ALTA TASA DE PRODUCCIÓN DE ACIDO LÁCTICO POR LACTOBACILLUS

RHAMNOSUS EN UN BIORRECTOR DE DOS ETAPAS DE LA MEMBRANA

CELULAR DE RECICLAJE.

Resumen

Es importante para producir ácido láctico L (+) al costo más bajo posible para que el ácido

láctico se convertierta en un material monómero candidato para el prometedor ácido

poliláctico biodegradable. En un esfuerzo para desarrollar un biorreactor de alta velocidad

que proporciona una alta productividad, junto con una alta concentración de ácido láctico,

el rendimiento de la membrana celular de reciclaje biorreactor (MCRB) se investigó

mediante estudios experimentales y optimización de la simulación.

Debido al gran aumento de la densidad celular, la alta productividad de ácido láctico, se

obtuvo 21,6 g L-1 h-1 en el reactor. La concentración de ácido láctico, sin embargo, podría

no ser incrementada hasta 83 g / L. Cuando un reactor adicional continuo de tanque agitado

(CSTR) se une al lado de la MCRB una concentración de ácido láctico mayor de 87 g / L

fue producido en un gasto significativo de la productividad.

Cuando los dos MCRBs se conectaron en serie, 92 g / L de ácido láctico se podría producir

con una productividad de 57 g L-1 h-1, la productividad más alta entre los informes de L

(+)-ácido láctico que obtuvo la concentración de ácido láctico superior a 85 g / L de usando

sustrato glucosa. Además, la investigación de la cinética de la fermentación del ácido

láctico como resultado un modelo de éxito que representa las características de la

fermentación del ácido láctico por Lactobacillus rhamnosus.

El modelo se encontró que era aplicable a la mayoría de los datos existentes con MCRBs y

estaba en buen acuerdo con el modelo de producto-inhibición de Levenspiel, y la ecuación

Luedeking-Piret para la cinética de formación de producto parecía ser eficaz en la

representación de la cinética de fermentación. Hubo una diferencia distintiva en el potencial

de producción de células (células de parámetros relacionados con la densidad en la

ecuación Luedeking-Piret) como el ácido láctico aumenta la concentración de más de 55 g /

L, y este hallazgo condujo a una estimación más precisa del rendimiento del biorreactor.

Introducción

La eficiencia de la membrana celular-de reciclaje biorreactor (MCRB) se demostró con

éxito en un número de estudios anteriores de la alta productividad volumétrica de ácido

láctica. Con gran aumento de la densidad de los biocatalizadores, es decir, las células

microbianas, la productividad volumétrica de ácido láctico podría ir hasta 160 g L-1 h-1

como se informa en el estudio de Ohleyer et al. (1985), que es más de 20 veces mayor que

la de los procesos por lotes y quimiostatos convencionales.

Sin embargo, la alta productividad no es el único requisito para la viabilidad económica del

proceso. Timmer y Kromkamp (1994) encontraron que el proceso podría ser influenciado

principalmente por la capacidad de producción y la concentración del producto, y en menor

medida por la productividad volumétrica cuando la capacidad anual de la producción de

ácido láctico se elevó hasta un máximo de 4.540 toneladas métricas. En caso de que la

concentración de ácido láctico es significativamente baja, el coste de la energía para la

eliminación de agua en el proceso aguas abajo compensa los beneficios de la mayor

productividad.

Desde este punto, MCRB tiene un problema importante que debe abordarse: Las

concentraciones de ácido láctico son significativamente bajos en comparación con los

procesos por lotes, donde la concentración de ácido láctico por encima de 120 g / L es

fácilmente alcanzable. A excepción de un informe que muestra 117 g / L D(-)-ácido láctico

con una productividad volumétrica de 84 g L-1 h-1 (Mehaia y Cheryan, 1987), todas las

demás operaciones MCRB dio lugar a concentraciones de ácido láctico de menos de 90 g /

L y, por otra parte, la mayoría de ellos tenían concentraciones inferiores a 60 g / L

(Cheryan, 1998; Litchfield, 1996;. Ohleyer et al, 1985). Los microorganismos no pueden

crecer por encima de un cierto rango de concentración de ácido láctico y los MCRBs se

ejecuten bajo de manera continua con sangrado continuo de las células para evitar la

pérdida de fluidez que se produce cuando la concentración de células va demasiado alto.

Por lo tanto, para mejorar la ventaja económica del proceso MCRB, se requieren métodos

que aumentan la concentración de ácido láctico junto con la densidad de células alta.

Algunos autores, que consideran este problema persistente de la concentración baja de

productos, realizaron estudios para obtener la concentración de ácido láctico mayor en

MCRB. Xavier et al. (1995) informaron una concentración de ácido láctico de 90 g / L con

una productividad de 36 g L-1 h-1, mientras que Tejayadi y Cheryan (1995) lograron 89 g /

L y 22 g L-1 h-1 de ácido láctico concentation y la productividad, respectivamente.

Un enfoque típico para superar el problema mencionado anteriormente, una concentración

baja del producto debido a la inhibición del producto severa, es el uso de un reactor de flujo

de pistón, que puede ser aproximada por varios receptores de tanque agitado continuo

(CSTR) en serie (de Gooijer et al, 1996;. Keller y Gerhardt, 1975; Luedeking y Piret,

1959b; Levenspiel, 1984). Las ventajas de los CSTR en serie contra un único CSTR

especialmente en la producción de ácido láctico fueron reveladas por otros en dos y tres

CSTR de la etapa (Aeschlimann et al, 1990;.. Bruno-Ba'rcena et al, 1999;. Mulligan et al,

1991): aumento de la productividad y la concentración de ácido láctico a través de la

separación en parte el crecimiento celular y las fases de producción de ácido láctico;

aumento de rendimiento de ácido láctico a expensas de la formación de la biomasa en una

etapa posterior; alta pureza del isómero de ácido láctico, L (+)-ácido láctico a través de

aumento de la población de células frescas; y el uso de un nutriente costoso, extracto de

levadura reducida.

En un esfuerzo para combinar la ventaja de tanto el biorreactor configuraciones –MCRB y

multi-etapas biorreactor- Kulozik y col. (1992) investigaron el rendimiento de un reactor de

cascada de siete etapas-con reciclado celular. Las células en el flujo de salida del último

reactor se concentraron cinco veces por un microfiltro y se reciclan de nuevo al primer

reactor. En comparación con un MCRB de una sola etapa, el reactor de cascada mostró 4

veces mayor productividad, 28 g L-1 h-1, con la utilización completa de 100 g / L de

lactosa, en el que se mantuvieron las concentraciones de células en 20 g / L y las

concentraciones de ácido láctico eran alrededor de 72 g / L.

En este estudio, el rendimiento de una nueva configuración de biorreactor, dos MCRBs en

serie, se investigó el objetivo de la más alta productividad volumétrica jamás obtenida,

junto con la concentración de ácido láctico lo más alto posible. Por otra parte, se llevó a

cabo un estudio de simulación para estimar el límite de potencia de MCRB con un modelo

cinético no estructurado, que está validado por los resultados del experimento.

Materiales y métodos

Microorganismo y condiciones de cultivo

Lactobacillus rhamnosus (ATCC 10863), un homofermentativo obligatoria anaeróbica

productora de L(+)-ácido láctico, se obtuvo de American Type Culture Collection

(Rockville, MD). Cultivos madre de Un mL se almacenaron a -76 ° C en lactobacilos

medio MRS (Difco, Detroit, MI) con 25% (v / v) de glicerol. Precultivos se prepararon

mediante la transferencia de un cultivo madre a 200 ml de medio MRS y se incubaron a 42

° C durante 12 h y se transfieren al cultivo principal. La temperatura de cultivo fue 42 ° C y

el pH del cultivo se controló a 6,0 con agua amoniacal (ca. 8 N). Para las operaciones McrB

el medio basal tenía los siguientes componentes por litro: 0,2 g Na3-Citrato 2H2O, 1,0 g de

KH2PO4, 0,2 g de MgSO4 7H2O, 0,03 g MnSO4 H2O, 0,03 g FeSO4 7H2O, y 0,015 ml

de ácido sulfúrico. Las concentraciones de glucosa y extracto de levadura se describen en la

sección Resultados.

Todos los componentes de los medios se esterilizaron a calor juntos a 121 ° C durante 100

min a excepción de extracto de levadura que se esterilizó por separado durante 15 min. El

volumen de cultivo se indica en los resultados incluye el volumen de caldo en la corriente

de reciclo.

Métodos analíticos

El crecimiento celular se midió mediante un espectrofotómetro (Pharmacia Ultrospec 3000,

Cambridge, Reino Unido) a una longitud de onda de 620 nm. Concentración de células en

seco se calcula a partir de la densidad óptica (DO620) con un factor de correlación lineal

(uno OD62040.32 g de peso celular seco por litro). Las concentraciones de ácido láctico y

la glucosa se determinaron mediante una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

equipado con un detector de índice de refracción (Hitachi L-6000, Tokio, Japón). Una

columna de HPLC (87H Aminex, Bio-Rad, Richmond, CA) fue usado con 0,005 M de

ácido sulfúrico como la fase móvil a una velocidad de elución de 0,6 ml / min mientras que

la temperatura de la columna se mantuvo a 50 ° C. Los estándares de concentración de 1,0

M de ácido láctico (Fluka, Buchs, Suiza) y 10 g / L de glucosa (Sigma, St. Louis, MO) se

utilizaron para el análisis por HPLC.

Biorreactor de membrana celular reciclada (MCBR)

En los experimentos de un MCRB de una sola etapa, se empleó un reactor de vidrio con

camisa de agua de 400 ml, que estaba equipado con una unidad de filtración de fibra hueca

UFP-100-H-4X2TCA (100 K de NMWC, 0.065 m2 de superficie de filtración; Un / G

Technology Corporation, MA). Una bomba peristáltica, 07090-40 (Cole-Parmer, IL) fue

utilizado para hacer circular el caldo de cultivo a través de la unidad de membrana con un

caudal de aprox. 100 ml / min. Para las dos operaciones de la etapa, dos MCRBs idénticas

fueron conectados en serie. Cada MCRB consistía en un reactor de 1 L de vidrio unida con

una placa y bastidor de la unidad de filtración, Pellicon 2 BIOMAX 100V (100 K de

NMWC, 0,1 m2 de superficie de filtración, Millipore, Bedford, MA), y una bomba de

diafragma, P-07090-40 (Cole-Parmer) para el reciclado celular con un caudal de aprox. 600

ml / min. El MCRB se esterilizó con 50% (v / v) de etanol y se lavó a fondo con agua

estéril antes de la inoculación.

En funcionamiento, un medio fresco se alimentó continuamente en el reactor mientras

permeado del filtro se bombea simultáneamente. Para evitar que la densidad celular para

que no pasen de un cierto límite, lo que provoca la pérdida de funcionalidad de filtro,

pequeñas cantidades de caldo de cultivo se extrajeron continuamente del reactor (flujo de

purga). En la operación de dos etapas, se alimenta el flujo de sangrar y permeado de la

primera reactor junto a la segunda.

Métodos numéricos

La regresión de mínimos cuadrados se utilizó para estimar los parámetros de la cinética de

fermentación. La integración numérica para encontrar valores en estado estacionario y

optimización multivariable obligados a encontrar las variables de operación óptimos se

realizaron con la ayuda de un paquete de software, Matlab 5.0 (The Mathworks, Inc.,

EE.UU.). Las limitaciones utilizadas en la optimización fueron la densidad celular máxima

(Xm) y la concentración de glucosa restante máximo (S).

MODELAMIENTO

Balance general de masa en un MCRB

Un diagrama esquemático de un sistema de biorreactor de células de reciclaje se muestra en

la Figura 1.

Las ecuaciones de velocidad para las concentraciones de células (X), el producto (P), y

sustrato (S) pueden ser construidos como:

( ) (1)

( ) (2)

( ) (3)

Donde θ se calcula incorporando una constante de titulación, γ, que depende de la

composición y la concentración de la solución de base en un supuesto de que la caída del

pH en el reactor se ve afectado solamente por la formación de ácido láctico:

(4)

O

(5)

Y, γ se pudo determinar por experimento. En este trabajo, se utilizó 8 N agua amoniacal

para el control de pH y g resultó ser 8,4 × 10-4 (litros de agua amoniacal consumida) por

(ácido gram-láctico producido).

Cinética de crecimiento celular

Para tener en cuenta la inhibición por el ácido láctico sobre el crecimiento celular, se utilizó

el modelo de la Levenspiel con la ecuación de Monod (Levenspiel, 1980):

(

)

(6)

Donde el valor KS de la cepa para la glucosa se da previamente como 0,3 g de glucosa / L

por Wang et al. (1995). La potencia tóxica (c), la tasa máxima de crecimiento específico

( ), y la mayor concentración de ácido láctico en donde podría ocurrir el crecimiento

celular (Pm) se calcula a partir de un conjunto de cultivos continuos con 180 g / L de

glucosa y 15 g / L de levadura extraer tal como se presenta en la Figura 2a. En el

experimento, ya que la concentración de glucosa se mantuvo a un nivel suficientemente

alto, por encima de 87 g / L, la cinética de Monod plazo podría ser descuidado en el cálculo

según lo revelado anteriormente por Keller y Gerhardt (1975) y Levenspiel (1980).

Figura 2. Estimación de los parámetros del modelo en el crecimiento celular y la cinética de

formación de ácido láctico a partir de un conjunto de cultivos quimiostato con corriente de

alimentación que contiene 180 g / L de glucosa y 15 g / L de extracto de levadura. En una

parcela, las constantes, , Pm, y c en la ecuación (6) se obtuvieron por regresión de

mínimos cuadrados de la concentración de ácido láctico (línea continua). En parcela B, la

correlación de la tasa de producción de ácido láctico específico y la tasa de crecimiento

específico, la ecuación (7), se obtuvo. Las pendientes de las dos líneas rectas en el diagrama

b se aproximan como 6.6 g / g, mientras que las dos intercepciones fueron 0,1 y 0,38 g.g-1

h-1, respectivamente.

Formación de ácido láctico

Para la tasa de formación de producto, la ecuación Luedeking-Piret, lo que explica el uso de

la tasa de crecimiento y la concentración de las células, se empleó aquí (Luedeking y Piret,

1959a)

(7)

(8)

Donde el parámetro del producto formado asociado al crecimiento (a), y la densidad celular

relacionados con los parámetros (b) se puede encontrar en el experimento anterior (ver fig.

2b). La correlación lineal entre la tasa de crecimiento específico, μ, y la tasa de producción

específica, v, mostró dos líneas rectas paralelas. Las pendientes de las líneas eran igual a

6,6 g / g, mientras que las interceptaciones son 0,38 y 0,1 g.g-1 h-1 en el rango de

concentración de ácido láctico de bajo y alto, respectivamente. De esta figura, a fue

determinada por la pendiente y b se puede aproximar como una función de dos niveles de

concentración de ácido láctico:

(

) (9)

El consumo de glucosa

La tasa de consumo de glucosa por el crecimiento celular y la producción de ácido láctico

fue simplemente establecida como:

(10)

Dónde ambos coeficientes de rendimiento se establecen como constantes 1,0 g/g.

Todos los valores de los parámetros utilizados en este modelado se comparan en la Tabla I

con los de otras investigaciones y fueron significativamente diferentes en los valores de

Pm, Yx/s y Yp/s. La concentración máxima de ácido láctico en que se puede producir el

crecimiento celular (Pm) tuvo el valor más alto de 114 g/L entre los valores reportados,

todos por debajo de 81 g/L. Esto puede explicarse por la naturaleza de los modelos

cinéticos sencillos: los valores son significativos no en las condiciones extremas, pero si en

el rango de interés. Por encima de la concentración de ácido láctico de 77,7 g/L la

corrección del modelo no puede ser garantizada. El límite realista de la concentración de

ácido láctico se puede obtener en el biorreactor continuo se discutirá más adelante.

Las diferencias significativas en los coeficientes de rendimiento, Yx/s y Yp/s, se deben a

que no se basan en el consumo total de glucosa, sino en las cantidades de consumo celular y

el ácido láctico, por separado.

Además, en contraste con los datos de los otros, el valor de b se expresó como una función

dependiendo de la concentración de ácido láctico.

Entre los factores que afectan el modelo cinético y sus parámetros, la concentración de

extracto de levadura no debe pasarse por alto, ya que el uso de extracto de levadura se

conoce generalmente como esencial para una alta productividad de ácido láctico debido a la

naturaleza exigente de bacterias de ácido láctico. Esto sin duda es un factor crítico que da

los diferentes resultados dentro de cada estudio que se enumeran en la tabla, en la que se

utilizaron diferentes concentraciones de extracto de levadura de 4 g/L a 30 g/L.

Desde un punto de vista económico, sin embargo, el uso de extracto de levadura debe

reducirse al mínimo en el proceso de ácido láctico, ya que supone un coste alto problema-

medios de comunicación. Nosotros, los autores informaron una posibilidad de sustitución

de extracto de levadura en el medio de cultivo con una fuente de nutrientes renovable.

Nosotros, los autores informamos una posibilidad de sustitución de extracto de levadura en

el medio de cultivo con una fuente de nutrientes renovable, hidrolizado de soja con la

administración de suplementos de vitaminas mínima (Kwon et al., 2000). Sin embargo, las

preocupaciones sobre efecto nutricional no están dentro del alcance de este estudio.

Un perfil de lotes de fermentación con 148 g/L de glucosa y 15 g/L de extracto de levadura

obtenida en un experimento preliminar se comparó con el resultado de la simulación en la

figura 3. La concentración celular inicial en la simulación se ajustó para acomodar el

período de retraso, que muestra que desarrollaron el modelo y los parámetros se

establecieron con éxito.

Resultados.

Tabla I. Parámetros del modelo en comparación con otros "para la fermentación del ácido

láctico

Figura 3. Comparación de modelo de simulación con el resultado de lote de cultivo con

extracto de 15 g/L de levadura y 148 g/L de glucosa. Las líneas representan la simulación

de resultados, y los puntos son los datos experimentales.

Experimento preliminar Con MCRB.

Los resultados de las dos corridas por MCRB con 180 g/L de glucosa y extracto de

levadura 15 g/L se muestran en la Figura 4, en la que los volúmenes de trabajo se ajustaron

a 260 ml. En el experimento I, se obtuvo una productividad de 35,5 g , y 33 g

en el experimento II. Con la reducción en la concentración de células B en el

experimento II se mantuvo mucho más alto que el experimento I, pero la concentración de

ácido láctico no podía ser aumentada de manera significativa, como se indica en la figura.

Las concentraciones de ácido láctico en los dos experimentos fueron casi los mismos, 51

g/L. Se reconoció que el estudio de simulación es necesario para facilitar el procedimiento

y tener condiciones óptimas de operación para cada actuación de destino.

En la Figura 5, otro resultado de la fermentación con 105 g/L de glucosa se muestra, que

fue operado a los valores óptimos cerca de D y B desde el estudio de simulación, para tener

un ácido láctico 90 g/L junto con una productividad más alta. Si bien la célula y la

concentración de glucosa restante se mantuvieron alrededor de 120 g/L y 4 g/L,

respectivamente, de ácido láctico 83 g/L se podría producir con una productividad de 21,6 g

.

Figura 4, carreras continuas de una sola etapa MCRB: ácido láctico; glucosa, y célula seca.

Los símbolos abiertos representan los datos de la operación con los valores de D y B, 0,69

h-1 y 0,079, respectivamente (Experimento I), mientras que los símbolos cerrados son con

0,66 h-1 y 0.042 de D y B, respectivamente (el experimento II).

Figura 5. MCRB operación para encontrar la posible concentración de ácido láctico con una

alta productividad con valores óptimos cerca de D (= 0,26 ) y B (= 0,033) en el período

indicado con una flecha.

El aumento de la concentración de ácido láctico superior a 83 g/L con un solo MCRB no se

logró por cualquier intento en este estudio. Cuando un CSTR de mayor volumen se adjunta

al lado de la MCRB, el aumento de la conversión obtenida es de 180 g/L de glucosa y

extracto de 15 g/L de levadura (Fig. 6).

La concentración de ácido láctico de 87 g/L, se obtuvo con una productividad de 7 g L-1 h-

1. Los volúmenes de cultivo de la MCRB y CSTR eran 200 ml y 1,8 L, respectivamente, y

B al MCRB era 0.091. Los caudales de agua amoniacal y la salida del reactor fueron de 12

ml/h y 160 ml/h, respectivamente.

La tasa de crecimiento específico de las células en el primer reactor fue de 0,073 h-1,

mientras que no hay crecimiento en el segundo reactor. Sin embargo, se mantuvo la

formación de ácido láctico en el segundo reactor. Se suponía que si MCRB adicional tomó

el lugar del CSTR, mucha mayor productividad volumétrica (> 35 g L-1 h-1) y

concentración de ácido láctico más alto (> 87 g/L) se obtendrían como se confirma en los

próximos experimentos.

Figura 6 Ciclo continuo del biorreactor de dos etapas con células de reciclaje en la primera

etapa: ácido láctico, glucosa y célulaseca. Los símbolos abiertos representan

concentraciones en el primer reactor (MCRB), y los símbolos cerrados son de la segunda

(CSTR).

Simulación de MCRB (solo)

Para un rendimiento óptimo de la MCRB es necesario operar a los valores óptimos de las

variables de operación, D y B. Utilizando el modelo desarrollado, se examinó la influencia

de las condiciones de operación en el rendimiento del reactor. Como se mencionó

anteriormente, la principal ventaja de MCRB radica en el aumento de la densidad de

biocatalizador es decir, es preferible mantener la concentración celular tan alta como sea

posible. El efecto de la concentración de células en el rendimiento del reactor se estimó en

cada condición óptima para tener concentraciones de ácido láctico objetivo como se

muestra en la Figura 7a. En el cálculo, las concentraciones de glucosa en corrientes de

alimentación se ajustaron para permanecer en 1 g/L de glucosa en el flujo de salida del

reactor. Por esta manipulación, el rendimiento afectado por la glucosa restante puede

dejarse de lado y sólo se expresó el efecto de Xm. Como se ilustra en la figura se pudo

confirmar que, con la condición de funcionamiento adecuado de la productividad del

reactor aumenta proporcionalmente con la densidad celular. Sin embargo, la concentración

máxima permisible de células parece estar limitado en torno a 140 g-peso seco por litro

porque la mayoría de las células microbianas consisten de aproximadamente 80% de agua.

Por encima de esta concentración el funcionamiento estable del reactor no era posible con

el aparato empleado en este estudio.

Figura 7. Trazas de una muestra del efecto de Xm sobre el desempeño de MCRB en las

condiciones operativas óptimas para la máxima productividad. Las concentraciones de

glucosa en la corriente de alimentación se ajustaron para tener un nivel de glucosa restante

de 1 g / L a las condiciones óptimas. Parcela B muestra el efecto de la glucosa restante en el

rendimiento de MCRB en Xm de 140 g / L. Las concentraciones de glucosa en la corriente

de alimentación se ajustaron para tener cada concentración restante de glucosa de 0,5, 1,0,

1,5, 2,0, 2,5, y 5,0 g / L. La flecha indica el aumento de la concentración de la glucosa

restante.

Figura 8. Optimización Simulación de MCRB solo con la restricción de Xm (140 g / l) en

comparación con los datos experimentales de los demás. Las concentraciones de glucosa en

la corriente de alimentación se ajustaron para tener la concentracion de glucosa restante de

1,0 g / L. Las líneas son resultado de la simulación con tres tipos de parámetro b en la

ecuación (7): línea continua, b es la ecuación (9); línea discontinua, b= 0,1 g g-1 h-1; la

línea de puntos, b= 0,38 g g-1 h-1, y los puntos son datos de otros experimentos. En la

grafica B, los datos utilizados en la trama un fueron modificados para comparar a la misma

concentración de células (140 g / L), por ejemplo, si un valor de la productividad en una

parcela se obtuvo a 100 celular g / L, que se multiplicó por 1.4 (140/100) en la parcela b.

De este resultado todas las siguientes simulaciones se llevaron a cabo con la restricción

física de Xm (<140 g/L). También es un requisito para tener la concentración de glucosa en

la salida del reactor (S) tan bajo como sea posible porque la glucosa restante significa una

pérdida en la fuente de carbono y, además, glucosa obstaculiza la eficiencia del proceso de

purificación posterior. Sin embargo, el agotamiento de la glucosa restringe el rendimiento

del reactor como se puede apreciar en la ecuación (6). El efecto de la glucosa restante se

comparó en la Figura 7b. Como restante de glucosa disminuye cerca de KS (40,3 g / L), el

rendimiento del reactor disminuye rápidamente, pero esta tendencia disminuyó

aparentemente cuando aumenta la concentración de ácido láctico o cuando la glucosa

restante era mayor que 1,0 g / L.

Validación del Modelo

Los resultados de los estudios de simulación actuales y los experimentos se presentan en la

Figura 8 junto con los informes anteriores que tratan con un MCRB de una sola etapa en

diversas condiciones de funcionamiento. Parece que el modelo muestra estimaciones razonables de un rendimiento óptimo del reactor junto con una concentración deseada de ácido láctico. La mayoría de los informes anteriores tenían una menor productividad que la optimización de resultados de la simulación (los puntos de datos son parte inferior de línea continua en. Fig. 8a).

También esto fracaso teniendo concentraciones de ácido láctico por encima de 60 g / L y esto se puede explicar con la caída abrupta de la óptima productividad cuando el aumento de la concentración de ácido láctico es más de 55 g / L. Si las concentraciones de células en los informes podrían ser aumentadas a 140 g / L, los rendimientos aumentarían como se muestra en la Figura 8b. Aproximadamente la mitad de los datos reportados por Ohleyer y col (1985). Mostraron mayores productividades que la simulación; esto es debido a una mayor concentración del extracto de levadura extracto utilizado y también, los datos fueron tomados cuando la concentración de glucosa estaba por encima de 7 g/L. Es de destacar que sólo había cuatro resultados que obtuvieron la concentración de ácido láctico por encima de 85 g / L con mayores productividades que la simulación, que podrían ser más o menos justificada de la diferencia en las cepas empleadas (L. bulgaricus: (triangulo negro), y Mehaia Cheryan, 1987; J, Tejayadi y Cheryan, 1995) , los datos fueron tomados antes del estado continuo (90 h Tiempo de operación:, ( triangulo contrario blanco)Xavier et al., 1995). En la Figura 9a los perfiles óptimos de D y B se muestran. La curva de la disminución en la figura b muestra una productividad óptima obtenible con las variables de operación en un solo MCRB. Como el rendimiento de varias etapas CSTR puede ser calculado a partir de la figura recíproca de la productividad frente a (vs) Concentración de producto. Para la producción de ácido láctico 90 g/L, las estimaciones de rendimiento de dos etapas y tres etapas de MCRB etapa se representan en lafigura B y C. Mientras que la máxima productividad en un solo MCRB fue de 21,9 g L-1 h-1; 2,04 veces (44,7 g L-1 h-1) y 2,76 veces (60,4 g L-1 h-1) productividades más elevadas se estimaron en el de dos etapas y de tres etapas MCRB, respectivamente. Simulación de dos etapas en un biorreactor con MCRB

En la figura 10, hay tres tipos diferentes de dos etapas biorreactor con reciclaje celular:

tipo A (dos MCRBs conectados en serie); tipo B (el primer reactor es MCRB y

posteriormente un CSTR ), y el tipo C (de reciclaje celular de la segunda MCRB a la

primera CSTR) fueron investigados con una pequeñas modificaciones en las ecuaciones de

balance de masa que aparecen en la sección de modelado.

En el tipo A, si los volúmenes de cultivo de dos reactores cambian, D y B en cada reactor

deben ajustarse para tener un rendimiento óptimo, por otra parte, los volúmenes afectan

directamente el rendimiento (Fig. 9). El efecto de la relación de volumen de la

productividad y la concentración de producto pueden ser aproximadas con el método

gráfico. Sin embargo, el cambio óptimo de D y B no pueden estimarse. Para ver los

cambios de operación de variables numéricas se llevó a cabo una simulación. ¿Cuándo un

medio se alimentó con glucosa 110g/L, la óptima relación de volumen, Rv (volumen del

segundo reactor dividido por el total de volumen), fue de 0.82, como se muestra en la

Figura 11, significa que el segundo reactor debe ser 4.6 veces más grande que el primer

reactor. Este resultado es similar a la del método gráfico (0.82 = 1.65/2.01).

En la investigación del tipo B, se encontró que, para la productividad óptima del reactor

(22,4 g L-1 h-1), la proporción del segundo reactor es el volumen total debe ser reducida a

cero (Rv = 0), lo que implica que el tipo B tiene su máxima productividad igual que MCRB

solo (simulación de resultado no se muestra). En el tipo C, una nueva variable de

operación, R, se introdujo para representar el flujo de reciclaje del segundo reactor al

primer reactor con rango de ( gama) 1> R ≥ 0 como el flujo de reciclaje no puede exceder

el flujo de entrada (R <1.0) de el segundo reactor, y si el flujo de reciclaje es cero, la

configuración se convierte en CSTR sujeta con MCRB, en el que no existe flujo de reciclaje

en el CSTR. La productividad del reactor aumentó a su máximo cuando Rv aumentó a 0.76,

después de eso, una disminución de la productividad apareció. La productividad máxima,

29.0 g L-1 h-1, fue mayor que la de un solo MCRB, 22.4 g L-1 h-1 (el resultado de la

simulación no se muestra).

En resumen, el tipo A y C resultaron ser útiles para la obtención de mayor productividad

que solo MCRB, mientras que el tipo B es de ninguna utilidad en el aspecto de la

productividad volumétrica.

Figura 9: Figura 9. Condiciones de

operación para el funcionamiento

óptimo de un solo MCRB y

la estimación de rendimiento de

dos y tres etapas MCRB ,

configuraciones con 105 g / L de

glucosa en el flujo de alimentación

y 140 g / l de Xm .

En trazar unas

condiciones, B y D están operando

y S es restante de la glucosa.

muestra que de dos etapas MCRB

da 2,04 veces mayor productividad

= 4.11/2.01), y muestra que

en tres etapas MCRB da 2,76 veces

mayor la productividad (=

4.11/1.49) que la de un solo MCRB.

Experimento de dos etapas MCRB (Tipo A)

El alto rendimiento de tipo A se confirmó a través de un experimento como se muestra en

la Figura 12. En experimentos preliminares la concentración requerida de extracto de

levadura podría reducirse a 13 g/L (datos no mostrados). Con 110 g/L de glucosa y 13 g/L

de extracto de levadura, se utilizaron dos MCRBs conectados en serie para el

experimento. Cuando la concentración de ácido láctico en el reactor en el flujo de salida

alcanzó 50 g/L, después de aproximadamente 20 horas de la operación puesta en marcha

(no mostrado en la figura), la dilución global tasa se fijó a 0.62 h-1 con las mismas

relaciones de purga para ambos los reactores (= 0.053). Como resultado, las

concentraciones de células se mantuvieron alrededor de 100 g/L y 120 g/L en el primero y

segundo reactor, respectivamente, y 92 g/L de ácido láctico fue producido con una

productividad de 57 g L-1 h-1. Durante la fermentación la concentración de glucosa en la

Figura 10. Tipos de dos etapas MCRB investigados

en este estudio.

Tipo A consta de dos MCRBs conectados en serie.

Tipo B, CSTR se encuentra junto a la MCRB.

En el tipo C, MCRB se adjunta al lado de un CSTR.

corriente de alimentación fue reducida de 105 g/L para tener una concentración de

glucosa restante 3 g/L.

Figura 11 borrosa

DISCUSIÓN

Para aumentar el rendimiento del biorreactor para la producción de ácido láctico, un

sistema de fermentación de ácido láctico continuo junto con la técnica de separación de

células de la membrana (MCRB) que se ha estudiado.

Por gran aumento de la densidad celular en el volumen de la productividad volumétrica

del reactor se podría aumentar más de 10 veces más que el lote convencional y en la

fermentación continúa. Sin embargo, la concentración de ácido láctico producido, un

factor importante para la viabilidad económica, no se podría aumentar más del 95 g/L

más allá del cual el crecimiento celular es inhibido casi completamente. En los

experimentos preliminares con solo MCRB, con bajas concentraciones de ácido láctico

acerca de 51 g/L se obtuvieron incluso cuando se mantuvo la densidad celular mayor que

90 g/L (Fig. 4). Cuando un CSTR con un volumen 9 veces más grande que el MCRB se

adjunta, con la intención que durante un tiempo de reacción más largo para las células en

la MCRB el ácido láctico de flujo de salida, 87 g/L se podría obtener con un gran sacrificio

en la productividad (fig. 6). Se concluyó que a mayor concentración de ácido láctico con

alta productividad podría ser obtenible si el segundo reactor, CSTR, había sido sustituido

por otro MCRB, que compone dos etapas en el biorreactor con células de reciclaje en las

dos etapas. Con los dos MCRBs en serie, 92 g/L de ácido láctico se obtuvieron con alta

productividad de 57 g L-1 h-1 (Fig. 12)

Figura 12. Dos etapas MCRB operando con

110 g/L de glucosa y 13 g /L extracto de

levadura en la corriente de alimentación. Los

símbolos abiertos representan los datos de la

primera MCRB mientras que los símbolos

cerrados son los datos de la segunda. (cb,cn ),

acido láctico; (tb, tn); glucosa (cub, cun),

celula seca. La tasa global de dilución se

mantuvo en 0.62 h-1 y la cantidad de cultivos

de la primera y la segunda MCRBs fueron 500

y 600 mL, respectivamente (Rv= 0.55). La

concentración de glucosa en la alimentación

media se redujo a 105 g/L en 35 h como se

indica.

pila seca

Esto fue demasiado laborioso para encontrar el rendimiento óptimo en cada tipo de la

configuración de los reactores por medio de experimentos. Por lo tanto, los efectos de las

variables de operación, incluyendo la tasa de dilución, (bleed ratio), y la relación de

volumen en el rendimiento del reactor fueron investigados por un estudio de simulación.

Como la producción de ácido láctico está estrictamente relacionada con el crecimiento

celular, el modelo Luedeking- Piret adoptó a una expresión de formación de producto.

Para la cinética de crecimiento celular, entre el modelo cinético previamente reportado,

Levenspiel modelo inhibición encontrado es el de mejor ajuste en los datos chemostat

convencionales (fig. 2a). Durante el procedimiento de la estimación de parámetros en el

modelo de Luedeking Piret por método gráfico en la Figura 2b, se observó una peculiar

propiedad en el parámetro relacionado con la densidad celular (b), que se ha utilizado

como constante. Se encontró que ser una constante de dos niveles, junto con la

concentración de ácido láctico: en el gama (rango) de baja concentración de ácido láctico

b tenía un valor más alto de 0.38 g/g; y b fue de 0.1 g/g en la gama (el rango) de alta

concentración de ácido láctico. Esto se puede explicar desde la producción de ácido

láctico específico en el tipo de las células en reposo, lo que disminuye con el aumento de

la concentración de ácido láctico, es decir con el crecimiento celular bajo. La producción

de la específica de ATP (adenosin trifosfato) puede calcularse directamente a partir de la

producción del tipo específico, debido a que la formación de ácido láctico es

estrechamente correlacionada con la producción de ATP (un mol de ATP por mol de ácido

láctico producido): la celula especifia de ATP genera una tasa( o tipo) (milimoles de ATP

por gramo de células por hora) es V multiplicado por 1000/90 (Nielsen y Villadsen, 1994).

Luego, el valor de dos niveles de b se aproxima como función continua de la concentración

de ácido láctico, la ecuación (9). Por este análisis, el cambio drástico en el rendimiento del

biorreactor continúo para la producción de ácido láctico en alta concentración se observo

en este estudio y otros que podrían ser explicado. Para tener una concentración de ácido

láctico cruzando los rangos crítico (55 g/ L) las condiciones de operación, D y B, se

debieron ajustar bruscamente como se muestra en la Figura 9a. La estimación del

rendimiento individual MCRB utilizando el modelo desarrollado se comparó con los datos

experimentales en la figura 8, que muestra una buena concordancia. En una operación

con MCRB con valores óptimos cercanos de D y B, referidos desde la simulación para la

condición óptima de funcionamiento, una alta concentración de ácido láctico, 83 g/L, con

22 g L-1 h-1 la productividad podría ser obtenida (Fig. 5).

En la Tabla II las más altas productividades obtenidas en los cuatro tipos de biorreactores

con configuración MCRB son enumeradas y comparadas con los resultados

experimentales. Sólo una simulación se llevó a cabo en este estudio para el tipo C.

Los experimentos configurados en dos etapas dio una concentración de ácido láctico

mayor que la concentración sola de MCRB que podría obtenerse, lo que implica que la

configuración de múltiples etapas es útil no sólo para la productividad, sino también para

la conversión. Esto puede ser motivado por la adición continua de células frescas del

primer reactor al segundo. Las células frescas son más activas que esas en el segundo

reactor y contribuyen al aumento de conversión en cierta medida. Este asunto no fue

considerado en el modelo desarrollado en este estudio.

En conclusión, un enfoque sistemático con MCRBs con operación de múltiples etapas

puede llevarse a cabo para predecir resultados óptimos de producción de ácido láctico,

que experimentalmente demostró que dos etapas de MCRBs puede producir ácido láctico

en alta concentración con gran aumento de la productividad volumétrica (tipo A).

NOMENCLATURA

a= constante asociada a crecimiento celular en la ecuación Luedeking-Piret (g / g).

B = bleed ratio.

b= constante asociada a la concentración de celular en la ecuación Luedeking-

Piret (g g-1 h-1).

c = constante de poder toxico en la inhibición de producto del modelo Levenspiel .

Cv = conversión de sustrato (g-glucosa utilizada / g de glucosa-alimentados,%).

D= tasa de dilución (h-1)

F= caudal (L/h)

i = subíndice de entrada.

K= subíndice denota reactor k

Ks= constante de saturación en la ecuación de Monod (g / L)

P= producto, ácido láctico concentración (g/L)

Pm = concentración máxima de ácido láctico por encima del cual el crecimiento

celular es completamente inhibido ( g/L)

Pr= productividad volumétrica de ácido láctico (g L-1 h-1)

R= relación de reciclado

rp, rs, rx = tasa de producto, sustrato, y generación de células, respectivamente

(g L-1 h-1).

R= Relación de reciclado de flujo desde el segundo reactor al primero.

Rv = proporción de volumen del segundo reactor al reactor total

S= sustrato, glucosa, concentración (g / L)

V= volumen de reactor (L)

X= concentración de células (g de peso seco de células / L)

Xm= operación máxima de concentración de células en MCRB (g / L)

Y p/s = rendimiento de células sobre la base del consumo de sustrato (g-seco de

células / g de glucosa)

Y x/s = rendimiento de producto sobre la base del consumo de sustrato (g-láctico

ácido / g de glucosa)

Símbolos griegos.

γ= constante de titulación para el control del pH en el reactor (8,4 × 10-4 L-amoníaco

Agua / g de ácido láctico

µ= tasa de crecimiento específico de células (h-1)

µm = tasa máxima de crecimiento específico de células(h-1)

ν= tasa de producción específica de célula [-g de ácido láctico (g-seca de células)exp -1 h-1]

Ѳ= relación del flujo base de la solución (amoniaco) a la salida del reactor