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BOSQUE 27(1): 3-15, 2006Marcadores genéticos en NothofagusBOSQUE 27(1): 3-15, 2006

ARTÍCULOS

El uso de marcadores genéticos en el género Nothofagus con especialreferencia a raulí y roble

The use of genetic markers in Nothofagus especially in raulí and roble

Leonardo Ariel Gallo1*, Paula Marchelli1, 2, María Marta Azpilicueta1, Paula Crego1, 2

*Autor de correspondencia: 1 Unidad de Genética Forestal, INTA EEA, Villa Verde s/n, CC 277, 8400 Bariloche, Argentina,Tel.: 54 2944 422731 Fax: 54 2944 424991 lgallo@bariloche.inta.gov.ar

2 CONICET (Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas), Argentina

SUMMARY

The accurate evaluation of the genetic variation, both for population and evolutionary genetic studies as well as for technologicalimprovement, constitutes a crucial point for proper conclusions and decisions. The use of molecular and biochemical geneticmarkers in forest tree species has become a key issue for the proper understanding of genetic variation and the resolution ofpractical problems. Among Nothofagus species, these markers have been used for 20 years. However, in species native toTemperate South American Forests, the first reference dates back to 10 years. This review describes the state of the art of the useof molecular markers among Nothofagus species in general with special concern in Nothofagus nervosa and N. obliqua.

Key words: genetic variation, DNA, isozymes, evolutionary processes, population genetics.

RESUMEN

En trabajos de investigación en genética de poblaciones y evolutiva así como en el desarrollo tecnológico de los programas demejora, la evaluación correcta de la variación genética es el punto crucial para la conclusión acertada y la toma de decisiones.El uso de marcadores genéticos bioquímicos y moleculares en especies forestales permitió un salto cualitativo en la confiabilidadde la información sobre la variación genética y la resolución en forma contundente de problemas de importancia práctica tantoen genética poblacional como en programas de mejora. En especies del género Nothofagus este tipo de marcadores comenzó autilizarse hace aproximadamente 20 años, aunque en especies nativas de los bosques templados de Sudamérica la primerareferencia data de diez años atrás. El presente trabajo describe los aportes que la genética molecular ha hecho hasta la fecha enlos estudios de variación genética del género Nothofagus en general y de Nothofagus nervosa (raulí) y N. obliqua (roble, roblepellín) en particular.

Palabras clave: variación genética, ADN, isoenzimas, procesos evolutivos, genética de poblaciones.

INTRODUCCIÓN

La información genética, que determina en interac-ción inseparable con el ambiente el fenotipo observablede los organismos, se encuentra ubicada en diferentescompartimentos celulares (Suzuki et al. 1993), donde seautoduplica, muta y recombina. Si bien en vegetales su-periores la mayor parte del ADN se halla en el núcleo,también es posible encontrarlo en organelas como loscloroplastos y las mitocondrias. Moléculas del ARN ri-bosómico, mensajero y de transferencia son frecuentesademás en los ribosomas y en el plasma celular.

En especies sudamericanas del género Nothofagus todaesta información genética ha evolucionado durante aproxi-

madamente 100 millones de años (Poole 1987), adaptán-dose por medio de los fenotipos portadores a enormescambios geológicos y macroclimáticos que tuvieron lu-gar en el extremo sur del continente desde el Mesozoicosuperior. Procesos evolutivos de gran importancia comoselección adaptativa, migración y deriva genética, pro-movidos principalmente durante los procesos de reduc-ción y expansión de las poblaciones, fueron modelandoel patrón observable de diferenciación específica adapta-da a diversas situaciones de altitud, suelos, humedad,irradiación, etc. En Sudamérica, probable centro de ori-gen evolutivo del género (Swenson et al. 2000), esteproceso originó unas nueve especies (Donoso 1987) quecubren gran parte de los aproximadamente 10 millones

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de has de estos bosques templados (Laclau 1997). Algu-nas de estas especies de Nothofagus ocupan en formaexclusiva nichos bien específicos, mientras que otrascomparten hábitats con especies congéneres o en mez-clas con coníferas u otras latifoliadas (Donoso y Lara1995, Laclau 1997).

La conservación de la diversidad genética de estosbosques de Nothofagus y la utilización de sus valiosasespecies maderables en programas de domesticación ymejora tendientes a su cultivo, concentran su objetivo enla correcta caracterización y evaluación de la variacióngenética entre individuos y poblaciones dentro de espe-cies. El raulí (Nothofagus nervosa (Phil.) Dim. et Mil.) yel roble (N. obliqua (Mirb.) Oerst.), especies destacadaspor su importancia comercial y por sus particularidadesevolutivas, son objeto de estudio desde hace algunos añosen trabajos de investigación de los patrones de variacióngeográfica y genética y de los procesos evolutivos que ledieron origen y los mantienen o modifican (Donoso 1979,Gallo et al. 1997, 2004, 2005, Marchelli y Gallo 1999 y2004a, Donoso et al. 2004).

En Chile y Argentina se ha comenzado a desarrollarla tecnología necesaria para la domesticación y la mejoragenética de ambas especies, contándose en la actualidadcon los resultados iniciales de ensayos de campo de pro-cedencias, pruebas de progenie y huertos semilleros (Ga-llo et al. 2000a, Ipinza y Gutiérrez 2000).

Tanto en los trabajos de investigación en genética depoblaciones y evolutiva cuanto en el desarrollo tecnoló-gico de los programas de mejora, la correcta evaluaciónde la variación genética es el punto crucial para la acer-tada conclusión y toma de decisiones. Los primeros estu-dios de variación geográfica y genética en especies fo-restales y la evaluación genética de los programas demejora analizan la distribución de la variación de carac-terísticas morfométricas de importancia adaptativa y/ocomercial (Wright 1976). Esta variación continua, asu-mida como de control genético poligénico, es de difícilcaracterización debido a la gran interacción del genotipocon el ambiente. La genética cuantitativa y el análisisestadístico de las fuentes de variación, con numerososartilugios matemáticos basados en supuestos biológicospoco convincentes y de restringida comprobación, handesarrollado un exagerado marco teórico que apuntala unmodelo determinístico y lineal, ampliamente criticadodesde hace años (Lewontin 1977, Gallo et al. 1995). Sibien algunas recientes técnicas computacionales de esti-mación (Gilmour et al. 2000) permitieron mejorar laexactitud de los modelos teóricos cuantitativos más utili-zados (Henderson 1975), ha sido principalmente el apor-te de la genética molecular lo que ha comenzado a des-entrañar recientemente el entendimiento de la conexiónentre esas características de importancia adaptativa y/ocomercial y su base genética subyacente. El advenimien-to de la determinación y uso de marcadores genéticosbioquímicos y moleculares en especies forestales desde

hace más de treinta años (Bartels 1971, Bergmann 1971),permitió un salto cualitativo en la confiabilidad de lainformación sobre la variación genética y la resoluciónen forma contundente de problemas de importancia prác-tica tanto en genética poblacional como en programas demejora.

En especies del género Nothofagus este tipo de mar-cadores comenzó a utilizarse desde hace poco más de 20años (Haase 1992). Mientras que en forestales nativas delos bosques templados de Sudamérica la primera referen-cia de la determinación y uso de marcadores genéticospara estudios de genética poblacional se remonta a diezaños atrás (Gallo y Geburek 1994), su utilización en es-tudios de variación genética de raulí y roble se reportapor primera vez unos años después (Gallo et al. 1997).

La aplicación potencial de algunas técnicas biotecno-lógicas en el género Nothofagus ha sido descrita en for-ma teórica por Paredes et al. (2000). Sin llegar a serexhaustiva, la presente contribución pretende describirlos variados aportes que la genética molecular ha hechohasta la fecha en los estudios de variación genética delgénero Nothofagus en general y de raulí y roble en par-ticular.

LOS MARCADORES GENÉTICOS

La unidad evolutiva y la unidad de mejora es la po-blación. Tanto la selección natural como los otros facto-res evolutivos y la selección artificial, impuesta por elmejorador, actúan directamente sobre las frecuenciasgénicas poblacionales. Son las proporciones de los genesen las poblaciones las que se ven modificadas permitien-do avanzar en el camino evolutivo de poblaciones natu-rales o acumular genes de particulares aptitudes adapta-tivas, de crecimiento, forma, etc., en la poblaciónmejorada. Es por ello que la identificación inequívoca degenes y el monitoreo de los cambios de las frecuenciasgénicas, aun en genes neutros sin relación directa conprocesos selectivos, constituyó siempre una aproxima-ción deseada tanto en genética evolutiva cuanto en gené-tica cuantitativa. La herramienta que permitió tal aproxi-mación son los denominados marcadores genéticos. Estosconstituyen fenotipos directamente relacionados con lapresencia de variantes genéticas, de modo tal que la ob-servación de uno de esos fenotipos permite identificar elmarcador genético en cuestión. A pesar de ello, en nume-rosas técnicas moleculares la relación no es tan directa.Numerosos artefactos metodológicos pueden modificarla expresión fenotípica de una variante genética y de estamanera hacer inestable y poco confiable su interpreta-ción en diferentes análisis de una misma muestra en elmismo o en diferentes laboratorios.

Las variantes genéticas de un locus con dos alelospueden expresarse fenotípicamente en forma dominante,es decir, una de las variantes homocigotas y el heteroci-

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gota presentan el mismo fenotipo; o en forma codomi-nante, es decir, es posible distinguir fenotípicamenteambas variantes homocigotas de la heterocigota. Con esteúltimo tipo de marcadores genéticos es posible y alta-mente recomendable realizar el análisis genético de lasegregación observada en un conjunto de individuos congrado de parentesco conocido. De esta forma, una vezformulada alguna de las hipótesis de segregación mende-liana se ponen a prueba su expresión cuali y cuantitativa,esto último por medio del análisis estadístico con la de-bida valoración de su significancia.

Cumplido este requisito, es posible denominar a laexpresión fenotípica observada “marcador génico”, esdecir, aquel que establece una relación inequívoca entreella y la presencia del gen que la controla (Hattemer etal. 1993). El análisis genético de la variación fenotípicaes, por lo tanto, la única comprobación aceptable parapoder referirse a genes o genotipos y locus o loci géni-cos. Sin él, sólo se deberá hablar de variantes genéticaso genes putativos. Resulta obvio, entonces, que en estu-dios de genética poblacional y evaluaciones de genéticacuantitativa sea siempre recomendable, aunque no im-prescindible, trabajar con marcadores génicos.

Los primeros marcadores génicos fueron morfológi-cos y corresponden a los determinados por Mendel ensus históricos y notables estudios con material segregan-te de Pisum sp. y Phaseolus sp., a partir de los cualesformuló las leyes que aún hoy rigen en la genética (Men-del 1866). En especies forestales no son muchos los tra-bajos en los que se hayan detectado marcadores morfoló-gicos con segregación mendeliana. Uno de los másrelevantes, y quizás el primero, corresponda al estudio dela segregación de plantas albinas en la descendencia deindividuos de Picea abies (Langner 1953). Otros ejemploscorresponden al control por un gen simple dominante delcontenido de antocianina en vacuolas de plántulas de Be-tuna sp. (Hattemer et al. 1990) o el contenido relativo deterpenos en especies del género Pinus (Squillace 1977).

Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, sedebe considerar que la gran mayoría de los trabajos degenética poblacional de especies forestales utiliza marca-dores genéticos ya que carecen de análisis genéticos, de lasegregación fenotípica observada. Algunos autores aducenque cuando el patrón de variación fenotípica observado enlas enzimas de una especie es parecido al de otra se puedetener cierto grado de confianza de que se trata de los mis-mos loci y genes. Sin embargo, estudios relativamenterecientes probaron que la homología entre zimogramas,aun de especies taxonómicamente emparentadas, puedeconducir a errores de interpretación (Pastorino y Gallo2001). Por este motivo numerosas afirmaciones sobre ge-nes, procesos genéticos y evolutivos publicados en revis-tas científicas internacionales deberían ser consideradasintrínsecamente heurísticas (Hattemer 1991).

En especies de vegetales superiores la informacióngenética puede presentarse en condición diploide en los

genes situados en el genoma nuclear o haploide en aque-llos ubicados en el genoma citoplasmático. Los marcado-res genéticos pueden entonces clasificarse también segúneste criterio. En estudios isoenzimáticos con el debidocontrol genético es posible referirse entonces a las diferen-cias en la constitución diploide entre dos poblaciones comodiferencias en la estructura genotípica, mientras que dife-rencias en las variantes genéticas del ADN de cloroplastos(cpADN) se indican como diferencias en sus haplotipos.

También pueden clasificarse con variados criterioscomo el polimorfismo en el número de alelos (variantesgenéticas de un mismo locus o sitio genético), la neutra-lidad o si pertenecen o no a regiones codificantes. Exis-ten en este sentido marcadores genéticos nucleares pocovariables (e.g. isoenzimas) y otros hipervariables (e.g.microsatélites o repeticiones de secuencias simples). Lamayoría de los marcadores utilizados son neutros a laselección. Por otro lado, en general, corresponden a re-giones no codificantes del genoma, a excepción de lasisoenzimas y de parte de los fragmentos secuenciados.

Por último, otro criterio puede basarse en la comple-jidad técnica para desarrollar y utilizar el marcador y enel costo del empleo del mismo. Un resumen de los prin-cipales marcadores utilizados en diferentes tipos de estu-dios en el género Nothofagus y sus características másnotables se presentan en el cuadro 1.

Clasificación taxonómica y filogenética. Los primerostrabajos que utilizaron marcadores moleculares en espe-cies del género Nothofagus se refieren a estudios de cla-sificación taxonómica y filogenética. Haase (1992) utili-za marcadores genéticos isoenzimáticos (loci putativos)para confirmar la separación taxonómica de N. menziesiide otras cuatro especies neocelandesas del género. Losresultados de este primer trabajo, aun con un marcadorpoco variable como las isoenzimas, establecieron la pri-mera coincidencia clasificatoria en el género entre carac-terísticas fenotípicas del grano de polen (la variable dis-criminante utilizada hasta esa fecha) y la informacióngenética de las especies.

Analizando el polimorfismo de los fragmentos origi-nados por siete enzimas de restricción con la técnica delsouthern blot en ADN de cloroplasto, Manos et al. (1993)dieron la primera evidencia molecular sobre la conve-niencia de considerar al género Nothofagus como perte-neciente a la familia monofilética Nothofagaceae, comohabía sido propuesto previamente en base a caracteresmorfológicos por otros autores (Kuprianova 1962, cit.Manos et al. 1993). Los resultados obtenidos en esteprimer trabajo ubican a esta familia más cerca de la fa-milia Betulaceae que de Fagaceae. En otro estudio másdetallado Martin y Dowd (1993) compararon por primeravez las secuencias nucleotídicas del gen rbcL de ADN decloroplasto para 23 especies de Nothofagus y tres deFagus, confirmando la separación de ambos géneros endos familias diferentes.

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Un análisis comparativo posterior de secuencias debases nucleotídicas ubicadas en el gen matK de ADN decloroplasto reafirmó la ubicación del género Nothofagusfuera de la familia Fagaceae en la familia Nothofaga-ceae (Manos y Steele 1997). El estudio filogenético deMartin y Dowd (1993) dentro del genéro Nothofagusconfirmó la clasificación morfológica de Hill y Read

Cuadro 1. Algunos criterios de clasificación de diferentes tipos de marcadores moleculares utilizados hasta la fecha en estudiosde genética evolutiva y de poblaciones en especies del género Nothofagus (modificado y adaptado de: de Vienne y Santoni 1998).

Some classification criteria for different molecular markers used in population and evolutionary genetics studies in Nothofagus.

Técnica ADN Codomi- Polimor- Complejidad Tema abordado Referencia bibliográficautilizada codificante Número nancia fismo técnica en Nothofagus en Nothofagus

Haase 1992, 1993ab y1994; Gallo 1995;Premoli 1996, 1997,1998 y 2003;Marchelli y Gallo2000ab, 2001; Pineda2000ab; Azpilicueta yGallo 2001 y 2002;Crego y Gallo 2002ab; Carrasco y Eaton2002; Gallo 2002 y2004; Gallo et al.1997, 2000b y 2003;Marchelli 2002;Stecconi et al. 2002 y2004; Donoso et al.2004; Premoli yKitzberger 2005.

Manos et al. 1993.

Marchelli et al. 1998;Marchelli y Gallo2000b, 2004b y 2006;Azpilicueta et al.2005

Mattioni et al. 2002.

Mattioni et al. 2002.

Marchelli yGallo 2000b;Azpilicuetaet al. 2004; Joneset al. 2004.

Martín y Dowd 1993;Manos 1997;Manos y Steele 1997;Setoguchi et al. 1997.

Isoenzimas

RFLP

PCR-RFLPcpADN

ISSR

RAPD

SSR(Microsat)

Secuenciación

Sí(1)

No

No

No

No

No

Sí/No

<30

~ ilimitado

~ ilimitado

~ ilimitado

~ ilimitado

Algunosmiles

~ ilimitado

Sí

Sí

No(2)

No

No

Sí

No

Bajo

Alto

Medio

Muy alto

Muy alto

Muy alto

Muy alto

Baja

Media

Media

Baja

Baja

Alta

Alta

Determinaciónmarcadores,diversidad ydiferenciacióngenéticas,hibridación,filogenia, flujogénico,conservación.

Filogenia.

Diferenciación,determinación derefugios, caminosmigratorios.

Desarrollo,diversidad ydiferenciación.

Desarrollo,diversidad ydiferenciación.

Desarrollo,transferibilidad,flujo génico.

Filogenia.

(1991) y sugiere al subgénero Lophozonia, donde se ubi-can raulí y roble como los de mayor antigüedad, con unaedad de diferenciación de 66 millones de años. Haase(1994) contribuye con otra estimación del tiempo de se-paración de los subgéneros neocelandeses Fuscospora yLophozonia en relación a las distancias genéticas estima-das a partir de estudios isoenzimáticos. Un estudio pos-

(1) En algunos trabajos se les atribuye además valor adaptativo.(2) ADN haploide.

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terior de Manos (1997) establece una clasificación filo-genética dentro de las especies templado-frío del géneroen base a las secuencias nucleotídicas codificantes y nocodificantes de ADN nuclear ribosomal (rADN) y lascompara con los resultados previos del análisis de se-cuencias nucleotídicas de ADN de cloroplasto de Martiny Dowd (1993) y con el árbol filogenético establecido enbase a caracteres morfológicos (Hill y Jordan 1993). Elárbol consensuado de las tres fuentes de informaciónconfirma, entre otras cosas, la ubicación de roble, raulí yN. glauca en un mismo clado dentro del subgénero Lo-phozonia, resultando roble el taxa ancestral del que ha-brían derivado las otras dos especies que se encuentranmás próximas entre sí. Otro estudio comparativo de lassecuencias de bases nucleotídicas del espaciador intergé-nico atpB-rbcL en el ADN de cloroplasto (Setoguchi etal. 1997) confirmó la clasificación de los cuatros subgé-neros determinados por Hill y Read (1991) en base a lascaracterísticas polínicas. Estos autores indican que la di-versificación del género en los cuatro subgéneros ocurrióantes de completarse la separación de las placas tectóni-cas de Gondwana durante el Terciario inferior. Reciente-mente se confirmó que la distribución transoceánica delgénero Nothofagus es consistente con un evento de vica-riancia, mientras que la distribución a través del mar deTasmania sólo podría ser explicada por procesos de dis-persión a larga distancia (Knapp et al. 2005).

Diferenciación y diversidad genéticas. La diferenciacióngenética entre poblaciones de especies del género Notho-fagus junto con consideraciones sobre la probable ubica-ción de refugios glaciales y los caminos de recoloniza-ción posteriores fue analizada por primera vez por Haase(1992) en N. truncata. El mismo autor contribuye poste-riormente con otro estudio de diferenciación sobre laprobable distancia de polinización y el efecto fundadoren N. menziesii (Haase 1993b). En ambos casos utilizómarcadores genéticos isoenzimáticos. En el último traba-jo mencionado, considerando las diferencias en las fre-cuencias de alelos putativos isoenzimáticos entre las po-blaciones fragmentadas analizadas, remarca la importanciadel “efecto fundador” y de la polinización a gran distan-cia en la diferenciación de la especie. También medianteel uso de marcadores genéticos isoenzimáticos se anali-zaron poblaciones de las tres especies de coihues sud-americanos (N. dombeyi, N. betuloides y N. nitida), en-contrándose que las dos primeras especies, de ampliadistribución, poseerían una mayor diversidad genética queN. nitida, de distribución más restringida (Premoli 1996,1997). La autora sugiere que la presencia de cuatro ale-los putativos exclusivos en esta última especie estaríaindicando su prolongado aislamiento. Por otro lado, laestructura genética a escala local se vio levemente afec-tada por el modo de regeneración en N. dombeyi (Premo-li y Kitzberger 2005). En Nothofagus pumilio (lenga),con marcadores genéticos isoenzimáticos (loci putativos),

se informa sobre la variación genética intraespecífica,diferenciándose las poblaciones del norte del área dedistribución natural de las del sur y sugiriendo algunashipótesis evolutivas (Premoli 1998) que deberían con-firmarse con un mayor número de poblaciones. Reciente-mente, un trabajo de diferenciación genética altitudinal,a partir del análisis de variación de las frecuencias dealelos putativos, sugeridos mediante análisis isoenzimáti-co, muestra en dos de las tres transectas analizadas unaleve tendencia a la disminución de la variación genéticacon la altura (Premoli 2003). El primer informe sobre eluso de marcadores de tipo “fingerprinting” en coihue,roble y raulí se refiere a la comparación entre marcado-res genéticos de ISSR (fragmentos entre repeticiones desecuencias simples) y RAPDs (ADN polimórfico ampli-ficado al azar) (Mattioni et al. 2002). Estos autores en-contraron una alta proporción de bandas polimórficas entrelos 63 fragmentos generados para ISSR y los 42 paraRAPDs con los seis iniciadores utilizados respectivamen-te. Con estos polimorfismos analizaron la diversidad ge-nética dentro y entre las muestras de las tres especies,encontrando un alto y similar poder discriminante paraambos marcadores que permitió diferenciar claramente acada una de ellas.

Los primeros estudios de la diversidad y diferencia-ción genéticas en raulí y roble se realizaron mediantemarcadores isoenzimáticos. La técnica de electroforesisde isoenzimas se ajustó, en primer término, para raulí apartir de los protocolos empleados en especies europeasemparentadas del género Fagus. En ambas especies serealizaron análisis genéticos cuali y cuantitativos de lasegregación fenotípica observada en los zimogramas,verificándose estadísticamente las hipótesis de segrega-ción propuestas según el método descrito por Gillet yHattemer (1989). De esta manera se estableció una rela-ción inequívoca entre el fenotipo observado y la presen-cia del gen que lo controla, determinándose marcadoresgénicos, algunos de ellos específicos de cada especie(Gallo et al. 1997).

En el caso del raulí se determinaron ocho loci marca-dores, identificándose en ellos 28 alelos (Marchelli y Gallo2000a). Con estos marcadores se analizó la variacióngenética de 20 poblaciones, cubriendo toda el área dedistribución natural de la especie en Argentina con unmínimo de 100 individuos (embriones) por población,determinándose niveles de variación tanto dentro comoentre poblaciones, así como las zonas de mayor diversi-dad genética (Marchelli y Gallo 2000b, 2001a, 2004ab).Los niveles de heterocigosis observada y esperada fueronde 16% y 18% respectivamente, en promedio, para eltotal de las poblaciones analizadas. El número de locipolimórficos por población varió entre 62,5% y 100%.El número medio de alelos por locus resultó de 3,5. Seobservaron también varios alelos raros, es decir, en pro-porciones menores al 5%, así como también alelos exclu-sivos, particularmente entre las poblaciones más occi-

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dentales de la distribución en Argentina, aquellas ubica-das en las cabeceras Oeste de las cuencas lacustres. Apesar de su distribución netamente fragmentada en ellado argentino y a lo largo de cuencas lacustres de origenglacial con orientación Oeste-Este, la variación longitu-dinal resultó mayor que la latitudinal. La mayor diversi-dad genética encontrada en las poblaciones del Oeste,probablemente como consecuencia de la discontinuidadde la superficie de la capa de hielo durante el periodoglacial y la posible ocurrencia de refugios, y el mayorporcentaje de hibridación con roble en las del Este ha-brían contribuido a este patrón de variación.

Tres poblaciones chilenas de raulí analizadas por losmismos autores a modo de comparación mostraron me-nor diversidad genética que las poblaciones argentinas(Marchelli y Gallo 2004a). Del mismo modo el númeromedio de alelos por locus de 22 poblaciones chilenas(Pineda 2000a) y 18 poblaciones chilenas (Carrasco yEaton 2002) resultaron ser levemente menores que elreportado antes para las 20 poblaciones argentinas. Sinembargo, el grado medio de heterocigosis es mayor enlas poblaciones chilenas. Esto sería un indicio del carác-ter fragmentado de la distribución de la especie en Ar-gentina, con restringido flujo génico entre las poblacio-nes. Si bien esta comparación entre poblaciones a amboslados de la Cordillera de Los Andes estaría indicandouna tendencia, es necesario tener en cuenta que en elcaso de las poblaciones chilenas (Pineda 2000a, Carrascoy Eaton 2002) los resultados preliminares obtenidos co-rresponden a un tamaño muestral sumamente reducido, aalelos putativos y a enzimas, que como en el caso de lasperoxidasas son poco estables, presentando variaciónambiental y ontogenética.

En roble el análisis de control genético de la varia-ción observada (Gillet y Hattemer 1989) posibilitó laidentificación de siete loci marcadores (Azpilicueta yGallo 2001). Con ellos se analizaron 14 poblaciones ar-gentinas de la especie con un mínimo de 100 individuos(embriones) por población, determinándose un númerototal de 19 alelos, con valores medios poblacionales de85% de loci polimórficos y un número medio de alelospor locus para la especie de 2,71. La diversidad mediapoblacional observada (ν) fue de 1,291. La variacióngenética mostró un patrón de distribución en el que laspoblaciones más variables resultaron las del este de ladistribución, más cercanas a la zona de ecotono con laestepa. Asimismo, las poblaciones con las mayores fre-cuencias de alelos específicos de raulí, especie con laque hibrida, se encontraron también al este de las cuen-cas (Azpilicueta y Gallo 2002). Tal como en el caso deraulí, a pesar de la distribución marcadamente fragmen-tada de estos bosques, acotada a las cuencas lacustres ycon predominancia de vientos del Oeste, no se encontróuna fuerte variación latitudinal.

Los niveles de variación encontrados en ambas espe-cies en Argentina resultaron altos, si se tiene en cuenta la

reducida área de distribución natural de ambas especiesen ese país. Probablemente esto se deba a tres factoresprincipales: a) la ocurrencia de refugios glaciales al estede la Cordillera de Los Andes, tanto en sitios húmedoscomo en poblaciones marginadas hacia la estepa; b) lagran fragmentación que tuvo lugar con el subsiguienteproceso de aislamiento e inicio de caminos evolutivosdiferentes y c) la alta tasa de hibridación natural encon-trada entre ambas especies.

Hibridación interespecífica. Existen algunos aportes dela genética molecular al entendimiento del proceso dehibridación entre diferentes especies del género Nothofa-gus. En general estos estudios han reforzado el conoci-miento previo sobre la existencia de hibridación a travésde caracteres morfológicos. Tal es el caso de la hibrida-ción entre Nothofagus betuloides y Nothofagus nitida,descritos inicialmente por Donoso y Atienza (1983) através de caracteres morfológicos y con una confirma-ción general a través de marcadores isoenzimáticos (Pre-moli 1996), o el conocido caso de la hibridación entre deNothofagus pumilio y Nothofagus antarctica que, ade-más de la clara diferenciación morfológica visible en eldimorfismo foliar de los rámulos, ha sido sugerido tam-bién con marcadores genéticos isoenzimáticos en fun-ción de la mayor heterocigosis encontrada en los supues-tos híbridos (Quiroga et al. 2001).

Recientemente, se informó sobre la utilización deambas aproximaciones, la morfológica y la molecular,para la primera descripción en comunidades naturales dela ocurrencia de hibridación entre una especie de hojaperenne, N. dombeyi y otra de hoja caduca N. antarctica(Steconni et al. 2002, 2004).

La hibridación natural entre raulí y roble fue descritapor primera vez en poblaciones naturales de estas espe-cies por Donoso et al. (1990) en base a característicasmorfológicas de las hojas, características anatómicas dela madera y análisis de flavonoides. La ocurrencia de lahibridación ya era conocida en arboretos (Stewart 1979,Tuley 1980), proponiéndose posteriormente el nombrede N. x alpina al híbrido resultante (Lennon et al. 1987).A nuevas descripciones morfológicas y de crecimientorealizadas en familias de una prueba de progenie (Gallo1995) se sumó el uso de marcadores génicos isoenzimá-ticos para la identificación de híbridos y el monitoreo dela dinámica de hibridación. Se encontraron dos loci géni-cos (Adh y Pgi) con alelos específicos para cada especiey de segregación independiente (Gallo et al. 1997). Conestos marcadores fue posible diferenciar a ambas espe-cies parentales de los híbridos F1 y de los probableshíbridos retrocruzas en muestras de embriones seminalesy de yemas y hojas de plántulas, renovales e individuosadultos. Se encontró una alta correlación positiva entre elgrado medio de heterocigosis y el crecimiento inicial enaltura en las familias con individuos híbridos. Se verificóuna alta segregación en los individuos híbridos con res-

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pecto a su crecimiento y fenología en vivero (Crego 1999).Con estos marcadores específicos de especie pudo deter-minarse además la unidireccionalidad de la hibridación,actuando el raulí principalmente como madre. Se estimóademás la tasa de autofecundación y la estrecha relaciónentre el grado de aislamiento de los árboles de raulí y elporcentaje de híbridos F1 generados (Gallo et al. 1997).Se probó además una significativa variación temporal enla generación de híbridos F1 y retrocruzas analizandopara ello, durante dos o tres años consecutivos, la pro-porción de híbridos generados en los mismos árboles(Crego y Gallo 2002a). El porcentaje de híbridos encon-trados en las diferentes familias de una zona de simpatríavarió entre 0 y 83%; mientras que en el bosque sólo fueposible estimar un 6% de individuos adultos híbridos.Observaciones en vivero de daños por heladas tempranassugirieron un posible mecanismo de selección naturalcontra los híbridos F1.

En base a todos estos datos y a los inventarios gené-ticos de la variación genética de ambas especies (Mar-chelli y Gallo 2001a, Azpilicueta y Gallo 2002) pudorealizarse un análisis de la distribución espacial del fenó-meno de hibridación, diferenciando entre híbridos F1 ehíbridos retrocruzas. Se constató que diferentes pobla-ciones se encuentran en diferentes etapas evolutivas en elproceso de hibridación. En un bosque mixto de ambasespecies con un grado de simpatría 1:1 se realizó luegoun mapeo individual de los árboles adultos y la regenera-ción de roble y raulí. En esa parcela se llevó a caboadicionalmente un estudio fenológico de la floración to-mando pares de individuos de ambas especies. Se com-probó que los árboles de raulí en las mismas condicionesambientales florecen antes que los de roble. Debido aello, se encontró un solapamiento parcial de los momen-tos de floración, infiriéndose que la nube de polen conposibilidad de fecundar a individuos de la otra especieestaría constituida por una proporción de granos de polende roble dos veces y media superior a la de raulí. (Cregoy Gallo 2002b). Por otro lado, los individuos de raulíubicados a menor altitud y en simpatría 1:1 con los deroble estarían aislados fenológicamente de los ubicados amayor altitud en el bosque puro de esta especie.

Un análisis integral de toda esta información permitiórealizar una propuesta sobre la dinámica de hibridaciónentre ambas especies, tanto a nivel local como regional,estableciéndose un modelo conceptual de base experi-mental para este importante proceso evolutivo (Gallo2002, 2004). En este modelo se plantea la posibilidad deun equilibrio dinámico en el proceso de hibridación quepodría mantenerse indefinidamente y que resulta posibleprincipalmente debido al balance entre las incompatibili-dades pre y postcigóticas de los híbridos.

Migración postglacial. Durante las últimas glaciacioneslos bosques vieron drásticamente reducida su distribu-ción, sobreviviendo en refugios. Dada la baja tasa de

mutación del ADN de cloroplasto y el bajo número degeneraciones desde el retiro de los hielos, la presencia dedistintos haplotipos entre las poblaciones de una especiese asume como indicadora de un aislamiento prolongado.Por lo tanto, se pueden utilizar estos marcadores paraestudiar la historia pre y postglacial de las especies, de-terminándose la probable localización de refugios glacia-les y reconstrucción de las posibles rutas migratorias lue-go de la retracción de las masas de hielo. La herenciauniparental y la baja tasa de mutación del ADN de clo-roplasto permiten su uso en estudios filogeográficos (Kre-mer y Petit 1993, Petit et al. 1993). De esta manera, sepueden trazar linajes intraespecíficos analizando las po-blaciones que comparten un tipo de ADN de cloroplasto(haplotipo).

Un estudio preliminar en poblaciones de raulí en Ar-gentina, utilizando la técnica de PCR-RFLP con primersuniversales, reveló la existencia de dos haplotipos (deter-minados por las combinaciones primer/enzima: trnD-trnT/TaqI y trnF-trnV/TaqI), uno al norte y otro al sur delvolcán Lanín (Marchelli et al. 1998). Estos resultadosfueron sorprendentes dada el área de distribución tan re-ducida en Argentina y llevaron a sugerir la existencia deal menos dos refugios glaciales ubicados en la Cordillerade Los Andes. Posteriormente, un estudio, incluyendopoblaciones de toda el área de distribución, permitió iden-tificar tres nuevos haplotipos. Los patrones de distribu-ción geográfica de los cinco haplotipos encontrados mues-tran una separación notoria entre la Cordillera de LosAndes y la Cordillera de la Costa. A su vez, dentro decada cordillera, se observa una variación en sentido lati-tudinal. Estos resultados sugieren la existencia de refu-gios adicionales al de la Cordillera de Nahuelbuta (Villa-grán 1991), los cuales estarían situados tanto al Este comoal Oeste de la Cordillera de Los Andes y sobre ella (Mar-chelli et al. 2002). La combinación con la informaciónproveniente de los marcadores isoenzimáticos sugierecomo posible centro de dispersión para el raulí la zonade las cuencas Lácar-Neltume, donde se detectó la mayorvariación intrapoblacional. Por otro lado, la confluenciade dos rutas migratorias en la zona del lago Paimún, enArgentina, habría estado interrumpida por una erupciónreciente del volcán Lanín que mantuvo aisladas a dospoblaciones cercanas (Milleron et al. 2005).

Para el estudio iniciado con roble se utilizaron lasmismas combinaciones de primers y enzimas de restric-ción que en el análisis de raulí. Se analizaron 14 pobla-ciones argentinas distribuidas en cinco cuencas lacustresy 20 poblaciones de distribución chilena, correspondien-tes a 10 regiones de procedencia de Chile. Se identifica-ron seis haplotipos en total, todos presentes entre laspoblaciones chilenas y dos entre las argentinas. A lo lar-go de la Cordillera de Los Andes y de la Depresión In-termedia el patrón de distribución de los haplotipos fuesimilar al encontrado en raulí, ya que se observaron prin-cipalmente dos haplotipos con distribución Norte-Sur.

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Adicionalmente se detectaron tres haplotipos en las po-blaciones más septentrionales. La Cordillera de la Costa,zona libre de hielo en las últimas glaciaciones, presentóla mayor diversidad con la presencia de los seis haploti-pos (Azpilicueta et al. 2005).

Los altos niveles de diferenciación entre poblacionesencontrados para ambas especies indican un alto gradode fijación (GST raulí = 0,931; GST roble = 0,888), lo cualtambién ha sido encontrado para otras Fagaceae (Petit etal. 2005).

Los resultados obtenidos con los marcadores de ADNde cloroplasto sugieren que estas dos especies han sobre-vivido las glaciaciones en múltiples refugios, probable-mente ubicados tanto en la Cordillera de la Costa comoa ambos lados de la Cordillera de Los Andes. La identi-ficación de haplotipos compartidos indicaría además lacoexistencia de ambas especies en algunos refugios co-munes y la ocurrencia de hibridación desde hace milesde años.

Flujo polínico. Los marcadores genéticos codominantes,particularmente los hipervariables como las repeticionesde secuencias simples o microsatélites, constituyen unapoderosa herramienta para el análisis de parentesco y porende para el estudio del movimiento polínico. Estos estu-dios no sólo tienen importancia práctica en la determina-ción de la contaminación genética de huertos semilleros(Adams 1981), sino especialmente en ayudar a entenderla conectividad entre poblaciones fragmentadas de variasespecies nativas y para delimitar los alcances geográficosdel concepto de población genética. En el primer caso,ese conocimiento encuentra una aplicación inmediata enla definición de medidas de conservación; en el segundoestá estrechamente relacionado con la veracidad de lasestimaciones de los parámetros cuantitativos utilizados enmejoramiento. Si bien existen numerosos métodos direc-tos e indirectos para estimar el flujo polínico (Hamrick yNason 2000), recientemente se ha desarrollado uno conventajas en el muestreo y en la interpretación de los re-sultados (Smouse et al. 2001).

Un trabajo reciente presenta el desarrollo de marca-dores microsatélites nucleares en N. cunninghamii (Joneset al. 2004), donde se determinaron 14 loci polimórficosutilizándose un número equivalente de pares de primersde los cuales seis podrían ser utilizados en otras especiesdel género, entre ellas roble. Paralelamente, con el objetode determinar este tipo marcadores específicamente pararaulí y roble se llevó a cabo en el INRA-UMR BIOGE-CO, Francia, un estudio en el que se desarrollaron 15microsatélites para Nothofagus y se intentó transferir aNothofagus 34 microsatélites desarrollados para el géne-ro emparentado Quercus (Azpilicueta et al. 2004). Delos 15 nuevos primers desarrollados, tres resultaron poli-mórficos tanto en roble como en raulí. La transferenciaentre géneros emparentados dio como resultado poli-morfismo en cuatro primers desarrollados para Quercus

rubra (roble americano) y en un primer desarrollado paraQuercus robur (roble europeo). El número de alelos en-contrados en el análisis de los ocho SSRs fue de 1-6 porlocus, con 3 alelos como el valor más frecuente. El aná-lisis de segregación pudo confirmarse en seis de los ochoprimers analizados y en cuatro de estos el genotipo de lamadre pudo ser inferido. A partir de estos resultados secuenta hoy con ocho primers de microsatélites con loscuales llevar a cabo diversos estudios entre los que estáprevisto un análisis de flujo génico en poblaciones veci-nas de roble, así como el monitoreo del flujo génico y deanálisis de parentesco en un rodal mixto de raulí y roble.Asimismo se está estudiando con estos marcadores elflujo polínico a escala local en raulí y se comenzará unestudio a escala de paisaje. Estos estudios posibilitaránprofundizar en el conocimiento de aquellos procesos di-námicos que modelan la estructura genética de las pobla-ciones y contar con una herramienta de amplia aplica-ción en los programas de mejoramiento.

Impacto del manejo silvicultural. Son pocos los trabajosque han intentado relacionar el impacto del manejo silvi-cultural sobre la estructura genética del bosque (Hosius1993). En especies del género Nothofagus existe un estu-dio preliminar realizado con N. pumilio bajo diferentestratamientos silviculturales (floreo, protección y testigo)en Tierra del Fuego, Argentina (Godoy y Gallo 1998).Los marcadores genéticos utilizados en este caso, geno-tipos y alelos isoenzimáticos, no mostraron diferenciassignificativas entre los tres tratamientos analizados en elestrato superior del bosque.

A partir del estudio de la hibridación natural interes-pecífica entre raulí y roble (Gallo et al. 1997) se llegódeductivamente a formular las consecuencias teóricas quehabría tenido la corta selectiva realizada en el pasado enla aptitud de las poblaciones mixtas de ambas especies(Gallo 2002, 2004). Raulí ha sido y es aún la especie másvalorada y, por lo tanto, la extracción selectiva de estaespecie en hábitats compartidos con el roble modificó laestructura específica de esos bosques mixtos. Esto habríatraído aparejado el mayor aislamiento de los árboles re-manentes de raulí con respecto a otros individuos de suespecie y el aumento proporcional de polen de roble enla nube de polen de la población. Ambas modificacionestenderían a aumentar la generación de individuos híbri-dos y, debido a la menor aptitud reproductiva de éstos, adisminuir la aptitud reproductiva general de las poblacio-nes mixtas (Gallo 2004). El manejo silvicultural actualdebería, por lo tanto, tratar de compensar esa extracciónselectiva del pasado para recomponer la potencialidadevolutiva de ambas especies.

Conservación. Las zonas que concentran los mayoresniveles de diversidad son las más importantes desde elpunto de vista de la conservación de una especie. A suvez, constituyen el material base tanto para programas de

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mejoramiento como para el cultivo de la especie fuera desu área de distribución.

En el caso de las poblaciones argentinas de raulí, tan-to los estudios isoenzimáticos como los de ADN de clo-roplasto permitieron distinguir una zona de gran diversi-dad genética al oeste de los lagos Lácar y Lolog(40º 01’- 40º 10’ S y 71º 46’- 71º 35’ O). Esta zona fuesugerida como posible refugio donde la especie sobrevi-vió durante las glaciaciones y a partir del cual recolonizóel área previamente glaciada (Marchelli y Gallo 2004a).Por su alto valor genético la zona fue declarada de inte-rés por la Administración del Parque Nacional Lanín y sedispuso un pedido de cambio en su categoría de protec-ción de modo que en ella no sea posible la extracciónmaderera, evitando así la corta de ejemplares de raulí(Gallo et al. 2003). De esta forma este cambio de catego-ría de protección se constituyó en el primer caso en Ar-gentina y uno de los pocos en el mundo en donde a partirde datos de variación genética se toman medidas concre-tas en la definición de áreas protegidas.

De la misma manera, con los datos de variación ge-nética de roble se detectaron del lado argentino dos po-blaciones de alto valor de conservación por su constitu-ción genética particular que incluye la presencia de alelosexclusivos (Azpilicueta y Gallo 2002). La primera deellas ubicada en el norte de la distribución natural de laespecie en Argentina, precisamente en el comienzo delos bosques andino-patagónicos, en las lagunas de Epulaf-quén (36º 49’ S, 71º 04’ O) se encuentra dentro de unárea de protección provincial (provincia del Neuquén).La otra población de particular interés en roble es la dePilolil (39º 30’ S, 70º 57’ O), que se encuentra en elextremo oriental de la distribución natural de la especie.Los estudios genéticos la identifican como de alta diver-sidad, con evidencias de antiguos procesos de hibrida-ción natural con raulí y sugiriéndosela como probablerefugio glacial de la especie (Azpilicueta y Gallo 2001,2002).

Mejoramiento genético. Son numerosas y diversas lasaplicaciones de los marcadores bioquímicos y molecula-res en programas de mejoramiento. Desde la identifica-ción del material (clones, familias, procedencias) hasta elanálisis de parentesco, el diseño de los huertos semille-ros, la determinación del porcentaje de su contaminaciónpolínica, la verificación de la proporcionalidad de fecun-dación en un mix de polen, etc. Estos y otros ejemploshan sido descritos en diferentes trabajos desde hace va-rios años (Adams 1981).

En el caso de raulí, Pineda (2000b) utilizó marcadoresgenéticos isoezimáticos para comparar la variabilidad ge-nética de un huerto semillero clonal de raulí con la de laspoblaciones naturales donde se seleccionaron los indivi-duos clonados. Si bien el número de individuos analizadosno fue suficientemente alto como para sacar conclusionesmuy contundentes, la variación genética encontrada en el

huerto representó con bastante similitud a la de las po-blaciones naturales.

Uno de los aspectos iniciales en los programas tradi-cionales de mejoramiento y forestación es determinar lasregiones de procedencia y de transferencia de semillas.En raulí y roble se determinaron regiones de proceden-cias del lado chileno en base a la variación climática, ladistribución geográfica actual, los límites fitogeográficosy la escasa información sobre variación genecológica(Vergara 2000). En Argentina, utilizando los datos devariación genética aloenzimática de raulí (Marchelli yGallo 2001a y 2004a) y teniendo en cuenta también lavariación en ADN de cloroplasto (Marchelli et al. 1998),se propusieron seis zonas de transferencia de semillas(Marchelli y Gallo 2004b) que serán ajustadas con losdatos que surjan de los ensayos de orígenes establecidosa campo. Esta información permite establecer medidasde control evitando la contaminación genética dentro delos Parques Nacionales en los que se distribuye la espe-cie y de este modo asistir a la regeneración natural consemillas pertenecientes a una misma zona. Por otro lado,permite concentrar las actividades de selección del pro-grama de mejoramiento dentro de una misma zona detransferencia y con particular énfasis en los centros demayor diversidad genética.

Otra aplicación de gran importancia en mejoramientogenético surge a partir de la confirmación de variacióntemporal en el sistema de apareamiento de raulí. Tanto através del monitoreo de la generación de híbridos F1(Crego y Gallo 2002b) como en un estudio ad hoc reali-zado durante dos años seguidos (Marchelli y Gallo 2001b),pudieron verificarse diferencias significativas entre lasestructuras genéticas de la descendencia de diferentes añosen un mismo árbol o en una misma población. Este resul-tado debería ser considerado cuando se realizan cosechasde semillas, particularmente teniendo en cuenta la perio-dicidad en la semillazón (Marchelli y Gallo 1999) y lamejor representatividad genética en las muestras de aque-llos años de alta producción de semilla.

CONCLUSIONES

Existen en la actualidad alrededor de 26 publicacio-nes científicas que se refieren a diferentes usos de losmarcadores bioquímicos y moleculares en especies delgénero Nothofagus en general, de las cuales poco más dela mitad tratan directa o indirectamente de su aplicacióna estudios genéticos en raulí y roble. Adicionalmente, enestas últimas especies esta temática se aborda también en10 capítulos de libros, tres tesis doctorales, dos trabajosde divulgación y 13 presentaciones a congresos. La prin-cipal contribución de la aplicación de esta poderosa he-rramienta en estas especies se refiere hasta el momento aestudios filogenéticos y de estimación de la variacióngenética dentro y entre poblaciones. Algunos de los últi-

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mos trabajos comienzan a incursionar más en procesosgenéticos de importancia evolutiva, tales como la migra-ción postglacial y la hibridación interespecífica y a desa-rrollar y emplear marcadores más potentes y nuevosmétodos para la mejor comprensión del flujo génico ac-tual y el análisis de parentesco. Las posibilidades de es-tas herramientas encuentran además un enorme campode acción en el monitoreo de la modificación de la varia-ción genética como consecuencia del manejo silvicultu-ral y de la mejora genética. El espectro de posibilidadeses, por lo tanto, muy amplio y los resultados esperadosmuy promisorios siempre y cuando se utilicen el marca-dor, la estrategia de muestreo y el método de análisisestadístico adecuados.

AGRADECIMIENTOS

Todos los estudios sobre variación genética molecu-lar en raulí y roble se enmarcan en un programa de con-servación y utilización de los recursos genéticos de am-bas especies, llevado a cabo en estrecha colaboracióncon el Departamento de Silvicultura, Delegación TécnicaPatagonia de la Administración de Parques Nacionales yfinanciados por diferentes proyectos de investigación(INTA, INTA-APN, IFS, DAAD-GTZ, BID-FONTAR,BID-FONTAGRO, SAGPyA-BIRF, CONICET). A to-dos ellos nuestro más sincero agradecimiento.

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Recibido: 13.04.04Aceptado: 10.11.05