Parameter Validasi

04/12/23

Parameter Validasi Unjuk Kerja Metode

• Konfirmasi identitas, selektifitas, spesifisitas

• Sensitivitas

• Limit deteksi dan Limit kuantitasi

• Daerah linier pengukuran (linieritas)

• Daerah kerja

• Repeatability dan Reproducibility

• Akurasi (ketepatan, accuracy) dan Kebenaran (trueness); Perolehan kembali (recovery)

• Ruggedness/Robust-ness metode

• Ketidakpastian (uncertainty)

04/12/23

1. Konfirmasi Identitas :

• Meyakinkan bahwa isyarat yang dihasilkan pada pengukuran hanya berasal dari analit bukan berasal dari senyawa lain atau

• bukan merupakan campuran isyarat dari analit + senyawa lain yang mempunyai sifat fisika/kimia serupa dengan analit yang ditetapkan

04/12/23

Spesifisitas & Selektivitas

• Metode yang spesifik adalah metode yang memberikan respon terhadap satu komponen tunggal

• Metode selektif adalah metode yang memberikan respon untuk sejumlah komponen yang dapat atau tidak dapat dibedakan satu sama lain

04/12/23

Spesifisitas dan selektivitas :

• Spesifisitas berarti prosedur mampu mengukur analit yang dinginkan dengan akurat tanpa terganggu oleh komponen matriks dalam sampel

• Selektivitas; yang mengukur sejauh mana zat lain bisa mengganggu pengujian analit x atau sejauh mana metode mampu menguji analit x dalam campuran tanpa mengalami gangguan zat lain dalam campuran

04/12/23

Senyawa pengganggu dapat menghambat konfirmasi melalui cara :

• Mendistorsi isyarat yang timbul dari analit• Memperbesar konsentrasi analit karena turut

memberikan kontribusinya pada isyarat analit• Memperkecil konsentrasi analit karena

memberikan kontribusinya berupa isyarat negatif• Mempengaruhi kemiringan kurva kalibrasi• Tidak efektifnya tahap isolasi (pemurnian analit

dalam sampel)

04/12/23

Spesifisitas (spesificity) :

• Kemampuan metode itu dalam mendeteksi hanya satu senyawa dalam contoh yang dianalisis, meskipun matriks contoh tersebut sangat kompleks

• Lakukan analisis blanko dan contoh yang telah diketahui kandungan analitnya.

04/12/23

04/12/23

Selektivitas :• Metode dapat memberikan respon terhadap beberapa

kandungan kimia yang bisa atau tidak bisa dibedakan satu sama lain atau;

• Menunjukkan derajat bebasnya metode analisis dari spesies atau konstituen lain dalam matriks contoh, karena tidak ada metode analisis yang betul-betul bebas dari pengaruh spesies atau konstituen lain, maka perlu diambil langkah-langkah untuk memperkecil pengaruh dari pengganggu tersebut.

• Jika respon dapat dibedakan dari respon yang lain, maka metode dikatakan selektif.

• Kemampuan metode untuk mengukur secara tepat analit dengan adanya interferensi

Ilustrasi Selektivitas :Dalam contoh/sampel terdapat analit A, spesies B dan C yang

perpotensi mengganggu pengukuran A.. Bila cA ; cB ; dan cC menyatakan konsentrasi masing-masing spesies, serta mA; mAB ; mC adalah slope (sensitivitas kalibrasi), maka respon (signal)- total yang diberikan instrumen sebagai berikut :Y = S Total = mAcA + mBcB + mCcC + Sblanko

Koefisien selektifitas (k) dinyatakan dengan persamaan sbb ;Spesies B : kB.A = mB/mA ; mB = kB..A .mA

Spesies C : kC.A = mC/mA ; mC = kC.A .mA

S Total = mAcA + kB..A .mA cB + kC.A .mA cC + Sblanko

STotal = mA(cA + kB..A .cB + kC.A .cC )+ Sblanko

jika k = 0 , maka spesies lain tidak mengganggujika k ≥ 1 , maka spesies lain mengganggukoefisien selektifitas harganya negatif, bila gangguan spesies lain menyebabkan pengurangan dalam intensitas signal yang berasal dari analit.

04/12/23

2. Sensitivitas /kepekaan Metode Analisis:• Menunjukkan kemampuan dari metode atau instrumen

dalam membedakan konsentrasi-konsentrasi suatu anali yang perbedaannya kecil.

• Ukuran kualitas metode yang menggambarkan kemampuannya untuk mendeteksi adanya suatu komponen (analit) dalam contoh yang dianalisis

• Ratio antara perubahan respons alat ukur terhadap perubahan konsentrasi analit yang diukur.

• Sensitivitas dibedakan menjadi :

- sensitivitas kalibrasi (IUPAC) adalah Slope = m dari kurva kalibrasi pada konsentrasi yang diinginkan.

- sensitivitas analitik; merupakan nilai yang tergantung pada simpangan baku hasil analisis tidak

tergantung pada satuan signal atau respon alat.

Sensitivitas Kalibrasi :• Sensitivitas kalibrasi (IUPAC) adalah Slope = m dari

kurva kalibrasi pada konsentrasi yang diinginkan

S = mc + Sbl

• Bila grafiknya linier dan memiliki persamaan y = bx + a, maka sensitivitasnya adalah b = (y-a)/x

• Bila a = 0 (grafik melewati titik nol, maka sensitivitasnya b = y/x atau respons alat ukur dibagi dengan konsentrasi analit

04/12/23

Ilustrasi :

04/12/23

Sensitivitas Analitik :• Sensitivitas analitik ; nilainya tergantung pada simpangan

baku hasil-hasil analisis, tetapi tidak tergantung pada satuan signal atau respon alat dan tidak peka terhadap faktor-faktor pembesaran.

• Sensitivitas analitik : ժժ = m/SD(Signal)

Keterangan :

m = slope = sensitivitas kalibrasi

SD(Signal) = simpangan baku signal

04/12/23

Ilustrasi : Sensitivitas analitik tidak peka terhadap faktor pembesar dapat ditunjukkan dengan hasil berikut ini :

04/12/23

Karena peningkatan nilai Sensitivitas kalibrasi (m), diikuti dengan peningkatan nilai simpangan baku signal dengan faktor 2x, maka nilai sensitivitas analitik tetap.

Ilustrasi : Penetapan analit – A dalam air dengan instrumen diperoleh data sebagai berikut :

04/12/23

Prosedur Kerja SensitivitasLangkah – langkah:

• Pilih larutan standar yang nilai konsentrasinya berada di daerah tengah kurva kalibrasi (daerah linier pengukuran)

• ukur serapan-masuknya (absorbans) sebanyak 10 kali

• Hitung absorbansi rata-rata dan menghitung nilai sensitifitasnya dengan menggunakan rumus berikut:

• Bandingkan dengan sensitivitas yang ada pada manual book batas keberterimaan sensitifitas adalah sensitifitas hasil percobaan harus lebih kecil sama dengan 1,25 sensitivitas yang ada pada manual book

04/12/23

3. LIMIT DETEKSI• Limit deteksi (LD) menurut Greenberg, A.E dkk adalah

konsentrasi terendah dari analit yang dapat dideteksi diatas noise atau blangko dalam suatu prosedur analisis untuk confidence limit tertentu. Confidence limit perlu ditentukan agar kesalahan deteksi dan tidak terdeteksi peluangnya kecil yaitu maksimum 5%.

• Menurut Greenberg, A.E dkk , beberapa istilah yang digunakan untuk menyatakan Limit deteksi khusus sbb :- IDL (Instrument Detection Limit)- LLD (Lower Limit of Detection)- MDL (Method Detection Limit)- LOQ (Limit of Quantitation)

Seringkali IDL digunakan sebagai pedoman untuk menetapkan MDL. Hubungan antara Limit-Limit tersebut seperti berikut :

IDL : LLD : MDL : LOQ = 1 : 2 : 4 : 10

04/12/23

Limit deteksi analisis untuk analisis kualitatif :

• Ukur blanko yang ditambahi analit dengan berbagai konsentrasi yang berbeda, dimana untuk masing-masing konsentrasi 10 buah, semua diukur @ 1 kali

• Tentukan tingkat konsentrasi di bawah mana identifikasi analit menjadi kurang andal

04/12/23

LOD untuk analisis kualitatif

• Kons analit Replikasi Hasil +/- (mg/L) analisis

200 10 10/0 100 10 10/0 75 10 5/5 50 10 1/9 25 10 0/10

Di bawah konsentrasi 100 mg/L identifikasi yang positif menjadi kurang andal

04/12/23

Instrument Detection Limit

• Sinyal terkecil yang dapat diukur secara kuantitatif

• Ditentukan untuk setiap analit dengan analisis replikat

• Konsentrasi analit yang menghasilkan signal yang setara dengan 3 kali standar deviasi (n=10) dari pengukuran blanko pereaksi

• Jika blanko menghasilkan signal : IDL = μ + 3SD• μ = nilai rata-rata pembacaan dari blanko pereaksi

yang sama

04/12/23

0.25 ppb mix 15.1

7.00 8.00 9.00Time50

100

%

010115_19 Sm (SG, 2x2) 2: MRM of 5 Channels ES+ 262.12 > 160.02

654Area

8.1129

0.25 ppb mix 15.1

1.50 2.00 2.50 3.00 3.50Time67

100

%


523Area

2.1014

3.2911

0.25 ng/mL std

0.5 ng/mL std0.5 ppb mix 15.1

1.50 2.00 2.50 3.00 3.50Time61

100

%


541Area

2.1426

DanofloxacinOxolinic Acid

Instrument Detection Limit

IDL 0.24 ng/mL) IDL 0.30 ng/mL)

0.5 ppb mix 15.1

7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50Time37

100

%


845Area

8.1137

04/12/23

• Jika blanko tidak menghasilkan signal dan standar deviasi 10 kali pengukuran blanko yang sama nol, maka IDL diukur menggunakan suatu standar

• Konentrasi analit yang menghasilkan signal yang setara dengan 3 kali standar deviasi dari signal terendah yang dapat diukur dari analit

04/12/23

Cara Pengukuran :

• Yang diuji : 10 blanko contoh yang berbeda diukur @ 1 kali 10 blanko contoh ditambah (spiked) analit

berkonsentrasi rendah diukur @ 1 kali

• Yang dihitung : Standar deviasi

LOD = (konsentrasi analit yang sesuai dengan nilai rata-rata) + 3 SD

04/12/23

Limit Kuantitasi/perhitungan (LOQ), Limit of determination, Limit of Reporting/pelaporan (LOR) :• Konsentrasi terendah analit yang dapat ditentukan dengan

akurasi yang bisa diterima• Ada konvensi yang menyatakan bahwa LOQ = blanko

contoh + 5 sd (atau 6 sd atau 10 sd)• Batas terendah dari working range metode• Nilai SD juga menyatakan ripitabilatas untuk konsentrasi

analit yang bersangkutan analit• 10 blanko contoh yang berbeda diukur @ 1 kali• Hitung standar deviasi blanko contoh• LOD = konsentrasi analit yang sesuai dengan nilai rata-

rata blanko contoh + 5 SD (atau 6SD atau 10 SD)

04/12/23

Method Detection Limit (MDL) Konsentrasi terkecil analit yang diinginkan setelah melalui metode

analisis secara lengkap. Nilainya akan lebih besar dari limit deteksi terendah

Konsentrasi terbaik dari analit yang dapat dideteksi atau dapat menghasilkan respon yang nyata dibanding blanko

Tergantung matriks Dinyatakan untuk masing-masing matrik Analisis replikat dari 7 sampel yang dispike pada satu konsentrasi

tertentu. Konsentrasi standar spike kira-kira sama dengan 5 kali IDL dibagi faktor konsentrasi metode

MDL = rata-rata konsentrasi blanko + (t x SDsampel)

04/12/23

Linieritas

• Kemampuan suatu metode analisis untuk menghasilkan hasil yang proposional dengan konsentrai analit dalam contoh pada kisaran yang ada.

• Mengetahui kemampuan standar dalam mendeteksi analit dalam contoh

04/12/23

• Uji ini dilakukan dengan suatu seri larutan baku yang terdiri dari minimal 5 konsentrasi yang menaik dengan rentang 50 – 100% dari rentang komponen uji

• Diharapkan respon liner terhadap konsentrasi larutan baku dengan nilai koefisien korelasi mendekati 1,00

04/12/23

Working range dan linear range

• Rentang kerja suatu metode analisis adalah interval antara konsentrasi tinggi dan rendah yang telah dianalisis/diuji dengan presisi, akurasi dan linieritas dengan menggunakan kondisi metode yang dievaluasi

• Dalam analisis kuantitatif dimulai dari LOQ (batas terbawah) dan batass respon alat (batas tertinggi)

• Di dalam batas rentang kerja ini ada linear range : bagian yang linier dapat diamati secara visual

04/12/23

• Distribusi yang random dari garis lurus merupakan konfirmasi linieritas

• Trend yang sistematik menunjukkan non linearitas

04/12/23

Analisis 1

• Blanko + bahan acuan atau blanko contoh yang kedalamnya ditambahkan analit dengan berbagai konsentrasi berbeda. Diperlukan sedikitnya 6 konsentrasi + blanko

• Pengulangan 1 x

• Plot respon pengukuran (sumbu y) terhadap konsentrasi yang diukur (sumbu x)

• Amati secara visual dan identifikasi daerah pengukuran yang linier batas atas bawah dari daerah kerja

• Dari pengerjaan ini akan didapat konfirmasi visual apakah daerah kerja itu linier atau tidak

04/12/23

Analisis 2

• Bahan acuan atau blanko contoh yang kedalamnya ditambahkan analit pada sekurang-kurangnya 6 konsentrasi berbeda pada daerah kerja yang linier

• Pengulangan 3X

• Plot respon pengukuran (sumbu y) terhadap konsentrasi (sumbu x). Secara visual amati outlier yang tidak tergambarkan pada regresi

• Hitung koefisien regresi. Hitung dan plot reside value (perbedaan antara nilai yang sebenarnya dengan nilai yang diprediksi oleh garis lurus untuk setiap harga x

• Tahap ini diperlukan untuk menguji daerah kerja yang linier dan pada daerah mana dapat digunakan kalibrasi titik tunggal

04/12/23

Presisi :

• Kedekatan atau kesesuaian antara hasil uji dengan lainnya pada serangkaian pengujian

• Teliti ----- perbedaan hasil uji satu dengan yang lainnya sangat kecil

• Mengukur sebaran serangkaian hasil uji• Menerangkan bagaimana anggota kelompok

menyebar diantara nilai yang benar• Dipengaruhi oleh kesalahan acak: ketidakstabilan

instrumen, variasi suhu/pereaksi, keragaman teknik, operator yang berbeda

04/12/23

Presisi :

• Kedekatan beberapa nilai pengukuran dari sampel yang homogen pada kondisi normal (sampel yang sama dan diuji secara berurutan)

• Terbagi : Repeatability, intermediate precision dan reproducibility

04/12/23

Repeatability/ripitabilitas:

• Within lab.precision

• Melihat konsistensi analis, tingkat kesulitan metode, kesesuaian metode dan contoh uji.

• Presisi yang mengukur keragaman nilai hasil uji yang dilakukan pada kondisi operator, alat, sample, lab yang sama dalam interval pemeriksaan waktu yang singkat

04/12/23

Intermediate Precision/Presisi antara (Rw):• Memastikan bahwa dalam laboratorium yang sama metode

akan menyediakan hasil yang sama • Untuk mengevaluasi kinerja operator, mengetahui dan

meningkatkan mutu lab dan mengetahui tingkat kesulitan metode

• Variasi pengukuran dengan waktu yang lebih lama dan ditentukan dengan membandingkan hasil antara metode yang dilakukan di lab.yang sama

• Hasil presisi dengan cara mengulang pemeriksaan dengan menggunakan alat yang berbeda, operator yang berbeda, hari yang berbeda, standar dan pereaksi dari suplier berbeda atau kombinasi di atas pada lab yang sama

04/12/23

Reproducibility/reprodusibilitas:

• Between lab precision• Memastikan bahwa metode menyediakan hasil

yang sama di lab. yang berbeda• Mengetahui kehandalan/kinerja lab• Presisi yang mengukur keragaman nilai hasil uji

dari sampel yang sama pada kondisi operator, peralatan, lab dan waktu yang berbeda

• Validasi reprodusibilitas penting dilakukan jika metode akan digunakan di lab yang berbeda

04/12/23

Faktor yang mempengaruhi Reprodusibilitas

• Perbedaan suhu kamar dan kelembaban• Operator dengan pengalaman dan

pengetahuan berbeda• Peralatan dengan karakteristik berbeda• Variasi bahan dan kondisi instrumen• Umur pakai alat yang berbeda• Pelarut, pereaksi dan bahan lain dengan

mutu berbeda

04/12/23

Pengukuran

• Yang diuji : standar , reference material, atau blanko

contoh yang ditambah analit dengan berbagai konsentrasi

• Analisis 10 x • Yang dihitung : hitung standar deviasi standar (SD) pada

masing-masing konsentrasi, lalu RSD

04/12/23

Akurasi :

• Menunjukkan kedekatan antara hasil percobaan dengan nilai sebenarnya (true value)

• Mengukur kesesuaian antara hasil dan nilai sebenarnya

• Menggambarkan kesalahan sistematis

04/12/23

Asesmen akurasi hasil analisis

• Hasil analisis harus dibandingkan dengan nilai sebenarnya• Dalam praktek, CRM memiliki nilai yang tertelusur ke SI

dan dapat dijadikan sebagai nilai acuan (refrence value) untuk nilai yang sebenarnya

• Syarat CRM yang digunakan : matriks cocok dengan contoh uji (memiliki komposisi matriks yang mirip matriks contoh uji)

• Bagaimana bila CRM tidak tersedia ? : Gunakan bahan yang mirip contoh uji, yang diperkaya (spiked) dengan analit yang kemurniannya tinggi, lalu diuji % recoverynya

04/12/23

Pendekatan :

• Menganalisis contoh yang sudah diketahui konsentrasinya lalu dibandingkan nilai yang terukur dengan nilai yang sebenarnya

• Membandingkan hasil tes dari metode baru dengan hasil metode alternatif yang sudah ada dan diketahui bahwa metode tersebut akurat

• Menambahkan analit ke dalam matriks blanko yang kemudian diukur % recovery

• Adisi standar yang dapat menentukan % recovery dari analit yang ditambahkan

04/12/23

Bias Metode:

• Yang diuji :

blanko reagen dan CRM masing-masing dianalisis 10 kali memakai metode yang divalidasi

• Yang dihitung :

Hasil rata-rata CRM dikoreksi hasil rata-rata blanko reagen

Bias penyimpangan metode :

hasil rata-rata CRM – nilai sertifikat

04/12/23

Trueness dan Bias

• Trueness (akurasi rata-rata) : kedekatan antara nilai rata-rata yang diperoleh dari serangkaian hasil pengujian dengan nilai acuan

• Adanya penyimpangan nilai rata-rata hasil pengukuran dari nilai sebenarnya disebabkan adanya bias

• Bias : perbedaan hasil analisis rata-rata dengan nilai acuan

04/12/23

Prosedur:

• Diperiksa larutan standar dengan konsentrasi tertentu sebanyak 7 x ( A)

• Diperiksa larutan standar dengan konsentrasi tertentu + placebo sebanyak 7 x (B)

• Nilai rata-rata, SD, RSD• Bias : A – B x 100 %

A

Nilai keberterimaan : bias -2.0 % s.d + 2,0 %

04/12/23

Data Reliability -

Accuracy versus Precision

Data Reliability -

Accuracy versus Precision

accuracy precision accuracy &precision

04/12/23

13

12

10

8

7

3SD

2SD

Mean

2SD3SD

Control chart of laboratory control samples analysed over a period of time

Rules for control chartsMethod is “out of control” if:(a) one point lies outside 3 from mean(b) two consecutive points lie outside 2(c) seven consecutive points are ascending or descending

CONTROL CHARTS

04/12/23

04/12/23

Uji Recovery

• Analit yang terkait dalam matriks contoh harus dilarutkan/diekstraksi/dibebaskan sebelum dapat diukur

• Agar hasil pengujian akurat maka efisiensi pelarutan/ekstraksi harus 100%

• Analit tidak boleh hilang selama proses• Uji ini dilaukan dengan mengerjakan pengujian

atas contoh yang diperkaya (spike) dengan sejumlah kuantitatif analit yang akan ditetapkan

04/12/23

Cara Pengukuran :

• Mula-mula contoh diuji dan hasil pengujian = C2

• Kepada contoh yang sama ditambahkan (spiking) sejumlah analit yang diketahui banyaknya, misalnya konsentrasi = C3, lalu dilakukan pengujian dengan hasil C1

• Analit yang diperoleh kembali = (C1 – C2) dari banyaknya yang ditambahkan (C3)

• Nilai perolehan kembali (%) = C1 – C2 x 100 C3

• Apabila dalam pengujian ini tidak ada kesalahan sistematik maka recovery tidak akan berbeda secara signifikan dari 100%

04/12/23

Ruggedness/Robustness metode :• Ukuran bagi suatu metode analisis dalam mempertahankan unjuk kerjanya dalam situasi

dimana pengaturan kondisi analisis tidak sesempurna seperti yang ditetapkan dalam metode yang bersangkutan

• Dalam metode analisis ada tahap-tahap kritis dimana bila tidak dikerjakan secara hati-hati akan menimbulkan kesalahan yang besar

• Dilakukan dengan memvariasikan kondisi analisis sedemikian rupa dan mengukur pengaruhnya terhadap presisi dan akurasi yang dicapai. Setiap perubahan kondisi dilakukan 2 kali analisis saja

• Membantu dalam mengantisipasi dan mengeliminasi sumber kesalahan yang mungkin

• Mendemonstrasikan bahwa metode stabil terhadap perubahan kondisi metode yang kecil

• Plackett Burman Method Design

04/12/23

• Ketahanan suatu metode terhadap perubahan kecil dari kondisi pada prosedur, misalnya :stabilitas larutan analit, waktu ekstraksi, perbedaan kolom, perubahan temperatur

04/12/23

Validasi metode bermanfaat untuk menetapkan :Instrumen :• IDL untuk semua analit• Ripitabilitas instrumen• Sensitivitas instrumen : linieritas (atau

sensitivitas) standar • Rentang kalibrasi instrumen• Presisi : ripitabilitas standar atau

reprodusibilitas standar

04/12/23

Metode :• MDL untuk semua analit dalam semua

matriks• Akurasi• Ruggedness atau robustness metode• Presisi dengan operator yang berbeda• Ripitabilitas sampel• Selektivitas atau spesipisitas metode• Ketidakpastian

Parameter Validasi

Documents

Transcript of Parameter Validasi