Determinarea resveratrolului din vin

Din punct de vedere biochimic, resveratrolul este o stilbena(principala stilbena din struguri), apartinand claseipolifenolilor non-flavonoidici (clasa unde sunt inclusi, deexemplu, si curcumina sau lignanii). S-a constatat ca unele planteil sintetizeaza ca raspuns la diferite circumstante stresante(lezare, expunere la doze ridicate de radiatii ultraviolete,parazitare fungica etc). Se gaseste in ambele formestereoizomerice (cis – in cantitati foarte mici si trans cel maiprezent) si este liposolubil.

In ceea ce priveste alimentele, substanta se gaseste instruguri (doar in coaja si in cantitati diferite in functie desoi, regiune si expunerea la infectii fungice), in vin, alune,fructe de padure din familia Vaccinum (coacaze rosii si negre,afine, merisoare ). Nivelul de resveratrol din vin depinde dedurata perioadei in care vinul vine in contact cu cojilestrugurilor. De aceea vinurile albe si rosé au mai putinresveratrol decat vinurile rosii. Forma de resveratrol dinstruguri este aceea de glucozid trans, iar in vin se gasesc sicantitati crescute de agliconi de resveratrol, care se datoreazafermentatiei glucidice. In vin se gaseste si resveratrol in formacis. Este de retinut ca vinul rosu are un continut bogat depolifenoli cu actiune sinergica , resveratrolul fiind numai unuldintre acestia.

Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii deinteres:

• oenologic – este un nou compus fenolic, provenit din struguri,care participa la culoare, la caracterul gustativ, la invechireavinului, intervine in reactiile de oxidare, interactioneaza cuproteinele.

• fitopatologic - mijloc de protectie impotriva organismelorfitopatogene prin stimularea apararii naturale a plantei; • farmacologic – face parte din compusii cu proprietatiantioxidante sau captatori de radicali liberi in organism;protector impotriva bolilor cardiovasculare; proprietatichimiopreventive impotriva cancerului; previne inflamatiileasociate cu artrita si reumatismul; creste cantitatea decolesterol „bun”(HDL) si scade pe cel „ rau”(LDL).

Resveratrolul (trans 3,5,4-trihidroxistilben) este o fitoalexinaasociata cu rezistenta vitei de vie la putregaiul cenusiu şi esteprodus de boabele de struguri sub influenta radiatiilor UV.Sinteza resveratrolului a fost localizata in pielita bobului, ceeace indica ca rezistenta principala a strugurilor la atacul deputregai are loc la acest nivel (PEZET R,-1998) .

Resveratrol este molecula-mamă dintr-o familie de polimerinumit viniferins

Peretii celulari

Dupa infectia strugurilor in floare ciuperca patogena ramaneagatata de planta, in stare latenta, o perioada lunga de timp

Botrytis cinereea

APARARE

FitoalexineRESVERATROL

ɛ - viniferina

ATAC

( din iunie pana in septembrie) si se dezvolta dupa coacereastrugurilor.

Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea

Fenomenul de latenta, timpul in care ciuperca inceteazadezvoltarea sa, nu a fost explicata. Dezvoltarea ei estefavorizata de anumiti factori externi: umiditatea, temperatura,tesuturile moarte, leziunile plantelor, lumina, etc.

Studiile au evidentiat anumite reactii pe care le produceciuperca musafir.

Ipoteza acumularii rapide a compusilor antifungici –resveratrol, resveratrol trans- de- hidrodimer şi ε - viniferina –in vita de vie dupa infectia cu Botrytis cinerea, a fost pusa peseama latentei acesteia.

Biosinteza stilbenilor, flavonoizilor şi taninurilor, decurgedin metabolismul secundar al aminoacizilor – metabolizarea L-fenil alaninei in acid cumaric.

Calea de biosinteza a flavonoizilor la care participafenilalanina, un aminoacid aflat in cantitati mari in toatetesuturile in prezenta enzimei stilben sintaza sufera o deviere cuformare de resveratrol .

Ciclul de sinteză al resveratrolului

Cercetarile efectuate au avut ca obiectiv elaborarea uneimetode de analiza a resveratrolului, care sa fie utilizata pentruidentificarea şi cuantificarea lui in struguri, vin şi altecomponente ale vitei de vie, cunoscut fiind faptul caresveratrolul a fost citat pentru prima data in pielitastrugurilor, ca un compus in prevenirea bolilor şi apoi in vin caaport benefic pentru sanatate. Metoda de separare cuprindeextractia prealabila a neflavonoizilor din struguri, must, vin sialte produse vitivinicole - extractie cu metanol si acetat deetil, evaporare la sec, reluare cu metanol sau acetonitril siconcentratul analizat prin HPLC.

Structura chimica a trans si cis resveratrolului

a) cis – resveratrol b) trans – resveratrol

Referinte

Resveratrolother names

trans-3,5,4'-Trihydroxystilbene;3,4',5-Stilbenetriol;

trans-Resveratrol;(E)-5-(p-Hydroxystyryl)resorcinol (E)-5-

(4-hydroxystyryl)benzene-1,3-diolProperties

Molecular formula C14H12O3

Molar mass 228.24 g mol−1

Exact mass 228.078644

Appearance white powder withslight yellow cast

Solubility in water 0.03 g/LSolubility in DMSO 16 g/LSolubility in ethanol 50 g/L

MATERIAL ŞI METODĂ

Pentru analiza conţinutului de trans - resveratrol, se vautiliza HPLC, care va permite separarea metaboliţilor şianaliza acestor compuşi cromatografic. Astfel se vor comparapicurii obtinuti prin cromatograma HPLC cu cei standard ,putandu-se astfel identica daca exista resveratrol in produs, şila ce cantităţi.

Cis-izomerul este, probabil, transformat în timpul procesuluide vinificatie, dar de obicei nu se ajunge la concentraţia trans-izomerul în vin.

Metode de extractie- purificare si de determinare ale trans -resveratrolului

• A Metoda de extractie-purificare bazata pe extractia cusolventi;

• B Metode de determinare : HPLC.

A 1. Extracţia din vin

Vinul este evaporat la ½ din cantitate in evaporator sub vid, pentruindepartaea alcoolului. Din vinul dezalcoolizat, compusii fenolici seextrag cu acetat de etil conform schemei

Vin ( 20 μl)

+ CH3 OH (50 ml )(metanol) Refluxare

( 30’ )Separare faza lichida

Filtrare

Evaporare sub vid ( la sec )

Rezidiuu + 30 ml. Apa

Extractie cu acetat de etil (50 ml )

Evaporare sub vid ( la sec )

Rezidiul + 5 ml metanol

Evaporare sub vid ( la sec) + acetonitril

Analiza cromatografica

B. 2. Metoda de separare prin HPLC

Extractele obţinute din prelucrarea probelor de vin sunt injectateîn coloană .

Conditii de lucru : - Coloana Nucleosil-C18 250 mm x 4,6 mm ; debit 1 ml/minut - Elutie: Sistem gradient = 2 solventi : A – apa B - apa acetonitril H 2O / CH3 CN2:8 (v/v) Volumul injectat : 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoareleavantaje: - este o metodă rapidă pentru separarea, identificarea şi determinareacantitativă a compuşilor aflaţi în amestecuri complexe; - dă posibilitatea separării substanţelor aflate în concentraţii foartemici în amestecurile de analizat; - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelorobţinute;

HPLC: Calibrare Standard

Figura 1. Trans-resveratrol standard . Serii diferite de dilutie: 20 ug/mL (rosu), 10ug/mL (violet), 5ug/mL (albastru), 2.5ug/mL (verde). ( curba de calibrare).

Figura 2. Cromatrograma HPLC pentru trans-resveratrol standard

HPLC: Extractia vinului rosu

Figura 3. Extractie vin rosu. A)Cromatograma extract vin rosu;tipurile de vin evidentiate sunt: Merlot din Australia (rosu),Shiraz din Australia (verde), Primitivo din S. Italy (violet). Cu liniepunctata albastra este trans-resveratrol standard . B)Zoomed-inview of the resveratrol peak region.

HPLC: Extractia vinului alb

Figure 4. Extravtie vin alb. A)Cromatograma extract vin alb;tipurile de vin sunt Sauvignon Blanc din France (rosu) siChardonnay din N. California (violet). Cu linie punctata albastraeste trans-resveratrol standard . B)Zoomed-in view of theresveratrol peak region.

Figura 5. Concentratia Resveratrolului calculata cu ajutorulcromatogramele de mai sus şi curba de etalonare. Eşantioanele de

vin rosu sunt reprezentate în roşu, cele pentru vinul alb îngalben. In proba de Chardonnay nu s-a detectat Trans -Resveratrol.

• Rezultatele arată clar că vinurile roşii conţin trans-resveratrol în cantităţi semnificative, în timp ce vinuri albecontin cantitati foarte mici.

Bibliografie:

..http://www.univagro-iasi.ro/Horti/Lucr_St_2005/63_heroiu%20g.pdf..http://2008.igem.org/Team:Rice_University/RESULTS#A._Genetic_Engineering_and_Part_Construction.. http://en.wikipedia.org/wiki/Resveratrol..http://www.doiserbia.nbs.bg.ac.yu/img/doi/0352-5139/2008/0352-51390811027D.pdf