UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE AGRONOMIA

DEPARTAMENTO ACADEMICO DE CIENCIAS AGRARIAS

AREA DE SANIDAD VEGETAL

TRABAJO ENCARGADO

“Crecimiento micelial  de Beauveria bassiana y Paecilomyces lilacinus

en medio PDA vertidas en placas de vidrio y chatas de ron,

esterilizadas en autoclave”

Curso : Fitopatología General

Alumnos : DE LA CRUZ RODRIGUEZ, Jorge Iván.

GUEVARA TERRONES, Luis enrique.

HUAMAN IGLESIAS, Juan Carlos.

Docente : Ing. M. Sc. EGOÁVIL JUMP, Giannfranco.

Semestre : 2014 - I

TINGO MARIA – PERÚ

2014

I. INTRODUCCIÓN

El desarrollo de resistencia a los insecticidas químicos y

su efecto deletéreo sobre el ambiente y la salud humana, son la

razón por las cuales se busca implementar el manejo integrado de

plagas mediante el uso de agentes microbianos. Diversos

microorganismos son considerados como agentes de control de

plagas, entre los que se incluyen: virus, bacterias, protozoos y

hongos. Siendo estos últimos los que juegan un papel más

importante como agentes de control biológico de plagas y

patógenos, gracias a sus versátiles mecanismos de acción

reduciendo de este modo el daño en los cultivos (Butt et

al2001). Dentro de los hongos entomopatógenos, los más

utilizados son los géneros Aspergillus, Beauveria,

Culicinomyces, Hirsutilla, Metarhizium, Nomuraea, Paecilomycesy

Tolypocladium y Lecanicillium.

El desarrollo del control biológico, se define como una

práctica agrícola en constante crecimiento que busca la

destrucción total o parcial de patógenos e insectos plaga

frecuentemente mediante el uso de sus enemigos naturales, los

hongos Entomopatógenos son los primeros agentes biológicos en

ser utilizados para el control de plagas, porque son capaces de

producir enfermedad y muerte de los insectos. Estos

microorganismos infectan a los artrópodos directamente, a través

de la penetración de la cutícula y ejercen múltiples mecanismos

de acción, confiriéndoles una alta capacidad para evitar que el

hospedero desarrolle resistencia. Sin embargo para su

utilización como control biológico es necesario prácticas

agrícolas en donde se manipule el ambiente para beneficiar las

poblaciones de Entomopatógenos, donde el conocimiento de los

aspectos ecológicos del hongo son necesarios, tales como la

humedad relativa, temperatura, patogenicidad, virulencia y

hospederos a los que infecta activamente.

II. REVISION LITERARIA

2.1 DEL MEDIO (PDA)

Muchos hongos y bacterias Fitopatógenas pueden cultivarse

en medios de cultivos artificiales, sólidos o líquidos. La

mayoría de los hongos crecen en medios de cultivo de alto conte-

nido de carbohidratos, con un pH que fluctúa entre 5 y 6,

mientras que las bacterias crecen mejor a un pH próximo a 7. No

existe un medio ideal para el cultivo de hongos y bacterias ya

que las exigencias de las diferentes especies varían

considerablemente. Los medios de cultivo se clasifican de

acuerdo a su composición en das grandes grupos: medios

naturales, compuestos de infusiones de productos naturales, cuya

composición exacta no se conoce y medios sintéticos, que

contienen ingredientes de composición química conocida y por lo

tanto pueden duplicarse con cierto grado de precisión.

El medio Papa Agar Dextrosa (PDA por sus siglas en inglés)

es el más simple y popular medio de crecimiento del micelio

para la mayoría de los hongos cultivados. Puede comprarse

comercialmente como una mezcla en polvo lista para usarse, que

puede usarse directamente para hacer el medio en el laboratorio,

alternativamente se puede preparar en el laboratorio con los

siguientes ingredientes: patata troceada en cubitos, 200 g ;

dextrosa, 20 g; agar-agar en polvo, 20 g; agua 1 litro.

2.2 DEL ENTOMOPATÓGENO Beauveria bassiana (Bals.) Vuill

2.3.1 Distribución geográfica

El hongo Beauveria bassiana se encuentra distribuido por

todo el mundo, de forma saprofítica y parásita atacando

mayormente a insectos del orden Coleóptera y Lepidoptera (CMI,

1979).

2.3.2 Taxonomía

Este hongo se encuentra clasificado como:

División : Deuteromicota

Clase forma : Deuteromicete

Orden forma : Moniliales

Familia : Moniliaceae

Género : Beauveria

Especie : bassiana

Nombre científico : B. bassiana Germar

(ALEXOPOULUS, 1985)

2.3.3 Descripción

Beauveria bassiana y B. brongniartii, son especies

reconocidas del género Beauveria; siendo la primera la más

conocida y estudiada, está presente en la mayoría de los suelos

del mundo; las colonias crecen en agar-papa-dextrosa o agar-

malta a 14 días a 23°C, cuya forma es aterciopelada o

polvorienta. Los conidióforos son abundantes, desarrollándose de

hifas vegetativa; las conidias son hialinas, aplanadas, globosas

y ampliamente elipsoidal (BARNETT y HUNTER, 1988).

Difiere de B. brongniartii por las células

conidiógenas en forma de racimo, donde la conidia es globosa

(CMI, 1979).

2.3.4 Acción entomopatogénica del hongo

La acción entomopatogénica del hongo comprende dos

fases: una patogénica y otra saprofítica. La fase patogénica o

infectiva ocurre cuando las conidias entran en contacto con el

tejido vivo del hospedero y en condiciones de humedad adecuada

(85%) las conidias germinan y penetran a través de la cutícula

del insecto o por los apéndices bucales y se desarrolla el

micelio en el cuerpo del insecto. La cutícula del insecto está

constituida por proteína, quitina y lípidos, sustancias

orgánicas muy resistentes, que son desnaturalizadas por enzimas

producidas por el hongo (GAMARRA, et al; 1994).

Una vez que el hongo se desarrolla en el punto de

infección, produce toxinas que se difunden en el celoma, a

través de la hemoiinfa y causa la muerte. Después de causada la

muerte, se inicia la fase saprofítica, donde el hongo se

desarrolla profusamente sobre el cadáver, en condiciones de

humedad apropiadas, produciéndose gran cantidad de conidias, que

son los propágulos para iniciar una nueva infección (TORRES,

1993).

B. bassiana ataca a más de 60 especies de insectos en todo el

mundo. En Colombia se ha descubierto hasta el momento en 30

huéspedes, fundamentalmente en lepidópteros y coleópteros. Su

importancia es elevada en agroecosistemas que muestran una gran

variedad de estas familias de insectos, p. ej. en plantaciones

colombianas de pijuayo, donde ha sido descubierto en nueve

huéspedes de diferentes géneros de insectos. También sirven de

huéspedes el barrenillo de las ramas del café (Xylosandrus

morigerus) y distintas especies de hormigas (LUTZEYER, 1994).

La patogenicidad del hongo sobre los insectos depende de

una compleja relación entre la habilidad del hongo para penetrar

la cutícula y la fortaleza del sistema inmunológico del insecto

para prevenir el desarrollo del hongo. Esta relación se debe a

factores muy concretos incluidos las diferencias cuticulares, la

penetración cuticular y las reacciones inmunes; donde el

desarrollo del hongo sobre el insecto puede ser influenciado por

la eficacia de los hemocitos en encapsular y melanizar el

patógeno (CASTELLANOS, 1997).

2.3.5 Usos de Beauvería bassiana

Bassi en 1835, inicialmente determinó que la muerte

del gusano de seda era causado por un hongo; Bálsamo en 1836, le

puso el nombre de Botrytis bassiana K. En 1912, el hongo fue

transferido al género Beauvería. En la actualidad, la especie

está reconocida como Beauvería bassiana (Bálsamo) Vuillemi

(GAMARRA, et al; 1994).

Brongniart en 1891, colectó un hongo que parasitaba

langostas migratorias, lo describió y no le puso nombre. Sacardo

en 1892, lo nombró Botrytis brongniartii y Pech, en 1926, lo

transfirió al género Beauvería. En la actualidad, la especie

está reconocida como Beauveria brongniartii (Saccardo) Pech

(CMI, 1979).

En Colombia, se produce masivamente el hongo B.

bassiana para el control de la broca del café (Hypothenemus

hampei), a partir de un cultivo multiespórico mediante pases

sucesivos en arroz, utilizado como sustrato. En este medio

artificial se ha registrado pérdida de la patogenicidad del

hongo luego de cultivarse por tres o más generaciones, por lo

cual, se recomienda reactivar la patogenicidad mediante pases o

procesos de reinfección en el insecto (CENICAFÉ, 1993).

Resultados provisionales dejan prever la fuerte

dependencia del éxito del control con B. bassiana de la

formulación, de las fracciones aplicadas del patógeno (cuerpos

hifales, blastosporas, conidias sumergidas o superficiales), del

número de aplicaciones y de la concentración del sustrato;

alcanzándose índices de infección medios de hasta 69% (tras 119

días con seis aplicaciones). Una retrospectiva sobre resultados

existentes de la lucha contra coleópteros con B. bassiana

muestra los mayores éxitos de lucha en zonas húmedas, lo que

coincide con los requisitos climáticos del patógeno (LUTZEYER,

1994).

2.3 DEL ENTOMOPATOGENO Paecilomyces lilacinus (Thom.) Samson

2.3.1 Generalidades.

Paecilomyces spp es un hongo saprófago, filamentoso común.

Se ha aislado de una amplia gama de hábitat incluyendo suelos

cultivados y no cultivados (bosques, prados, desiertos), los

sedimentos y el lodo de aguas residuales. También se ha

encontrado en huevos de nematodos, y en ocasiones en hembras de

nematodos. Además, se ha detectado con frecuencia en la

rizósfera de muchos cultivos. La especie puede crecer en una

amplia gama de temperaturas desde 8°C a 38°C para algunos

aislados, con crecimiento óptimo en el rango de 26°C a 30°C.

También tiene una tolerancia amplia del PH y puede crecer en una

variedad de substratos P. lilacinus ha demostrado resultados

prometedores para el uso como agente de biocontrol para

controlar el crecimiento de los nematodos que destruyen las

raíces.

2.3.2 Taxonomía.

Este hongo se encuentra clasificado como:

División : Deuteromicota

Clase forma : Deuteromicete

Orden forma : Moniliales

Familia : Moniliaceae

Género : Paecilomyces

Especie : lilacinus

Nombre científico : Paecilomyces lilacinus (Thom.)

Samson

2.3.3 Morfología macroscópica

Las infecciones causadas por P. fumosoroseus se reconocen por

el color rosado pálido mientras que en P. lilacinus son de color

violeta claro. La especie más importante del género es

Paecilomyces fumosoroseus. Sus colonias son inicialmente de color

blanco en medio PDA, luego adquieren el tinte rosado

característico. El revés de la colonia es al comienzo

ligeramente amarillento, pero a medida que pasa el tiempo se

vuelve de color anaranjado intenso.

2.3.3 Morfología microscópica

Hongo formado por hifas hialinas-amarillentas, septadas,

la mayoría con la pared lisa, miden entre 1.5–3.5 mm de

diámetro. Los conidióforos están formados por 4 a 6 filiadas

(cada filiada = 5.7–8 x 1-2mm), constituidas por una parte basal

cilíndrica o hinchada. Las conidias, cilíndricas o fusiformes,

se disponen en enredadas cadenas basípetas, están formadas por

una sola célula (raramente dos), son hialinas, ligeramente

pigmentadas y tienen pared lisa o equinulada. La pared de las

clamidósporas cuando está presente, es más gruesa o equinulada,

lisa, u ornamentada (Denise Grady).

Las colonias crecen rápidamente, polvo de gamuza, funículos

o mechones, y amarillo-marrón o de color arena. Conidióforos

llevan densas ramas, dispuestas verticillately llevan fiálides.

Los conidios son subesféricos, elipsoidales a fusiformes,

hialina de color amarillo, de paredes lisas, de 3-5 x 2-4 micras

y se producen en cadenas divergentes largas. Las clamidosporas

son generalmente presentes, solos o en cadenas cortas, marrón,

subesféricos a piriforme, 4-8 micras de diámetro, de paredes

gruesas para verrugosas ligeramente.

2.3.4 Uso en el control de nematodos

Paecilomyces lilacinus es parásito de varias especies de

nematodos fitoparásitos. El hongo inicia su ataque cuando las

conidias entran en contacto sobre el nemátodo; una vez que la

conidia germina, ésta produce enzimas que disuelven la cutícula

haciendo un pequeño agujero a través del cual el hongo comienza

a crecer en el cuerpo produciendo unas toxinas que matan el

nemátodo. El hongo se reproduce formando millones de conidias

que están en capacidad de infectar otros nemátodos.

Paecilomyces lilacinus parasita a huevos y hembras de nemátodos,

causando deformaciones, destrucción de ovarios además produce

toxinas que afecta el sistema nervioso de los nemátodos también

se ve algunas veces sobre nemátodos en estados libres o móviles,

o sobre hembras sedentarias. Las masas de huevos pueden ser

reducidas o suprimidas a veces, la formación de agallas en los

tejidos de la raíz de la planta huésped se inhibe. (Agostina V)

2.3.4.1 Ciclo de vida

El ciclo de vida de este hongo consiste en las

siguientes etapas: adhesión de las conidias o blastosporas

al huésped, germinación, penetración, crecimiento

vegetativo y conidiogénesis. En condiciones de campo, el

hongo crece y se desarrolla rápidamente sobre todos los

estadios de mosca blanca, completando su ciclo de vida a

las 120 horas. En medio de cultivo sintético, las colonias

de P. fumosoroseus crecen de manera moderada cuando son

incubados a 24 ºC (25–30 mm de diámetro a los 7 días y 50-

65 mm a las 2 semanas).

2.3.4.2 Síntomas de la enfermedad.

Los nemátodos pierden el apetito, seguido de una

desorientación. Debilidad y decremento de la sensibilidad,

con la subsecuente pérdida progresiva de las funciones

hasta llegar a la parálisis.

El cadáver del insecto adquiere un aspecto

momificado. Si las condiciones de humedad son apropiadas,

emerge el micelio del cuerpo del insecto y esporula en el

exterior. (Cobo S)

III. MATERIALES Y METODOS

3.1 MATERIALES:

10 placas de vidrio (Petri). 20 chatas de ron de 125 ml. 600 ml. de medio PDA Cámara de flujo. Mechero, estilete, sacabocado. Alcohol al 70%. Autoclave. Marcador indeleble.

3.2 MÉTODOS.

3.2.1. Lugar de ejecución del experimento.

El experimento se llevó a cabo en las instalacionesdel Laboratorio de entomopatógenos de la facultad deAgronomía, y en el laboratorio de fitopatología de laUniversidad Nacional Agraria de la Selva

3.2.2 Obtención del cultivo puro de controladores

biológicos.

3.2.2.1 Medio de cultivo.

Se preparó 200 ml de PDA en matraces de 250 ml

siguiendo la metodología de FRENCH y HEBERT (1982).Se midió

el pH del medio PDA preparado antes de ser esterilizado.

3.2.2.2 Esterilización de placas Petri.

El medio de cultivo PDA y las placas de vidrio, se

esterilizaron por separados    en la autoclave por un

espacio de 15 y 40 min respectivamente a una temperatura de

121°C y 15 Libras de presión, según la metodología de

FRENCH y HEBERT (1982). Y fueron mantenidos en  la

refrigeradora a una temperatura aproximadamente de 10 °C

hasta su utilización.

3.2.2.3 Plaqueo.

Para esto el medio de cultivo PDA con la ayuda del

microondas por un espacio de 5 min con intervalos de 1 min

para su agitación manual sobre la mesa de trabajo,  se

derritió hasta su forma líquida, el cual se llevó a la

cámara de flujo laminar para el plaqueo en placas de vidrio

de 8.5 cm de diámetro.  

3.2.2.4 Repique de los controladores biológicos.

Utilizamos los aislamientos de B. bassiana y P.

lilacinus del Laboratorio de entomopatógenos, para esto

dentro de la cámara de flujo laminar se realizó la

trasferencia de estos aislamientos mantenidos en los tubos

de ensayos a las placas de vidrio conteniendo medio de

cultivo PDA, y así obtuvimos material biológico puro para

el experimento.

3.2.3 Siembra de los controladores biológicos en los medios

a evaluar

3.2.3.1 Medio de cultivo

Se prepararon 600 ml de medio PDA, distribuidos 400

ml en dos botellas de néctar y 200 ml en 10 chatas de ron,

siguiendo la metodología de FRENCH y HEBERT (1982).

3.2.3.2 Esterilización de placas de vidrio y chata de

ron

Las placas de vidrio y la chata de ron se

esterilizaron en la autoclave por un espacio de 40 min a

121°C y 15 Libras de presión, según la metodología de

FRENCH y HEBERT (1982).

Luego se esterilizó el medio PDA contenida en las dos

botellas de néctar y las 10 chatas de ron en la autoclave

por un espacio de 15 min a 121°C y 15 Libras de presión.

Una vez esterilizados las botellas de néctar y las chatas

de se mantuvieron en la refrigeradora a una temperatura

aproximadamente de 10 °C hasta su utilización (3‐5 días).

3.2.3.3 Plaqueo.

Para esto se utilizó el microondas para derretir el

medio de cultivo PDA, esto sucedió después de 5 min de

estar el medio PDA dentro del microondas, cada minuto

trascurrido en el microondas las botellas de néctar que

contienen el medio de PDA fueron agitadas manualmente sobre

la mesa de trabajo, esto se realizó hasta que el medio de

cultivo se derrita hasta su forma líquida, seguidamente

será llevó la cámara de flujo laminar para ser vertidos en

las placas de vidrio y chatas de ron. Además se derritió el

medio PDA contenida en las 10 chatas de ron mantenidas en

la refrigeradora.

3.2.3.4 Siembra de controladores biológicos

Se utilizaron los cultivos puros de B. bassiana y P.

lilacinus repicados en medio PDA contenidas en placas de

vidrio, la siembra se realizó dentro de la cámara de flujo

laminar previamente desinfestada con alcohol y la luz UV se

procederá con la ayuda de un sacabocado a cortar 0.5 cm de

diámetro del medio de cultivo puro de los entomopatogenos,

con el estilete se trasfirió una rodaja de PDA con el

cultivo puro del hongo a las placas de vidrio plaqueadas

con medio PDA, chatas de ron plaqueadas con medio PDA y las

chatas de ron con el medio PDA que fue derretido, la rodaja

fué puesta (siembra) sobre el centro de la placa de vidrio.

Tratam ientos r1 r2 r3 r4 r5 total prom edioT1 0.32 0.29 0.30 0.33 0.30 1.54 0.31T2 0.15 0.19 0.13 0.10 0.13 0.70 0.14T3 0.21 0.20 0.20 0.20 0.19 1.00 0.20

IV. RESULTADOS

4.1 Parámetros a evaluar

– Ritmo promedio de crecimiento micelial en cada

tratamiento.

– Numero de conidias en el tratamiento 2.

4.2 Datos obtenidos:

4.2.1 Bauveria bassiana.

Ritmo promedio de crecimiento micelial (cm/ día)

T1 T3 T20.000.050.100.150.200.250.300.35

Ritmo promedio de Crecimiento (cm/día)

RPC

Tratam ientos r1 r2 r3 r4 r5 total prom edioT1 0.20 0.23 0.24 0.26 0.27 1.20 0.24T2 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00T3 0.17 0.20 0.25 0.18 0.20 1.00 0.20

Número de conidias. No se observaron conidias deBauveria bassiana en el tratamiento 2

4.2.2 Paecilomyces lilacinus

Ritmo promedio de crecimiento micelial (cm/ día)

T1 T3 T20.000.050.100.150.200.250.300.35

Ritmo promedio de Crecimiento (cm/día)

RPC

T1 T3 T20.000.050.100.150.200.250.30

Ritmo promedio de crecimiento micelial

(cm/día)RPC

Tratam iento 2.000 0.0725 0.0362 76.56 3.89Error exp. 12.000 0.0057 0.0005TOTAL 14.000 0.0781

Valor críticoFcalculadoFV GL SC CM

Numero de conidias.- no se observaron conidias dePaecilomyces lilacinus en el tratamiento 2.

4.2. Análisis estadístico.

4.1. Análisis de varianza

Bauveria basssiana.

CV = 10.35%

Ho: Todos los ritmos promedios de crecimiento micelialson iguales.

Tratam iento 2 0.1653 0.0827 145.80 3.89Error exp. 12 0.0068 0.0006TOTAL 14 0.1721

Valor críticoFV GL SC CM Fcalculado

Ha: Al menos un ritmo promedio de crecimiento miceliales diferente a los demás.

* Como F es mayor al valor critico se rechaza Ho por lotanto se encontró diferencias entre los ritmos promediosde crecimiento

Prueba de Duncan

Comparación medias

diferencia ALS(D)

SIGNIFICANCIA

T1 vs T30.31 ;0.20 0.11 < 0.13 ns

T1 vs T20.31 ;0.14 0.17 > 0.14 *

T3 vs T20.2 ;0.14 0.06 < 0.13 ns

* Solo se encontró diferencia significativa entreT1 y T2.

Paecilomyces lilacinus

CV = 16.70 %

Ho: Todos los ritmos promedios de crecimiento micelialson iguales.Ha: Al menos un ritmo promedio de crecimiento micelial

es diferente a los demás.

* Como F es mayor al valor critico se rechaza Ho por lotanto se encontró diferencias entre los ritmos promediosde crecimiento.

Prueba de Duncan

*Se encontró diferencia significativa en T1 y T2;T2 y T3.

Comparación medias

diferencia ALS(D)

SIGNIFICANCIA

T1 vs T30.24 ;0.20 0.04 < 0.044 ns

T1 vs T20.24 ;0.00 0.24 > 0.045 *

T3 vs T20.20 ;0.00 0.20 > 0.044 *

V. DISCUSION.

No se observó crecimiento micelial de Paecilomyces lilacinusen el T2 debido a que el medio se contaminó conbacterias.

No se observaron conidias en los tratamientos debido aque éstas aún estaban fuertemente arraigadas al micelioy al procesarlas no se desprendían.

El crecimiento micelial en los tratamientos sin esterilización fue menor que el resto debido a que posiblemente existía cierto tipo de contaminación.

VI. CONCLUSION.

El tratamiento con mayor ritmo promedio de crecimientomicelial fue el T1 (placas Petri esterilizadas) quepresento un RPC de 0.31 cm/día en Bauveria bassiana y 0.24cm/día en Paecilomyces lilacinus.

El tratamiento con menor ritmo promedio de crecimientomicelial fue el T2 (chatas de ron de 125 ml.) quepresento un rpc de 0.14 cm/día en Bauveria bassiana y 0.00cm/día en Paecilomyces lilacinus.

Paecilomyces lilacinus presenta un cambio de coloración delila claro a lila oscuro aproximadamente a los 9 díasde ser sembrado.

Bauveria bassiana presenta una mayor uniformidad decrecimiento (campos x,y) que Paecelomyces lilacinus.

VII. BIBLIOGRAFIA

AGRIOS, G. N. 2002. Fitopatología. Departamento fitopatología de

la universidad de Massachusetts. 2da edición. 7ma

reimpresión. Editorial Limusa. 635p.

EGOAVIL JUMP G. Protocolo de prácticas de Fitopatología General.

Universidad Nacional Agraria De La selva. 2014

http://ftp.censa.edu.cu/revistas_censa/rpv/v25n3/rpv05310.pdf

Rev. Protección Veg. Vol. 25 No. 3 (2010): 174-180

http://www.tecnicapecuaria.org.mx/trabajos/201104084213.pdf DE

Rev. Mex .Cienc .Pecu 2011;2(2):177-192

http://hongometarrhizium.blogspot.com/ Publicado por diego

Suarez lunes, 5 de abril de 2010

http://es.scribd.com/doc/186433813/HONGOS-ENTOMOPATOGENOS-libro-

klyslerts