Flow Cytometry and applications. [CITOMETRIA DE FLUXO E SUAS APLICAÇÕES] Portuguese

CITOMETRIA de FLUXO e suas APLICAÇÕES

Leandro F. Tarosso Pesquisador Adjunto

Laboratório de GenéBca Molecular e Mutagênese Depto de Ciências Biológicas, UNESP Assis-‐SP

Tarosso LF. Citometria de Fluxo e suas Aplicações. 2015. Palestra. Faculdade de Ciências e Letras, UNESP – campus de Assis-‐SP. 03/setembro/2015

ObjeBvos Apresentar e construir entendimento sobre: -‐ as caracterísBcas básicas e peculiares da Citometria de Fluxo, suas vantagens e limitações -‐ como é montado um experimento de Citometria de Fluxo -‐ os princípios básicos do funcionamento de um Citômetro -‐ como é feita a análise de dados de Citometria e como "ler" e interpretar dados de Citometria -‐ exemplos de aplicações do método Apresentar: -‐ a complexidade existente no delineamento, execução e análise dos experimentos -‐ opções de so#wares para análise -‐ organização de importantes laboratórios de Citometria de Fluxo -‐ formas de aprofundar o estudo sobre Citometria de Fluxo


Citometria de Fluxo

Tecnologia que simultaneamente mensura e analisa múlTplas caracterísBcas Wsicas (tamanho, granularidade, fluorescências) de parXculas únicas (0.2 a 150 um; ex.: células) em suspensão fluida através de um feixe de luz (laser).


CARACTERÍSTICAS


CaracterísBcas Tarosso LF. Citometria de Fluxo e suas Aplicações. 2015. Palestra. Faculdade de Ciências e Letras, UNESP – campus de Assis-‐SP. 03/setembro/2015

Preparo de amostras para análise por Citometria de Fluxo


Sistema de fluídos. Transporte das par\culas suspensas, em feixe, até interceptar um laser Sistema óp4co. Lasers que iluminam as par\culas, filtros ópTcos e espelhos que direcionam a luz resultante a detectores apropriados Sistema eletrônico. Conversão dos sinais luminosos em sinais eletrônicos que podem ser processados por computador

Citômetro de fluxo ConsTtuído de três sistemas principais:


Três sistemas principais


Componente: Fluido


Componente: ÓpBca


FILTROS ÓPTICOS


História do desenvolvimento de fluorocromos e lasers

Engineering advances: Op4cs: opTmal light collecTon and delivery to detectors; Signal processing: digital electronics; Data analysis advances: So#wares: rapidly processing raw data and spillover compensaTon; Tools: displaying and analyzing 20-‐parameter data

1974 Argônio laser (488nm)

1970s Krypton lasers

1983 HeNe lasers

Arc lamps

2001 Violet laser

Modificado a parTr de:


Luz e Fluorescência

Conjugação de mAbs a fluorocromos

Espectros de fluorescências de fluorocromos


Luz e Fluorescência


Componente: Eletrônica


Conversão de sinais eletrônicos para sinais digitais


ANÁLISE


FORWARD e SIDE SCATTERS


PMTs / canais / fluorescências

Histograma Dot-‐plot

anT-‐CD14 PE anT-‐CD4 FITC células


Controles de performance e análise Detectores e fluorescências

Compensação


Qualidade da aquisição: Parâmetro 'tempo'

Qualidade da aquisição: Exclusão de 'doublets' e agregados celulares


Compensação Tarosso LF. Citometria de Fluxo e suas Aplicações. 2015. Palestra. Faculdade de Ciências e Letras, UNESP – campus de Assis-‐SP. 03/setembro/2015

"(...) data should be collected and stored uncompensated; data for compensaBon samples should also be collected; and compensaTon should be computed and applied when the data are analyzed" "This recommendaTon, which is made in the strongest terms, goes against common pracTce. Errors introduced by compensaTng the data before collecTon are no longer tolerable in an era where fluorescence compensaBon can readily be done aser the (uncompensated) data have been collected and stored.


FMO (‘fluorescence minus one’)


Análise de viabilidade celular


Display e análise


Display logarítmico vs 'lógico' (ou bi-‐exponencial) para eventos duplo-‐negaBvos

Compensação


Complexidade da análise mulBdimensional em células únicas


APLICAÇÕES


ImunofenoBpagem


These findings demonstrate that normal and CSC-‐like cells can arise de novo from more differenTated cell types and that hierarchical models of mam-‐ mary stem cell biology should encompass bidirecTonal interconver-‐ sions between stem and nonstem compartments. The observed plasTcity may allow derivaTon of paTent-‐specific adult stem cells without geneTc manipulaTon and holds important implicaTons for therapeuTc strategies to eradicate cancer.

Ontogenia celular, maturação, toB-‐, pluri-‐ mulB-‐potência


Ciclo celular e apoptose Efeito anT-‐proliferaTvo e apoptóTco do ácido betulínico de sour jujube fruits sobre células de câncer de mama

Ciclo Celular marcação com Iodeto de Propídeo (PI)

Efeito anT-‐proliferaTvo / parada na fase G2/M

morte celular

viáveis

apoptose tardia

apoptose

Annexin V – FL1

PI – FL3

Apoptose marcação com PI e Annexin V

Aumento dose-‐dependente de apoptose


Análise de Proliferação celular


Análise CinéBca de Respostas Celulares


Análise de viabilidade de espermatozóides Tarosso LF. Citometria de Fluxo e suas Aplicações. 2015. Palestra. Faculdade de Ciências e Letras, UNESP – campus de Assis-‐SP. 03/setembro/2015

Análise de Estresse OxidaBvo (Espécies ReaBvas de Oxigênio)


Fagocitose


Detecção intracelular de patógenos: definição de infecção ou supressão de infecção

UngatedHIV Infection_p24 FMO.fcsEvent Count: 32098

0 50K 100K 150K 200K 250KFSC-A

0

50K

100K

150K

200K

250K

FS

C-H

95.9

singletsHIV Infection_p24 FMO.fcsEvent Count: 30796

0 50K 100K 150K 200K 250KFSC-A

0

50K

100K

150K

200K

250K

SS

C-A

98.4

lymphsHIV Infection_p24 FMO.fcsEvent Count: 30305

0 102

103

104

105

<PE-A>: p24

0

103

104

105

<F

ITC

-A>

: C

D4

6.6e-3

lymphsHIV Infection_0h-0,3a,1-a.fcsEvent Count: 33429

0 102

103

104

105

<PE-A>: p24

0

103

104

105

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: C

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3.98

lymphsHIV Infection_0h-0,3a,1+b.fcsEvent Count: 62766

0 102

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104

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<PE-A>: p24

0

103

104

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: C

D4

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lymphsHIV Infection_48h-0,3a,1+a.fcsEvent Count: 78203

0 102

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<PE-A>: p24

32.5


0 102

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<PE-A>: p24

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0 102

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<PE-A>: p24

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0 102

103

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<PE-A>: p24

24.7


0 102

103

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<PE-A>: p24

18.6

HIV negative (0E:1T)

HIV positive (0E:1T)HIV positive (4E:1T) HIV positive (2E:1T) HIV positive (1E:1T)

VSA IPatient=Vif01-0006CD8 T cell line= Vif01-0006: Nef34Virus: NL43

48h0h

HIV positive (0E:1T)



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0

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150K

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250K

FS

C-H

95.9


0 50K 100K 150K 200K 250KFSC-A

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50K

100K

150K

200K

250K

SS

C-A

98.4


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0

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6.6e-3


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!"#$%&'()&*+,-#$ .&'()&*+,-#$(infecção experimental com HIV-1 NL43)

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<PE-A>: p24

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<PE-A>: p24

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,-%&'(%."/01*+ Figura 9. Ensaio de supressão viral (ESV) com linhagem de celular T CD8+ do indivíduo Vif01-0006, específica para o peptídeo 15-mero Nef34:IRYPLTFGWCFKLVP. Células T CD4+ foram isoladas de CMSP, ativadas por 48h e infectadas experimentalmente com o isolado NL43 de HIV-1 (células alvo, A). Imediatamente após a infecção, células da linhagem de linfócitos T CD8+ específicos a Nef34 (células efetoras, E) foram adicionadas em razões 1E:1A, 2E,1A e 4E:1A, ou não foram adicionadas (0E:1A). As células alvo infectadas foram detectadas por citometria de fluxo pela detecção intracelular da proteína viral p24 após 48h da infeção e início da co-cultura. As células efetoras foram capazes de eliminar as células alvo infectadas em 36%, 48% e 61%, quando adicionadas nas razões 1E:1A, 2E:1A e 4E:1A, respectivamente. Tarosso, LF. Doutorado, 2013


Análise de microorganismos

Detecção e quanTficação Diferenciação de formas / fases Resistência a radiação

SuscepTbilidade a anTbióTcos


Pesquisa e Desenvolvimento de Vacinas Tetrâmeros de MHC Resposta imune epíteto-‐específica


Encurtamento telomérico


Sor4ng


Citometria de Massa


RECURSOS


So@wares FREE para análise


Fornecedores e Fabricantes


Core Facili4es DFCI Flow Cytometry Facility Dana Farber Cancer InsTtute, Harvard University Boston -‐ MA, EUA FlowCytometry.dfci.Harvard.edu/


Core Facili4es London Regional Flow Cytometry Facility Western University London -‐ Ontario, Canadá Robarts.ca/london-‐regional-‐flow-‐cytometry-‐facility


Core Facili4es Department of Oncology Flow Cytometry Facility Faculty of Medicine & DenTstry, University of Alberta Alberta, Canadá Oncology.med.uALBERTA.ca/Research/MulTUserFaciliTes/FlowCytometryFacility


Core Facili4es

Carver College of Medicine University of Iowa Iowa City – IA, EUA Healthcare.uIOWA.edu/corefaciliTes/flowcytometry/


Flow Cytometry and applications. [CITOMETRIA DE FLUXO E SUAS APLICAÇÕES] Portuguese

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