78 micro-organismos a um

amplo painel de provas fenotípicas foi avaliado comparativamente frente à

identificação obtida no sequenciamento do gene 16S rRNA (tabela 4). As 31

amostras das diferentes espécies do CBc foram caracterizadas fenotipicamente

como pertencentes ao gênero Burkholderia. Para a análise comparativa da

identificação obtida nas duas metodologias, excluímos essas amostras, devido à

impossibilidade de identificação ao nível de espécie por método fenotípico.

A concordância da identificação fenotípica das 47 amostras de BGNNF em

nível de espécie em relação ao sequenciamento foi de 64% (n=30). Apenas em

relação ao gênero a concordância foi de 17% (n=8). Foi observada completa

discordância de resultados em 19% (n=9) das amostras.

Todas as amostras de A. baumannii (n=2), Achromobacter xylosoxidans

(n=2), Brevundimonas vesicularis (n=1), Delftia acidovorans (n=3), Elizabethkingia

meningoseptica (n=2), Moraxella catarrhalis (n=1), Moraxella osloensis(n=1),

Pseudomonas oryzihabitans(n=2), Pseudomonas aeruginosa (n=1), Rhizobium

radiobacter (n=1) e S. maltophilia(n=3) foram identificadas corretamente pela

52

metodologia fenotípica manual. Resultados de concordância variáveis foram

observados para amostras de uma mesma espécie em algumas ocasiões. Por

exemplo, das oito amostras de Pseudomonas stutzeri, seis foram identificadas

corretamente ao nível de espécie, uma foi identificada em gênero e outra identificada

incorretamente como Achromobacter xylosoxidans pela metodologia manual. As

amostras de Acinetobacter lwoffii (n=1), Acinetobacter ursingii (n=2), Brevundimonas

diminuta (n=1), Pseudomonas mosselii (n=1) e Pseudomonas mendocina (n=1)

foram corretamente caracterizadas até gênero.

53

Tabela 4: Análise comparativa da identificação pelo método fenotípico em relação ao

sequenciamento de 16S rRNA.

Micro-organismo identificado por sequenciamento (n)

Identificação Fenotípica (n) Concordância

em espécie

Concordância apenas em

gênero Discordância

Pseudomonas stuzeri (8)

Pseudomonas stutzeri (6)

75% 12,5% 12,5% Pseudomonas aeruginosa (1)

Achromobacter xylosoxidans (1)

Delftia acidovorans (3) Delftia acidovorans (3)

100% 0% 0%

Stenotrophomonas maltophilia (3) Stenotrophomonas maltophilia (3)

100% 0% 0%

Acinetobacter baumannii (2) Acinetobacter baumannii (2)

100% 0% 0%

Achromobacter xylosoxidans (2) Achromobacter xylosoxidans (2)

100% 0% 0%

Acinetobacter ursingii (2) Acinetobacter spp. (2) 0% 100% 0%

Alcaligenes faecalis (2) Alcaligenes faecalis (1)

50% 0% 50% Pseudomonas spp. (1)

Chryseobacterium indologenes (2)

Chryseobacterium indologenes (1) 50% 0% 50% Myroides odoratus (1)

Elizabethkingia meningoseptica (2) Elizabethkingia meningoseptica (2)

100% 0% 0%

Pseudomonas oryzihabitans (2) Pseudomonas oryzihabitans (2) 100% 0% 0%

Pseudomonas putida (2) Pseudomonas putida (1)

50% 0% 50% Alcaligenes faecalis (1)

Wautersiella falsenii (2) Wautersiella falsenii (1)

50% 0% 50% Moraxella spp. (1)

Acinetobacter calcoaceticus (1) Sphingomonas spp. (1) 0% 0% 100%

Acinetobacter lwoffii (1) Acinetobacter spp. (1) 0% 100% 0%

Bordetella holmesii (2) Bordetella holmesii (1)

50% 50% 0%

Bordetella spp. (1) 0%

Brevundimonas diminuta (1) Brevundimonas vesicularis (1) 0% 100% 0%

Brevundimonas vesicularis (1) Brevundimonas vesicularis (1) 100% 0% 0%

Chryseobacterium haifense (1) Brevundimonas sp. (1) 0% 0% 100%

Moraxella catarrhalis (1) Moraxella catarrhalis (1) 100% 0% 0%

Moraxella osloensis (1) Moraxella osloensis (1) 100% 0% 0%

Paenibacillus amylolyticus (1) Sphingomonas spp. (1) 0% 0% 100%

Pannonibacter phragmitetus (1) Achromobacter xylosoxidans(1) 0% 0% 100%

Pseudomonas aeruginosa (1) Pseudomonas aeruginosa (1) 100% 0% 0%

Pseudomonas mosselii (1) Pseudomonas putida (1) 0% 100% 0%

Pseudomonas mendocina (1) Pseudomonas aeruginosa (1) 0% 100% 0%

Rhizobium radiobacter (1) Rhizobium radiobacter (1) 100% 0% 0%

54

3.3 MALDI-TOF MS

A identificação oriunda dos resultados da análise dos espectros proteicos das

amostras submetidas ao sistema MALDI-TOF MS também foi confrontada com a

técnica de referência (sequenciamento).

A análise geral da concordância (sem levar em consideração os parâmetros

estabelecidos para a aceitação da identificação pelo sistema MALDI-TOF MS)

mostrou que 42% (n=33) das 78 amostras foram identificadas corretamente ao nível

de espécie e 45% (n=35) apenas em gênero. Para o restante das amostras (13%;

n=10) os resultados foram discordantes (tabela 5)

Foi observado que das 78 amostras, 35 (45%) foram identificadas com scores

iguais ou maiores a 2,300, sendo 10 (13%) concordantes em nível de espécie, e 22

(28%) apenas em nível de gênero, comparativamente ao resultado do

sequenciamento. Não houve concordância na identificação em três amostras. Trinta

e seis amostras (45%) foram identificadas com scores de 2000 a 2299, sendo nesse

caso 23 concordantes em nível de espécie (29%), 6 (8%) em nível de gênero e 7

discordantes (9%). Sete amostras (9%) foram identificados com scores de 1,700 a

1,999 e concordantes em nível de gênero com a metodologia molecular de

sequenciamento de 16S rRNA e recA (tabela 5)

Tabela 5: Índices de concordância da identificação de 78 amostras de BGNNF

obtida no MALDI-TOF MS em relação ao sequenciamento 16S rRNA e recA

Score concordância em espécie (n) concordância apenas em

gênero (n) discordância (n) n

≥2300 13% (10) 28% (22) 4% (3) 35

2000-2299 29% (23) 8% (6) 9% (7) 36

1700-1999 0 9% (7) 0 7

TOTAL 42% (33) 45% (35) 13% (10) 78

A mesma analise foi feita excluindo as espécies do CBc. Nesse caso, houve

um aumento importante da concordância em nível de espécie para 60%,

acompanhado de uma redução da concordância apenas em nível de gênero para

55

19% e um aumento da discordância para 21%, ainda que em números absolutos

essa última categoria tenha permanecido inalterada. A maioria das amostras (n= 30

;64%) foi identificada com scores entre 2,000 e 2,299, sendo 47% concordantes em

nível de espécie, 2% concordantes em gênero e 15% discordantes. Das 10 amostras

(21%) identificadas na faixa superior de scores (≥2300), 13% foram concordantes

em nível de espécie, 2% em gênero e 6% discordantes. As sete amostras restantes

(15%) mostraram scores entre 1,700 e 1,999 e foram concordantes em nível de

gênero com a identificação molecular por sequenciamento de 16S rRNA (tabela 6).

Tabela 6: Índices de concordância da identificação de 47 amostras de BGNNF

(exceto CBc) obtida no MALDI-TOF MS em relação ao sequenciamento 16S rRNA



≥2300 13% (6) 2% (1) 6% (3) 10

2000-2299 47% (22) 2% (1) 15% (7) 30

1700-1999 0 15% (7) 0 7

TOTAL 60% (28) 19% (9) 21% (10) 47

Analisando somente as amostras de CBc, todas foram identificadas

corretamente no gênero. Entretanto apenas 16% das amostras foram especiadas.

Cabe ressaltar que embora para a maioria das amostras (n=25) os scores tenham

sido superiores a 2300, critério definido como de alta probabilidade de identificação

em espécie, a maioria (68%) foi caracterizada apenas em nível de gênero (tabela 7).

Tabela 7: Índices de concordância da identificação de 31 amostras de Burkholderia

spp. obtida no MALDI-TOF MS em relação ao sequenciamento de recA



≥2300 13% (4) 68% (21) 0 25

2000-2299 3% (1) 16% (5) 0 6

1700-1999 0 0 0 0

TOTAL 16% (5) 84% (26) 0 31

56

Na tabela 8 estão discriminadas as espécies identificadas nas duas

metodologias. Houve total concordância para as amostras de Achromobacter

xylosoxidans (n=2), Acinetobacter baumannii (n=2), Acinetobacter ursingii (n=2),

Chryseobacterium indologenes (n=2), Elizabethkingia meningoseptica (n=2),

Moraxella catarrhalis (n=1), Paenibabillus amylolyticus (n=1), Pannonobacter.

phragmitetus (n=1), Pseudomonas mendocina (n=1), Pseudmonas mosselii (n=1),

Rhizobium radiobacter (n=1) e Stenotrophomonas. maltophilia (n=3). Por outro lado,

discordância total foi observada em Bordetella holmesii (n=2), Brevundimonas

vesicularis (n=1), Moraxella osloensis (n=1) e Pseudmonas putida (n=2).

A identificação correta exclusivamente em nível de gênero ocorreu em 100%

das amostras de Acinetobacter calcoaceticus (n=1), Acinetobacter lwoffii (n=1),

Brevundimonas diminuta (n=1), Chryseobacterium haifense (n=1), Delftia

acidovorans (n=3) e Pseudomonas aeruginosa (n=1). Chryseobacterium joostei

(n=1). Setenta e cinco por cento das amostras de P. stutzeri e metade de

Alcaligenes faecalis, Pseudomonas oryzihabitans e Wautersiella falsenii foram

concordantes em nível de espécie.

Os maiores percentuais de discordância entre as duas metodologias

ocorreram dentro das amostras do CBc. Das 19 amostras identificadas pelo

sequenciamento do gene recA como Burkholderia contaminans, oito foram

identificadas como Burkholderia cepacia, quatro como Burkholderia cenocepacia e

uma como Burkholderia pyrrocinia. Em seis amostras o resultado do MALDI-TOF MS

não discriminou entre duas espécies. No caso das nove amostras de Burkholderia

cenocepacia, 56% (n=5) foram identificadas corretamente pelo MALDI-TOF-MS e

em três, a espécie correta estava entre as duas opções fornecidas pelo

equipamento. As duas espécies de Burkholderia cepacia e uma de Burkholderia

vietnamiensis não foram identificadas e a espécie correta não estava entre as

opções de identificação fornecidas pelo aparelho.

A figura 5 ilustra o espectro proteico de quatro amostras, como apresentadas

pelo sistema MALDI-TOF MS.

57

Figura 5: Espectro proteico de 4 amostras gerado pelo sistema MALDI-TOF-MS: (A)

Achromobacter xylosoxidans; (B) Burkholderia contaminans; (C) Delftia acidovorans;

e (D) Pseudmonas stutzeri.

58

Tabela 8: Análise comparativa da identificação por MALDI-TOF MS em relação ao

sequenciamento de 16S rRNA e recA

Micro-organismo Sequenciado (n)

MALDI-TOF (n) Concordância

em espécie

Concordância apenas em

gênero Discordância

* Burkholderia contaminans (19)

Burkholderia cepacia (8)

0% 100% 0%

Burkholderia cenocepacia (4)

B. cepacia / B. cenocepacia (5)

B. cenocepacia / B. pyrrocina (1)

Burkholderia pyrrocina (1)

* Burkholderia cenocepacia (9)

Burkholderia cenocepacia (5)

56% 44% 0%

Burkholderia cepacia (1)

B. cepacia / B. cenocepacia (1)

B. cenocepacia / B. metallica (1)

B. cenocepacia / B. pyrrocina (1)

* Burkholderia cepacia (2) Burkholderia pyrrocina (1)

0% 100% 0% B. cenocepacia / B. pyrrocina (1)

* Burkholderia vietnamiensis (1)

B. cepacia / B. cenocepacia (1) 0% 100% 0%



75% 12.5% 12,50% Pseudomonas sp. (1)

Alcaligenes faecalis (1)

Delftia acidovorans (3) Delftia sp. (3) 0% 100% 0%

Stenotrophomonas maltophilia (3)


100% 0% 0%

Acinetobacter baumannii (2)

Acinetobacter baumannii (2) 100% 0% 0%


Achromobacter xylosoxidans (2) 100% 0% 0%

Acinetobacter ursingii (2) Acinetobacter ursingii (2) 100% 0% 0%

Alcaligenes faecalis (2) Alcaligenes faecalis (1)

50% 0% 50% Pseudomonas monteilii (1)



100% 0% 0%

Elizabethkingia meningoseptica (2)


100% 0% 0%

Pseudomonas oryzihabitans (2)

Stenotrophomonas maltophilia(1)

50% 0% 50% Pseudomonas oryzihabitans (1)

Pseudomonas putida (2) Alcaligenes faecalis (1)

0% 0% 100% Stenotrophomnas maltophilia (1)

Wautersiella falsenii (2) Wautersiella falsenii (1)

50% 0% 50% Acinetobacter baumannii (1)

59

Tabela 8: Análise comparativa da identificação por MALDI-TOF MS em relação ao

sequenciamento de 16S rRNA e recA (continuação).


MALDI-TOF (n) Concordância em

espécie Concordância

apenas em gênero Discordância

Acinetobacter calcoaceticus (1)

Acinetobacter genomospecies 3 (1)

0% 100% 0%

Acinetobacter lwoffii (1) Acinetobacter sp. (1) 0% 100% 0%

Bordetella holmesii (2) Alcaligenes faecalis (2) 0% 0% 100%

Brevundimonas diminuta (1) Brevundimonas sp. (1) 0% 100% 0%

Brevundimonas vesicularis (1) Stenotrophomonas maltophilia (1)

0% 0% 100%

Chryseobacterium haifense (1) Chryseobacterium joostei (1) 0% 100% 0%

Moraxella catarrhalis (1) Moraxella catarrhalis (1) 100% 0% 0%

Moraxella osloensis (1) Acinetobacter pittii (1) 0% 0% 100%

Paenibacillus amylolyticus (1) Paenibacillus amylolyticus (1) 100% 0% 0%

Pannonnibacter phragmitetus (1)

Pannonnibacter. phragmitetus (1)

100% 0% 0%

Pseudomonas aeruginosa (1) Pseudomonas nitroreducens (1)

0% 100% 0%

Pseudomonas mosselii (1) Pseudmonas mosselii (1) 100% 0% 0%

Pseudmonas mendocina (1) Pseudomonas mendocina (1) 100% 0% 0%

Rhizobium radiobacter (1) Rhizobium. radiobacter (1) 100% 0% 0%

* organismo identificado por sequenciamento de recA


metodologias fenotípica, molecular e MALDI-TOF-MS

Considerando os resultados obtidos na metodologia molecular como padrão,

os mesmos resultados para a identificação das espécies nos três métodos foram

observados em 21 amostras das 47 de BGNNF analisadas (excluídas as amostras

do CBc), assim distribuídos: Acientobacter baumannii (n=2/2), Achromobacter

xylosoxidans (n=2/2), Elizabethkingia meningoseptica (n=2/2), Moraxella catarrhalis

(n=1/1), Rhizobium radiobacter (n=1/1), Stenotrophomonas maltophilia (n=3/3),

Pseudomonas stutzeri (n=6/8), Alcaligenes faecalis (n=1/2), Chryseobacterium

60

indologenes (n=1/2), Pseudomonas oryzihabitans (n=1/2) e Wautersiella falsenii

(n=1/2).

Concordância de identificação apenas em gênero entre as três técnicas foram

observadas em 11 amostras: Acinetobacter spp. (n=3), Brevundimonas spp. (n=1)

Delftia (n=3) e Pseudomonas spp. (n=4) (tabela 9).

61

Tabela 9: Análise comparativa da identificação pelo método fenotípico e por MALDI-

TOF MS em relação ao sequenciamento de 16S rRNA.


MALDI-TOF (n) Identificação

Bioquímica (n) Concordantes em espécie (n)

Concordantes em gênero (n)

Discordantes (n)




6 1 1 Pseudomonas sp. (1) Pseudomonas aeruginosa (1)



Delftia acidovorans (3)

Delftia sp. (3) Delftia acidovorans (3)

0 3 0




3 0 0




2 0 0




2 0 0

Acinetobacter ursingii (2)

Acinetobacter ursingii (2)

Acinetobacter spp. (2)

0 2 0




1 0 1

Pseudomonas monteilii (1)

Pseudomonas spp. (1)




1 0 1

Myroides odoratus (1)




2 0 0


Stenotrophomonas maltophilia (1) Pseudomonas

oryzihabitans (2)

1 0 1


Pseudomonas putida (2)


Pseudomonas putida (1)

0 0 2



Wautersiella falsenii (2)



1 0 1


Moraxella spp. (1)

62

Tabela 9: Análise comparativa da identificação pelo método fenotípico e por MALDI-

TOF MS em relação ao sequenciamento 16S rRNA (continuação).


MALDI-TOF (n) Identificação

Bioquímica (n) Concordantes em

espécie (n) Concordantes em gênero (n)

Discordantes (n)

Bordetella holmesii (2)


Bordetella holmesii (1)

0 0 2

Bordetella spp. (1)

Acinetobacter calcoaceticus (1)

Acinetobacter genomospecies 3 (1)

Sphingomonas spp. (1) 0 0 1

Acinetobacter lwoffii (1)

Acinetobacter sp. (1) Acinetobacter spp. (1)

Brevundimonas diminuta (1)

Brevundimonas sp. (1)

Brevundimonas vesicularis (1) 0 1 0

Brevundimonas vesicularis (1)


Brevundimonas vesicularis (1) 0 0 1

Chryseobacterium haifense (1)

Chryseobacterium sp. (1)

Brevundimonas sp. (1) 0 0 1

Moraxella catarrhalis (1)

Moraxella catarrhalis (1)

Moraxella catarrhalis (1) 1 0 0

Moraxella osloensis (1)

Acinetobacter pittii (1)

Moraxella osloensis (1) 0 0 1

Paenibacillus amylolyticus (1)

Paenibacillus amylolyticus (1)

Sphingomonas spp. (1) 0 0 1

Pannonibacter phragmitetus (1)

Pannonibacter phragmitetus (1)

Achromobacter xylosoxidans(1) 0 0 1

Pseudomonas aeruginosa (1)

Pseudomonas nitroreducens (1)

Pseudomonas aeruginosa (1) 0 1 0

Pseudomonas mosselii (1)

Pseudomonas mosselii (1)

Pseudomonas putida (1) 0 1 0

Pseudomonas mendocina (1)

Pseudomonas mendocina (1)

Pseudomonas aeruginosa (1) 0 1 0

Rhizobium radiobacter (1)

Rhizobium radiobacter (1)

Rhizobium radiobacter (1) 1 0 0

63

Em 15 amostras, o resultado da identificação de pelo menos uma das

técnicas fenotípicas não apontou corretamente a espécie identificada pelo método

de referência (sequenciamento). Em três dessas amostras, houve total incoerência

de resultados em todos os métodos testados, como relacionados na tabela 10.

Tabela 10: Resultados de identificação incorreta por ambos os métodos fenotípicos

em relação ao sequenciamento de 16S rRNA.

Micro-organismo Sequenciado MALDI-TOF Score Identificação Bioquímica

Pseudomonas stuzeri Alcaligenes faecalis 2,285 Achromobacter xylosoxidans

Pseudomonas putida Stenotrophomonas maltophilia 2,033 Alcaligenes faecalis

Wautersiella falsenii Acinetobacter baumannii 2,46 Moraxella spp.

3.5 Tipagem das amostras de Burkholderia contaminans por PFGE

Por serem os micro-organismos mais prevalentes nesse estudo, as 19

amostras de Burkholderia contaminans obtidas de 11 pacientes da mesma

instituição hospitalar foram avaliadas quanto à possível existência de relação de

clonalidade. Para essa analise, quando os pacientes apresentavam 2 resultados

positivos para o mesmo micro-organismo, em hemoculturas realizadas no mesmo

dia, optamos por incluir as 2 amostras bacterianas de cada paciente. Assim, em seis

pacientes foram tipadas as duas amostras de Burkholderia contaminans isoladas na

mesma data.

Um dos géis utilizados para a corrida eletroforética de campo pulsado está

representado na figura 6. A figura 7 contém o dendrograma construído de acordo

com os perfis de PFGE gerados para essa espécie. Para uma das amostras (8199),

não foi possível determinar o grupo clonal, uma vez que não houve formação de

bandas após a corrida eletroforética. Assim a análise dos dados foi realizada com 18

amostras.

64

O dendrograma construído para a espécie Burkholderia contaminans,

considerando 85% de similaridade entre os perfis de PFGE formados, evidenciaram

a presença de dez grupos clonais distintos na população estudada (BcoA a BcoK,

exceto BcoG). O grupo clonal BcoF foi observado em três amostras. Os grupos

clonais BcoC, BcoD, BcoE, BcoH, BcoI e BcoJ foram detectados duas vezes e os

clones BcoA, BcoB e BcoK foram únicos.

Figura 6: Gel representativo dos padrões de PFGE para 13 amostras da espécie

Burkholderia contaminans. 1 e 14 – λ ; 2 – 7168; 3 – 7174; 4 – 7177 (posteriormente

excluída do estudo); 5 – 7319; 6 – 7324; 7 – 7394; 8 – 7454; 9 – 8185; 10 – 8233; 11

– 8234; 12 – 8303; 13 – 8308.

65

Figura 7: Dendrograma considerando 85% de similaridade entre os perfis de PFGE

obtidos de amostras de Burkholderia contaminans.

Foi observado que apenas em dois (33%) dos seis pacientes que tiveram 2

hemoculturas colhidas no mesmo dia positivas para Burkholderia contaminans, as

duas amostras de Burkholderia contaminans eram do mesmo grupo clonal. As

demais amostras do mesmo paciente não tinham relação de clonalidade (tabela 11).

A análise da distribuição dos grupos clonais de Burkholderia contaminans em

relação aos setores de origem dos pacientes mostrou que nefrologia e hemodiálise

foram os que contribuíram com maior número de pacientes com amostras positivas

(5 pacientes e 9 amostras). Os grupos clonais BcoD e BcoE foram encontrados em

pacientes distintos assistidos no mesmo setor com diferença de quatro meses

(BcoD, nefrologia) e 1,5 ano (BcoE, hemodilálise), entre as

culturas,respectivamente.

Apenas dois grupos clonais foram encontrados em pacientes distintos de

diferentes unidades em períodos próximos: BcoJ (um paciente da nefrologia e um da

UTI neonatal com intervalo de dois meses entre as culturas) e BcoF (um paciente da

unidade coronariana e um paciente atendido primeiramente na nefrologia e depois

na hemodiálise , com intervalo de nove meses entre as culturas (tabela 11).

66

Tabela 11: Distribuição cronológica dos grupos clonais determinados por PFGE para

a espécie Burkholderia contaminans encontrada nos pacientes atendidos nos

diversos setores do HUPE.

Amostra Paciente Data de cultura Setor

Grupo Clonal

7174 P1 29/02/2008 Unidade Coronariana BcoA

7168 P1 29/02/2008 Unidade Coronariana BcoF

7454 P2 14/03/2008 Infectologia BcoC

7394 P2 14/03/2008 Infectologia BcoC

7324 P3 29/04/2008 Pediatria BcoH

7319 P3 29/04/2008 Pediatria BcoH

8185 P4 28/11/2008 Nefrologia BcoF

8233 P4 08/12/2008 Hemodiálise BcoE

8234 P4 08/12/2008 Hemodiálise BcoF

8303 P5 05/01/2009 Nefrologia BcoI

8308 P5 05/01/2009 Nefrologia BcoK

8532 P6 11/02/2009 Unidade Intermediária Clínica BcoI

9504 P7 09/10/2009 Nefrologia BcoD

9503 P7 09/10/2009 Nefrologia BcoJ

9742 P8 09/12/2009 UTI neonatal BcoJ

9987 P9 04/03/2010 CTI geral BcoB

10317 P10 15/05/2010 Hemodiálise BcoE

10385 P11 08/06/2010 Nefrologia BcoD

67

4 DISCUSSÃO

BGNNF são micro-organismos dotados de notável versatilidade metabólica,

capazes de colonizar os mais diversos nichos do ambiente comunitário e hospitalar,

tornando-se fontes ubíquas para infecção em humanos. Assim, instalam-se nos mais

diversos tecidos, especialmente fluidos nobres como o sangue, onde podem causar

graves enfermidades sistêmicas de difícil tratamento, por serem resistentes a muitos

dos antimicrobianos usados na prática clínica. Todavia, somente as espécies mais

frequentes deste grupo são estudadas com maior atenção – as espécies menos

comuns são subestimadas quanto à sua importância, apesar do seu grande

potencial nocivo à saúde humana. Ademais, podem desempenhar certa função no

microbioma hospitalar e do hospedeiro, ao atuar como reservatórios e vetores de

mecanismos de resistência antimicrobiana e de fatores de virulência, impactando

também na saúde pública (Higgins et al, 2001; Woods et al, 2004; Gaynes &

Edwards, 2005; Enoch & Ludlam, 2007; Yoshino et al, 2011).

Esses microoganismos possuem características metabólicas que tornam

difícil sua identificação de forma precisa e distintiva pelos métodos fenotípicos

empregados rotineiramente. Além disso, os métodos moleculares como

sequenciamento, além de serem onerosos, nem sempre conseguem distinguir com

eficácia grupos de BGNNF intimamente relacionados geneticamente, exigindo

adaptações na metodologia a fim de maximizar sua sensibilidade e requerendo

maior disponibilidade de recursos físicos e humanos (Bosshard et al, 2006; Zbinden

et al, 2007; Jacquier et al, 2011). Portanto, a identificação laboratorial de espécies

de BGNNF, e em especial os menos frequentes, tem se mostrado um grande

desafio na microbiologia clínica. O presente estudo avaliou a identificação de

BGNNF isolados em hemoculturas utilizando três diferentes metodologias: a

fenotípica convencional, a metodologia mais recente MALDI-TOF-MS e o

sequenciamento dos genes 16 S rRNA e recA.

68

4.1 Identificação molecular e identificação fenotípica manual de BGNNF

De um modo geral, as técnicas moleculares são consideradas de referência.

Dentre elas, o sequenciamento do gene 16rRNA tem vantagens em relação a

procedimentos de identificação tradicionais: (i) não é restrito a um grupo específico

de bactérias, visto que bases de dados públicas, tais como GenBank, cobrem

praticamente todo o espectro da diversidade filogenética; (ii) espécies ainda não

descritas podem ser atribuídas a um grupo de bactérias afins, (iii) os resultados são,

em geral, não ambíguos e não dependem de interpretação individual (Bosshard et

al, 2006). Porém, pode apresentar algumas limitações. É, em certos casos,

comprometido por um baixo poder de distinção filogenética nos níveis de espécie ou

subespécie (Stackebrandt et al, 1994). Isso é particularmente verdadeiro para os

membros do CBc, no qual o sequenciamento do gene recA é mais apropriado para o

reconhecimento das diferentes espécies (Mahenthiralingam et al, 2000).

A qualidade dos bancos de dados públicos, como o GenBank, é crítica. As

sequencias são depositadas independentemente de sua qualidade, por exemplo,

quanto ao seu tamanho, número de nucleotídeos ambíguos, possíveis mudanças

taxonômicas ou mesmo se o organismo associado já foi anteriormente publicado de

forma válida ou não. A interpretação correta de dados gerados por este método

também requer experiência com taxonomia (Bosshard et al, 2006).

Apesar dessas pequenas limitações, o sequenciamento do gene 16S rRNA

teoricamente não leva a falsa identificação, salvo nos casos em que sequências

erradas tiverem sido depositadas no GenBank. Então, com análise crítica dos

resultados e algum conhecimento sobre a taxonomia, a seqüência pode ser quase

que inequivocamente atribuída a uma espécie e o micro-organismo em questão

corretamente identificado. Este método é considerado atualmente o padrão-ouro

para a identificação de bactérias na microbiologia clínica (Clarridge et al, 2004).

Vários estudos comprovam a confiabilidade desta técnica para a identificação de

BGNNF quando comparados a outros métodos de identificação fenotípicos e

moleculares (Ferroni et al, 2002; Bosshard et al, 2006; Cloud et al, 2010).

Todos as 78 amostras de BGNNF incluídas neste estudo foram identificados

por sequenciamento dos genes 16S rRNA e recA. Foram encontrados 16 gêneros e

30 espécies, com grande predominância de espécies do CBc (40%), particularmente

Burkholderia contaminans (24%), Burkholderia cenocepacia (12%) e Pseudomonas

69

stutzeri (10%). É importante salientar que pelo sequenciamento de 16S rRNA,

amostras de CBc foram identificadas somente até o nível do gênero Bukholderia. Só

foi possível identificar as espécies através do sequenciamento de recA, indicando a

importância da adoção de estratégias de sequenciamento adequadas para a

identificação de grupos mais intimamente relacionados.

Existem muitas limitações para analises comparativas em relação a

epidemiologia de BGNNF em bacteremias: o pequeno número de publicações sobre

organismos que não P. aeruginosa, A. baumannii e S. maltophilia, dificultam a

obtenção de dados em volume significativo para comparações; a utilização de

diferentes metodologias de identificação, as constantes mudanças taxonômicas

desse grupo, a origem e período da amostragem, dentre outros.

Entre 1997 e 2002, em um estudo contemplando 176 BGNNF encontrados

em hospitais da América Latina, Gales e colaboradores (2005) também encontraram

predominância de Burkholderia spp., em percentual semelhante ao deste estudo

(44%). Entretanto, para os demais BGNNF, houve diferenças: enquanto em nosso

estudo o segundo mais frequente foi Pseudomonas stutzeri (10%), no de Gales e

colaboradores foi Achromobacter spp. (14%), Também foram encontradas espécies

não identificadas neste estudo, como Ralstonia picketti, além de uma quantidade

considerável de outros BGNNF em que a identificação não foi alcançada

possivelmente porque a metodologia usada para identificação das amostras foi a

fenotípica. Vidal e colaboradores (2002) observaram predominância entre 101

BGNNF também achados neste estudo, mas em diferentes percentuais:

Pseudomonas putida (14% contra 3%) e grupo Alcaligenes-Achromobacter – 14%

contra 6% somatório de Alcaligenes faecalis e Achromobacter xylosoxidans, as duas

espécies do mesmo grupo encontradas. Outros achados incluem Burkholderia spp.

(13% contra 40%), além de quantidades próximas de Pseudomonas stutzeri (8%

contra 10%) e Pseudomonas oryzihabitans (5% contra 3%). Porém, foram também

identificadas espécies não encontradas no presente trabalho: Acinetobacter

johnsonii, Pseudomonas fluorescens, Ralstonia pickettii, Comamonas spp. e

Sphingomonas paucimobilis (Vidal et al, 2002).

Outro trabalho, conduzido por Jacquier e colaboradores (2011) com

188 amostras de BGNNF de nove hospitais franceses e mais amplo em número de

espécies, mostrou uma distribuição de BGNNF de bacteremias (n=36) diferente

deste estudo. Com o uso de sequenciamento de 16S rRNA e métodos fenotípicos

70

(API 20NE e Vitek-2), montaram um perfil epidemiológico das amostras. Nenhuma

amostra de CBc, o principal organismo achado em nossa amostragem, foi

encontrada dentre as amostras de hemoculturas, talvez porque as três técnicas

utilizadas sejam pouco precisas na identificação desses organismos. Por outro lado,

houve predomínio de Pseudomonas oryzihabitans, em quantidade muito superior a

por nós encontrada: 15% contra 3%. Acinetobacter junii também ocorreu em igual

quantidade, mas não incidiu em nosso levantamento. Outro organismo prevalente foi

Acinetobacter lwoffii (12%), que achamos em menor prevalência (1%). Em nossa

amostragem, Pseudomonas stutzeri foi mais frequente (8% contra 4%), enquanto

Achromobacter xylosoxidans, Alcaligenes spp., Pseudomonas putida, Pseudomonas

mossellii, Brevundimonas diminuta e Elizabethkingia meningoseptica foram

observados em ambos os estudos, em quantidades menores e semelhantes. Esta

pesquisa não achou Pseudomonas luteola, Acinetobacter johnsonii, Acinetobacter

radioresistens, Burkholderia gladioli, Cupriavidus pauculus e Ochrobactrum anthropi,

encontrados no trabalho citado. (Jacquier et al, 2011). As diferenças em relação aos

resultados entre os trabalhos podem ser reflexo de vários fatores como

anteriormente citado, mas as diferenças nas metodologias usadas para a

identificação dos BGNNF contribuem de forma importante.

A identificação fenotípica convencional através da avaliação do metabolismo

bacteriano é ainda o método amplamente usado nos laboratórios clínicos, por se

basear em conhecimentos bem disseminados e ser empregado com relativa

facilidade e baixo custo, apesar de ser relativamente demorado. Diante dessa

desvantagem, muitos laboratórios utilizam métodos miniaturizados ou mesmo

automatizados. Quando se trata de BGNNF, não é diferente, mas há maior

dificuldade devido à baixa atividade metabólica e variabilidade morfológica e

bioquímica das amostras.

A presente pesquisa avaliou a identificação por este método, com a utilização

de um conjunto de testes manuais bem mais amplo que o utilizado nos laboratórios

de rotina e comparou com a identificação obtida pela técnica padrão-ouro – o

sequenciamento. Todas as amostras pertencentes ao CBc foram corretamente

classificadas no gênero Burkholderia spp., mas pela impossibilidade de identificação

ao nível de espécies usando este método não puderam ser comparadas com a

identificação obtida pelo sequenciamento do gene recA, que permite diferenciação

de espécies. Ainda assim, é possível afirmar que a identificação de organismos do

71

CBc é facilitada, quando comparado aos outros BGNNF menos comuns, pelo

pequeno conjunto de provas: além do conjunto básico para identificação inicial de

BGNNF (OF-glicose, mobilidade, oxidase), o teste da lisina, quando positivo, é um

marcador importante. Como a maioria das espécies dentro do CBc é positiva para

esse teste, existe alta probabilidade de uma amostra ser incluída no CBc.

Com esse método, foi observado concordância de 64% de identificação em

nível de espécie e 17% em relação a identificação apenas em nível de gênero. Foi

observada completa discordância de resultados em 19% das amostras, pertencentes

aos gêneros Acinetobacter, Alcaligenes, Chryseobacterium, Paenibacillus,

Pannonibacter, Pseudomonas e Wautersiella.

A identificação fenotípica de BGNNF é, por vezes, controversa. Os índices de

precisão na identificação em nível de espécie, quando comparados à metodologia

genotípica, variam entre 53-87% e 54-75% para os sistemas de identificação

fenotípica Vitek-2 e API 20NE, respectivamente. Tal variância se dá em função de

uma série de fatores: da origem da amostra (rotina ou coleção ou material de origem

– sangue, secreção respiratória, etc.), diferentes métodos de referência, inclusão de

diferentes espécies na classificação e variação no grau de aceitabilidade de

resultados (Zbinden et al, 2007; Bosshard et al, 2006; Jacquier et al, 2011).

Bosshard e colaboradores (2006) compararam os sistemas API 20NE e Vitek-

2 frente ao sequenciamento de 16S rRNA. De uma forma global, atingiram taxas de

concordância entre os métodos menores que as deste estudo: respectivamente, a

concordância em nível de espécie foi de 54%/53%. Em relação somente ao gênero a

concordância foi de 7%/1%. Foi observada completa discordância de resultados em

39% e 46% das amostras. Ainda, 15%/43% das amostras corresponderam a

espécies não incluídas nos bancos de dados dos dois sistemas. Cabe ressaltar que

os autores incluíram na amostragem todas as amostras de BGNNF, exceto P.

aeruginosa (Bosshard et al, 2006).

Zbinden e colaboradores (2007) também avaliaram a precisão da

identificação fenotípica de BGNNF isolados de materiais clínicos diversos, através

do sistema Vitek-2, diante do sequenciamento de 16S rRNA, apontando resultados

também inferiores aos deste estudo: concordância em nível de espécie em 59% das

amostras e 10% de concordância apenas em nível de gênero e 31% de amostras

completamente discordantes na identificação ou não identificados por não

constarem no banco de dados do sistema. Uma vez que os resultados discordantes

72

foram devido à identificação de BGNNF incomuns, os autores sugeriram a utilização

do sequenciamento de 16S rRNA para identificação precisa de BGNNF que não

Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter sp., CBc, P. aeruginosa e S. maltophilia,

quando assim identificados pelo sistema Vitek-2 (Zbinden et al, 2007).

Jacquier e colaboradores (2011) realizaram avaliação semelhante a deste

estudo com BGNNF incomuns, excluindo P. aeruginosa, A. baumannii e S.

maltophilia, com os métodos API 20NE e sistema Vitek-2 comparados com

sequenciamento de 16S rRNA. Concordância em nível de espécie foi possível em

57%/71% das amostras, enquanto concordância apenas em gênero foi achada em

19%/10% das amostras, respectivamente. Discordância absoluta foi observada em

4%/6% das amostras. Além disso, 20%/13% não foram identificadas por não

constarem nos bancos de dados dos sistemas de identificação mencionados

(Jacquier et al, 2011).

De um modo geral, os sistemas automatizados são inferiores aos manuais

miniaturizados na identificação de BGNNF menos comuns. Uma das possíveis

causas é que nos sistemas automatizados as leituras das provas são realizadas em

um único tempo de incubação e não permitem a reincubação das cartelas, como no

caso dos testes manuais. Além disso, a ausência de microrganismos raros nos

bancos de dados dos sistemas é outro fator que contribui para identificações

incorretas ou não alcançadas. O índice de concordância superior obtido no presente

estudo quando comparado aos obtidos na literatura com a utilização de metodologia

fenotípica provavelmente se deve ao extensivo número de provas utilizadas na

técnica fenotípica manual, aliado a possibilidade de se fazer leituras prolongadas

(por até 7 dias) de algumas provas. Entretanto, uma desvantagem dessa

metodologia é exatamente o tempo elevado de geração de resultados, o que em um

laboratório clínico não é desejável, diante da necessidade de rapidamente resolver o

quadro de enfermidade dos pacientes. Assim, opta-se pela liberação dos resultados

como “grupo BGNNF” apenas. Nesses casos, as implicações no tratamento (se

guiadas pelo teste de suscetibilidade a antimicrobianos) são pequenas, uma vez que

não há padronização para os antimicrobianos empregados contra BGNNF pelo teste

de difusão em agar (amplamente utilizado em laboratórios clínicos), excetuando-se

Acinetobacter spp, P. aeruginosa, S. maltoplilia e Burkholderia cepacia. Para os

demais BGNNF a metodologia recomendada é a determinação da concentração

73

inibitória mínima por microdiluição e macrodiluição e a interpretação é generalizada

para “outras não-enterobactérias”. Em tais casos, o tratamento é empírico.

4.2 MALDI-TOF-MS

Metodologias baseadas em espectrometria de massa, em especial o MALDI-

TOF-MS foram recentemente introduzidas em laboratórios clínicos e têm causado

uma grande revolução, devido à possibilidade de ser um método diagnóstico

confiável e rápido. As aplicações mais simples do MALDI-TOF MS envolvem

identificar colônias de bactérias, sem preparação elaborada e usando o mínimo de

consumíveis, proporcionando identificação rápida e de baixo custo. Em comparação

com métodos convencionais, MALDI-TOF MS melhora o tempo de identificação de

micro-organismos a uma média de 1,5 dia. Além disso, uma vez que apenas uma

pequena quantidade do micro-organismo é necessária, o teste pode ser realizado

diretamente a partir de colônias isoladas em placas de cultura primária, enquanto

que outros métodos podem requerer subcultivos (Patel, 2013).

Os custos de reagentes são de aproximadamente US$ 0.35/teste e a sua

implementação reduz os custos de reagentes e de trabalho para a identificação em

57% dentro de 1 ano. Estima-se que 87% das amostras são identificadas no

primeiro dia (em comparação com 9% com técnicas convencionais), com um dia de

vantagem na identificação final para a maioria dos organismos e vários dias mais

cedo para organismos bioquimicamente inertes, fastidiosos, ou de crescimento lento

(Tan et al, 2012).

Com a utilização do MALDI-TOF MS, despesas com sequenciamento de DNA

são evitadas para a maioria dos organismos, a eliminação de resíduos é reduzida, e

o controle de qualidade e treinamento de profissionais para o trabalho com os testes

substituídos ou descontinuados são eliminados ou pelo menos diminuídos (Gaillot et

al, 2011).

Além da identificação direta da colônia, a identificação rápida de micro-

organismos que crescem em frascos de hemocultura é promissora e podem reduzir

o tempo de identificação em um dia ou mais, mas requer processamento prévio das

amostras por garrafas de cultura de sangue conter macromoléculas do sangue e

meios de crescimento. O processamento é realizado com centrifugação diferencial e

74

lavagens, a lise seletiva de células de sangue, gel de separação, filtração, e assim

por diante. Para agilizar essa etapa, há no mercado garrafas de sangue com

separação facilitada, como o Sepsityper (Bruker Daltonics) (Buchan et al, 2012;

Loonen et al, 2012; Saffert et al, 2012), porém seu rendimento não é tão bom como

testes em colônias (Buchan et al, 2012) e culturas polimicrobianas não pode ser

completamente caracterizadas (embora estratégias estejam sendo desenvolvidas).

MALDI-TOF MS tem limitações: (i) Ao contrário dos bancos de dados de

sequenciamentos publicamente disponíveis, tais como GenBank, o banco de dados

de MALDI-TOF MS são privados; (ii) por causa de baixos scores, repetições são

necessárias para aproximadamente 10% das amostras (Tan et al, 2012); (iii) são

necessários critérios refinados para distinguir espécies estreitamente relacionadas e

diferenciá-las taxonomicamente (De Bel et al, 2011). Para certas espécies de

organismos, pontos de corte específicos de score (reduzidos) podem ser mais

apropriados (Ford & Durnham, 2013); e (iv) há também uma curva de aprendizado

para a inoculação da quantidade ideal de massa bacteriana nas placas-alvo (Harris

et al, 2012). Os meios de cultura também podem influenciar nos resultados e

estarem associados com baixos scores, em especial meios contendo

antimicrobianos Também as características morfológicas podem influenciar:

microrganimos que apresentam colônias mucoides tendem a ser identificados

incorretamente ou não identificados (Anderson et al, 2012; Harris et al, 2012; Xiao

et al, 2012). MALDI-TOF MS pode produzir resultados diferentes de identificação

(geralmente mais precisos) quando comparados os sistemas fenotípicos atuais

(Saffert et al, 2011).

A identificação obtida pelos resultados do MALDI-TOF-MS também foi

confrontada com a técnica de referência (sequenciamento). Os percentuais de

concordâncias gerais foram de 42% em nível de espécie e de 45% somente em

nível de gênero. Identificação discordante aconteceu em 13% das amostras. De

todas as amostras incluídas neste estudo, apenas duas das espécies encontradas

não constavam no banco de dados do sistema MALDI-TOF-MS: Chryseobacterium

haifense e Burkholderia contaminans, justamente a mais frequente neste

levantamento.

Portanto, concordância ao menos em nível de gênero foi alcançada em 87%

das amostras, dado promissor no que diz respeito à possibilidade do emprego de

MALDI-TOF MS na identificação de BGNNF incomuns.

75

A comparação destes dados é difícil diante da vaga literatura ainda disponível

sobre uma técnica tão recente e também, assim como para os outros métodos

fenotípicos de identificação, diante das diferenças metodológicas entre os estudos,

como tamanho do universo amostral, materiais de origem das amostras, dentre

outros, que podem resultar em eventuais diferenças de resultados. Os trabalhos

encontrados na literatura lidam com materiais diversos de interesse clínico ou se

concentram em amostras de secreções respiratórias de pacientes com FC, onde

encontramos a maior diversidade de BGNNF quando comparadas a qualquer outro

grupo de pacientes.

Nossos dados não estão distantes dos descritos por Melmann e

colaboradores (2009) que, ao testarem 559 amostras de BGNNF frente a um banco

de dados próprio contendo 87 cepas de referência, encontraram índices de

concordância em nível de espécie de 50%, somente em nível de gênero de 43% e

discordância de 7%, dados que sugerem que suas identificações foram ligeiramente

melhor sucedidas. Quando comparados aos nossos números, apresentaram maior

concordância em nível de espécie, majorada em 8%, índice esse distribuído entre

amostras discordantes e concordantes apenas em nível de gênero. Porém, somente

utilizaram a identificação por métodos moleculares quando ocorreu incoerências

entre as identificações obtidas por MALDI-TOF MS e aquelas feitas por métodos

fenotípicos. Em nossa amostragem, todas as amostras passaram por

sequenciamento de 16S rRNA ou de recA (Melmann et al, 2008).

Bizzini e colaboradores (2010), com uma amostragem reduzida (n=22),

chegaram a números de identificação correta em nível de espécie de 86% e em

nível de gênero de 14%, sem resultados discordantes em relação ao método

fenotípico convencional, realizado com os sistemas API e Vitek-2. O estudo, além de

não ter empregado métodos mais precisos como referência (sequenciamentos, por

exemplo), contemplou uma gama ampla de bactérias e fungos, com poucas

amostras de BGNNF, possivelmente gerando um viés estatístico para identificações

mais bem sucedidas em relação a um perfil de amostragem mais semelhante ao

nosso (Bizzini et al, 2010).

Em trabalho com amostras de BGNNF provenientes de secreção respiratória

de pacientes com FC, Marko e colaboradores (2012) observaram índices menores

de sensibilidade para MALDI-TOF MS. Concordância em nível de espécie foi de

27%, enquanto concordância somente em nível de gênero foi de 62% e discordância

76

de 11%, em relação a técnicas de identificação fenotípicas (manuais, miniaturizadas

e automatizados) e genotípicas (PCR e sequencimento de 16S rRNA e recA), porém

grupos amostrais distintos foram identificados por técnicas distintas, impossibilitando

uma comparação uniformizada do MALDI-TOF MS frente a uma técnica de

referência. Esses dados podem indicar uma maior dificuldade de identificação de

BGNNF em secreção respiratória de FC por MALDI-TOF MS em relação às outras

amostras clínicas, até porque a diversidade e similaridade microbiana é maior neste

material. Logo, as dificuldades de identificação para BGNNF de pacientes com FC

possivelmente serão as mesmas independentemente das técnicas empregadas

(Marko et al, 2012).

Com desenho metodológico semelhante ao do presente estudo, mas com um

número de amostras maior (n=86) e com maior diversidade espécies de BGNNF,

Jacquier e colaboradores (2011) atingiram índices globais de concordância em nível

de espécie e apenas em nível de gênero de 78% e 12%, respectivamente. Houve

discordância completa em 3% das amostras e outros 7% não puderam ser

identificadas.

Uma outra abordagem dos nossos resultados foi a analise dos resultados com

a exclusão das espécies do CBc. Assim, houve um significativo aumento da precisão

de MALDI-TOF MS: 60% de concordância em nível de espécie, acompanhado de

uma redução da concordância somente em nível de gênero para 19% e um aumento

da discordância para 21%, categoria essa inalterada em números absolutos. Na

literatura previamente descrita, ao se analisar os dados de forma semelhante

(excluindo CBc da amostragem), também notou-se um desvio das concordâncias em

nível de gênero para concordâncias em nível de espécie, porém bem menos

acentuados, uma vez que não eram predominantes na amostragem: 1% e 4% no

estudo de Melmann e colaboradores (2008) e no de Bizzini e colaboradores (2010),

respectivamente. No trabalho de Jacquier e colaboradores (2011), essa tendência

não foi notada, uma vez que, sob tal análise, houve uma diminuição da concordância

em nível de espécie de 1%, com o aumento de mesma proporção para a categoria

de concordância apenas em nível de gênero. Marko e colaboradores (2012) teriam

notado uma diminuição de ambas as categorias de concordância de 2% cada, sendo

este montante (4%) acrescido na categoria de discordância completa. Em outro

estudo com 52 amostras de CBc analisados com o sistema MALDI-TOF MS, Degand

77

e colaboradores (2008) relataram maior concordância de nível de espécie (83%) do

que o atual estudo.

Todas as amostras de CBc foram corretamente identificadas em gênero,

enquanto apenas 16% delas foram corretamente identificadas até o nível de

espécie. Além disso, as maiores taxas de discordância também incidiram sobre esse

grupo. Cabe ressaltar que embora para a maioria das amostras os scores tenham

sido superiores a 2300, critério definido como de alta probabilidade de identificação

em espécie, a maior parte delas (68%) foi caracterizada apenas em nível de gênero,

ou seja, identificação de CBc mesmo com scores acima de 2,300 não foram precisos

em espécie.

Em estudo anterior realizado por nosso grupo em colaboração com o grupo

de Gales e colaboradores, avaliou-se a identificação de 91 amostras de CBc de

hospitais de São Paulo e Rio de Janeiro, majoritariamente oriundas de secreção

respiratória e sangue, por MALDI-TOF MS comparativamente à identificação por

sequenciamento de recA. Todas as amostras foram identificadas corretamente em

nível de gênero, e 77% em nível de espécie. Os erros mais frequentes de

identificação aconteceram com amostras de Burkholderia contaminans (n=6), todas

discordantes da técnica de referência, e Burkholderia cepacia, com resultados

discordantes em 1/3 das amostras (Fehlberg et al, 2013). A diferença de

sensibilidade deste estudo em relação ao anteriormente citado pode estar na maior

quantidade de espectros proteicos de referência de CBc nos bancos de dados do

sistema, por exemplo. Em relação ao nosso estudo, essa diferença também pode

estar no fato de que nossas amostras de CBc são predominantemente Burkholderia

contaminans, espécie descrita recentemente, pouco comum e portanto ainda pouco

estudada.

Por ser um método recente, MALDI-TOF MS ainda pode ser aprimorado nas

variáveis envolvidas na técnica, como condições de crescimento microbiano,

extração proteica com ácido fórmico ou inoculação direta da colônia in natura e

mudanças nos pontos de corte das categorias de confiabilidade da identificação. Um

estudo conduzido por Ford & Burnham (2013) aponta como o melhor procedimento

para BGNNF o inóculo denso e ligeira redução dos pontos de corte do sistema em

relação aos indicados pelo fabricante (para BGNNF não fastidiosos), sem grande

diferença para tratamento com ácido fórmico. A temperatura do cultivo também

pareceu influenciar no resultado final, com temperaturas ótimas em torno de 35ºC.

78

O principal território a ser explorado na melhora da sensibilidade de MALDI-

TOF MS é tão simples quanto animador: com um mínimo cuidado na curadoria da

biblioteca de espectros proteicos de referência é possível incrementar

consideravelmente a identificação de novas amostras (Melmann et al, 2008;

Melmann et al, 2009; Degand et al, 2008). Isso é particularmente importante em um

grupo de organismos de relação mais íntima como o CBc, no qual a utilização dessa

estratégia mostrou bons resultados (Miñán et al, 2009; Jacquier et al, 2011). Ao se

aprimorarem os bancos de dados do sistema, e com o cadastro de novos perfis

proteicos que cubram a epidemiologia local e os principais micro-organismos

circulantes em cada laboratório, há a tendência em fazer do MALDI-TOF MS uma

técnica de identificação fácil, econômica, rápida e precisa, de grande potencial como

método de escolha na microbiologia clínica.


metodologias fenotípica, molecular e MALDI-TOF-MS

A contribuição de BGNNF em doenças infecciosas e particularmente em

bacteremias não pode ser negligenciada, requerendo meios de identificação rápida e

precisa. Analisando os resultados obtidos na metodologia molecular como padrão e

comparando com os dois métodos fenotípicos, os mesmos resultados para a

identificação das espécies nos três métodos foram observados em 21 das 47

amostras de BGNNF analisadas (excluídas as amostras do CBc). Concordância de

identificação apenas em gênero entre as três técnicas foram observadas em 11

amostras. Uma analise mais detalhada dos casos em que nenhuma técnica

fenotípica acertou na identificação quanto comparada ao sequenciamento (três

casos) parece apontar como possíveis causas a similaridade fenotípica e genotípica

entre as amostras, o que por si só torna a identificação fenotípica convencional

extremamente difícil.

Especificamente em relação ao MALDI-TOF MS nesses casos, podemos

inferir que: (i) valores elevados de score deste sistema não garantem a identificação

mais precisa, uma vez que até amostras com os mais altos valores de score

79

(≥2,300) foram discordantes em relação à identificação genotípica; (ii) valores de

score relatados na literatura como altamente confiáveis para a identificação em nível

de espécie (≥2,000) também não parecem ser adequados para todas as amostras, e

o próprio fabricante do sistema sugere apenas o termo “alta probabilidade”, portanto

não excluindo a possibilidade de identificação discordante; e (iii) a sensibilidade da

identificação em nível de gênero entre os dois métodos fenotípicos parece ser

equivalente.

A identificação de micro-organismos de maior dificuldade, como os BGNNF

pelo uso de técnicas fenotípicas manuais está bem estabelecida, porém é

demorada, assim como a metodologia genotípica de sequenciamento, que é

altamente precisa, mas onerosa. MALDI-TOF MS é um método muito recente,

rápido, econômico e preciso, porém precisa ainda de estudos para melhorar o seu

desempenho porem é promissor na microbiologia cínica e promete revolucionar a

rotina laboratorial.

4.4 Tipagem das amostras de B. contaminans por PFGE

O CBc é particularmente importante em pacientes com FC, sendo encontrado

em frequência variável. Em média, 2,5% dos pacientes com FC (CFF) apresentam o

CBc nas culturas de secreções respiratórias, podendo trazer consequências graves

para esses pacientes. A identificação em nível de espécie é útil para a adoção de

medidas de prevenção da transmissão de cepas epidêmicas de Burkholderia

cenocepacia e Burkholderia multivorans, associadas à 80% dos pacientes e

relacionadas com o declínio respiratório agudo de "síndrome cepacia” (LiPuma,

2010; LiPuma et al, 2011). A bacteremia é um evento raro nesse grupo de pacientes

e ocorre nos casos de síndrome cepacia. A importância de cada espécie do CBc em

bacteremias em pacientes sem FC ainda não está muito bem descrita. Em geral,

nesses casos estão associados a surtos ocasionados por contaminação ambiental,

produtos e equipamentos de uso hospitalar.

Em nossa amostragem as espécies do CBc contribuíram com os maiores

percentuais de isolamento em bacteremia, sendo Burkholderia contaminans a

80

espécie mais frequente (24%). Esses dados de certa forma foram surpreendentes,

pois, juntamente com Burkholderia lata, é uma das espécies mais recentemente

descritas no CBc (2009). Nos últimos anos, porém, B. contaminans vem ganhando

importância. Sua associação com infecção do trato biliar foi descrita em um paciente

que desenvolveu sepse após um procedimento invasivo (colangiopancreatografia

retrógrada endoscópica – CPRE) (Ohji et al, 2013). Outro relato descreve um surto

de B. contaminans cuja fonte foi de origem ambiental (toalhas umedecidas

industrializadas) abrangendo diversos setores de um hospital alemão acometendo

pacientes com pneumonia associada à ventilação, ferida cirúrgica e casos de

septicemia (Martin et al, 2011). Em ambos os casos, as hemoculturas dos pacientes

foram testadas fenotipicamente com métodos automatizados e miniaturizados, que

identificaram o agente etiológico apenas em nível de complexo. A identificação

correta do patógeno em nível de espécie só foi possível através da análise do

sequenciamento de recA.

Em trabalho recente com 91 amostras de CBc isoladas de pacientes

hospitalizados em hospitais terciários no RJ (n=57) e São Paulo (n=34) de diferentes

espécimes clínicos, Burkholderia contaminans foi encontrada em 12 amostras

(13%), sendo a principal espécie isolada de hemocultura (83%) (Fehlberg et al,

2013).

Burkholderia contaminans também foi recentemente reportada como a mais

frequente (58%) dentre 66 pacientes com FC de dois centros de referência na

Argentina (Martina et al, 2013). Nosso grupo também encontrou pela primeira vez B.

contaminans em 3% das 100 amostras de CBc isoladas de secreções respiratórias

de pacientes com FC assistidos em um centro pediátrico no Rio de janeiro (Neto,

2013).

No presente estudo, a análise dos perfis de restrição gerada por PFGE das

amostras de Burkholderia contaminans do presente trabalho não apresenta um

clone disseminado causando surto. A análise da distribuição dos grupos clonais de

B. contaminans em relação aos setores de origem dos pacientes mostrou que dois

setores (nefrologia e hemodiálise) contribuíram com cinco pacientes e nove

amostras positivas em períodos de até 1,5 anos. Dois grupos clonais foram

encontrados em pacientes distintos em cada um desses setores, sugerindo

aquisição ambiental. Embora não possamos afirmar, é possível sugerir que

equipamentos e soluções de diálise empregados em nefrologia hospitalar sejam as

81

fontes potencialmente importantes de aquisição desse micro-organismo, como já

descrito na literatura (Magalhães et al, 2003; Gómez et al, 2008). Foi observado

também que, na maioria dos pacientes, grupos clonais diferentes foram encontrados

no mesmo paciente em amostras coletadas na mesma data, sugerindo uma possível

ocorrência de pseudobacteremia. Em conjunto esses dados reforçam o meio

ambiente como a possível fonte de aquisição desses microrganismos.

Intrigante é o fato da maior predominância de Burkholderia contaminans em

relação a outras espécies do gênero. Hipoteticamente, esse achado pode ser devido

a características intrínsecas à espécie, que permitiriam a sua manutenção no

ambiente; ou ainda por se tratar de uma espécie descrita somente em 2009,

anteriormente já causava infecções e era identificada pelos laboratórios como outro

táxon relacionado. Uma vez que as espécies do CBc são extremamente

semelhantes entre si, B. contaminans poderia estar sendo classificada como

Burkholderia cepacia, espécie antes referida como a mais frequente em surtos.

O conhecimento sobre metodologias para a identificação de espécies de

BGNNF incomuns deve ser aprofundado, aprimorado e discutido para a construção

de um perfil epidemiológico mais fidedigno. O conceito de microrganismos “raros” ou

“incomuns” muitas vezes esbarra na falta de ferramentas suficientes para o seu

conhecimento, assim patógenos ditos “raros” podem ser subestimados quanto ao

seu verdadeiro papel como patógeno e consequentemente com pouco incentivo

sobre estudos de virulência e patogênese. Aliado a isso, esses microrganismos são

resistentes naturalmente a muitos antimicrobianos usados na prática clínica e o

laboratório não dispõem de recursos padronizados para a determinação do seu perfil

de sensibilidade aos antimicrobianos. Assim é importante conhecer melhor não só

sobre metodologias para a identificação como também sobre os mecanismos de

resistência destes micro-organismos para o estabelecendo de estratégias

terapêuticas adequadas.

82

5 CONCLUSÃO

A identificação molecular das amostras de BGNNF incomuns em bacteremias

foi possível pela associação do sequenciamento de dois genes alvo: 16S rRNA e

recA ,que caracterizou dentre as 78 amostras de BGNNF 16 gêneros e 30 espécies,

com maior ocorrência de Burkholderia contaminans (24%), Burkholderia

cenocepacia (12%) e Pseudomonas stutzeri (10%).

As amostras de CBc somente puderam ser identificadas em nível de espécie

através do sequenciamento de recA, indicando a importância da adoção de

estratégias adequadas para a identificação de grupos mais intimamente

relacionados.

A comparação dos resultados da identificação obtida nos método fenotípico

manual com o sequenciamento mostrou resultados concordantes em 54% das

amostras em nível de espécie e 17% em gênero. Todas as amostras pertencentes

ao CBc foram corretamente classificadas pelo método fenotipico apenas em gênero

Burkholderia spp.

A identificação das espécies do gênero Burlkolderia, incluindo aquelas

bactérias do CBc, é dificill por métodos fenotípicos, mas pode ser facilitada, quando

comparado aos outros BGNNF menos comuns, pela utilização do teste da lisina, que

quando positivo, é um marcador importante. Como a maioria das espécies dentro do

CBc é positiva para esse teste, existe alta probabilidade de uma amostra ser incluída

nesse grupo.

A comparação dos resultados obtidos no MALDI-TOF MS frente ao

sequenciamento do genes 16S e recA mostrou concordância de 42% e 45% em

nível de espécie e somente em nível de gênero, respectivamente, das 78 amostras

de BGNNF. A causa principal das discordâncias entre os dois métodos deveu-se as

amostras do gênero Burkholderia e, em especial, pelo maior número de amostras de

B. contaminans, espécie que não constava do banco de dados do equipamento.

Com a exclusão dessas amostras da analise, os percentuais em nível de espécie

atingiram 60%.

A comparação combinada dos métodos fenotípico e proteomico, frente aos

métodos moleculares, mostrou concordância de identificação em percentuais

semelhantes, ao menos em nível de gênero, para a maioria das amostras. As

83

discordâncias entre as técnicas ocorreram principalmente devido a dificuldade de

identificação das espécies do CBc.

A análise dos casos de discordância dos métodos fenotipicos sugrem como

possíveis causas a similaridade fenotípica das amostras de BGNNF, que dificulta

significativamente a identificação por esses métodos. Essa similaridade se estende

também aos perfis proteicos que consequentemente impactam na identificação pelo

MALDI-TOF, além da ausência desses perfis no banco de dados do equipamento.

Nenhum dos três métodos utilizados foi capaz de, exclusivamente,

identificar todos os BGNNF estudados, apontando para a necessidade da utilização

de estratégias metodológicas combinadas para a identificação em nível de espécie.

Considerando a aplicação dessas metodologias em laboratório clinico, cuja

resposta deve ser a mais rápida possível, a identificação pelo método MALDI-TOF

MS é promissora, uma vez que poderá identificar esses BGNNF incomuns, com

segurança em nível de gênero, podendo ser aprimorado com a atualização

constante do banco de dados com novos perfis proteicos e com baixo custo de

insumos e rapidez maior que as outras técnicas disponiveis. .

O predomínio de Burkholderia contaminans (24%) em hemoculturas de

pacientes de uma mesma instiuição, foi surpreendente por ser uma das espécies do

CBc mais recentemente descritas dentro do CBc. O estudo dos perfis de restrição

enzimática após PFGE dessas amostras não apresentou um clone disseminado

causando surto. Além disso, a maioria das amostras isoladas de coletas múltiplas de

sangue no mesmo paciente, não mostrou relação de clonalidade entre elas. Estes

dados em conjunto reforçam o ambiente como a possível fonte de aquisição dessa

espécie.

84

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