MAKALAH

Hairy Roots Inductions From Portulaca oleracea using Agrobacterium

rhizogenes to Noradrenaline’s productionSebagai Pemenuhan Tugas Mata Kuliah Kultur Jaringan

Dosen pengampu: Dr. Wahyu Widoretno

Oleh:

1). Alfonsina A. A. Torimtubun ()115061100111027)

2). Megah Mulyo Eko H (115061100111028)

3). Rahma Yulia Rusmo (115061100111029)

4). Angga Reza (115061100111030)

5). Afida Khofsoh (115061100111031)

6).Inggit Kresna Maharsih (115061100111005)

PROGRAM STUDI TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

TAHUN AJARAN 2012/2013

Abstrak

Noradreneline adalah salah satu metabolit sekunder penting yang diproduksi oleh Portulaca

oleraceao. Awalnya, tanaman ini memproduksi metabolit ini dalam jumlah yang relatif kecil

sehingga induksi rambut akar menjadi suatu hal yang sangat berguna untuk meningkatkan

produk komersialnya. Dalam penelitian ini strain dari Agrobacterium rhizogenes digunakan

untuk menginduksi rambut akar pada Portulaca oleraceao. Untuk meningkatkan transduksi,

perbedaan faktor seperti eksplan (daun, batang, akar), umur eksplan (14, 28, 56 hari), strain

bakteri (15834, C318, 9435, A4), dan konsentrasi bakteri (0/2, 0/4, 0/6, 0/8) digunakan.

Inokulasi eksplan dalam 14 hari dengan 0/6 konsentrasi dari strain AR15834 mengindikasikan

persentasi maksimum dari tranduksi. Analisis PCR menunjukkan kehadiran pita diagnosa

dengan ukuran 780 bp yang dihubungkan dengan reproduksi spesifik dari gen primer dari rolB,

sehingga akar rambut transgenik dapat dikonfirmasi. Konsentrasi dari produksi noradrenalin

dalam akar dapat dievaluasi menggunakan HPLC. Hasil kita menunjukkan konsentrasi dari

rambut akar (garis-A) mempunyai kelipatan hingga 12 kali dari pada akar normal (Non-HR).

Kata kunci: Portulaca oleracea, Noradrenalin, pembentukan rambut akar, starin AR15834,

PCR.

BAB I

PENDAHULUAN

Portulaca oleracea merupakan tanaman hias yang banyak tumbuh di daerah beriklim

sedang dan dapat tumbuh hingga 30 cm, secara umum digunakan sebagai tanaman obat dalam

pengobatan tradisional dan makanan. Karena tanaman ini kaya protein, flavonoid, dopamin, dan

noradrenalin yang memiliki kegunaan untuk terapi anti septik, anti spasmodik, diuretik,

antipiretik, antioksidan yang berguna untuk memperkuat sistem kekebalan tubuh dan

pembersihan darah (Kumar & Kanwar, 2007).

Noradrenalin adalah katekolamin dengan peran ganda seperti membuat keputusan dengan

cepat, meningkatkan kewaspadaan, fokus, energi (Haeri Rohani, 1380) dan secara langsung

meningkatkan denyut jantung, memicu pelepasan glukosa dari menyimpan energi, dan

meningkatkan aliran darah ke otot rangka (Henka et al.2010) sebagai agent anti inflamasi yang

akan dilepas di otak dan efektif dalam mengobati neurologis dan penyakit yang gampang

terkejut (Rentang, 2003).

Banyak tanaman telah diteliti untuk menghasilkan metabolit sekunder dengan

menggunakan bioteknologi seperti kultur sel dan lain-lain. Secara umum, pada in vitro kultur sel

dan organ untuk produksi metabolit sekunder yang berbeda, biasanya ditemukan suatu

keberhasilan yang terbatas karena hasil yang rendah dan ketidakstabilan genetik. Dalam

beberapa tahun terakhir, banyak peneliti memperhatikan inokulasi dan produksi akar rambut oleh

Infeksi dengan gram negatif bakteri Agrobacterium rhizogenes tanah. Bakteri ini bertindak

sebagai faktor alami untuk transformasi yang merupakan penyebab tumbuhnya akar rambut

transgenik pada tanaman (Binns,2002). Akar-akar rambut dapat tumbuh dengan cepat tanpa

adanya zat pengatur tumbuh eksogen (Phytohormones), tanpa menghilangkan beda fenotipe

mereka dan untuk menghasilkan jumlah metabolit sekunder yang lebih tinggi dibandingkan

dengan kultur suspensi dan bahkan kultur sel induk. Diperlukan sepotong plasmid bakteri

Tanaman seperti gen rolB dalam fitur ini.

Ketika bakteri menginfeksi tanaman, T-DNA antara daerah TR dan TL dari Ri-plasmid

dalam bakteri ditransfer dan diintegrasikan ke dalam kompleks gen dari tanaman inang.

Virulensi gen yang membentuk wilayah vir dari Ri plasmid, dan gen CHV ditemukan pada

kromosom bakteri menengahi transfer T-DNA (Kayser & Quax 2007). Spesies tanaman bandel

untuk transformasi dapat diubah dnegan mendorong gen vir tersebut dari bakteri oleh molekul

sinyal atau dapat dicapai secara in vitro oleh co-budidaya. Agrobacterium dengan jaringan yang

terluka atau dalam media yang mengandung molekul sinyal Transformasi Proses menghasilkan

berharga oleh-produk, akar berbulu, yang akan terbentuk pada atau dekat tempat infeksi (Et

al.1982 Chilton).

Akar serabut tumbuh pesat, menunjukkan pertumbuhan plagiotropic, dan bercabang pada

phytohormone bebas media. Akar-akar tumbuh cepat berbulu memiliki kapasitas biosintesis

tinggi, khususnya akar yang melekat pada metabolit seperti yang ditemukan di akar aslinya in

vivo dan mereka juga dapat digunakan sebagai sumber berkelanjutan untuk produksi metabolit

sekunder yang berharga. Berbeda dengan ketidakstabilan dan variabilitasterorganisir suspensi sel

tanaman, akar berubah mampu menumbuhkan tanaman yang layak secara keseluruhan dan

menjaga stabilitas genetik mereka selama subkultur lanjut dan regenerasi tanaman. Banyak

peneliti tekun berupaya untuk menghasilkan metabolit yang diinginkan berasal dari akar berbulu

(Kittipongpatana et al. 1998).

Untuk berhasil dalam membangun sistem kultur akar rambut untuk jenis tanaman

tertentu, beberapa penting kondisi harus diambil dalam pertimbangan. Beberapa faktor termasuk

jenis dan umur eksplan,konsentrasi dan beda strain Agrobacterium rhizogenes yang efektif dalam

produksi dan meningkatkan akar rambut transgenik tanaman.Dalam penelitian ini, kami

melaporkan produksi akar rambut berubah dalam Portulaca oleracea oleh Agrobacterium

rhizogenes di dalam kondisi in vitro dan diperiksa faktor yang mempengaruhi meningkatnya

induksi akar rambut transgenik Portulaca oleracea untuk meningkatkan produksi noradrenalin di

akar rambut transgenik tanaman ini dari akar normal.

BAB II

BAHAN dan METODE

2.1. Bahan Tumbuhan

Benih Portulaca oleraca diambil dari kebun Hamedan pada Oktober 1989 dan dikirim ke

laboratorium pada kondisi aliran Laminar, disterilisasi dengan 2% NaOCl dan dibilas dengan air

distilasi steril. Kemudian di cawan petri mengandung ½ medium kultur MS.

2.2. Persiapan Bakteri

Untuk persiapan kultur suspensi dari Agrobacterium rhizogenes yang didapat dari Biotechnology

Research Center, Karaj, Iran. Koloni dari bakteri Agrobacterium rhizogenes tumbuh pada

medium padat LB yang dipindah dan dikultur di 10 mL medium cair LB yang mengandung 50

mg/L antibotik rifampin pada kondisi steril. Untuk langkah selanjutnya medium cair LB

dikontaminasi dengan bakteri yang ditransfer ke kamar pertumbuhan dengan 28oC dan dikocok

dalam Shaker dengan kecepatan 110 rpm untuk 24 jam di kondisi gelap, sampai bakteri tumbuh

dan aktif. Setelah periode ini, konsentrasi suspensi bakteri ditentukan dengan menggunakan

spektofotometer model Lambda 45UV/Tampak di OD600 (Optical Density). Untuk transformasi,

OD diatur pada panjang gelombang 600 nm antara 0/2 hingga 0/8 dan kemudian digunakan

untuk infeksi eksplant bakteri.

2.3. Induksi dan Produksi Akar Rambut

Tiga tipe jaringan (daun, batang, akar) dari 14 hingga 56 hari lamanya bibit berkecambah

digunakan sebagai eksplan untuk menginfeksi. Eksplan dipotong untuk inokulasi dengan bakteri

dan kemudian dipindahkan di suspensi LB yang mengandung bakteri aktif dalam 20 menit.

Setelah periode infeksi untuk bakteri cocultivation selesai, eksplan dipindah ke cawan petri yang

mengandung ½ medium MS tanpa hormone, antibotik dan diletakkan di kamar pertumbuhan

yang gelap dengan temperatur 25oC. Pada waktu yang sama, jumlah eksplan sebagai bukti (tanpa

meletakkan bakteri di suspensi) yang diletakkan di ½ medium MS. Setelah 48 jam kokultivasi,

untuk memindahkan bakteri, eksplan dipindah ke ½ medium MS yang mengandung antibiotic

cefotaxine.

2.4. Faktor diperiksa dalam optimalisasi transgenic

Untuk meningkatkan transgenik di P. oleraca beberapa faktor dipelajari dalam rancangan acak

lengkap. Setiap treatmen dievaluasi di triplicate dan untuk setiap pengulangan dipertimbangkan

10 eksplan. Untuk mereview informasi yang diperoleh, software Excel 2007 dan software SAS

9,1 digunakan untuk membuat diagram dan analisis variasi treatment test berturutan.

2.5. Faktor yang diperiksa meliputi :

1. Tipe eksplan : eksplan berbeda dari daun, batang dan akar yang digunakan

2. Umur eksplan : bibit dari variasi umur 14, 28 dan 56 hari dipelajari

3. Strain berbeda dari A.rhizogenes : AR15834, A4, C318, 9435 untuk menentukan strain

terbaik yang digunakan untuk kontaminasi pada tumbuhan

4. Konsentrasi bakteri : suspense bakteri pada konsentrasi 2/0, 4/0, 6/0 dan 8/0 digunakan

untuk menginfeksi

2.6. Konfirmasi molecular dari akar transgenic

Setelah pengembangan akar rambut, untuk konfirmasi molecular dari akar transgenic, setelah

beberapa langkah dari subkultur di antibiotic yang mengandung medium dan memastikan

pemindahan bakteri komplit, ekstraksi DNA dilakukan dengan metode Cai dkk dan teknik PCR

digunakan dengan primer spesifik gen rol B T-DNA ke dalam genome tumbuhan.

2.7. Ekstraksi dan penentuan noradenaline dari akar transgenic

Setelah pembentukan akar rambut, empat baris dipilih dari akar yang memiliki pertumbuhan

yang baik dan dipotong dalam 3*3 potongan dan kemudian dipindahkan ke 250 mL labu

Erlenmeyer disegel dengan parafilm dan diletakkan pada suhu 25oC dengan periode

pertumbuhan 16 jam siang dan 8 jam gelap dalam shaker elektrik dengan 110 rpm untuk 4

minggu. Setelah 4 minggu, metode Chen dan kampus digunakan untuk ekstraksi noradenaline.

Juga system HPLC dengan c18 kolom (25 cm x 4,6 mm) dan detector UV, digunakan untuk

penentuan kuantitatif noradenaline. Fase gerak mengandung 0/02 molar larutan dari KH2PO4

(95%), asetonitrile (5%), pH 3 dan panjang gelombang 280 nm.

Tiga replikasi dari setiap treatment termasuk dan test dikonduksi di design acak komplet.

BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1. Induksi akar transgenik

Hasil awal dari benih yang disterilkan dan dikulturkan dalam ½ MS medium cair menunjukkan

pengecambahan biji dan produksi bibit setelah 3 hari, sehingga digunakan untuk produksi

eksplan. Hasil dari variabel umur dari pembibitan menunjukkan bahwa 14 hari pembibitan lebih

besar dari pembibitan 28 dan 56 hari direaksikan dengan agrobacterium rhizogenes. Frekuensi

dari transgenic dalam pembibitan 14 hari mencapai 62% dimana angka tersebut merupakan

angka tertinggi yang ditunjukkan pada perbedaan yang signifikan dari pada 28 dan 56 hari. (pada

gambar a)

gambar 2 a dan b

Hasil dari gambar 2b menunjukkan bahwa jaringan pada daun, batang dan akar digunakan

sebagai eksplan, level dalam eksplan daun bertangkai ternyata lebih tinggi dari eksplan yang lain

sehingga pada level 5 % ditunjukkan perbedaan yang signifikan dengan eksplan yang lain.

Tingginya persentasi dari dari daun transgenic dapad dihubungkan dengan tingginya sensitivitas

dari eksplan daun terhadap bakteri daripada hubungan yang lain, yang mana sensitivitas ini

bergantung pada kondisi fisiologi dari jaringan (Pavar&Maheshvari,2003). Hamill 2003

melaporkan efek kunci rol gen dalam jalan auksin dan sitikinin tidak aktif menjadi aktif

dilakukan pada perbedaan antara seluruh eksplan transgenic dari tanaman. Juga beberapa

penelitian menunjukan bahwa umur eksplan dapat berefek banyak pada limpahan produksi dari

akar rambut karena umur eksplan berefek pada fisat fisik dari sel dan berakibat pada kemampuan

membentuk transgenic (Mehrotra, 2008). Jaringam meristem dan bagian yang muda biasanya

merupakan mempunyai daya tumbuh yang tinggi dan oleh karena itu bagian tersebut cocok

untuk dijadikan transgenic, tanaman lebih tua biasanya pengerasannya lebih rendah.

Pertambahan umur tanaman dan organ tanaman ini menyebabkan diferensiasi berlebihan pada

jaringan dan sel. Dan oleh sebab itu pada kemampuan proliferasi sel dan kemampuannya untuk

sesuai dengan faktor yang menyebabkan penyakit (Bageri&Safari,1887)

Hitungan strain terbaik untuk infeksi dan produksi akar dalam penambahan menggunakan

AR15834, strain A4, 9435 dan C318 yang juga digunakan. Hasil terdapat pada gambar 3-a

menmunjukkan bahwa kecepatan transgenic yang tinggi dengan frekuensi 66% didapatkan dari

penggunaan strain AR15834, statistic dari kstrain menunjukkan perbedaan yang signifikan pada

level 5%.

Gambar 3 a dan b

(gambar 3-a) efek dari perbedaan strain dari A. rhizogenes pada perubahan produksi akar

rambut, b) efek dari perbadaan konsentrasi A. rhizogenes pada perubahan produksi akar rambut,

Hasil yang didapatkan mengindikasikan hasil yang sama dengan penelitian Kamada et al

(Kamada et al, 1986) dan Manu et al, 1986, yang pertama kali untuk produksi tropane alkaloid

menggunakan agrobakteria rhizogenes strain ATCC15834 pada tanaman Atropa belladonna dan

Scopolia japonica, akar rambut tapat dimunculkan secara sempurna. Menurut penelitian ini

kesuksesan pembantukan tanaman transgenic dari strain karena sensitifitas yang tinggi dari

tanaman pada strain bakteri. Hasil dari induksi akar rambut transgenic menunjukkan bahwa

banyaknya variatas dari pertumbuhan akar diamati setelah co-cultivation dengan A.rhizogenes.

Batra dan Colleague melaporkan bahwa masuknya TL dan TR atau salah satunya dapat

menyebabkan pada pertumbuhan dan morfologi pada pada produksi akar karena mereka dapat

merubah kesetimbangan hormone pada akar ini. Tiwari dan colleague melaporkan pada

penelitian dari akar rambut, ada hubungan secara langsung antara ekspresi rolB, pertumbuhan

akar dan cabang lateral dari akar rambut. Keuntungan, termasuk kecepatan tumbuh, waktu

pergandaan rendah, pemeliharaan yang rendah dan kemampuan tuntuk sintesis berbagai senyawa

kimia dari akar rambut terdapat pada teknik ini seperti sumber penting dan permanen dari

metabolit sekunder yang berharga. Akar rambut dapat tumbuh tak terbatas pada medium bebas

hormon dan juga karena sifat khas memiliki stabilitas genetik dan produksi metabolit sekunder

pada level tinggi

Hasil keseluruhan menunjukkan bahwa agrobakterium rhizogenes strain AR15834 dengan

konsentrasi 0/6 sukses untuk kontaminasi dan induksi akar ranmbut dalam 14 hari eksplan daun

tua dari P.oleracea (gambar 4)

Gambar 4. pembentukan akar rambut Portulaca Oleracea dari agrobakterium rhizogenes a) 14

hari pembibitan kecambah dari bibit P.oleracea. b) potongan daun dan inkubasi dengan suspensi

bakteri kemudian di transfer ke medium 1/2MS c) produksi pembentukan akar dengan potongan

eksplan d) perpanjangan pembentukan akar pada medium pada 1/2MS termasuk cefatoxim e)

kecepatan tumbuh dari pembentukan akar pada medium cair.

2.2. Konfirmasi molekul dari akar rambut transgenik

Ditunjukan pada gambar 5, hasil dari elektroforesis gel mengungkapkan kegadiran gen rolB pada

dalam akar rambut.

2.3. Evaluasi Produksi Noradrenaline

Satu dari aplikasi penting akar rambut adalah produksi atau meningkatkan produksi dari

metabolit sekunder dibanding akar biasa. Sebagai pengertiannya dalam Bahan dan Metode,

tingkat noradrenaline ditentukan dengan sistem HPLC menggunakan noradrenaline standard dan

Rt yang berhubungan dengan metabolit ini ditentukan secara akurat menggunakan standard.

Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 6, puncak yang berhubungan dengan metabolit

sekunder noradrenaline ditunjukkan dalam 3/09 menit.

Gambar 6 : Kromatogram HPLC, 280 nm panjang gelombang terdeteksi. Untuk pembelajaran

dari noradrenaline. A : Jumlah noradrenaline dari akar biasa. B : Jumlah noradrenaline dari akar

rambut.

Hasil dari pengukuran jumlah noradrenaline di kontro bari akar dan bari akar rambut

menunjukkan bahwa tingkat noradrenaline di akar terkontrol adalah 0/002 mg per gram berat

kering. Hasil mengindikasikan perbedaan signifikan antara jumlah produksi noradrenaline dari

akar rambut dibanding akar normal. Seperti yang ditunjukkan di Tabel 1, tingkat produksi

noradrenaline di akar rambut transgenik, secara signifikan lebih banyak jumlah produksi

metabolit ini di akar kontrol. Jumlah terbanyak dari noradrenaline didapat dari akar rambut

transgenik (baris A) yaitu 0/025 mg per gram bahan kering yang 12 kali lebih besar diamati di

perbandingan dengan akar kontrol. Sehingga, menggunakan teknik akar rambut, jumlah

noradrenaline yang ditunjukkan meningkatkan akar rambut dibanding akar kontrol. Nilai yang

ditunjukkan dikalkulasi menggunakan LSD pada tingkat 1%.

Tabel 1 : Jumlah noradrenaline di bari A-D (mg/g berat kering), kata berbeda lebih baik untuk

secara statistik signifikan secara tinggi (p<0/01).

Hasil mengindikasikan bahwa seluruh 4 baris menunjukkan perbedaan signifikan dengan

kontrol (non-HR) dan baris A dan C bersama-sama dengan baris B dan D juga signifikan pada

tingkat 1%. Giri & Narso 2000 melaporkan bahwa perbedaan dalam jumlah produksi metabolit

sekunder antara baris dapat dikarenakan perbedaan jumlah T-DNA copy input ke genom

tumbuhan dan perbedaan pola ekspresi gen T-DNA di baris akar rambut. Hal itu mungkin alasan

utama dari perbedaan ini. Perbedaan penyimpangan T-DNA ke genome tumbuhan. Tenae dkk

juga melaporkan bahwa peningkatan biomassa dapat dikarenakan efek gen rol dalam divisi sel

sehingga meningkatkan metabolit biosintesis potensial.

Secara umum, tingkat noradrenaline secara signifikan naik di akar transgenik yang dapat

digunakan pada bidang farmaseutikal, kimia, komersial dll.