Laporan Praktikum Hari/ tanggal : Selasa/ 1 Oktober 2013Biokimia Waktu : 13.00-14.40 WIB

PJP : Puspa Julistia Puspita, S. Si, M. Sc.Asisten : Resti Siti Muthmainah, S. Si.

Lusianawati, S. Si.

PROTEIN II

Kelompok 7Ayu Septra Wulandari J3L112029Yaya Nugraha J3L112089Diana Agustini Raharja J3L112168

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIAPROGAM DIPLOMA

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2013

Pendahuluan

Menurut Hart (2003), protein berasal dari kata protos. Protos memiliki arti,

yaitu utama. Protein merupakan senyawa organik kompleks yang memiliki berat

molekul yang tinggi dan merupakan polimer yang terdiri dari monomer-monomer

asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Menurut

Lehninger (1982), struktur umum asam amino mempunyai dua gugus pada tiap

molekulnya, yaitu gugus amino dan gugus karboksil yang digambarkan sebagai

struktur ion dipolar.

Gambar 1 Struktur molekul asam amino (Fessenden dan Fessenden 1986)

Gugus amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifat-sifat

spesifiknya. Karena asam amino mengandung gugus amino dan karboksil,

senyawa ini akan memberikan reaksi kimia yang mencirikan gugus-gugusnya.

Asam amino juga bersifat amfoter. Pada larutan asam atau pH rendah maka asam

amino akan bersifat basa dan sebaliknya (Hawab 2004).

Gambar 2 Asam amino bersifat amfoter dapat berperilaku sebagai asam sekaligus

basa (Hawab 2004)

Protein terbentuk dari beberapa asam amino yang dihubungkan dengan

ikatan peptida. Peptida merupakan oligomer dari asam amino yang memainkan

peran penting dalam banyak proses biologis (Wirahadikusumah 1977).

Gambar 3 Ikatan peptida antar asam amino dalam membentuk protein

(Wirahadikusumah 1977)

Tujuan

Praktikum dilakukan untuk mengidentifikasi sifat dan struktur asam amino

dan protein melalui reaksi uji pengendapan protein oleh logam, pengendapan

protein oleh garam, uji koagulasi, pengendapan protein oleh alkohol, serta

denaturasi protein.

Metode

Bahan-bahan yang digunakan, di antaranya sampel putih telur, HgCl2 2%,

Pb-asetat 5%, AgNO3 5%, kristal (NH4)2SO4, pereaksi Millon, pereaksi Biuret,

asam asetat 1 M, HCL 0,1 M, NaOH 0,1 M, buffer asetat pH 4,7, etanol 95%,

akuades, dan kertas saring . Alat-alat yang digunakan adalah penangas air dan

alat-alat gelas.

Pengendapan protein oleh logam dilakukan dengan cara ke dalam 3 mL

sampel putih telur ditambahkan 5 tetes larutan HgCl2 2%. Percobaan diulangi

dengan menggunakan larutan Pb-asetat 5% dan AgNO3 5%.

Pengendapan protein oleh garam dilakukan dengan cara 10 mL sampel

putih telur dijenuhkan dengan (NH4)2SO4 dengan ditambahkan sedikit demi

sedikit garam tersebut serta diaduk hingga mencapai titik jenuh dan disaring.

Endapan yang terbentuk diuji kelarutannya dalam air dan dengan pereaksi Millon

dan filtrate diuji dengan pereaksi Biuret.

Uji koagulasi dilakukan dengan cara 2 tetes asam asetat 1 M ditambahkan

ke dalam 5 mL sampel putih telur. Tabung diletakkan ke dalam air mendidih

selama 5 menit. Endapan diambil dengan batang pengaduk dan endapan tersebut

diuji kelarutannya dalam air dan pereaski Millon.

Pengendapan protein oleh alkohol dilakukan dengan cara 3 tabung reaksi

disiapkan. Tabung pertama dimasukkan 2,5 mL sampel putih telur, 0,5 mL HCl

0,1 M, dan 3 mL etanol 95%. Tabung kedua dimasukkan 2,5 mL sampel putih

telur, 0,5 mL NaOH 0,1 M, dan 3 mL etanol 95%. Tabung ketiga dimasukkan 2,5

mL sampel putih telur, 0,5 mL buffer asetat pH 4,7, dan 3 mL etanol 95%.

Kemudian kelarutan sampel putih telur diamati pada tiap tabung.

Denaturasi protein dilakukan dengan cara 3 tabung reaksi disiapkan.

Tabung pertama dimasukkan 4,5 mL sampel putih telur dan 0,5 mL HCl 0,1 M.

Tabung kedua dimasukkan 4,5 mL sampel putih telur dan 0,5 mL NaOH 0,1 M.

Tabung ketiga dimasukkan 4,5 mL sampel putih telur dan 0,5 mL buffer asetat pH

4,7. Ketiga tabung ditempatkan dalam air mendidih selama 15 menit dan

didinginkan pada temperatur kamar. Untuk tabung pertama dan kedua

ditambahkan 5 mL buffer asetat pH 4,7.

Hasil dan Pembahasan

Denaturasi protein merupakan suatu keadaan telah terjadinya perubahan

struktur protein yang mencakup perubahan bentuk dan lipatan molekul, tanpa

menyebabkan pemutusan atau kerusakan lipatan antar asam amino dan struktur

primer protein. Sedangkan koagulasi adalah denaturasi protein akibat akibat panas

dan alkohol. Baik denaturasi maupun koagulasi ini mengalami suatu perubahan

atau modifikasi terhadap struktur sekunder, tersier, maupun kuartener molekul

protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan kovalen.

Kelarutan protein sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu pH, suhu,

kekuatan ionik, dan tetapan dielektrik pelarutnya. Berbagai cara fisik dan kimia

dapat merusak bentuk trimatra dari protein, yang menyebabkan berkurangnya

daya larut protein dan sering kali mengendap. Peristiwa ini disebut denaturasi.

Penyebab denaturasi meliputi pemanasan, penambahan asam atau basa,

penambahan pelarut organik atau zat terlarut tertentu, pengocokan yang kuat, atau

penyinaran dengan cahaya ultraviolet. Jika kerusakan hanya terjadi pada ikatan

lemah, denaturasi bersifat dapat balik (reversible), tetapi jika merusak ikatan

kovalen, ia menjadi tidak dapat balik (irreversible). Denaturasi akan

menghilangkan aktivitas hayati dari protein, tetapi tidak menghilangkan nutrisi

protein, bahkan mungkin bertambah.

Tabel 1 Hasil uji pengendapan oleh logam

Logam berat Hasil pengamatan Perubahan warna larutanHgCl2 + Putih keruhPb-asetat +++ Putih keruhAgNO3 ++ Putih keruh

Keterangan: pada hasil pengamatan semakin banyak +, endapan yang terbentuk semakin banyak

Gambar 4 Hasil uji pengendapan albumin dengan logam HgCl2 (a), Pb-asetat (b), dan AgNO3 (c)

Protein dapat mengalami denaturasi irreversible dengan logam-logam berat

seperti Ag, Hg, dan Pb sehingga mudah membentuk endapan logam proteinat,

karena logam dapat bereaksi dengan gugus R yang bermuatan negatif. Selain itu,

logam juga dapat mengendapkan protein dengan cara bereaksi dengan gugus –SH.

Protein mengalami denaturasi karena ikatan yang terbentuk amat kuat dan akan

memutuskan jembatan garam. Oleh karena itu, logam berat sangat berbahaya jika

sampai termakan karena garam logam tersebut akan mendenaturasi sekaligus

mengendapkan protein sel-sel tubuh.

Dari praktikum ini diperoleh bahwa semua larutan dan bahan uji

mengendap. Hal ini karena protein mengalami presipitasi bila bereaksi dengan ion

logam. Pengendapan oleh ion positif (logam) diperlukan pH larutan di atas pI,

karena protein bermuatan negatif dan begitu sebaliknya (Poedjadi 1994). Fungsi

dari uji ini adalah untuk mengetahui pengaruh logam berat terhadap kelarutan

protein.

Tabel 2 Hasil uji pengendapan oleh garam

Uji Hasil pengamatan Perubahan warna larutanUji kelarutan + Larut, tidak berwarnaUji Millon - Putih

Uji Biuret - BiruKeterangan: + = menunjukkan hasil positif pada uji tersebut

- = menunjukkan hasil negatif pada uji tersebut

Gambar 5 Hasil uji kelarutan dalam air (a), uji Millon (b), dan uji Biuret pada pengendapan albumin oleh garam

Larutan albumin dalam air dapat diendapkan dengan penambahan

ammonium sulfat hingga jenuh (Poedjiadi 1994). Berdasarkan percobaan, setelah

larutan albumin dijenuhkan dengan (NH4)2SO4, uji kelarutan endapan yang terjadi

dengan air menunjukkan hasil positif yaitu endapan larut membentuk butiran,

karena protein kembali larut dalam air. Kemudian butiran direaksikan dengan

pereaksi Millon dan hasilnya negatif, sedangkan menurut literatur albumin

memberikan hasil positif pada uji Millon, karena tirosin memiliki molekul fenol

pada gugus alkilnya dan albumin mengandung tirosin sebagai salah satu asam

penyusunnya.

Gambar 6 Reaksi yang terjadi pada uji Millon

Uji filtrat dengan pereaksi Biuret juga menunjukkan hasil negatif, karena

filtratetidak lagi mengandung protein tetapi telah jenuh dengan larutan garam.

Dalam praktikum ini digunakan (NH4)2SO4 Hal ini terjadi karena

ammonium sulfat memiliki tingkat kelarutan yang lebih tinggi daripada protein.

Sehingga pada saat penambahan ammonium sulfat, ammounium sulfat akan

melarut dalam air atau pelarutnya dan mendesak protein keluar, kembali dalam

bentuk solidnya, sehingga terbentuklah protein yang terendapkan (Poedjiadi

1994). Proses ini terjadi karena adanya kompetisi antara molekul protein dengan

ion anorganik dalam mengikat air (hidrasi). Salting out yaitu pengendapan protein

dari sampel sedangkan salting in pengendapan protein dari sampel yang endapan

tersebut dapat larut kembali jika ditambahkan pelarut.

Selain metode salting out yang dilakukan pada praktikum, pada prinsipnya

metode salting in dilakukan dengan menambahkan garam yang tidak jenuh atau

pada konsentrasi rendah sehingga protein menjadi bermuatan dan larut dalam

larutan garam. Kelarutan protein akan terus meningkat sejalan dengan

peningkatan konsentrasi garam, apabila konsentrasi garam ditingkatkan terus,

maka kelarutan protein akan turun. Pada konsentrasi garam yang lebih tinggi,

protein akan mengendap. Fungsi dari uji ini adalah untuk mengetahui pengaruh

larutan garam konsentrasi tinggi terhadap sifat kelarutan protein.

Tabel 3 Hasil uji koagulasi

Uji Hasil pengamatan Perubahan warna larutanUji kelarutan - Tidak larut, putihUji Millon - Tidak larut, putihUji Biuret + Ungu

Keterangan: + = menunjukkan hasil positif pada uji tersebut- = menunjukkan hasil negatif pada uji tersebut

Gambar 7 Hasil uji kelarutan dalam air (a), uji Millon (b), dan uji Biuret (c) pada uji koagulasi

Pada percobaan uji koagulasi mengunakan prinsip denaturasi protein dan

titik isolistrik. Denaturasi protein adalah kondisi di mana struktur sekunder,

tersier, maupun kuartener dari suatu protein mengalami modifikasi tanpa ada

pemecahan ikatan peptida. Denaturasi dapat berupa rusaknya struktur tiga dimensi

dari suatu protein. Sedangkan yang dimaksud titik isolistrik adalah suatu keadaan

di mana ion negatif dan ion positif yang ada pada suatu molekul jumlahnya sama

dan mengindikasikan kenetralan. Tingkat keasaman atau pH ketika terjadi

keadaan isolistrik itulah yang disebut sebagai pH isolistrik (pI). Besarnya pI

sebanding dengan pKa larutan protein tersebut.

Untuk uji kelarutan dengan air dan Millon dihasilkan hasil yang

mengindikasikan bahwa protein tersebut memang sudah tidak larut dalam air

kembali dan berwarna putih. Namun seharusnya endapan tersebut larut dan warna

yang ditimbulkan pada uji Millon adalah warna merah yang merupakan indikasi

adanya asam amino tirosin, karena albumin mengandung asam amino tersebut,

maka uji Millon tersebut seharusnya berhasil positif. Pada uji Biuret dihasilkan

hasil yang positif menunjukkan bahwa filtrate tersebut masih mengandung

protein.

Penambahan asam asetat 1 M ke dalam larutan protein menyebabkan ion-

ion H+ dari asam akan terikat pada gugus-gugus yang bermuatan negatif sehingga

terjadi perubahan pengutuban dari molekul protein. Perubahan pengutuban ini

menyebabkan perubahan konfirmasi dari protein atau rusaknya struktur tersier

atau struktur kuartener protein sehingga protein mengalami koagulasi (Fessenden

dan Fessenden 1986). Fungsi dari uji ini adalah untuk mengetahui pengaruh asam

organik terhadap sifat kelarutan protein.

Tabel 4 Hasil uji pengendapan oleh alkohol

Uji Hasil pengamatan Perubahan warna larutanHCl 0,1 M + Tidak larut, putih (++)NaOH 0,1 M - Larut, tidak berwarnaBuffer asetat pH 4,7 + Tidak larut, putih (+++)

Keterangan: pada hasil pengamatan, + menunjukkan hasil positif pada uji tersebut dan – menunjukkan hasil negatif pada uji tersebut sedangkan pada perubahan warna larutan, semakin banyak +, warna larutan semakin pekat

Gambar 8 Hasil uji pengendapan oleh alkohol pada tabung 1 yang ditambahkan HCl (a), tabung 2 yang ditambahkan NaOH (b), dan tabung 3 yang

ditambahkan buffer asetat pH 4,7 (c)

Percobaan berikutnya adalah pengendapan oleh alkohol. Pelarut organik,

seperti alkohol dapat mengganggu kelarutan albumin. Pelarut organik

menyebabkan denaturasi reversible dan sering digunakan untuk isolasi protein

secara pengendapan. Pada uji pengendapan oleh alkohol, hanya tabung 2 yang

mengandung basa yang menunjukkan protein yang larut dalam alkohol, karena pH

pada basa di atas titik isoelektriknya. Pada tabung 1, ujung C asam amino yag

terbuka pada protein dapat bereaksi dengan alkohol dalam suasana asam

membentuk senyawa protein ester. Pembentukan ester ini ditunjukkan oleh

adanya endapan yang terbentuk. Pada percobaan pengendapan oleh alkohol fungsi

dari buffer asetat pH 4,7 adalah untuk mengendapkan protein. Karena protein

sampel yang digunakan adalah albumin yang memiliki kisaran pH isoelektrik

sekitar angka tersebut maka protein akan mengendap. Hal ini terjadi karena pada

titik isoelektriknya, protein mempunyai daya kelarutan minimum

(Wirahadikusumah 1977). Fungsi dari uji ini adalah untuk mengetahui pengaruh

alkohol dalam suasana asam, basa, dan dengan menggunakan buffer pH asam

terhadap protein.

Tabel 5 Hasil uji denaturasi

LarutanHasil pengamatan

Sebelum pemanasan Setelah pemanasan Setelah penambahan

bufferAlbumin+HCl Berwarna putih,

tidak larutBerwarna putih, terdapat gumpalan

Terbentuk 2 fase, yaitu fase atas tidak berwarna dan fase bawah berwarna putih

Albumin+NaOH Tidak berwarna, larut

Tidak berwarna, tidak ada gumpalan

Putih keruh

Albumin+buffer asetat pH 4,7

Terbentuk 2 fase, yaitu fase atas putih keruh (++) dan fase bawah putih keruh (+)

Berwarna putih dan keruh

Tidak dilakukan

Keterangan: pada hasil pengamatan semakin banyak +, kekeruhan yang terbentuk semakin banyak

Gambar 9 Hasil uji denaturasi pada albumin+buffer asetat pH 4,7 (a), albumin+NaOH (b), albumin+HCl (c)

Denaturasi protein adalah berubahnya bentuk dan lipatan molekul protein

tetapi tidak sampai memutuskan ikatan  antar asam amino dalam struktur protein.

Hal itu dikarenakan denaturasi tidak cukup kuat untuk memutuskan ikatan.

Denaturasi terjadi karena adanya gangguan pada struktur sekunder dan tersier

protein. Denaturiasi yang umum ditemui adalah proses presipitasi dan koagulasi

protein.

Berdasarkan percobaan didapatkan bahwa pada tabung yang berisi albumin

dan NaOH tidak mengalami penggumpalan, karena pH di atas 7. Pada tabung I,

penggumpalan terjadi karena buffer tetap mempertahankan pH-nya pada 4,7.

Sehingga diketahui bahwa titik isolistrik albumin yaitu pada pH 4,7 begitu pula

pada asam yang memiliki pH di bawah 7.

Titik isolistrik pada albumin adalah pada pH 4,55-4,90. Titik isolistrik

pada protein mempunyai arti penting karena pada umumnya sifat fisika dan kimia

erat hubungannya dengan pH isolistrik ini. Pada pH di atas titik isolistrik protein

bermuatan negatif, sedangkan di bawah titik isolistrik, protein bermuatan positif

(Poedjiadi 1994). Pada setiap percobaan yang memerlukan pemanasan bertujuan

untuk mempercepat laju reaksi dan juga untuk mendenaturasi protein.

Simpulan

Berdasarkan .hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa pada uji

pengendapan protein oleh logam, logam berat seperti Ag, Hg, dan Pb dapat

mengendapkan protein. Pada uji pengendapan protein oleh garam, endapan

protein dapat larut kembali dalam air dan ketika diberi pereaksi Millon

memberikan hasil yang negatif sedangkan filtrat yang diuji dengan pereaksi Biuret

memberikan hasil yang negatif juga. Pada uji koagulasi, endapan protein tidak

larut dalam air dan memberikan hasil negatif pada pereaksi Millon sedangkan

filtrat yang diuji dengan pereaksi Biuret memberikan hasil positif. Pada uji

pengendapan oleh alkohol dan denaturasi protein, dalam suasana asam dan buffer

pH 4,7, protein mengendap sedangkan pada basa tidak mengendap.

Daftar Pustaka

Fessenden RJ, JS Fessenden. 1986. Kimia Organik. Jilid ke-2. Pudjaatmaka AH, penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Organic Chemistry. Ed. ke-3.

Hart Harold, LE Craine, DJ Hart. 2003. Kimia Organik. Achmadi SS, penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Organic Chemistry. Ed. ke-11.

Hawab HM. 2004. Pengantar Biokimia. Malang: Bayumedia.

Lehninger AL. 1982. Dasar- Dasar Biokimia. Maggy T, penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principle of Biochemistry.

Poedjiadi Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.

Wirahadikusumah M. 1977. Biokimia: Protein, Enzim, dan Asam Nukteat. Bandung: ITB Press.