Validasi Metode Analisis Penetapan Kadar Senyawa Siklamat Dalam Minuman Ringan

Prosiding PPI Standardisasi 2009 - Jakarta, 19 November 2009

1

VALIDASI METODE ANALISIS PENETAPAN KADAR SENYAWA SIKLAMAT DALAM MINUMAN RINGAN

Oleh

Yus Maria Novelina S1, Sutanto2, Alia Fatimah2

Abstrak

Penetapan kadar senyawa siklamat di dalam minuman ringan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dipelajari untuk menentukan kelayakannya sebagai metode analisis uji standar. Pada penelitian ini digunakan contoh minuman ringan yang beredar di pasaran. Pemisahan senyawa dari matriksnya dilakukan dengan melarutkan contoh ke dalam fasa gerak yang digunakan, sedangkan pemisahannya dengan menggunakan kolom C18. Kolom distabilkan dengan menggunakan KH2PO4: methanol dengan perbandingan (7:3) dengan kecepatan alir 1 mL/menit, kemudian komposisi fase gerak yang tetap selama 10 menit. Pengamatan dilakukan dengan menggunakan HPLC detektor UV. Sebagai pembanding digunakan standar siklamat. Validasi menggunakan spike sample menunjukkan bawa metode ini teliti dalam menentukan kadar siklamat. Presisinya cukup tinggi dan nilai batas deteksinya adalah 154 mg/L . Penelitian menyimpulkan bahwa metode KCKT dapat dipakai sebagai metode uji penetapan kadar siklamat dalam minuman ringan.

Kata kunci : siklamat, minuman ringan

1 Peneliti di Balai Besar Industri Agro – Bogor

2 Jurusan Farmasi Universitas Pakuan - Bogor


2

I PENDAHULUAN

Penggunaan bahan sintetik semakin diminati di berbagai lapisan masyarakat,

termasuk kalangan industri. Tingkat kemanisan serta harga yang ekonomis menjadi

penyebab berbagai kalangan lebih tertarik menggunakan pemanis sintetik tersebut

dibandingkan pemanis alami yang cenderung lebih mahal.

Siklamat merupakan pemanis sintetis non-kalori yang paling besar jumlahnya

dikonsumsi di Indonesia. Menurut Departemen Kesehatan Republik Indonesia,

penggunaannya hanya diperbolehkan untuk pasien diabetes ataupun orang yang

membutuhkan makanan berkalori rendah (Farida, 1989). Tetapi pada kenyataannya

penggunaan siklamat semakin meluas pada berbagai kalangan dan beragam produk

(Winarno dan Birowo, 1988).

Penggunaan siklamat sempat dilarang dibeberapa Negara di dunia seperti

Amerika Serikat, Kanada, Inggris pada tahun 1970an. Alasan pelarangan didasarkan

atas dugaan adanya sifat karsinogenik yang disebabkan oleh hasil uraiannya berupa

sikloheksamin.

Namun demikian penelitian yang mendasari timbulnya larangan penggunaan

siklamat tersebut mendapat banyak kritikan. Jumlah (konsentrasi) siklamat yang

digunakan untuk uji toksisitas, karsinogen maupun mutagen dilakukan dengan

menggunakan dosis yang sangat tinggi dan tidak mungkin terjadi pada praktek

sehari-hari. Selain itu data-data pengujian siklamat pada Beberapa hewan

percobaan tidak menunjukkan efek yang merugikan dalam dosis kecil setiap harinya

(Mitchel, 2006). Oleh karena itu WHO masih memasukkan siklamat sebagai bahan

tambahan pangan (BTP) yang diperbolehkan (Albiner S, 2002) selama

penggunaannya sesuai dengan ketentuan acceptable daily intake (ADI). Pada

akhirnya, Joint Expert Comitte on Food Additives (JECFA) menetapkan ADI untuk

siklamat sebesar 11 mg/kg bb/hari (Watson, 2001).

Di Indonesia penggunaan siklamat untuk dikonsumsi telah diatur oleh Badan

POM dalam Peraturan Teknis Penggunaan Bahan Tambahan Pangan Pemanis

Buatan dalam Produk Pangan (BPOM, 2004). Aturan ini membahas batas

penggunaan maksimum siklamat untuk tiap katagori pangan dengan mendasarkan

perhitungannya pada Acceptable Daily Intake (ADI). Sebagai lembaga yang

berwenang dalam hal pengawasan obat dan makanan yang beredar dipasaran

Indonesia, serta memperhatikan aspek keamanan terhadap penggunaan bahan

pemanis sintetis, Badan POM menegaskan pada setiap industri yang akan

menggunakan siklamat sebagai pemanis harus mencantumkan laporan hasil uji

siklamat yang dilakukan oleh lembaga (Laboratorium pengujian) terakreditasi.

Sampai saat ini analisis siklamat masih dilakukan menggunakan metode

konvensional secara gravimetri. Akan tetapi teknik tersebut memerlukan waktu yang

cukup lama dengan resiko analisis yang cukup tinggi, sehingga dilakukan teknik

analisis yang lebih praktis dan mudah serta dalam waktu relative singkat dengan

menggunakan teknik kromatografi cair.


3

Metode analisis siklamat secara KCKT telah dilakukan oleh Inggris dan

dibakukan dalam British Standard versi EN 1379 : 1996. Di Indonesia sendiri belum

banyak industri maupun laboratorium uji yang menggunakan metode ini dalam

menganalisis siklamat secara kualitatif maupun kuantitatif. Oleh sebab itu untuk

menjamin keabsahan hasil analisis maka metode tersebut harus divalidasi terlebih

dahulu. Validasi merupakan konfirmasi bahwa metode dapat memenuhi persyaratan

tujuan penggunaannya melalui pengujian metode dan mengumpulkan bukti-bukti

yang objektif (Harmita, 2004).

Sebagai tindak lanjut fungsi pengawasan tersebut, maka diperlukan adanya

suatu metode pengujian yang dapat menganalisis kandungan siklamat dalam

berbagai produk terutama produk pangan.

II METODE PENELITIAN

Penelitian ini dilakukan dua tahap pekerjaan, yaitu persiapan analisis dan validasi

metode uji siklamat yang mengacu pada British Standard versi EN 1379 tahun 1996.

Pada validasi ini dilakukan uji selektivitas, linieritas, limit deteksi metode, uji akurasi,

uji presisi serta uji ketegaran.

Bahan dan Peralatan

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah standar natrium siklamat, methanol

HPLC grade, kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4), akuades, akuabides, sample

minuman ringan.

Peralatan yang digunakan adalah KCKT UV, kolom C18, neraca analitik,

peralatan gelas (labu ukur, gelas ukur, corong, pipet mohr, pipet volumetrik, pipet

tetes, dan tabung reaksi), penyaring Millipore, kertas saring, vakum penyaring, bulp

dan sudip.

Prosedur

a. Kondisi HPLC

Kolom: 12 cm x 4.6 mm Nucleosil

Detektor: UV set pada panjang gelombang 200 nm

Volume injeksi: 20 uL

Mobile phase: methanol-kalium dihidrogen fosfat 0.0125 mg/L

(KH2PO4) (3:7)

b. Preparasi standar

Larutan baku diperoleh dengan menimbang sebanyak 100 mg standar Na

siklamat, dimasukkan ke dalam labu 100 mL dan dilarutkan dengan fase

gerak sampai tanda tera, dihomogenkan (larutan mengandung 1000 ppm).

Persiapan standar yang akan digunakan dengan membuat deret standar yang

memiliki konsentrasi 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700,800, 900

dan 1000 ppm. Konsentrasi tersebut diperoleh dengan memipet 0.1, 0.25, 0.5,


4

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, dan 10 mL larutan baku standar siklamat 1000 ppm

masing-masing dilarutkan dengan menggunakan fasa gerak hingga batas tera

dan dihomogenkan.

c. Preparasi Sample

Ditimbang kurang lebih 0.5 gram sample kemudian tambahkan larutan fase

gerak hingga tanda batas, dihomogenkan dan disaring. Filtrat yang dihasilkan

kemudian dimasukkan ke dalam vial. Larutan siap untuk diinjeksikan.

Validasi Metode

Beberapa aspek yang diukur dalam validasi metode adalah selektivitas, linieritas,

presisi, akurasi, limit deteksi dan uji ketegaran. Penetapan selektivitas dilakukan

dengan membandingkan kromatogram standar yang dihasilkan dengan blanko.

Sedangkan uji linieritas diperoleh dari data pengukuran larutan deret standar yang

telah dibuat sehingga diperoleh kurva kalibrasi dan persamaan regresinya. Uji presisi

dilakukan dengan cara pengulangan (repeatability) 7 kali larutan contoh yang di buat

sesuai prosedur yang diinjekkan pada hari yang sama sehingga diperoleh data yang

akan dinyatakan nilai presisinya sebagai simpangan baku relative (% SBR). Uji

akurasi (uji perolehan kembali) dilakukan dengan membuat larutan sample sesuai

prosedur diulangi sebanyak 7 kali dan masing-masing diinjekkan ke dalam alat KCKT.

Nilai akurasi dinyatakan sebagai % recovery. Pengukuran limit deteksi dilakukan

dengan mengolah data yang diperoleh dari hasil pengukuran linieritas standar

sehingga diperoleh nilai Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantitation (LOQ).

Nilai tersebut dijadikan dasar dalam menentukan limit deteksi metode (LDM).

Kemudian dilakukan uji ketegaran yang dilakukan dengan memvariasikan komposisi

fasa gerak yang digunakan yaitu 70:30 sebagai control, 60:40 dan 80 :20.

III HASIL DAN PEMBAHASAN

Pengujian zat aditif di dalam suatu produk, terutama pangan bersifat amat krusial,

guna menjamin keamanan penggunaan produk. Anaisis ini harus menghasilkan data

yang benar mengenai kandungan analit dalam produk. Selain itu metode yang

digunakan dalam pengujian harus dapat diandalkan sehingga dapat menjamin

kebenaran data yang diperoleh.

Metode uji yang diadopsi berprinsipkan pada serapan molekuler siklamat

terhadap cahaya UV pada daerah panjang gelombang 200 nm, pemisahan analitik

melalui kolom C18 menggunakan fasa gerak (mobile phase) KH2PO4 0.0125 mg/L

dan methanol HPLC grade dengan perbandingan (70:30) dengan laju alir 1 mL/menit.

Dan alat yang digunakan adalah KCKT dengan detektor UV.


5

IV VALIDASI METODE

Kehandalan suatu metode yang digunakan dapat ditentukan dari Beberapa faktor

antara lain, akurasi, presisi dan limit deteksi. Dalam penelitian ini dilakukan

parameter-parameter yang meliputi, selektivitas, linieritas, limit deteksi metode

presisi, akurasi dan uji ketegaran.

Selektivitas

Selektivitas dilakukan dengan membandingkan kromatogram standar dengan blanko.

Hasil penelitian menunjukkan dari hasil penginjekkan standar muncul peak area

pada retention time (RT)/waktu retensi 4 menit. Sedangkan pada larutan blanko tidak

terdapat peak yang dihasilkan. Sehingga dapat disimpulkan bahwa peak yang

diperoleh pada waktu retensi 4 menit tersebut merupakan senyawa siklamat.

Gambar kromatogram uji selektivitas dapat dilihat pada Gambar 1 berikut ini.

Gambar 1 Kromatogram Uji Selektivitas Standar Siklamat

Linieritas Standar

Nilai koefisien korelasi (R) merupakan indikator kualitas dari parameter linieritas yang

menggambarkan proposionalitas respon analitik (luas area) terhadap konsentrasi

yang diukur.

Berdasarkan data evaluasi kalibrasi deret standar siklamat pada level konsentrasi

antara 10.8 mg/L sampai 1018 mg/L diperoleh persamaan regresi linier y = 150.59x

– 913.2 dengan nilai koefisien korelasi sebesar 0.9997. Nilai koefisien yang diperoleh

menunjukkan hasil yang baik karena mendekati nilai 1. Hal ini menginformasikan

bahwa terdapat hubungan yang proporsional antara respon analitik dengan

konsentrasi yang diukur. Dari hasil uji linieritas dapat dilihat kurva deret standar pada

Gambar 2 berikut ini.


6

Gambar 2 Kurva Deret Standar Siklamat

Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi

Pembahasan limit deteksi dan limit kuantitasi tidak dapat dipisahkan karena diantara

keduanya terdapat hubungan yang sangat kuat. Secara praktis cara evaluasi

keduanya dapat dikatakan tidak ada perbedaan yang signifikan. Perbedaan diantara

keduanya hanya pada sifat kuantitatif data yang diperoleh. Jika pada limit deteksi

didefinisikan sebagai konsentrasi terkecil yang dapat dideteksi namun tidak perlu

secara kuantitatif, sedangkan pada definisi limit kuantitasi dikatakan konsentrasi

terkecil analit yang dapat diukur secara kuantitatif. Secara statistik perhitungan batas

deteksi dan batas kuantitasi diperoleh melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi

standar siklamat. Dari hasil perhitungan diperoleh nilai limit of detection (LOD)

sebesar 24.8 mg/L dan limit of quantitation sebesar 82.5 mg/L.

Presisi (Keterulangan)

Uji presisi dilakukan untuk melihat kedekatan antara hasil uji yang dilakukan secara

berulang pada sample. Pengujian dilakukan dengan metode ripitabilitas

(pengulangan) sehingga diperoleh ketepatan system dalam memberikan respon

terhadap analit yang dideteksi. Sebagai syarat keberterimaan digunakan persamaan

koefisien variasi Horwitz sesuai AOAC (Association of Official Analytical Chemist,

2005) yang menjadi acuan dalam penelitian ini. Presisi suatu metode dikatakan

memenuhi syarat keberterimaan jika nilai %RSD lebih kecil dari 2/3CVHorwitz. Uji

presisi dilakukan dengan menginjekkan larutan sebanyak 7 kali. Berdasarkan hasil

penelitian diperoleh nilai %RSD untuk uji presisi sebesar 3.03 %. Nilai tersebut

memenuhi persyaratan AOAC ≤2/3 CVHorwitz 3.73 %. Hal ini menginformasikan

bahwa system operasional alat dan analis memiliki nilai presisi yang baik terhadap

metode dengan respon yang relative konstan, sehingga hasil pengukuran memiliki

nilai presisi yang memenuhi persyaratan. Data uji presisi dapat dilihat pada Tabel 1

berikut ini


7

Tabel 1 Data Hasil Uji Presisi

Akurasi

Berbeda halnya dengan presisi yang merujuk pada pengertian ketelitian, akurasi

merujuk pada pengertian ketepatan (kecermatan). Hasil evaluasi menunjukkan

bahwa metode terpilih memiliki kisaran % perolehan kembali (% recovery) yang

menyatakan tingkat akurasi yang memenuhi syarat keberterimaan. Nilai recovery

yang mendekati 100% menunjukkan bahwa metode tersebut memiliki ketepatan

yang baik dalam menunjukkan tingkat kesesuaian dari rata-rata suatu pengukuran

yang sebanding dengan nilai sebenarnya (true value). Hasil uji akurasi dapat dilihat

pada Tabel 2 berikut.

Tabel 2 Data Hasil Uji Akurasi

Pada Tabel 2 diperoleh % recovery berada pada rentang 86 – 109% dengan

rata-rata % recovery 101%. Nilai recovery hasil pengujian menunjukkan

kecenderungan terjadinya kesalahan acak, dimana nilai % recovery yang dihasilkan

berada dibawah dan diatas 100%. Sumber kesalahan acak yang terjadi pada praktek

disebabkan adanya senyawa lain yang ada pada matriks yang masih terbawa

Jumlah

Replikat Parameter uji

Area

Sample Hasil (mg/L)

1 66222 1009.67

2 69579 1071.98

3 70889 1079.33

4 70821 1087.92

5 71159 1094.27

6 72135 1100.73

7

SIKLAMAT

72842 1106.86

Rata-rata 1078.68

SD 32.70

%RSD 3.03

CVHorwitz 5.59

2/3CVHorwitz 3.73

Replikat Konsentrasi

Praktis (x)

Konsentrasi

teoritis (µ) %Recovery

1 217.03 198.89 109

2 216.20 198.73 109

3 186.55 197.10 95

4 206.88 199.37 104

5 171.65 198.89 86

6 210.16 198.67 104

Rata-rata 201.41 198.67 101


8

meskipun telah dilakukan penyaringan. Senyawa ini menyebabkan analisis

terganggu, sehingga konsentrasi yang terukur oleh alat sebagian lebih tinggi dan

sebagian lebih rendah dari 100%. Kesalahan acak tersebut dapat diminimalisasi

dengan melakukan sonikasi terhadap larutan uji pada rentang waktu tertentu.

V LIMIT DETEKSI METODE

Limit deteksi metode (LDM) adalah konsentrasi terendah yang terbaca dari

pengukuran suatu sample dengan mengasplikasikan secara lengkap metode

pengukuran sample tersebut, sehingga nilai yang diperoleh memenuhi criteria cermat

dan seksama. Nilai LDM diperoleh dari hasil percobaan dengan melakukan secara

langsung konsentrasi analit terendah yang diperkirakan sebagai limit kuantitasi.

Setelah dilakukan pengujian diperoleh hasil konsentrasi terendah yang terdeteksi

oleh alat sebesar 154 ppm.

Nilai konsentrasi praktis menyatakan nilai terendah yang dapat terkuantitasi

serta memenuhi criteria cermat dan seksama oleh metode yang digunakan, dengan

nilai SBR sebagai indikator kualitas presisi (cermat) sebesar 1.52% dan nilai

recovery sebagai indicator kualitas akurasi (seksama) berkisar antara 94.16% -

98.68%. Hasil pengukuran dapat dilihat pada Tabel 3 berikut ini

Tabel 3 Data Hasil Uji Limit Deteksi Metode (LDM)

Jenis Sample Replikat Luas

Area

Konsentrasi

Praktis Analit

dalam Contoh

Konsentrasi

Teoritis Analit

dalam Contoh

%Recovery

1 0 0 0 0 Sirup IC

2 0 0 0 0

1 5567 157.67 159.78 98.68

2 5452 154.71 160.13 96.62

3 5344 150.32 158.77 94.68

4 5451 154.25 159.68 96.60

5 5428 153.99 160.09 96.19

6 5499 155.66 159.71 97.46

7 5471 155.29 160.16 96.96

Spike

8 5344 151.45 159.97 94.68

Rata-rata 5445 154.17 159.79 96.48

SD 2.34

SBR 1.54

CVHorwitz 7.495

2/3CVHorwitz 4.997


9

VI KESIMPULAN DAN SARAN

1. Metode HPLC dapat digunakan untuk penetapan siklamat sebagai metode

standar.

2. Limit deteksi pada metode ini adalah 24.8 mg/L, sedangkan limit kuantitasi

adalah 154 mg/L.

3. Untuk mengantisipasi maksimum limit siklamat dalam produk pangan, dan

mempermudah dalam analisis maka metode ini perlu terdaftar dalam Standar

Nasional Indonesia.

4. Metode standar yang digunakan dalam penelitian ini perlu disosialisasikan

kepada laboratorium lain.

VII DAFTAR PUSTAKA

1. AOAC. 2005. Official Method of Analysis of the Association of Official

Analytical Chemist. Benyamin Franklin Station. Washington, D.C

2. Badan POM. 2004. Peraturan Teknis Penggunaan Bahan Tambahan Pangan

Pemanis Buatan dalam Produk Pangan. Direktorat Standarisasi Produk

Pangan, Deputi Bidang Pengawasan Keaman Pangan dan Bahan Berbahaya.

p : 34-36

3. British Standard International. Foodstuffs-Determination of cyclamate and

saccaharin in liquid table top sweetener preparations-Method by high

performance liquid chromatography EN. 1379 : 1996. Europian comitte for

standardization

4. Chan, C.C. et al. 2004. Analytical Method Validation and Instrument

Performance Verification. Willer Interscience. New Jersey

5. Farida, I. 1989. Status Siklamat Dewasa Ini. Warta AKAB, Vol I (2). Akademi

Kimia Analisis. Bogor. p : 49-50

6. Furia, T.E. 1980. CRC Handbook of Food Additives. 2nd Edition. Boca Raton :

CRC Press Inc

7. Harmita. 2004. Majalah Ilmu Kefarmasian UI. FMIPA UI. Jakarta

8. Johnson, E.L dan Stevenson, R. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Penerjemah:

Kosasih Padmawinata. Bandung. Penerbit ITB

9. Leo M. L. Nollet, 1996. Handbook of Food Analysis. Marcell Decker. New York.

10. Miller, J.C. dan J.N. Miller. 1991. Statistika Untuk Kimia Analisis.

Diterjemahkan oleh Drs. Suroso M.Sc. Bandung. Penerbit ITB

11. Mitchell, 2006. Sweeteners and Sugar Alternative in Food Technology.

Victoria, Autralia. Blackwell Publishing. p : 32; 118; 122-123

12. Nabors, Lyn O. dan Robert C, Gelardi. 1991. Alternative Sweeteners. Marcel

Dekker, Inc. New York

13. Prosiding. 1997. Seminar Nasional Kimia II Peran Kimia Organik dalam Era

Industri Kimia Indonesia. FMIPA UGM. Yogyakarta


10

14. Siagian, Albiner. 2002. Bahan Tambahan Makanan. USU Digital Library.

Medan

15. Skoog, Douglas A. Dan James J, Leary. 1992. Principles of Instrumental

Analysis. New York. Saunders College Publishing

16. Sumardi. 2002. Validasi Metode Pengujian. Pusat Standardisasi dan

Akreditasi Sekretariat Jenderal Pertanian. Jakarta

17. USP. 1995. United States Pharmacopeia Convention, Inc. Twinbrook Park

Way Rockville. USA

18. Winarno, F.G. dan A.T. Birowo. 1988. Gula dan Pemanis Buatan di Indonesia.

Sekretariat Dewan Gula Indonesia. Jakarta

Validasi Metode Analisis Penetapan Kadar Senyawa Siklamat Dalam Minuman Ringan

Documents

Transcript of Validasi Metode Analisis Penetapan Kadar Senyawa Siklamat Dalam Minuman Ringan