AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI GELATIN TULANG IKAN PATIN

BERAT MOLEKUL TINGGI TERHADAP

ENZIM DIPEPTIDYL PEPTIDASE-IV

SKRIPSI

SELAWATI

15106015

PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS BIOINDUSTRI

UNIVERSITAS TRILOGI

JAKARTA

2020

ii

AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI GELATIN TULANG IKAN PATIN

BERAT MOLEKUL TINGGI TERHADAP

ENZIM DIPEPTIDYL PEPTIDASE-IV

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Teknologi Pangan

Pada

Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan

SELAWATI

15106015

PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS BIOINDUSTRI

UNIVERSITAS TRILOGI

JAKARTA

2020

iii

iv

v

vi

ABSTRAK

Selawati. Aktivitas Inhibisi Fraksi Gelatin Tulang Ikan Patin Berat Molekul Tinggi

Terhadap Enzim Dipeptidyl Peptidase-IV. Dibimbing oleh Yoni Atma, 2020.

Gelatin adalah bahan pendukung dalam industri pangan, farmasi dan kosmetika. Gelatin

digunakan sebagai pengemulsi dan penstabil. Sumber alternatif gelatin yang paling

potensial adalah yang berasal dari limbah produk pengolahan ikan terutama kulit dan

tulang. Salah satu ikan yang menghasilkan limbah tulang dalam kuantitas besar yakni ikan

patin. Gelatin dari tulang ikan dapat dihidrolisis lebih lanjut menjadi hidrolisat-hidrolisat

gelatin yang memiliki bioaktivitas tinggi. Hidrolisat gelatin diperoleh dari hasil hidrolisis

gelatin secara enzimatik dengan memanfaatkan enzim protease. Flavourzyme merupakan

enzim komersil yang banyak digunakan pada pembuatan hidrolisat gelatin ikan. Penelitian

ini bertujuan untuk menguji aktivitas antidiabetes fraksi hidrolisat gelatin tulang ikan

patin. Penelitian diawali dengan mengekstraksi gelatin tulang ikan patin yang dilanjutkan

dengan hidrolisis enzimatik menggunakan 3% enzim flavourzyme. Setelah itu, hidrolisat

dipisahkan dengan ultrafiltrasi kombinasi sentrifugasi 4000 rpm. Fraksi > 3kDa yang

diperoleh dimurnikan menggunakan kolom kromatografi yang mengandung gel filtrasi

fase diam sephadex G-25. Analisis meliputi aktivitas inhibisi terhadap enzim DPP-IV, uji

kadar protein, bobot aktivitas dan konsentrasi hambat setengah maksimal (IC50). Hasil

penelitian menunjukkan bahwa fraksi dengan berat molekul tinggi yang dimurnikan

dengan kolom gel filtrasi memiliki aktivitas penghambatan terhadap Dipeptidyl Peptidase-

IV sebesar 51,53% -67,86%. Fraksi ini memiliki kandungan protein 0,04 mg/mL–0,23

mg/mL. Dan bobot aktivitas 1170 sampai 268. IC50 dari hidrolisat gelatin tulang ikan

dengan berat molekul tinggi sekitar 0.0142 mg/mL.

Kata Kunci : Antidiabetes, Hidrolisat Gelatin Ikan, Inkretin, DPP-IV Inhibitor

vii

ABSTRACT

Selawati. Inhibitory Activity of High Molecular Weight Fractions Derived From Bone of

Pangasius Catfish Gelatin Hydrolysate Toward Dipeptidyl Peptidase-IV. Supervised by

Yoni Atma, 2020.

Gelatin is biomaterial used in food, medicine and cosmetic industries. The main faction

function of gelatin is as an emulsifier and stabilizer. The most potential alternative source

of gelatin is coming from fish processing by products especially skin and bone. Pangasius

catfish is one of fish that remain bone in large quantity during their filleting process.

Previously, gelatin from fish bones were hydrolyzed into gelatin hydrolysates which have

bioactivities. Gelatin hydrolysates obtained through of enzymatic hydrolysis by protease

action. Flavourzyme was used widely in order to produce fish gelatin hydrolysates. In this

study was measured the anti-diabetic bioactivity of fish gelatin fractions from bone of

pangasius sutchi. The research was began by extracting gelatin from bone of fish, then

followed by enzymatic hydrolysis using flavourzyme at enzyme substrate ratio of 3%. After

that, the hydrolysates separated by ultrafiltration coupled with centrifugation 4000 rpm.

The > 3kDa fraction which obtained was purified using chromatography column

contained stationary phase gel filtration (sephadex G-25). The analysis covering inhibitory

activity, protein content, value activity and the half maximal inhibitory concentration

(IC50). The result shows that high molecular weight fractions which purified by gel

filtration have inhibitory activity rage against dipeptidyl peptidase-IV around 51.53%-

67.86%. They have protein content 0.04 mg/mL–0.23 mg/mL. And value activity 1170-268.

The IC50 of high molecular weight fish bone gelatin hydrolisate was 0.0142 mg/mL.

Keywords: Antidiabetic, Fish Gelatin Hydrolyzate, Incretin, DPP-IV Inhibitors

viii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya

sehingga karya ilmiah dengan judul “Aktivitas Inhibisi Fraksi Gelatin Tulang Ikan Patin

Berat Molekul Tinggi Terhadap Enzim Dipeptidyl Peptidase-IV” berhasil diselesaikan.

Skripsi disusun sebagai syarat untuk menyelesaikan pendidikan dan memperoleh gelar

Sarjana Teknologi Pertanian pada Program Studi Teknologi Pangan Universitas Trilogi.

Terselesaikannya skripsi ini tidak terlepas dari bantuan banyak pihak, sehingga pada

kesempatan ini dengan segala kerendahan hati dan penuh rasa hormat penulis

menghaturkan terima kasih yang sebesar-besarnya bagi semua pihak yang telah

memberikan bantuan dalam penyusunan skripsi ini hingga selesai, terimakasih kepada :

1. Bapak Yoni Atma, S.TP., M.Si selaku Dosen Pembimbing yang telah membimbing

dan memberikan arahan, waktu, tenaga dan kontribusi selama pelaksanaan

penelitian dan penyelesaian proposal skripsi ini.

2. Kedua orang tua saya tercinta Ibu Hj. Etty Mulyati dan Bapak H. Armansyah serta

kakak, yang telah banyak mendoakan penulis dan memberi dukungan baik segi

moril maupun material.

3. Sahabat (Serendipity) Dita, Stephanie, Angel, Thasya, Dian dan Intan serta team

gelatin (Dita, Yusinta, Dhea, dan Joshua) yang selalu memberikan dukungan, saran

dan mendengarkan keluh kesah selama penelitian maupun penulisan skripsi ini.

4. Kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian skripsi ini yang

tidak dapat disebutkan satu per satu.

Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih jauh dari kata memuaskan, maka

diharapkan adanya saran untuk memperbaiki dan mengembangkannya. Akhir kata,

semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi semua pihak.

Jakarta, Februari 2020

penulis

ix

DAFTAR ISI

ABSTRAK vi

DAFTAR ISI ix

DAFTAR TABEL xi

DAFTAR GAMBAR xi

DAFTAR LAMPIRAN xi

PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Tujuan Penelitian 3

TINJAUAN PUSTAKA 4

Gelatin 4

Hidrolisat Gelatin 5

Ultrafiltrasi dan Kromatografi Kolom Gel Filtrasi 6

Inhibitor Dipeptidyl Peptidase-IV (DPP-IV) 7

METODOLOGI 8

Waktu dan Tempat 8

Bahan dan Alat 8

Metode Penelitian 8

Persiapan Ekstraksi Gelatin Kasar 9

Hidrolisis Enzimatik 10

Ultrafitrasi 10

Kromatografi Gel Filtrasi 10

Metode Analisis 12

Aktivitas Inhibisi DPP-IV 12

Penentuan Kadar Protein 12

Bobot Aktivitas 13

Penentuan IC50 13

Analisis Data 13

HASIL DAN PEMBAHASAN 14

Ekstraksi Gelatin 14

Hasil Ultrafiltrasi dan Fraksi Kromatografi Filtrasi Gel 15

Aktivitas Inhibisi Enzim Dipeptidyl Peptidase- IV (DPP-IV) 17

Kadar Protein 18

x

Bobot Aktivitas dan Aktivitas Penghambatan 50 persen (IC50) 19

PENUTUP 22

Kesimpulan 22

Saran 22

DAFTAR PUSTAKA 23

LAMPIRAN 27

RIWAYAT HIDUP

31

xi

DAFTAR TABEL

Tabel 1 Sifat Gelatin Berdasarkan Cara Pembuatannya 4

Tabel 2 Standar Mutu Gelatin 5

Tabel 3 Aktivitas spesifik enzim 19

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1 Diagram alir untuk mendapatkan fraksi ultrafiltrasi 8

Gambar 2 Diagram alir kromatografi filtrasi gel 11

Gambar 3 Ekstrak gelatin dengan penambahan enzim flavourzyme 3% 14

Gambar 4 fraksi >3 kDa 15

Gambar 5 Pola protein fraksi hidrolisat gelatin berat molekul tinggi setelah

dimurnikan dengan kolom gel filtrasi

16

Gambar 6 Grafik aktivitas inhibisi 17

Gambar 7 Kadar Protein Gelatin Tulang Ikan Patin 18

Gambar 8 Bobot Aktivitas Penghambatan DPP-IV 19

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Tabel Kadar Protein dan Kurva Standar BSA (Bovine Serum

Albumin)

27

Lampiran 2 Kurva Standar BSA 28

Lampiran 3 Hasil Analisis Statistik Uji Protein 29

Lampiran 4 Hasil Analisis Statistik Aktivitas Inhibisi 30

PURIFIKASI FRAKSI GEL FILTRASI GELATIN

TULANG IKAN PATIN DENGAN HIGH PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) UNTUK

IDENTIFIKASI PEPTIDA BIOAKTIF

SKRIPSI

DHEANISYA QAUSARINA AIDA

15106026

PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS BIOINDUSTRI

UNIVERSITAS TRILOGI

JAKARTA

2020

ii

PURIFIKASI FRAKSI GEL FILTRASI GELATIN

TULANG IKAN PATIN DENGAN HIGH PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) UNTUK

IDENTIFIKASI PEPTIDA BIOAKTIF

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Teknologi Pertanian

Pada

Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan

DHEANISYA QAUSARINA AIDA

15106026

PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS BIOINDUSTRI

UNIVERSITAS TRILOGI

JAKARTA

2020

iii

Judul Skripsi : Purifikasi Fraksi Gel Filtrasi Gelatin Tulang Ikan Patin

dengan High Performance Liquid Chromatogrphy (HPLC)

untuk Identifikasi Peptida Bioaktif

Nama : Dheanisya Qausarina Aida

NIM : 15106026

Penguji: Dr. M. Rizal Taufikurrahman, M.Si dan Hermawan Seftiono, S.Si., M.Si

Tanggal Lulus: 7 Februari 2020

iv

v

vi

ABSTRAK

Dheanisya Qausarina Aida. Purifikasi Fraksi Gel Filtrasi Gelatin Tulang Ikan Patin

dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) untuk Identifikasi

Peptida Bioaktif. Dibimbing oleh Yoni Atma dan Apon Zaenal Mustopa, 2020.

Penelitian ini mengenai purifikasi fraksi gel filtrasi gelatin tulang ikan patin

menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dan uji

aktivitasnya dalam menghambat enzim dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV).

Tujuannya ialah untuk mengetahui aktivitas penghambatan dari fraksi gel filtrasi

yang dimurnikan dengan metode High Performance Liquid Chromatography

preparatif. Penelitian terdiri atas empat tahapan yaitu (1) separasi fraksi hidrolisat

dari hasil hidrolisis 3% flavourzyme (rasio enzim:substrat [E/S]) dengan gel filtrasi,

(2) purifikasi fraksi gel filtrasi terpilih dengan HPLC, (3) uji aktivitas

penghambatan, (4) uji kadar protein dan IC50 (Inhibitory Concentration of 50%).

Hasil pemurnian dengan HPLC didapatkan dua puncak utama pada menit ke-3.1

dan 4.07. Hasil uji aktivitas penghambatan oleh ketujuh fraksi HPLC berada di

bawah 30%, fraksi HPLC 3 dan 4 sebagai puncak utama memiliki aktivitas

penghambatan lebih rendah daripada fraksi HPLC 1, 2, dan 5. Aktivitas

penghambatan tertinggi ada pada fraksi HPLC 1 sebesar 26.50%. Hasil uji kadar

protein menunjukkan antara sampel fraksi gel filtrasi dengan fraksi HPLC memiliki

perbedaan sangat nyata (p<0.05). Kadar protein tertinggi sebesar 1.57 mg/ml pada

sampel 3% F4, dan terendah sebesar 0.13 mg/ml pada sampel fraksi HPLC 1. Hasil

pengukuran aktivitas spesifik enzim menunjukkan nilai bobot tertinggi ada pada

fraksi HPLC 1 sebesar 203.85 kemudian diikuti oleh fraksi HPLC 2 sebesar 101.61,

untuk nilai bobot terendah sebesar 5.29 pada sampel 3% fraksi 1. Hasil pengukuran

IC50 pada sampel fraksi gel filtrasi diperoleh sebesar 1.03 mg/ml, dan pada sampel

fraksi HPLC sebesar 0.33 mg/ml.

Kata kunci: bradford, DPP-IV, HPLC preparatif, senyawa peptida

vii

ABSTRACT

Dheanisya Qausarina Aida. Purification of gel filtration fraction of fish bone

gelatin from Pangasius catfish using High Performance Liquid Chromatography

(HPLC) for identification a bioactive peptide. Supervised by Yoni Atma and Apon

Zaenal Mustopa, 2020.

This study aims to purify of gel filtration fraction of fish bone gelatin from

Pangasius catfish using High Performance Liquid Chromatography (HPLC), and

measured their activities against dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV). Purification

stage was done by HPLC preparative equipment. The research conducted in four

stages including (1) hydrolysate >3 kDa (from 3% [E/S] ratio) separation through

gel filtration chromatography, (2) purification of selected gel filtration fraction, (3)

activity measurement, (4) protein content and IC50 determination. The result shown

that HPLC purification provide two main peaks at time retention of 3.1 and 4.07

minutes. All of purification fractions was below 30%, while fraction 3 and 4 (at

retention time 3.01 and 4.075) have inhibitory activity lower than fractions 1, 2,

and 5. The highest inhibitory activity from HPLC fraction was 26.50%. It is come

from fraction 1 (F1) (at retention time of 1.55 minutes). In addition the protein

content both of fraction; gel filtration and HPLC were significant different

(p<0.05). The highest protein content was from fraction 4 of HPLC which about

1.57 mg/ml, while the lower ones was from fraction 1 with concentration of 0.13

mg/ml. In addition, the activity value was also measured by dividing percent

inhibition with protein concentration. In this research, the highest activity value

was F1, F2, and the lower was F5 namely 203.85, 101.61, and 5.29 respectively.

The IC50 from gel filtration and HPLC fraction were 1.03 mg/ml and 0.33 mg/ml

respectively.

Keywords: bradford, DPP-IV, HPLC preparative, peptide compound

viii

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah Subhanahu Wata’ala atas segala

rahmat dan karunia-Nya, sehingga dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul

“Purifikasi Fraksi Gel Filtrasi Gelatin Tulang Ikan Patin dengan High Performance

Liquid Chromatography (HPLC) untuk Identifikasi Peptida Bioaktif”. Sholawat

beserta salam penulis panjatkan untuk Rasulullah Muhammad Salallahu ‘Alaihi

Wasalam. Karya ilmiah ini disusun sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana

Teknologi Pertanian pada Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan, Universitas

Trilogi.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Yoni Atma, S.TP., M.Si dan

Bapak Dr. Apon Zaenal Mustopa., M.Si selaku pembimbing atas bimbingan, waktu,

tenaga, saran, dan kontribusinya yang luar biasa terhadap penyelesaian karya ilmiah

ini. Penghargaan dan ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada kedua

orang tua, abang Eiryl, Kak Evan Prasetya selaku laboran di Program Studi Ilmu

dan Teknologi Pangan, seluruh teman dan pegawai di Laboratorium RGTDP, teman

halaqoh, teman sebimbingan (Sella, Dita, Yusi, Josua), seluruh kawan di Fakultas

Bioindustri khususnya Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan angkatan 2015,

Anggun, Dina, serta Khairia atas doa, kerjasama, dan dukungannya selama

penelitian.

Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih jauh dari kata memuaskan,

maka diharapkan adanya masukan serta saran untuk memperbaiki dan

mengembangkannya. Akhir kata, semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi

yang membutuhkannya.

Jakarta, Februari 2020

Penulis

ix

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI ix

DAFTAR TABEL x

DAFTAR GAMBAR x

DAFTAR LAMPIRAN x

PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Tujuan 2

TINJAUAN PUSTAKA 3

Gelatin Tulang Ikan 3

Fraksi Gel Filtrasi Gelatin sebagai Antidiabetes 5

Purifikasi 7

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 8

Pengukuran Konsentrasi Protein 9

Peptida Bioaktif 10

METODOLOGI 11

Waktu dan Tempat Pelaksanaan 11

Bahan dan Alat 11

Rancangan Percobaan dan Analisis Data 11

Metode Penelitian 12

Kromatografi Gel Filtrasi 12

Purifikasi Protein Fraksi Gel Filtrasi Gelatin Tulang Ikan Patin

menggunakan High Performance Liquid Chromatography 13

Uji Aktivitas Inhibisi terhadap DPP-IV (dipeptydil peptidase-IV) 13

Penentuan Kadar Protein dengan Metode Bradford 14

Pengukuran Aktivitas Spesifik 14

Penentuan Nilai IC50 14

HASIL DAN PEMBAHASAN 15

Purifikasi Protein 15

Uji Aktivitas Inhibisi terhadap DPP-IV (dipeptydil peptidase-IV) 18

Penentuan Kadar Protein dengan Metode Bradford 19

SIMPULAN DAN SARAN 23

Simpulan 23

Saran 23

DAFTAR PUSTAKA 24

LAMPIRAN 29

RIWAYAT HIDUP 35

x

DAFTAR TABEL

Tabel 1 Sumber Peptida Bioaktif 10

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1 Skema Alur Penelitian 12

Gambar 2 Kromatogram dari Kolom Filtrasi Gel dengan Matriks

Sephadex G-25 15

Gambar 3 Aktivitas Penghambatan Enzim DPP-IV oleh Fraksi Gel Filtrasi 16

Gambar 4 Kromatogram dari Kolom HPLC C-18 17

Gambar 5 Ketujuh Fraksi HPLC Hasil Koleksi dengan Waktu Retensi,

Luas Area Puncak, dan Konsentrasi Protein Berbeda 18

Gambar 6 Aktivitas Penghambatan Enzim DPP-IV oleh Fraksi HPLC dan

Fase Gerak 19

Gambar 7 Kadar Protein pada Sampel Fraksi Gel Filtrasi dan Fraksi HPLC 20

Gambar 8 Aktivitas Spesifik Enzim pada Sampel Fraksi Gel Filtrasi dan

Fraksi HPLC 21

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Kurva Standar BSA dan Kadar Proteinnya 29

Lampiran 2 Kurva Regresi IC50 Sampel Fraksi Gel Filtrasi 30

Lampiran 3 Kurva Regresi IC50 Sampel Fraksi HPLC 31

Lampiran 4 Analisis Ragam ANOVA dan Uji Duncan 32

Lampiran 5 Dokumentasi Penelitian 34