Prositfing Pertemuan 16nian 'Rflaioisotop, 'Rflaiofamzal<9, SiliJotron aan'/(etfoRJeran JfuliJir'Tanun 2014

ISSJf: 2087-9652

VALIDASI KIT IMMUNORADIMETRICASSAY FREEPROSTATE SPECIFIC ANTIGEN

UNTUK PEMANTAUAN PEMBESARAN PROSTAT JINAK SECARA IN VITRO

Puji Widayati, Veronika Yulianti Susilo, Wening Lestari, Agus Ariyanto

Pusat Teknologi Radioisotop dan Radiofarmaka - BA TANKawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang Selatan, Banten, Indonesia

pujiw@batan.go.id

ABSTRAKVALIDASI KIT IMMUNORADIOMETRICASSA Y FREE PROSTA TE SPECIFIC ANTIGEN UNTUKPEMANTAUAN PEMBESARAN PROSTAT JINAK SECARA INVITRO. Prostate Specific Antigen(PSA) diproduksi oleh sel-sel epitel yang melapisi asinus dan saluran kelenjar prostat. Peningkatankadar PSA dalam darah disebabkan oleh peradangan atau kerusakan jaringan prostat yangmengakibatkan kanker prostat atau pembesaran prostat jinak (Benign Prostatic Hyperplasia, BPH).Salah satu metode penentuan kadar free PSA adalah immunoradiometricassay (IRMA) yangdidasarkan pada reaksi immunologi antara antigen dan antibodi yang spesifik, serta menggunakanmonokonal antibodi yang ditandai zat radioaktif 1251 sebagai perunut. Pusat Teknologi Radioisotop danRadiofarmaka (PTRR-BATAN) telah berhasil mengembangkan kit IRMA free PSA untuk penentuankadar free PSA. PTRR melakukan validasi kit yang meliputi penentuan batas deteksi, kepekaan(sensitivitas), ketelitian (presisi) dan parameter assay (Non Spesific Binding, NSB dan MaximumBinding, MB). Penelitian ini bertujuan untuk menentukan batas deteksi, ketelitian intra assay dan interassay serta parameter assay, dimana diperoleh batas deteksi 0,39 nglmL, ketelitian intra assaymenghasilkan koefisien variasi (%CV) sebesar 7,18%, ketelitian inter assay untuk %CV sebesar14,95% dan parameter assay kit IRMA free PSA menghasilkan %NSB sebesar 0,9 dan % BIT sebesar19,57. Hal penelitian ini menunjukkan kit IRMA free PSA memenuhi persyaratan dari IAEA Protocol.Kata kunci : Immunoradiometricassay, PSA. validasi, kanker, koefisien variasi

ABSTRACTVALIDA TlON OF FREE PROSTA TE SPECIFIC ANTIGEN IMMUNO RADIOMETRIC ASSA Y KIT FORIN VITRO MONITORING OF BENIGN PROSTATIC HYPERPLASIA. Prostate Specific Antigen (PSA)is produced by epithelial cells lining the acini and ducts of the prostate gland. Elevated levels of PSA inthe blood caused by resulting prostate inflammation or tissue damage resulting prostate cancer orbenign prostate enlargement (benign prostatic hyperplasia, BPH). Among methods to determine freePSA is immunoradiometricassay (IRMA) which based on immunological reactions between antigensand specific antibodies, and using monoclonal antibodies labeled with 1125 as a tracer. The Center forRadioisotopes and Radiopharmaceuticals Technology BATAN has successfully developed free PSAIRMA kit for the determination of free PSA. PTRR BA TAN performed validation of the kit, comprises thedetermination of detection limit of sensitivity, precision and the assay parameters (non-Specific Binding,NSB and Maximum Binding, MB). This study aims to determine the limit of detection, precision of intra­assay and inter-assay and assay parameters which resulted a detection limit of 0.39 nglml, intra-assayprecision showed coefficients of variation (% CV) of 7.18% while for inter-assay precision was 14.95%and the assay parameters of free PSA IRMA kits showed 0.9% NSB and 19.57%B/T. These indicatethat this free PSA IRMA kit comformed to the requirements.Key words: Immunoradiometicassay, PSA, validation, cancer, coefficient of variation

Ci'uji'Witfayat~ aR..R.. 65

Prosid"illB <Pertemuall J{miafi <1?flaioisotop,<1?flaiofanlla/ig,Silifotroll aarl1Vao/(ferall !Nulifir'Tafiull 2014

ISS!N: 2087-9652

PENDAHULUAN

Validasi metode analisis bertujuan untukmemastikan dan mengkonfirmasi bahwametode analisis tersebut sudah sesuai untuk

peruntukannya. Validasi biasanyadiperuntukkan untuk metode analisa yangbaru dibuat dan dikembangkan, sedangkanuntuk metode yang memang telah tersediadan baku (misal: AOAC, ASTM dan lainnya)tidak perlu dilakukan validasi, hanyaverifikasi. Beberapa parameter analisis yanghc.7rus dipertimbangkan dalam validasimetode analisis adalah kepekaan, ketelitian,selektivitas, linieritas, rentang, batas deteksidan kekuatan (robustness) [1,2,3].Kepekaan adalah ukuran yang menunjukkanderajat kedekatan hasil analisis dengankadar analit yang sebenarnya. Kepekaandinyatakan sebagai persen perolehankembali (recovery) analit yang ditambahkan.Kepekaan dapat ditentukan melalui duacara, yaitu metode simulasi (spiked-placeborecovery) atau metode penambahan baku(standard addition method) [1,2,3].

Ketelitian adalah ukuran yangmenunjukkan derajat kesesuaian antarahasil uji individual, diukur melaluipenyebaran hasil individual dari rata-rata jikaprosedur diterapkan secara berulang padasampel-sampel yang diambil dari campuranyang homogen. Ketelitian diukur sebagaisimpangan baku atau simpangan relatif(koefisient variasi). Ketelitian dapatdinyatakan sebagai keterulangan(repeatability) atau ketertiruan(reproducibility). Keterulangan adalahketelitian metode jika dilakukan berulang kalioleh anal is yang sama pada kondisi yangsama dan dalam interval waktu yang pendek(intra assay). Ketertiruan adalah ketelitianmetode jika dikerjakan pada kondisi yangberbeda, biasanya dilakukan dalamlaboratorium-Iaboratorium yang berbedamenggunakan peralatan, pereaksi, pelarutdan analis yang berbeda serta sampel yangdianalisa diduga identik sama dari batchyang sama, tetapi dapat juga dilakukandalam laboratorium yang sama dengan

<PujiWid"ayat~ ali..li.. 66

menggunakan peralatan, pereaksi dan analisyang berbeda (inter assay) [1,2,3].

Selektifitas suatu metode adalah

kemampuan mengukur zat tertentu secaracermat dan seksama dengan adanyakomponen lain yang mungkin ada dalammatriks sampel, dinyatakan sebagai derajatpenyimpangan (degree of bias). Selektivitasmetode ditentukan dengan membandingkanhasil analisis sampel yang mengandungcemaran, hasil urai, senyawa sejenis,senyawa asing lainnya dengan analisissampel tanpa penambahan bahan-bahantadi [1,2,3].Linieritas adalah kemampuan metodeanalisis memberikan respon proporsionalterhadap konsentrasi analit dalam sampel.Rentang metode adalah pernyataan batasrendah dan tertinggi analit yang sudahditunjukkan dapat ditetapkan dengankecermatan, keseksamaan dan linieritasyang dapat diterima. Batas deteksi adalahjumlah terkecil analit dalam sampel yangdapat dideteksi yang masih memberikanrespon signifikan dibandingkan denganblangko[1,2,3].

Prostate Specific Antigen adalahglikoprotein dengan berat molekul 34.000dalton yang diproduksi terutama oleh sel-selepitel yang melapisi asinus dan salurankelenjar prostat. Pada keadaan normal,hanya sedikit PSA yang masuk ke dalamaliran darah tetapi bila terjadi peradanganatau kerusakan jaringan prostat maka kadarPSA dalam darah meningkat. Peningkatankadar PSA dapat disebabkan oleh kankerprostat atau pembesaran prostat jinak(Benign Prostatic Hyperplasia, BPH). PSAdalam darah ditemukan pada keadaanbebas (free PSA) dan sebagian besar diikatoleh protein (complexed-PSA, c-PSA). Padakanker prostat peningkatan c-PSA lebihdominan dibanding konsentrasi free PSA,sedangkan pada BPH yang lebih dominanfree PSA. Pada pria berusia lanjut > 60 tahunhasil pengukuran PSA rancu apakahdisebabkan oleh BPH atau kanker prostatoleh karena itu dianjurkan pemeriksaan rasiofree-PSA/PSA-total atau rasio c-PSA/PSA

(j'ros;diIlB (j'ertelllllall lfilliafi 'R(ld;oisotop, 'R(ldiofarma(;g, SiliJotroll dall 'l(cl{oliJerall :NllliJir%fillll 2014

ISS:N: 2087-9652

total terutama bagi mereka yang kadar PSAtotalnya antara 2,6-10 ng/mL. Interpretasipemeriksaan rasio free-PSAlPSA-totaladalah < 10% diduga kanker prostat, 10% ­25% diduga BPH atau kanker prostat, >25%diduga BPH. Manfaat pemeriksaan PSAadalah untuk skrining (PSA total), untukdiagnosis (PSA total dan rasio free­PSAlPSA-total atau rasio c-PSAlPSA-total),untuk pemantauan penyakit danpemantauan pengobatan serta pemantauansetelah pengangkatan prostat [4,5,6].

Pengukuran kadar free PSA dalam darahdapat dilakukan dengan beberapa metodediantaranya metodeimmunoradiometricassay (IRMA) ataupunmetode ELISA. Metode IRMA merupakansalah satu teknik immunoassay yangmenggunakan radionuklida 1251 sebagaiperunut sehingga cuplikan dalam jumlahkecil dapat dideteksi. Teknik ini sangat cocokdigunakan untuk penentuan tumor marker

dalam serum yang mempunyai matriks yangkomplek dan kadarnya yang sangatbervariasi. Teknik assay ini didasarkan padareaksi antara antigen (Ag) yang terdapatpada cuplikan atau standar (tumor marker)

dengan antibodi yang bertanda radioaktif(Ab*) dalam jumlah berlebih membentukkompleks antigen-antibodi (Ag-Ab*). Dengandemikian semakin tinggi kadar tumor marker

(Ag) , maka kompleks antigen-antibodi yangterbentuk juga semakin tinggi sehingga akanmemberikan cacahan radioaktivitas yangsemakin tinggi [4,5,6]Pusat Teknologi Radioisotop danR;-,diofarmaka (PTRR) BATAN telah berhasilmengembangkan kit IRMA free PSA yangdigunakan untuk penentuan kadar free PSAdalam darah. Adapun tahapan prosespembuatan kit IRMA free PSA adalahpembuatan komponen kit, optimasi assay kitdan validasi kit serta uji bandingmenggunakan kit komersil yang adadipasaran.

Tujuan validasi kit IRMA free PSAmeliputi penentuan batas deteksi, ketelitianClan parameter assay. Pengujian parameterassay meliputi nilai blanko, nilai ikatan

PII}i 'Wid'ayati, dli..li.. 67

maksimum (Maximum Binding, MB) dan nilaiserum kontrol. Nilai blanko atau dikenal

dengan istilah persen ikatan tidak spesifik(%NSB) dan nilai ikatan maksimum (%B/T)akan menentukan kurva standar yangdidapat. Adapun persyaratan kit yang baikadalah %CV di bawah 10% untuk intra

assay, %CV di bawah 15% untuk inter assay,untuk %NSB < 2 dan %B/T >10 serta batas

deteksi sekecil mungkin.

METODOLOGI

Bahan yang digunakan dalampenelitian ini di antaranya adalah larutanstandar free PSA, tabung reaksi polistirendasar bintang bersalut monoklonal antibodifree PSA, larutan monoklonal antibodi free

PSA bertanda 1251 yang selanjutnya disebutlarutan perunut free PSA dengan konsentrasitertentu, dan aqudemin.Alat yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya adalah pencacah Gamma (600

Gammatec /I The Nucleus), Gamma

Management System OPC, berbagai ukuranpipet mikro beserta tipnya, pH meter (Fisher

Accumet model 810), pengaduk (Vortex),

inkubator (Soft Incubator SL 1-6000),

timbangan analitik (Mettler AE 160).

Protokol Pengujian

Enam belas tabung reaksi polistirendasar bintang bersalut antibodi free PSA

(coated tube, CT) cJiberi nomor urut (1,2 3,dst). Sejumlah 50 IJL larutan free PSAstandar 0, 1, 2,5, 5, 10, 20, 40 dan 80 ng/mLditambahkan ke masing-masing tabung CTsecara berurutan. Sejumlah 25 IJL larutanperunut Na1251 dengan aktivitas == 50.000 cpmditambahkan ke masing-masing tabung CT,larutan perunut 125/ dan standar free PSAyang berada didalam tabung CTdihomogenkan menggunakan alat vortex

kemudian diinkubasi selama 18 jam padasuhu ruangan dengan shaker kecepatan 400rpm. Cairan dibuang dan tabung CTdikeringkan kemudian radioaktivitas yangtertinggal di dalam tabung diukur dengan alatpencacah Gamma selama satu menit.

Prosilfing (j'ertemuan I(miafi 1?flaioisotop, 1?flaiofannaR.a, Silifotroll aall '/(ftao~eran J{ulifir'Tafiull 2014

ISSJ{: 2087-9652

Batas Deteksi (Limit of Detection)Batas deteksi suatu kit ditunjukkan

oleh konsentrasi minimum antigen yang tidakbertanda yang dapat dibedakan dari sampelyang tidak mengandung antigen. Perbedaanini berdasarkan batas deteksi (ConfidenceLimit) sama dengan ± 2S0 dari nilai rata-ratastandar 0 dengan 8 kali pengulangan.Protokol pengujian diatas digunakan untukm:;netukan batas deteksi denganmenambahkan larutan standar free PSA 0

ng/mL pada tabung CT nomer urutselanjutnya sebanyak 8 kali (17,18,19 .... 24).Kepekaan dihitung berdasarkan nilai ± 2Standar Oeviasi (SO) dari rata-rata nilailarutan standar free PSA 0 (nol) dalamsatuan konsentrasi (ng/mL).Penentuan Ketelitian

Ketelitian merupakan aspek metodeyang memberikan informasi batas deteksi(Iimitasi) pengujian klinis yang relevan, yangmenentukan derajat kepercayaan. Ketelitiandinyatakan dalam persen coeficient variation(%CV) pengamatan pada pengulanganpengujian pada sampel yang sama,umumnya digunakan pengulangan sampelfree PSA yang sudah diketahuikonsentrasinya.Protokol pengujian diatas digunakan untukmenentukan ketelitian denganmenambahkan sampel free PSA yang sudahdiketahui konsentrasinya pada tabung CTurutan berikutnya (17, 18). Pengujiandilakukan minimal 6 (enam) kalipengulangan [1] untuk penentuan ketelitianintra assay dan inter assay. Ketelitianditentukan oleh persen koefisien variasi(%CV) yang dihasilkan dari analisis.Rumus perhitungan %CV dengan rumussebagai berikut:

%CV = SD xl 00% (1)xOimana :% CV : koefisien variasiSO : Standar OeviasiX : nilai rata-rata

q>uji'Wilfayati, aR.R. 68

Penentuan Parameter AssayParameter assay ditentukan denganmelakukan pengujian sesuai protokolpengujian meliputi nilai Non Specific Binding(NSB), Maximum Binding (%B/T).Rumus perhitungan NSB dengan rumussebagai berikut:

Cacahan NSB-BG

%NSB= -------------------------- X 100% (2)Cacahan Total- BG

Rumus perhitungan %B/T dengan rumussebagai berikut:

Cacahan fasa terikat-BG

%B/T= ---------------------------------X100% (3)Cacahan total-BG

Oimana: BG : Cacahan latar

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian ini diperoleh batasdeteksi X±2S0 sebesar 0,39±0,12 sepertiterlihat pada Tabel1.

T abel 1. Penentuan batas deteksi

Pengulangan Konsentrasi free PSA

(n=8)(ng/mL)

1.

0,452.

0,393.

0,304.

0,415.

0,416.

0,417.

0,468.

0,32Jumlah

3,15X

= 0,39Nilai

SO= 0,06X±2S0 =O,39±O,12%CV

=14,43

Pada penelitian ini pengujianketelitian kit IRMA free PSA intra assaydilakukan sebanyak 8 kali pengulangandengan satu orang operator. Nilai %CVhasil pengujian ini adalah 7,18 % dapatdilihat pada Tabel 2.

<Prosid"iIlBPertellluall I(lIliafi fiVId"ioisotop, fiVIaiofanna/(g, Silifotroll aall '/(faol(jerall ;Nulifir'Yafiull 2014

ISSJl: 2087-9652

Tabel 2. Hasil perhitungan konsentrasi free PSA

untuk intra assay

25

Gambar 1. Kurva kalibrasi standar free PSA

KESIMPULAN

Validasi kit IRMA free PSA yangdiproduksi secara lokal di PTRR inimempunyai batas deteksi 0,39 ng/mLdengan ketelitian intra assay yangmemberikan koefisien variasi (%CV) sebesar7,18 sedangkan ketelitian inter assaysebesar 14,95 serta mempunyai parameterassay dengan %N,SB dan %B/T berturut­turut 0,9 dan 19,57 serta nilai r 0,997.Oengan demikian dapat disimpulkan bahwakit IRMA free PSA hasil penelitian ini telahmemenuhi persyaratan kit yang baik,sehingga dapat digunakan untuk uji bandingdengan kit komersil pada penelitianselanjutnya.

Kad.u PSA, ng/ml

~ l~,E.~~ 10

E Vi ~·

~ 5 i /.///./

O •... m •

10080604020o

Pengulangan Konsentrasi free PSA

(n=8)( ng/mL)

1.0,71

2.0,71

3.0,71

4.0,71

5.0,73

6.0,78

7.0,77

8.0,86

Jumlah5,98

X

= 0,75Nilai

SO= 0,05%CV

= 7,18

Tabel 3. Hasil perhitungan konsentrasi free PSA

untuk inter assay

Pengujian ketelitian inter assaydilakukan sebanyak 8 kali pengulangandengan 8 orang operator. Nilai %CV hasilpengujian adalah 14,95% seperti terlihatpada Tabel3. Oari kedua pengujian ketelitianintra assay dan inter assay tersebut kit IRMAfree pSA yang dibuat telah memenuhipersyaratan kit yang baik yaitu %CV<10%untuk intra assay sedangkan %CV<15%untuk inter assay.

Pengulangan Konsentrasi free PSA

(n=8)(ng/mL)

1.0,77

2.0,91

3.0,74

4.0,75

5.0,70

6.0,78

7.1,02

8.1,00

Jumlah6,67

X= 0,83

NilaiSO= 0,12

% CV = 14,95

Oari hasil pengujian parameter assayberturut-turut didapatkan nilai blankosebesar 0,9% dan nilai ikatan maksimum

sebesar 19,57 serta nilai r 0,998 sepertiditunjukkan pada Gambar 1, sehingga nilaiini memenuhi persyaratan kit yang baik.

UCAPAN TERIMAKASIH

Penulis mengucapkan terimakasihkepada staf bidang Radioisotop dalampenyediaan radioisotop Na1251 sebagaibahan utama pembuatan perunut free PSA,staf bidang Radiofarmaka dan tim KPTPyang memberi masukan sehinggaterselesaikannya makalah ini.

DAFTAR PUSTAKA

1. Harmita, Petunjuk Validasi Metoda danCara Perhitungan, Majalah IImuKefarmasian, Volume I (3) hal 117-130,2004

2. RA Biddlecombe, Brian L, Validation of animmunoassay, in Immunoassay APractical Guide, Taylor&Francis, pp 179­198, 1798.

3. Ludwig Huber, Validation andQualification in Analytical Laboratories,Second Edition, pp 125-154,1948

4. Rediatning W, Sukiyati OJ,Immunoraiometricassay (IRMA) Oalam

Puji WUfayati, aK,.K,. 69

Prosidillg PertCII/llall /(miafi !J?.(ldioisotop, !J?..adiofamrafig,Si/(fotroll dall1(edoliJerall :Nu/(fir7'afiull 2014

ISS:N: 2087-9652

Deteksi Dan pemantauan Kanker, JurnalRadioisotop dan Radiofarmaka, Volume3, Nomor 1, hal 55-70, 2000

5. Puji Widayati, Gina Mondrida, SriSetiyowati, Agus Ariyanto, Yulianti Susilo,Wening Lestari, Preparasi Pereaksi Kitimmunoradiometricassay free ProstatSpecifik Antigen Untuk Deteksi Kanker

. Prostat, Jurnal Kimia Terapan IndonesiaVol 15, NO..2, Hal 13-24, BandungDesember 2013, ISSN 0853-2766,

(j'u/i '(1/idayatl, d(( 70

Akreditasi No. 540/AU1/P2MI-LlPI/06/2013

6. Puji Widayati, Sutari, Triningsih, AgusAriyanto, "Optimasi Assay KitImmunoradiometricassay( IRMA) Prostatspecific Antigen(PSA) Untuk DeteksiKanker Prestat, Prosiding SeminarNasional Kimia, Universitas NegeriYogyakarta, Hal 77-85, Yogyakarta 2013.