BAB IPENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANGValidasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan uji laboratorium. Penilaian bertujuan untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Validasi metode analisis bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi bahwa metode analisis sudah sesuai dengan tujuannya (Gandjar & Rohman, 2007).Obat tradisional adalah bahan atau ramuan bahan berupa bahan tumbuhan, bahan hewan, bahan mineral, sediaan galenik, atau campuran dari bahan tersebut, yang secara turun temurun telah digunakan untuk pengobatan berdasarkan pengalaman (BPOM, 2004). Bahan-bahan tersebut berisiko terkena cemaran selama proses pembuatannya menjadi sebuah sediaan, yaitu pada saat pemanenan, pencucian, perajangan, pengeringan, atau saat penyimpanan. Mikroorganisme mampu akan merusak zat aktif tanaman sehingga menurunkan kadarnya, bahkan mampu mengubah khasiatnya. Konsumen akan dirugikan karena tidak mendapatkan khasiat yang diinginkan. Maka, untuk menjamin mutu produk dilakukan pengujian mikrobiologi sebagai salah satu parameter jaminan mutu produk.

B. RUMUSAN MASALAHRumusan masalahnya adalah bagaimana cara melakukan validasi metode analisis uji Angka Lempeng Total (ALT) dan Angka Kapang Khamir (AKK).

C. TUJUANMengetahui cara validasi metode analisis uji Angka Lempeng Total (ALT) dan Angka Kapang Khamir (AKK).

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

A. UJI ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT)Uji Angka Lempeng Total (ALT) merupakan metode kuantitatif yang digunakan untuk mengetahui jumlah mikroba pada suatu sampel. Uji ALT menggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat diamati secara visual dan dihitung. Interpretasi hasil berupa angka dalam koloni (cfu) dalam mL atau g. Cara yang digunakan yaitu cara tuang (pour plate), cara sebar (spread plate) dan cara tetes. Prinsip metode ini adalah jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada media agar, sel tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata telanjang (Betsy & Keogh, 2012), Sampel dari bahan atau produk yang sudah dihomogenkan, diinokulasi pada media Plate Count Agar (PCA). Setelah diinkubasi, koloni mikroba yang tumbuh dihitung sebagai jumlah mikoba. Proses inokulasi sampel ke media agar dapat dilakukan dengan cara penuangan, penyebaran dan penetesan. Untuk mencegah kematian mikroba sampel, suhu media agar cair yang dituangkan berkisar 45-50C. Bila suhunya terlalu rendah akan menyulitkan karena sudah mulai mengental. Jumlah koloni yang dipersyaratkan adalah 30-300 cfu (Feldsine, dkk., 2002).

B. Uji Angka Kapang / Khamir (AKK)Kapang adalah mikroorganisme yang termasuk dalan anggota Kingdom Fungi yang membentuk hifa. Kapang memiliki lebih dari satu sel, sedangkan khamir adalah mikroba bersel tunggal (Betsy & Keogh, 2012). Kapang dan khamir mampu mencemari bahan tanaman yang tidak diproses dengan baik. Kapang mampu tumbuh dengan baik pada suhu ruang dengan kelembaban tinggi.Prosedur pengujian Angka Kapang / Khamir (AKK) menggunakan media Potato Dextrose Agar (PDA) yang ditambah dengan kloramfenikol (BPOM, 2006). Pemberian kloramfenikol bertujuan untuk mencegah pertumbuhan bakteri pada media, sehingga mengganggu pengamatan. Pengujian dilakukan dengan suhu inkubasi 20-25C. Koloni kapang berbentuk seperti kapas atau bulat dengan berbagai warna dan permukaan kasar, sedangkan khamir berbentuk bulat kecil putih hampir menyerupai bakteri. Jumlah koloni yang diamati dan sesuai persyaratan adalah cawan dengan seri pengenceran yang menghasilkan 50-150 koloni (Feldsine, dkk., 2002).

C. VALIDASI METODEValidasi metode adalah suatu proses dalam menentukan kesesuaian metode untuk tujuan tertentu. Validasi dapat diklasifikasikan menjadi validasi primer dan sekunder berdasarkan tujuan validasi. Validasi primer adalah proses penelitian untuk mengembangkan limit operasional dan karakteristik performa dari metode baru, perubahan metode atau metode yang inadekuat. Validasi sekunder adalah proses pengumpulan bukti bahwa suatu laboratorium mampu memenuhi persyaratan yang dibentuk oleh validasi primer (ICH, 1995).Tujuan validasi metode analisis adalah untuk mengevaluasi kinerja metode, menguji faktor-faktor yang dapat mempengaruhi kinerja metode dan melakukan verifikasi bahwa kinerja metode analisis yang digunakan valid. Persyaratan dari validasi metode analisis adalah menggunakan instrumen dan peralatan yang terkalibrasi dan dilaksanakan oleh personnel yang kompeten. Salah satu metode analisis yang divalidasi adalah metode analisis mikrobiologi.Untuk memenuhi persyaratan validitas metode analisis mikrobiologi, dibutuhkan parameter-parameter tertentu yang harus dipenuhi. Beberapa parameter tersebut antara lain:1. Akurasi Kemampuan metode untuk mengukur dan mendeteksi nilai actual dari mikroorganisme target dalam sampel. Akurasi merupakan ukuran ketepatan atau kedekatan hasil pengujian dengan hasil yang sebenarnya. Nilai akurasi dilihat dari persen recovery atau perolehan kembali dari hasil pengujian.2. PresisiPresisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil pengujian individual dengan hasil rata-rata pengujian berulang pada sampel yang homogen. Kondisi pengujian dipersyaratkan harus sama. Nilai presisi dilihat dari Relative Standarad Deviation (RSD) hasil pengujian.3. Kepekaan (Sensitivitas) dan SpesifisitasSensitivitas adalah kemampuan metode untuk mendeteksi mikroorganisme target dalam jumlah sekecil mungkin. Spesifisitas adalah kemampuan metode untuk mendeteksi mikroorganisme tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya mikroorganisme asing atau bahan lain.4. Limit Deteksi dan Limit KuantitasiLimit deteksi merupakan jumlah atau konsentrasi terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi, namun tidak perlu diukur sesuai dengan nilai sebenarnya. Limit kuantitasi adalah jumlah analit terkecil dalam sampel yang dapat ditentukan secara kuantitatif pada tingkat ketelitian dan ketepatan yang baik.Limit deteksi dan limit kuantitasi dihitung dari rerata kemiringan garis dan simpangan baku intersep kurva standar yang diperoleh(ICH,1995).5. Linieritas dan RentangLinieritas menunjukkan kemampuan suatu metode analisis untuk memperoleh hasil pengujian yang sesuai dengan konsentrasi analit dalam sampel pada kisaran konsentrasi tertentu.Rentangdapat dilakukan dengan cara membuat kurva kalibrasi dari beberapa set larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya(Ermer & Miller, 2005). Kriteria keberterimaan dari linieritas adalah r2 > 0,999 (BPOM, 2013).

BAB IIIMETODE PENELITIAN

A. ALAT DAN BAHAN1. Autoclave2. Waterbath3. Laminair Air Flow (LAF) merk Envair C-Flow4. Oven merk Memmert5. Neraca analitik6. Inkubator merk Memmert7. Colony counter8. Bunsen burner9. Beaker glass10. Alat-alat gelas11. Ball pump12. Kapas, aluminium foil, tali, label13. Sampel14. Media PCA (untuk ALT)15. Media PDA (untuk AKK)16. Kloramfenikol17. Air RO18. Alkohol 90%

B. Cara Kerja Validasi Metode Analisis Mikrobiologi Uji ALT dan AKK1. Sterilisasi alata. Cawan petri yang telah dicuci bersih dibungkus dengan kertas (4 petri dalam 1 bungkus) (A)b. Bungkus pipet volume dengan kertas (B)c. Botol tempat sampel yang telah dicuci bersih direndam dengan air panas (C)d. Masukkan B dalam autoclave dengan mode ster pada suhu 121C selama 30 menit. Lanjutkan dengan mode dry pada autoclave selama 15 menit.e. A dan C disterilisasi dengan oven pada suhu 160-180C selama 2 jam2. Persiapan media PCAa. Cuci / semprot tangan dengan alkohol 90%b. Media PCA ditimbang sesuai kebutuhanc. Dalam Erlenmeyer yang telah berisi air RO setengah dari volume yang diperlukan, dimasukkan media PCAd. Sisa air RO ditambahkane. Erlenmeyer dimasukkan dalam waterbath sambil terus diadukf. Pemanasan dihentikan bila media sudah jernihg. Erlenmeyer disumbat dengan kapas, kemudian ditutup dengan aluminium foil dan diikat3. Persiapan media PDAa. Media PDA ditimbang sesuai kebutuhanb. Dalam Erlenmeyer yang telah berisi air RO setengah dari volume yang diperlukan, dimasukkan media PDA & kloramfenikolc. Sisa air RO ditambahkand. Erlenmeyer dimasukkan dalam waterbath sambil terus diaduke. Pemanasan dihentikan bila media sudah jernihf. Erlenmeyer disumbat dengan kapas, kemudian ditutup dengan aluminium foil dan diikat4. Persiapan air untuk pengencerana. Tabung reaksi disiapkan sesuai keperluanb. Masing-masing tabung reaksi diisi dengan 9 mL air ROc. Tabung reaksi disumbat dengan kapas & dimasukkan dalam wadahd. Wadah ditutup dengan aluminium foil5. Sterilisasi larutan pengencer dan mediaa. Erlenmeyer berisi media dan tabung reaksi berisi larutan pengencer dimasukkan dalam autoclaveb. Dilakukan sterilisasi dengan suhu 121C selama 20 menit6. Penimbangan sampela. Sampel ditimbang sebanyak 1 g untuk masing-masing uji & dimasukkan dalam botol kacab. Disiapkan label sebanyak 11 untuk masing-masing uji7. Persiapan sampela. Persiapan sampel dilakukan dalam LAF yang telah disterilisasi (UV pada LAF dan pensteril ruangan dinyalakan sebelum ruangan digunakan)b. Masing-masing uji dibutuhkan 9 sampel (digunakan 3 tingkat konsentrasi, masing-masing 2 replikasi), 1 media blangko (kontrol negatif) dan 1 media dengan air RO (kontrol positif)c. Air RO dimasukkan dalam botol sampel dan digojog. Didapatkan pengenceran sebanyak 1 kali (10-1)d. Untuk pengenceran berikutnya, diambil 1 mL air sampel dan dimasukkan dalam air RO pada tabung reaksi yang telah disiapkan. Gojog tabung reaksi dan didapatkan pengenceran 2 kali (10-2).e. Untuk pengenceran berikutnya diulang tahap df. Sampel dari masing-masing pengenceran direplikasi sebanyak 2 kalig. Sebanyak 1 mL sampel dimasukkan dalam cawan petri (diberi label ALT A1-A3, ALT B1-B3, ALT C1-C3, Blanko ALT, Air RO ALT; AKK A1-A3, AKK B1-B3, AKK C1-C3, Blangko AKK, Air RO AKKh. Saat berganti sampel tangan disemprot dengan alkohol 90%. Tiap membuka tutup cawan petri, tabung reaksi, Erlenmeyer, dan botol didekatkan dengan Bunsen burner dengan jarak 10 cm.8. Penambahan mediaa. Media PCA dan PDA dituang secukupnya 0,5 cm. Cawan petri digoyang-goyangkan agar sampel dan media homogenb. Cawan petri dikelompokkan berdasarkan uji9. Inkubasia. Media PCA yang telah memadat dimasukkan dalam inkubator pada suhu 37C selama 24 jam, dalam posisi terbalikb. Media PDA yang telah memadat diinkubasi dalam tempat gelap pada suhu ruang (25C) selama 72 jam10. Perhitungan jumlah kolonia. Cawan diletakkan dengan posisi terbalik pada colony counterb. Jumlah koloni pada cawan dihitung dan dicatat hasilnya

C. PARAMETER VALIDASI1. Akurasi (Kecermatan)

Keterangan:H = Hasil pengujian dengan metodeA = Hasil sebenarnya* Range recovery adalah 80-120% (Feldsine, dkk., 2002)

2. Presisi

Keterangan:SD = Standard deviation = Rata-rata log*Range RSD (Relative Standard Deviation) adalah 5-15% (Feldsine, dkk., 2002)

DAFTAR PUSTAKA

Betsy, Tom & Jim Keogh, 2012, Microbiology Demystified, 2nd Edition, McGraw and Hill Professional, New York.BPOM, 2004, Pedoman Cara Pembuatan Obat Tradisional yang Baik, Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, JakartaBPOM, 2006, Metode Analisis Mikrobiologi Suplemen 2000, Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, Jakarta.BPOM, 2013, Petunjuk Operasional Penerapan Pedoman Cara Pembuatan Obat yang Baik 2012, Jilid I, Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, Jakarta.Ermer, J.H. dan McB. Miller, 2005, Method Validation in Pharmaceutical Analysis: A Guide to Best Practice, Wiley-Vch. Verlag GmbH & Co, Weinheim.Feldsine, dkk., 2002, AOAC International Method Committee Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Method Analysis, Journal of AOAC International, Vol. 85, No. 5.Gandjar, I.G. & A. Rohman, 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Belajar, Yogyakarta.ICH, 1995, Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology,Q2 (R1).