Laporan Praktikum Nama : Diana Agustini RaharjaMikrobiologi NIM : J3L112168

Kelas/kelompok : C P1/1PJP : M. Arif Mulya, S. Pi.Asisten : 1. Yuriska Sekar Rani

2. Lia Suliani3. Ramdhani

MIKROBIOLOGI AIR

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIAPROGAM DIPLOMA

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2013

PendahuluanAir yang kita gunakan untuk keperluan sehari-hari dapat mengandung

berbagai jenis mikroba (patogen dan nonpatogen) di dalamnya. Seiring dengan berkembangnya industri, penduduk, dan luasnya areal pemukiman, ketersediaan akan air bersih yang layak diminum semakin langka. Salah satu hal yang perlu diperhatikan dalam menilai kelayakan atau kualitas air untuk menjadi air minum adalah jenis bakteri yang terkandung di dalamnya. Pemakaian air sungai sebagai air minum masih aman digunakan asalkan mikroorganisme (bakteri) yang terkandung di dalamnya tidak bersifat patogen (Dwidjoseputro 2003). Suatu bakteri dikatakan patogen jika bakteri tersebut telah membentuk suatu koloni. Koloni didapatkan jika berada pada lingkungan buatan, sedangkan jika berada di alam konsentrasi bakteri patogen cukup rendah dan sulit untuk dideteksi maka dilakukan analisis mikrobiologi untuk mengidentifikasi bakteri patogen dengan uji mikrobiologi air (Fardiaz 1989).

Uji mikrobiologis air dapat dianalisis berdasarkan organisme penunjuk atau indicator organism. Syarat organisme indikator antara lain yaitu terdapat pada air yang tercemar, mempunyai kemampuan bertahan hidup yang lebih besar dibandingkan bakteri patogen, terdapat dalam jumlah lebih banyak dibandingkan bakteri patogen, dan mudah dideteksi dengan teknik laboratorium yang sederhana. Biasanya yang digunakan sebagai indikator yaitu dari jenis Escherichia coli (E. coli) dikarenakan selalu terdapat dalam tinja. Kehadiran E. coli di dalam air perlu diperhatikan karena terkait dengan kehadiran mikroba patogen lain akibat dari sifat E. coli yang biasanya hidup bersama bakteri lainnya seperti Salmonella tipholia, Shigella dysentriae, dan Vibrio cholera. Bakteri patogen tersebut dapat menyebabkan infeksi saluran pencernaan. (Adam 1992).

TujuanPercobaan bertujuan mengidentifikasi tipe mikroorganisme yang ada dalam

beberapa sampel air dan menentukan kelayakan sampel air tersebut dengan menggunakan prosedur standar yang bersifat kualitatif dan kuantitatif.

Alat dan BahanAlat-alat yang digunakan di antaranya pembakar spirtus, rak tabung, pipet

Mohr, mikropipet, bulp, spidol, kawat ose, inkubator, mikroskop, serta kaca preparat. Bahan-bahan yang digunakan di antaranya media lactose broth untuk double strength dan single strength yang berisi tabung durham, media eosin methylene blue agar, kristal ungu, kalium iodida, alkohol 90%, dan safranin.

Prosedur KerjaPercobaan mikrobiologi air dilakukan dengan menggunakan tiga jenis uji di

antaranya uji penduga, uji penguat, dan uji pelengkap. Sampel air yang digunakan ialah air kemasan, air sungai, air kolam ikan, air minum kantin, serta air kloset. Uji penduga dilakukan dengan cara sebanyak 10 mL sampel air dimasukkan ke dalam masing-masing 5 media lactose broth tipe double strength. Media ini telah berisikan tabung Durham dalam posisi terbalik dan dalam kondisi tidak ada gelembung udara yang terperangkap. Sebayak 1 mL sampel air dimasukkan juga ke dalam masing-masing 5 media lactose broth tipe single strength, kemudian percobaan diulangi untuk sampel air sebanyak 0,1 mL ke dalam masing-masing 5

media lactose broth tipe single strength. Media lactose broth yang telah ditambahkan sampel air diinkubai selama 48 jam pada suhu 37°C. Hasil positif pada uji penduga yaitu terbentuknya gelembung gas pada tabung durham.

Uji penguat dilakukan dengan cara sampel hasil uji penduga diinokulasikan pada media eosin methylene blue agar. Media eosin methylene blue agar yang telah diinokulasikan dengan sampel air diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Hasil positif pada uji penguat yaitu terbentuknya warna hijau metalik pada koloni bakteri.

Uji pelengkap dilakukan dengan menggunakan pewarnaan Gram. Biakan bakteri dalam media EMBA diambil dengan kawat ose yang telah disterilkan dengan panas api dan dioleskan pada kaca preparat. Setelah bakteri dioleskan pada kaca preparat, olesan tersebut ditandai dengan spidol di balik permukaan kaca preparatnya. Fiksasi dilakukan dengan cara dikeringudarakan dekat api spirtus. Setelah kering, kristal ungu diteteskan di atas biakan bakteri tersebut hingga rata menutupi area bakteri. Kristal ungu dibiarkan melekat hingga satu menit. Setelah satu menit, kristal ungu yang telah diteteskan dibilas dengan akuades dari bagian samping kaca preparat hingga mengalir dan jangan langsung terkena biakan bakterinya. Kemudian kaca preparat dikeringudarakan kembali, diteteskan dengan kalium iodida hingga menutupi seluruh area biakan bakteri, dan dibiarkan selama satu menit. Setelah satu menit, kalium iodida yang telah diteteskan dibilas dengan menggunakan alkohol 90% dan dikeringudarakan. Safranin diteteskan pada biakan bakteri secara merata dan didiamkan selama satu menit dan setelah satu menit dibilas dengan akuades serta dikeringudarakan. Kaca preparat yang berisi bakteri tersebut diamati di bawah mikroskop. Bakteri bentuk batang yang Gram negatif menunjukkan hasil positif.

Data dan Hasil PengamatanBerikut ini data dan hasil pengamatan yang dilakukan pada beberapa sampel

air.Tabel 1 Hasil uji penduga pada beberapa sampel air

Sampel air

Gas

Terbaca MPN

Tabung LB double

strength 10 mL

Tabung LB single

strength 1 mL

Tabung LB single

strength 0,1 mL

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5Air kemasan - - - - - - - - - - - - - - - 0-0-0 <2Sungai + + + + + - - - - - + + - - + 5-0-3 63Kolam - + + + + + + + + + + + + + + 4-5-5 350Kantin + + + + + + + - - + + - - + + 5-3-3 180Kloset + + - + + + - + + + + + - + + 4-4-4 280

Keterangan: + : membentuk gelembuang gas- : tidak membentuk gelembung gas

Gambar1 Hasil uji penduga pada sampel air kemasan dengan tabung double strength 10 mL

Gambar 2 Hasil uji pada sampel air kemasan dengan tabung single strength 1 mL

Gambar 3 Hasil uji penduga pada sampel air kemasan dengan tabung single

strength 0,1 mL

Tabel 2 Hasil uji penguat pada beberapa sampel airSampel air Koliform Layak

diminumTidak layak

diminumAir kemasan - √Sungai + √Kolam - √Kantin - √Kloset + √

Keterangan: + : membentuk hijau metalik- : tidak membentuk hijau metalik

Gambar 4 Hasil uji penguat pada sampel air kemasan

Tabel 3 Hasil uji pelengkap pada beberapa sampel air

Sampel airPewarnaan Gram Layak

diminumTidak layak

diminumSifat Gram

Morfologi

Air kemasan - - √Sungai Negatif Batang √Kolam - - √Kantin - - √Kloset Negatif Batang √

Keterangan: - : tidak dilakukan uji pelengkap

Gambar 5 Hasil uji pelengkap pada sampel air sungai

PembahasanPerlakuan aseptik dilakukan bertujuan agar  terbebas dari mikroorganisme

yang tidak diinginkan (kontaminan) (Dwijoseputro 2003). Aseptik diimbangi dengan sterilisasi yang merupakan upaya untuk menghilangkan mikroorganisme kontaminan yang menempel pada alat atau bahan yang akan dipergunakan untuk analisis selanjutnya (Jati 2007). Uji penduga, uji penguat, dan uji pelengkap digunakan untuk mendeteksi adanya bateri koliform sebagai indikator kontaminasi asal feses. Bakteri e.coli merupakan salah satu bakteri koliform yang memiliki sifat sebagai bakteri Gram negatif, berbentuk batang, tidak membentuk spora, dapat memfermentasikan laktosa dengan menghasilkan gas yang dapat terdeteksi setelah inkubasi selama 24 atau 48 jam pada suhu 37°C. Suhu 37°C digunakan karena E. coli dapat tumbuh dengan baik atau optimum pada suhu tersebut yang merupakan suhu umum pada tubuh.

Uji penduga merupakan uji yang dilakukan untuk menetapkan bakteri koliform dengan menggunakan indeks MPN. MPN merupakan most probable number yang menyatakan jumlah mikroorganisme dalam periode analisis. Uji penduga menggunakan media kaldu laktosa dan tabung kecil Durham dengan posisi terbalik. Bakteri koliform menggunakan laktosa sebagai sumber karbon, selain itu ada sebagian bakteri enterik yang tidak dapat melakukannya. Kaldu latosa juga mengandung surface tension depressant (lauril sulfat atau garam empedu) yang menekan pertumbuhan bakteri Gram positif dan memacu bakteri Gram negatif terutama bakteri koliform. Media LB yang digunakan terdapat dua tipe yaitu double strength dan single strength. Kedua tipe ini memiliki perbedaan pada jumlah komposisi penyusunnya. Media LBDS (Lactose Broth Double Stegth) memiliki komposisi  ekstrak daging sapi  (3 gram),  pepton  (5 gram),  laktosa  (10 gram), dan bromotimol biru (0,2%) per liternya, sedangkan media LBSS (Lactose Broth Single Stegth) memiliki komposisi yang sama tapi hanya kadar laktosanya setengah dari LBDS yaitu 5 gram (Volk 1988).

Tabung yang berisi kaldu laktosa diionilasikan dengan sampel air. Variasi volume sampel air yang digunakan yaitu 10 mL, 1 mL , dan 0,1 mL. Rangkaian ini paling sedikit terdiri dari 3 jenis unit dengan masing-masing unit berjumlah 3 sampai 5 tabung. Jumlah tabung yang digunakan pada uji penduga jika semakin banyak maka tiap unit akan semakin tinggi sensitivitasnya. Adanya gas dalam tabung merupakan uji penduga kehadiran bakteri koliform dalam sampel air dan jumlah bakteri dapat diduga dengan menggunakan indeks MPN. Indeks MPN yang diperoleh pada sampel air kolam sebesar 350 yang berarti terdapat 350 mikroorganisme per 100 mL sampel air. Berdasarkan pengertian tersebut maka air kolam memiliki jumlah mikroorganisme terbanyak, kemudian sampel air kloset, air kantin, air sungai, dan terakhir yang memiliki jumlah mikroorganisme paling sedikit yaitu kurang dari dua merupakan air kemasan. Air kemasan pada percobaan digunakan sebagai kontrol negatif, sedangkan air kloset digunakan sebagai kontrol positif adanya E. coli. Standar dari SK DIRJEN POM No.03726/B/SK/VII/89 yaitu batas maksimal nilai MPN koliform air minum ialah < 3 sel/mL, sehingga sampel air minum layak untuk dikonsumsi sedangkan untuk air sungai, kolam, kloset, dan kantin tidak layak untuk dikonsumsi. Metode perhitungan MPN sering juga digunakan dalam pengamatan untuk menghitung jumlah bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis bakteri ini memegang peranan penting dalam meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman, sehubungan dengan kemampuannya dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah amonium menjadi nitrat.

Uji penguat dilakukan untuk menguatkan pernyataan akan kehadiran bakteri koliform dalam sampel air setelah melewati uji penduga dengan hasil positif. Hasil uji penduga yang positif atau yang meragukan pada uji penguat menyatakan bahwa sampel air tidak layak untuk diminum. Penegasan hasil diperlukan karena hasil positif dapat diperolehdari aktivitas bakteri nonkoliform yang bukan merupakan indikator bakteri pencernaan. Uji penguat memerlukan media selektif dan diferensial seperti eosin methylene blue agar atau endo agar yang diinokulasikan dengan sampel hasil uji penduga. Percobaan yang dilakukan menggunakan media eosin methylene blue mengandung biru metilena yang menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif. EMBA pada lingkungan asam

yang dihasilkan oleh bakteri koliform akan membentuk kompleks yang berwarna menghasilkan warna hijau metalik. Reaksi ini merupakan karakteristik E. coli yang merupakan bakteri indikator pencermaran feses. Endo agar merupakan media nutrien yang mengandung pewarna fuksin yang tidak berwarna. Pewarna fuksin yang tidak berwarna dengan asam yang dihasilkan oleh koloni bakteri koliform akan membentuk kompleks berwarna merah muda yang menjadikan koloni E. coli dan sekelilingnya berwarna merah muda.

Hasil percobaan yang dilakukan menunjukkan bahwa air kloset dan air sungai memberikan hasil positif pada uji penguat. Sebelumnya, percobaan yang dilakukan memberikan hasil uji negatif. Hasil negatif ini dipengaruhi oleh beberapa faktor di antara media EMBA yang digunakan sudah kadaluarsa atau sudah tidak dalam keadaan baik sehingga tidak dapat membentuk warna hijau metalik ketika bakteri koliform menghasilkan asam. Selain faktor tersebut, faktor suhu juga memengaruhi hasil uji. Jika sampel disimpan pada suhu bukan suhu optimum bakteri koliform untuk tumbuh maka bakteri tidak akan tumbuh dan membentuk koloni. Percobaan kemudian diulangi untuk beberapa sampel yaitu sampel air kloset dan air sungai sehingga diperoleh warna hijau metalik. Warna hijau metalik yang terbentuk dari bakteri koliform yang berasal dari air kloset pada media EMBA dapat dilihat pada gambar 6.

Gambar 6 Warna hijau metalik dari sampel air kloset dengan menggunakan media EMBA

Uji pelengkap dilakukan untuk menegaskan kehadiran bakteri koliform dalam sampel air ataupun untuk menghilangkan hasil yang meragukan dari hasil uji sebelumnya dengan menggunakan pewarnaan Gram. Sampel biakan bakteri pada media agar sebaiknya perlu ditambahkan akuades terlebih dahulu sebelum diberi pewarna pada pewarnaan Gram. Hal tersebut bertujuan agar bakteri yang dioleskan tidak dalam keadaan menumpuk, karena akan sulit untuk menentukan penataan selnya ketika bertumpuk. Bakteri yang dioleskan juga tidak boleh terlalu tipis, karena sejumlah besar bakteri yang diberi berbagai macam perlakuan dapat hilang pada kaca preparat akibat ikut terbilas dengan akuades maupun alkohol. Bakteri yang telah dioleskan pada kaca preparat diberi tanda pada bagian belakang kaca preparat dengan spidol agar mempermudah dalam pemberian perlakuan sehingga semua bakteri yang telah dioleskan dapat terwarnai semua. Selain itu, jika sampel bakteri yang dihasilkan dapat menumpuk, terlalu sedikit, ataupun tidak ada maka sebaiknya bakteri yang dioleskan pada kaca preparat dibuat dua. Bakteri yang telah dioleskan dikeringudarakan atau fiksasi udara agar bakteri menempel pada kaca preparat. Agar fiksasi memakan waktu lebih sedikit maka fiksasi dilakukan di dekat api pembakar spirtus, akan tetapi fiksasi ini tidak boleh

dilakukan terlalu dekat dengan api pembakar spirtus karena bakteri yang menempel dapat mati akibat suhu yang panas sehingga ketika ditambahkan kristal ungu maupun safranin dapat larut dan hilang ketika dibilas. Setelah bakteri terebut diteteskan kristal ungu yang berfungsi memberikan warna utama dengan warna berupa ungu selama 1 menit yang kemudian dibilas dengan akuades. Pembilasan dengan akudes dilakukan dengan cara mengalirkannya pada bagian bakteri tidak dioleskan dengan cara kaca preparat sedikit dimiringkan, bukan dengan cara menyemprotkannya secara langsung pada bakteri karena dapat menyebabkan sejumlah besar bakteri yang menempel pada kaca preparat ikut terbilas. Setelah itu, kaca preparat dikeringudarakan dan ditambahkan kalium iodida selama satu menit yang dapat menyatu dengan kristal ungu membentuk kompleks di dalam sel sehingga sel tetap berwarna ungu atau dengan kata lain untuk mengintensifkan warna utama. Setelah satu menit, kaca preparat dibilas dengan alkohol 90%. Fungsi alkohol ini adalah untuk dekolorisasi atau dengan kata lain untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan ungu daru kompleks kristal ungu dan kalium iodida (KU-KI) pada bakteri Gram negatif, karena mengandung lebih banyak lipid sedangkan pada bakteri Gram positif akan tetap mempertahankan warna ungu karena mengandung lebih banyak peptidoglikannya. Bakteri Gram positif akan mengalami dehidrasi pada dinding selnya dan pori-porinya menciut karena daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga kompleks KU-KI tidak dapat keluar dari sel dan tetap berwarna ungu, sedangkan pada bakteri Gram negatif lipid tereksitasi (keluar) dari dinding sel dan pori-pori mengembang sehingga kompleks KU-KI keluar dari sel dan sel menjadi tidak berwarna atau warna ungu akan luntur karena peluruhan dinding sel. Setelah dibilas dengan alkohol dan dikeringudarakan, larutan safrani diteteskan pada area dioleskannya bakteri selama 1 menit. Saftranin merupakan warna penutup, pewarna tandingan, atau counterstain yang berfungsi untuk mewarna bakteri Gram negatif yang semula telah luntur pewarnaanya menjadi warna merah atau merah muda. Hasil akhirnya yaitu bakteri Gram positif akan berwarna ungu atau biru gelap dan bakteri Gram negatif akan memberikan warna merah atau merah muda. Pengamatan Gram yang dilakukan dengan mikroskop pembesaran 1000 kali harus menggunakan minyak imersi. Minyak imersi ini dapat menyebabkan karat, oleh karena itu setelah mikroskop tidak digunakan lagi maka minyak imersi yang menempel pada lensa dibersihkan.

Hasil percobaan menunjukkan bahwa pada uji pelengkap sampel air kloset dan air sungai yang tumbuh pada media EMBA mengandung E. coli yang merupakan bakteri Gram negatif yang berwarna merah muda dan memiliki bentuk batang. Uji pelengkap merupakan tahap akhir analisis bakteri dari sampel air. Ketiga uji tersebut menunjukkan bahwa air minum yang layak untuk dikonsumsi ialah air kemasan. Air kloset dan air sungai tidak layak untuk dikonsumsi karena adanya bakteri E. coli pada semua uji yang telah dilakukan baik pada uji penduga, uji penguat, dan uji pelengkap. Air kolam dan air kantin layak untuk dikonsumsi berdasarkan uji penguat, akan tetapi karena adanya beberapa faktor yang memengaruhi pertumbuhan bakteri pada media EMBA dan tidak dilakukannya uji pelengkap serta berdasakan jumlah mikroorganisme yang ada pada sampel yang cukup banyak maka air kolam dan air kantin tidak layak untuk dikonsumsi. Air tidak layak untuk dikonsumsi berdasarkan hasil percobaan sebaiknya tidak digunakan untuk memenuhi kebutuhan air minum terutama yang mengandung E.

coli karena bakteri tersebut dapat bersosiasi dengan bakteri patogen lain seperti Salmonella tipholia, Shigella dysentriae, dan Vibrio cholera.

SimpulanBerdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa air

kemasan layak untuk dikonsumsi sedangkan air kloset, air sungai, air kolam, dan air kantin tidak layak untuk dikonsumsi.

Daftar PustakaAdam S. 1992. Dasar-Dasar Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Perawatan. Jakarta: Kedokteran EGC.Dwijoseputro. 2003. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.Fardiaz S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Bogor: IPB Press.Jati Wijaya. 2007. Biologi Interaktif. Jakarta: Ganeca Exact.Volk S. 1988. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Erlangga.