ESTERILIZACION DEL MEDIO Y MUERTE CELULAR TERMICA Y

ESTERILIZACION DEL AIRE

La preparación de medios para el desarrollo de procesos de

fermentación es una etapa fundamental para asegurar la

productividad de los mismos. Para ello es fundamental

esterilizar los medios a trabajar. En las fermentaciones

industriales se requiere de un alto grado de limpieza y

asepsia. No existe un método cuantitativo seguro y confiable

para medir el número o la concentración de contaminantes en

el sistema.

Dado que la esterilidad no puede demostrarse de manera

absoluta sin causar la destrucción completa de todas las

unidades del lote de producto terminado, se define la

esterilidad en términos probabilísticos, en donde la

probabilidad de que una unidad de producto esté contaminada

es aceptablemente remota. Se considera que un producto

crítico es estéril cuando la probabilidad de que un

microorganismo esté presente en forma activa o latente es

igual o menor de 1 en 1.000.000 (coeficiente de seguridad de

esterilidad 10^-6).

Cabiendo resaltar que esterilidad significa la eliminación de

toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva a

cabo generalmente por medios físicos, por ejemplo,

filtración, o por muerte de los organismos por calor,

productos químicos u otra vía. La razón fundamental para

efectuar la esterilización es para evitar la competición por

los nutrientes en medios de cultivo y permitir así que el

cultivo de microorganismos específicos que se utilizan en un

proceso de fermentación de los rendimientos esperados en

biomasa y/o metabolitos específicos.

Posibles elementos de contaminación en un procesos

fermentativo:

1. El medio.

2. El inoculo y el proceso de inoculación.

3. El suministro de aire.

4. La adición de nutrientes, antiespumantes, etc.

Durante el proceso.

5. El fermentador en sí.

ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVOS:

1. Esterilización por calor

El calor desnaturaliza estructuras y macromoléculas

(membranas, proteínas, etc.). Todos los microorganismos son

susceptibles a la acción del calor. Su sensibilidad varía

con la especie y con el estado en que se encuentren.

En general las formas vegetativas bacterianas mueren por

calentamiento a 50-70ºC. Las endosporas, (las formas de vida

más termo resistentes), requieren mayores temperaturas y

tiempo de exposición. El calor puede utilizarse de dos formas

en presencia (esterilización por calor húmedo) o ausencia de

humedad (esterilización por calor seco).

1.1. CALOR HÚMEDO:

Los materiales húmedos conducen mejor el calor que los secos:

el agua tiene mayor coeficiente de transferencia de calor

que el aire. Por eso el vapor de agua es más eficaz que el

calor seco matando a los microorganismos. Así la

esterilización en presencia de vapor de agua requiere menos

temperatura y tiempo que sin agua. El autoclave de vapor

utiliza calor húmedo para la esterilización.

Autoclave de vapor:

Trabaja a presión superior a la atmosférica. El agua a

presión atmosférica hierve a 100ºC. A presiones superiores,

la temperatura de ebullición aumenta por lo que se pueden

calentar soluciones acuosas (como los medios de cultivo-) a

temperaturas superiores a 100ºC. El autoclave permite elevar

la presión de una a dos atmósferas sobre la presión

atmosférica.

El dispositivo trabaja aislado del exterior. En un sistema

aislado del exterior, cada elevación de temperatura provoca

un aumento de presión. La relación entre temperatura y

presión depende de la composición de la atmósfera incluida en

el sistema

Cuando en el autoclave el aire es reemplazado por vapor de

agua purgado del autoclave), La relación entre temperatura y

presión en atmósfera saturada de agua es la indicada en la

tabla de la izquierda. Si quedan restos de aire son

necesarias temperaturas mayores para provocar la misma

presión en el interior.

Empleo del autoclave:

El autoclave de vapor es el aparato más utilizado para la

esterilización de medios de cultivo, soluciones, ropa de

laboratorio, y emulsiones que no se desnaturalicen a

temperaturas superiores a 100ºC. En general la esterilización

de estos materiales se realiza a (112-121ºC) durante 30-20

minutos. Estas condiciones pueden variar en función del tipo

de material, carga microbiana y volúmenes a esterilizar.

Ventajas del autoclave:

o Rápido calentamiento y penetración del calor,

destrucción de bacterias y endosporas en corto tiempo,

no deja residuos tóxicos, poco deterioro del material

expuesto, es económico.

o Tindalización o esterilización fraccionada a vapor

fluente:

o El material se calienta a 80-100º durante 30 minutos,

en días sucesivos, con periodos de incubación entre

ellos. De esta manera se destruyen las células

vegetativas pero no las endosporas termo resistente. Las

endosporas que sobrevivieron pueden germinar en el

periodo de incubación. Desde renacidas como células

vegetativas son destruidas en el calentamiento

posterior.

Pasteurización:

Es un método que reduce la cantidad de microorganismos

viables. No es un método de esterilización pues no destruye

esporas bacterianas. Es utilizada en la industria

alimentaria. Hay dos tipos de tratamiento: la pasterurización

a baja temperatura y mayor tiempo (63ºC/30 minutos) y la

pasteurización a alta temperatura y corto tiempo (72ºC/15

segundos).

Uperización:

Variante de la pasteurización (ultrarrápida) en la que la

temperatura se eleva por encima de 150°C durante unos

segundos

1.2. CALOR SECO:

Su acción letal se debe a la oxidación de componentes

celulares. El aire es mal conductor del calor y el aire

caliente entra más lentamente que el vapor en los materiales.

Por ello se requiere más temperatura y tiempo de exposición

que en la esterilización con calor húmedo. Puede utilizarse

mediante flameado (incineración) o con hornos de aire

caliente.

Flameado e incineración:

Se aplica directamente la llama de un mechero. Se utiliza

para la esterilización de asas e hilos de siembra, pinzas

así como las bocas de tubos y matraces antes y después de

utilizarlos. La incineración se emplea para destruir

materiales de desecho contaminados.

Hornos de aire caliente:

Alcanzan temperaturas mayores a 150ºC. Las condiciones

usuales de esterilización son de 160-180ºC durante 1-2 horas.

Las ventajas son que penetra en materiales insolubles en agua

(aceites, grasas) y es menos corrosivo sobre metales que el

calor húmedo. Se utiliza para la esterilización de materiales

secos, grasas, aceites y material de vidrio y metales termo

resistente

FALTA LA PARTE DE JONNA: ESTERILIZACION QUIMICA

2. ESTERILIZACIONDE MEDIOS Y BIORREACTORES A ESCALA INDUSTRIAL:

CALOR HUMEDO : Esterilización discontinua

Es un tipo de esterilización discontinua ya que se

realiza a una temperatura de 121 ºC durante un solo

periodo de tiempo, los tiempos de esterilización

aproximados pueden ser calculados a partir de la

naturaleza del medio y del tamaño del fermentador.

No solamente debe ser esterilizado el medio de cultivo,

sino también las uniones, válvulas y electrodos del

propio fermentador.

Se necesitan de 2-3 horas para alcanzar la temperatura

de esterilización de 121 ºC, lo que depende de la

conducción del vapor y el tamaño del fermentador. Una

vez alcanzado la temperatura se emplean otros 20-60 min.

Para el proceso real de muerte, seguidos del

enfriamiento durante 1 hora.

Las fases de enfriamientos calor y enfriamiento no solo

matan a los microorganismos, sino que también alteran

severamente la solución de nutrientes. Las vitaminas se

destruyen y la calidad del medio de cultivo se

deteriora.

INYECCION DIRECTA DE VAPOR: Esterilización continua:

Se emplean intercambiadores de calor, en el primer

intercambiador de calor, la solución de nutrientes, se

precalienta a 90-120 ºC durante 20-30 segundos por la

solución nutritiva previamente esterilizada que sale.

En el segundo intercambiador de calor, se calienta

indirectamente con vapor a 140ºC. Esta temperatura se

mantiene durante 30-120 segundos en una tubería de

mantenimiento antes de que sea colocada en el primer

intercambiador mediante enfriamiento preliminar.

Posteriormente un tercer intercambiador para

refrigeración a la temperatura del fermentador. La fase

de enfriamiento es solo de 20-30 segundos.

Algunas desventajas que se encuentran en este tipo de

esterilización es que con algunas soluciones de

nutrientes se forman sales insolubles y aparecen

incrustación en el primer intercambiador de calor debido

a las diferencias de temperatura entre la solución de

nutrientes esterilizada y la solución fría que entra.

Ademas si se produce una precipitación, el coeficiente

de transferencia de calor disminuye por lo que el

sistema debe detener y tratar con agentes que limpian

(acidos, bases) y re-esterilizarlo.

ESTERILIZACION POR RADIACION:

RAYOS GAMMA: Su empleo está basado en conocimientos

sobre la energía atómica. Este tipo de

esterilización se aplica a productos o materiales

termolábiles y de gran importancia en el campo

industrial. Pueden esterilizar antibióticos,

vacunas, alimentos, etc.

RAYOS X: Penetran bien, pero requieren de mucha

energía, son pocos operativos para su uso masivo,

su empleo es muy costoso, por lo tanto son muy poco

usados con fines de esterilización.

RAYOS ULTRAVIOLETA: Afectan las moléculas de DNA de

los microorganismos. El DNA absorbe una longitud de

onda de 2600ª y libera energía ocasionando re

arreglo de enlaces químicos, son escasamente

penetrantes y se utilizan para superficies, se

utilizan mayormente para la esterilización de

quirófanos.

ESTERILIZACION POR FILTRACION:

Se emplea tanto para la esterilización de líquidos como

de gases, se realiza mediante filtros absolutos que son

de materiales cerámicos de vidrio o de metal con poros

tan pequeños que la penetración de microorganismos no es

posible. Para la filtración de medios también es

empleada, agregando una superficie tipo canastilla entre

la válvula de entrada del medio y el tanque del

fermentador lo que permite retener microorganismos, es

muy poco utilizado en el ámbito industrial. Y para la

esterilización de aire se colocan filtros en las

mangueras de entra de este para retener las partículas

contaminantes y no permitir su ingreso al medio que se

encuentra en el tanque del birreactor.

Cinética de la esterilización por calor

La cinética de la esterilización por calor húmedo, está

caracterizada bastante aproximadamente por una reacción

cinética de primer orden.

Si No es el número de organismos viables presentes

inicialmente y N es número viable al final tendremos que la

ecuación de velocidad de muerte será:

N/No es la fracción de organismos viables que sobreviven

después del tratamiento por calor durante el tiempo t y K =

constante de velocidad de destrucción, que depende de la

temperatura según la clásica ecuación de Arrhenius:

Dónde:

A = constante

E = energía de activación

R = Constante general de los gases

T = Temperatura en grados Kelvin

Si se gráfica el In k en función de 1/T se obtendrá una línea

recta, siendo la inclinación igual a -E/R y la intersección

de la recta con la ordenada, el valor de la constante de

Arrtherius. La ecuación de velocidad de muerte necesita una

aclaración, ya que la misma no admite una disminución del

número de organismos a cero, porque si N es cero, t debería

ser infinito. Para resolver este problema supongamos que N =

0.1 y calculemos el valor correspondiente de t. No podemos

decir que después de ese tiempo

sobrevivirá una décima parte de

un microorganismo, pero si

podemos decir que habrá sólo una

probabilidad de 1 en 10 de que

sobreviva un microorganismo. Por

razones de seguridad podemos

fijar el valor de N = 0.001 o sea

fijar una probabilidad de 1 en

1000 de sobrevivencia.

La figura muestra una curva típica de la esterilización en

"batch" de un medio en un fermentador. La curva AB representa

la etapa de calentamiento, la parte BC corresponde a la etapa

de mantenimiento y CD es la etapa de enfriamiento. Durante la

primera y última etapa ocurre parte de la destrucción térmica

de organismos presentes en el medio debido a que se alcanza

temperatura elevada sobre todo en la última parte de la curva

AB y la primera parte de la curva CD. Se considera que la

temperatura a partir de la cual se produce destrucción

de esporos es 100 °C. Por lo tanto tendremos eliminación de

esporos de 100 a

120 °C durante la etapa de calentamiento y de 120 a 100 °C

durante la correspondiente al enfriamiento. Los tiempos de

calentamiento y enfriamiento varían de acuerdo al volumen del

equipo. En fermentadores industriales de 60.000 1 por ejemplo

esos tiempos están en el orden de 28-30 min. y 11-14 min.

para los períodos de calentamiento y enfriamiento

respectivamente.

En la práctica de la esterilización es necesario tener

presente que la calidad nutriente del medio debe ser

preservada todo lo posible, razón por la cual, es

imprescindible diseñar un ciclo de esterilización lo más

efectivo posible pero al mismo tiempo lo más corto posible.

ESTERILIZACION DEL AIRE:

Durante el proceso de esterilización del aire se

eliminan las partículas de tamaño entre 0.5 y 10 micra.

Para poder diseñar un sistema de esterilización es

necesario conocer el tamaño de las partículas y el

numero de microorganismos presentes en el aire, asi la

cantidad de otras partículas.

En Inglaterra se han reportado valores promedio de 3 a 9

x 10 a la tres partículas/m3 y en Japon 12 x 103,

El proceso de esterilización del aire mas usado es el e

filtración.

REQUISITOS DE UN SISTEMA DE FILTRACION:

1. El sistema debe de ser de diseño sencillo.

2. Su operación debe ser barata.

3. Debe ser estable y resistente a varias

esterilizaciones con vapor.

4. Debe acondicionar el aire, ajustando temperatura y

humedad.

FILTROS FIBROSOS

Estos filtros están elaborados por un material fibroso

(papel, asbesto o fibra de vidrio) dispuesto al azar, de

manera que dentro de la estructura del filtro se crean vías

tortuosas donde pueden quedar retenidos la mayoría de los

contaminantes presentes. Entre sus ventajas se encuentran su

alta capacidad de retención de partículas sobre su superficie

y a través de toda su estructura y que permiten filtrar

grandes volúmenes. Sin embargo, tienen como desventajas que

no presentan un tamaño de poro uniforme y existe la

posibilidad de liberación, hacia el material filtrado, de

partículas y microorganismos que hayan crecido dentro del

filtro. Dadas sus características los filtros de profundidad

se usan principalmente como prefiltros, ya que permiten

eliminar las partículas grandes pero no la eliminación total

de los microorganismos.

Los filtro fibrosos, como un segundo grupo, no ofrecen una

barrera impenetrable a los microorganismos. Se hacen

comúnmente de las camas o almohadillas de material fibroso

tal como papel, algodón o de vidrio y lana mineral. Los

diámetros de las fibras suele estar en el rango de 0,5 a 15

um y los espacios entre las fibras, en la mayoría de los

casos mucho mayor que esta cifra. A pesar de ello, estos

filtros pueden ser lo suficientemente eficaz en la

eliminación de las esporas bacterianas corriente de aire, que

son del orden de 1 um de diámetro o menos.

Está claro que los filtros fibrosos no pueden, al menos en

teoría, ser absolutos, pero los filtros fibrosos

cuidadosamente diseñados puede ser lo suficientemente

eficaces , ya que son relativamente baratos y de baja caída

de presión.

Este último factor es de gran importancia en los sistemas

industriales, en las altas presiones de operación pueden ser

muy costosos.

PARTE DE CHIQUITO: MUERTE TERMICA

Conservación de la calidad nutriente:

Como ya dijimos anteriormente, los medios de fermentación

utilizados en la industria son casi siempre complejos y a

menudo con sólidos en suspensión, de manera tal que los

cambios que se producen durante la esterilización pueden ser

importantes. A veces puede haber modificaciones beneficiosas

o perjudiciales dependiendo del tiempo de esterilización.

Existen casos en los cuales si se prolonga la esterilización

50 a 60 min se producen pérdidas de rendimiento que llegan

hasta el 65% con respecto al medio normal. En ciertos casos

cuando el tiempo es solamente de 15-20 min se puede producir

un efecto beneficioso.

La naturaleza de las interacciones que tienen lugar entre los

componentes de un medio, durante la esterilización por calor,

dependerá no solamente de la naturaleza de los componentes

sino también de la temperatura, duración del calentamiento,

pH del medio, y de la agitación. Un ejemplo típico de

interacción es la reacción de Maillard que tiene lugar entre

los grupos carbonilos de los azúcares con los grupos amino de

proteínas, aminoácidos, etc. Se forman así productos de

condensación con lo cual se inactivan significativas

cantidades de carbohidratos y nitrógeno amínico. Por ese

motivo es necesario que los carbohidratos se esterilicen por

separado de los compuestos nitrogenados orgánicos.

Las sales de NH4+ se deben autoclavar a pH 7 o menor, si no

el amonio se volatiliza.

En medios químicamente definidos se puede observar pérdida

importante de magnesio, potasio, amonio, sodio y fosfatos por

precipitación de sales poco solubles como MgNH 4PO4, MgKP04 y

MgNaP04. Es importante por lo tanto autoclavar las sales de

calcio y magnesio aparte de los fosfatos.

Los aminoácidos y factores de crecimiento son muy lábiles al

calor. Entre los aminoácidos, el triptofano, glutamina,

asparagina, y entre las vitaminas hidrosolubles, la tiamina,

riboflavina y piridoxina son las más susceptibles de sufrir

descomposición. En todos estos casos es aconsejable

disolverlas separadamente en pequeños volúmenes de H2 O y

luego esterilizarlas por filtración.

Como ya dijimos es fundamental, además de esterilizar

correctamente los medios, conservar al máximo la calidad

nutriente de los mismos. En la misma forma que la

inactivación de microorganismos puede ser considerada una

reacción cinética de primer orden, también la destrucción de

algunos compuestos sensibles al calor puede ser tratada en la

misma forma.

BIBLIOGRAFIA:

http://es.scribd.com/doc/111376308/Esterilizacion-de-

Biorreactores

http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/108596/

mod_resource/content/0/Clase%206%20.pdf

http://www.pisa.com.mx/publicidad/portal/enfermeria/manual/

4_6_5.htm

http://www.ms.gba.gov.ar/sitios/laboratorio/files/2012/08/

ESTERILIZACI%C3%93N-DE-MEDIOS-DE-CULTIVO.pdf