Validasi Metode Analisis Mikrobiologi

• Definisi :

Validasi Metode Analisis adalah proses pembuktian atau konfirmasi pengujian yang obyektif di Laboratorium, dan bahwa metode itu memenuhi persyaratan yang telah ditentukan, yang sesuai dengan tujuan penggunaannya

Tujuan :

• Mengevaluasi kinerja metode : kepekaan, selektivitas, akurasi, presisi, dll., sekaligus

menguji kelemahan dan keterbatasan metode

• Menguji faktor-faktor yang dapat mempengaruhi kinerja metode dan mengetahui besarnya pengaruh itu terhadap hasil analisis

• Melakukan verifikasi atau membuktikan kinerja metode analisis baku yang

diadopsi/digunakan laboratorium

Syarat :

• Menggunakan instrumen dan peralatan yang terkalibrasi

• Dilaksanakan oleh pesonel yang kompeten

Jenis Validasi Metode

• Validasi primer dilakukan jika laboratorium menggunakan metode

analisis “baru” hasil pengembangan , atau metode yang di modifikasi terhadap suatu

metode standard.

• Validasi sekunder dilakukan untuk verifikasi, jika laboratorium menggunakan

atau mengadopsi metode standard yang telah divalidasi.

Parameter Validasi metode analisis mikrobiologi

• Akurasi – Kecermatan

• Presisi ( repeatability, reproducibility dan intermediate precision) – Keseksamaan

Evani Nurbaeti

3A

PMKL

• Sensitivitas – Kepekaan

• Selektivitas dan Spesifisitas

• Linearitas

• Rentang Hitung yang diterima ( acceptable ) (batas atas dan batas bawah dari rentang perhitungan)

• Robustness (Ketangguhan) metode

Pedoman Validasi

• The United States Pharmacopeia (USP) 27, 2004

• International Conference on Harmonization, 1996

• Method Validation of Microbiological Methods, guidance note : C & B and ENV 002, Singapore Accreditation Council, July 2002.

• Water quality – Guidance on Validation of Microbiological Methods, Technical Report, ISO/TR 13843 : 2000.

• Procedure for The Estimation and Expression of Measurement Uncertainty in Chemical Analysis, Nordic Committee on Food Analysis, NMKL, No.5, 1997.

• APHA Standard methods for the Examination of Water and Wastewater, 20th ed., 1998.

Metode Analisis Mikrobiologi

• Kualitatif :

Uji langsung terhadap mikroba indicator Metode kultur untuk identifikasi makroskopik dan mikroskopik

Metode alternatif ( Dye-reduction Test, Electrical Methods, ATP Determination)

Metode Cepat deteksi mikroba spesifik dan toksinnya (metode imunokimia, metode biologi molekuler)

• Kuantitatif :

Angka Lempeng Total ( Total Plate Count )

MPN (Most Probable Number)

Uji potensi antibiotik

Uji sterilitas

Uji koefisien fenol (uji desinfektan dan antiseptik)

Uji efektivitas pengawet

Tahap Persiapan Validasi

Sebelum validasi dilakukan, hendaknya laboratorium menyediakan atau menyiapkan beberapa hal :

1. Mikroorganisme target atau acuan (lihat SR-02 : persyaratan tambahan untuk akreditasi laboratorium, Pengujian Kimia dan Biologi SNI 17025, DP.01.16, Januari 2004)

2. Peralatan dan Instrumen ukur yang telah dikalibrasi

3. Personel yang kompeten

4. Program Statistika untuk menghitung, mengevaluasi dan menginterpretasikan hasil pengujian

Akurasi (Kecermatan)

Definisi :

• Akurasi adalah kemampuan metode untuk mengukur dan mendeteksi nilai actual atau nilai sebenarnya dari mikroorganisme target dalam sampel

• Akurasi merupakan ukuran ketepatan atau kedekatan hasil pengujian dengan hasil yang sebenarnya.

Presisi (Keseksamaan)

Definisi

• Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil pengujian individual dengan hasil rata-rata pengujian berulang pada sampel yang homogen dengan kondisi pengujian yang sama

• Presisi : keterulangan ( Repeatability ), ketertiruan (reproducibility ), keseksamaan antara (intermediate precision)

Sensitifitas dan Spesifisitas

Definisi

• Sensitifitas (Kepekaan) : Kemampuan metode untuk mendeteksi/mengukur mikroorganisme target dalam jumlah sekecil mungkin

• Spesifisitas (Kemenjenisan): Kemampuan metode untuk mendeteksi/mengukur mikroorganisme tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya mikroorganisme asing atau bahan/matriks lain.

Linearity (Kelinieran) (untuk penetapan potensi antibiotika)

Definisi

• Keliniearan adalah kemampuan metode analisis yang menunjukkan bahwa larutan sampel yang berada dalam rentang konsentrasi memiliki respon analit yang proporsional dengan konsentrasi, secara langsung ataupun melalui transformasi matematika

Cara pengujian

• Kurva baku disiapkan dan dianalisis 3 kali dengan konsentrasi antara 50 – 150% kadar aktual (FDA), untuk penentuan kadar dalam sampel, tiga larutan baku digunakan : 80, 100 dan 120% konsentrasi target

Robustness (Ketangguhan) metode

• Pengujian Ketangguhan sebenarnya harus dilakukan pada saat fase pengembangan metode dan tergantung pada faktor-faktor yang berpengaruh pada pengujian

• Jika pengujian sangat peka terhadap perubahan dalam kondisi analisis,maka kondisi pengujian hendaknya dikendalikan atau dilakukan dengan penuh kehati- hatian

• Jenis keragaman kondisi pengujian yang harus diperhatikan :

– Stabilitas sampel

– Pengaruh suhu inkubasi

– Pengaruh waktu inkubasi

– Kondisi aerobik atau anaerobik (untuk pengujian mikroba tertentu)

– Pengaruh jenis media (nutrisi), dll

• Hasil pengujian dievaluasi secara Statistika menggunakan ANOVA atau Algoritma dari Yate