Uji Endotoksin Sediaan Injeksi Intravena Natrium Klorida

Uji Endotoksin Sediaan Injeksi (Insan Sunan K)

28

UJI ENDOTOKSIN SEDIAAN INJEKSI INTRAVENA NATRIUM KLORIDA DENGAN METODE GEL-CLOT

Insan Sunan Kurniawan Syah, Sohadi Warya, Yessy Christina Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran

ABSTRAK

Endotoksin merupakan bagian kompleks lipopolisakarida membran bakteri Gram negatif yang dapat menyebabkan reaksi pirogenik. Uji Limulus Amebocyte Lysate (LAL) metode gel-clot telah banyak digunakan untuk mendeteksi keberadaan endotoksin dalam sediaan parenteral. Penelitian ini dilakukan untuk membandingkan kadar endotoksin pada sediaan injeksi natrium klorida 0,9% yang dibuat dengan menggunakan karbon aktif sebagai penjerap endotoksin dan tanpa karbon aktif. LAL yang digunakan adalah Pyrotell Single Test Vial (STV) yang memiliki sensitivitas 0,25 EU/mL. Sebagai pembanding dilakukan pengujian terhadap standar kontrol endotoksin 0,5 EU/mL sebagai kontrol positif dan LAL Reagent Water (LRW) sebagai kontrol negatif. Dari pengujian sampel didapatkan hasil negatif tetapi dengan konsistensi gel yang berbeda. Hal ini membuktikan bahwa karbon aktif berpengaruh terhadap pembebasan endotoksin.

Kata kunci : endotoksin, injeksi natrium klorida, metode gel-clot

ABSTRACT

Endotoxin is part of lipopolysaccharide complex from Gram negative bacteria membran that can cause pyrogenic reaction. The Limulus Amebocyte Lysate (LAL) gel-clot method assay have been used for detection of endotoxin in parenteral preparation. This research was done to compare endotoxin content of preparations of sodium chloride injection 0,9% made by using activated carbon as endotoxin adsorbent and without activated carbon. LAL which used is Pyrotell Single Test Vial (STV) with sensitivity 0,25 EU/mL. As comparator, the examination to endotoxin control standar 0,5 EU/mL as positive control and LAL Reagent Water (LRW) as negative control was done. From examination samples, was got negative result but with different gel consistency. This showed that activated carbon have influence to Iiberation of endotoxin.

Key words : endotoxin, sodium chloride injection, gel-clot method

Farmaka, Volume 7 Nomor 1, April 2009

29

PENDAHULUAN Suplai larutan steril bertakaran besar

pada manusia secara intravena kadangkadang muncul reaksi demam tinggi, yang disertai rasa menggigil, cemas, kesulitan bernafas, lemahnya peredaran darah, nyeri

kepala, dan nyeri bagian tubuh. Pada hipertermi ini mulamula akan terjadi leukopeni (pengurangan jumlah leukosit) dan belakangan menjadi leukositosis (Voigt, 1995).

Salah satu syarat dari sediaan injeksi intravena ialah harus bebas pirogen (Ansel, 1989). Pirogen adalah senyawa molekular tinggi, yang dinyatakan sebagai senyawa lipopolisakarida, yang diproduksi kirakira 5 10% dari masa total bakteri (Voigt, 1995). Pirogen dari satu sediaan dapat dihilangkan dengan cara adsorpsi, diantaranya dengan menggunakan karbon

aktif 0,1 0,3 % b/v. Namun demikian karbon aktif tersebut selain mengadsorpsi

pirogen, juga mengadsorpsi zatzat terkandung dalam larutan itu sendiri (ChemicaCom, 2006).

Untuk menjamin tidak adanya pirogen dalam sediaan injeksi intravena volume besar maka dilakukan uji pirogen. Uji pirogen menggunakan kelinci dilakukan dengan cara menginjeksikan larutan sediaan steril secara intravena, kemudian diukur peningkatan suhu tubuh kelinci

melalui rektal (Departemen Kesehatan RI, 1995).

Metode yang lebih baik adalah uji in vitro yang telah memiliki tingkat

sensitivitas lebih tinggi dari pada uji pirogen kelinci yaitu uji LAL (Limulus Amoebocyte Lysate). Uji ini menggunakan ekstrak cair dari Limulus polyphemus (kepiting ekor tapal kuda) untuk mendeteksi tingkat endotoksin bakterial

dalam sampel. Tiga jenis metode uji endotoksin (metode bekuan gel, metode turbidimetri, metode kromogenik) telah dijelaskan dalam British Pharmacopoeia untuk evaluasi akhir konsentrasi

endotoksin dalam suatu produk steril

(Department of Health, 1980). Metode yang digunakan dalam

penelitian ini adalah metode bekuan gel (Gel-Clot Method). Metode bekuan gel melibatkan penggunaan pembekuan protein yang dipotong pada suatu enzim

pembekuan aktif, dimana bagian tidak larut produk membentuk gel. Walaupun reaksi

keseluruhan belum ditemukan, dapat dimengerti bahwa reaksi pembentukan bekuan diaktivasi oleh enzim tertentu (Joiner, et al., 2002).

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan endotoksin yang

masih tersisa dalam sediaan injeksi intravena natrium klorida setelah dibebaskan dengan karbon aktif, menggunakan metode gel-clot.


30

METODE PENELITIAN Alat-alat yang digunakan dalam uji

endotoksin ini antara lain botol infus, alat gelas yang lazim, inkubator (Memmert), Laminar Air Flow (LAF) cabinet (MinihelicII Zero 0), mikropipet (Finnpipette Campus S69054), otoklaf (MC 03000011), oven (Heraeus RT360), pencampur vortex (VM 300), syringe steril (York), dan timbangan analitik digital (Mettler Toledo).

Bahan-bahan yang digunakan dalam uji endotoksin ini antara lain alkohol 70%

(Nurfarindo), aqua pro injectionum bidestilata bebas pirogen (PT. Ikapharmindo Putramas), indikator pH universal (Merck), karbon aktif (Shirasagi), natrium klorida (Merck), LAL Reagent Water (Associates of Cape Cod Incorporated), Pyrotell Limulus Amebocyte Lysate (Associates of Cape Cod Incorporated), Pyrosol Reconstitution Buffer (Associates of Cape Cod Incorporated), dan Standar Kontrol Endotoksin (Associates of Cape Cod Incorporated). Tahapan kerjanya adalah sebagai berikut : 1. Penyiapan Alat dan Bahan

Seluruh alat yang digunakan dibungkus

menggunakan kertas perkamen kemudian disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 121C selama 15 menit. Setelah itu, alat kualitatif yang telah disterilisasi

dimasukan ke dalam oven dengan suhu

250C selama 30 menit atau 200C selama 1 jam. 2. Formulasi

Sediaan yang akan diuji pada penelitian ini adalah injeksi natrium klorida 0,9%. Injeksi natrium klorida dibuat sendiri di laboratorium dengan

menggunakan formula berdasarkan Formularium Nasional edisi II tahun 1978 dimana tiap 100 mL injeksi mengandung natrium klorida sebanyak 0,9 gram. 3. Pembuatan Injeksi Natrium Klorida

Injeksi natrium klorida yang dibuat 2 sediaan, yaitu dengan menggunakan karbon aktif dan tanpa karbon aktif.

Volume yang dibuat untuk masing-masing sediaan adalah 120 mL. a. Pembuatan sediaan injeksi intravena

NaCl 0,9% tanpa karbon aktif. Natrium klorida ditimbang sebanyak 1,08 gram kemudian dilarutkan dalam

sebagian aqua pro injectionum. Larutan ditambahkan aqua pro injectionum hingga mendekati volume akhir lalu cek pH larutan. Larutan

ditambahkan aqua pro injectionum hingga 120 mL dan disaring

menggunakan kertas saring, filtrat

pertama dibuang. Larutan injeksi yang telah dibuat dimasukkan dalam botol infus sebanyak 102 mL, kemudian tutup dan disterilisasi dalam otoklaf 1210C selama 15 menit.

b. Pembuatan sediaan injeksi intravena NaCl 0,9% dengan karbon aktif 0,1%.


31

Ditimbang natrium klorida sebanyak 1,134 gram dan karbon aktif sebanyak

0,12 gram. Natrium klorida dilarutkan dalam sebagian aqua pro injectionum kemudian ditambah aqua pro injectionum hingga mendekati volume akhir dan pH larutan dicek. Larutan ditambahkan aqua pro injectionum hingga 120 mL dan ditambahkan karbon aktif kemudian dipanaskan sampai suhu 600 700C sambil diaduk selama 15 menit. Larutan disaring panas-panas menggunakan kertas

saring, filtrat pertama dibuang. Filtrat

yang telah disaring ditampung dalam botol infus sebanyak 102 mL, kemudian tutup dan disterilisasi dalam otoklaf 1210C selama 15 menit.

4. Penyiapan Endotoksin dan LAL a. Penyiapan Endotoksin

Standar kontrol endotoksin yang tersedia adalah 2500 EU/vial. Sebanyak 10 mL LAL Reagent Water dimasukkan ke dalam vial endotoksin sehingga diperoleh endotoksin 250 EU/mL. Kemudian dilakukan

pengenceran endotoksin sebagai berikut :

1. Endotoksin 25 EU/mL Sebanyak 1 mL endotoksin 250 EU/mL ditambah dengan 9 mL LAL Reagent Water (LRW).

2. Endotoksin 2,5 EU/mL

Sebanyak 1 mL endotoksin 25 EU/mL ditambah dengan 9 mL LRW. 3. Endotoksin 0,5 EU/mL

Sebanyak 1 mL endotoksin 2,5 EU/mL ditambah dengan 4 mL LRW.

b. Penyiapan LAL

Pereaksi LAL yang digunakan dalam penelitian ini adalah Pyrotell LAL

Single Test Vial yang hanya dapat digunakan untuk sekali pakai. Sensitivitas dari LAL ini adalah sebesar 0,25 EU/mL. Vial yang berisi LAL dapat langsung digunakan untuk menguji endotoksin dalam sediaan injeksi natrium klorida yang telah dibuat.

5. Prosedur Metode Gel-Clot a. Kontrol positif

Penelitian dilakukan di dalam Laminar Air Flow (LAF). Pyrosol Reconstitution Buffer dimasukkan ke dalam larutan endotoksin 0,5 EU/mL sebanyak 2-3 tetes sampai diperoleh pH dengan rentang 6-8 . Kemudian larutan endotoksin yang telah ditambah buffer diambil sebanyak 0,2 mL menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam Pyrotell LAL

Single Test Vial (STV). Campuran dalam vial dikocok menggunakan pencampur vortex selama 1-2 detik, kemudian vial dimasukkan ke dalam

inkubator dan diinkubasi pada suhu 371oC selama 602 menit.


32

b. Kontrol Negatif

Pyrosol Reconstitution Buffer dimasukkan ke dalam LAL Reagent Water (LRW) sebanyak 2-3 tetes sampai diperoleh pH dengan rentang 6-8 . Kemudian LRW yang telah diberi buffer diambil sebanyak 0,2 mL menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam Pyrotell LAL

Single Test Vial. Campuran dalam vial dikocok menggunakan pencampur vortex selama 1-2 detik, kemudian vial dimasukkan ke dalam inkubator dan

diinkubasi pada suhu 371oC selama 602 menit.

c. Pengujian Sediaan Injeksi Intravena Natrium Klorida 0,9%

Pyrosol Reconstitution Buffer dimasukkan ke dalam sediaan injeksi natrium klorida sebanyak 2-3 tetes sampai diperoleh pH dengan rentang 6-8 . Kemudian larutan uji yang telah ditambah buffer diambil sebanyak 0,2 mL menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam Pyrotell LAL Single Test Vial. Campuran dalam vial dikocok menggunakan pencampur

vortex selama 1-2 detik kemudian vial dimasukkan ke dalam inkubator dan

diinkubasi pada suhu 371oC selama 602 menit. Prosedur ini dilakukan untuk kedua sediaan, yaitu injeksi natrium klorida dengan karbon aktif

dan tanpa karbon aktif.

6. Penafsiran Hasil Setelah proses inkubasi selesai, STV

dikeluarkan dari dalam inkubator. Kemudian diamati apakah di dasar STV tersebut terbentuk gel atau tidak. STV dibalik 180o secara perlahan dan dilihat apakah gel yang terbentuk di dasar STV

jatuh atau tidak.

HASIL PEMBAHASAN 1. Pengujian Endotoksin Kontrol

Positif Dari pengujian standar kontrol

endotoksin 0,5 EU/mL dengan menggunakan LAL Pyrotell Single Test Vial (STV) didapatkan hasil gel yang kompak. Gel yang terbentuk tidak tumpah ketika STV diputar sampai terbalik 180o. Hasil diperlihatkan pada gambar di bawah

ini :

Gambar 1. Hasil Pengujian Endotoksin Kontrol Positif

Seperti yang tertera pada USP, standar kontrol endotoksin yang digunakan untuk

kontrol positif adalah dua kali sensitivitas LAL yang digunakan (2). Sensitivitas ini merupakan batas konsentrasi endotoksin


33

yang dapat terdeteksi oleh LAL Pyrotell STV . Menurut Guidance for Industry yang dikeluarkan oleh US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration (FDA), salah satu persyaratan sediaan injeksi volume besar memiliki batas toleransi endotoksin sebesar 0,25 EU/mL. Reaksi positif terjadi karena bakteri Gram negatif (endotoksin dari Escherichia coli) mengkatalisis aktivitas proenzim dalam pereaksi LAL Pyrotell STV. Enzim yang diaktivasi

(koagulase) menghidrolisis ikatan spesifik pada protein penggumpal (koagulogen) yang terdapat dalam pereaksi LAL menjadi bagian yang larut dan tidak larut (koagulin). Bagian tidak larut ini yang membentuk gel. Pada saat vial dibalikkan tidak boleh ada guncangan karena gel yang terbentuk sangat sensitif dan mudah rusak

sehingga hasil yang seharusnya positif

menjadi negatif. Hasil yang positif menunjukkan bahwa kadar endotoksin yang digunakan lebih besar dari sensitivitas LAL.

2. Pengujian Endotoksin Kontrol Negatif

Dari pengujian LAL Reagent Water (LRW) bebas endotoksin dengan menggunakan STV didapatkan hasil yaitu tidak terbentuknya gel. Larutan langsung tumpah ketika STV diputar sampai terbalik

180o. Hasil diperlihatkan pada gambar di bawah ini :

Gambar 2. Hasil Pengujian Endotoksin Kontrol Negatif

Hasil yang negatif disebabkan karena tidak adanya endotoksin dalam LRW. Hal

tersebut menunjukkan bahwa LRW yang digunakan memenuhi persyaratan untuk digunakan dalam pengujian LAL.

Hasil kontrol positif dan kontrol

negatif digunakan sebagai pembanding hasil pengujian endotoksin terhadap injeksi natrium klorida yang dibuat tanpa karbon aktif dan dengan karbon aktif.

3. Pengujian Endotoksin Injeksi Natrium Klorida 0,9% Tanpa Karbon Aktif

Dari hasil pengujian sampel dengan menggunakan STV didapatkan gel yang

tidak sempurna. Gel yang terbentuk tumpah secara perlahan ketika STV diputar

sampai terbalik 180o.


34

Gambar 3. Hasil Pengujian Endotoksin Injeksi Natrium

Klorida 0,9% Tanpa Karbon Aktif Dari gambar 3. dapat dilihat hasil yang

negatif tetapi terbentuk gel yang tidak sempurna. Gel yang terbentuk jatuh secara perlahan ketika vial dibalikkan. Hasil tersebut menunjukkan bahwa di dalam larutan uji terdapat endotoksin yang mengaktivasi enzim membentuk gel, tetapi kadar endotoksin dalam larutan uji berada di bawah sensitivitas pirotel. Hasil yang negatif menunjukkan bahwa kadar endotoksin dalam larutan uji kurang dari sensitivitas STV (0,25 EU/mL). 4. Pengujian Endotoksin Injeksi

Natrium Klorida 0,9% dengan Karbon Aktif Dari pengujian sampel dengan

menggunakan STV didapatkan hasil yaitu

tidak terbentuknya gel. Larutan langsung tumpah ketika STV diputar sampai terbalik 180o. Hasil ditunjukkan pada gambar di bawah ini :

Gambar 4. Hasil Pengujian Endotoksin Injeksi Natrium Klorida 0,9% dengan Karbon Aktif

Dari gambar 4. dapat dilihat hasil yang negatif, ditandai dengan tidak terbentuknya gel. Hasil pengujian jatuh secara langsung ketika vial dibalikkan. Hasil tersebut menunjukkan bahwa kadar endotoksin dalam larutan uji kurang dari sensitivitas STV.

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan

Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa :

1. Pengujian endotoksin kontrol positif dengan penambahan standar kontrol endotoksin 0,5 EU/mL pada STV membentuk gel yang kompak. Hasil menunjukkan bahwa standar kontrol endotoksin memenuhi persyaratan.

2. Pengujian endotoksin kontrol negatif dengan penambahan LAL Reagent Water (LRW) pada STV tidak membentuk gel. Hasil menunjukkan bahwa dalam LRW tidak mengandung

endotoksin.


35

3. Pengujian endotoksin pada injeksi natrium klorida tanpa karbon aktif,

menghasilkan pembentukan gel yang tidak kompak. Hal ini menunjukkan masih terdapat endotoksin dengan konsentrasi yang lebih kecil daripada

sensitivitas STV. 4. Pengujian endotoksin pada injeksi

natrium klorida dengan karbon aktif, tidak menghasilkan pembentukan gel. Hal ini menunjukkan bahwa dalam larutan uji tidak terdapat endotoksin

dan membuktikan efek karbon aktif terhadap pembebasan endotoksin

dalam sediaan yang dibuat.

Saran Pada penelitian selanjutnya disarankan : 1. Penggunaan metode lain yang lebih

baik dalam pembebasan endotoksin.

2. Penggunaan cara pengujian lain dalam mendeteksi endotoksin, seperti uji Neutrophil Chemiluminescence.

DAFTAR PUSTAKA

Akers, M. J. 1994. Parenteral Quality Control. 2nd Edition. New York : Marcel Dekker, Inc. p. 101-147

Ansel, H. C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Penerjemah : Farida Ibrahim. Edisi ke-4. Jakarta : UI Press. hal. 399-400

ChemicaCom. 2006. Carbon Based Adsorbent. http:// www.chemica.com/ consultationsery.html. diakses tanggal 30 November 2006

Departemen Kesehatan RI. 1995. Farmakope Indonesia. Edisi ke-4. Jakarta : Departemen Kesehatan RI. hal. 300-301, 908-909

Department of Health. 1980. British Pharmacopeia. Volume II. London : Pharmaceutical Press. p. A222 A227

Joiner, T. J., Paul F. K., Thomas C. K., Ph.D. 2002. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. International Journal of Pharmaceutical Compounding. Volume 6. p. 408-409

Lukas, S. 2006. Formulasi Steril. C.V. Yogyakarta : Andi Offset. hal. 11-14, 81-98 Societys Department of Pharmaceutical Sciences. 1994. The Pharmaceutical Codex :

Principles and Practice of Pharmaceutics. 12th Edition. London : Pharmaceutical Press. p. 92-94

Suwandi, U., Drs. 1988. Uji Pirogenitas dengan Kelinci dan Limulus Amebocyte Lysate.http://www.kalbefarma.com/files/cdk/files/52_08_UjiPirogenitasdenganKelincidanLimulus.pdf/52_08_UjiPirogenitasdenganKelincidanLimulus.html. diakses tanggal 12 April 2007

United States Pharmacopeial Convention. 2005. The United States Pharmacopeia 28 : The National Formulary 23. Volume III. Twinbrook Parkway : United States Pharmacopeial Convention, Inc. p. 2201


36

Voigt, R. 1995. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi. Edisi ke-5. Penerjemah : Soendani NS dan Mathilda BW. Yogyakarta : Gadjah Mada University Press. hal. 462 463

Uji Endotoksin Sediaan Injeksi Intravena Natrium Klorida

Documents

Transcript of Uji Endotoksin Sediaan Injeksi Intravena Natrium Klorida