UJI AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI-FRAKSI HASIL KOLOM ... · KROMATOGRAFI DARI EKSTRAK BIJI JINTAN HITAM...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI-FRAKSI HASIL KOLOM KROMATOGRAFI DARI EKSTRAK BIJI

JINTAN HITAM (Nigella sativa L.) TERHADAP ENZIM RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C

SKRIPSI

FAKHRUL UMAM

NIM.109102000049

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

SEPTEMBER 2013

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom Kromatografi dari Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella

sativa L.) terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

SKRIPSI

Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Far)

FAKHRUL UMAM

NIM.109102000049

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

SEPTEMBER 2013

iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang

dikutip maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Fakhrul Umam

NIM : 109102000049

Tanda Tangan :

Tanggal : 27 September 2013

iv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

Nama : Fakhrul Umam

NIM : 109102000049

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom

Kromatografi dari Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella


Disetujui Oleh :

Pembimbing I Pembimbing II

Lina Elfita, M.Si.,Apt. Rifqiyah Nur Umami, M.S. NIP. 197312122011012002 NIP. 198205182006042003

Mengetahui, Ketua Program Studi Farmasi

FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Drs. Umar Mansur, M.Sc.,Apt.

v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PENGESAHAN

Skripsi ini diajukan oleh :

Nama : Fakhrul Umam

NIM : 109102000049


Judul Skripsi : Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom

Kromatografi dari Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella


Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I : Lina Elfita, M.Si.,Apt. ( )

Pembimbing II : Rifqiyah Nur Umami, M.S. ( )

Penguji I : Ofa Suzanti Betha, M.Si.,Apt. ( )

Penguji II : Ismiarni Komala, M.Sc.,Ph.D., Apt. ( )

Ditetapkan di : Jakarta

Tanggal : 27 September 2013

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Nama : Fakhrul Umam Program Studi : Farmasi Judul : Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom

Kromatografi dari Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Hepatitis C termasuk penyakit hati kronis yang menyerang organ hati yang disebabkan oleh infeksi dari virus hepatitis C (HCV) yang merupakan golongan keluarga Flaviviridae. Hingga saat ini belum ditemukan obat yang efektif untuk penanggulangan penyakit hepatitis C ini. Sebagai salah satu pendekatan adalah mencari senyawa yang merupakan inhibitor dari enzim esensial untuk replikasi virus tersebut. Enzim RNA helikase adalah salah satu diantaranya.. Enzim RNA helikase berfungsi melepaskan untai ganda RNA menjadi untai tunggal, dimana proses ini sangat penting dalam proses replikasi HCV sehingga dapat menjadi target yang potensial untuk pengembangan obat anti-HCV. Jintan hitam (Nigella sativa L.) telah lama digunakan sebagai obat herbal untuk meningkatkan kesehatan dan melawan penyakit. Menurut data pustaka jintan hitam dapat berperan sebagai antimikroba, antiparasit, antikanker, antiinflamasi, immunomodulator dan antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas inhibisi fraksi-fraksi kolom kromatografi dari ekstrak n-heksana biji jintan hitam terhadap RNA Helikase HCV. Eluen yang digunakan pada kolom kromatografi ini adalah n-heksana:etil asetat (100:0 - 0:100). Uji aktivitas inhibisi ekstrak biji jintan hitam terhadap enzim RNA helikase HCV dilakukan dengan menggunakan metode kolorimetri ATPase. Hasil dari fraksi kolom kromatografi ekstrak biji jintan hitam dibuat dalam konsentrasi 10.000 ppm. Aktivitas inhibisi tertinggi ditunjukkan oleh fraksi kesepuluh yaitu 77,170% dengan aktivitas RNA helikase sebesar 53,5938 pmol fosfat/ ml/ menit/ pmol protein.

Kata Kunci : Ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.), kolom kromatografi, RNA helikase HCV

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Fakhrul Umam Program Study : Pharmacy Title : Inhibition Activity Test of Fractions Result Column

Chromatography of Black Cumin (Nigella sativa L.) Seed Extract to Hepatitis C Virus RNA Helicase

Hepatitis C is a chronic liver disease attacks the liver caused by infection of hepatitis C virus (HCV) that is a member of the Flaviviridae family. To date there is no effective drug for prevention of hepatitis C disease. As an approach is looking for compound that can be an inhibitor from the essential enzymes for the replication of the virus. RNA helicase enzyme is one of them. RNA helicase enzyme has a function to release the RNA double-stranded into a single strand in which this process is very important for the HCV replication process that can be a potential target for the development of anti-HCV drug. Black cumin (Nigella sativa L.) has been used as an herbal to promote health and against disease. According to the literature, black cumin can works as antimicrobial, antiparasitic, anticancer, antiinflammatory, antioxidant and immunomodulator. This study aims to know the inhibitor activity of column chromatographic fractions of n-hexane black cumin seeds extract toward HCV RNA helicase. The used eluent in the chromatography column is n-hexane-ethyl acetate (100:0 - 0:100). Inhibitory activity test of black cumin seed extract to HCV RNA helicase is calculated by using colorimetric ATPase method. The results of column chromatography fractions of black cumin seed extract are made in concentration of 11,111 ppm. The highest inhibitory activity is shown by the tenth fraction which is 77.170% and the activity of RNA helicase is 53.5938 pmol phosphate / ml / min / pmol protein.

Keywords : Extracts of black cumin seeds (Nigella sativa L.), column chromatography, HCV RNA helicase

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT karena atas

segala rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan

skripsi ini dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk

menyelesaikan pendidikan guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi di Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta

Penulis menyadari bahwa tanpa dukungan dan bimbingan dari

berbagai pihak, sangatlah sulit bagi penulis untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh

karena itu, penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

(1) Ibu Lina Elfita, M.Si., Apt. selaku pembimbing I dan Ibu Rifqiyah Nur

Umami, M.S. selaku pembimbing II, yang memiliki peranan besar dalam

proses penelitian dan penyelesaian tugas akhir saya ini. Semoga segala

bantuan dan bimbingan ibu mendapat imbalan yang lebih baik dari Allah

SWT.

(2) Bapak Apon Zaenal Mustopa, M.Si. selaku Kepala Laboratorium

Bakteriologi dan Virologi Molekuler Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI

beserta staf (Ibu Linda Sukmarini, M.Eng, Bapak Muhamad Ridwan,

S.Far,) atas bantuannya dan penggunaan segala fasilitas di laboratorium

selama penelitian.

(3) Bapak Prof. Dr. dr.(hc). M. K. Tadjudin, Sp.And selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta.

(4) Bapak Drs. Umar Mansur, M,Sc., Apt selaku ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN)

Syarif Hidayatullah Jakarta.

(5) Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah banyak memberikan

bantuan dan bimbingan selama saya menempuh pendidikan di Program

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam

Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

(6) Kedua orang tua tercinta, Ayahanda Syamsuddin Ali dan Ibunda Nazlah

yang selalu mendoakan dan memberikan dukungan kepada penulis untuk

menyelesaikan tugas akhir ini.

(7) Teman seperjuangan selama kuliah dan penelitian Yunita Sari.

(8) Keluarga besar Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler LIPI,

Kak Meita, Kak Hana, Mas Aris, Kang Ace, Kak Yuni, Kak Putri, Kak Ike,

Kak Aksar, Kak Bugie, Uud, yang telah banyak membantu penulis dalam

penelitian.

(9) Teman-teman Farmasi angkatan 2009 khususnya teman EDTA-C, dan

teman-teman CSSMORA yang sudah banyak membantu dalam berbagi

informasi dan pengetahuan serta memberikan dukungan semasa kuliah

hingga penyelesaian tugas akhir ini.

Akhir kata, penulis berharap semoga Allah SWT berkenan membalas segala

kebaikan semua pihak yang telah membantu. Penulis berharap semoga skripsi ini

membawa manfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan.

Jakarta, September 2013

Penulis

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Fakhrul Umam

NIM : 109102000049


Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis karya : Skripsi

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah

saya, dengan judul :

UJI AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI-FRAKSI HASIL KOLOM

KROMATOGRAFI DARI EKSTRAK BIJI JINTAN HITAM (Nigella sativa

L.) TERHADAP ENZIM RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan diinternet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universita Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan pubikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Di buat di : Jakarta

Pada Tanggal : 27 September 2013

Yang menyatakan

( Fakhrul Umam )

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ...................................................................................... ii HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS ........................................... iii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .......................................... iv HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ v ABSTRAK ...................................................................................................... vi ABSTRACT .................................................................................................... vii KATA PENGANTAR .................................................................................... viii HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK ...................................... x DAFTAR ISI ................................................................................................... xi DAFTAR TABEL .......................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xv DAFTAR ISTILAH ....................................................................................... xvi

BAB 1. PENDAHULUAN ............................................................................. 1 1.1 LatarBelakang ..................................................................................... 1 1.2 Batasan dan Rumusan Masalah ........................................................... 3 1.3 Tujuan Penelitian ................................................................................. 3 1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................... 4

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................... 5 2.1 Botani .................................................................................................. 5

2.1.1 Klasifikasi Tanaman ...................................................................... 5 2.1.2 Deskripsi Tanaman ........................................................................ 6 2.1.3 Ekologi dan Penyebaran ................................................................ 6 2.1.4 Khasiatdan Kegunaan .................................................................... 6 2.1.5 Kandungan Kimia .......................................................................... 7

2.2 Ekstra dan Ekstraksi ............................................................................ 7 2.3 Virus Hepatitis C ................................................................................. 7 2.4 RNA Helikase ...................................................................................... 8 2.5 SDS PAGE .......................................................................................... 10 2.6 Kolorimetri ATPase ............................................................................ 11 2.7 Kromatografi ....................................................................................... 12 2.8 Kromatografi Kolom ........................................................................... 12

BAB 3. METODE PENELITIAN ................................................................. 14 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................. 14 3.2 Alat dan Bahan .................................................................................... 14 3.3 Tahapan Penelitian .............................................................................. 15

3.3.1 Persiapan Simplisia ..................................................................... 15 3.3.2 Determinasi Biji Jintan Hitam .................................................... 15

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.3 Pembuatan Ekstrak N-heksana Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) ................................................................................................ 15

3.3.4 Rendemen Total Ekstrak N-Heksana Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) ..................................................................................... 16

3.3.5 Skrinning Fitokimia .................................................................... 16 3.3.6 Parameter Standar ....................................................................... 18 3.3.7 Pemisahan Senyawa dengan Kolom kromatografi ..................... 18 3.3.8 Produksi Enzim RNA Helikase HCV ......................................... 19 3.3.9 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE ................................................................................. 21 3.3.10 Uji Aktivitas ATPase RNA Helikase HCV ................................. 22 3.3.11 Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap RNA

Helikase HCV ............................................................................. 22 3.3.12 Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV ................................ 23

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 24 4.1 Determinasi Biji Jintan Hitam .............................................................. 24 4.2 Rendemen Ekstrak ................................................................................ 24 4.3 Penapisan Fitokimia ............................................................................. 25 4.4 Parameter Standar ................................................................................. 26 4.5 Pemisahan Senyawa Inhibitor dengan Kolom Kromatografi ............... 26 4.6 Produksi Enzim RNA Helikase HCV .................................................. 27

4.6.1 Ekspresi Enzim RNA Helikase HCV ............................................ 27 4.6.2 Purifikasi Enzim RNA Helikase HCV .......................................... 28

4.7 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE ........ 29 4.8 Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap Enzim RNA Helikase HCV ............................. 31 4.9 Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV ......................................... 33

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 35

5.1 Kesimpulan ............................................................................................ 35 5.2 Saran ...................................................................................................... 35

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 36 LAMPIRAN .................................................................................................... 39

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 4.1 Penapisan Fitokimia Ekstrak Biji Jintan Hitam .................................. 25 Tabel 4.2 Parameter Standar Ekstrak .................................................................. 26

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 2.1 Biji jintan hitam (Nigella sativa L.) ............................................... 5 Gambar 2.2 Mekanisme kerja enzim RNA helikase ......................................... 9 Gambar 4.1 Hasil SDS-PAGE RNA Helikase HCV ......................................... 30 Gambar 4.2 Diagram Inhibisi Fraksi Kromatografi Kolom Ekstrak Biji Jintan

Hitam (Nigella sativa L.) terhadap RNA Helikase HCV ........... 32 Gambar 4.3 KLT pada Fraksi Hasil Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan

Hitam (Nigella sativa L.) ............................................................ 33 Gambar 4.4 Diagram Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C ...... 34

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Hasil Determinasi Biji jintan hitam (Nigella sativa L.) .............. 40 Lampiran 2. Alur Penelitian ............................................................................. 41 Lampiran 3. Skema Kerja Persiapan Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa

L.) ................................................................................................ 42 Lampiran 4. Skema Kerja Produksi Enzim RNA Helikase HCV .................... 43 Lampiran 5. Skema Kerja Analisis Kemurnian Enzim RNA helikase HCV

dengan SDS - PAGE ................................................................... 44 Lampiran 6. Skema Kerja Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV ............. 45 Lampiran 7. Skema Kerja Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap RNA helikase ................................................................ 46 Lampiran 8. Komposisi Larutan-Larutan yang Digunakan dalam SDS-PAGE ..................................................................................................... 47 Lampiran 9. Komposisi Reagen, Dapar, dan Medium yang Digunakan ........ 48 Lampiran 10. Perhitungan Rendemen Ekstrak Biji Jintan Hitam ...................... 49 Lampiran 11. Perhitungan Parameter Standar Ekstrak Biji Jintan Hitam.......... 50 Lampiran 12. Perhitungan Pengenceran Enzim ................................................. 51 Lampiran 13. Contoh perhitungan Pembuatan Larutan Pewarna Malachite Green

..................................................................................................... 52 Lampiran 14. Contoh Perhitungan Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Biji Jintan

Hitam (Nigella sativaL.) terhadap RNA Helikase HCV ............. 53 Lampiran 15. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kental Biji Jintan Hitam

(Nigella sativa L.) ........................................................................ 54 Lampiran 16. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak

Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) ........................................... 55 Lampiran 17. Contoh Perhitungan Persen Inhibisi Hasil Fraksi Ekstrak Biji

Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap RNA helikase HCV .. 58 Lampiran 18. Kurva Standar Fosfat (Uji ATPase) ............................................ 59 Lampiran 19. Contoh Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV ................... 60 Lampiran 20. Tabel Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV dengan Penambahan

Senyawa Inhibitor Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) .................................................................................................. 61

Lampiran 21. Gambar Alat Penelitian ............................................................... 63

xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISTILAH

APS : Ammonium Per Sulfat ATP : Adenosin Trifosfat IPTG : Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase IV : Inner volum S : Supernatan W : Washing E : Elution HCV : Hepatitis C Virus LB : Media Luria - Bertani MOPS : 4-asam morfolinopropana sulfonat OD : Optical Density SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis TEMED : N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamin

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Penyakit hepatitis merupakan penyakit hati yang disebabkan oleh

lima tipe virus hepatitis yaitu hepatitis A, B, C, D dan E dan dapat menjadi

penyebab utama sirosis dan kanker hati. Indonesia menempati peringkat

ketiga penderita hepatitis terbanyak di dunia setelah India dan China.

Penderita hepatitis B dan C di Indonesia diperkirakan mencapai 30 juta orang.

Badan Kesehatan Dunia (WHO) memperkirakan sebanyak 3-4 orang juta

terinfeksi dengan virus hepatitis C setiap tahun. Sekitar 150 juta orang

terinfeksi secara kronis dan beresiko menjadi sirosis hati atau kanker hati.

Lebih dari 350.000 orang meninggal akibat penyakit hepatitis C setiap tahun

(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/en/).

Hepatitis C termasuk penyakit hati kronis yang menyerang organ

hati yang disebabkan oleh infeksi dari virus hepatitis C (HCV) yang

merupakan golongan keluarga Flaviviridae. HCV merupakan virus

beramplop RNA yang memiliki diameter sekitar 50 nm. HCV bekerja

dengan cara masuk ke dalam sel hati, menggunakan mesin genetik di dalam

sel untuk menduplikasi materi genetiknya, kemudian menginfeksi sel lainnya

(WHO, 2002).

Virus ini dapat menyebar melalui penggunaan jarum suntik,

transfusi darah, hubungan seksual, dan hemodialisis (Sy & Jamal, 2006).

HCV mengalami perkembangan secara klinis selama 7 hingga 8 minggu

setelah paparan virus tersebut. Namun biasanya penderita tidak menunjukkan

gejala atau hanya gejala ringan. Gejala tersebut timbul setelah menjadi kronis

dan dalam waktu yang sangat lama. Infeksi HCV sangat sulit untuk dideteksi.

Interval antara infeksi hingga fase kronis yang menimbulkan fibrosis dan

sirosis dapat meningkat setelah tiga puluh tahun (Lauer & Walker, 2001).

Hingga saat ini belum ditemukan obat yang efektif untuk

penanggulangan penyakit hepatitis C ini. Sebagai salah satu pendekatan

adalah mencari senyawa yang merupakan inhibitor dari enzim esensial untuk

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

replikasi virus tersebut. Enzim RNA helikase adalah salah satu diantaranya.

RNA helikase mempunyai tiga aktivitas yaitu aktivitas pengikatan RNA

(RNA binding), ATPase dan RNA helikase. Aktivitas RNA helikase

berfungsi melepaskan untai ganda RNA menjadi untai tunggal, dimana proses

ini sangat penting dalam proses replikasi HCV. Oleh karena itu, RNA

helikase merupakan target yang potensial untuk pengembangan obat anti-

HCV karena inhibisi RNA helikase dapat dilakukan melalui salah satu dari

tiga aktivitas tersebut (Elfita et al, 2009).

Pengobatan yang berpusat pada tanaman herbal sudah sejak lama

dilakukan, dan penelitian terhadap herbal tersebut semakin berkembang

akhir-akhir ini. Hal ini dikarenakan bahan herbal terbukti lebih sedikit

menghasilkan efek samping jika dibandingkan dengan obat sintetis. Salah

satu bahan herbal yang sering digunakan adalah biji jintan hitam (Nigella

sativa L.). Selama berabad-abad biji jintan hitam telah digunakan sebagai

obat herbal untuk meningkatkan kesehatan dan melawan penyakit terutama di

Timur Tengah dan Asia Tenggara (Gilani et al, 2004). Di zaman Rasulullah

SAW, biji jintan hitam ini sudah digunakan dalam berbagai pengobatan.

Sebagaimana yang pernah disabdakan oleh nabi:

ي>قول و>س>╋م> ع>╋يه ص>╋ىاه اه ر>س=ول س>]ع> أنDه= أبيه=ر>ير>〝 السDود>اء[إ:ع>ن 〞D｠اح في

إبنماجهرواه و>السDا′=امو─=،و>اح｟D〞السDود>اءالشEونيز=.شفاءمنكلد>اءإاالسDا′

Dari Abu Hurairah bahwa dia mendengar Rasulullah saw bersabda:

"Sesungguhnya di dalam al-Habbah as-Sauda’ itu ada kesembuhan (obat)

bagi setiap penyakit kecuali as-Sam". Dan as-Sam itu adalah kematian dan al-

Habbah as-Sauda’ itu adalah as-Syuniz (nama lain dari al-Habbah as-

Sauda’/jintan hitam) (H.R. Ibnu Majah) (Al -Albani, 1996).

Banyak penelitian yang telah dilakukan sebelumnya terhadap

jintan hitam dan menunjukkan beberapa aktivitas seperti antimikroba,

antiparasit, antikanker, antiinflamasi, immunomodulator, analgesik dan

antioksidan (Gali et al, 2006). Namun hanya sedikit penelitian yang

dilakukan untuk mendeteksi aktivitasnya sebagai antivirus. Penelitian yang

3


telah dilakukan sebelumnya (Ayuni, 2012) menunjukkan bahwa ekstrak

jintan hitam dalam fraksi n-heksana mempunyai aktivitas sebagai inhibitor

RNA helikase dari HCV. Penelitian ini sedikit banyak memberikan gambaran

bahwa jintan hitam (Nigella sativa L.) dapat berpotensi sebagai kandidat

senyawa baru dalam menghambat kerja HCV. Merujuk dari penelitian

tersebut maka peneliti bermaksud untuk melakukan pemisahan tahap awal

senyawa bioaktif sebagai inhibitor RNA helikase HCV dari ekstrak biji jintan

hitam (Nigella sativa L.) dengan menggunakan kolom kromatografi.

1.2 Batasan dan Rumusan Masalah

1.2.1 Batasan Penelitian

Batasan penelitian yang dilakukan meliputi pemisahan tahap awal

senyawa inhibitor RNA helikase HCV dari ekstrak biji jintan hitam (Nigella

sativa L.) dengan menggunakan kolom kromatografi.

1.2.2 Rumusan Masalah

Penelitian tentang tanaman herbal untuk mengobati penyakit

hepatitis C masih gencar dilakukan, hingga diperoleh suatu senyawa murni

yang mampu menghambat enzim RNA helikase HCV secara efektif. Untuk

memperoleh suatu senyawa yang murni dari senyawa kompleks yang

terdapat pada ekstrak tanaman herbal cukup sulit, maka perlu dilakukan

penelitian lebih lanjut. Oleh karena itu perumusan masalah dalam penelitian

ini adalah apakah pada fraksi kolom kromatografi ekstrak biji jintan hitam

(Nigella sativa L) memiliki aktivitas sebagai senyawa inhibitor RNA

helikase HCV dan pada fraksi berapakah yang mempunyai aktivitas inhibisi

tertinggi.

1.3 Tujuan Penelitian

Mengetahui aktivitas inhibisi hasil fraksi-fraksi kolom

kromatografi dari ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L) terhadap enzim

RNA helikase HCV.

4


1.4 Manfaat Penelitian

1.4.1 Manfaat penelitian secara teoritik

Penelitian ini diharapkan mampu menambah ilmu pengetahuan

serta wawasan dalam memisahkan senyawa yang berasal dari jintan hitam

(Nigella sativa L.) yang berpotensi sebagai inhibitor RNA helikase HCV.

1.4.2 Manfaat penelitian secara metodologik

Mengetahui cara pemisahan tahap awal ekstrak biji jintan hitam

(Nigella sativa L.) yang berpotensi sebagai inhibitor RNA helikase HCV.

1.4.3 Manfaat penelitian secara aplikatif

Penelitian ini diharapkan dapat menjadi acuan bagi penelitian

selanjutnya mengenai potensi yang terkandung dalam biji jintan hitam

(Nigella sativa L.) sebagai senyawa obat baru dalam pengobatan penyakit

hepatitis C.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Botani

Tinjauan botani meliputi klasifikasi tanaman, deskripsi, ekologi, khasiat

dan kegunaan serta kandungan kimia biji jintan hitam (Nigella sativa L).

2.1.1 Klasifikasi Tanaman

Klasifikasi tanaman jintan hitam adalah sebagai berikut (United

State Departement of Agriculture, 2012):

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta

Superdivision : Spermatophyta

Division : Magnoliophyta

Class : Magnoliopsida

Subclass : Magnoliidae

Ordo : Ranunculales

Family : Ranunculaceae

Genus : Nigella L.

Species : Nigella sativa L.

Gambar 2.1 Biji jintan hitam (Nigella sativa L.)

Sumber : dokumen pribadi

6


2.1.2 Deskripsi Tanaman

Jintan hitam merupakan tanaman herba tahunan dan berbatang tegak.

Batang biasanya berusuk dan berbulu kasar, rapat atau jarang-jarang dan

disertai dengan adanya bulu-bulu yang berkelenjar. Bentuk daun lanset

berbentuk garis panjang 1,5 cm sampai 2 cm, ujung meruncing, terdapat tiga

tulang daun yang berbulu. Daun bagian bawah bertangkai dan bagian atas

duduk. Daun pembalut bunga kecil. Kelopak bunga 5, bundar telur,

ujungnya agak meruncing hingga tumpul, pangkal mengecil membentuk

sudut yang pendek dan besar. Mahkota pada umumnya 8, agak memanjang

berbentuk bunga dua, bibir bagian atas pendek, lanset, ujung memanjang

berbentuk benang, ujung bibir bunga bagian bawah tumpul. Benang sari

banyak dan gundul. Kepala sari jorong dan sedikit tajam, berwarna kuning.

Buah bulat telur atau agak bulat. Biji hitam, jorong berbentuk sudut tiga tak

beraturan dan sedikit berbentuk kerucut, panjang 3 mm dan berkelenjar

(Depkes RI, 1979).

2.1.3 Ekologi dan Penyebaran

Jintan hitam tumbuh dari daerah Levant ke arah timur Samudera

Indonesia sebagai gulma semusim (Depkes RI, 1979).

2.1.4 Khasiat dan kegunaan

Biji jintan hitam sudah lama digunakan dalam pengobatan

tradisional, seperti diuretik, diaforetik, penyakit hati, antihipertensi,

memperbaiki proses pencernaan, antidiare, stimulan nafsu makan, analgesik,

antibakteri dan antihelmintik. Selain itu jintan juga dilaporkan mampu

mengobati sakit kepala, migrain, keracunan merkuri dan leprosi (Gillani et

al, 2004). Kajian lain menyebutkan bahwa jintan hitam juga dapat berfungsi

sebagai immunostimulan, antihistamin, antikanker, hypoglycemic,

choleretic, dan antiparasit (Al-Ali et al, 2008). Jintan hitam juga dapat

berperan sebagai antimikroba, antiparasit, antikanker, antiinflamasi,

immunomodulator dan antioksidan (Gali et al, 2006).

7


2.1.5 Kandungan Kimia

Biji jintan hitam mengandung minyak atsiri (0,5-1,6%), asam

lemak (35,6-41,6%), protein (22,7%) yang meliputi asam amino meliputi

albumin, globulin, lisin, leusin, isoleusin, valin, glisin, alanin, fenilalanin,

arginin, asparagin, sistin, asam glutamat, asam aspartat, prolin, serin,

treonin, triptopan dan triosin. Biji jintan hitam juga mengandung berbagai

mineral seperti Fe, Na, Cu, Zn, P, Ca dan vitamin (asam askorbat, tiamin,

niasin, piridoksin dan asam folat). Asam lemak yang terkandung dalam biji

jintan hitam antara lain asam palmitat, asam linoleat, asam oleat, asam

dehidrostearat. Kandungan aktif dalam biji jintan hitam biasanya berada

dalam minyak atsiri seperti carvone, α-pipene, d-limoene, dan p-cymene,

thymoquinon, thymohydroquinon, dithymoquinon, thymol dan nigellone

(Gillani et al, 2004).

2.2 Ekstraksi dan Ekstrak

Ekstraksi suatu tanaman obat adalah pemisahan secara kimia atau

fisika suatu bahan padat atau bahan cair dari suatu padatan, yaitu tanaman

obat (Depkes RI, 2000). Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan

mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani

menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua

pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian

hingga memenuhi baku yang ditetapkan (Depkes RI, 1995).

Maserasi adalah proses ekstraksi simplisia dengan menggunakan

pelarut beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan.

Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan prinsip pencapaian konsentrasi

pada keseimbangan.

2.3 Hepatitis C

HCV termasuk golongan Flaviviridae dan merupakan satu-satunya

anggota dari genus Hepacivirus. Infeksi HCV adalah penyebab utama dari

hepatitis kronis, sirosis hati, dan karsinoma hepatoseluler (Brass et al, 2006).

HCV menyerang sel hati atau limfosit B. Virus ini menyebabkan penyakit

hepatitis C yang dalam jangka panjang mengakibatkan peradangan hati,

8


sirosis, dan kanker hati. Penyakit ini sulit dideteksi karena gejala yang

ditimbulkan mirip dengan penyakit yang lain, seperti mual, nafsu makan

berkurang, mudah lelah, timbul kekuningan (mata, kulit), dan urin berwarna

gelap. Umumnya penyakit ini terdeteksi apabila sudah mencapai tingkat

kronis, sekitar 30-80% infeksi (Sy & Jamal, 2006).

Genom HCV terdiri dari open reading frame (ORF) tunggal yang

mengkodekan poliprotein tunggal. Poliprotein tersebut merupakan prekusor

bagi 3000 jenis asam amino. Poliprotein ini akan diubah menjadi sekitar 10

jenis protein yang berbeda dan terbagi dalam dua kelompok besar protein

virus, yaitu protein struktural (protein inti, E1, E2, dan p7) dan protein

nonstruktural (NS) (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, dan NS5B) (Lauer &

Walker, 2001).

Replikasi virus bersifat kuat dan dapat diperkirakan lebih dari sepuluh

milyar partikel virion diproduksi perhari bahkan pada fase kronis dari infeksi.

HCV mengkode poliprotein tunggal yang terdiri atas 3011 asam amino dan

memproses menjadi 10 protein struktural dan regulator. Komponen struktural

terdiri atas inti dan dua protein amplop. Selain inti dari virus terdapat juga

dua daerah dari protein amplop E2 didesain sebagai daerah hipervariabel 1

dan 2 yang memiliki laju yang tinggi terhadap mutasi dan dipercaya sebagai

hasil dari tekanan selektif oleh antibodi spesifik terhadap virus (Lauer &

Walker, 2001).

2.4 RNA Helikase

Helikase adalah enzim yang berperan dalam membuka untai ganda

nukleotida (DNA atau RNA) menjadi untai tunggal. RNA helikase

merupakan enzim yang membuka ikatan dupleks RNA menjadi untai tunggal.

(Kadare & Haenni, 1997). Fungsi dasar enzim helikase untuk membuka utas

ganda DNA atau RNA melalui coupling hidrolisis NTP dengan translokasi

sepanjang satu utas DNA atau RNA. Seluruh helikase virus memiliki

aktivitas NTP/ATPase yang tergantung pada keberadaan NTP dan kation

divalen berupa Mg2+. Produk hidrolisis NTP pada helikase adalah NDP/ADP

dan Pi (Fan et al, 2008).

9


Enzim helikase diperlukan untuk proses replikasi genom organisme

tersebut. Enzim helikase dapat dibagi menjadi DNA helikase dan RNA

helikase, sesuai dengan genom yang dimiliki organisme tersebut. HCV yang

merupakan virus RNA memiliki RNA helikase. Helikase bekerja secara

katalitik memisahkan untai ganda DNA atau RNA menggunakan energi yang

dihasilkan dari hidrolisis nukleosida trifosfat dan merupakan target pencarian

obat karena dibutuhkan dalam replikasi virus (Utama et al, 2000).

Gambar 2.2 Mekanisme kerja enzim RNA helikase

Sumber Utama et al, 2000

Aktivitas NTP/ATP helikase secara umum distimulasikan oleh

keberadaan asam nukleat untai tunggal. Hal ini memungkinkan enzim

berikatan dengan untai RNA dengan energi yang dihasilkan dari hidrolisis

ATP untuk memisahkan ikatan hidrogen pasangan basa dari struktur dupleks

(Utama et al, 2000).

10


Ikatan asam nukleat dapat menginduksikan formasi protein yang

terkarakterisasi dengan pengembangan situs aktif dari domain NTP/ATPase

dari NTP/ATP. Aktivitas NTP/ATPase tidak dapat distimulasi pada kadar

garam tinggi. Hal ini disebabkan kondisi kekuatan ionik kuat asam nukleat

tidak dapat terikat dengan enzim dan enzim membentuk konformasi untuk

pelepasan untaian. Mekanisme kerja enzim RNA atau DNA helikase adalah

pertama-tama helikase akan mengikat untai RNA atau DNA utas ganda pada

ujung 3’, selanjutnya ATP akan berikatan pada suatu sisi aktif dari RNA atau

DNA helikase tersebut. Gugus ATP akan dihidrolisis oleh enzim RNA atau

DNA helikase menjadi ADP dan fosfat inorganik. Proses hidrolisis ini akan

terlepas energi yang kemudian digunakan oleh enzim RNA atau DNA

helikase untuk menguraikan utas ganda RNA atau DNA menjadi utas tunggal

RNA atau DNA (Utama et al, 2000).

2.5 SDS PAGE

Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan yang memisahkan analit

berdasarkan kemampuan bergerak dalam medium konduksi yang biasanya

berupa larutan bufer dan akan memberikan respons setelah ditambahkan

medan listrik (Harvey, 2000). Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide

Gel Electrophoresis (SDS PAGE) adalah metode pemisahan protein dalam

sampel untuk dianalisa dan menentukan berat molekulnya. Protein-protein

akan terdenaturasi dan melepas monomernya karena pemanasan yang

ditunjukkan dengan adanya agen-agen pereduksi (2-merkaptoetanol atau

ditiotheitol) dan surfaktan bermuatan negatif.

Elektroforesis gel Sodium Dodesil Sulfat (SDS) poliakrilamid adalah

teknik yang sering digunakan dalam bidang biokimia, forensik, genetika, dan

biologi molekuler untuk memisahkan protein sesuai dengan mobilitas

elektroforesis (fungsi dari panjang rantai polipeptida atau molekul). Sampel

elektroforesis gel SDS tersebut dipisahkan berdasarkan ukuran berat molekul

(Gam & Latiff, 2005).

Polimerisasi dapat terjadi dengan cepat pada suhu kamar dengan adanya

katalis dan inisiator. Katalis dan inisiator yang umum digunakan ialah

11


N,N’,N’,N’–tetrametilenadiamina (TEMED) dan amonium persulfat (APS)

sebagai sumber radikal bebas yang akan menginisiasi pembentukan polimer

(Caprette, 2005).

Medan listrik diterapkan di seluruh gel yang menyebabkan protein

bermuatan negatif bermigrasi menuju anoda. Setiap protein akan bergerak

berbeda melalui matriks gel. Protein yang berbobot molekul kecil akan lebih

mudah melalui pori-pori pada gel, sedangkan protein yang berbobot molekul

lebih besar akan memiliki lebih banyak kesulitan untuk melewati pori-pori

tersebut. Setelah waktu yang telah ditentukan protein akan bermigrasi

berdasarkan ukuran; protein yang lebih kecil akan bermigrasi jauh di bawah

gel, sedangkan yang lebih besar akan tetap lebih dekat ke titik asal. Protein

dapat dipisahkan berdasarkan ukuran atau bobot molekul (Gam & Latiff,

2005).

Pewarna yang digunakan dalam teknik ini terdiri atas dua macam yaitu

Coomassie Brilliant Blue atau pewarna perak. Pewarna Coomassie Brilliant

Blue biasanya dapat mendeteksi sebuah band hingga 50 µg protein.

Pewarnaan perak meningkatkan sensitivitas pewarnaan sampai 50 kali.

Banyak variabel yang dapat mempengaruhi intensitas warna. Setiap protein

memiliki karakteristik pewarnaan sendiri (Jovanovic et al, 2007).

2.6 Kolorimetri ATPase

Uji kolorimetrik digunakan untuk menganalisis bahan yang umumnya

tidak berwarna, misalnya untuk mengukur konsentrasi protein dalam suatu

sampel yang tidak menyerap cahaya. Adapun pereaksi yang digunakan adalah

pereaksi yang bewarna seperti malakit hijau dan amonium molibdat. Uji

ATPase dilakukan dengan mengukur konsentrasi fosfat yang terurai dari ATP

menjadi ADP dan P, yang dihasilkan dari reaksi enzim ATPase. Prinsip uji

kolorimetrik adalah perubahan warna yang terjadi dari suatu zat yang tidak

bewarna dengan suatu pereaksi warna (Utama et al, 2000).

12


2.7 Kromatografi

Kromatografi adalah cara pemisahan zat yang berkhasiat dan zat lain

yang ada dalam sediaan, dengan jalan penyarian berfraksi, atau penyerapan,

atau penukaran ion pada zat padat berpori, menggunakan cairan atau gas yang

mengalir. Zat yang diperoleh dapat digunakan untuk percobaan identifikasi

atau penetapan kadar. Kromatografi yang sering digunakan ialah

kromatografi kolom, kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis dan

kromatografi gas. Sebagai bahan penyerap selain kertas, digunakan juga zat

penyerap berpori misalnya aluminium oksida yang diaktifkan, asam silikat,

atau silika gel, kiselgur dan harsa sintetik (Depkes RI, 1979).

2.7.1 Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom merupakan salah satu metode kromatografi

yang dapat digunakan untuk fraksinasi ini merupakan cara yang terbaik

untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar (lebih dari 1 g). Campuran

yang akan dipisahkan pada kromatografi kolom adalah berupa pita pada

bagian atas kolom penjerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam,

atau bahkan tabung plastik. Pelarut eluen dibiarkan mengalir melalui kolom

karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan

tekanan (Rouessac & Rouessac, 2007). Kolom kromatografi atau tabung

untuk pengaliran karena gaya gravitasi atau sistem bertekanan rendah

biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu pada bagian

bawahnya untuk mengatur aliran pelarut (Gritter et al, 1991).

Zat penyerap (misalnya aluminium oksida yang telah diaktifkan,

silika gel, kiselgur terkalsinasi, dan kiselgur kromatografi murni) dalam

keadaan kering atau setelah dicampur dengan sejumlah cairan, dimampatkan

kedalam tabung kaca atau tabung kwarsa dengan ukuran tertentu dan

mempunyai lubang pengalir keluar dengan ukuran tertentu. Sejumlah

sediaan yang diperiksa dilarutkan dalam sedikit pelarut ditambahkan pada

puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat penyerap. Zat berkhasiat

diserap dari larutan oleh bahan penyerap secara sempurna berupa pita

sempit pada puncak kolom. Dengan mengalirkan pelarut lebih lanjut,

13


dengan atau tanpa tekanan udara, masing-masing zat bergerak turun dengan

kecepatan khas hingga terjadi pemisahan dalam kolom yang disebut

kromatogram. Kecepatan bergerak zat dipengaruhi beberapa faktor misalnya

daya serap zat penyerap, sifat pelarut, dan suhu dari sistem kromatografi

(Depkes RI, 1979).


BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

3.1.1 Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret 2013 sampai bulan

September 2013.

3.1.2 Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di laboratorium Farmakognosi dan

Fitokimia, laboratorium Kimia Obat Jurusan Farmasi FKIK UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta, Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler

Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong Bogor dan Herbarium

Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong Bogor.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah erlenmeyer,

batang pengaduk, gelas ukur, kertas saring, kapas, lumpang alu, tabung

reaksi, corong, cawan penguap, timbangan analitik, alat penggiling

simplisia, inkubator goyang, vortex, tube 50 ml, erlenmeyer, 96-well

microtiter, pipet mikro, neraca analitik, peralatan gelas, microplate reader

Multiscan EX, vial, Laminar Air Flow (LAF), lemari pendingin, sonikator,

autoklaf, kolom kromatografi, erlenmeyer, gelas beaker, lempeng KLT,

chamber.

3.2.2 Bahan

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah biji jintan hitam

(Nigella sativa L.). Biji jintan hitam ini diperoleh dari PT Lantabura, Depok.

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah pelarut n-

heksana, aquadest, natrium hidroksida, dragendroff’s, mayer’s, asam

hidroklorit, ferri klorida, asam sulfat, kloroform, pereaksi Liebermann-

Buchard (2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H2SO4 pekat), bakteri

15


Escerichia coli BL21 (DE3) pLysS yang membawa gen NS3 RNA helikase

HCV dalam plasmid pET21b (koleksi Andi Utama, Puslit Bioteknologi

LIPI), media Luria Bertani (LB), aquades, ampisilin, IPTG (isopropil β-D-

thiogalaktopiranoside), buffer B (10 mM Tris HCl pH 8.5, 100 mM NaCl,

dan 0,25% Tween 20), resin Talon, dan buffer elusi (400 mM imidazole

dalam buffer B), 0.1 mM ATP (Adenosin trifosfat), 0.1 mM MOPS (asam

4-morfolinopropana sulfonat), 1 mM MgCl2, larutan hijau malachite, 2.3 %

polivinil alkohol, amonium molibdat, natrium sitrat, sukrosa, TEMED,

akrilamid, amonium persulfat, coomassie brilliant blue, marker protein 250

kDa BIORAD®, silika gel, etil asetat, kapas dan alumunium foil.

3.3 Tahapan Penelitian

3.3.1 Persiapan Simplisia

Biji jintan hitam diperoleh dari PT Lantabura Depok. Selanjutnya

dilakukan proses penggilingan dan pengayakan menggunakan ayakan 40

mesh untuk diperoleh serbuk halus simplisia biji jintan hitam.

3.3.2 Determinasi Biji Jintan Hitam

Proses determinasi dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang

Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong, Bogor.

3.3.3 Pembuatan Ekstrak N-heksana Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.)

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 300 g dan dimasukkan

kedalam erlenmeyer. Lalu dimaserasi dengan menggunakan pelarut n-

heksana sebanyak 900 ml. Proses maserasi didiamkan selama 24 jam,

sambil sesekali dilakukan pengadukan. Setelah 24 jam maserat ditampung

di dalam erlenmeyer lain dengan cara disaring menggunakan kertas saring.

Kemudian serbuk simplisia tadi dimaserasi kembali dengan pelarut n-

heksana dan didiamkan selama 24 jam sambil sesekali dilakukan

pengadukan. Setelah 24 jam maserat ditampung kembali dengan cara

disaring menggunakan kertas saring. Serbuk simplisia tadi dimaserasi

kembali dengan pelarut n-heksana dan didiamkan selama 24 jam sambil

sesekali dilakukan pengadukan. Setelah 24 jam maserat ditampung

16


kembali dengan cara disaring dengan menggunakan kertas saring. Seluruh

hasil penampungan maserasi dikumpulkan untuk dilakukan pemekatan

ekstrak dengan menggunakan rotary evaporator suhu 45⁰C hingga

diperoleh ekstrak kental n-heksana biji jintan hitam (Nigella sativa L.).

3.3.4 Rendemen Total Ekstrak N-Heksana Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.)

Rendemen ekstrak n-heksana biji jintan hitam total dihitung dengan

membandingkan berat awal serbuk simplisia dengan berat akhir ekstrak n-

heksana biji jintan hitam total yang diperoleh.

% Rendemen =

3.3.5 Penapisan Fitokimia

Penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui golongan

senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak n-heksana biji jintan

hitam (Nigella sativa L.).

a. Alkaloid

Ekstrak dilarutkan dalam pelarut asam hidroklorit dan kemudian

disaring. Dilakukan uji pada beberapa pereaksi (Tiwari et al, 2011):

1. Uji Mayer: filtrat ditambahkan dengan pereaksi Mayer (kalium

merkuri iodida). Maka akan terbentuk endapan berwarna kuning

yang menunjukkan adanya senyawa alkaloid.

2. Uji Dragendroff: filtrat ditambahkan pereaksi Dragendroff (larutan

potassium iodida). Maka akan membentuk endapan merah yang

menunjukkan adanya senyawa alkaloid.

b. Saponin

Ekstrak sebanyak 0,5 mg dikocok dalam 2 ml aquades. Jika terbentuk

busa yang cukup lama sekitar 10 menit, menunjukkan adanya senyawa

saponin (Tiwari et al, 2011).

17


c. Fenol

Ekstrak ditambahkan 3-4 tetes larutan ferri klorida. Jika terbentuk

warna hitam kebiru-biruan menunjukkan adanya senyawa fenol (Tiwari

et al, 2011).

d. Tannin

Ekstrak sebanyak 0,5 gram dididihkan dalam 10 ml aquadest dalam

tabung reaksi, lalu disaring. Kemudian kedalam filtrat ditambahkan

beberapa tetes ferri klorida 0,1 %. Terbentuk warna hijau kecoklatan

atau biru kehitaman menunjukkan keberadaan tannin (Ayoola, G.A. et

al., 2008).

e. Flavonoid

Larutan ammonia sebanyak 5 ml ditambahkan kedalam filtrat air dari

ekstrak, lalu ditambahkan 1 ml asam sulfat. Terbentuk warna kuning

menunjukkan adanya flavonoid (Ayoola, G.A. et al, 2008).

f. Triterpenoid dan Steroid

Ekstrak sebanyak 0,15 gram dicampurkan ke dalam 2 ml asam asetat

anhidrat (CH3CO)2O, kemudian ditambahkan 2 ml H2SO4 1N. Adanya

cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan dua pelarut menunjukkan

adanya triterpenoid sedangkan munculnya warna hijau kebiruan

menunjukkan adanya steroid (Indrayani, Soetjipto & Sihasale, 2006).

g. Terpenoid

Ekstrak sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam 2 ml kloroform,

kemudian ditambahkan H2SO4 sebanyak 3 ml. Adanya warna coklat

kemerahan menunjukkan adanya terpenoid (Ayoola et al, 2008).

h. Minyak atsiri

Ekstrak kental yang berbau enak ditambahkan etanol, selanjutnya

larutan alkoholik tersebut diuapkan kembali sampai kering. Jika residu

tetap berbau enak, menunjukkan ekstrak positif mengandung minyak

atsiri (Indrayani, Soetjipto & Sihasale, 2006)

18


3.3.6 Parameter Standar

a. Susut Pengeringan

Ekstrak ditimbang sebanyak 1 g dan dimasukkan kedalam botol

timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu

105⁰C selama 30 menit dan ditara. Sebelum ditimbang ekstrak diratakan

dalam botol timbang, dengan cara menggoyangkan botol, hingga

membentuk lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm. Jika

berupa ekstrak kental diratakan dengan batang pengaduk. Kemudian

dimasukkan kedalam ruang pengering, buka tutupnya, keringkan pada

suhu 105⁰C hingga bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, biarkan

botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam eksikator hingga suhu

kamar (Depkes RI, 2000).

b. Kadar Abu

Ekstrak ditimbang sebanyak 1 g dan dipanaskan pada temperatur

625⁰C dimana senyawa organik dan turunannya terdestruksi dan

menguap sehingga hanya tersisa unsur mineral dan anorganik.

Tujuannya adalah untuk memberikan gambaran tentang kandungan

mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai

terbentuknya ekstrak. Nilai untuk kadar abu sesuai dengan yang tertera

dalam monografi (Depkes RI, 2000).

3.3.7 Pemisahan Senyawa dengan Kolom Kromatografi

Pemisahan senyawa yang terkandung di dalam ekstrak kental biji

jintan hitam (Nigella sativa L.) menggunakan kolom kromatografi. Kolom

yang digunakan berdiameter 2,54 cm dan panjang 65 cm. Kolom

dibersihkan dan disiapkan dengan memberi kapas pada ujung kolom untuk

menahan silika gel agar tidak keluar, lalu dipasang tegak lurus pada statif.

Kemudian silika gel ditimbang seberat 100 gram dan dilarutkan dengan

pelarut organik nonpolar yaitu n-heksana, diaduk hingga terbentuk

suspensi (Yazid, 2005).

Selanjutnya silika dimasukkan kedalam kolom sambil diketuk-

ketuk agar silika dapat memadat didalam kolom. Pelarut dimasukkan ke

19


dalam kolom dan ditampung, lalu dimasukkan kembali ke dalam kolom.

Proses ini dilakukan secara berulang-ulang hingga silika gel menjadi

padat. Ekstrak kental biji jintan hitam seberat 4 gram dilarutkan ke dalam

pelarut n-heksana sebanyak 4 ml. Kemudian dimasukkan secara hati-hati

kedalam kolom pada bagian atas dengan cara dialirkan melalui dinding

kolom.

Pemisahan ekstrak kental biji jintan hitam dengan menggunakan

elusi pelarut bergradien n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 100:0-

0:100 Eluat ini kemudian ditampung di dalam vial. Masing-masing fraksi

elusi diuji aktivitas inhibisi RNA helikase HCV dengan menggunakan uji

ATPase kolorimetri.

3.3.8 Produksi Enzim RNA Helikase HCV

Produksi enzim RNA helikase HCV diawali dengan pembuatan

media terlebih dahulu. Media yang dibuat adalah LB (Luria Bertani) cair

untuk Escherichia coli BL21 (DE3)pLysS. Media LB ini dibuat sebanyak

10 ml untuk prekultur dan 400 ml untuk kultur. Pembuatan media LB

dengan cara mencampurkan Tryptone:NaCl:Yeast ekstrak (2:2:1).

Selanjutnya media ini disterilisasi pada suhu 121⁰C selama 15 menit.

Tahap pertama dalam purifikasi RNA helikase HCV adalah

prekultur, yaitu media LB cair 10 ml diberi ampisilin 100 µg/ml dan

dimasukkan ke dalamnya bakteri E.coli BL21 (DE3)pLysS yang

membawa gen RNA helikase. Lalu diinkubasi dalam inkubator goyang

dengan suhu 37⁰C, kecepatan 150 rpm dan dibiarkan semalam.

Tahap selanjutnya adalah kultur, yaitu hasil prekultur

diinolukasikan kedalam media LB 400 ml yang sebelumnya telah diberi

ampisilin 100 µg/ml dan diinkubasi dalam inkubator goyang suhu 37⁰C,

150 rpm selama satu jam. Setelahnya ditambahkan IPTG (isopropil β-D-

tiogalakto-piranoside) 0,3 mM dan diinkubasi kembali selama 3 jam pada

suhu 37⁰C dan kecepatan 150 rpm.

Selanjutnya hasil kultur dipindahkan dalam tube 50 ml, divortex

terlebih dahulu kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm

20


selama 10 menit untuk mendapatkan pelet. Supernatan dibuang dan pelet

yang diperoleh disimpan pada suhu -20⁰C. Untuk tahap berikutnya,

terlebih dahulu dibuat larutan buffer B yang terdiri dari campuran Tris-

HCl 10 mM pH 8,5, Tween 20 0.25% dan NaCl 100 mM. Selanjutnya

dibuat buffer elusi dengan cara mencampurkan imidazol 400 mM kedalam

buffer B.

Pelet yang diperoleh dilakukan pengeringbekuan sebanyak tiga

kali. Kemudian dilanjutkan dengan sonikasi (pemecahan sel dengan

menggunakan sonikator dengan amplitudo 40 cycle 0,5 selama 15 detik)

dilakukan tiga kali dengan interval 1 menit. Selanjutnya disentrifugasi

dengan kecepatan 7000 rpm selama 2 menit. Supernatan diambil dan

dimasukkan ke dalam tube 50 ml, sedangkan pelet disimpan pada suhu -

20⁰C untuk pengujian SDS PAGE. Supernatan tersebut ditambahkan resin

TALON 200 µl dan diletakkan pada rotary cold room selama 3 jam.

Setelahnya, supernatan disentrifugasi selama 7 menit dengan

kecepatan 3500 rpm. Supernatan (inner volume) yang diperoleh

dipindahkan untuk pengujian SDS PAGE, sedangkan pelet ditambahkan

buffer B sebanyak 10 ml dan diaduk secara perlahan. Kemudian

disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3500 rpm.

Supernatan yang diperoleh dipindahkan (washing 1) dan peletnya

ditambahkan buffer B sebanyak 10 ml, lalu disentrifugasi kembali selama

3 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan yang diperoleh (washing

2) dipisahkan dari peletnya. Pelet ini dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml dan

disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Kemudian

ditambahkan 400 µl buffer elusi dan diletakkan pada rotary cold room

selama satu malam. Kemudian pelet tersebut disentrifugasi selama 5 menit

dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan (E1/Elution 1) yang diperoleh

dipindahkan, sedangkan endapannya dicuci dengan 100 µl larutan buffer

elusi dan disentrifugasi kembali selama 1 menit dengan kecepatan 3500

rpm. Supernatan (E2/Elution 2) dan resin yang diperoleh dipisahkan dan

disimpan pada suhu 4⁰C.

21


3.3.9 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE 8%

Enzim RNA helikase dianalisa kemurniannya menggunakan

metode SDS-PAGE. Plat kaca yang terdiri atas short plate dan spacer

plate dibersihkan terlebih dahulu dengan alkohol 70%. Short plate

ditempatkan pada bagian depan kaca spacer yang sebelumnya diberi

casting frame pada bagian tengah dan dikunci menggunakan casting stand.

Selanjutnya dibuat larutan separating gel yang terdiri dari 1,5 Tris pH 8.8,

30% Akrilamid, 10% Amonium persulfat dan TEMED. Larutan tersebut

dimasukkan diantara celah short plate dan spacer plate sampai terisi dua

pertiga bagian, kemudian sepertiganya diisi dengan aquades hingga penuh

dan ditunggu hingga terbentuk gel selama ± 30 menit.

Setelah terbentuk separating gel, larutan gel stacking dibuat sesuai

dengan bahan-bahan yang terdiri dari 0,5 Tris pH 6.8, 30% Akrilamid,

10% Amonium persulfat dan TEMED. Sebelum larutan gel stacking

dimasukkan, aquades pada gel separating dibuang. Kemudian larutan gel

stacking dimasukkan sampai batas atas kaca, lalu comb dipasangkan dan

ditunggu selama ± 30 menit hingga gel memadat. Gel dipindahkan dari

casting frame, gel cassette sandwich ditempatkan pada electrode assembly

dengan posisi short plate menghadap kedalam, lalu ditempatkan ke dalam

clamping frame, dan ditutup kedua camp levers pada clamping frame.

Lower inner chamber dimasukkan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi

dengan working solution (buffer elektroforesis SDS 1x pH 8,3).

Masing-masing sampel yang akan diuji dengan SDS PAGE 8%

yaitu pelet, supernatan, inner volume, washing 1, washing 2, elution 1,

elution 2 dan resin diambil 4 µl dan ditambahkan loading dye 10 µl,

kemudian didenaturasi dengan cara dipanaskan di dalam waterbath pada

suhu 90⁰C selama 15 menit. Sampel tersebut dimasukkan ke dalam well

sebanyak 5 µl. Kemudian gel dielektroforesis pada 40 mA selama 90

menit. Kemudian gel diangkat dan direndam dalam larutan staining

comassie blue G-250 selama 1 jam sambil digoyang diatas rocker. Gel

dibilas dengan larutan Commassie Blue G-250 Destaining ± 30 menit

22


dengan 2 kali pengulangan. Setelahnya dibilas dengan aquades hingga bau

asam hilang (Utama et al, 2000).

3.3.10 Uji Aktivitas ATPase RNA Helikase HCV

Pengujian aktivitas ATPase RNA helikase HCV ini berdasarkan

metode ATPase kolorimetri. Enzim RNA helikase dibuat pengencerannya

terlebih dahulu yaitu 5x, 10x, 20x, 40x, dan 80x. Pengenceran yang

dilakukan menggunakan MOPS 10 mM. Kemudian pembuatan larutan

master mix yang terdiri dari ddH2O, MOPS 0.1 M, MgCl2 0.1 mM, dan

ATP 0.1 mM. Selanjutnya dilakukan pengujian dengan cara mengisi tiap

microtiter plate 96-well dengan 5 µl pengenceran enzim dan 45 µl master

mix. Blanko dibuat dengan komposisi 5 µl aquades dan 45 µl master mix.

Pengujian ini dilakukan secara triplo. Campuran reaksi tersebut diinkubasi

selama 45 menit pada suhu ruang. Hasil reaksi divisualisasikan dengan

penambahan larutan pewarna yang terdiri dari 0.081 % malachite green,

H2O, 5.7 % amonium molibdat dalam HCl 6 M dan 2.3 % polivinil alkohol

dengan perbandingan 2:2:1:1. Setelah selesai masa inkubasi, larutan

pewarna dimasukkan ke dalam masing-masing well sebanyak 100 µl dan

diinkubasi kembali selama 5 menit pada suhu ruang. Kemudian

ditambahkan Na sitrat sebanyak 25 µl untuk menghentikan reaksi

pewarnaan. Asorbansi hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 405 nm

dan 620 nm (Utama et al, 2000).

3.3.11 Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap RNA Helikase

HCV

Pengujian aktivitas inhibisi ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa

L) terhadap enzim RNA Helikase dilakukan berdasarkan metode ATPase

kolorimetri (Utama et al, 2000). Ekstrak biji jintan hitam dimasukkan

sebanyak 5 µl ke dalam setiap well, lalu ditambahkan 45 µl larutan master

mix yang sudah ditambahkan dengan pengenceran enzim. Blanko dibuat

dengan komposisi 5 µl aquades dan 45 µl larutan master mix. Untuk

kontrol aktivitas enzim berupa campuran larutan master mix yang sudah

ditambahkan dengan pengenceran enzim, sedangkan kontrol negatif

23


berupa campuran 5 µl metanol dan 45 µl campuran master mix yang sudah

ditambahkan dengan pengenceran enzim. Semua pengujian dilakukan

secara triplo. Campuran reaksi tersebut diinkubasi selama 45 menit pada

suhu ruang. Hasil reaksi divisualisasikan dengan penambahan larutan

pewarna yang terdiri dari 0.081 % malachite green, H2O, 5.7 % amonium

molibdat dalam HCl 6 M dan 2.3 % polivinil alkohol dengan perbandingan

2:2:1:1. Setelah selesai masa inkubasi, larutan pewarna dimasukkan ke

dalam masing-masing well sebanyak 100 µl dan diinkubasi kembali

selama 5 menit pada suhu ruang. Kemudian ditambahkan Na sitrat

sebanyak 25 µl untuk menghentikan reaksi pewarnaan. Absorbansi diukur

pada panjang gelombang 405 nm dan 620 nm menggunakan microplate

reader (Utama et al, 2000).

Nilai absorbansi yang diperoleh akan digunakan untuk menghitung

persentase aktivitas inhibisi ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L)

terhadap RNA Helikase HCV. Persentase inhibisi ekstrak biji jintan hitam

terhadap RNA helikase dapat dihitung dengan rumus :

% Inhibisi = x 100%

Keterangan : A = absorbansi enzim RNA helikase tanpa penambahan sampel. I = absorbansi enzim RNA helikase dengan penambahan sampel

3.3.12 Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV

Fraksi-fraksi yang diperoleh dari kolom kromatografi yang telah diuji

aktivitas inhibisi terhadap enzim RNA helikase HCV, kemudian dihitung

aktivitas RNA helikase dengan menghitung kadar fosfat yang dilepaskan.

Fosfat tersebut terbentuk dari hasil reaksi antara RNA helikase dengan ATP

yang menghasilkan ADP dan Pi (fosfat bebas). Perhitungan aktivitas RNA

helikase dilakukan dengan memasukkan nilai absorbansi λ 620nm–405nm

ke dalam persamaan kurva standar fosfat (Lampiran 18).


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Determinasi Biji Jintan Hitam

Determinasi dilakukan untuk mengidentifikasi sampel yang digunakan

dalam penelitian ini. Determinasi dilakukan di Herbarium Bogoriense

Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI Cibinong. Hasil determinasi

menyatakan bahwa sampel merupakan jenis Nigella sativa L dari suku

Ranuculaceae (Lampiran 1).

4.2 Rendemen Ekstrak

Ekstraksi biji jintan hitam ini dilakukan dengan metode maserasi.

Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan

pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur

ruang (Depkes, 2000). Metode maserasi ini biasanya digunakan untuk

senyawa-senyawa yang tidak tahan pemanasan (Tiwari, P et al, 2011).

Prinsip ekstraksi dengan metode maserasi didasarkan pada kelarutan

komponen didalam pelarutnya. Kelarutan suatu komponen tergantung pada

derajat kepolarannya. Hukum “like dissolved like” menyatakan bahwa

senyawa yang bersifat polar hanya dapat larut dalam pelarut polar dan

semipolar, begitupun sebaliknya senyawa yang bersifat nonpolar hanya

dapat larut dalam pelarut nonpolar dan semipolar (Yuliani, 2010)

Simplisia serbuk biji jintan hitam sebanyak 300 gram dimaserasi

dengan menggunakan pelarut n-heksana yang bersifat non polar. Hal ini

bertujuan agar senyawa-senyawa yang bersifat non polar yang terkandung di

dalamnya dapat tertarik oleh pelarut n-heksana tersebut. Proses maserasi ini

dilakukan selama 3 x 24 jam. Hasil maserasi disaring dan diperoleh filtrat

yang kemudian dikentalkan dengan rotary evaporator pada suhu 40⁰C

hingga diperoleh ekstrak kental. Prinsip penggunaan rotary evaporator

adalah pemekatan filtrat dengan penguapan pada tekanan rendah dan

temperatur sesuai dengan pelarutnya. Pelarut pada sampel akan teruapkan

dan melewati kondensor sehingga berubah kembali menjadi larutan dan

25


tertampung pada receiving part sedangkan untuk ekstrak jintan hitam

terbentuk pada evaporation part. Pemekatan dihentikan ketika pelarut tidak

menetes pada receiving part dengan asumsi bahwa sudah tidak ada pelarut

yang terkandung didalam sampel (Yuliani, 2010). Rendemen ekstrak yang

diperoleh yaitu sebesar 20,54%. Nilai rendemen memperlihatkan bahwa

ekstrak yang diperoleh dengan metode maserasi menggunakan pelarut n-

heksana cukup banyak. Hal ini dapat dijelaskan dengan adanya

kemungkinan bahwa biji jintan hitam didominasi oleh senyawa-senyawa

non polar.

4.3 Penapisan Fitokimia

Tujuan dilakukannya penapisan fitokimia ini adalah mengetahui

golongan metabolit sekunder yang terdapat didalam ekstrak biji jintan hitam

(Nigella sativa L.) yang diekstraksi dengan n-heksana.

Tabel 4.1 Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Biji Jintan Hitam

Metabolit sekunder Hasil

Alkaloid -

Flavonoid -

Saponin -

Tannin -

Fenol -

Terpenoid +

Triterpenoid +

Minyak Atsiri +

Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak biji jintan hitam

dalam n-heksana positif mengandung metabolit terpenoid, triterpenoid dan

minyak atsiri. Golongan terpenoid teridentifikasi dengan terbentuknya

lapisan berwarna kuning setelah penambahan kloroform dan asam sulfat

pekat. Golongan triterpenoid ditunjukkan dengan terbentuknya cincin

26


kecoklatan pada perbatasan dua pelarut. Sedangkan kandungan minyak

atsiri ditandai dengan residu yang tetap beraroma khas.

4.4 Parameter Standar.

Parameter standar yang dilakukan terhadap ekstrak kental biji jintan

hitam dapat dilihat pada tabel 4.2

Tabel 4.2 Parameter Standar Ekstrak

Parameter Ekstrak

Susut pengeringan 2,639 %

Kadar abu 0,297 %

Pemeriksaan kadar abu dilakukan dengan memanaskan bahan pada

temperatur dimana senyawa organik dan turunannya akan terdekstruksi dan

menguap, sehingga yang tertinggal hanya unsur mineral dan anorganik.

Tujuan penetapan kadar abu adalah untuk memberikan gambaran

kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal pada proses awal

sampai terbentuknya ekstrak. Batas kadar abu total jintan hitam yang

diperbolehkan yaitu tidak lebih dari 8,00% seperti yang telah dijelaskan

dalam Materi Medika jilid III. Dari tabel diatas maka diketahui bahwa

ekstrak kental jintan hitam masuk dalam persyaratan yang dianjurkan.

Sementara, nilai pada susut pengeringan menyatakan jumlah maksimal

senyawa yang mudah menguap atau hilang pada proses pengeringan.

4.5 Pemisahan Senyawa Inhibitor Dengan Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom digunakan sebagai pemisahan tahap awal

terhadap senyawa yang terkandung dalam ekstrak biji jintan hitam (Nigella

sativa L.). Kromatografi kolom bekerja sama seperti kromatografi lapis tipis

dimana molekul senyawa yang terikat lemah dengan fase diamnya akan

keluar lebih dahulu dibandingkan dengan senyawa yang terikat kuat dengan

fase diamnya.

Kromatografi kolom dalam penelitian ini menggunakan fase diam

silika gel F254 (Merck). Sedangkan eluen yang digunakan sebagai fase

27


geraknya adalah eluen bergradien, yaitu n-heksana:etil asetat dengan

berbagai perbandingan (100:0–0:100). Sampel ekstrak biji jintan hitam yang

dimasukkan ke dalam kolom sebanyak 4 ml dengan konsentrasi 1 g/ml, lalu

dilanjutkan dengan memasukkan eluen n-heksana:etil asetat tersebut.

Senyawa yang keluar ditampung sebanyak 4 ml untuk masing masing

fraksi. Seluruh fraksi yang diperoleh kemudian diuapkan dan dilarutkan

kembali dengan metanol absolut sehingga konsntrasinya menjadi 100.000

ppm. Fraksi-fraksi ini kemudian diuji aktivitas inhibisinya terhadap enzim

RNA helikase HCV dengan metode uji kolorimetri ATPase.

4.6 Produksi Enzim RNA Helikase HCV

4.6.1 Ekspresi Enzim RNA Helikase HCV

Tahap pertama dimulai dengan prekultur yang dilakukan dalam

media cair Luria Bertani (LB) 10 ml. Media LB ini merupakan media

yang cocok untuk pertumbuhan bakteri karena terdiri dari komponen yang

kompleks yaitu tripton, ekstrak khamir, dan natrium klorida. Dalam tahap

prekultur ini ditambahkan antibiotik ampisilin pada media LB yang

berfungsi sebagai selection marker terhadap pertumbuhan E.coli

BL21(DE3) pLysS-RNA helikase HCV rekombinan yang juga

mengandung gen resisten ampisilin. Oleh karena itu, dengan penambahan

ampisilin ini diharapkan dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain

sehingga hanya bakteri E.coli yang membawa gen RNA HCV tersebut

yang dapat tumbuh. Media yang sudah dimasukkan bakteri E.coli tersebut

dikultur dalam shaker incubator pada suhu 37⁰C dengan kecepatan 150

rpm selama satu malam (Pelzar & Chan, 1986).

Tahap kedua adalah kultur bakteri E.coli BL21(DE3) pLysS-RNA

helikase HCV rekombinan yaitu dengan memindahkan hasil prekultur ke

medium LB 400 ml yang sebelumnya telah ditambahkan ampisilin.

Kemudian diinkubasi kembali pada suhu 37⁰C dengan kecepatan 150 rpm

dan Isopropil β-D-thiogalaktopiranosida (IPTG) ditambahkan pada saat

nilai OD600 (Optical Density) kultur sel E.coli mencapai 0,3, karena pada

nilai tersebut kultur bakteri mencapai fase logaritmik. Fase ini merupakan

28


fase awal dimana bakteri E.coli tumbuh. Penambahan IPTG tersebut

bertujuan untuk menginduksi gen RNA helikase HCV agar terjadi ekspresi

yang berlebih hingga fase awal stasioner dimana nilai OD600 mencapai 1

(Utama et al, 2000).

Kemudian bakteri E.coli yang membawa gen RNA helikase HCV

tersebut dipanen dengan sentrifugasi bertingkat. Sentrifugasi bertingkat ini

bertujuan untuk memisahkan E.coli dari media LB. Proses sentrifugasi

dilakukan pada suhu 4⁰C dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit.

Bakteri E.coli akan mengendap sebagai pelet sedangkan media LB terpisah

sebagai supernatan. Pelet yang telah terkumpulkan disimpan pada suhu -

200C untuk menghindari kerusakan pada sel dan menjaga stabilitas enzim

RNA Helikase HCV.

4.6.2 Purifikasi Enzim RNA Helikase HCV

Purifikasi enzim RNA HCV bertujuan untuk memurnikan hasil

ekspresi enzim RNA helikase HCV yang telah disisipkan dalam bakteri E.

coli BL 21 (DE3) pLysS. Proses purifikasi ini diawali dengan pemecahan

sel terlebih dahulu. Pemecahan sel dilakukan dengan dua tahap yaitu

pengeringbekuan (freeze thawing) dan sonikasi. Pengeringbekuan

dilakukan dengan menempatkan sel secara bergantian pada suhu -20⁰C

dan suhu ruang, masing-masing selama 30 menit sebanyak tiga kali

pengulangan. Pengeringbekuan menyebabkan pembentukan kristal es pada

sel E.coli yang membawa gen RNA helikase HCV. Kristal es terbentuk

akibat dilakukannya pengeringbekuan yang berulang terhadap cairan

intraselular dan cairan ekstraselular. Proses inilah yang memudahkan

pemecahan sel (Schwen & Melling, 1985).

Pemecahan sel tahap kedua yaitu sonikasi yang bertujuan untuk

memecah dinding sel. Metode sonikasi ini akan merusak organel dalam sel

namun tidak merusak integritas (kemampuan) fungsionalnya. Sebelum

dilakukan sonikasi, pelet HCV ditambahkan terlebih dahulu dengan dapar

B (10 mM Tris HCl pH 8,5, 100 mM NaCl dan 0,25% Tween 20). Tris

HCl berfungsi sebagai dapar untuk mempertahankan pH enzim RNA

29


helikase selama proses purifikasi. Tween 20 digunakan untuk merusak

lipid bipolar pada membran sel. Natrium Klorida berperan untuk

menghilangkan kontaminan dan asam nukleat yang berikatan tidak spesifik

dengan RNA helikase (Vanz et al, 2008).

Setelah proses sonikasi, selanjutnya dilakukan sentrifugasi untuk

mengambil supernatannya. Supernatan ini berupa metabolit intraseluler

yang perlu dimurnikan. Proses pemurnian menggunakan resin TALON

dan dibiarkan selama 3 jam didalam cold rotary room. Resin TALON

bekerja dengan cara mengikat RNA helikase yang telah dilabel dengan

6xHis-Tag pada N terminalnya. Pengikatan ini dilakukan oleh logam Co2+

yang terdapat dalam resin TALON. RNA helikase yang telah diikat oleh

resin TALON dipisahkan dari metabolit intraseluler lainnya dengan

sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan 3500 rpm selama 7 menit.

Resin yang telah berikatan dengan RNA helikase dicuci dengan

menggunakan dapar B dengan maksud untuk menghilangkan protein non

target. Pencucian selanjutnya menggunakan dapar elusi (imidazol dalam

dapar B), dimana imidazol yang terdapat dalam dapar elusi ini akan

memutus ikatan antara RNA helikase dengan resin TALON. Setiap proses

pencucian dilanjutkan dengan sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan

3500 rpm selama 5 menit untuk memisahkan resin dan supernatannya.

Setiap hasil sentifugasi pada tahap pemurnian enzim dikoleksi untuk

dianalisis dengan menggunakan metode SDS-PAGE. Penggunaan

kecepatan tersebut untuk menghindari kerusakan enzim dan mencegah

penurunan aktivitasnya (Sambrook & Russel, 2001).

4.7 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE

Uji kemurnian enzim RNA helikase HCV dengan menggunakan SDS

PAGE. Adapun prinsip kerjanya adalah pemisahan berdasarkan migrasi

protein pada media penyangga. Komposisi SDS PAGE adalah akrilamid,

Tris HCL, H2O, tetramethylethylendiamine dan amonium persulfat.

Akrilamid berguna sebagai pembentuk gel, Tris HCl berguna sebagai dapar

atau pengatur keseimbangan pH. Amonium persulfat sebagai inisiator dalam

30


proses polimerasi akrilamid menjadi poliakrilamid, sedangkan tetramethyl-

ethylendiamine berguna sebagai katalisator reaksi polimerasi akrilamid

menjadi akrilamid sedangkan H2O sebagai pencuci pada proses pembuatan

gel akrilamid. Untuk pewarnaan hasil SDS-PAGE digunakan pereaksi

warna commasie blue dan destain for commasie sebagai pembilasnya

sehingga dapat menampakkan pita protein sesuai ukuranya.

Gambar 4.1. Hasil SDS PAGE RNA helikase HCV

(S: Supernatan, W1: Washing 1, IV: Inner Volume, M: Marker, E1: Elusi 1)

Dari hasil SDS PAGE pada gambar 4.1 menunjukkan enzim RNA

helikase HCV memiliki bobot molekul 54 kDa. Enzim RNA helikase yang

dipurifikasi dapat dikatakan telah murni karena menunjukkan pita tunggal

dan sesuai dengan marker (BIORAD®). Pada lajur pelet tidak terlihat

adanya pita protein dikarenakan metabolit intraseluler telah berada dalam

supernatan (S). Pada lajur inner volume (IV) dan supernatan (S) masih

terlihat banyak pita protein dikarenakan masih banyak metabolit intraseluler

yang belum termurnikan melalui tahap purifikasi. Lajur washing (W) yang

merupakan hasil tahap pencucian dengan resin TALON tidak menunjukkan

adanya pita protein yang berarti pada proses pencucian ini tidak terbawa

protein RNA helikase. Namun hasil SDS PAGE ini yang belum terlalu

bagus dikarenakan proses destaining commassie blue yang terlalu cepat

Pelet S W1 IV M E1

37 kDa

50 kDa

85 kDa

120 kDa

54 kDa

31


sehingga larutan commassie blue yang memberikan warna biru masih

terlihat sangat pekat pada gel SDS PAGE.

4.8 Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan

Hitam terhadap Enzim RNA Helikase HCV

Uji aktivitas inhibisi fraksi kolom kromatografi ekstrak biji jintan

hitam terhadap enzim RNA helikase HCV menggunakan metode

kolorimetri ATPase. Uji kolorimetri ATPase memerlukan larutan master

mix. Larutan ini terdiri dari air suling, asam 4-morfolinopropana sulfonat

(MOPS), MgCl2, adenosin trifosfat (ATP) dan enzim RNA helikase yang

telah diencerkan dengan aquades. MOPS berperan sebagai dapar dalam

larutan master mix. Buffer ini bertujuan untuk menjaga stabilitas enzim.

ATP yang ditambahkan berperan sebagai substrat pada pengujian ATPase

kolorimetri. Mg2+ diperlukan sebagai kofaktor RNA helikase sehingga

MgCl2 berfungsi sebagai donor kofaktor dalam master mix. (Utama et al,

2000). Pada saat pengujian kolorimetri ATPase, fraksi kolom kromatografi

ekstrak biji jintan hitam yang sudah dilarutkan dalam metanol ditambahkan

sebanyak 5 µl ke dalam satu well yang sudah terdapat 45 µl master mix.

Sehingga konsentrasi fraksi yang diujikan menjadi 10.000 ppm.

Uji kolorimetri ATPase ini melibatkan pengukuran serapan senyawa

organik yang dilepaskan ATP oleh enzim RNA helikase. Aktivitas enzim

RNA helikase bergantung pada ATP sebagai donor energi. Prinsip ujinya

adalah pengukuran fosfat bebas yang terbentuk dari hasil reaksi antara RNA

helikase dengan ATP yang menghasilkan ADP dan Pi (fosfat anorganik). Pi

bebas akan membentuk kompleks warna dengan pereaksi ammonium

molibdat membentuk fosfomolibdat. Fosfomolibdat dapat bereaksi dengan

enzim RNA helikase dan enzim akan mengendap dan menimbulkan

kekeruhan. Polivinil alkohol akan melarutkan kembali enzim yang

terendapkan sehingga tidak menimbulkan kekeruhan. Warna yang terbentuk

sebanding dengan konsentrasi Pi yang dihasilkan dari reaksi RNA helikase

dan ATP (Chan et al, 1986). Na sitrat digunakan untuk menghentikan

reaksi enzimatik yang mengakibatkan terjadinya warna yang berlebih.

32


Selajutnya absorbansi diukur dengan menggunakan multiscan EX

pada panjang gelombang 620 nm dan 405 nm. Panjang gelombang 620 nm

adalah serapan optimum dari kompleks fosfomolibdat malachite green hasil

reaksi larutan pewarna dengan fosfat bebas hasil hidrolisis ATP yang

menghasilkan warna hijau kebiruan. Sedangkan warna kuning merupakan

warna yang dihasilkan oleh larutan pewarna yang tidak berikatan dengan Pi.

Penggunaan dua panjang gelombang bertujuan agar perhitungan reaksi

antara enzim dengan substrat lebih akurat. Perhitungan konsentrasi Pi

dihasilkan dengan membandingkan nilai absorbansi dari pembacaan kedua

panjang gelombang tersebut (Chan et al, 1986).

Gambar 4.2 Diagram Inhibisi Fraksi Kromatografi Kolom Ekstrak Biji

Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap RNA Helikase HCV

Dari diagram hasil uji kolorimetri ATPase menunjukkan fraksi kolom

kromatografi dari ekstrak biji jintan hitam menunjukkan adanya aktivitas

untuk menghambat enzim RNA helikase HCV. Fraksi tertinggi dalam

menghambat RNA helikase HCV dari ekstrak biji jintan hitam ditunjukkan

oleh fraksi 10, 11 dan 12 yaitu dengan persen inhibisi masing-masing

77,170%, 76,381% dan 73,709%. Perbedaan aktivitas inhibisi diantara

fraksi-fraksi tersebut tidak jauh dikarenakan masih berada pada gradien

33


yang sama yaitu dielusi dengan menggunakan eluen n-heksana:etil asetat

9:1.

Terlihat adanya perbedaan dari hasil uji aktivitas inhibisi RNA

helikase HCV dari fraksi kolom dengan ekstrak kental yang belum

dipisahkan dimana persentase inhibisi ekstrak kental biji jintan hitam

dengan konsentrasi yang sama yaitu 66,935% dengan konsentrasi 10.000

ppm (lampiran 15). Hasil fraksi kolom kromatografi memberikan aktivitas

yang lebih tinggi, dikarenakan senyawa yang memberikan aktivitas pada

ekstrak biji jintan hitam telah berhasil dipisahkan dari komponen senyawa

lain.

Sebaiknya untuk pengerjaan yang lebih efisien, tidak perlu dilakukan

pengujian aktivitas inhibisi pada semua fraksi, namun terlebih dahulu

melakukan uji kromatografi lapis tipis (KLT) terhadap fraksi-fraksi yang

diperoleh. Kemudian fraksi yang memiliki spot yang sama digabung, lalu

dilakukan uji aktivitas inhibisi enzim RNA helikase. Dari gambar 4.3

terlihat bahwa fraksi 10 hingga 17 menunjukkan spot yang sama, sehingga

dapat digabung dalam pengujian aktivitas inhibisinya.

Gambar 4.3 KLT pada Fraksi Hasil Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan

Hitam (Nigella sativa L.)

4.9 Perhitungan Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV

Prinsip dari perhitungan aktivitas enzim RNA helikase HCV ini

adalah dengan menghitung fosfat bebas yang terbentuk dari hasil reaksi

antara RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan ADP dan Pi (fosfat

anorganik). Aktivitas enzim RNA helikase dapat dilihat pada gambar 4.5.

34


Gambar 4.4 Diagram Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Aktivitas enzim RNA helikase sebelum penambahan senyawa

inhibitor adalah 517,548 pmol fosfat/ml/menit/pmol protein. Aktivitas

inhibitor enzim RNA helikase HCV yang berada pada fraksi kesepuluh

menunjukkan aktivitas enzim RNA helikase yang berkurang menjadi

53,5938 pmol fosfat/ml/menit/pmol protein.

Dari gambar diatas, menunjukkan bahwa terjadi penurunan aktivitas

enzim RNA helikase setelah penambahan senyawa inhibitor. Aktivitas

enzim RNA helikase ini berbanding terbalik dengan persentase inhibisi,

dimana semakin tinggi persen inhibisi maka semakin rendah aktivitas enzim

RNA helikase dan sebaliknya semakin rendah persen inhibisi maka semakin

tinggi aktivitas enzim RNA helikase.

Pada penelitian Kacem dan Meraihi (2006), telah melaporkan bahwa

ekstrak minyak atsiri dari biji jintan hitam mampu menghambat enzim

elastase neutrofil (HNE) yang dapat merusak jaringan elastin sehingga

merusak saluran napas dan alveoli. Jumlah enzim elastase ini akan

meningkat pada perokok. Konsentrasi inhibisi tertinggi dari ekstrak minyak

atsiri jintan hitam tersebut dalam menghambat aktivitas enzim HNE adalah

5.8 mg/ml. Merujuk dari penelitian tersebut diketahui bahwa konsentrasi

fraksi hasil kolom kromatografi yang digunakan pada uji aktivitas inhibisi

RNA helikase ini masih tinggi yaitu 10.000 ppm, sehingga perlu dilakukan

pengujian lebih lanjut dengan konsentrasi yang lebih rendah yang tetap

mampu menghasilkan aktivitas inhibisi yang optimal.


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Adanya aktivitas inhibisi terhadap enzim RNA helikase virus hepatitis

C pada fraksi kolom kromatografi ekstrak biji jintan hitam (Nigella

sativa L.).

2. Aktivitas tertinggi dalam menghambat RNA helikase HCV dari

ekstrak biji jintan hitam ditunjukkan oleh fraksi 10 yaitu dengan

persen inhibisi 77,170% pada konsentrasi 10.000 ppm dan aktivitas

enzim RNA helikase sebesar 53,5938 pmol fosfat/ml/menit/pmol

protein

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pemisahan senyawa

bioaktif dari ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.) untuk

mengetahui senyawa yang lebih spesifik yang berpotensi sebagai

inhibitor RNA helikase HCV.

2. Perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan metode in vivo untuk

mengetahui apakah ekstrak benar-benar mampu menghambat aktivitas

dari RNA helikase HCV.

3. Untuk penelitian yang menggunakan metode kromatografi kolom,

sebaiknya fraksi yang diperoleh dilakukan uji kromatografi lapis tipis

(KLT) terlebih dahulu agar pengerjaan yang dilakukan lebih efisien.


DAFTAR PUSTAKA

Al -Albani, Muhammad Nashiruddin. 1996. Shahih Sunan Ibnu Majah. Jakarta:

Pustaka Azzam

Al -Ali, A., Abdul, A.A., Mohammad, A.R., dan Nisar, A.S. 2008.Oral and

Intraperitoneal LD50 of Thymoquinone, An Active Principle of Nigella

sativa, in Mice and Rats. Journal Ayub Medical College Abbottabad, Vol.

20

Ayoola, G.A et al.2008. Phytochemical Screening and Antioxidant Activities of

Some Selected Medicinal Plants Used for Malaria Therapy in Southwestern

Nigeria. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, September 2008; 7

(3): 1019-1024

Brass V, Moradpour D, Blum HE. 2006. Molecular virology hepatitis C virus

(HCV): 2006 update. International Journal of Medicine Science. 3:29-34

Caprette DR. 2005. Preparing SDS-Gels. Experimental Biosciences. Introductory

Laboratory-Bios 211. Rice University

Chan KM, Delfert D dan Junger KD. 1986. A direct Colorimetric Assay for Ca2+

Stimulated ATPase Activity. Anal Biochem 157:375 – 380

Departemen Kesehatan RI., 1979. Materia Medika Indonesia jilid III. Jakarta:

Departemen Kesehatan RI.

Departemen Kesehatan RI., 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan.

Jakarta: Departemen Kesehatan RI.

Elfita, L et al.. 2009. Purifikasi Inhibitor ATPase/RNA Helikase Virus Japanese

Encephalitis dari Streptomyces Chartreusis. Majalah Ilmu Kefarmasian,

Vol. VI, No. 2, 88 – 96

Fan L et al.. 2008. XPD helicase structures and activities: insight into the cancer

and aging phenotypes from XPD mutations. Cell 133: 789-800

37


Gam LH and Latiff A. 2005. SDS-PAGE electrophoretic property of human

chorionic gonadotropin (hCG) and its β-subunit. Int.J.Biol.Sci 1(3): 103-

109.

Gilani, A.H.,Qaiser, J. dan Muhammad, A.U.K. 2004. A Review of Medicinal and

Pharmacological activities of Nigella sativa. Pakistan Journal of Biological

Science, Vol. 7

Gritter RJ, Bobbitt JM, and Schw AE. 1991. Pengantar Kromatografi, Edisi II.

Diterjemahkan oleh Padmawinata K. Bandung : ITB Bandung.

Hairany, Ainun. 2010. Pemurnian dan Karakterisasi Protein Inhibitor RNA

Helikase Virus Hepatitis C dari Streptomyces chartreusis 5-095 [Tesis].

Bogor: Institut Pertanian Bogor.

Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. Ed ke-1. New York: McGraw Hill

Heinrich et al. 2009. Farmakognosi dan Fitoterapi. Jakarta: EGC

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/en/

Indrayani L, Soetjipto H dan Sihasale L. 2006. Skrining Fitokimia dan Uji

Toksisitas Ekstrak Daun Pecut Kuda (Stachytarpheta jamaicensis L. Vahl)

terhadap Larva Udang Artemia salina Leach. Berk Penel Hayati : 12 (57-61)

Jovanovic S, Barac M, Macej O, Vucic T, and Lacnjevac C. 2007. SDS-PAGE

analysis of soluble proteins in reconstituted milk expose to different heat

treatments. Sensors 7: 371-383

Kacem, Rachid and Meraihi Zahia. 2006. Effects of essential oil extracted from

Nigella sativa (L.) seeds and its main components on human neutrophil

elastase activity. The pharmaceutical society of Japan: 301-305.

Kadare G, Haenni A. 1997. Virus encoded RNA helicases. Journal of Virology

71: 2583-2590

38


Pelzar MJ dan Chan ECS. 1988. Dasar – Dasar Mikrobiologi 2. Hadietomo et

al., penerjemah. Jakarta : UI Pr. Terjemahan dari: Element of Microbiology

Rouessac, Francis and Annick Rouessac. 2007. Chemical Analysis Modern

Instrumentation Methods and techniques Second Edition. England: WILEY.

Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold

Spring Harbor Laboratory Press New York.

Sangi, Meiske S., Momuat, Lidya I, Kumaunang, Maureen. 2012. Uji Toksisitas

Dan Skrining Fitokimia Tepung Gabah Pelepah Aren (Arenga Pinnata).

Jurnal Ilmiah Sains Vol. 12 No. 2

Schwen MD dan Melling J. 1985. Handbook of Enzyme Biotechnology. Alan

Wiseman, editor. West Sussex: Ellis Horword Ltd.

Sy T, Jamal MM. 2006. Epidemiology of hepatitis C virus (HCV) infection.

Int.J.Med.Sci 3:41-4.

United State Departement of Agriculture. 2012. Plants Profile Nigella sativa L.

http://plants.usda.gov/java/name

Utama A et al.. 2000. Identification and characterization of the RNA helicase

activity of Japaneese encephalitis virus NS3 protein. FEBS Lett 465: 74-78.

Vanz, et al. 2008 Human granulocyte colony stimulating factor (Hg-CSF):

cloning, overexpresion, purificarion, and characterization. Microbial Cell

Factories 7:13 – 15

WHO. 2002. Hepatitis C. Journal [serial on the Internet]. Available

from:www.who.int/csr/disease/hepatitis/Hepc.pdf

Yazid, Estien. 2005. Kimia Fisika untuk Paramedis. Yogyakarta: penerbit ANDI.


LAMPIRAN

40


Lampiran 1. Hasil Determinasi Biji jintan hitam (Nigella sativa L.)

41


Lampiran 2. Alur Penelitian

Determinasi biji jintan hitam (Nigella sativa L. )

Biji jintan hitam (Nigella sativa L.)

Simplisia serbuk kering

Ekstrak n-heksana dipekatkan dengan rotary evaporator

Ektrak n-heksana kental

Pemisahan senyawa dengan kolom kromatografi

Ekspresi dan purifikasi enzim RNA helikase

HCV

Uji aktivitas RNA helikase dngan

metode kolorimetri ATPase

Uji aktivitas inhibitor RNA helikase

Perhitungan Aktivitas Enzim RNA Helikase

Skrining fitokimia

Maserasi dengan n-heksana

42


Lampiran 3. Skema Kerja Persiapan Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.)

Maserasi dengan n-heksana (3 x 24 jam). Perbandingan serbuk

simplisia : pelarut (1:3)

Biji jintan hitam

Sortasi kering

Dihaluskan dengan ayakan

40 mesh

Serbuk halus biji jintan hitam

Hasil maserasi dikumpulkan

Dipekatkan dengan rotary evaporator

Ekstrak kental biji jintan hitam.

43


Lampiran 4. Skema Kerja Produksi Enzim RNA Helikase HCV

Sentrifus 3500 rpm, 10 menit (koleksi pelet)

Sentrifus 7000 rpm, 20 menit, 4⁰C

Sonikasi (amplitudo 0.5, waktu 3x15 detik, interval 1

menit)

Freeze thaw 3x, ditambah 10 ml

buffer B

Sentrifus 5000 rpm, 10 menit, 4⁰C, pelet disimpan pada suhu -

20⁰C

Pelet + Resin TALON, binding selama 3 jam di

cold rotary room

Sentrifus 3500 rpm, 5 menit. Pelet + buffer elusi. Binding

semalaman di cold rotary room

Sentrifus 3500 rpm, 7 menit, 4⁰C. Pelet + 10 ml

buffer B

Konfirmasi kemurnian dgn SDS PAGE

RNA helikase HCV

0,3 M IPTG, shaker 150 rpm,

37⁰C, 3 jam

10 ml E. coli rekombinan

diinokulasi pada media LB yang ditambahkan

Shaker 150 rpm, 37⁰C, 1

44


Lampiran 5. Skema Kerja Analisis Kemurnian Enzim RNA helikase HCV dengan SDS - PAGE

Commasie blue staining

Destain for commasie blue

Hasil SDS PAGE di scan

Denaturasi pada suhu 95⁰C, 15 menit

Preparasi gel ( stacking dan separating)

Running SDS PAGE

Sample + loading dye

45


Lampiran 6. Skema Kerja Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV

Inkubasi selama 45 menit dalam suhu ruang

Tambahkan larutan pewarna

(0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan 2,3% polivinil alkohol dengan perbandingan 2:1:1:2)

Inkubasi selama 5 menit pada suhu ruang

Pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 620 nm dan 405 nm dengan menggunakan

microplate reader

Tambahkan 25 µL Natrium Sitrat

Campuran master mix

(5 µL MOPS 10 mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl2 1 mM, 38,5 µL H2O, dan 5 µL RNA helikase HCV)

46


Lampiran 7. Skema Kerja Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap RNA helikase

Dibuat campuran master mix

(5 µL MOPS 10 mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl2 1 mM, 38,5 µL H2O, dan 5 µL RNA helikase

Blanko: master mix + ddH2O Enzim: master mix + enzim

Kontrol negatif: master mix + enzim + metanol

Sampel : master mix + enzim + fraksi kolom

Fraksi kolom kromatografi diuapkan, dilarutkan dengan metanol

Inkubasi selama 45 menit pada suhu ruang

Tambahkan larutan pewarna

(0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan 2,3% polivinil alkohol dengan

perbandingan 2:1:1:2)

Inkubasi selama 5 menit dalam suhu ruang

Pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 620 nm dan 405 nm dengan

menggunakan microplate reader

Tambahkan 25 µL Natrium Sitrat

47


Lampiran 8. Komposisi Larutan-Larutan yang Digunakan dalam SDS-PAGE

Larutan-larutan Komposisi

Larutan separating

8%

H2O 7,25 mL

1,5 M Tris-Cl pH 8,8 containing 0.4% SDS

3,75 mL

30% Akrilamid 4 mL

10% Amonium Persulfat 0,05 mL

TEMED 0,015 mL

Larutan stacking

3,9%

H2O 3,05 mL

0,5 M Tris-Cl pH 6,8 containing 0.4% SDS 1,25

mL

30% Akrilamid 0,65 mL

10% Amonium Persulfat 0,025 mL

TEMED 0,005 mL

Dapar sampel SDS

2X (Loading Dye)

4x Tris Cl/SDS pH 6,8 25 mL

Gliserol 20 mL

SDS 4 g

β- mercaptoethanol (2-ME) 2 mL

Bromphenol blue 1 mg

H2O sampai 100 mL

Commasie Blue G-

250 Staining

Solution (500 mL)

45% H2O 225 mL

45% Metanol 225 mL

10% Asam asetat glacial 50 mL

0,05% Commasie brilliant blue 250 mg

Commasie Blue G-

250 Destaining

Solution (1000 mL)

50% H2O 500 mL

10% Asam asetat glacial 100 mL

40% Metanol 400 mL

48


Lampiran 9. Komposisi Reagen, Dapar, dan Medium yang Digunakan

Larutan, dapar, medium

Komposisi dan Cara Pembuatan

Media LB (Luria-Bertani) cair

Media LB dibuat sebanyak 10 mL untuk prekultur dan 400 mL untuk kultur. Media LB dibuat dengan cara melarutkan sejumlah 0,25 g dan 10 g masing-masing ke dalam 10 mL dan 400 mL akuades. Semua disterilisasi pada suhu 121o C selama 15 menit.

Dapar B Dapar dibuat dengan komposisi Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM, dan Tween 20 0,25%. Dicampur menjadi satu dan diaduk hingga homogen.

Dapar Elusi Sebanyak 0,2724 g imidazol dilarutkan dalam 10 mL dapar B kemudian dihomogenkan

Adenosin 5’ trifosfat (ATP) 0,1 M

Sebanyak 0,3 g adenosine 5’ triphosphate disodium salt dilarutkan dalam nuclease free water sambil diukur pH 7,0. Sebanyak 500 µL dialikuot ke dalam 1,5 mL tabung mikrosentrifus. Disimpan pada -

20°C.

Ampisilin 100 mg/mL

Amphicillin sodium salt sebanyak 2 gram dilarutkan dalam 2 mL akuades kemudian dihomogenkan. Larutan disaring dengan filter 0,2 µm. Alikuot 1 mL ke dalam tabung 1,5 mL. Disimpan pada -20°C

Malachite green 0,081%

Sebanyak 0,081 malachite green oxalate salt dilarutkan dalam akuades hingga mencapai volume 100 mL dan dihomogenkan. Selanjutnya larutan disaring dengan kertas saring

Polivinil alkohol 2,3%

Sebanyak 2,3 g polivinil alkohol dilarutkan dalam akuades hingga mencapai volume 100 mL kemudian dihomogenkan dengan pemanasan

Ammonium molibdat 5,7% dalam HCl 6 N

Sebanyak 5,7 g ammonium molibdat tetrahidrat dilarutkan dalam HCl 6 N hingga mencapai volume 100 mL kemudian dihomogenkan

Natrium Sitrat 30% Sebanyak 3 g citric acid trisodium salt dihydrate dilarutkan dalam akuades hingga mencapai 100 mL kemudian dihomogenkan

49


Lampiran 10. Perhitungan Rendemen Ekstrak Biji Jintan Hitam

Rendemen

Ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.)

Rendemen

50


Lampiran 11. Perhitungan Parameter Standar Ekstrak Biji Jintan Hitam

1. Susut pengeringan x 100%

Berat sampel awal Berat sampel akhir

1,023 g 0,996 g

Susut pengeringan

2. Kadar abu x 100%

Berat sampel awal Berat sampel akhir

1,009 g 0,003 g

Kadar abu = 0,297%

51


Lampiran 12. Perhitungan Pengenceran Enzim

Pengenceran enzim menggunakan larutan MOPS 10 mM, dengan perhitungan

sebagai berikut:

5x pengenceran = 1/5 x 40 µl = 8 µl enzim + 32 µl MOPS 10 mM

10x pengenceran = 5/10 x 40 µl = 20 µl (5x enzim) + 20 µl MOPS 10 mM




Pembuatan larutan Mastermix

Dilakukan pengujian terhadap blanko, enzim dengan pengenceran 5x, 10x, 20x,

40x, dan 80x masing-masing dilakukan secara triplo sehingga dibutuhkan 18 well.

Larutan mastermix dibuat untuk 20 well dengan komposisi :

ddH2O : 770 µl

MOPS 0,1 M : 100 µl

MgCl2 0,1 mM : 10 µl

ATP 0,1 mM : 20 µl

Komposisi larutan pada masing-masing well

Dilakukan sebanyak triplo

Blanko = 5 µl aquades + 45 µl mastermix

Enzim 5x = 5 µl enzim 5x pengenceran + 45 µl mastermix





52


Lampiran 13. Contoh Perhitungan Pembuatan Larutan Pewarna Malachite Green

Larutan pewarna yang digunakan pada uji aktivitas enzim RNA helikase adalah

sebanyak 100 µl untuk tiap well. Sehingga dibuat larutan pewarna untuk 18 well

dengan komposisi :

ddH2O : 2 = 700 µl

0,081% Malachite green : 2 = 700 µl

2,3% Polivinyl alkohol : 1 = 350 µl

5,7% Amonium molibdat dalam 6N HCl : 1 = 350 µl

53


Lampiran 14. Contoh Perhitungan Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Biji Jintan Hitam

(Nigella sativaL.) terhadap RNA Helikase HCV

Rumus Perhitungan Pengenceran enzim yang akan digunakan pada uji ATPase :

Dan ditambahkan 147,75 µl aquabides

54


Lampiran 15. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kental Biji Jintan Hitam

(Nigella sativa L.)

Konsentrasi (ppm) Persen inhibisi (%)

10000 66,93502

5000 60,38311

2000 57,07939

1000 48,27872

500 44,30871

200 42,61521

100 34,45308

55


Lampiran 16. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak

Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.)

Absorbansi

enzim Fraksi

Absorbansi

dengan sampel % Inhibisi

Kontrol (-) 0,970 11,658

Enzim 40x 1,098

4 0,347 68,397

5 0,358 67,365

6 0,363 66,940

7 0,408 62,842

8 0,325 70,431

9 0,295 73,163

10 0,123 88,828

11 0,131 88,039

12 0,161 85,367

13 0,201 81,694

14 0,235 78,567

15 0,184 83,212

16 0,264 75,926

17 0,222 79,812

18 0,285 74,074

19 0,249 77,353

20 0,419 61,809

21 0,495 54,918

22 0,523 52,398

23 0,579 47,268

24 0,525 52,155

25 0,632 42,410

26 0,605 44,900

27 0,598 45,507

28 0,716 34,791

29 0,673 38,676

56


30 0,611 44,353

31 0,617 43,777

32 0,635 42,137

33 0,749 31,785

34 0,672 38,798

35 0,682 40,407

36 0,634 44,748

37 0,676 40,953

38 0,752 34,032

39 0,822 26,947

40 0,786 30,175

41 0,675 40,065

42 0,662 41,220

43 0,668 40,628

44 0,629 44,122

45 0,599 46,757

46 0,655 41,783

47 0,626 44,359

48 0,673 40,184

49 0,661 41,309

50 0,598 46,906

51 0,550 51,110

52 0,581 48,357

53 0,663 41,131

54 0,655 41,842

55 0,677 39,887

56 0,659 41,457

57 0,629 44,152

58 0,619 44,981

59 0,606 46,165

60 0,534 52,591

57


61 0,630 44,004

62 0,612 45,662

63 0,702 37,637

64 0,665 40,954

65 0,682 39,384

66 0,629 44,152

67 0,591 47,527

58


Lampiran 17. Contoh Perhitungan Persen Inhibisi Hasil Fraksi Ekstrak Biji Jintan

Hitam (Nigella sativa L.) terhadap RNA helikase HCV

Rumus Perhitungan :

% inhibisi = x 100

A = absorban enzim tanpa adanya senyawa inhibitor

I = absorban enzim dengan adanya senyawa inhibitor.

Contoh perhitungan pada fraksi ke-10 :

Absorbansi aktivitas inhibisi – kontrol negatif

= 88,828 % - 11,658 %

= 77,171 %

59


Lampiran 18. Kurva Standar Fosfat (Uji ATPase)

Data :

Grafik :

Konsentrasi K2HPO4 (mM)

Absorbasi 620 nm dengan referensi

405 nm 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8

1.0

0.000 0.102 0.239 0.417 0.622 0.834 1.022

y = 1.020x + 0.010

R2 = 0.9989

60


Lampiran 19. Contoh Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV

Diketahui : y = 1,020x + 0,010 (kurva standar dilihat di lampiran 18)

Sampel didilusi 40x

Absorbansi enzim = 1,098

Masa inkubasi 45 menit

1 well terdapat 5 µL enzim RNA helikase

Konsentrasi enzim RNA helikase = 18,32 µg/ µL

1 pmol = 0,05

Ditanya : Aktivitas enzim RNA helikase

Jawab : y = 1,020x + 0,010

1,098 = (1,020x) + 0,010

x = 1,0667 mM fosfat

Banyaknya fosfat yang dilepaskan dari sampel = 1,0667 mM fosfat x 40

= 4,27 x 10-5 mol fosfat/mL

Fosfat yang dilepaskan dalam 45 menit =

= 9,48 x 10-7 mol fosfat/mL/menit

Banyaknya enzim dalam 1 well = 18,32 µg/µL x 5 µL

= 91,6 µg = 1832 pmol protein

Aktivitas enzim RNA helikase =

= 517,548 pmol fosfat/mL/menit/pmol protein

61


Lampiran 20. Tabel Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV dengan Penambahan

Senyawa Inhibitor Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.)

Ket % inhibisi Aktivitas RNA

helikase

blanko

enzim 40x 517,548

kontrol (-) 456,6599

fraksi 4 56,740 160,3066

fraksi 5 55,707 165,6977

fraksi 6 55,282 167,9176

fraksi 7 51,184 189,3235

fraksi 8 58,774 149,6829

fraksi 9 61,506 135,4122

fraksi 10 77,171 53,59398

fraksi 11 76,381 57,7166

fraksi 12 73,710 71,67011

fraksi 13 70,036 90,85617

fraksi 14 66,910 107,1881

fraksi 15 71,554 82,92805

fraksi 16 64,268 120,9831

fraksi 17 68,154 100,6871

fraksi 18 62,417 130,6554

fraksi 19 65,695 113,5306

fraksi 20 50,152 194,7146

fraksi 21 43,260 230,7083

fraksi 22 40,741 243,869

fraksi 23 35,610 270,6661

fraksi 24 40,498 245,1375

fraksi 25 30,753 296,0361

fraksi 26 33,242 283,034

62


fraksi 27 33,849 279,8627

fraksi 28 23,133 335,8353

fraksi 29 27,019 315,5393

fraksi 30 32,696 285,8881

fraksi 31 32,119 288,9008

fraksi 32 30,480 297,4632

fraksi 33 20,128 351,533

fraksi 34 27,140 314,9052

fraksi 35 28,749 319,6621

fraksi 36 33,090 296,9876

fraksi 37 29,296 316,8079

fraksi 38 22,374 352,9602

fraksi 39 15,289 386,4169

fraksi 40 18,517 369,1336

fraksi 41 28,408 316,1737

fraksi 42 29,562 309,9898

fraksi 43 28,970 313,161

fraksi 44 32,464 294,4506

fraksi 45 35,100 280,3386

fraksi 46 30,125 306,9771

fraksi 47 32,701 293,1821

fraksi 48 28,526 315,5394

fraksi 49 29,651 309,5141

fraksi 50 35,248 279,5458

fraksi 51 39,453 257,0299

fraksi 52 36,699 271,7762

fraksi 53 29,474 310,4654

fraksi 54 30,184 306,6599

fraksi 55 28,230 317,1251

fraksi 56 29,799 308,7213

fraksi 57 32,494 294,2921

63


fraksi 58 33,323 289,8523

fraksi 59 34,508 283,5098

fraksi 60 40,933 249,1017

fraksi 61 32,346 295,0849

fraksi 62 34,004 286,2054

fraksi 63 25,979 329,1758

fraksi 64 29,296 311,4168

fraksi 65 27,726 319,8206

fraksi 66 32,494 294,2921

fraksi 67 35,870 276,2159

64


Lampiran 21. Gambar Alat Penelitian

Shaker incubator

Mikropipet

Microplate reader

Laminar Air Flow

Sentrifuge

Neraca analitik

Vortex

Sonikator

UJI AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI-FRAKSI HASIL KOLOM ... · KROMATOGRAFI DARI EKSTRAK BIJI JINTAN HITAM...

Documents

Transcript of UJI AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI-FRAKSI HASIL KOLOM ... · KROMATOGRAFI DARI EKSTRAK BIJI JINTAN HITAM...