F F Screening and identification of acrylamide degrading ...

123
Screening and identification of acrylamide degrading bacteria from domestic wastewaters in Chonburi province UTHUMPORN THANYACHAROEN

Transcript of F F Screening and identification of acrylamide degrading ...

�������������� ��������������������������������� ������������

���� ������� Screening and identification of acrylamide 0 degrading bacteria from

domestic wastewaters in Chonburi province

�����9� :�;;����; UTHUMPORN THANYACHAROEN

G������ ���H�������IJ��� ���KL�M�����NK�O�P������QP�I��;;� ���N��P���RS�P

��M� ����� ���� �R� ���N��P�� ��� �����Q�9� �M���:�T�IJ�M����� �����Q�9�

���������� ����� ����������������� ����������������������������� ���� � !"�! # �������!��"�

!$%� ���& ������"�"�' (�))���) ��� ���& 47031602 �����1& �����2��&��34�& (!�����) ��������%78�9� �.�.��&&��� ���)'� �! 7;��28�9� 2550 3�������������'���3����������=��� � ���� ��> ������7? ��� � 8%������28�9�&�������1&7�))������2��&��34�& ������!�!����� 3������2��&� ������������1'� ..............................................................................7�(� ���� �����������%78�9�

(�.�.��&&��� ���)'� �!) ..............................................................................����

(@2.�.��������) 2��"�) ..............................................................................����

(@2.�.�"���& � �� ��&) A���!�!������ "��&������������=��� � �7? ��� � 8%������28�9�&�������1&7�))������2��&��34�& ������!�!����� 3������2��&� ������������1'� ..............................................................................@1���9��!���� ���� ��A���!�!�����

(�.�.��&&��� ���)'� �!) �� ��%......./......./.......

���������� ����� ����������������� ����������������������������� ���� � !"�! # �������!��"� !$%� ���& ������"�"�' (�))���) ��� ���& 47031602 �����1& �����2��&��34�& (!�����) ��������%78�9� �.�.��&&��� ���)'� �! 7;��28�9� 2550

�������

����������7? ����%��'�9&�����7���������� �� ����%���7? ��������>� ����C'������%��7# (�!�&� ���7 �7DE� ��������� ��@��&����"&������������������ ��#������� ����������'���7F����'$! # ��28�9� � � #���%����������������� ����������������������������� ���� �!"�! # �������!��"� �������� �����"�&������� ���� �# �������$�&%����%������������7? ��������� ���� �&�� '�����������������������%�����93������3G� ������&�&����� 3 ���H��� ��$%� ������������H�������> ������'�%�7���3!� �� � "��9� 16S rRNA ����� �'�H���� ���@��&A�34�� �� 1,060 1���� ������� @��&A�34� '�H������%��������1�'������ pUC118 �����������7������������1������� �������������!� �� 16S rRNA ��%������G� ����1���� ���� ���������'� (��������� ����S ��� '�������H�����% 1 �����1�# ���������"� Enterococcus faecalis �3���%���H�����% 2 ��� 3 �����1�# ���������"� Klebsiella pneumoniae

PROJECT TITLE Screening and identification of acrylamide h degrading bacteria from domestic wastewaters in Chonburi province NAME Miss Uthumporn Thanyacharoen STUDENT NUMBER 47031602 PROGRAM Bachelor of Science (Biochemistry) ADVISOR Jittima Charoenpanich, Ph.D. ACADEMIC YEAR 2007

Abstract

Acrylamide, a neurotoxin and suspected carcinogen, is typically found in nature as contaminant in industrial processes and during the heating of plant-starch food. In this study, we focused on screening and identification of acrylamide h degrading bacteria from domestic wastewaters in Chonburi province. The wastewater samples were cultivated in minimal medium containing acrylamide as a sole carbon and nitrogen sources. Three isolates that showed different morphological characteristics were found. Their chromosomal DNAs were extracted and the 16S rRNA genes were PCR amplified, which gave the PCR products about 1,060 bp. After that the PCR products were cloned into a cloning vector, pUC118 and used as templates for nucleotide sequencing. Homology searching and phylogenetic analysis showed that the acrylamide-degrading bacterium isolate 1 belongs to Enterococcus faecalis whereas isolate 2 and 3 belong to Klebsiella pneumoniae.

I����N��RQI��� ������������!�����=��� � ����>��������� &�����������'�"3 �.��&&��� ���)'� �! A���!�!����� ��������%78�9��7? ������1���%����"3�� � ��� �������#�������&���y �� �# A��z9{� ���7|���&�����������#�#������ �������%�# ���7��>�&���������%��������� ��C8�!�����������������=��� � #����>����13� ���'����1��8�H��H8 ����7����#��7? �������%� ��������'�"3 @2.�.��������) 2��"� A���!�!����� ��%�"3����7? ���� �����������%��� # ��� ��!�����%���%������������������ ���� �#����� � ��� ����# ������������'���&���y ������������# � � � ��������'�"3 @2.�.�"���& � �� ��& A���!��"�!������� ��%�"3���������������7? ���� ���#����� � ��� ����# ������������'���&���y ������������# � � � ��������'�"33�����A���!�!������"���� @1�H8%������%��� #�����1�&���y �� �# ��� ����� ��������� � !���& ��C8����1�����#�#���7? ������� �����"33������2��&� ������������1'� ��%#���" � ��� " �� ����� 7����7;��7���3 2550 ��������#!�����# �$%�������������������=��� � ��������'�"3 "3'�����"3�����%���7? ������#� ��������%��� ��&���� �1� � 7����������>� ���� ����#� ��������%���7? ���� ���#��������#� �����'�"3'�%7����3 ���� ��%���1���$%���$�&���y �����"3�'$%� A���!�!�����"� ��% 7 �"� ��%!������$�����7? ������#�#���� �����&��� �"�"�' (�))���) 1 �"�A�'� (� 2551

=

�����;

� �� 7�# ........................................................................................................................................ � � ��� "��&�................................................................................................................................ � �������A�9����................................................................................................................... �������A�9�����z9.............................................................................................................. � 7���2"317��..................................................................................................................... � ����)..................................................................................................................................... = ����)&���........................................................................................................................... } ����)17A�'......................................................................................................................... ) ����% 1 �� ��.......................................................................................................................... 1

1.1 ����7? ������������)���7~)��............................................................... 1 1.2 ��&C"7��������������................................................................................ 2 1.3 ���&�G� ����������.................................................................................... 2 1.4 7���! ���%����������������������.......................................................... 2 1.5 �����&����������....................................................................................... 2

2 �z9{������ �������%���%������...................................................................................... 4 2.1 �z9{�.................................................................................................................... 4 2.1.1 ���������................................................................................................ 4 2.1.2 �"�� �����������������......................................................................... 5 2.1.3 ��������� �! ������������................................................................. 9 2.1.4 !� �� � "��9� 16S rRNA........................................................................... 10 2.1.5 7|������'�H����............................................................................................ 12 2.1.6 ����>��&���H��......................................................................................... 14

2.1.7 �� ������> ���1�@�������1��H���������� ...................................................... 16 2.1.8 ������$������> �����@��........................................................................ 17 2.1.9 ���������� �����������������> ��......................................................... 18

2.2 �� �������%���%������................................................................................................. 22

!

�����; (P��)

����% � �� 3 ����" �"7�3� ����� �����(��������.................................................................. 25 3.1 ����" ����"7�3�.................................................................................................. 25 3.2 �����.................................................................................................................. 26 3.3 ��(��������........................................................................................................ 30 3.3.1 ���������������������������...................................................... 30 3.3.2 ��������� ����������%����$����������� ��������������3� "��9� ���!� �� 16S rRNA........................................................................................... 30 3.3.3 ���������������'� (��������� ����S ���.................................... 35 4 @��������............................................................................................................... 36

4.1 ���������������������������................................................................. 36 4.2 ����������H�������> ��������������%��������..................................... 36 4.3 ���'�%�7���3!� �� � "��9� 16S rRNA ���7|������'�H����.......................... 40 4.4 ��������"�(��@��&A�34�'�H����........................................................................... 40 4.5 ���� @��&A�34�'�H����.................................................................................. 43

4.6 ��&�����!� �� 16S rRNA # '���������@�������&�������� �H�� &������'��..................................................................................................................... 43 4.7 ��&�����!� �� 16S rRNA # '���������@������� �'�H����.......... 47 4.8 ���������� ����������������7��������������$� ��������� �������������!� �� 16S rRNA ���G� ����1������� �������������............... 47 4.9 ���������������'� (��������� ����S ���.............................................. 47 5 �A�7�� �"7@�������� �������� �� �.......................................................... 55 5.1 �A�7��@��������.......................................................................................... 55 5.2 �"7@��������................................................................................................ 58 5.3 ����� �� �......................................................................................................... 59 ������������............................................................................................................................ 60 A�@ ��.................................................................................................................................. 64 A�@ �� � ���&��������............................................................................................... 65 A�@ �� � '������ pUC118.............................................................................................. 70

H

�����; (P��)

� �� A�@ �� ��(����� �3��������� �������> ��............................................................ 71 A�@ �� � 17��������� ���������� (DNA sequencing profile)................................. 72 A�@ �� � @����7�������������� ������������%������G� ����1� �������������.... 78 A�@ �� = ���7��������������$� ��������� ����������# !� �� � "��9� 16S rRNA....................................................................................................................................... 95 A�@ �� ! ��������'�������� �������������!� �� � "��9� 16S rRNA..................... 101 7���&������� ���&.................................................................................................................. 113

}

�����;P����

&�����% � �� 2-1 @���&����7 �7DE� ������������# ����# 7���2����� ���

��� ���� ��������!�&������ ................................................................................. 7 4-1 ���93���� �����!$ ����������%���������&������� ������������� ���� ���� !"�! # �������!��"�................................................................................................ 37 4-2 �����1���$ �����% 260 �� ��&, ��&���� A260/A280 ������������ ��%��� ������� �3�������H�������> ����%�������................................................... 38

)

�����;�QI

17��% � �� 2-1 ������������������������............................................................................ 6 2-2 ���������������������%������7? �7������!��A�'........................................ 8 2-3 �� 16S rRNA........................................................................................................... 11 2-4 �� &� ������7|�������1��H��'�������................................................................. 13 2-5 ���������� �����������������> �������(���� Sanger......................................... 19 2-6 ���������� �����������������> �������(���� Maxam-Gilbert............................ 21 4-1 ����H�������> ����%������������������� � 3 ���H���................................... 39 4-2 @��&A�34����7|������'�H�������!� �� 16S rRNA................................................. 41 4-3 @��&A�34�'�H�������!� �� 16S rRNA ������������ � 3 ���H�����%@�� �����

���"�(��........................................................................................................................ 42 4-4 @��&A�34�'�H�������'������ pUC 118 ��%C1�&�������� �H��&������'�� BamHI

��� HindIII................................................................................................................ 44 4-5 '���������@����%���������� ������7|�������!$%��@����� pUC118 ���

!� @��&A�34�'�H���������������� � 3 ���H���.................................................... 45 4-6 @���&��'���������@�������� �H��&������'�� BamHI ��� HindIII................ 46 4-7 @��&A�34�'�H�������!� �� 16S rRNA ��$%�#!�'���������@�������������� �

3 ���H����7? ����> ��������.................................................................................. 48 4-8 ������ �������������!� �� 16S rRNA �������������H�����% 1.................... 49 4-9 ������ �������������!� �� 16S rRNA �������������H�����% 2.................... 50 4-10 ������ �������������!� �� 16S rRNA �������������H�����% 3.................... 51 4-11 �@ A�'����� ����S ���� '$ G� ���!� �� 16S rRNA �������������H �����% 1 ��%��������................................................................................................... 52 4-12 �@ A�'����� ����S ���� '$ G� ���!� �� 16S rRNA �������������H �����% 2 ��%��������................................................................................................... 53 4-13 �@ A�'����� ����S ���� '$ G� ���!� �� 16S rRNA �������������H �����% 3 ��%��������................................................................................................... 54

1

����� 1 ����

1.1 �� ���� ����� ������������

��������� (acrylamide) ������������������������ � !"#�������$%&'()���� *��+,�-�.���/0�)��# ,%1��� α *�� β (α,-β unsaturated olefin) �%�����+�:;�<����������)<=� )�'()>,�?���� (sulfhydryl) ��.�� "� (Bergmark et al., 1991) ����������������!"#"+�: )����������! (Tilson et al., 1979) *��"*�%.�$!"#H���������)����I< (Segerback et al., 1995 *�� Tareke et al., 2000) �������������O+��&()!,#%�P�-��1� � *��O(�P1$�&)�<�%$�<;%�<P�����%����=�� !�<�Q ��'��� .�&P1$�������!"#1)%&P����+���������� ���!R�P'$*;I< *��P1$P�����%�����R��,��SR���"& H�����P1$���.&1��;�<����������&)�<*+�)'��& �)<=�P'$"�������TU��;�<���������!"#��)�&�H������%�����Q ��'���!,S<P���� *����#<*%��$�!"#�����SR� (Cherry et al., 1956 *�� Prasad, 1982)

�Z#���I%[�"S "����$�+�����)� ,%;�<���������P���'��HR�+%�*�\<!"#�$H��+Z1]�&'�,<=)������%������Q<* )<!"# $�<����Q^'](��(< �1)� ���!��*������� (Tareke et al., 2000, *�� Tareke et al., 2002) .�&�)��=)������%������Q<* )< ��'���'�)��"SH�"�������������TU��P����,�!"# �%H���)�$*��H�"���,��+�#�(<;_S�O_< 2.3 ������, )���.���, ]�&'�,<����%������Q<* )< (Svesson et al., 2003) ����)� ,%;�<����������1Z#�%)��H��=�� ],^b�;�<�c�����&�������� (Maillard reaction) ��'%)�<������.�*��+���H"� (asparagine) *���SR� ����(.�� (glucose) '�Z��SR� ��/�Q�. � (fructose) ��'%)�<����%������Q<* )< (Gökmen and Hamide, 2007, Mottram et al., 2002 *�� Stadler et al., 2002)

H����" O_<�iHHQ�,�"�����&<��+�HQ���!�"&�'��&1���!"#����OP1$���+�:;�<���������P��(�*��.���Q���"#&%����*'�)<��"&%;�<�������*��+�,<<���R�'�,�����H��j (Nawaz et al., 1993, Nawaz et al., 1994a, Shanker et al., 1990, Wang et al., 2001 *�� Zabaznaya et al., 1998) .�&+�%)�;,S� ��*��;�<������&����H���c�����&��"�����1,#� (deamination) ;�<���>��"������ (deamidase) ���"#&������������������������� (acrylic acid) '�Z�!"#�($H,�P�1Z#� ������� (acrylate) (Nawaz et al., 1998, Nawaz et al., 1994b, Shanker et al., 1990 *�� Zabaznaya et al., 1998) H���,S�������� H�O(����& )�.�&���>�!"#��"#&%;$�<P�����%�������&������� !"#"��<P��>���;�<HQ���!�"&��,S�

�iHHQ�,�"������&Q� �P1$���>�!"#=�� H��HQ���!�"&� '�Z��>��� �_<P�������&��� ��$�<H������%�����Q ��'���*�������'�� ��Z#�<H������%�-"!"#���'&,� �%���I% *���1Z#�%)�)����=�

2

���!�]�&'�,< H���%� $�<����'�)��"S!R�P'$<��%�H,&q�,��"S"��\�'�&!"#H��,�*&�*��H,�HR�*�� HQ���!�"&�!"#����O���&���������H��*'�)<�SR�!�S<1Q1� >_#<��������%^!"#"������;�<�����SR�,�!"#�$H�������Q<* )<��'��.�&P1$�%��$�� ��Z#�<H�������"����' Q'�_#<!"#!R�P'$��������)��(�;�<��- ��������,<!"#��)�%�*�$%;$�< $� .�&HQ���!�"&�!"#�,�*&��$����O�R�����&Q� �P1$P�����%�����R�H,����+�: ��$�<;�<���������!"#����H������%�����Q ��'���*������%������Q<* )<��'�� )��

1.2 ������ ����!���" �#���

�+Z#��,�*&�*��H,�HR�*��*��!"��"&���&���������H��*'�)<�SR�!�S<1Q1�P�H,<'%,�1��Q�"

1.3 � �%&����" �#��� 1. ��Z#�<H��*'�)<�SR�!�S<;�<1Q1���������%^!"#"������;�<�����SR�,� !"#�$H�����!��

��'�� >_#<"*�%.�$!"#H�"�������TU��;�<��������� H_<�)�H� �%H+�*��!"��"&!"#����O���&����������$ 2. +���������!,#%�����O�+�#����^1�S�&"���Q�,�:� 16S rRNA ;�<*��!"��"&!"#�,�*&��$ *��H�����%������'��R��,���%��".�!��;�<1�S�&"���Q�,�:� 16S rRNA !"#� �"&�$���"&��!"&��,�;$�(��R��,���%��".�!��P�t��;$�(���%��".�!��.�� H�����OH,�HR�*����&+,�-Q�*��!"��"&���&���������!"#�,�*&��$

1.4 � �()*�!����#�+,�-#. ��,"" �#��� �R�*��!"��"&!"#�,�*&��$�u_�:�����%�������&��������� �+Z#�!R�����,�*&�*��!"��"&!"#

"u,�&]�+P�������& �R�'�,����&Q� �P1$P�����%�����R�H,����+�: ��$�<;�<���������!"#����H������%�����Q ��'���*�������Q<* )<��'�� �%!,S<P1$���� ,%��)<�c�����&�!�<1"%]�+�R�'�,�����%����=�� �����������P����,��Q ��'��� )��

1.5 ���������" �#��� �,���Z��*��!"��"&!"#����O�H��jP���'��!"#"�������������*'�)<��"&%;�<�������*��+�,<

<��H�� ,%�&)�<�SR����<*��*'�)<�SR�!�S<;�<1Q1� .�&�Q)��I� ,%�&)�<�SR�H������%^!"#"�����SR�,� �R�'�,����H,�HR�*����&+,�-Q�;�<*��!"��"&!"#�,�*&��$ !R�.�&�����,�.��..>���"��I���H��*��!"��"&*�$%�+�#����^1�S�&"���Q�,�:� 16S rRNA !R����.���1�S��)%�;�<&"�!"#� �"&�$�;$��()�"��I���+�'�*�$%���Z#���()�>���P'$��u,& �,���Z���"��I�����&=� !R����%������'��R��,���%��".�!��*��

3

���"&��!"&�;$�(��R��,���%��".�!��P�t��;$�(���%��".�!��.�� �%!,S<%������'��%��,+,�-�!�<%<��%��%�%,v�����;�<��&+,�-Q�*��!"��"&!"#�,�*&��$

4

����� 2 �012�������%,�)����"��)��.��

2.1 �012� 2.1.1 ��� %�- #! (SUBSTANCE PROFILES, 1991) �������������;�<*;I<.���Q���"#&%!"#"�"�)��H�O_<�";�%����P��(�=�_� !"#����O����&�$P��SR� �!���� ��!���� ��!������ ��� *����>�. � * ))����&P����>"� *���?��!� HQ�'���'�%;�<����������&()!"#�Q^'](� 84 O_< 85 �<u��>��>"&� *��"HQ���Z��!"#�Q^'](� 125 �<u��>��>"&� =�_����������.���Q���"#&%���� ����!"#"�%�����Q!-�}O_<�$�&�� 98 *���$�&�� 95 ��_#<'�_#<;�<���������!"#+�,�H��&()P��(�!"#�����������& �Q^��, �P��������.���Q���"#&%;�<���������!R�P'$���%�P���������c�����&�.+������>1,#� (polymerization) !"#HQ�'���'�%'�Z�]�&P $�,<�"�,� ��%.��� ���������!"#����;�<*;I<H�"�%���O"&�!"#�Q^'](�'$�< * )H������c�����&�+�������>1,#��&)�<�Q�*�<�Z#�O(�'���'�% '�Z��%�&()�,�������>���� (oxidizing agent) H�����u_�:�.��<��$�<;�<���������!"#=)���+�%)� ������������������������ �����]!����/� ������ (aliphatic amide) (Tilson and Cabe, 1979) >_#<�������$%&'()���� *��+,�-�.���/0�)��# ,%1��� α *�� β �,<*��<P��(�!"# 2-1 .�&�����������&P1$������� ,%���<!�<��"P����=�� *������,<�����'�.+�"��������� (polyacrylamide) >_#<����.+�"����!"#"�SR�'�,�.���Q��(<����O�,�*��<�Q^��, �������������� (nonionic) *�������� (anionic) '�Z�*�!������ (cationic) �R�'�,�����R��P1$P��%�HR��+��!"# )�<�,� .�&���������H�P1$� ��R�'�,�����R��,��SR���"& �+�#����R���,��Z�;�<�SR�,� ���!R�P'$�����Q& ���!R������: ���!R�'�� *������R�H,���#<.�.��� H_<!R�P'$�����������TU��;�<���������!,S<P���� *���SR�!"#+�P�-��1� � "�' Q=�&Z�&,�!"#���%)����������H���������)����I<P��Q:&� >_#<�$"���!���<P��, %� !���< �1)� '�( .�&P'$'�(�Z#�SR� *�$%%������'�����+�#;_S�;�<����������$%& /�.�.��.>.!*� (pheochromocytomas) *��".>!"��.�*� (mesotheliomas) +�%)�"����+�#;_S�;�<���������H��< *���Z#���I%[ �"S "��� �%H+��������TU��;�<������������P���'��!"#�Q���$%&����.�?-���!!"#�$H��+Z1 .�&�q+��,���,#<!������'�Z�,���,#<1�S�!�� >_#<������'��'�,�;�<1�%&Q.��*�������� =�H����� �%H�����'��P�����!u�%"���+��������TU��;�<���������P���'��'��&1��� �,<*��<P� ���<!"# 2-1 �������������"S���� ,%���!"#!R�P'$&"����"#&��(��R���()�������.�����I<'��&1��� *��&,<����+�: )����������!�"��$%& ������������)�$O(� �%H+��q+��P�����%�=�� ��'���!)��,S�&,<����O+��$P��SR��Z#�$%& ��Z#�<H��������������!"#�&()P��(�;�<

5

.+�"���� >_#<)"�%�����+�:�$O(��R��P1$=�� �����$���<�+Z#��R�������!"#) $�<������H���SR��Z# �$%&�' Q�"S!�<�']�+&Q.��H_<�$�R�'��� �t���%�����],&%)� $�<"������������!"#���,��%��;$;$�)���� 0.1 .����, )��SR��Z# 1 �� � *����'����<1����']�+&Q.���$�R�'��P'$���,�;�<���������!"#����TU���()��'�� $�<)���� 0.01 ������, )���'�� 1 ��.���, �+Z#��%�����],&�R�'�,�=($���.]� 2.1.2 ,��%�� �)!��)��� %�- #! (Nawaz et al., 1998)

HQ���!�"&�!,#%�����O&)�&���&���+%�����/� ������*����.�� ������ (aromatic amide) * ))����O&)�&���&����������$ ��Z#�<H�����������"=����� ,%&,�&,S<'()>,�?����;�<.�� "�!"#����O&,�&,S<����H��j;�<HQ���!�"&��$ HQ���!�"&�!"#����O���&���������H�P1$�����-��������*'�)<�������*���. ��H�P�����H��j .�&"��&<��+�HQ���!�"&����&����������$!,S<P�*'�)<�SR�*����� �1)� Rhodococcus sp., Rhodococcus rhodocrhous J1 *�� Pseudomonas chlororaphis B23 ���� $� ���u_�:�!,S<'��,�O_<�iHHQ�,�+�%)�P�;,S� $�;�<������&���������H������c�����&��"�����1,#����"#&�������������������������'�Z�!"#�($H,�P�1Z#� ������� �)%����P1$���.&1��;�<������� )��P�*��!"��"&+%�!"#P1$���������&,<)"��&����"&�*�)1,� "���u_�:��,�:^��q+��P�*��!"��"&'��&1���!"#����O���&������� *�� $�<������>��H� +�%)��*!����->_;�<������� ����H���c�����&�?.��>���1,#� (hydroxylation) ������ �-?����>".++.��� (β-hydroxypropionate) >_#<H�O(����>���� )�����������������>�� '�Z������c�����&��"�,�1,#� (reduction) ����.+�+.��� �%�* � )�<;�<���P1$���.&1��;�<������� ]�&P $�]�%�!"#)"���>��H�P� Clostridium propionicum �Z�����O�������',�������� ������>�� (acetate) *��.+�+.��� (propionate) ���H���"S&,<+�%)�������� ���� ,%�,�����I� �� ,%�Q�!$�&;�< Desulfovi- brio acrylicus �)%�.++.��� !"#=�� ;_S�H�)O(��*!����� )���+Z#�P1$������� ,S< $�P�����H��j *���)%���,��>���;�< C. Propionicum *��<��������c�����&��"?���1,#�!"#'();$�<;�<*�I�� ������������ *��<P'$�'I�O_<�%�������$;�<�c�����&�&$����,�P�����%�������&������� (Wampler and Ensign, 2005) �,<*��<P��(�!"# 2-2

6

3���� 2-1 .��<��$�<!�<��";�<��������� (!"#�: http://www.stami.no/IPS?module=Articles;action=Artic... �Z��$��Z#� 28/08/2550)

7

� ���� 2-1 =���� �%H�������TU��;�<���������P���'��P�����!u�%"��� .�&�R��,�<����'��*')<1� ��%"��� (Swedish National Food Administration: SNFA)

����^���������!"#+�(.����,/��.���,)

��Q)��'��!"# �%H

�)�,-&t�� �)� #R��Q�-�(<�Q�

HR��%� ,%�&)�<

,���,#<*=)�!������ 1200 330-2300 14 ,���,#<1�S�!�� 450 300-1100 9 ����� *��;��i<*��I������ 410 <30-650 14 ;��i<���� 140 <30-1900 21 -,j+Z1!"#P1$������'���1$� 160 <30-1400 15 ;$�%.+�*=)����� 150 120-180 3 ;��i<�Q) 50 <30-160 20 ��'��!���Z#�[ �1)� +�>>)� *+���$� %,/�/0� 40 <30-60 9 (!"#�: http://webdb.dmsc.moph.go.th/ifc_toxic/a_tx_1_001c.asp?info_id=285 �Z��$��Z#� 12/01/2551)

8

3���� 2-2 ���������&���������!"#"�%�������$!�<1"%]�+ (!"#�: Wampler and Ensign, 2005)

deamidase

9

2.1.3 " ,�#,���"*�%#��������� �) (�<�,�:^� *����"1� �Q%��^+���H, 2548) ���HR�*������]!HQ���!�"&�"���H,��R��,��&)�<�������� >_#<HR�����H� $�<!����,�:^�;�< HQ���!�"&��)�� .�&���O_<�%��,+,�-� *���%�* � )�<��'%)�<��#<"1"%� )�<[ �!�:�"%�%,v�����;�<1������ ����%�� >_#<��)�%%)���#<"1"%� !"#"�,�:^� )�<[ ��$�&�,�����=���Z#�<H���Z�!���H�����+�Q�Q:�)%�,� �,<�,S����H,���#<"1"%� ����'%�'() H_<*��<P'$�'I�O_<�%��,+,�-�!�<%�%,v�����;�<��#<"1"%� �$ .�&!,#%��,�:^�!"#�R��,j;�<HQ���!�"&�!"#P1$����'�,���^b�P����H,�HR�*��1��� �$*�) 2.1.3.1 �,�:^�!�<�,^t��%�!&� (Morphological characterization) H�!R����u_�:�H���1ZS�����Q!-�} .�&���+�H��^�H��;��� �(��)�< .��<��$�<;�<�1ZS�HQ���!�"&� ��Z#�<H��* )���>���";�����I���P����,�����.��� � P����u_�:�H_< $�<P1$��$�<HQ�!��u��!"#"�R��,<;&�&����^ 1,000 �!)� *��&,< $�<P1$��$�<HQ�!��u������I� ���!"#P'$��&����"&���;_S� �&)�<��I ��(��)�<�,�:^�;�<�>���)�$���O_<�%��,+,�-�!�<%�%,v��������,� * )��HP1$P���� �%H���1���;�<*��!"��"&�$ �1)� .��<��$�<;�<���.������ (endospore) '�Z� */���H��� (flagella) 2.1.3.2 �<��������!�<��";�<�>��� (Chemical composition) �>���;�<HQ���!�"&��������$%&������!�"&�!"#* � )�<�,����& �1)� ���"��.++��"*>I���-��� (lipopolysaccharide) !"#=�,<�>��������,�:^�;�<*��!"��"&*���� >_#<)����O+��$P�*��!"��"&*���%� '�Z�P�*��!"��"&*���%�!"#"���!.���� (teichoic acid) !"#=�,<�>��� >_#<)+�P�*��!"��"&*���� ���� $� 2.1.3.3 �,�:^�;�<�����"S&<�>��� (Cultural characterization) HQ���!�"&�* )��1��� $�<��������'��P�����H��j!"#* � )�<�,� �1)� ��<1�����"S&<P���'����"S&<�1ZS�P�'$�<�c��, �����$ ��<1�����"S&<P���'��!"#"�������!�"&��!)��,S� * )��<1��� $�<���������!�"&�'��&1��� �1)� ������.� �SR� �� +�����"� %� ��� *��.����>� ���� $� HQ���!�"&�&)�"�%� $�<����]�+*%��$�P�����H��j!"#* � )�<�,� �1)� �]�%�!"#"�Q^'](� #R� *�����>�I"�%�HR����� ��Z#�<H��HQ���!�"&���<1���HR����� $�<P1$���>��H�P�����H��j * )��<1���)HR����� $�<P1$ ���H���"SHQ���!�"&�* )��1���&,<"�,�:^�����H��j!"#* � )�<�,� �1)� ��"S&<P���'���'�%H�"������H�&�� '�Z� � ����!"#�$�'��� '�Z�����/0����<[ !"#=�%'�$���'�� �)%�P���'��*;I<H��H��j����.�.��"!"#�<�'I��$�$%& ����)� >_#<H�"�,�:^�* � )�<�,�;�<;��� �(��)�<�,�:^� ��ZS� �%�'�Z� *���" 2.1.3.4 �,�:^�;�<�*!����>_ (Metabolic characterization) �*!����>_ (metabolism) �Z� �c�����&�!�<��"!"#!R�P'$��������%�����R��<1"%� ;�<�>��� �c�����&��"SH�* � )�<�,� �1���;�<HQ���!�"&� �1)� HQ���!�"&���<1��� $�<P1$+�,<<��H��*�< '�Z���<

10

1���P1$+�,<<��H���c�����&����>���1,#� (oxidation) ;�<������!�"&�'�Z��������!�"&� ���H���"S%�O"P�����,<�����'��<�������� )�<[ ;�<�>����I* � )�<�,� 2.1.3.5 �,�:^�!�<+,�-Q��� (Genetic characterization) ���+,�-Q���P��>���H�"�,�:^��<!"#����������"#&�*��<�$�$�& H_<�R��1)%&P����HR�*��HQ���!�"&��$.�&u_�:�H�� - �<��������;�<���P���&�"��I��� (DNA base composition) �"��I����������$%&�();�<��� �Z� �%��"� (guanine, G) �()�,�>. >"� (cytosine, C) *�� ���"�"� (adenine, A) �()�,�!"� (thymine, T) >_#<HR��%�;�<�����%��".�!��P��"��I���H���������$�&��;�<�%��"��,�>.!>"��%�,�!"#��"&�%)� .�% G+C (mol% G+C) !"#H�* � )�<�,�� �1���;�<HQ���!�"&� ,S<* )�$�&�� 23 O_< 75 - �R��,���%��".�!�� (nucleotide sequence) P���&�"��I��� ����'�,���^b�!"#�R��,j!"#�Q�P����H,�'%�'()HQ���!�"&� ��Z#�<H���R��,���%��".�!��P���&�"��I���"�%�HR��+��P�HQ���!�"&�* )��1��� 2.1.2.6 �,�:^�!�<���%u%�!&� (Ecological characterization) O�#�!"#�&();�<HQ���!�"&�"�%��R��,jP��������,�:^�;�<HQ���!�"&��,S�[ ��Z#�<H��HQ���!�"&���<1�������O�&()�&)�<���H�&!,#%�P�-��1� � * )��<1���H�HR��,�!"#�&()P���<����%^�!)��,S� 2.1.4 *%5�)����� �"1! 16S rRNA (http://www.thaiscience.com/lab_vol/p23/PCR-DGGE.asp �Z��$��Z#� 06/01/2551)

1�S�&"���Q�,�:� 16S rRNA ����1)%<��&�"��I���!"#"�',��R�'�,������$�<�.�.>+��$P�*��!"��"&!Q�1��� ���"&��'Z��&"���&�>I� (signature gene) !"#"�%�* � )�<�,�P�*��!"��"&* )��1��� *��"��<1)%<;�<��&�"��I���;�<&"� 16S rRNA !"#�'Z���,�P�*��!"��"&!Q�1��� �,<*��<P��(�!"# 2-3 .�&�)%�!"#�'Z���,��"S����O�R��P1$�+Z#����*��+����� (primer) '�Z���)�%�"��,&'�_#<�I�Z� &"� 16S rRNA H�"1)%<;�<��&�"��I���!"#"�R��,����1)%<�,S��'Z���,�P�!Q�*��!"��"& P�;^���"&%�,�&"� 16S rRNA �I"1)%<;�<��&�"��I���!"#* � )�<�,�P�*��!"��"&* )��1��� 1)%<!"#�'Z��*�� 1)%<!"#* � )�<�,�;�<�R��,���%��".�!��P���&�"��I����,S�����O�R��P1$���.&1��P����u_�:��%�'���'��&;�<*��!"��"& �,<�"S�Z� 1)%<!"#�'Z���,�H��R��P1$���*��+����� �R�'�,�����+�#����^�"��I����$%&�c�����&��(�.>).+������� '�Z�+">"���� (polymerase chain reaction; PCR) *�����!"#��&�"��I���1)%<�"S"�%��'Z���,�P���#<"1"%� !Q�1��� H_<����O�R��R��,���%��".�!��P�����%^�"S�P1$���*������+��������� (universal primer) �R�'�,�P1$�+�#HR��%�&"� 16S rRNA H��*��!"��"&!Q�1����$

11

94S 23S 5S

16S

.��.� ��� (Promoter) 1)%<%)�<]�&P� (Internal) Spacer &"�������I���;��)< (tRNA ) gene ����%^'&Q� (Terminator)

1 1540 bp

3���� 2-3 &"� 16S rRNA "�)%�!"#�'Z���,�*���)%�!"# )�<�,�P�*��!"��"&* )��1��� �)%�!"# �'Z���,�����O�R��P1$P�������*��+����� �+Z#�����+�#����^�"��I���

(�,�*��<H�� http://www.thaiscience.com/lab_vol/p23/PCR-DGGE.asp �Z��$��Z#� 06/01/2551)

12

�)%�;�<�%�* � )�<;�<��&�"��I���;�<&"� 16S rRNA P�*��!"��"&* )��1��� ����O�R��P1$ �%H���%)� *��!"��"&1����,S�H,��&()P���Q)P��Z#��!"&��,�;$�(�P�t��;$�(������� �1)�P�t��;$�(� GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) '�Z� http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp H�����.&1��'�Z�;$��$���"&�;�<&"� 16S rRNA !"#��)�%�;$�< $� H_<!R�P'$����R�'���%�'���'��&!�<+,�-Q���;�<��Q)*��!"��"& ���H,�HR�*������1���*����Q);�<*��!"��"&����Ou_�:��$.�&P1$�R��,���%��".�!��P�1�S�&"� 16S rRNA

2.1.5 �<%"% %)=�>�� ! (1�� �� -Q%H� �, 2548)

�c�����&�+">"���� ����O�R��P1$P�����+�#1�S��)%�;�<�"��I����$�&)�<HR��+�� <)�&*���%���I%*��!R��$]�&P�'���!���< '�,����;�<�c�����&�+">"�������������"&�*������%����!�<-��1� �!"#�>���P1$P�����+�#����^�"��I����)�����*�)<�>��� �Z� ���HR���< ,%��<;�<�"��I��� (replication) >_#<H,������c�����&�!"#����>SR�[ �,� '��&[��� .�&�"��I��� $�*�� (DNA template) !"#P1$H������"��I������"&%�()!"#O(�*&������"��I�����$���"#&%�$%&�%��$�� �Z#��Q^'](����<+�����>_#<���� .���.���%��".�!��!"#"�R��,�����()��,��R��,����P��"��I��� $�*�� H��;$��H,�!"# R�*'�)<����()�!R�P'$���>��"��I���.+�"����� (DNA polymerase) ����O��)<�c�����&������$�<+,�-�/��./����� ��� (phophodiester bond) � ���%��".�!���;$�!"#���& 3’ (3’�end) ;�<+����� �$�����"��I�����&P') .�&P�* )�����;�<�c�����&�+">"�����,S��������$%&;,S� ��&)�& 3 ;,S� �� �Z� 1. ���*&���&�"��I��� (Denaturation) ;,S� ���"S�������!R���&.��<��$�<��&�();�<�"��I��� .�&P1$�%��$���(< ��&!R�!"#�Q^'](�����^ 90 � 95 �<u��>��>"&� �+Z#�P'$�$�"��I�����&��"#&%����*)*��P'$+������;$�H,��$P�;,S� �� )�� 2. ����;$�H,�;�<+����� (Annealing) ����;,S� ��!"#+������;$��H,��,���&�"��I���*)*��!,S<��<��$� >_#<H�����;_S��$�Z#����Q^'](�;�<�����<�!"#�Q^'](�����^ 55 �<u��>��>"&� ��H��'�Z��$�&�%)��"S�$ ;_S��&()�,��%�&�%*��HR��%���� G *�� C ;�<+����� * )��Z#�<H��+�����";�����I��Z#��!"&��,��"��I��� $�*�� *��"����^!"#���%)� H_<H,��()�,���&�"��I��� $�*���$�)�� .�&H�����!"# R�*'�)<!"#�����()��,��,��"��I��� $�*�� 3. ��� )���&�"��I��� (Extension) ����;,S� ������ ���%��".�!��!"#�;$��()�,��,���&�"��I��� $�*�� .�&���#H����%��".�!�� ,%*��!"#�&()O,�H�����& 3’ ;�<+�����!,S<��<���� ;,S� ���"S����;_S�.�&��u,&���!R�<��;�<���>��"��I���.+�"����� >_#<!R�P'$�$�"��I�����&P')����;_S�P�!�u 5’� 3’ '�,<H��!"#��)�&P'$���>�!R�<���$1)%<�%��'�_#< �c�����&�H���,�����# $�!"#;,S� ��*��P') *��!R�>SR�[ �,���&)�<�"S����^ 30 - 40 ����IH��$1�S��"��I���!"# $�<���u_�:�P�HR��%�!"#��+� H���(�!"# 2-4 H��'I�%)��Z#���� 1 ��� H��$�"��I�����&�()1Q�P')HR��%� 2 �() >_#<�Z#�O(��%��$��H��;,S� �����*&���&�"��I���P����O,�� �"��I�����&�()��<1Q��"SH�*&������"��I�����&

13

3���� 2-4 ;,S� ����������c�����&��(�.>).+�"����� (!"#�: http://www.student.chula.ac.th/~49371019/polymerase_chain_reaction.htm �Z��$��Z#�

09/01/2551)

14

��"#&% 4 ��$� *���Z#����Q^'](��< +�����>_#<"�&()P�����^��H��;$��H,��"��I�����&��"#&% !R�P'$���>��"��I���.+�"�������)<�c�����&���� )���&��%��".�!�� H������"��I�����&�()1Q�P')HR��%� 4 �() �Z#�������!"# 3 H��$�"��I�����&�()�!)��,� 8 �() HR��%�����+�#�"��I���H�����*��!%"�(^ P�����^�!)��,� 2n �Z#� n ����HR��%����;�<�c�����&� ����+�#����^�"��I����$%&�c�����&�+">"�����"S $�<����<��������!"#�R��,j �Z� 1. �"��I��� $�*�� �����"��I���!"#"����%^�)%�!"# $�<����+�#����^�&() ,�H��&()P��(�;�<�"��I�����&�() >_#<��,��H���>���;�<��#<"1"%� )�<[ '�Z���H�����"��I����()� (complementary DNA; cDNA) !"#�$H�����O���',�H����&������I����R��',� (mRNA) 2. ��%��".�!��P��(��"���>"�.���%��".�!�� �/���/ (deoxyribonucleotide triphos- phate) !,S< 4 1��� �Z� dATP, dCTP, dGTP, *��dTTP ��"&��%[ %)� dNTPs !R�'�$�!"#������� ,S< $�;�<���>��"��I���.+�"����� 3. +���������.���.���%��".�!����&�,S�[ !"#"'()?����>"!"#���& 3’ (3’�OH) +�����H�H,��,��"��I���*)+�+��+Z#�����HQ����# $�;�<����,<�����'��"��I�����&P') ,�";�������^ 18 O_< 30 ��%��".�!�� *���,<�����'��$.�&�c�����&���" 4. ���>��"��I���.+�"����� !R�'�$�!"#� ���%��".�!�� �< R�*'�)<���& 3’�OH ;�< �"��I��� �$%&�����$�<+,�-�/��./����� ��� (��)�%;%,j u�"�Q;, 2549) 2.1.6 �%��?"(� (@� >�� (��)�%;%,j u�"�Q;, 2549) ����I�. �./��>"� (Electrophoresis) �����!����!"#P1$*&����!"#"���HQ��.���Q�P����//\� .�&������Z#��!"#�&,<;,S%//\�!"#"���HQ �<�,�;$��$%&�%���I%)�!)��,� ��)�%�Z�.���Q�!"#"���HQ��H����Z#��!"#�'�;,S%//\��%� (anode) .���Q�!"#"���HQ�%�H����Z#��!"#�'�;,S%//\��� (cathode) .�&!,#%����!R�����I�. �./��>"� ,�H�P1$�%� )�<u,�&�//\� (voltage; V) !"#�<!"# !"#�%� )�<u,�&�//\��(<H�!R�P'$.���Q�������Z#���$��I%�%)�!"#�%� )�<u,�&�//\� #R�[ ��Z#�<H���%� )�<u,�&�//\����� ,%�R�'���R��,<//\�!"#P1$P����!R�����I�. �./��>"� * )���P1$�%� )�<u,�&�//\�!"#�(<�����,�!R�P'$�����%��$���(<;_S��$%& �)<=� )��%��1,�;�<*O�������Z#��!"#;�<.���Q� �%��$��!"#�(<;_S�!R�P'$�%�'�Z�;�<�,/�/������< *���%� $��!��//\����<P�;^�!"#�%� )�<u,�&�//\��<!"# ���*�//\�H��+�#;_S� !R�P'$�����%��$���+�#;_S���Z#�&[ *������=�P'$�,/�/������'&���H�� ,%���<�$ >_#<"=� )����*&�!R�P'$�$*O�>$���,� *���Q^'](�!"#�(<;_S���H!R�P'$.�� "�'�Z������%��"�����"&�]�+-��1� ��$ ���H���"S�)��%�*�<���� (ionic strength) ;�<�,/�/����I"=� )��%��1,�;�<*O�.���Q��1)���"&%�,�

15

2.1.6.1 ����.���H�����I�. �./��>"� (u���+� ��!-����^" , 2531) ����%�-"� �t��!"#P1$P����*&� %������'� *��!R��"��I���P'$����Q!-�} .�&��u,&'�,����

+ZS�t��!"#%)� �"��I���".��<��$�<!"#�������$%&'()/���/ !R�P'$"���HQ������ �Z#��&()P����//\�H�O(�=�,�P'$���Z#��!"#H��;,S%����();,S%�%� =)�� ,%���<�Z��H� ,%���<!"#��&P1$.�&!,#%� �Z� ����.�� (agarose) !"#*&��$H��=�,<�>���;�<*��!"��"&1��� )�<[ ������&+���*>I��������!"#�������$%& ��*�I�. � (galactose) *����Q+,�-�;�<��*�I�. � .�&��u,&+,�-�?.���H���'%)�<'()?����>�������;�<�SR� ����*�I�. � !R�P'$��&����.��+,�;%$�,��$ �������' QP'$����.��P��������&�����H�!"#"�,�:^������(+�Q�

�iHH,&�R��,j!"#"=� )�������Z#��!"#=)���H�;�<�"��I��� "�,<�"S (%���� u����,<�", 2539) 1. ;���.���Q�;�<�"��I��� �"��I���;���P'j)H�=)���H��$1$��%)��"��I���;�����I� �,<�,S�P�

�%���!)��,� *���]�%���"&%�,��"��I���;���P'j)H����Z#��!"#�$��&�!�<�,S��%)��"��I���;�����I� 2. �(��)�<;�<�"��I��� �"��I���!"#"�(��)�< )�<�,� (*$�SR�'�,�.���Q��!)��,�) ]�&P $�]�%���"&%

�,�H����Z#��!"#=)���H��$%&�%���I%!"# )�<�,� �"��I���!"#"�,�:^��������"&% (superhelical circular) H����Z#��!"#�$��I%�%)��"��I���!"#"�,�:^�������$� (linear DNA) >_#<���Z#��!"#�$��I%�%)��"��I���!"#���&���"&% (open circular)

3. �%��;$;$�;�<�H� �H�!"#"�%��;$;$��(< H�"1)�<%)�<��'%)�<.���Q��$�& !R�P'$�"��I������Z#��=)���$1$��%)��H�!"#"�%��;$;$� #R� �,<�,S��H�!"#"�%��;$;$��(<H_<�'��!"#H�P1$*&��"��I���!"#";�����I� P�;^�!"#�H�!"#"�%��;$;$� #R��'��!"#H�P1$*&��"��I���;���P'j) *���Z#��%��;$;$�;�<�H��<!"# ��&�!�<!"#�"��I�������O���Z#��!"#=)���H�H�*��=�=,��,�HR��%��()��%��".�!��;�<��&�"��I���

4. ���*�//\� ���� ,%=�,��,�P'$�"��I���"������Z#��!"# !,S<�"S�%� $��!��;�< ,%���<H�*��=�=,��,��%�'��;�< ,%���< ���H�����^���HQP��,/�/��� .�&!,#%��Z#�P1$�)��%� )�<u,�&�!"#+��'�� �%���I%P�������Z#��!"#;�<�"��I���!"#"�,�:^�������$�H�*��=,� �<�,�����^�%� )�<u,�&� * )O$��%� )�<u,�&��(<����� �"��I���!"#";���P'j)H����Z#��!"#)�#R���� !R�P'$�%�����OP����*&�1�S��)%��"��I������< �,<�,S��+Z#�P'$*&��"��I���;���P'j)�%)� 2 ��.�����$�" �%�P1$�%� )�<u,�&�)���� 5 .%� � )��>� �� �

5. �)%�������;�<�,/�/����R�'�,����!R�����I�. �./��>"� �,/�/���!"#P1$P����!R�����I�. �./��>"�"=� )�������Z#��!"#;�<�"��I��� ��)%�������;�<���HQ*���%�*�<���� �Z#�)"���� (��^"P�)�,/�/���)!)%*=)��H�) ����R�//\�����;_S��$�&!R�P'$�"��I������Z#��!"#1$�'�Z�)���Z#��!"#��& * )O$�P1$�,/�/���!"#"�%�*�<�����(< �1)�P���^"�������=��+���P1$�,/�/��� 10X *!� ����R�//\�H�����;_S��&)�<�� !R�P'$�����%��$��H����!,#<�H�����& *��!R���&�"��I���

16

�,/�/���!"#��&P1$P����!R�����I�. �./��>"�" 2 1��� �Z� 1. �,/�/��� TAE (Tris-acetate *�� EDTA) ��&P1$P�<��%�H,&!,#%� * )�,/�/���1����"S"

�%�HQ�)��;$�< #R� P����!R�����I�. �./��>"������%�����[ �1)� �$�<�Z� H�!R�P'$�������&�$��;,S%��"�]�%������)�< *���������&�$��;,S%�%�"�]�%�������� >_#<�(j��"&�%������,/�/���� * )����O*�$;�$ .�&P1$����O)�&�!'Q��%"&���'%)�<�������&!,S<��<�$���$%&���Z#�<�i��+���� � �� (peristaltic pump) ������!R�����I�. �./��>��

2. �,/�/��� TBE (Tris-borate *�� EDTA) �����,/�/���!"#"�%�HQ�,/�/����(< *��"��� ��������� ,%&,�&,S<����H��j;�<*��!"��"& H_<����!"#��&P1$P��iHHQ�,�

2.1.7 " ��#���?����)B� ��.�3+�>��!C�.�D�) �"��I�����&=�!"#H��R��;$��>�����u,&!"#����*��!"��"&�,S� HR����� $�<"�"��I���+�'�!"#����O�+�#HR��%��$P�*��!"��"& �$*�) +����� �/H *�� ����� ���� ,%�R�+� (��)�%;%,j u�"�Q;, 2549) P��iHHQ�,�"*��!"��"&!"#P1$�����>���P'$��u,&�&()'��&1���* )!"#��&P1$�,����Z� Escherichia coli >_#<����*��!"��"&!"#!���;$�(�+ZS�t��!�<+,�-Q��� *��'�$�!"#;�<&"� )�<[ ��!"#�Q� (�Q���!�� �0&�.1�^��Q�, 2548) %�-"����R��"��I�����&=��;$��()�>���P'$��u,&!R��$'��&%�-" �1)� !���/����1,#�(transformation) ����%�-"����R��"��I�����&=�!"#"�"��I���+�'�����+������;$��()�>���P'$��u,&!"#����*��!"��"& .�&��u,&;�%����!�<��"P����!R�P'$*��!"��"&P'$��u,&�&()P��]�%�!"#+�$�P�����,��"��I�����&=� ��"&��]�%��"S;�<�>���P'$��u,&%)� �>�����+�"�!� � (competent cell) �����"!"#��&P1$P����� �"&*��!"��"&P'$"�]�%���+�"�!� � �$*�) Ca2+, Mg2+ *�� ��!��>,�/��>�� (dimethyl sulfoxide; DMSO) ���� $� *��!"��"&!"#"�]�%���+�"�!� ��,S� =�,<�>���H�"�%�*=)��< (permeable) !R�P'$�"��I�������O���� ������%^*=)��<�,S��$�" �Z#��R��>���P'$��u,&�P�)�%�,� +����� *��!R�������"#&��Q^'](��&)�<�%���I% (heat shock) H���Q^'](� #R� (0-5 �<u��>��>"&�) ��()�Q^'](��(< (37-45 �<u��>��>"&�) !R�P'$�"��I���!"#���� ������O*!���;$��()�>���P'$��u,&�$ '�,<H���,S��R��>������"S&<P���'����"S&<�1ZS�����^ 30 ��!"O_< 1 1,#%.< �+Z#�P'$�,�:^�/�.�!����<�&)�<;�<+�����"���*��<��� �1)� �,�:^�����ZS�&��c�1"%��(��)�%;%,j u�"�Q;, 2549) �����!-�]�+P�����R�+������;$��()�>���*��!"��"&;_S��&()�,�

1. ;���;�<�"��I��� O$�;���P'j)H�"�����!-�]�+ #R� 2. �(��)�<;�<�"��I��� �"��I���!"#"�(��)�<����%<�����(��)�<!"#"��O"&�]�+��!"#�Q� *��

�����!-�]�+�"!"#�Q� 3. 1���;�<�>���P'$��u,& 4. ��&�����H��j;�<*��!"��"&P'$��u,& 5. %�-"���� �"&�>���P'$��u,&P'$�����>�����+�"�!� � (u���+� ��!-����^" , 2531)

17

2.1.8 " ��#��F�"#���?����)B� (��)�%;%,j u�"�Q;, 2549) ������� �%H'��"��I�����&=� (recombinant DNA) >_#<"�"��I���!"# $�<���H�����1���;�<�>���!,S<'� (library) ��#<*��P�����,���Z���+Z#�P'$�$�"��I�����&=��Z� ����,�!�S<�>���P'$��u,&������H����Q)�>���P'$��u,&!"#"�"��I�����&=� P�;,S� ���"S��u,&�Q^��, �;�<���Z#�<'�&�,���Z�� (selective marker) ;�<�"��I���+�'� >_#<)"P��>���P'$��u,& �1)� �Q^��, ���� $��&��c�1"%�� '�Z����!R�<��;�<���>���<1��� ���� $� �>���P'$��u,&!"#�$�,��"��I���+�'�*���+�#HR��%��$H���"&�%)� !���/���*�!� (transformant) >_#<��HH�"'�Z�)"&"�!"#��PH�&()P��"��I���+�'��I�$ * )O$��>���P'$��u,&�,S��$�,��"��I�����&=��;$��H���"&�%)� �"����*��!� (recombinant) ����,���Z���>���!"#"�"��I�����&=� ��������,��"����*��!�H��!���/���*�!� .�&��u,&�Q^��, �!�</�.�!��!"#*��<���;�<�"��I���+�'� *�)<����$���� 2 %�-" �Z�

1. ���P�)*��!R���&���!R�<�� (Insertional inactivation) ����1Z#� )��"��I���'�Z�&"�!"#��PH�;$��()�"��I���+�'� *�$%!R�P'$�(j��"&�Q^��, �;�<���Z#�<-'�&�,���Z��;�<�"��I���+�'�� �1)� �"��I���+�'�"&"��R�'�,� $��&��c�1"%���������Z#�<'�&�,� ��Z�� �Z#�!R���� ,� )��"��I����;$�� �<����%^&"��R�'�,� $��&��c�1"%�� H�!R�P'$�Q^��, ��"S���"#&� ����&����% )�&��c�1"%�� �"��I���+�'�!"#P'$����,���Z��*���"S �1)� pBR322 ���H���"S&,<"�"��I���+�'�1����Z#�!"#P'$����,���Z��*���"S * )P1$���Z#�<'�&�,���Z��!"#��u,&�Q^��, ����!R�<��;�<���>� �" �-��*��. >���� (β-galactosidase) �$*�) +����� ���(� pUC ����,���Z���"����*��!�.�&��u,&���!R�<��;�<���>��" �-��*��. >���� $�<P1$�"��I���+�'�!"#"�)%�;�<&"� lacZ P�����%^HQ�.��� (multiple cloning sites) &"� lacZ �"SH��%��Q�����$�<���>��" �-��*��. >���� �)%��$�����&���.� '�Z� 1�S�*��/� (α-fragment) >_#<�������$%&������.�����^ 46 .���Q� P�;^�!"#�>���*��!"��"&P'$��u,&!"#P1$O)�&���&"�H�"����,�*��<&"���.��..>!R�P'$)����O��$�<���>��" �-��*��. >����!,S<.���Q� * )H���$�<�$�q+���)%����&�������>�� '�Z� 1�S�.���� (ω-fragment) �)%�;�<���>�!,S<��<�)%��"SH��%�,� (α-complementation) *�������������>�!"#"���!R�<��;�<�" �-��*��. >���� >_#<����O&)�&�����Q+,�-�;�<�SR� ��*����*��. � X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) ���� 5, 5�-dibromo-4,4�-dichloro-indigo >_#<P'$�"�SR��<��P��]�%�!"#" IPTG (isopropyl-(β)-D-thiogalactopyranoside) ���� ,%�'�"#&%�R� �Z#�"����1Z#�1�S��"��I����;$�P�����%^HQ�.��� H�!R�P'$�������*���',����"#&�� H_<)����1�S�*��/� �,<�,S��>���!"#"�"��I�����&=��&()H�P'$.�.��"!"#"�";�% * )�>���!"#����!���/���*�!�H�".�.��"�"�SR��<�� ����,���Z��.�&%�-"�"S��H��"&�%)� ����,���Z��.�.��"�"/\�;�% (blue/white colony selection)

18

2. ���P�)*����� Q$����!R�<�� (Insertional activation) ����1Z#� )��"��I���'�Z�&"�!"#��PH�;$��()�"��I���+�'�P�����%^���Z#�<'�&�,���Z�� !"#!R�'�$�!"#���� ,%�%��Q>_#<�� �H���$�< ,%���,� (repressor) )P'$&"�!"#�ZS�&��c�1"%����$�<=�=�� �R�'�,�����ZS�&� �Z#�"����1Z#� )��"��I����;$��P�����%^�%��QP����Z#�<'�&�,���Z�� !R�P'$)����O��$�< ,%���,��$�Q^��, ����% )�&�H����"#&������ZS�&� ����,���Z��.�&%�-"�"S�>���!"#"�"��I�����&=�H�����O�H��j� ��. P���'��!"#"&��c�1"%��1����,S��$ �)%��>���!"#"* )�"��I���+�'�H�O(��,�!�S<� ,%�&)�<�"��I���+�'�!"#P'$����,���Z��*���"S �$*�) pUN 121 2.1.9 " ���#���%����(�-�#!���#���?��� (DNA sequencing) (��)�%;%,j u�"�Q;, 2549) �"��I����������1"%.���Q�!"#��I�;$�(�+,�-Q��� (genetic information) >_#<�R�'��.�&�R��,� ��%��".�!��P��"��I��� ���%������'��R��,���%��".�!��;�<�"��I��� H�!R�P'$!���.��<��$�<;�<&"� *����Z#�<H���R��,���%��".�!��P��"��I������� ,%�R�'���R��,�;�<������.�P�.�� "� ���!����R��,���%��".�!��P��"��I���H�!R�P'$!����R��,�;�<������.�P�.�� "� !R�P'$����O%������'�.��<��$�< *���;$�PH�%��,+,�-���'%)�<.��<��$�<*��'�$�!"#;�<�<��������!"#�R��,jP�.�� "��,S�[ ���H���"S���'��R��,���%��".�!��"���.&1�� )�������"&��!"&���#<"1"%� P����,�.���Q� ����O���"&��!"&��%�P��$�$ �%!,S<���H,�'%�'();�<��Q)��#<"1"%� %�-"���'��R��,���%��".�!��P��"��I������!R��$ 2 %�-" �Z�

1. %�-"���P1$���>� (enzymatic method) %�-"�"S��H��"&�%)�%�-";�< Sanger '�Z�%�-" chain termination ����%�-"!"#��"&�*������,<�����'�

�����%��"��� ��u,&���!R�<��;�<���>��"��I���.+������� P����� ��"���>���%��".�!�� !,S< 4 1��� �Z� dGTP, dATP, dCTP *�� dTTP �+Z#���$�<�"��I�����$�P')P�!�u!�< 5’ � 3’ .�&"+�����>_#<������%��".�!���,<�����'���&��"#&%���� ,%�������# $�"�"��I���!"# $�<���'��R��,����!R�'�$�!"#����*)*�� P��c�����&�H�� ���%��".�!������]! 2’ , 3’ – dideoxynucleotides (ddGTP, ddATP, ddCTP *�� ddTTP) 1���P�1���'�_#<�<��$%& ��%��".�!��1����"S)"'() 3’-OH �,<�,S������$�<��&�"��I�����&P')H���S��Q��< �< R�*'�)<;�< ddNTP ��Z#�<H��!R�P'$)����O��$�<+,�-�/��./����� ��� (3’, 5’phosphodiester) �+Z#��1Z#� )���%��".�!��P')�;$��$%&�,� ���&Q �����,<�����'� �"��I�����&P')H�����;_S�*���Q)!R�P'$�$��&�"��I���P')!"#";���* � )�<�,� >_#<H�*&��,��$�� ����I�. �./��>���H���������� �,<*��<P��(�!"# 2-5 ���'��R��,���%��".�!���$%&%�-"���>��"S����O'��R��,���%��".�!���$.�&���P1$����,,� �,<�" '�Z���������,,� �,<�"�I�$ P���^"!"#P1$����,,� �,<�"H���&P1$ [α-32P] dATP '�Z� [α-35S] dATP P�)�<�P��c�����&��+Z#� �� �*O��"��I���!"# ��q����,<�" *�$%'� R�*'�)<1�S��"��I����'�)��"S.�&���!R���. ����.����/ (autoradiograph) ��/0���,<�"��I�>� (x-ray film)

19

3���� 2-5 ���'��R��,���%��".�!��;�<�"��I���.�&%�-";�< Sanger (!"#�: http://www.mcb.mcgill.ca/~hallett/GEP/Lecture15/Image31.gif �Z��$��Z#� 31/01/2551)

20

2. %�-"���P1$�����" (chemical cleavage method) %�-"�"S��H��"&�%)�%�-";�< Maxam-Gilbert '�,����;�<%�-"�"S�Z� ��� ,���&�"��I���!"# $�<���'�

�R��,�����$%&�c�����&���" .�&�����"H�!R�������"#&�*��<���;�<��%��".�!��P���&�"��I���>_#<�$!R���� ��q����$%&����,,� �,<�" [γ-32P] dATP !"#���& 3’ '�Z� 5’ ;�<��&�"��I���!"# $�<���'��R��,���%��".�!�� �c�����&����'��R��,���%��".�!��.�&%�-"�"SH�!R�*&��,�P�'���!���< 4 '����Z�

'���!"# 1 ����'���!"#!R�������"#&�*��<!"#����%��"� .�&P1$��-��>,��/ (dimethylsul- fate; DMS) !"#�)�+"��1 8.0 �� �'()�-�� (methylation) P'$�. ��H� R�*'�)<!"# 7 (N7) ;�<����%��"� H���,S���&��%��".�!��H�* ���� ��Z#�<H��"���!R���&+,�-�/��./����� ���!"# R�*'�)<;�<����%��"��Z#�"+�+������ (piperidine) P��c�����&�

'���!"# 2 ����'���!"#!R�������"#&�*��<!"#����%��"�*�����"�"� !"#�)�+"��1 2.0 ��� ��-��>,��/ H��� �'()�-��P'$�. ��H� R�*'�)<!"# 7 ;�<����%��"� *���. ��H� R�*'�)<!"# 3 ;�<������"�"� !R�P'$��&�"��I���* ����!"# R�*'�)<����%��"�*�������"�

'���!"# 3 ����'���!"#!R�������"#&�*��<!"#���>. >"�*��!"� .�&P1$?���>"� (hydra- zine) *��+�+����"� ���!,S<��<H�!R�P'$��&��%��".�!��;�����!"# R�*'�)<���>. >"�*��!"�

'���!"# 4 ����'���!"#���>. >"�O(����"#&�*��<�&)�<�%���I% .�&P1$?���>"�!R��c�����&�!"#"���Z�.>��"&������ (NaCl) �;$;$� 1.5 O_< 2 .���� P��]�%��"SH�"������&�q+�����>. >"�

H���,S��R��c�����&�!,S< 4 �%������'��$%&����I�. �./��>���H���������� *�� �� �*O� �"��I���!"# ��q����,<�" .�&���!R���. ����.����/��/0���,<�"��I�>� �,<*��<P��(�!"# 2-6

21

3���� 2-6 ���'��R��,���%��".�!��;�<�"��I���.�&%�-";�< Maxam-Gilbert (!"#�: http://www.nd.edu/~aseriann/maxam.gif �Z��$��Z#� 31/01/2551)

22

2.2 ���%,�)����"��)��.�� H����" "�����&<��+�HQ���!�"&�'��&1���!"#����O&)�&���&�����Q)�����$!,S<����/� ��*����.�� �� (Friedrick and Mitrenga, 1981, Grant and Wilson, 1973, Hynes and Pateman, 1970 *�� Kagayama and Ohe, 1990) * )�R�'�,����������)�)�&+�����Z#�<H��=����!�H�����&,�&,S<.�� "�>,�?����!"#&,�&,S<����H��j;�<HQ���!�"&� (Bergmark et al., 1991, *�� Cavins and Friedman, 1968) +�HQ���!�"&�!"# $�<������>��H�>_#<����O�H��jP�����������$*�) ��&+,�-Q� Pseudomonas, Rhodococcus *�� Xanthomonas (Nawaz et al., 1993, Nawaz et al.,1994a, *�� Shanker et al., 1990) .�&HQ���!�"&�!"#����OP1$���.&1��H�����������P�����H��j "����$�+���,S<*��P� ,%�&)�<�SR�H��*)�SR�*��H����� * )&,<)�$"����,���Z��*��HR�*����&+,�-Q� H����!,#<�$"���!R�����,���Z�� Pseudomonas chlororaphis B23 H�� ,%�&)�<���!"#"�������TU��;�<��������� '�,<H���,S��$"����$�+�*��u_�:��Q^��, �P�������&���������H��HQ���!�"&� )�<[ �&)�<���& (Cherry et al., 1956, Croll et al., 1974, Brown et al., 1982, *�� Lande et al., 1979)

Nagasawa *�� Yamada (1989) �R����>�����Q!-�}������H���>���*��!"��"&!"#P1$�������-��P�����H��j��$�<+�:;�<��������� *��P1$���� ,%��)<�c�����&�!�<1"%]�+P�����%����=�� �����������P����,�����^�(< )��P��� 1990 Shanker *���^� *&� Pseudomonas sp. H�����P��%��; �$�� >_#<����*��!"��"&*���� �(�*!)<�,S� ����O���Z#��!"#�$ *�� $�<������>��H�P�����H��j .�&%�-"�����"S&<�R��Q< (enrichment) P���'��!"#"���������.�&+�%)� *��!"��"&����O���&����������$O_< 4 ��, )��� � ���������������*��*�.��"&�+Z#�P1$����*'�)<�������*���. ��H�P�����H��j .�&P1$���>����������� ,%��)<�c�����&�?.���>����������� >_#<H�!R�<���$�"P�������&�,S� �$*�) /������ ��>" ��� * ))!R��c�����&��,���Q+,�-�;�<�������-�� �1)� �!��������*�������������� �%�����O;�<���>�H�O(����,��$%&>,�>��� P��]�%�!"#"*��)"�. ��H� )�� Nagasawa *���^� (1993) !R����*&� Rhodococcus rhodocrhous J1 !"#����O���&�����.�� ��*�����������H����� ;^�!"#P�����"&%�,� Nawaz *���^� �$!R����*&� Pseudomonas sp. *�� Xanthomonas maltophilia *��P1$�>��� �_<'�Z����>�������!"#=�� H���1ZS��'�)��"SP�������&�������TU��;�<��������� H���,S�P��� 1994 Nawaz *���^� !R����*&� Rhodococcus sp. H�����!"#"�������TU��&��)�*�< .�&P1$���������������� ,S< $�P�����H��j *��!R�����Q!-�} *��u_�:��,�:^��q+��;�<���>�������!"#��)<�c�����&��"�����1,#�;�<��������� +��]�%�!"#�'���P����!R�<��;�<���>��Z� !"#�Q^'](� 40 �<u��>��>"&� *���)�+"��1!"# 8.5 "�)��.>����I�!��� (pI) !"# 4.0 *��+�%)����>�"�%�HR��+���(<�,����������*����>" ��� ���H���"S&,<+�%)�P�.���Q�;�<��>��������$%&�'�I� 8 .� *��*�� �%� ";�<���>�O(�&,�&,S<�$.�&.�'�'�,�*�����!"#;,�;%�<'()!.��

23

Ignatov *���^� (1996) !R�����,���Z��*��!"��"&!"#"��H������'�&PH�R�'�,����P1$�����-.�� �!�, ��������� *�������������P��SR���"& +�%)� Brevibacterium sp. B-4987 "��H������'�&PH�(<�R�'�,����P1$��������� *��/'�Z� ����������� .�&���������!"#P1$"�%��;$;$� 0.14-1.0 ����.���� *��P�����"&%�,� Hirrlinger *���^� !R����*&� Rhodococcus erythropolis H���1ZS�!"#���&�����.+�+.����� +�%)�����O���&������������������������*��*�.��"&�$

)��P��� 1998 Nawaz *���^� !�����iHH,&!�<��&]�+ �Z� �%��;$;$�;�<�������-��, �)�+"��1, �Q^'](� *���%�* � )�<;�<.�'�*���"��� ��� (chelator) !"#"=� )�����%�������&���������.�&�>��� �_< Rhodococcus sp. +�%)�!"#�%��;$;$��(<;�<����������Z� 128 ����.���� ����O&,�&,S<����H��j;�<*��!"��"&�$ *��!"#�Q^'](��(<[����O���&����������$�+�#��;_S� �)%��)�+"��1!"#�'���P�������&���������;�<�>��� �_<�Z�!"#+"��1 7.0 ���H���"S&,<+�%)�.�'���������*��������� ����O&,�&,S<������&����������$ >_#<����%^*��!"/;�<���>�������!"#��)<�c�����&�������&����������������$%&'()>,�?���� �)%��, ����I%P�������&�+�#;_S��$.�&����'�"#&%�R�;�<�'�I� *��H����<�$.�&���+%��"��� ��� �"�!,S<�>��� �_<!"#� �"&*�$%����O��I�%$P1$<�� )��$���O_<���%,� .�&)"=����!� )�����(j��"&�, ��������&���������* )�&)�<�

Wang *�� Lee (2001) *&�*��!"��"&���&� �!������. ��H� (denitrifying bacteria) !"#P1$���������������� ,S< $�P������R��,��SR���"&]�&P $�]�%�!"#"���>��H�*��)"���>��H� *��HR�*������ Pseudomonas stutzeri +�%)�P��]�%�!"#"���>��H�*��!"��"&����O�R�H,�����������$P�����^ #R� 440 ������, )��� � * )P��]�%�!"#"�� � �,S�*��!"��"&����O���&���������!"#����TU��P� ,%�&)�<�SR���"&�$*��&,<���&������������"��$%&

Wampler *�� Ensign (2005) *&�*��u_�:��,�:^��q+��;�<��&+,�-Q�P') Rhodopseudomonas palustris !"#����O�H��jP����������]�&P $�]�%�!"#"*�< >_#<�$H�� ,%�&)�<;�<'�H��.�<�)�%,%;�<����!u&(!)� .�&%�-"�����"S&<�R��Q<P���'�����Z�!"#"����������%��;$;$� 16 ����.���� ����*'�)<������� ]�&P $*�<H��'���/ 60 %, � H���,S�u_�:�������&�������-��*�����=�� *�����P1$������� H���������&�>���+,�*���)%���,�;�<�>��� .�&�!����.���.!���/��%��,��(< (high performance liquid chromatography; HPLC) +�%)�P� R. palustris ��&+,�-Q� Ac1 �������������O�����c�����&��"�����1,#��&)�<�%���I%����������� *��H�����������&������� )�� >_#<H,������c�����&�!"#�R�'���, ����I%P�����H��j;�<�>��� *���Z#�!R����u_�:���%���"&��*��� ����.>*��>�;�<������� 13 +�%)���� ,%���<!"#����H��������&;�<������� �Z�.+�+.���

24

Wang *�� Lee (2007) *&�*��!"��"&!"#���&�. ��H�;�<���������H�������R��,��SR���"&!"#�$H��.�<<��=�� ��$�P&.+�"�����.�� �!� .�&"HQ�����<���+Z#��-���&=�;�<���*&���&+,�-Q�����Q!-�}*����&+,�-Q�=��,�.+�"�����.�� �!�P�������!R��,����������H���SR���"& +�%)� Ralstonia eutropha TDM-3 !"#*&�H�������R��,��SR���"&;�<.�<<��=�� ��$�P&.+�"�����.�� �!�����O���&����������$�(<O_< 1446 ������, )��� �

25

����� 3 ���#� ���" S! � �� � ����%T�" �#���

3.1 ���#� ������" S!

1. ������ %< (Graduated cylinder) ;��� 100 *�� 500 ������ � 2. ��$�<O)�&�(� �Q)� Powershot A530 ���:,! Canon �'+,�-�,t����>"& 3. ;%�"���0� ;��� 100 *�� 500 ������ � 4. ���Z#�<�%�*)�'�I� (Magnetic stirrer) �Q)� 1000 ���:,! JENWAY 5. ���Z#�<H)�&���*�//\� (Power supply) �Q)� EC250-90 ���:,! Gibthai ����!u!&

*���Q)� Powerpac300 ���:,! Bio-Rad �'�,t������ 6. ���Z#�<1,#< 2 R�*'�)< �Q)� PG2002-S ���:,! MonoBioc ��+,�-�,t�%�� 7. ���Z#�<1,#< 4 R�*'�)< �Q)� Precisa404A ��+,�-�,t�%�� 8. ���Z#�<�i���'%"#&< (Centrifuge) �Q)� J.P.Selecta ���:,! Bio-Active ��1��^�H,������ 9. ���Z#�<=���� (Vortex) �Q)� KS1 ���:,! Velp sciencetifica �'+,�-�,t����>"& 10. ���Z#�<%,�����(���Z�*�< (Spectrophometer) �Q)� Hewlett packaro �'+,�-���-��^�,t

�&��,��" 11. ���Z#�<�)�<]�+�H� �Q)� Spectroline Model TVC-312A ���:,! GUARANTEED 12. ���Z#�<���_#<�)��1ZS��$%&�%��,���SR� (Autoclave) �Q)� AMA2405 �'��1��^�H,�� 13. ���Z#�<�;&)��H� �Q)� OM6 ���:,! Ratek 14. ���Z#�<�+�#;&�&����^�"��I��� Thermo Hybaid PCR �Q)� Px2 15. ���Z#�<P'$�%��$�� (Hot plate) �Q)� HB-1 ���:,! Bio-Active ��-��^�,t $'%,� 16. H����"S&<�1ZS� (Petri dish) ;�����$�=)��u(�&����< 850 ����� � 17. HQ�>���.��� ;��� 200 ����� � ���:,! Toyobo ����!uj"#�Q�� 18. 1Q�*&�;���1�S��"��I���]�&P $���*�//\� (Electrophoresis) �Q)� EC250-90 ���:,!

Gibthai ����!u!& *���Q)� Powerpac300 ���:,! Bio-Rad �'�,t������ 19. 1$�� ,���� (Spatula) 20. ���"&<*����?��� 21. ($�)��"S&<�1ZS� (Incubator) �Q)� BE 500 ���:,! Memmert �'+,�-���-��^�,t�&��,��" 22. ($�)��"S&<�1ZS�*���;&)� �Q)� innova 4230 ���:,!>*�� �/0�.��.1,#� �'�,t������ 23. ($�����1ZS� (Laminar flow) ���:,! Clean �'�,t������ 24. ($�� (Oven) �Q)� AM003 ���:,! BINDER

26

25. !�� ;��� 10, 200 *�� 1,000 .���� � 26. !"#%�<'���!���< (Test tube rack) *��!"#%�<'���.���>� ��/0%�� ;��� 200

.���� � *�� 1.5 ������ � 27. *!)<*)�'�I��R�'�,��%���� (Magnetic bar) 28. �0�� �, .�, � (Autopipette) ;��� 0.1, 2, 20, 200 *�� 1,000 .���� � ���:,!

Nichiryo ����!uj"#�Q�� 29. +���/0�� 30. .���%/ ���:,! Sharp ����!u!& 31. $H�S/i� 32. �%��;"#&�1ZS� (Loop) 33. '���!���< ;��� 10 *�� 20 ������ � 34. '���.���>� ��/0%H� ;��� 0.2 *�� 1.5 ������ � 35. ���(���"&/�&�� (Aluminium foil) 36. �Q���^�=)� ,� *������"�

3.2 � �� � 3.2.1 �����"!"#P1$P����� �"&��'����"S&<�1ZS� - ��'�����Z� #R� (Minimal medium)

1. Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) MW 132.14 AnalaR Grade ���:,! BDH �'��1��^�H,��

2. Boric acid (H3BO3) MW 61.83 AnalaR Grade ���:,! BDH �'��1��^�H,�� 3. Calcium carbonate (CaCO3) MW 100.09 AnalaR Grade ���:,! BDH

�'��1��^�H,�� 4. Cobalt (II) sulphate (CoSO4.7 H2O) MW 281.10 AnalaR Grade ���:,! BDH

�'��1��^�H,�� 5. Copper (II) sulphate (CuSO4.5 H2O) MW 249.68 AnalaR Grade ���:,! BDH

�'��1��^�H,�� 6. Ferrous sulphate (FeSO4.7 H2O) MW 278.02 AnalaR Grade ���:,! BDH

�'��1��^�H,�� 7. Hydrochloric acid (HCl) MW 36.46 Chemical Grade ���:,! Normapur 8. Magnesium Oxide (MgO) MW 40.30 ���:,! BDH �'��1��^�H,��

27

9. Magnesium Sulphate (MgSO4.7 H2O) MW 246.48 AnalaR Grade ���:,! BDH �'��1��^�H,��

10. Manganese (II) sulphate (MnSO4) MW 246.48 AnalaR Grade ���:,! BDH �'��1��^�H,��

11. Potassium dihydrogen orthophosphate (KH2PO4) MW 136.09 AnalaR Grade ���:,! BDH �'��1��^�H,��

12. di-Sodium hydrogen orthophosphate (Na2HPO4) MW 141.96 AnalaR Grade ���:,! BDH �'��1��^�H,��

13. Sulphuric acid (H2SO4) MW 98.08 AnalaR Grade ���:,! BDH �'��1��^�H,�� 14. Zinc sulphate (ZnSO4) MW 287.54 AnalaR Grade ���:,! BDH �'��1��^�H,��

- �)%�������P���'���'�% ��'��*;I< *����'���'�% 2X YT 1. Acrylamide MW 71.08 Molecular Biology Grade ���:,! Vivantis �'+,�-�,t

����>"& 2. Agar Bacteriology Grade ���:,! Criterion �'�,t������ 3. Bacto-tryptone ���:,! BD �'�,t������ 4. LB Agar ���:,! BD �'�,t������ 5. Glucose MW 180.16 Biochemika Grade ���:,! Fluka ��+,�-�,t�%�� 6. Nutrient Broth Chemical Grade ���:,! Himedia ��-��^�,t�����"& 7. Sodium chloride (NaCl) MW 58.443 Foranalysis Grade ���:,! Carloerba

�'+,�-�,t����>"& 8. Yeast Extract Chemical Grade ���:,! Criterion �'�,t������

3.2.2 �����" ���>� *��+������R�'�,��c�����&�+">"����

1. +����� (Primers) - 16S_UniNBam (5’-GGGGGATCCGCTCAGATTGAACGCTGGCG-3’) Tm 76 �<u�

�>��>"&� ���:,! Sigma-Proligo �'�,t������ (����%^H�HR�;�<���>� ,�HR��+�� BamHI *��<P� ,%'��)

- 16S_UniCHin (5’-CCCAAGCTTACATTTCACAACACGAGCTG-3’) Tm 65 �<u��>��>"&� ���:,! Sigma-Proligo �'�,t������ (����%^H�HR�;�<���>� ,�HR��+�� HindIII *��<P� ,%'��) 2. dNTPmix ���:,! Takara ����!uj"#�Q�� 3. 25mM MgCl2 ���:,! Takara ����!uj"#�Q��

28

4. Taq DNA polymerase ���:,! Vivantis �'+,�-�,t����>"& 3.2.3 �����"�R�'�,����!R�����I�. �./��>��

1. Agarose Molecular Grade ���:,! Vivantis �'+,�-�,t����>"& 2. Ethidium bromide ���:,! Promega �'�,t������ 3. Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) MW 372.24 Chemika Grade ���:,!

Fluka ��+,�-�,t�%�� 4. Sodium hydroxide (NaOH) MW 40.00 Proanalysis ���:,! Merck �'+,�-� ��-��^�,t�&���" 5. Tris (hydroxymethyl)-aminomethane MW 121.14 MD Grade ���:,! usb �'�,t

������ 6. 6X loading dye ���:,! Vivantis �'+,�-�,t����>"&

3.2.4 �����" ���>� *���"���H� ��R�'�,����.��� 1. 1Q���,��"��I���H���H� GF-1 GEL DNA RECOVERT KIT ���:,! Vivantis

�'+,�-�,t����>"& 2. 1Q���,�H".����"��I��� QIAampDNA Mini Kit ���:,! QIAGEN �'+,�-���-��^�,t

�&��,��" 3. 1Q���,�+����� GF-1 PLASMID DNA EXTRACTION KIT ���:,! Vivantis

�'+,�-�,t����>"& 4. ���>� ,�HR��+�� Hind III *�� BamH I ���:,! Vivantis �'+,�-�,t����>"& 5. ���>� RNase ���:,! Vivantis �'+,�-�,t����>"& 6. ���>� T4 DNA ligase ���:,! Vivantis �'+,�-�,t����>"& 7. Absolute ethanol Chemical Grade ���:,! Carloerba ��-��^�,t��,#<�u� 8. Ampicillin anhydrous ���:,! Fluka ��+,�-�,t�%�� 9. Calcium Chloride (CaCl2) MW 147.02 AnalaR Grade ���:,! BDH

�'��1��^�H,�� 10. IPTG; MW 238.3 Biochemical Grade ���:,! Vivantis �'+,�-�,t����>"& 11. Lysozyme Biochemical Grade ���:,! Vivantis �'+,�-�,t����>"& 12. Sodium dodecyl sulfate (SDS) MW 126.05 Chemical Grade ���:,! Fisher

Chemical �'��1��^�H,�� 13. X-gal MW 408.63 Biochemical Grade ���:,! Vivantis �'+,�-�,t����>"&

29

3.2.5 �"��I���� �t�� 1. lambda DNA ���:,! Vivantis �'+,�-�,t����>"& 2. 100 bp ladder ���:,! Vivantis �'+,�-�,t����>"&

30

3.3 �%T�" �#��� 3.3.1 " ��#�)"������ �)��)��� %�- #! �Q)��I� ,%�&)�<�SR�H�����< *��*'�)<�SR�!�S<;�<1Q1�P�H,<'%,�1��Q�"P�)P�]�1��!"#�0���1�� H���,S��0�� ,%�&)�<�SR����� � 200 .���� � !R������"S&<�R��Q<P���'���'�%���Z� #R� ���� � 5 ������ � (]��=�%� �) !"#"��������� �%��;$;$� 0.5% (�SR�'�,� )����� �) �R���).�&P1$���Z#�<�)�1ZS�*���;&)�!"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �$%&�%���I% 200 ��� )���!" �����%�� 24 1,#%.< �����"S&<�R��Q<!"#P'$=��%�HR�*��.�&�%�;Q)�;�<�1ZS�!"#;_S�P���'���'�%!"#"�������-�� �0�� ,%�&)�<���� � 200 .���� � ���"S&<P���'��*;I<���Z� #R� !"#"��������������)%��������'Z���,�P���'���'�% �)!"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �����%�� 3-4 %,� �Z#��1ZS��H��j��Z��.�.��"!"#"�,�:^�* � )�<�,�!,S< �(��)�< �" *���,�:^�.�.��" ���"S&<�+�#HR��%�P���'���'�%���Z� #R� ���� � 5 ������ � !"#"����������,<��)�%�*�$%;$�< $� �R���).�&P1$���Z#�<�)�1ZS�*���;&)�!"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �$%&�%���I% 200 ��� )���!" �����%�� 24 1,#%.< H���,S���I��1ZS�P���'���'�%���Z� #R�!"#"��"�>���� (70%) �����<�������� H���,S���I�!"#�Q^'](� -70 �<u��>��>"&� (]��=�%� �) �+Z#��R��P1$P����u_�:�!,S<'� )�� 3.3.2 " ,�#,���"������ �)�����#��F�"-#.(#)��#���%����(�-�#!� %��S��� �"1!���*%5�)�� 16S rRNA 3.3.2.1 " �"�#(� ( (> ��#���?���,"������ �)�����#��F�"-#. �R�*��!"��"&!"#�,���Z���$H��;$� 3.3.1 ���"S&<P���'���'�% LB ���� � 5 ������ � (]��=�%� �) �).�&P1$���Z#�<�)�1ZS�*���;&)�!"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �$%&�%���I% 200 ��� )���!" �����%�� 24 1,#%.< H���,S�!R������,�.��..>���"��I���.�&P1$1Q���,��"��I��� QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) �%�-"!"#*���R�.�&���:,!�,<�"S�Z� ��I��>���P�'��� .���>� ��/0%H�;��� 1.5 .���� � .�&����i���'%"#&<!"# 7,500 ��� )���!" !"#�Q^'](�'$�<�����%�� 10 ��!" H���,S�����& �����>���.�&� ��������&�.>>� �%��;$;$� 100 ������, )������� � ���� � 100 .���� � �,��,/�/��� TE (]��=�%� �) ���� � 500 .���� � �)!"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �����%�� 30 ��!" *�$%� ��,/�/��� AL ���� � 200 .���� � *�����>� Proteinase K ���� � 20 .���� � =�P'$�;$��,��$%&����0�� ;_S��< �)!"#�Q^'](� 56 �<u��>��>"&� �����%�� 30 ��!" *���) )�!"#�Q^'](� 95 �<u��>��>"&� �����%�� 15 ��!" H���,S�� � Absolute ethanol ���� � 200 .���� � ��,�'����������%�� 15 %���!" *�$%O)�&���=��<P� QIAamp Spin Column !"#���HQ�&()P� collection tube ;��� 2 ������ � �0��� �R���i���'%"#&<!"# 8,000 ��� )���!" !"#�Q^'](�'$�< �����%�� 1 ��!" �!�)%�P�!"#�&()P� collection tube !�S< � ��,/�/��� AW1 ���� � 500 .���� � *�$%!R�����i���'%"#&<!"# 8,000 ��� )���!" !"#

31

�Q^'](�'$�< �����%�� 1 ��!" H���,S�%�< QIAamp Spin Column �<P� collection tube P') � ��,/�/��� AW2 ���� � 500 .���� � !R�����i���'%"#&<!"# 14,000 ��� )���!" !"#�Q^'](�'$�< �����%�� 3 ��!" H_<&$�& QIAamp Spin Column P�)�<P�'���.���>� ��/0%H�P') ;��� 1.5 .���� � !R����1��"��I���P� QIAamp Spin Column HR��%� 2 ��,S< .�&� ��SR���,#�!"#=)��������_#<�)��1ZS�*�$%���� � 50 .���� � �)!"#�Q^'](�'$�<�����%�� 1 ��!" *�$%�i���'%"#&<!"# 8,000 ��� )���!" !"#�Q^'](�'$�< �����%�� 1 ��!" H���,S��R��������&.��..>���"��I���!"#��,��$�'��%��;$;$��$%&���%,��)�����(���Z�*�<!"# 260 ��.�� � (A260) *��!"# 280 ��.�� � (A280) %������'�;���*�����q"�;��;�<�"��I���.�&P1$����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ���"&��!"&��,��"��I���� �t�� Lambda DNA !"#O(� ,��&)�<��(�^��$%&���>� ,�HR��+�� Hind III (λ/Hind III) P1$�%� )�<u,�&� 100 .%� � P��,/�/��� 1X TBE (]��=�%� �) �����%�� 30 ��!" H���,S�&$��$%&��-���"&.���� �%��;$;$� 1 .����, )������� � �����%�� 10 ��!" �$�<�H��$%&�SR���,#�HR��%� 2 ��,S< ��,S<�� 5 ��!" �)�<�(]�+�H�]�&P $�,<�"�,� ��%.��� *�$%�,�!_�]�+�$%&��$�<��H� �� ��I��������&�"��I���!"#�Q^'](� 4 �<u��>��>"&� �+Z#�H��R��P1$u_�:� )��

3.3.2.2 " �=%� � % S*%5�)����� �"1! 16S rRNA (#)�<%"% %)=�>�� ! �R�.��..>���"��I���!"#� �"&�$H��;$� 3.3.2.1 ������"��I���*)*�� P�����+�#����^1�S�&"���Q�,�:� 16S rRNA .�&�!����+">"���� �$%&+����� 16S_UniNBam *��+����� 16S_UniCHin >_#<����+�����!"#���*��P'$"����%^H�HR�;�<���>� ,�HR��+�� BamHI *�� Hind III !"#���& 5’ *��"�R��,���%��".�!��!"#���*���H������%^��Q�,�:� R�*'�)<!"# 22 O_< 41 *�� R�*'�)<!"# 1066 O_< 1085 P�1�S�&"� 16S rRNA ;�< E. coli ��R��,� (Precigou et al., 2004) .�&�������&=�!"#P1$!R��c�����&�+">"���� (���� �!,S<'� 50 .���� �) )�'�_#< ,%�&)�< �������$%& .��..>���"��I��� 250 ��.���, dNTP * )��1���!"#�%��;$;$� 0.2 ����.���� MgCl2 �%��;$;$� 1.5 ����.���� +�����* )����&!"#�%��;$;$� 0.8 .��.���� �,/�/��� PCR �%��;$;$� 1X *�����>�*!��"��I���.+�"����� (Taq DNA polymerase) 2.5 '�)%& (� �!"'�,<) ����+�#����^�"��I���!R�P����Z#�< Thermo Hybaid PCR .�&P1$.��*�� )���"S �Z� �%��$�����# $�!"# 95 �<u��>��>"&� �����%�� 10 ��!" H���,S�'&Q����Z#�<1,#%���% �+Z#�� ����>�*!� �"��I���+�������� )��!R��c�����&�HR��%� 30 ��� !"#�������$%& ;,S����*&���&�"��I���!"#�Q^'](� 95 �<u��>��>"&� �����%�� 30 %���!" ���H,�;�<+�����!"#�Q^'](� 60 �<u��>��>"&� �����%�� 45 %���!" *����� )���&�"��I���!"#�Q^'](� 72 �<u��>��>"&� �����%�� 2 ��!" *��;,S��Q�!$�&;�<��� )���&!"#�Q^'](� 72 �<u��>��>"&� �����%�� 7 ��!" H���,S��R�=�� ],^b�+">"����!"#

32

�$�!R����%������'�;���.�&����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% ���"&��!"&��,��"��I���� �t�� λ/HindIII �,<��)�%�*�$%P�',%;$� 3.3.2.1 3.3.2.3 " ��� %���T%XB�%�Y�SZ!=�>�� ! �R�=�� ],^b�+">"����!"#�$H��;$� 3.3.2.2 �!R�����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) �!"&�;����,��"��I���� �t�� 100 bp DNA ladder ,�1�S��H�!"#"=�� ],^b�+">"����;�������^ 1 ��.���� P'$";�������1�S���I�[ *�$%!R�����Q!-�}.�&P1$1Q���,� �"��I���H���H� GF-1 GEL DNA RECOVERT KIT (Vivantis) �%�-"!"#*���R�H�����:,!�,<�"S�Z� '&��1�S��H�!"#O(� ,�P�)P�'���.���>� ��/0%H� ;��� 1.5 .���� � !"#1,#<�SR�'�,�%$*�$% H���,S�1,#<�SR�'�,��+Z#�'�����^;�<�"��I��� *�$%� ��,/�/��� GB ���� 5 �!)�;�<����^�"��I��� �)!"#�Q^'](� 50 �<u��>��>"&� �;&)��+Z#�����&�H� H��Z#��H�����&'�P�)�������&�<P����,�� �R���i���'%"#&<!"#�%���I% 10,000 ��� )���!" �����%�� 1 ��!" H���,S�� � Wash Buffer ���� � 750 .���� � �)!"#�Q^'](�'$�< �����%�� 2 ��!" !R�����i���'%"#&< 2 ��,S<!"#�%���I% 10,000 ��� )���!" �����%�� 1 ��!" � � Elution Buffer ���� � 30 .���� � �)!"#�Q^'](�'$�< �����%�� 2 ��!" �R���i���'%"#&<!"# 10,000 ��� )���!" �����%�� 1 ��!" H���,S��R��"��I���!"#��,��$�%������'�;���*������^.�&����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ���"&��!"&�;����,��"��I���� �t�� 100 bp DNA ladder �,<�-���&�*�$%P�',%;$� 3.3.2.1 3.3.2.4 " �"�#=�� %# pUC118 �����,�+�����H�P1$1Q���,�+����� GF-1 PLASMID DNA EXTRACTION KIT (Vivantis) >_#<"%�-"�����,��,<�"S�Z� ��"S&<�>���*��!"��"&!"#"+�����P���'�� 2X YT ���� � 5 ������ � !"#"*�+�>���� �%��;$;$� 50 .����, )������� � !"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �����%�� 16 1,#%.< ��I� �����>���P�'���.���>� ��/0%H� ;��� 1.5 ������ � .�&����i���'%"#&<!"# 8,000 ��� )���!" �����%�� 2 ��!" ����& �����>���.�&� ��������& S1 !"#"���>� RNase �%��;$;$� 10% (�SR�'�,� )����� �) ���� � 250 .���� � � ��������& S2 ���� � 250 .���� � �R���)P��SR�*;I<�����%�� 5 ��!" H���,S�� ��������&�,/�/��� NB ���� � 400 .���� � =�P'$�;$��,� �i���'%"#&<!"# 14,000 xg �����%�� 10 ��!" *�$%O)�&�������&=��<���,�� �i���'%"#&<!"# 10,000 xg �����%�� 1 ��!" H���,S�� � Wash Buffer ���� � 700 .���� � �i���'%"#&<!"# 10,000 xg �����%�� 1 ��!" HR��%� 2 ��,S< *�$%� � Eluion Buffer ���� � 50 .���� � ,S<!�S<%$!"#�Q^'](�'$�<�����%�� 2 ��!" *�$%�i���'%"#&<!"# 10,000 xg �����%�� 1 ��!" !R���� �%H���;���;�<+�����!"#��,��$.�&����I�. �./��>"��H�����.��

33

�%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ���"&��!"&��,��"��I���� �t�� λ/Hind III �%�-"!"#�-���&%$*�$%P�',%;$� 3.3.2.1 3.3.2.5 " (���B�%�Y�SZ!=�>�� ! 3.3.2.5.1. " ��#*%5�B�%�Y�SZ!=�>�� !���=�� %# pUC118 (Digestion) �R�=�� ],^b�+">"����>_#<"����%^H�HR�;�<���>� ,�HR��+�� BamHI *�� HindIII !"#=)�����!R�����Q!-�}H��;$� 3.3.2.3 (�%��;$;$� 2.5 .����,) *��+����� pUC 118 (]��=�%� ;) (�%��;$;$� 1.6 .����,) �!R���� ,��$%&���>� ,�HR��+�� BamHI (Vivantis) *�� HindIII (Vivantis) HR��%��&)�<�� 100 '�)%&���>� (]��=�%� �) !R��c�����&�P�'��� .���>� ��/0%H� ;��� 1.5 ������ � !"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �����%�� 16 1,#%.< �%H���;���;�<=�� ],^b�+">"����*��+�����!"#=)����� ,��$%&���>� ,�HR��+�� BamHI *�� HindIII �$%&����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) �!"&��,��"��I���� �t�� λ/Hind III �%�-"!"#�-���&%$*�$%P�',%;$� 3.3.2.1 3.3.2.5.2 " �*F�� �+�B�%�Y�SZ!=�>�� !"��=�� %# pUC118 (Ligation) !R�����1Z#� )�=�� ],^b�+">"����*��+����� pUC 118 !"#�$H��',%;$� 3.3.2.5.1 P�'���.���>� ��/0%H� ;��� 1.5 ������ � !"#"���� ��%;�<�������&P��c�����&� 30 .���� � !"#�������$%&=�� ],^b�+">"���� �%��;$;$� 1.8 .����, +����� pUC 118 �%��;$;$� 0.7.����, *�����>� T4 DNA ligase (Vivantis) �%��;$;$� 400 '�)%&���>� �)!"#�Q^'](� 16 �<u��>��>"&� �����%�� 18 1,#%.< 3.3.2.5.3 " �� �) �>��!C�.�D�)��� ��" ��� ��!@� ! � *��� �>���P'$��u,&!"#P1$�Z� E. coli ��&+,�-Q� DH5α (supE44∆lacU169(Φ80lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) .�&� �"&�>�����+�"�!� � �%�-"�,< )���"S�Z� ��"S&<*��!"��"& E. coli ��&+,�-Q� DH5α P���'���'�% LB ���� � 2 ������ � �R���).�&P1$���Z#�<�)�1ZS�*���;&)�!"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �$%&�%���I% 200 ��� )���!" �����%�� 12-16 1,#%.< �0�� *��!"��"&!"#�H��j� 1 ������ � P�)P���'���'�% LB ���� � 100 ������ � �).�&P1$���Z#�<�)�1ZS�*���;&)�!"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �$%&�%���I% 200 ��� )���!" �����%�� 2-3 1,#%.< %,��)�����(���Z�*�<!"# 600 ��.�� � (A600) P'$�&()P�1)%< 0.3-0.4 H���,S�*1)�>���P��SR�*;I< �����%�� 1 1,#%.< !R�>SR��"� 2 ��,S< .�&�R���i���'%"#&<!"#�%���I% 2,700 xg �����%�� 10 ��!" *���$�< �����>����$%&�������&*���>"&������ (CaCl2) �%��;$;$� 100 ����.���� !"#"��"�>����=��&()!"#�%��;$;$� 15% (���� � )����� �) ���� � 4 ������ � �;&)�P'$�>������H�& H���,S�

34

,S<�������&�>���P��SR�*;I<�����%�� 30 ��!" *�$%*�)<�������&�>��� 100 .���� � ��I�P�'���.���>� ��/0%H�;��� 1.5 ������ � !"#�Q^'](� -70 �<u��>��>"&� �+Z#�P1$P����!R�!�����/����1,#� )��

3.3.2.5.4 " ��� ��!@� ! � *��� ���" ��#��F�"(�(������ �=�� %#�)B� �R�=�� ],^b�;�<�c�����&�����1Z#�!"#�$H��',%;$� 3.3.2.5.2 ���� � 30 .���� � � ��<P��������&�>�����+�"�!� �!"#�$H��',%;$� 3.3.2.5.3 ���� � 150 .���� � !"#O(��R������& (thaw) ���SR�*;I<*�$% ,S<!�S<%$���SR�*;I< �����%�� 45 ��!" *��&$�&��)!"#�Q^'](� 42 �<u��>��>"&� �����%�� 2 ��!" H���,S�*1)P��SR�*;I< �����%�� 5 ��!" O)�&���=��<P���'���'�% LB ���� � 2 ������ � �;&)��)!"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �����%�� 90 ��!" �0�� �������&�>���� 100 .���� � ���H�& (spread) ����'��*;I< LB !"#"*�+�>���� �%��;$;$� 50 .����, )������� � X-gal �%��;$;$� 50 ������, )������� � *�� IPTG �%��;$;$� 0.1 .���� (]��=�%� �) �)�1ZS�!"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �����%�� 16 1,#%.< �,���Z��.�.��"�";�%>_#<���%)�H�����.�.��"!"#"+�������&=����,�+����� �%�-"!"#�-���&�*�$% P�',%;$� 3.3.2.4 3.3.2.6 " � �,���*%5�)�� 16S rRNA C�=�� %#�)B� (#)" ��##.�)���-> !��#,��=� !R���� �%H���1�S�&"� 16S rRNA P�+�������&=�!"#�$H��',%;$� 3.3.2.5.4 .�&��� ,��$%&���>� ,�HR��+�� BamHI *�� HindIII >_#<�������>�P�����%^.���;�<+�������&=��"S !R��c�����&�P�'���.���>� ��/0%H� ;��� 1.5 ������ � �,<�-���&�*�$%P�',%;$� 3.3.2.5.1 * )P1$+�������&=� �%��;$;$� 0.5 ��.���, *�����>� ,�HR��+�� BamHI *�� Hind III �&)�<�� 50 '�)%& P��c�����&�!"#"����^!,S<'� 10 .���� � H���,S�!R���� �%H���1�S�&"� 16S rRNA !"#"�&()P�+�������&=�!"#�$H����� ,��$%&���>� ,�HR��+��.�&���!R�����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ���"&��!"&�;����,��"��I�-��� �t�� λ/HindIII �%�-"!"#�-���&%$*�$%P�',%;$� 3.3.2.1 3.3.2.7 " � �,���*%5�)�� 16S rRNA C�=�� %#�)B� (#)����%�=�>�� ! �R�+�������&=�!"#+�*O�;�<1�S�&"� 16S rRNA !"#�$H����� �%H���P�',%;$� 3.3.2.6 �!R���� �%H���&Z�&,��"���,S<�$%&�!����+">"���� .�&P1$+�������&=�!"#�$H��;$� 3.3.2.6 �%��;$;$� 125 ��.���,�����"��I���*)*�� P��c�����&�+">"����!"#�������$%& dNTP * )��1���!"#�%��;$;$� 1.5 ����.���� MgCl2 �%��;$;$� 1.5 ����.���� +�����

35

16S_UniNBam *�� 16S_UniCHin !"#�%��;$;$�* )����&�Z� 0.8 +�.�.� +">"�����,/�/��� �%��;$;$� 1X *�����>�*!��"��I���.+�"����� 2.5 '�)%& ��]�%�P����!R�+">"���� �,<;$� 3.3.2.2 �%H���=�� ],^b�+">"����!"#�$ .�&����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ���"&��!"&��,��"��I���� �t�� λ/HindIII �%�-"!"#�-���&%$*�$%P�',%;$� 3.3.2.1 3.3.2.8 " �����%�� ��!��#���%����(�-�#!� %��S��� �"1!���*%5�)�� 16S rRNA 3.3.2.8.1. " ���#���%����(�-�#!���*%5�)�� 16S rRNA �R�+�������&=�!"#�$H��',%;$� 3.3.2.5.4 !"#=)�����&Z�&,�%)�"1�S�&"� 16S rRNA ;�<*��!"��"&!"#�,���Z���$* )����&+,�-Q� .�&%�-"P�',%;$� 3.3.2.6 *�� 3.3.2.7 *�$% �'��R��,� ��%��".�!���$%&���Z#�< ABI3700 sequencer (First BASE Laboratories, ����!u����>"&) !"#P1$1Q��)���R��,���%��".�!�� Big Dye 3.1 Terminator �$%&+����� 16S_UniNBam (�)����&�R�; sense) *�� 16S_UniCHin (�)����&�()�; antisense) 3.3.2.8.2. " �� �)����)��� �� F�������#���%����(�-�#!���*%5�)�� 16S rRNA "��&��.� 3���#���%����(�-�#!(�" �R�=��R��,���%��".�!��!"#�$H��',%;$� 3.3.2.8.1 �'� R�*'�)<H,�;�<+����� 16S_UniNBam *�� 16S_UniCHin *������%^>$��!,� (overlap sequence) .�&P1$.��*�� BioEdit H���,S����"&��!"&��%��'Z��;�<�R��,���%��".�!��!"#�$ (Basic local alignment search tool;BLAST) �,��R��,���%��".�!��!"#"P�t��;$�(���%��".�!��.�� (GenBank: http://www.ncbi. nlm.nih.gov) *��H,�HR�+%���%��".�!�� (alignment) .�&P1$.��*�������� CLUSTALW (http://align.genome.jp/) 3.3.3. " �%�� ��!�� �� =��T!�����!���%��a�" �R�;$�(��R��,���%��".�!��!"#O(�H,�HR�+%���%��".�!��H��',%;$�!"# 3.3.2.8.2 �!R����%������'��%��,+,�-�!�<%<��%��%�%,v����� (phylogenetic analysis) .�&��u,&�%�P��$��"&<;�<�R��,���%��".�!�� *����$�<*=�]�+%<��%��%�%,v����� (phylogenetic tree) *�� Neighbor-joining (N-J tree) .�&P1$t��;$�(������� http://align.genome.jp

36

����� 4 B�" �#���

4.1 " ��#�)"������ �)��)��� %�- #! H������R��SR�H�����<!"#�����SR�'� ����%�� *��*'�)<�SR�!�S<;�<1Q1�!"#�����)��SR���#<P�H,<'%,�1��Q�" �!R�����,�*&�*��!"��"&���&��������� .�&�����"S&<�R��Q<P���'���'�%���Z� #R�!"#"*'�)<��������Z� ��������� �%��;$;$� 0.5% (�SR�'�,� )����� �) *�$%�).�&P1$���Z#�<�)�1ZS�*���;&)�!"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �$%&�%���I% 200 ��� )���!" �����%�� 24 1,#%.< +�%)���'���'�%"�,�:^�;Q)� *���Z#��R��1ZS�!"#�$���"S&<����'��*;I<���Z� #R�!"#"*'�)<�������1�����"&%�,� �)!"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �Z#��%��=)��� 4 %,� +�.�.��"*��!"��"&�H��j��H���+����"S&< �Z#��,<�� �,�:^�.�.��"!"#"�%�* � )�<�,�!,S<�$���(��)�< ;��� *���" ����O*&�.�.��"!"#* � )�<�,��$ 3 �,�:^� �Z� �.>��!!"# 1 .�.��""�,�:^��";�%P� ����HQ���;�����I� ";����"&�, �.>��!!"# 2 .�.��""�,�:^��";�%;Q)� ����HQ���;�����I� ";����"&� �����Z��*���.>��!!"# 3 .�.��""�,�:^��";�%;Q)� ����HQ���;���P'j)�%)�.�.��";�<�.>��!!"# 2 ";����"&� �����Z�� ��Q��,< ���<!"# 4-1

4.2 " �"�#(� ( (> ��#���?���,"������ �)�����#�)"-#. �Z#��R�*��!"��"&���&���������!"#�,�*&��$!,S< 3 �.>��! �!R������,�.��..>�� �"��I���.�&P1$1Q���,��"��I��� QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) *�$%'��%��;$;$�;�<.��..>���"��I���!"#��,��$ .�&%,��)�����(���Z�*�<!"# 260 *�� 280 ��.�� � +�%)� �.>��!!"# 1, 2 *�� 3 "�%��;$;$�;�<�"��I����Z� 20.47, 48.47 *�� 47.03 .����, )�������, ��R��,� *��"�, ���)%��)� A260/A280 �!)��,� 1.79, 1.57 *�� 1.65 ��R��,� ��Q��,< ���<!"# 4-2 =�H����� �%H���;���*���%�����Q!-�};�<.��..>���"��I���.�&����I�. �./��->"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ���"&��!"&��,��"��I���� �t�� λ/HindIII +�%)�.��..>���"��I���!"#��,��$H��*��!"��"&!,S< 3 1���";������%)� 23 ��.���� *��)+����q"�;��;�<�"��I��� *��<�,<�(�!"# 4-1

37

� ���� 4-1 �,�:^�.�.��";�<�1ZS�*��!"��"&!"#*&��$H�� ,%�&)�<�SR����<*��*'�)<�SR�!�S<;�<1Q1�P�H,<'%,�1��Q�" �Z#��H��jP���'��*;I<���Z� #R�!"#"��������� �%��;$;$� 0.5% (�SR�'�,� )����� �) !"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �����%�� 4 %,� -�(>������ ��"1S�(�(��� ���+����=�

1 �";�%P� HQ���;�����I� ;����"&� �SR����<'$%&����0 *��*'�)<�SR�!�S<;�<1Q1��O��,�+,v����Z�*�<<��

2 �";�%;Q)� HQ���;�����I� ;����"&� �����Z���&�S

�SR����<'$%&����0 *��*'�)<�SR�!�S<;�<1Q1��O��,�+,v����Z�*�<<��

3 �";�%;Q)� HQ���;���P'j�%)�.�.��";�<�.>��!!"# 2 ;����"&� �����Z���&�S

�SR����<'$%&����0 *��*'�)<�SR�!�S<;�<1Q1��O��,�+,v����Z�*�<<��

38

� ���� 4-2 �)�����(���Z�*�<!"# 260 ��.�� �, �, ���)%� A260/A280 *���%��;$;$�!"#�$H������R��%^;�<.��..>���"��I���!"#��,��$H��*��!"��"&!,S< 3 �.>��! -�(>������ " �,F�,�

(��+) A260 A260/A280 �� ��. �.�#���?���

(- (� " � �+� %��%�%� ) 1 - 0.41 1.79 20.47 2 6 0.96 1.57 48.47 3 6 0.96 1.65 47.03

39

M 1 2 3

23,130 9,416 6,557 4,361

2,027

3���� 4-1 .��..>���"��I���!"#��,��$H��*��!"��"&!,S< 3 �.>��! '�,<H����� �%H���.�& ����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ]�&P $�%� )�<u,�&� 100 .%� � �����%�� 30 ��!" 1)�<!"# M �Z� �"��I���� �t�� λ/HindIII 1)�<!"# 1 �Z� .��..>���"��I���!"#��,��$H��*��!"��"&�.>��!!"# 1 1)�<!"# 2 �Z� .��..>���"��I���!"#��,��$H��*��!"��"&�.>��!!"# 2 1)�<!"# 3 �Z� .��..>���"��I���!"#��,��$H��*��!"��"&�.>��!!"# 3

2,322

> 23,000 �()���

�()���

40

4.3 " �=%� � % S*%5�)����� �"1! 16S rRNA (#)�<%"% %)=�>�� ! �Z#��R�.��..>���"��I���!"#��,��$H��*��!"��"&���&���������!,S< 3 �.>��! �P1$�����"��I���*)*��P�����+�#����^1�S�&"���Q�,�:� 16S rRNA .�&�c�����&�+">"���� �$%&+����� 16S_UniNBam �,� 16S_UniCHin �,<�-���&%$*�$%P�',%;$� 3.3.2.2 �Z#��R�=�� ],^b�+">"����!"#�$� �%H���;���;�<1�S�&"� 16S rRNA .�&����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ���"&��!"&��,��"��I���� �t�� λ/HindIII +�*O�=�� ],^b�'�,�*O���"&%!"#;�������^ 1,060 �()��� �,<*��<P��(�!"# 4-2

4.4 " ��� %���T%XB�%�Y�SZ!=�>�� ! �Z#��R�=�� ],^b�+">"����!"#�$H��*��!"��"&!,S< 3 �.>��! �!R�����Q!-�} .�&P1$1Q�!R�����Q!-�}�"��I��� GF-1 GEL DNA RECOVERT KIT (Vivantis) *�� �%H���;���;�<=�� ],^b�+">"����!"#=)�����!R�����Q!-�}�"���,S< .�&����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ���"&��!"&��,��"��I���� �t�� 100 bp DNA ladder &,<�<+�*O��"��I���!"#";�������^ 1,060 �()��� *��<=��,<�(�!"# 4-3

41

1,060 �()��� 564

23,130 9,416

4,361

2,027

3���� 4-2 =�� ],^b�H���c�����&�+">"����;�<1�S�&"� 16S rRNA �Z#�P1$.��..>���"��I���;�<*��!"��"&���&���������!,S< 3 �.>��! �����"��I���*)*�� *��P1$+����� 16S_UniNBam �,� 16S_UniCHin '�,<H�����!R�����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ]�&P $�%� )�<u,�&� 100 .%� � �����%�� 30 ��!" 1)�<!"# M �Z� �"��I���� �t�� λ/HindIII 1)�<!"# 1 �Z� =�� ],^b�+">"����;�<1�S�&"� 16S rRNA H��*��!"��"&�.>��!!"# 1 1)�<!"# 2 �Z� =�� ],^b�+">"����;�<1�S�&"� 16S rRNA H��*��!"��"&�.>��!!"# 2 1)�<!"# 3 �Z� =�� ],^b�+">"����;�<1�S�&"� 16S rRNA H��*��!"��"&�.>��!!"# 3

M 1 2 3 �()���

42

M 1 2 3

3,000 2,000

500

1,060 �()���

3���� 4-3 =�� ],^b�+">"����;�<1�S�&"� 16S rRNA ;�<*��!"��"&!,S< 3 �.>��! !"#=)�����!R�����Q!-�} .�&1Q�!R�����Q!-�}�"��I��� �Z#� �%H���.�&����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ]�&P $�%� )�<u,�&� 100 .%� � �����%�� 30 ��!" 1)�<!"# M �Z� �"��I���� �t�� 100 bp DNA ladder 1)�<!"# 1 �Z� =�� ],^b�+">"����;�<1�S�&"� 16S rRNA H��*��!"��"&�.>��!!"# 1 !"#=)����� !R�����Q!-�} 1)�<!"# 2 �Z� =�� ],^b�+">"����;�<1�S�&"� 16S rRNA H��*��!"��"&�.>��!!"# 2 !"#=)����� !R�����Q!-�} 1)�<!"# 3 �Z� =�� ],^b�+">"����;�<1�S�&"� 16S rRNA H��*��!"��"&�.>��!!"# 3 !"#=)����� !R�����Q!-�}

�()���

1,200 1,000

43

4.5 " (���B�%�Y�SZ!=�>�� ! �Z#��R�=�� ],^b�+">"����!"#=)�����!R�����Q!-�};�<*��!"��"&!,S< 3 �.>��! *��+����� pUC 118 � ,��$%&���>� ,�HR��+�� BamHI *�� HindIII �,<!"#�-���&%$*�$%P�',%;$� 3.3.2.5.1 �Z#� �%H���;���1�S��"��I���*��+�����!"#�$'�,<��� ,��$%&����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ]�&P $�%� )�<u,�&�//\� 100 .%� � �����%�� 30 ��!" ���"&��!"&��,��"��I���� �t�� λ/HindIII +�%)��$*O�;�<1�S��"��I���!"#";�������^ 1,060 �()��� *��*O�;�<+�����;�������^ 3,162 �()��� �,<*��<P��(�!"# 4-4 H���,S��R��"��I���*�� +�����!"#O(� ,��$%&���>� ,�HR��+���!R�����1Z#� )� *��!�����/����1,#��;$��()�>���P'$��u,& E. coli ��&+,�-Q� DH5α �Z#��R����"S&<����'��*;I< LB !"#"�)%�������;�<&��c�1"%��*�+�>�-���, X-gal *�� IPTG �)!"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �����%�� 16 1,#%.< +�%)�".�.��"�"/\�*���";�%�H��j����'��*;I< .�&H��!"# 1 (!�����/���*�!�;�<*��!"��"&�.>��!!"# 1) "HR��%� 252 *�� 54 .�.��" ��R��,� H��!"# 2 (!�����/���*�!�;�<*��!"��"&�.>��!!"# 2) "HR��%� 135 *�� 36 .�.��" ��R��,� *��H��!"# 3 (!�����/���*�!�;�<*��!"��"&�.>��!!"# 3) "HR��%� 230 *�� 51 .�.��" ��R��,� )��!R�����,���Z���q+��.�.��"�";�%���"S&<P���'���'�% 2X YT (]��=�%� �) !"#"*�+�>���� �%��;$;$� 50 .����, )������� � �����)%������� �)!"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �����%�� 12-16 1,#%.< !R������,�+�������&=�P��>���*��!"��"&!"#�$.�&P1$1Q���,�+����� GF-1 PLASMID DNA EXTRACTION KIT (Vivantis) �Z#� �%H���;���+�����!"#��,��$.�& ����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) +�%)�*O�+�������&=�!"#�$H��!,S< 3 �.>��! ";�������^ 4,000 �()��� ���"&��!"&��,��"��I���� �t�� λ/HindIII �,<*��<P��(�!"# 4-5

4.6 " � �,���*%5�)�� 16S rRNA C�=�� %#�)B� (#)" ��##.�)���-> !��#,��=� �Z#��R�+�������&=�!"#���%)�H�"1�S�&"� 16S rRNA (";���P'j);_S�) ;�<*��!"��"&!,S< 3 �.>��! �!R���� ,��$%&���>� ,�HR��+�� 2 1��� �Z� ���>� ,�HR��+�� BamHI *�� HindIII �,<!"#�-���&%$*�$%P�',%;$� 3.3.2.6 �Z#� �%H���.�&����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ���"&��!"&��,��"��I���� �t�� λ/HindIII H�+�*O��"��I��� 2 *O� .�&*O�!"# 1 ����*O�;�<+����� pUC118 !"#";�������^ 3,162 �()��� �)%�*O�!"# 2 ����*O�;�<1�S�&"� 16S rRNA !"#";�������^ 1,060 �()��� (*��<�,<�(�!"# 4-6; 1)�<!"# 1 2 *�� 3 ���� +�������&=�!"#"1�S�&"� 16S rRNA ;�<*��!"��"&�.>��!!"# 1 2 *�� 3 ��R��,�)

44

M 1 2 3 4

23,130 6,557

2,322 4,361

2,027

564

3,162 �()���

1,060 �()���

3���� 4-4 =�� ],^b�+">"����*��+����� pUC 118 !"#O(� ,��$%&���>� ,�HR��+�� BamHI *�� HindIII �Z#� �%H���.�&����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ]�&P $�%� )�<u,�&� 100 .%� � �����%�� 30 ��!" 1)�<!"# M �Z� �"��I���� �t�� λ/HindIII 1)�<!"# 1 �Z� =�� ],^b�+">"����;�<*��!"��"&�.>��!!"# 1 !"#O(� ,��$%&���>� ,�HR��+�� BamHI *�� HindIII 1)�<!"# 2 �Z� =�� ],^b�+">"����;�<*��!"��"&�.>��!!"# 2 !"#O(� ,��$%&���>� ,�HR��+�� BamHI *�� HindIII

1)�<!"# 3 �Z� =�� ],^b�+">"����;�<*��!"��"&�.>��!!"# 3 !"#O(� ,��$%&���>� ,�HR��+�� BamHI *�� HindIII 1)�<!"# 4 �Z� +����� pUC 118 !"#O(� ,��$%&���>� ,�HR��+�� BamHI *�� HindIII

�()���

45

23,130

6,557 4,361

2,322

M 1 2 3

4,000 �()���

3���� 4-5 +�������&=�!"#�$H�����!�����/����c�����&��1Z#�=�;�< pUC118 *��1�S�=�� ],^b�+">"����;�<*��!"��"&!,S< 3 �.>��! �Z#� �%H���.�&����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ]�&P $�%� )�<u,�&� 100 .%� � �����%�� 30 ��!"

1)�<!"# M �Z� �"��I���� �t�� λ/HindIII

1)�<!"# 1 �Z� +�������&=�;�<�c�����&��1Z#� pUC118 �,�1�S�=�� ],^b�+">"����;�< *��!"��"&�.>��!!"# 1 1)�<!"# 2 �Z� +�������&=�;�<�c�����&��1Z#� pUC118 �,�1�S�=�� ],^b�+">"����;�< *��!"��"&�.>��!!"# 2 1)�<!"# 3 �Z� +�������&=�;�<�c�����&��1Z#� pUC118 �,�1�S�=�� ],^b�+">"����;�< *��!"��"&�.>��!!"# 3

�()���

46

M 1 2 3

*O�!"# 1 ~ 3,162 �()���

*O�!"# 2 ~ 1,060 �()���

23,130

6,557 4,361

564

2,322 2,027

3���� 4-6 =���� ,�+�������&=��$%&���>� ,�HR��+�� BamHI �,� HindIII �%H���.�&����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ]�&P $�%� )�<u,�&� 100 .%� � �����%�� 30 ��!" 1)�<!"# M �Z� �"��I���� �t�� λ/HindIII 1)�<!"# 1 �Z� *O�+����� pUC118 �,�1�S�&"� 16S rRNA !"#�$H����� ,�+�������&=� !"#"1�S�&"� 16S rRNA ;�<*��!"��"&�.>��!!"# 1 1)�<!"# 2 �Z� *O�+����� pUC118 �,�1�S�&"� 16S rRNA !"#�$H����� ,�+�������&=� !"#"1�S�&"� 16S rRNA ;�<*��!"��"&�.>��!!"# 2 1)�<!"# 3 �Z� *O�+����� pUC118 �,�1�S�&"� 16S rRNA !"#�$H����� ,�+�������&=� !"#"1�S�&"� 16S rRNA ;�<*��!"��"&�.>��!!"# 3 *O�!"# 1 �Z� +����� pUC118 *O�!"# 2 �Z� 1�S�&"� 16S rRNA

�()���

47

4.7 " � �,���*%5�)�� 16S rRNA C�=�� %#�)B� (#)����%�=�>�� ! H������R�+�������&=�!"#��,��$>_#<";�������^ 4,000 �()��� ������"��I���*)*��P���� �%H���1�S�&"� 16S rRNA .�&�!����+">"�����+Z#�&Z�&,�=����.��� �,<%�-"!"#�-���&P�',%;$� 3.3.2.7 +�=�� ],^b�+">"����H�����%������'��$%&����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ";�������^ 1,060 �()��� �,<*��<P��(�!"# 4-7 >_#<�!)��,�;���=�� ],^b�+">"����!"#�$*��<P��(�!"# 4-2

4.8 " ���#���%����(�-�#!���" �� �)����)��� �� F�������#���%����(�-�#!���*%5�)�� 16S rRNA "��&��.� 3���#���%����(�-�#!(�" �Z#��R�+�������&=��'��R��,���%��".�!��;�<1�S�&"� 16S rRNA �,<!"#�-���&P�',%;$� 3.3.2.8 !����R��,���%��".�!��;�<*��!"��"&�.>��!!"# 1, 2 *�� 3 ;��� 1029, 1008 *�� 1010 �()��� ��R��,� ��Q��R��,���%��".�!��;�<&"� 16S rRNA !"#�$;�<*��!"��"&!,S< 3 �.>��! P��(�!"# 4-8 O_< 4-10 �Z#����"&��!"&��%��'Z��;�<�R��,���%��".�!��!"#�$�,�t��;$�(��R��,���%��".�-!��.�� +�%)��.>��!!"# 1 "�%��'Z���(<�Q��,� Enterococcus faecalis (��; Accession AB362602) 99% �.>��!!"# 2 "�%��'Z���(<�Q��,� Klebsiella pneumoniae ��&+,�-Q� AU45 (��; Accession EF032681) 99% *���.>��!!"# 3 "�%��'Z���(<�Q��,� Klebsiella pneumoniae (��; Accession AF511429) 99% (]��=�%� <-1)

4.9 " �%�� ��!�� �� =��T!�����!���%��a�" �Z#��R��R��,���%��".�!��;�<1�S�&"� 16S rRNA !"#�$H��*��!"��"&!,S< 3 �.>��! �H,�HR�+%� *��%��*=�]�+%<��%��%�%,v������,<�-���&P�',%;$� 3.3.2.8.2 *�� 3.3.2.8.3 +�%)� �.>��!!"# 1 H,��&()P���Q)��"&%�,�*��!"��"&��Q� Enterococcus faecalis ;^�!"#�.>��!!"# 2 *�� 3 H,��&()P���Q)��"&%�,�*��!"��"&��Q� Klebsiella pneumoniae *��<P��(�!"# 4-11 O_< 4-13

48

M1 1 2 3 M2

23,130

4,361

2,027

564

3,000

1,000 1,200

500

1,060

3���� 4-7 =�� ],^b�+">"����;�<1�S�&"� 16S rRNA �Z#�P1$+�������&=�;�<*��!"��"&!,S< 3 �-.>��!�����"��I���*)*�� �%H���.�&����I�. �./��>"��H�����.�� �%��;$;$� 0.7% (�SR�'�,� )����� �) ]�&P $�%� )�<u,�&� 100 .%� � �����%�� 30 ��!" 1)�< M1 �Z� �"��I���� �t�� λ/HindIII 1)�<!"# 1 �Z� *O�=�� ],^b� PCR ;�<1�S�&"� 16S rRNA �Z#�P1$�"��I���*)*���Z�+����� ��&=�;�<=�� ],^b�+">"����H��*��!"��"&�.>��!!"# 1 1)�<!"# 2 �Z� *O�=�� ],^b� PCR ;�<1�S�&"� 16S rRNA �Z#�P1$�"��I���*)*���Z�+����� ��&=�;�<=�� ],^b�+">"����H��*��!"��"&�.>��!!"# 2 1)�<!"# 3 �Z� *O�=�� ],^b� PCR ;�<1�S�&"� 16S rRNA �Z#�P1$�"��I���*)*���Z�+����� ��&=�;�<=�� ],^b�+">"����H��*��!"��"&�.>��!!"# 3 1)�< M2 �Z� �"��I���� �t�� 100 bp DNA ladder

�()���

�()���

49

1 CGCATATAATGCAGTCGAACGCTTCTTTCCTCCCGAGTGCTTGCACTCAATTGGAAAGAG 60

61 GAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCCATCAGAGGGGGATAACACTTG 120

121 GAAACAGGTGCTAATACCGCATAACAGTTTATGCCGCATGGCATAAGAGTGAAAGGCGCT 180

181 TTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTC 240

241 ACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACA 300

301 CGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGA 360

361 CCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAA 420

421 GAACAAGGACGTTAGTAACTGAACGTCCCCTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTA 480

481 ACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGC 540

541 GTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGA 600

601 GGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGC 660

661 GGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAA 720

721 CTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG 780

781 CCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCAAACGC 840

841 ATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGG 900

901 GCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGGGGTTTAATTTGAAGCAACGCGAAAAACCTTACCAGG 960

961 TCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAAAAAGAGCTTTCCCTTCGGGGACAAAGTGACAGG 1020

1021 GGGTGCATG

3���� 4-8 �R��,���%��".�!��;�<1�S�&"� 16S rRNA ;�<*��!"��"&�.>��!!"# 1

50

1 CCTAACACCTGCAAGTCGAGCGGTAGCCCAGAGAGCTTGCTTTCGGGTGACGAGCGGCGG 60

61 ACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAG 120

121 CTAATACCGCATAATGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGA 180

181 TGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTA 240

241 GCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGG 300

301 AGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGTAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTG 360

361 TGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGGTGAGGTTAATA 420

421 ACCTCATCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGC 480

481 GGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGG 540

541 TCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCA 600

601 GGCTGGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATC 660

661 TGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAA 720

721 GCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTT 780

781 GGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGG 840

841 AGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGC 900

901 ATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTT 960

961 TCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGTGCTGCATG

3���� 4-9 �R��,���%��".�!��;�<1�S�&"� 16S rRNA ;�<*��!"��"&�.>��!!"# 2

51

1 CCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAGCCCAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGGGG 60

61 ACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAG 120

121 CTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGA 180

181 TGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTA 240

241 GCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGG 300

301 AGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTG 360

361 TGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGGTGAGGTTAATA 420

421 ACCTCATCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAACAGCCGC 480

481 GGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGG 540

541 TCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCA 600

601 GGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATC 660

661 TGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAA 720

721 GCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTT 780

781 GGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGG 840

841 AGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGC 900

901 ATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCACAGAACTT 960

961 TCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGG

3���� 4-10 �R��,���%��".�!��;�<1�S�&"� 16S rRNA ;�<*��!"��"&�.>��!!"# 3

52

0.01

Enterococcus faecalis

Bacillus subtilis

Streptococcus dentirousetti

Pseudomonas aeruginosa

Rhodococcus sp.

3���� 4-11 *=�]�+%<��%��%�%,v�������+ZS�t��;�<1�S�&"� 16S rRNA ;�<*��!"��"&�.>��!!"# 1 !"#�,�*&��$ *��*O���$�*��<O_<�%�* � )�< 0.01 P��R��,���%��".�!�� .�&�c��, ����HR���< 100 bootstrap

Isolate1

Enterococcus faecalis

Bacillus subtilis

Streptococcus dentirousetti

Pseudomonas aeruginosa

Rhodococcus sp.

53

0.01

Bacillus subtilis

Streptococcus dentirousetti

Rhodococcus sp.

Pseudomonas aeruginosa

Klebsiella pneumoniae

3���� 4-12 *=�]�+%<��%��%�%,v�������+ZS�t��;�<1�S�&"� 16S rRNA ;�<*��!"��"&�.>��!!"# 2 !"#�,�*&��$ *��*O���$�*��<O_<�%�* � )�< 0.01 P��R��,���%��".�!�� .�&�c��, ����HR���< 100 bootstrap

Bacillus subtilis

Streptococcus dentirousetti

Rhodococcus sp.

Isolate2

Pseudomonas aeruginosa

Klebsiella pneumoniae

54

0.01

Bacillus subtilis

Streptococcus dentirousetti

Rhodococcus sp.

Klebsiella pneumoniae

Pseudomonas aeruginosa

3���� 4-13 *=�]�+%<��%��%�%,v�������+ZS�t��;�<1�S�&"� 16S rRNA ;�<*��!"��"&�.>��!!"# 3 !"#�,�*&��$ *��*O���$�*��<O_<�%�* � )�< 0.01 P��R��,���%��".�!�� .�&�c��, ����HR���< 100 bootstrap

Bacillus subtilis

Streptococcus dentirousetti

Rhodococcus sp.

Isolate3

Klebsiella pneumoniae

Pseudomonas aeruginosa

55

����� 5 �Y%� ) � ��B�" �#��� ����.��������

5.1 �Y%� )B�" �#��� ����������������.���Q���"&%!"#"+�: )����������! *��"*�%.�$!"#��������)����I<P��Q:&� (Segerback et al., 1995 *�� Tareke et al., 2000) �&)�<��I �"���P1$����������&)�<�%$�<;%�<P�����%����=�� !�<�Q ��'��� �)<=�P'$"�������TU��;�<���������P�-��1� � (Cherry et al., 1956 *�� Prasad, 1982) *��H����&<��+�����)� ,%;�<���������P���'��HR�+%�*�\<!"#�$H��+Z1]�&'�,<=)������%������Q<* )<!"# $�<����Q^'](��(< �1)� ���!��'�Z������ .�&�1Z#�%)����������!"#����;_S�����=�� ],^b�;�<�c�����&�������� (Tareke et al., 2000 *�� Tareke et al., 2002) H���Q^��, �P��������&�SR��$;�<��������� (SUBSTANCE PROFILES, 1991) !R�P'$�Z#�O(���)�&�<�()*'�)<�SR�H_<�����������TU��P��(�;�<�������&�&)�<*+�)'��& �$��&"��&<��%�H,&+��������TU��;�<���������P�*'�)<�SR�-��1� � �1)� *)�SR� *��P��SR���"&;�<.�<<���Q ��'���*��!"#�R��,j �Z� ����O*&�HQ���!�"&�!"#����O���&����������$H��*'�)<�SR��,<��)�% (Shanker et. al., 1990 *�� lgnatov et. Al., 1996 ) �,<�,S��Z#��R� ,%�&)�<�SR�H�����<*��*'�)<�SR�!�S<;�<1Q1�P�����%^!"#"�����SR�,��!R������"S&<�R��Q<P���'���'�%!"#"��������� �����%�� 24 1,#%.< +���'���'�%"�,�:^�;Q)� *��<O_<"����H��j;�<HQ���!�"&�!"#P1$�������������*'�)<�������, �. ��H� *��*'�)<+�,<<���R�'�,�����H��j .�&���������!"#P1$"����^!"#�'��� ��Z#�<H��)�&,�&,S<����H��j;�<*��!"��"& �Z#��R��1ZS��H��j!"#�$���"S&<P���'��*;I<!"#"��������������)%��������'Z��P���'���'�% +�.�.��"*��!"��"&�H��j��H���+����"S&<!"#"�,�:^�* � )�<�,��+"&< 3 1����Z� �.>��!!"# 1 >_#<����.�.��"!"#"�,�:^��";�%P� ����HQ���;�����I� *��";����"&�, �.>��!!"# 2 >_#<����.�.��"!"#"�,�:^��";�%;Q)� ����HQ���;�����I� ";����"&� *�������Z���&�S *���.>��!!"# 3 >_#<����.�.��""�,�:^��";�%;Q)� ����HQ���;���P'j)�%)�.�.��";�<�.>��!!"# 2 ";����"&� *�������Z���&�S =����!���<!"#�$&Z�&,���� �%H+�*��!"��"&!"#"�%�������$P�������&���������P���#<*%��$� *$%)�H�)+��%�'���'��&;�<*��!"��"&���&���������P�*'�)<�SR�!�S<1Q1��,<��)�%���,� *���,<�� +�%)�.�.��";�<�.>��!!"# 2 �,� 3 "�,�:^�!"#"�%���$�&��_<�,��� �Z#��R�*��!"��"&!,S< 3 �.>��! ���,�.��..>���"��I��� *�$%%������'��Q^]�+*������^;�<.��..>���"��I���!"#��,�$H�����%,��)�����(���Z�*�<!"# 260 *�� 280 ��.�� � *�����!R�����I�. �./��>"��H�����.�� +�%)�����^.��..>���"��I���!"#� �"&�$H��!,S< 3 �-.>��! "����^*���Q^]�+P����,�!"#�" *��)+����q"�;��;�<��&�"��I��� *��<O_<�Q^]�+!"#

56

�+"&<+�;�<�"��I���!"#� �"&�$!"#����O�R��P1$P����u_�:�!�<1"%.���Q� )�� *���Z#��R�.��.- .>���"��I���!"#��,��$H��*��!"��"&!,S< 3 �.>��!�P1$�����"��I���*)*��P�����+�#����^1�S�&"���Q�,�:� 16S rRNA .�&�c�����&�+">"�����$%&�()+�����!"#���*���H������%^��Q�,�:�P�1�S�&"� 16S rRNA ;�< E. coli �,<��)�%�*�$%P��!!"# 3 (Precigou et al., 2004) +�=�� ],^b�+">"����";�������^ 1,060 �()��� �1)%< R�*'�)<��%��".�!��!"#P1$���*��+������,<!"#���%$ *��<P'$�'I�%)�+�����!,S< 2 ��&"����()�!"#"�%���Q�,�:����,��"��I���*)*��;�<*��!"��"&*�� ����OP1$P�����+�#����^1�S�&"���Q�,�:� 16S rRNA ;�<*��!"��"&!,#%��$ �Z#��R�=�� ],^b�+">"����!"#�$�=)�����!R�����Q!-�}, ,��$%&���>� ,�HR��+�� *���1Z#��;$�1�S�&"� lacZ >_#<�%��Q�����$�<���>��" $�-��*��. >����;�<+����� pUC118 !"# ,��$%&���>� ,�HR��+��1�����"&%�,� �Z#�!R����!�����/����;$��()�>���P'$��u,& E. coli ��&+,�-Q� DH5α *�$%�,���Z��.�.��"�";�%>_#<�����>���!"#" �"��I�����&=��&()����'��!"#"�)%�������;�<&��c�1"%��*�+�>���� X-gal *�� IPTG �Z#��R����"S&<�+�#����^�+Z#���,�+�����*��%������'�����I�. �./��>"��H�����.�� +�*O�+�����";����(<;_S� *��<O_<�%��R���IHP������$�<+�������&=�!"#"1�S�&"� 16S rRNA !"#�$H��*��!"��"&!,S< 3 �.>��!�&() H����� �%H������"1�S�&"� 16S rRNA P�+�������&=�.�&��� ,��$%&���>� ,�HR��+�� BamHI *�� HindIII +�*O��"��I��� 2 *O� .�&*O�!"# 1 ����*O�;�<+�����!"#";��� 3,162 �()��� �)%�*O�!"# 2 ����*O�;�<1�S�&"� 16S rRNA !"#";��� 1,060 �()��� *���Z#��R� +�������&=�!"#��,��$������"��I���*)*��P���� �%H���1�S�&"� 16S rRNA .�&�!����+">"�����+Z#�&Z�&,�=����.��� +�=�� ],^b�+">"����";��� 1,060 �()��� �!)��,�;���!"#!R���� ,��$%&���>� ,�HR��+�� BamHI *�� HindIII *��=�� ],^b�+">"�������# $� *��<P'$�'I�O_<���"1�S�&"� 16S rRNA P�+�������&=�!"#��,��$ *���Z#��R�+�������&=�!"#�$�,����&Z�&,�%)�"1�S�&"� 16S rRNA �'��R��,���%��".�!�� *���R�=�;�<�R��,���%��".�!��!"#�$����"&��!"&��%��'Z���,��R��,� ��%��".�!��P�t��;$�(�.��*��%������'�%<��%��%�%,v����� �+Z#�HR�*����&+,�-Q�*��!"��"&!"#�,���Z���$ +�%)��.>��!!"# 1 "�%��'Z���(<�Q� 99% �,� Enterococcus faecalis (��; Accession AB362602) >_#<�Z#�+�H��^��,�:^�!�<�,^t��%�!&�*��!"��"&P���Q��"S!"#����*��!"��"&*���%� .�.��""�";�%P� �(��)�<�� ;�����I� *��";����"&� (Jacobs et. al., 1978, Moellering and Krogstad, 1979 *�� Uttley et. al.,1988) P'$=�!"#�����$�<�,��,�:^�;�<*��!"��"&�.>��!!"# 1 !"#�,���Z���$ H_<����O��Q��$%)�*��!"��"&�.>��!!"# 1 !"#�,���Z���$H,��&()P���Q� Enterococcus faecalis �R�'�,��.>��!!"# 2 *���.>��!!"# 3 "�%��'Z���(<�Q� 99% �,� Klebsiella pneumoniae ��; Accession EF032681 *�� ��; Accession AF511429 ��R��,� >_#<H���,�:^�!�<�,^t��%�!&�;�<*��!"��"&��Q� Klebsiella pneumoniae >_#<����*��!"��"&*���� .�.��""�";�%;Q)�O_<�"�'�Z�<�)�� ;���P'j) "�,�:^��Z���&�S (Chen et. al., 2007 *�� Prescott, 2007) +�%)�"

57

�%���$�&��_<��<�)%��,�*��!"��"&�.>��!!"# 2 *�� 3 !"#�,���Z���$ H_<��H��Q��$%)�*��!"��"&�-.>��!!"# 2 *�� 3 H,��&()P���Q� Klebsiella pneumoniae *$%)��.>��!!"# 2 �,� 3 H�)+��%�* � )�<�,��&)�<1,��H�;�<�,�:^�.�.��"'�Z��R��,���%��".�!�� * )H�����u_�:��,�:^��q+����<�)%� �1)� ����H��jP���'��!"#"�%�* � )�<;�<�)�+"��1+�%)��.>��!!"# 2 �H��j�$�"!"#�Q�!"#�)�+"��1 4 P�;^�!"#�.>��!!"# 3 �H��j�$�"!"#�Q�!"#�)�+"��1 7 *������H��jP���'��!"#"�%��;$;$�'���'��&;�<���������+�%)�!,S<�.>��!!"# 2 *�� 3 �H��j�$�"!"#�Q�P�����������%��;$;$� 0.5% (�SR�'�,� )����� �) (1,1%��&� ��1,&.1 �, 2550) H_<�(�'Z��H���Q��$%)�*��!"��"&�.>��!!"# 2 �,� 3 ��H����*��!"��"&P���Q���"&%�,��Z���Q� Klebsiella pneumoniae * )H,��&()P���&+,�-Q�!"#* � )�<�,� >_#<H��<��%�H,&!"#=)���+�*��!"��"&!"#����O�H��jP�����������$��<��&+,�-Q� �$*�) ��&+,�-Q� Pseudomonas, Rhodococcus *�� Xanthomonas *���Z#���I%[�"S�$!R����*&� Rhodopseudomonas palustris H���SR�!�S< >_#<P� ,%�&)�<!,S<'��"S�*!����>_;�<���������H�"�c�����&����# $�!"#��"#&%;$�<�Z� �c�����&��"�����1,#����&����������+Z#�=�� ������� (Wampler and Ensign, 2005) >_#<������#<!"#�)���PHP����u_�:� )��O_<�����!-�]�+P�������&��������� �%!,S<'�&"�!"#��"#&%;$�<�,���������c�����&��"�����1,#� �Z�&"�!"#O���',�*��*���',��������>��"������!"#����O���&�������������������� �+Z#��R�����&Q� �P1$P�]���Q ��'��� )�� * )�&)�<��I �*��!"��"&!"#�,���Z���$!,S< 3 �.>��! H,��&()P���Q)*��!"��"&�)�.����)�%�Z� *��!"��"&��Q� Enterococcus �&()P��R��$;�<��*���, %� '�Z�+�P���#<*%��$����%)� 10 ��&+,�-Q� .�&��&+,�-Q�!"#�R��,j �$*�) Enterococcus faecalis *�� Enterococcus faecium !"#,��)�P'$����.��P��� �1)� .��]�%��&Z#��Q',%PH�,���� (infective endocarditis), ��� ���1ZS�!"#�����i���%� �%�O_<��� ���1ZS�P����*�.�'� (Jacobs et. al., 1978, Moellering and Krogstad, 1979 *�� Uttley et. al.,1988) ;^�!"#*��!"��"&��Q� Klebsiella +��$P���#<*%��$� *������!�<�����i���%� �%!,S<����!�<����'�&PH '�Z���� ���1ZS�!"#���*=�!"#!R�P'$����.������% *���&Z#�'Q$��<�,���� (Chen et. al., 2007 *�� Prescott, 2007) �,<�,S�O_<*$&,<)��&"��&<��O_<�%�����OP�������&���������;�<*��!"��"&!,S<��<��Q��"S�I � �I���������"#&<!"#H��R�*��!"��"&!"#�,�*&��$!,S<��<��&+,�-Q��"S�P1$P���� u_�:� )��

58

5.2 � ��B�" �#��� ����,�*&�*��!"��"&���&���������H��*'�)<�SR�!�S<1Q1�P�H,<'%,�1��Q�" .�&�����"S&<�R��Q<P���'��!"#"�������������*'�)<��"&%;�<�������*���. ��H� +�*��!"��"&>_#<"�,�:^�!�<�,^t��%�!&�* � )�<�,� 3 �.>��! �Z#��R�.��..>���"��I���;�<*��!"��"&!,S< 3 �.>��! ��+�#����^1�S�&"���Q�,�:� 16S rRNA +�*O�=�� ],^b�+">"����";�������^ 1,060 �()��� '�,<H��.���=�� ],^b�+">"���� *�$%��,�+�������&=� !R���� �%H���1�S�&"� 16S rRNA P� +�������&=�.�&��� ,��$%&���>� ,�HR��+�� BamHI *�� HindIII +�*O�+�����;�������^ 3,162 �()����,�*O�;�<1�S�&"� 16S rRNA ;�������^ 1,060 �()��� �Z#�&Z�&,�=���� �%H����"���,S<.�&����+�#����^1�S�&"� 16S rRNA !"#�&()P�+�������&=�!"#� �"&�$.�&�!����+">"���� +�*O�=�� ],^b�+">"����";�������^ 1,060 �()��� >_#<�!)��,�;���!"#+�H����� ,��$%&���>� ,�HR��+��*���Z#��R�+�������&=�;�<*��!"��"&!,S< 3 �.>��! �'��R��,���%��".�!��;�<1�S�&"� 16S rRNA *�����"&��!"&��%��'Z��;�<�R��,���%��".�!��!"#�$�,�t��;$�(��R��,� ��%��".�!��.������OH,�HR�*��*��!"��"&���&���������!"#�,�*&��$�,<�"S *��!"��"&�.>��!!"# 1 H,��&()P���Q� Enterococcus faecalis ;^�!"#*��!"��"&�.>��!!"# 2 *���.>��!!"# 3 H,��&()P���Q� Klebsiella pneumoniae

59

5.3 �.�������� P����u_�:���,S<�"S��������,�*&�*��!"��"&���&��������� .�&�����"S&<�R��Q<P���'�����Z� #R�!"#"�������������*'�)<�������*��+�,<<�� >_#<HR�*��.�.��"!"#�H��j����'������������$.�&���+�H��^��%�* � )�<H���(��)�< ;��� �" *���,�:^�;��;�<.�.��" >_#<��HH�!R�P'$*&��%�* � )�<�$)�"�!)�!"#�%� �+���.�.��"��<1���"�,�:^�!�<��&]�+!"#��$�&��_<�,��� �,<�,S��+Z#��%�O(� $�<*���)��1Z#�OZ� H_<�%�!R����u_�:��+�#� �!�<�,^t��%�!&� *���Q^��, �!�<1"%��" �1)� ���&$��"*�� ���&$������ �,<�� ������Z#��!"# u_�:��<��������!�<1"%��";�<�>��� �+Z#�1)%&P����HR�*����&+,�-Q�;�<*��!"��"&!"#�,���Z���$�)%�,����HR�*����&+,�-Q� .�&P1$�R��,���%��".�!��;�<1�S�&"� 16S rRNA !"#�$!R����u_�:�P�.��<<��%�H,&q�,��"S �%!,S<�%�u_�:��%�����OP�������&���������;�<*��!"��"&!"#�,���Z���$.�&P1$�!����!"#"u,�&]�+ �1)� .���.!����/��%��,��(< �+Z#��������&Z�&,�%)�*��!"��"&!"#�,�*&��$����O���&����������$H��< ��Z#�<H��*��!"��"&!,S< 3 �.>��! !"#�,�*&��$H,��&()P��Q)*��!"��"&�)�.�� H_<)�%��R��u_�:� )��*��)�%��R�����&Q� �P1$P����,��Q ��'����$%&

60

��"� �.��%�

��)�%;%,j u�"�Q;. (2549). )*+,-./.0+*1+-.,*2 Principles of genetic engineering. ]��%�1�1"%��" �^�%�!&�u�� �� '�%�!&��,&�(�+�. 1,1%��&� ��1,&.1 �. (2550). +-.34+5-6789:+5801-;,<=2>*;?16@A).AB,9-B*06.C9-DEFG@AHDFIJ-+ ?K9<;2LM-@CL;N7EN2O2J:;K=:FN917.A. ���jj���+�-�%�!&�u�� ��,^b� ]��%�1�1"%��" �^�%�!&�u�� �� '�%�!&��,&�(�+�. 1�� �� -Q%H� �. (2548). )@6P2P9BA@-;NA==C@B-PE)9+79. P� R���1"%��". ���PH ���"H� ���Q��^� *�� �^�. +�+���,S<!"# 4. ]��%�1�1"%��" �^�*+!&u�� �� '�%�!&��,&;��*�)�. ;��*�)�: .�<+�+���,<����%�!&�. 531 '�$�. �<�,�:^� *����"1� �Q%��^+���H. (2548). J79NA==C@B-@:H=D/. +�+���,S<!"# 5. ��Q<�!+¡: �R��,�+�+�*')< HQ¢��<��^�'�%�!&��,&. %���� u����,<�". (2539). Gel electrophoresis. P� %�!&����!,��,&P���� �%H���%���Hq,&.��..> *��&"�. %�,� � H,�!��!� &� *���^�. ]��%�1�HQ�1"%%�!&������� �^��!�������*+!&� '�%�!&��,&�1"&<P'). �1"&<P'): +<:��%,���}���+�+�. 476 '�$�. �Q���!�� �0&�.1�^��Q�. (2548). R:2S7=C3=+..E)1TL*;UI2. +�+���,S<!"# 3. ]��%�1�+,�-Qu�� �� �^� %�!&�u�� �� '�%�!&��,&��: �u�� ��. ��Q<�!+¡: �R��,�+�+�'�%�!&��,&��: �u�� ��. 282 '�$�. u���+� ��!-����^" . (2531). R:2S7=C3=+..E:/WC1:UC+-.)1TL*;UI2. ]��%�1�1"%��" �^�%�!&�u�� �� HQ¢��<��^�'�%�!&��,&. ��Q<�!+¡: �.%�1�j���+�+�. 206 '�$�. Bergmark, E., C. J. Calleman, and L. G. Costa. (1991). Formation of hemoglobulin in adducts of acrylamide and its epoxide metabolite glycidamide in the rat. Toxicol. Appl. Pharm. 111: 352�363. Brown, L., M. M. Rhead, D. Hill and K. C. C. Bancroft. (1982). Rapid screening technique utilizing high-performance liquid chromatography for assessing acrylamide contamination in effluents. Analyst. 107: 749-754. Cavins, J. F., and M. Friedman. (1968). Specific modification of sulfhydryl groups with β-unsaturated compounds. J. Biol. Chem. 243: 3357-3360. Chen C.Y., C.M. Kao, and S.C. Chen. (2007) Application of Klebsiella oxytoca immobilized cells on the treatment of cyanide wastewater. Chemosphere. 10: 1-7. Cherry, A. B., A. F. Gabaccia, and H. W. Senn. (1956). The assimilation behavior of certain toxic organic compounds in natural waters. Sewage Ind. Waste. 28: 1137.

61

Croll, B. T., G. H. Arkell, and R. P. J. Hodge. (1974). Residues of acrylamide in water. Water Ras. 8: 989-993. Friedrick, G.C., and G. Mitrenga. (1981). Utilization of aliphatic amides and formation of two different amidases by Alcaligenes eutrophus. J. Gen. Microbiol. 125: 367-374. Gökmen V. and Ş. Z. Hamide. (2007). Acrylamide formation is prevented by divalent cations during the Maillard reaction. Food Chemistry. 103 : 196-203. Grant, D. J. W., and J. Wilson. (1973). Degradation and hydrolysis of amides dy Corynebacterium pseudodiptheriticum NCIB 10803. Microbios. 8: 15-22. Hirrlinger, B., A. Stolz, and H. J. Knackmuss. (1996). Purification and properties of an amidase from Rhodococcus erythropolis MP50 which enantioselectively hydrolyzes 2-arylpropionamides. J. Bacteriol. 178: 3501-3507. Hynes, M. J., and J.A. Pateman. (1970). The use of amides as nitrogen source by Aspergillus nidulans. J. Gen. Microbiol. 63: 317-324. Ignatov O.V., S.M. Rogatcheva , O.V. Vasileva , and V.V. Ignatov. (1996). Selective determination of acrylonitrile, acrylamide and acrylic acid in waste waters using microbial cells. Resources, Conservation and Recyclin. 18: 69-78. Jacobs M. R., H. J. Koornhof, R. M. and Robins-Browne. (1978). Emergence of multiply resistance in enterococci. N Engl J Med. 299: 735-40. Kagayama, T., and T. Ohe. (1990). Purification and properties of an aromatic amidase from Pseudomonas sp. GDI211. Agric. Biol. Chem. 54: 2565-2571. Lande, S. S., S. J. Bosch, and P. H. Howard. (1979). Degradation and leaching of acrylamide in soil. J. Environ Qual. 8: 133-137. Moellering R. C. Jr. and D. J. Krogstad. (1979). Antibiotic resistance in enterococci. In: Schlessinger D, 2ed. Microbiology. Washington, D.C.: American Society for Microbiology. 293-298. Mottram, D. S., B. L. Wedzicha, and A. T. Dodson. (2002). Acrylamide is formed in the Maillard reaction. Nature. 419: 448�449 Nagasawa T., H. Shimizu, and H. Yamada. (1993). The superiority of the third-generation catalyst, Rhodococcus rhodochrous J1 nitrile hydratase, for industrial production of acrylamide. Appl. Microbiol. Biotechnol. 40: 189�195. Nagasawa, T., and H. Yamada. (1989). Microbial transformation of nitriles. Trends Biotechnol. 7: 153- 158.

62

Nawaz, M. S., S. M. Billedeau, and C. E. Cerniglia. (1998). Influence of selected physical parameters on the biodegradation of acrylamide by immobilized cells of Rhodococcus sp. Biodegradation 9: 381�387. Nawaz, M. S., W. Franklin, and C. E. Cerniglia. (1993). Degradation of acrylamide by immobilized cells of a Pseudomonas sp. and Xanthomonas maltophilia. Can. J. Microbiol. 39: 207�212. Nawaz M. S., W. Franklin, and C. E. Cerniglia. (1994a) Degradation of aliphatic amide mixture by immobilized and non immobilized cells of Pseudomonas sp. Environ. Sci. Technol. 28: 1106� 1109. Nawaz, M. S., A. A. Khan, J. E. Seng, J. E. Leakey, P. H. Siitonen, and C. E. Cerniglia. (1994b). Purification and characterization of an amidase from an acrylamide-degrading Rhodococcus sp. Appl. Environ. Microbiol. 60: 3343�3348. Prasad, D.Y. (1982). Polyacrylamide as a coagulant aid in water treatment. Chem Age India. 34: 387- 391. Precigou S., M. Wieser1, P. Pommares, P. Goulas1, and R. Duran. (2004). Rhodococcus pyridinovorans MW3, a bacterium producing a nitrile hydratase. Biotechnology Letters. 26: 1379- 1384. Prescott J. (2007). Letter to the Editor. Veterinary Microbiology. 125: 1. Segerback, D., C. J. Calleman, J. L. Schreoder, L. G. Costa, and E. M. Faustman. (1995). Formation of N-7-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)guanine in DNA of the mouse and the rat following intraperitoneal administration of [14C]acrylamide. Carcinogenesis 16: 1161-1165. Shanker, R., C. Ramakrishna, and P. K. Seth. (1990). Microbial degradation of acrylamide monomer. Arch. Microbiol. 154: 192�198. Stadler, R. H., I. Blank, N. Varga, F. Robert, J. Hau, P. A. Guy, M. Robert, and S. Riediker. (2002). Acrylamide from Maillard reaction products. Nature. 419: 449�450. SUBSTANCE PROFILES. (1991). Acrylamide. Sixth Annual Report on Carcinogens. 1-3. Svesson, K., L. Abramsson, W. Becker, A. Glymm, K.-E. Hellenas, Y. Lind, and R. J. Rosen. (2003). Dietary intake of acrylamide in Sweden. Food Chem. Toxicol. 41: 1581�1586. Tareke, E., P. Rydberg, S. Eriksson, and M. Tornqvist. (2002). Analysis of acrylamide, a carcinogen formed in heated foodstuffs. J. Agric. Food Chem. 50: 4998�5006. Tareke, E., P. Rydberg, P. Karlsson, S. Eriksson, and M. Tornqvist. (2000). Acrylamide: a cooking carcinogen? Chem. Res. Toxicol. 13: 517�522.

63

Tilson, H. A., and P. A. Cabe. (1979). The effects of acrylamide given acutely or in repeated doses on fore- and hindlimb functions of rats. Toxicol. Appl. Pharm. 47: 253�260. Uttley A. H. C., C. H. Collins, and J. Naidoo. (1988). Vancomycin-resistant enterococci. Lancet:1: 57- 58. Wampler, D. A., and S. A. Ensign. (2005). Photoheterotrophic metabolism of acrylamide by a newly isolated strain of Rhodopseudomonas palustris. Appl. Environ. Microbiol. 71: 5850-5857. Wang, C., and C. Lee. (2001). Denitrification with acrylamide by pure culture of bacteria isolated from acrylonitrile-butadiene-styrene resin manufactured wastewater treatment system. Chemosphere 44: 1047�1053. Wang, C., and C. Lee. (2007). Isolation of the acrylamide denitrifying bacteria from a wastewater treatment system manufactured with polyacrylonitrile fiber. Curr Microbiol. 55: 339-343. Zabaznaya, E. V., S. V. Kozulin, and S. P. Voronin. (1998). Selection of strains transforming acrylonitrile and acrylamide into acrylic acid. Appl. Biochem. Microbiol. 34: 341�345. [Online]. *'�)<�;$�O_< http://gillnet.lab.nig.ac.jp/~cvector/map/pUC118.gif �Z��$��Z#� 12/01/2551 [Online]. *'�)<�;$�O_< http://webdb.dmsc.moph.go.th/ifc_toxic/a_tx_1_001c.asp?info_id=285 �Z��$��Z#� 12/01/2551 [Online]. *'�)<�;$�O_< http://www.mcb.mcgill.ca/~hallett/GEP/Lecture15/Image31.gif �Z��$��Z#�31/01/2551 [Online]. *'�)<�;$�O_< http://www.nd.edu/~aseriann/maxam.gif �Z��$��Z#� 31/01/2551 [Online]. *'�)<�;$�O_< http://www.stami.no/IPS?module=Articles;action=Artic... �Z��$��Z#� 28/08/2550 [Online]. *'�)<�;$�O_< http://www.student.chula.ac.th/~49371019/polymerase_chain_reaction.htm �Z��$��Z#� 09/01/2551 [Online]. *'�)<�;$�O_< http://www.thaiscience.com/lab_vol/p23/PCR-DGGE.asp �Z��$��Z#� 06/01/2551

64

Y�B��"

65

Y�B��" " " �� �) � �� �

1. Nutrient broth (NB) Nutrient 0.65 ��, �SR���,#� 50 ������ � *�)<P�)'���!���< ���� �'����� 5 ������ � �R�����_#<�)��1ZS�!"#�Q^'](� 121 �<u��>��>"&� �����%�� 15 ��!" 2. Nutrient agar (NA) Nutrient 1.3 ��, Agar 2 ��, �SR���,#� 100 ������ � �R�����_#<�)��1ZS�!"#�Q^'](� 121 �<u��>��>"&� �����%�� 15 ��!" *�$%�!P�)H����"S&<�1ZS� H��������^ 10 ������ � 3. Stock 20% Acrylamide Acrylamide 20 ��, �SR���,#� 100 ������ � 'Q$�$%&���(���"&/�&��!,S<;%� *�$%�R�����_#<�)��1ZS�!"#�Q^'](� 121 �<u��>��>"&� �����%�� 15 ��!" *����I�!"#�Q^'](� 4 �<u��>��>"&� 4. Stock solution �R�'�,�� �"& Minimal medium 10X

KH2PO4 1.7 ��, Na2HPO4 9.8 ��, (NH4)2SO4 1.0 ��,

��,����� �P'$���� 100 ������ � �$%&�SR���,#� �R�����_#<�)��1ZS�!"#�Q^'](� 121 �<u��>��>"&� �����%�� 15 ��!" *����I�!"#�Q^'](� 4 �<u��>��>"&� 100X

MgSO4.7 H2O 0.5 ��, FeSO4.7 H2O 0.025 ��, H2SO4 2.5 .���� �

66

��,����� �P'$���� 50 ������ � �$%&�SR���,#�!"#=)��������_#<�)��1ZS�*�$% ��I�!"#�Q^'](� 4 �<u�-�>��>"&� 1000X

MgO 0.54 ��, CaCO3 0.1 ��, FeSO4.7 H2O 0.22 ��, ZnSO4.7 H2O 0.07 ��, MnSO4.5 H2O 0.06 ��, CuSO4.5 H2O 0.012 ��, CoSO4.7 H2O 0.014 ��, H3BO3 0.003 ��, HCl 2.5 .���� �

��,����� �P'$���� 50 ������ � �$%&�SR���,#�!"#=)��������_#<�)��1ZS�*�$% ��I�!"#�Q^'](� 4 �<u��>��>"&� 5. Luria-Bertani broth (LB broth) Bacto-Tryptone 5 ��, Yeast extract 2.5 ��, NaCl 5 ��, �SR���,#� 500 ������ � �R�����_#<�)��1ZS�!"#�Q^'](� 121 �<u��>��>"&� �����%�� 15 ��!" 6. Luria-Bertani agar (LB agar) + 50 µg/ml Ampicillin Agar 3.5 ��, LB broth 100 ������ � �R�����_#<�)��1ZS�!"#�Q^'](� 121 �<u��>��>"&� �����%�� 15 ��!" �Z#��Q^'](�;%����<����^ 50 �<u��>��>"&� � � 50 µl ;�< Ampicillin (0.1 g/ml) 7. ��'���'�% Minimal medium + 0.5% Acrylamide 10X 5 ������ � Yeast extract 0.1 ��, �SR���,#� 44 ������ � =�P'$�;$��,� *�$%*�)<P�)'���!���<'����� 5 ������ � �R�����_#<�)��1ZS�!"#�Q^'](� 121 �<u��>��>"&� �����%�� 15 ��!" H���,S�* )��'���� � 100X 50 .���� �

67

1000X 5 .���� � 20% Acrylamide 125 .���� � 8. ��'��*;I< Minimal medium + 0.5% Acrylamide 10X 10 ������ � �SR���,#� 87.5 ������ � Agar 2 ��, �R�����_#<�)��1ZS�!"#�Q^'](� 121 �<u��>��>"&� �����%�� 15 ��!" �Z#��Q^'](�;%����<����^ 50 �<u��>��>"&� � � 100X 1 ������ � 1000X 100 .���� � 20% Acrylamide 2.5 ������ � 9. 2X YT medium Bacto-Tryptone 8 ��, Yeast extract 5 ��, NaCl 2.5 ��, �SR���,#� 500 ������ � �R�����_#<�)��1ZS�!"#�Q^'](� 121 �<u��>��>"&� �����%�� 15 ��!" *����I�!"#�Q^'](� 4 �<u��>��>"&� 10. Ampicillin (0.1 g/ml) Ampicillin 0.1 ��, �SR���,#�!"#=)��������_#<�)��1ZS�*�$% 1 ������ � ��I�!"#�Q^'](� -20 �<u��>��>"&� 11. 0.5M EDTA (pH 8.0) EDTA 18.61 ��, �SR���,#� 80 ������ � =�P'$�;$��,� ��,��)�+"��1;�<�������&���� 8 �$%& NaOH *�$%��,����� ����� 100 ������ � �$%&�SR���,#� �R�����_#<�)��1ZS�!"#�Q^'](� 121 �<u��>��>"&� �����%�� 15 ��!" 12. 5X TBE buffer (pH 8.0) Tris base 60.5 ��, Boric acid 25.6 ��, 0.5 M EDTA 20 ������ �

68

13. 20% SDS SDS 2 ��, �SR���,#�!"#=)������_#<�)��1ZS�*�$% 10 ������ � 14. 1M Tris-HCl (pH 8.0) Tris base 1.25 ��, �SR���,#� 8 ������ � =�P'$�;$��,� ��,��)�+"��1;�<�������&���� 8 *�$%��,����� ����� 10 ������ ��$%&�SR���,#� �R�����_#<�)��1ZS�!"#�Q^'](� 121 �<u��>��>"&� �����%�� 15 ��!" 15. TE buffer 1M Tris-HCl 100 .���� � 0.5 M EDTA 10 .���� � ��,����� ����� 10 ������ ��$%&�SR���,#�!"#=)��������_#<�)��1ZS�*�$% 16. X-gal (50 mg/ml) X-gal 0.5 ��, N,N-dimethylformamide 1 ������ � ��I�!"#�Q^'](� -20 �<u��>��>"&� 17. 0.1M IPTG IPTG 0.072 ��, �SR���,#�!"#=)��������_#<�)��1ZS�*�$% 3 ������ � ��I�!"#�Q^'](� -20 �<u��>��>"&� 18. �"��I���� �t�� λ/HindIII λ DNA 167 .���� � HindIII 5 .���� � 10X HindIII buffer 50 .���� � �SR���,#� 278 .���� � �)!"#�Q^'](� 37 �<u��>��>"&� �����%��;$��Z� �%H����(�*��;�<*O�.�&����I�. �./��>"��H�����.�� � � 500 .���� � phenol:chloroform:isoamyl (25:24:1) �i���'%"#&<!"# 8,000 ��� )���!" �����%�� 5 ��!" *&�����)%�P�;$�<���� � 100 .���� � 6X loading dye ��I�!"# -20 �<u��>��>"&� 19. Stock glycerol �1ZS�*��!"��"& 300 .���� � Glycerol 700 .���� �

69

�R��*1)P��. ��H��'�%����^ 3 %���!" *�$%��I�!"#�Q^'](� -70 �<u��>��>"&� 20. Ethidium bromide Ethydium bromide 10 .���� � �SR���,#� 100 ������ �

70

Y�B��" � =�� %# pUC118 ��#�� %��S,#,�������-> !��#,��=�C�)�� lacZ >d��C*.����,�#(���

(!"#� : http://gillnet.lab.nig.ac.jp/~cvector/map/pUC118.gif �Z��$��Z#� 12/01/2551)

71

Y�B��" � �%T�" ����S�� ��. �.����#���?���

�)�����(���Z�*�<!"# 260 ��.�� � >_#<%,��$ 1 '�)%& "�%��;$;$��"��I����!)��,� 50 .����, )������� � O$��.>��!!"# 1 "�)�����(���Z�*�<!"# 260 ��.�� � �Z� 0.40935 H�"�%��;$;$��"��I����!)��,� 50 x 0.40935 = 20.4675 x HR��%��!)�����HZ�H�<�������&�"��I��� ,%�&)�< (O$�") �+���q��,S�.��..>���"��I�;�<��&+,�-Q�!"# 1 "�%��;$;$��!)��,� 20.47 .����, )������� �

72

Y�B��" � 3������#���%����(�-�#! (DNA sequencing profile)

K1 �Z� �R��,���%��".�!��!"#�$H��+�������&=�;�<*��!"��"&�.>��!!"# 1 �Z#�P1$+����� 16S_UniNBam ���� ,%���# $��c�����&�

73

K2 �Z� �R��,���%��".�!��!"#�$H��+�������&=�;�<*��!"��"&�.>��!!"# 1 �Z#�P1$+����� 16S_UniCHin ���� ,%���# $��c�����&�

74

K3 �Z� �R��,���%��".�!��!"#�$H��+�������&=�;�<*��!"��"&�.>��!!"# 2 �Z#�P1$+����� 16S_UniNBam ���� ,%���# $��c�����&�

75

K4 �Z� �R��,���%��".�!��!"#�$H��+�������&=�;�<*��!"��"&�.>��!!"# 2 �Z#�P1$+����� 16S_UniCHin ���� ,%���# $��c�����&�

76

K5 �Z� �R��,���%��".�!��!"#�$H��+�������&=�;�<*��!"��"&�.>��!!"# 3 �Z#�P1$+����� 16S_UniNBam ���� ,%���# $��c�����&�

77

K6 �Z� �R��,���%��".�!��!"#�$H��+�������&=�;�<*��!"��"&�.>��!!"# 3 �Z#�P1$+����� 16S_UniCHin ���� ,%���# $��c�����&�

78

Y�B��" , B�" �� �)����)���#���%����(�-�#!���-#."��&��.� 3��%����(�-�#!(�"

=�������"&��!"&��R��,���%��".�!��;�<1�S�&"� 16S rRNA H��*��!"��"&�.>��!!"# 1

79

80

81

82

83

=�������"&��!"&��R��,���%��".�!��;�<1�S�&"� 16S rRNA H��*��!"��"&�.>��!!"# 2

84

85

86

87

88

89

=�������"&��!"&��R��,���%��".�!��;�<1�S�&"� 16S rRNA H��*��!"��"&�.>��!!"# 3

90

91

92

93

94

95

Y�B��" g " �� �)����)��� �� F�������#���%����(�-�#!C�*%5�)����� �"1! 16S rRNA

������"&��!"&��%��'Z��;�<�R��,���%��".�!��P�1�S�&"���Q�,�:� 16S rRNA ;�<�.>��!!"# 1

96

97

������"&��!"&��%��'Z��;�<�R��,���%��".�!��P�1�S�&"���Q�,�:� 16S rRNA ;�<�.>��!!"# 2

98

99

������"&��!"&��%��'Z��;�<�R��,���%��".�!��P�1�S�&"���Q�,�:� 16S rRNA ;�<�.>��!!"# 3

100

101

Y�B��" * " ,�#,�=�"��#���%����(�-�#!���*%5�)����� �"1! 16S rRNA

���H,�HR�+%��R��,���%��".�!��;�<1�S�&"���Q�,�:� 16S rRNA ;�<*��!"��"&�.>��!!"# 1

Isolate1 �Z� *��!"��"&���&����������.>��!!"# 1 !"#�,�*&��$, E.f �Z� Enterococcus faecalis, B.s �Z� Bacillus subtilis , P.a �Z� Pseudomonas aeruginosa, S.d �Z� Streptococcus dentirousetti *�� R.sp. �Z� Rhodococcus sp.

102

( )�)

Isolate1 �Z� *��!"��"&���&����������.>��!!"# 1 !"#�,�*&��$, E.f �Z� Enterococcus faecalis, B.s �Z� Bacillus subtilis , P.a �Z� Pseudomonas aeruginosa, S.d �Z� Streptococcus dentirousetti *�� R.sp. �Z� Rhodococcus sp.

103

( )�)

Isolate1 �Z� *��!"��"&���&����������.>��!!"# 1 !"#�,���Z���$, E.f �Z� Enterococcus faecalis, B.s �Z� Bacillus subtilis , P.a �Z� Pseudomonas aeruginosa, S.d �Z� Streptococcus dentirousetti *�� R.sp. �Z� Rhodococcus sp.

104

( )�)

Isolate1 �Z� *��!"��"&���&����������.>��!!"# 1 !"#�,�*&��$, E.f �Z� Enterococcus faecalis, B.s �Z� Bacillus subtilis , P.a �Z� Pseudomonas aeruginosa, S.d �Z� Streptococcus dentirousetti *�� R.sp. �Z� Rhodococcus sp.

105

���H,�HR�+%��R��,���%��".�!��;�<1�S�&"���Q�,�:� 16S rRNA ;�<*��!"��"&�.>��!!"# 2

Isolate2 �Z� *��!"��"&���&����������.>��!!"# 2 !"#�,�*&��$, K.p �Z� Klebsiella pneumoniae, B.s �Z� Bacillus subtilis, P.a �Z� Pseudomonas aeruginosa, S.d �Z� Streptococcus dentirousetti *�� R.sp. �Z� Rhodococcus sp.

106

( )�)

Isolate2 �Z� *��!"��"&���&����������.>��!!"# 2 !"#�,�*&��$, K.p �Z� Klebsiella pneumoniae, B.s �Z� Bacillus subtilis, P.a �Z� Pseudomonas aeruginosa, S.d �Z� Streptococcus dentirousetti *�� R.sp. �Z� Rhodococcus sp.

107

( )�)

Isolate2 �Z� *��!"��"&���&����������.>��!!"# 2 !"#�,�*&��$, K.p �Z� Klebsiella pneumoniae, B.s �Z� Bacillus subtilis, P.a �Z� Pseudomonas aeruginosa, S.d �Z� Streptococcus dentirousetti *�� R.sp. �Z� Rhodococcus sp.

108

( )�)

Isolate2 �Z� *��!"��"&���&����������.>��!!"# 2 !"#�,�*&��$, K.p �Z� Klebsiella pneumoniae, B.s �Z� Bacillus subtilis, P.a �Z� Pseudomonas aeruginosa, S.d �Z� Streptococcus dentirousetti *�� R.sp. �Z� Rhodococcus sp.

109

���H,�HR�+%��R��,���%��".�!��;�<1�S�&"���Q�,�:� 16S rRNA ;�<*��!"��"&�.>��!!"# 3

Isolate3 �Z� *��!"��"&���&����������.>��!!"# 3 !"#�,�*&��$, K.p �Z� Klebsiella pneumoniae, B.s �Z� Bacillus subtilis, P.a �Z� Pseudomonas aeruginosa, S.d �Z� Streptococcus dentirousetti *�� R.sp. �Z� Rhodococcus sp.

110

( )�)

Isolate3 �Z� *��!"��"&���&����������.>��!!"# 3 !"#�,�*&��$, K.p �Z� Klebsiella pneumoniae, B.s �Z� Bacillus subtilis, P.a �Z� Pseudomonas aeruginosa, S.d �Z� Streptococcus dentirousetti *�� R.sp. �Z� Rhodococcus sp.

111

( )�)

Isolate3 �Z� *��!"��"&���&����������.>��!!"# 3 !"#�,�*&��$, K.p �Z� Klebsiella pneumoniae, B.s �Z� Bacillus subtilis, P.a �Z� Pseudomonas aeruginosa, S.d �Z� Streptococcus dentirousetti *�� R.sp. �Z� Rhodococcus sp.

112

( )�)

Isolate3 �Z� *��!"��"&���&����������.>��!!"# 3 !"#�,�*&��$, K.p �Z� Klebsiella pneumoniae, B.s �Z� Bacillus subtilis, P.a �Z� Pseudomonas aeruginosa, S.d �Z� Streptococcus dentirousetti *�� R.sp. �Z� Rhodococcus sp.

113

� ����%)+�����%�%�

1Z#�-����Q� ��<��%�Q!Q+� -,jj�H��j %,���Z�������� 21 +�:]�� 2528 ���%, ����u_�:� ���,����Ou_�:���!"# 1 O_< 2 .�<��"&��!u��� 5 +'�.&-���� ��!�],��" H,<'%,���1�Q�" ���,����Ou_�:���!"# 3 O_< 6 .�<��"&��!u��� 7 %,�*�)<;�Q� H,<'%,�����Q�" ���,�,-&u_�:���!"# 1 O_< 2 .�<��"&�����+�"&%%�!&�� H,<'%,�����Q�" ���,�,-&u_�:���!"# 2 O_< 6 .�<��"&�1��,�&��Q�(� H.1��Q�" !"#�&()�iHHQ�,� 145 . 1 O���Q;Q%�! . '��<$*�< �. �Z�< H,<'%,�1��Q�" .!�u,+!� 089-6007034 �"��� [email protected] ��H�����'%)�<���u_�:� 1. ���-������ ]��%�1�1"%��" �����u_�:� 2549 2. �$�,���"&� ��, ��R��+Ij���.&1��*�)]��%�1�1"%��" ���HR��� ���u_�:� 2548

3. �¤��c��, �<��!"#�O��,�%�H,&.]1����� '�%�!&��,&'��� 4. ���� =($�,�=��1��.��<���!R��Qj]��%�1�1"%��" *����"S&<�)<+"#�� 4 ���HR������u_�:� 2549 5. ���� =($�,�=��1��.��<���������&Q� �P1$ Proteomics �+Z#� ���u_�:�!�<1"%��"