UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA UJI AKTIVITAS...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK KAPANG

ENDOFIT DARI LUMUT HATI Marchantia emarginata Reinw.,

Blume & Nees

SKRIPSI

ZAKIYATUL MUNAWAROH

NIM. 1113102000079

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN


2017

ii Uin Syarif Hidayatullah Jakarta


UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK KAPANG

ENDOFIT DARI LUMUT HATI Marchantia emarginata Reinw.,

Blume & Nees

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

ZAKIYATUL MUNAWAROH

NIM. 1113102000079

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN


2017

iii Uin Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah karya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun yang dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar

Nama : Zakiyatul Munawaroh

NIM : 1113102000079

Tanda Tangan :

Tanggal : 4 Oktober 2017

iv Uin Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERSETUJUAN SKRIPSI


NIM : 1113102000079

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit dari

Lumut Hati Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

Disetujui oleh

Pembimbing I

Eka Putri, M.Si., Apt

NIP. 197905172009122002

Pembimbing 1I

Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt

NIP. 197806302006042001

Mengetahui,

Kepala Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt

NIP. 197407302005012003

v Uin Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI

Skripsi ini diajukan oleh:


NIM : 1113102000079


Judul Skripsi : Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit dari

Lumut Hati Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima

sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar

Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I : Eka Putri, M.Si., Apt ( )

Pembimbing II : Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt ( )

Penguji I : Suci Ahda Novitri, M.Si., Apt ( )

Penguji II : Saiful Bahri, M.Si ( )

Ditetapkan di : Jakarta

Tanggal :

vi Uin Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Name : Zakiyatul Munawaroh

Program Study : Farmasi

Title : Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit dari

Lumut Hati Marchantia emarginata Reinw., Blume &

Nees

Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees merupakan salah satu lumut hati

yang tumbuh di Indonesia dan mempunyai aktivitas antibakteri, tetapi sulit untuk

dikumpulkan dalam jumlah banyak sebagai sampel murni karena ukurannya yang

sangat kecil. Oleh karena itu, dilakukan isolasi dan uji aktivitas antibakteri ekstrak

kapang endofit dari lumut hati M. emarginata sebagai alternatif untuk

mendapatkan senyawa metabolit dan aktivitas biologi yang serupa dengan

inangnya. Dilakukan isolasi, pemurnian, karakterisasi, dan skrining aktivitas

antibakteri kapang endofit. Selanjutnya isolat kapang endofit difermentasi dan

diekstraksi untuk memperoleh senyawa metabolit sekunder yang aktif sebagai

antibakteri. Aktivitas antibakteri ekstrak kapang endofit diujikan menggunakan

metode difusi cakram dan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) ditentukan

dengan metode mikrodilusi cair. Diperoleh 6 isolat kapang endofit yang

menunjukkan aktivitas antibakteri pada uji skrining awal yaitu isolat MEA1,

MEA2, MEB1, MEC1, MEC2, dan MEC3. Hasil dari pengujian antibakteri

dengan difusi cakram menunjukkan bahwa pada fraksi ekstrak etil asetat isolat

MEB1 aktif terhadap Bacillus subtilis dan Pseudomonas aeruginosa. Nilai KHM

fraksi etil asetat isolat MEB1 yaitu 200 µg/mL terhadap B. subtilis dan P.

aeruginosa.

Kata kunci : aktivitas antibakteri, kapang endofit, lumut hati, Marchantia

emarginata

vii Uin Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Zakiyatul Munawaroh

Program Study : Pharmacy

Title : Antibacterial Activity Test of Endophytic Fungi Extracts

from Liverwort Marchantia emarginata Reinw., Blume &

Nees

Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees is known as one of liverworts in

Indonesia and has antibacterial activity, but it is difficult to be collected in large

quantities as a pure sample because of its very small size. Therefore, isolation and

evaluation of antibacterial activity of endophytic fungi extract from liverwort M.

emarginata were performed as an alternative to obtain metabolite compounds and

biological activities that similar to its host. The research performed by isolating,

purificating, characterizing, and screening of the antibacterial activity from

endophytic fungi. The endophytic fungi isolates were fermented and extracted to

obtain secondary metabolite compounds that were active as antibacterials.

Antibacterial activity was measured by used disc diffusion method and the

Minimum Inhibitory Concentration (MIC) was measured by used broth

microdilution. Six isolates of endophytic fungi were obtained and showed

antibacterial activity in preliminary screening termed as MEA1, MEA2, MEB1,

MEC1, MEC2, and MEC3 isolates. Result of disc diffusion antibacterial assay

indicated that ethyl acetate fraction of MEB1 was active against Bacillus subtilis

and Pseudomonas aeruginosa. The MIC value of the ethyl acetate fraction of

MEB1 is 200 μg/mL against B. subtilis and P. aeruginosa.

Keywords : antibacterial activity, endophytic fungi, liverwort, Marchantia

emarginata

viii Uin Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas

segala nikmat, rahmat, dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan

penelitian dan penulisan skripsi ini. Shalawat serta salam senantiasa penulis

sampaikan kepada Nabi Muhammad SAW yang memberikan petunjuk bagi umat

manusia, semoga kelak kita mendapat syafaatnya di hari akhir.

Skripsi dengan judul “Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit

dari Lumut Hati Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees” ini disusun

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi di Program

Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri

Syarif Hidayatullah Jakarta.

Penulis menyadari bahwa dalam proses penulisan skripsi ini tidak terlepas

dari beberapa doa, bantuan, bimbingan dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh

karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada :

1. Kementrian Agama RI selaku penyedia Program Beasiswa Santri

Berprestasi (PBSB) sehingga penulis dapat menuntut ilmu di universitas ini.

2. Dr. H. Arif Sumantri, S.KM., M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran Dan Ilmu Kedokteran UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Ibu Eka Putri, M.si., Apt dan ibu Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt selaku

dosen pembimbing I dan II yang senantiasa memberikan arahan, dukungan,

dan solusi selama melaksanakan penelitian dan menyelesaikan skripsi ini.

Semoga segala bantuan dan bimbingan ibu tercatat menjadi amal shaleh

dan mendapatkan imbalan yang lebih baik di sisi Allah.

5. Ibu Nelly Suryani, Ph.D., Apt selaku pembimbing akademik yang

senantiasa memberikan nasehat, motivasi dan solusi selama penulis

menjalani pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran Dan

Ilmu Kedokteran UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

ix Uin Syarif Hidayatullah Jakarta

6. Bapak dan ibu dosen Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran Dan Ilmu

Kedokteran UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah memberikan

ilmunya kepada penulis. Semoga kelak menjadi ilmu yang bermanfaat.

7. Semua laboran FKIK yang telah membantu keseharian penulis selama

penelitian dan memberikan informasi tentang teknis pengerjaan di

laboratorium.

8. Kedua orang tua penulis, Bapak Ikhyan dan Ibu Khayatun yang senantiasa

memberikan do’a, nasehat, dukungan, dan bantuan baik materil maupun non

materil. Kedua adik penulis, Syifaur Rahmah dan Zumrotul Hidayah yang

senantiasa memberikan do’a, dukungan, dan semangat kepada penulis

9. Teman-teman seperjuangan penelitian mikrobiologi dan lumut Lisa, Nuril,

Puspa, Ajeng, Vita, Tewe, Abbas, Ghifar, Rizal, Anggi, Aisyah, Tika, dan

Hasan, teman-teman farmasi 2013, CSS MoRA 2013, dan Fantastic Four

Ramaza, Elok, dan fifi yang telah memberikan semangat, dukungan, dan

saran kepada penulis dalam menyelesaikan penelitian ini.

10. Pihak-pihak lain yang terlibat dalam penulisan skripsi ini yang tidak dapat

ditulis satu persatu, penulis akan selalu mengingat atas kebaikan dan doa-

doanya.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam skripsi ini.

Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati penulis mengucapkan terima kasih

terhadap kritik dan saran yang membangun demi kesempurnaan skripsi ini.

Semoga Allah akan memberikan balasan yang berlipat ganda atas dukungan dan

bantuan kepada penulis.

Ciputat, 4 Oktober 2017

Penulis

x Uin Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai civitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :


NIM : 1113102000079


Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

Demi mengembangkan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya

ilmiah saya dengan judul :

UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK KAPANG ENDOFIT DARI

LUMUT HATI Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lainnya yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat

dengan sebenarnya.

Dibuat di : Ciputat

Pada Tanggal : 4 Oktober 2017

Yang menyatakan

(Zakiyatul Munawaroh)

xi Uin Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ............................................... iii

HALAMAN PERSETUJUAN SKRIPSI ........................................................... iv

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI .............................................................. v

ABSTRAK ............................................................................................................ vi

ABSTRACT ......................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI.......................... x

DAFTAR ISI ......................................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiv

DAFTAR TABEL ............................................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xvi

BAB I. PENDAHULUAN ..................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ............................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah .......................................................................................... 2

1.3 Tujuan Penelitian ........................................................................................... 2

1.4 Manfaat Penelitian ......................................................................................... 3

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................... 4

2.1 Lumut Hati ..................................................................................................... 4

2.1.1 Morfologi Lumut Hati ....................................................................... 4

2.1.2 Aktivitas Biologi Lumut Hati ............................................................ 5

2.2 Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees. .......................................... 6

2.2.1 Kandungan Senyawa dan Aktivitas Biologi ...................................... 6

2.3 Kapang Endofit .............................................................................................. 7

2.3.1 Kapang Endofit Penghasil Antibakteri .............................................. 8

2.4 Mikroorganisme ............................................................................................. 8

2.4.1 Bakteri ................................................................................................ 9

2.4.2 Kapang ............................................................................................. 10

2.5 Antimikroba ................................................................................................. 12

2.6 Uji Aktivitas Antimikroba ........................................................................... 13

2.6.1 Metode Difusi .................................................................................. 14

xii Uin Syarif Hidayatullah Jakarta

2.6.2 Metode Dilusi .................................................................................. 14

2.7 Karakterisasi Mikroba ................................................................................ 15

2.7.1 Karakterisasi Bakteri ........................................................................ 15

2.7.2 Karakterisasi Kapang ....................................................................... 16

2.8 Bakteri Uji ................................................................................................... 17

2.8.1 Staphylococcus aureus ..................................................................... 17

2.8.2 Bacillus subtilis ................................................................................ 17

2.8.3 Pseudomonas aeruginosa ................................................................ 18

2.9 Antibiotik Pembanding ................................................................................ 18

2.9.1 Kloramfenikol .................................................................................. 18

2.9.2 Siprofloksasin Hidroklorida ............................................................. 19

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ........................................................ 20

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ...................................................................... 20

3.2 Alat dan Bahan ............................................................................................ 20

3.2.1 Alat ................................................................................................... 20

3.2.2 Bahan ............................................................................................... 20

3.3 Prosedur Penelitian ...................................................................................... 21

3.3.1 Pembuatan Media Pertumbuhan ...................................................... 21

3.3.2 Isolasi Kapang Endofit ..................................................................... 23

3.3.3 Pemurnian Kapang Endofit .............................................................. 23

3.3.4 Karakterisasi Kapang Endofit .......................................................... 24

3.3.5 Skrining Aktivitas Antibakteri Kapang Endofit .............................. 24

3.3.6 Fermentasi dan Ekstraksi Kapang Endofit ....................................... 25

3.3.7 Uji Aktivitas Antibakteri ................................................................. 25

3.3.8 Uji Sensitivitas Antibiotik ............................................................... 27

3.3.9 Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) ......................... 28

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 30

4.1 Determinasi Tanaman .................................................................................. 30

4.2 Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit ....................................................... 30

4.3 Karakterisasi Kapang Endofit ...................................................................... 32

4.4 Skrining Aktivitas Antibakteri Kapang Endofit .......................................... 39

4.5 Fermentasi dan Ekstraksi Kapang Endofit .................................................. 40

xiii Uin Syarif Hidayatullah Jakarta

4.6 Karakterisasi Bakteri Uji ............................................................................. 41

4.7 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit ...................................... 43

4.8 Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) ..................................... 45

BAB V. PENUTUP .............................................................................................. 49

5.1 Kesimpulan .................................................................................................. 49

5.2 Saran ............................................................................................................ 49

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 50

LAMPIRAN ......................................................................................................... 57

xiv Uin Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Morfologi Lumut Hati ........................................................... 5

Gambar 2.2 Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees ................... 6

Gambar 2.3 Struktur Senyawa Marchantin A ............................................ 7

Gambar 2.4 Struktur Sel Bakteri ................................................................ 9

Gambar 2.5 Tipe-tipe Hifa ......................................................................... 11

Gambar 2.6 Prosedur Pewarnaan Gram ..................................................... 16

Gambar 2.7 Struktur Kloramfenikol .......................................................... 18

Gambar 2.8 Struktur Siprofloksasin Hidroklorida ..................................... 19

Gambar 4.1 Posisi Penanaman Talus Marchantia emarginata .................. 31

Gambar 4.2 Isolat MEA1 secara Makroskopik dan Mikroskopik .............. 33

Gambar 4.3 Isolat MEA2 secara Makroskopik dan Mikroskopik .............. 34

Gambar 4.4 Isolat MEB1 secara Makroskopik dan Mikroskopik .............. 35

Gambar 4.5 Isolat MEC1 secara Makroskopik dan Mikroskopik .............. 36



Gambar 4.8 Hasil Uji Sensitivitas Antibiotik Pembanding ........................ 46

xv Uin Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Aktivitas Biologi Lumut Hati ................................................. 5

Tabel 2.2 Ciri-ciri Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif ................... 10

Tabel 4.1 Daftar Isolat Kapang Endofit M. Emarginata ........................ 32

Tabel 4.2 Hasil Skrining Isolat Kapang Endofit terhadap Bakteri Uji ... 39

Tabel 4.3 Hasil Perolehan Ekstrak Hasil Fermentasi Kapang Endofit.... 41

Tabel 4.4 Hasil Karakterisasi Bakteri Uji dengan Pewarnaan Gram ...... 42

Tabel 4.5 Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit ....... 44

Tabel 4.6 Hasil KHM Fraksi Ekstrak Etil Asetat Isolat MEB1 .............. 48

xvi Uin Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Determinasi Tanaman ............................................................. 57

Lampiran 2. Alur Penelitian ........................................................................ 58

Lampiran 3. Bagan Kerja Isolasi Kapang Endofit ...................................... 59

Lampiran 4. Bagan Kerja Pemurnian Kapang Endofit ............................... 60

Lampiran 5. Bagan Kerja Karakterisasi Kapang Endofit ............................ 60

Lampiran 6. Bagan Kerja Skrining Aktivitas Antibakteri ........................... 61

Lampiran 7. Bagan Kerja Fermentasi dan Ekstraksi Kapang Endofit ........ 62

Lampiran 8. Bagan Kerja Karakterisasi Bakteri Uji ................................... 63

Lampiran 9. Bagan Kerja Pembuatan Suspensi Bakteri Uji ....................... 63

Lampiran 10. Bagan Kerja Uji Antibakteri Ekstrak Kapang endofit ............ 64

Lampiran 11. Bagan Kerja Penentuan Nilai KHM ....................................... 65

Lampiran 12. Hasil Isolasi Kapang Endofit ................................................. 66

Lampiran 13. Hasil Skrining Isolat Kapang Endofit ..................................... 68

Lampiran 14. Hasil Fermentasi Isolat Kapang Endofit ................................. 70

Lampiran 15. Hasil Ekstraksi Isolat Kapang Endofit .................................... 71

Lampiran 16. Hasil Uji Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit ....................... 73

Lampiran 17. Hasil Penentuan KHM ............................................................ 76

Lampiran 18. Sertifikat ATCC Bakteri Uji ................................................... 77

Lampiran 19. Sertifikat Analisis Siprofloksasin ........................................... 80

Lampiran 20. Sertifikat Analisis Kloramfenikol ........................................... 81

Lampiran 21. Sertifikat Analisis p-iodonitrotetrazolium (INT) .................... 82

xviii Uin Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR SINGKATAN

µg : Mikrogram

µL : Mikroliter

µm : Mikrometer

ATCC : American Type Culture Collection

B. subtilis : Bacillus subtilis

Ca

: Kalsium

CFU : Colony Forming Unit

cm : Sentimeter

DMSO : Dimetil sulfoksida

DNA : Deoxyribose-Nucleic Acid

INT : p-iodonitrotetrazolium

KBM : Konsentrasi Bunuh Minimum

KHM : Konsentrasi Hambat Minimum

LAFC : Laminar Air Flow Cabinet

LIPI : Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia

M. emarginata : Marchantia emarginata

ME : Marchantia emarginata

mg : Miligram

Mg : Magnesium

MHA : Mueller-Hinton Agar

MHB : Mueller-Hinton Broth

MIC : Minimum Inhibitroy Concentration

mL : Mililiter

mm : Milimeter

NA : Nutrient Agar

NaCl : Natrium klorida

NCCLS : National Committee for Clinical Laboratory Standards

nm : Nanometer

P. aeruginosa : Pseudomonas aeruginosa

PDA : Potato Dextrose Agar

PDB : Potato Dextrose Broth

PDY : Potato Dextrose Yeast

RNA : Ribonucleid Acid

S. aureus : Staphylococcus aureus

WHO : World Health Organization

PPM : Part Per Million

1 Uin Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kawasan hutan di Indonesia umumnya merupakan hutan hujan tropis

dengan keanekaragaman flora termasuk di dalamnya jenis lumut (Windadri,

2009). Lumut merupakan salah satu kelompok tumbuhan tingkat rendah dan

bagian dari keanekaragaman hayati yang belum banyak mendapat perhatian

(Windadri, 2007). Lumut terdiri dari 3 divisi, yaitu Bryophyta atau mosses (lumut

daun sebanyak 14.000 spesies), Marchantiophyta atau liverworts (lumut hati

sebanyak 6.000 spesies), dan Anthocerotophyta atau hornworts (lumut tanduk

sebanyak 300 spesies) (Asakawa, 2009; Sharma, 2014; Sulistyowati, 2014).

Lumut hati mempunyai cellular oil body yang tidak ditemukan pada dua divisi

yang lain (Asakawa, 2009). Lumut hati mempunyai aktivitas biologi yang

menarik seperti antibakteri, antifungi, antihepatotoksik, sitotoksik, antioksidan,

kardiotonik, insect antifeedant, dan relaksan otot (Ludwiczuk, dkk., 2008).

Fitokimia lumut hati sering diabaikan dalam waktu yang lama karena

secara morfologi bentuknya sangat kecil dan sulit untuk dikumpulkan dalam

jumlah yang banyak sebagai sampel murni (Asakawa, 2009). Tingkat produksi

obat dengan bahan baku tanaman terbatas karena apabila dieksploitasi terus

menerus maka bahan baku tanaman tersebut akan musnah. Oleh karena itu,

diperlukan alternatif sumber yang dapat menghasilkan senyawa metabolit dan

aktivitas biologi yang serupa yaitu dengan menggunakan kapang endofit (Strobel,

dkk., 2004).

Kapang endofit yang tumbuh di dalam jaringan tanaman memproduksi

senyawa bioaktif, baik yang sama dengan inangnya maupun tidak sama akan

tetapi memiliki aktivitas biologi yang serupa (Strobel, dkk., 2004). Hal ini terjadi

kemungkinan karena adanya transfer genetik antara tanaman inang dengan kapang

endofit, sehingga zat-zat yang bermanfaat pada tanaman inang juga dapat

dihasilkan oleh kapang endofitnya (Syarmalina, dkk., 2007).

2

Marchantia emarginata merupakan salah satu jenis lumut hati yang ada di

Indonesia. Kapang endofit dari inang M. emarginata yang hidup di Indonesia

tentu menjadi sumber yang menarik untuk diteliti khasiatnya sebagai penghasil

senyawa obat, terlebih diketahui bahwa kapang endofit yang hidup di dalam

jaringan lumut kurang menjadi perhatian pada penelitian ilmiah (Zhang Tao, dkk.,

2013). Senyawa berkhasiat yang dapat diamati dari spesies M. emarginata yaitu

sebagai antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, dan

Pseudomonas aeruginosa (Asakawa, dkk., 2009). Pencarian antibiotik dimulai

pada akhir tahun 1800-an ketika teori tentang asal-usul penyakit yang

menyebutkan bahwa bakteri dan mikroorganisme lain sebagai penyebab penyakit

diterima oleh masyarakat luas (Pratiwi, 2008). Pencarian senyawa yang berpotensi

sebagai antibakteri penting dilakukan untuk mencegah penyebaran penyakit

infeksi dan resistensi bakteri terhadap antibiotik yang sudah ada.

Berdasarkan uraian latar belakang di atas, maka dilakukan penelitian untuk

memperoleh kapang endofit dari lumut hati M. emarginata dan menguji aktivitas

antibakterinya terhadap bakteri S. aureus, B. subtilis, dan P. aeruginosa.

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana cara memperoleh kapang endofit dari M. emarginata?

2. Bagaimana aktivitas antibakteri dari ekstrak kapang endofit terhadap

bakteri uji?

3. Berapakah Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) ekstrak kapang

endofit terhadap bakteri uji?

1.3 Tujuan Penelitian

1. Mengisolasi kapang endofit dari M. emarginata.

2. Menguji kemampuan aktivitas antibakteri dari ekstrak kapang endofit

terhadap bakteri uji.

3. Menentukan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) ekstrak kapang

endofit terhadap bakteri uji.

3

1.4 Manfaat Penelitian

1. Memberikan informasi tentang aktivitas antibakteri ekstrak kapang

endofit M. emarginata yang tumbuh di Indonesia terhadap bakteri S.

aureus, B. subtilis, dan P. aeruginosa.

2. Sebagai informasi tambahan pada peneliti lain tentang kapang endofit

dari M. emarginata.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Lumut Hati

Lumut hati merupakan kelompok tanaman kecil yang terdistribusi di

dunia. Lumut hati (Marchantiophyta) memiliki dua subkelas (Jungermanniidae

dan Marchantiidae), 6 ordo, 49 famili, 130 genera, serta 6.000 spesies. Lumut hati

sering ditemukan di lokasi yang lembab, terutama di hutan hujan tropis seperti

Borneo, Sumatra, dan Papua Nugini. Spesies lumut hati tumbuh pada daerah

pegunungan tinggi di Equador dan Colombia dengan ketinggian lebih dari 2.000

meter di atas permukaan laut (Asakawa, 2009).

2.1.1 Morfologi Lumut Hati

Klasifikasi lumut hati secara morfologi tergolong sulit karena

gametofitnya yang kecil. Ludwiczuk, dkk (2008) menjelaskan bahwa adanya

senyawa metabolit terpenoid lipofilik dan senyawa aromatik pada cellular oil

body lumut hati yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi perbedaan

taksonomi dari lumut yang lain. Cellular oil body pada lumut hati berfungsi

untuk melindungi sel dari kekeringan dan cellular oil body ini akan pecah jika

keadaan kering (Suire, 2000 dalam Sulistyowati dkk., 2014). Ada 2 tipe lumut hati

yaitu lumut hati bertalus (thallose liverwort) dan lumut hati berdaun (leafy

liverwort) (Hasan dan Ariyanti, 2004, di dalam Sulistyowati dkk., 2014).

Lumut hati bertalus memiliki suatu talus yang dikotomus bercabang dan

umumnya terdiri dari beberapa sel tebal. Jaringan atas bersifat longgar, yang

dihasilkan dari ruang udara internal, dan umumnya memiliki pori-pori.

Permukaan bawah biasanya memiliki dua jenis rhizoid, yaitu halus dan dengan

tonjolan serta biasanya memiliki sisik (Glime, 2006 dalam Sulistyowati, dkk.,

2014).

Lumut hati berdaun memiliki rhizoid yang terdiri atas 1 sel (uniseluler),

berfungsi sebagai alat untuk melekatkan diri pada substrat dan beberapa spesies

memiliki 2–3 baris daun yang melekat pada batang (Damayanti, 2006 dalam

Sulistyowati, dkk., 2014).

5

Gambar 2.1 Morfologi lumut hati

(Sumber: Simpson, 2006)

2.1.2 Aktivitas Biologi Lumut Hati

Lumut hati (Marchantiophyta) memiliki aktivitas biologi yang beragam

sebagai sumber tanaman obat. Berikut ini merupakan beberapa aktivitas biologi

dari macam-macam lumut hati yang ada.

Tabel 2.1 Aktivitas Biologi Lumut Hati

Spesies Senyawa Kimia Aktivitas Biologi

Marchantia polymorpha Marchantin A,

Marchantin B,

Marchantin C,

Marchantin E

Antipiretik, antidotum,

diuretik, antimikroba,

antikanker, relaksan otot,

penyembuh luka, fraktur,

tergigit ular, terbakar, dan

luka terbuka.

Frullania tamarisci Costunolide,

Eudesmanolide,

Germacranolide,

Antiseptik, pemelihara

rambut

Conocephalum conicum Eudesmanolide,

Germacranolide,

Bicyclogermacrena

l, 2a,5b

dihydroxybornane-

2-cinnamate

Antimikroba, antifungi,

antipiretik, antidotum,

fraktur, luka terbakar,

tergigit ular.

Reboulia hemisphaerica Marchantiaquinon,

Riccardin C dan

Riccardin F

Hemostatis, luka luar, anti

obesitas, memar

Dumortiera hirsuta Lunularin Antimikroba

(Sumber: Asakawa, 2008; Sabovljevi , dkk., 2016)

6

2.2 Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees merupakan salah satu

jenis lumut yang ada di Indonesia. Taksonomi lumut hati M. emarginata Reinw.,

Blume & Nees adalah sebagai berikut (Goffinet & Shaw, ed., 2009).

Kingdom : Plantae

Divisi : Marchantiophyta

Kelas : Marchantiopsida

Ordo : Marchantiales

Famili : Marchantiaceae

Genus : Marchantia

Spesies : Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

Gambar 2.2 Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

(Sumber: koleksi pribadi, 2017)

M. emarginata mempunyai morfologi berupa talusnya yang sempit,

berwarna hijau gelap dengan garis median yang tidak jelas di permukaan dorsal.

Lebar sekitar 2,5-5 mm, berdinding tebal, dengan sel pada daerah marginal yang

lebih kecil daripada bagian dalamnya (Siregar, 2015). Permukaan ventral

berwarna ungu kehitaman atau coklat. Receptacle betina sering melengkung ke

arah tangkai, kadang-kadang lurus (Siregar, dkk., 2013).

2.2.1 Kandungan Senyawa dan Aktivitas Biologi

M. emarginata mengandung senyawa metabolit sekunder berupa

isolepidozene (45,2%), β-barbatene (23,1%), β-elemene, α-barbatene,

isobazzanene, β-acoradiene, germacrene D, α dan γ-cuprenene (Ludwiczuk, dkk.,

7

2008). M. emarginata mengandung senyawa marchantin A dalam jumlah yang

besar. Senyawa marchantin A mempunyai beberapa aktivitas antara lain sebagai

antimikroba, antifungi, antiinflamasi, antioksidan, dan relaksan otot (Huang, dkk.,

2010).

Senyawa marchantin A yang diisolasi dari spesies M. emarginata

menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap Acinetobacter calcoaceticus,

Alcaligenes faecalis, Bacillus cereus, B. megaterium, B. subtilis, Cryptococcus

neoformans, Enterobacter cloacae, E. coli, Proteus mirabilis, P. aeruginosa,

Salmonella typhimurium, dan S. aureus (Asakawa, dkk., 2009).

Gambar 2.3 Struktur Senyawa Marchantin A

(Sumber: Huang, dkk., 2010)

2.3 Kapang Endofit

Kapang endofit merupakan mikroba yang tumbuh di dalam jaringan

tanaman inangnya. Kapang endofit selama siklus hidupnya tumbuh membentuk

koloni pada jaringan dalam tanaman inangnya tanpa menyebabkan bahaya yang

nyata atau infeksi simtomatik pada tanaman inang (Srobel, 2003 dalam Selim K.,

dkk., 2012). Sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di permukaan bumi,

masing-masing tanaman mengandung satu atau lebih kapang endofit (Strobel,

dkk., 2004). Kapang endofit dapat menjadi sumber berbagai metabolit sekunder

baru yang berpotensi untuk dikembangkan dalam bidang farmasi (Kalyanaraman,

2012), medis, pertanian, dan industri (Strobel, dkk., 2004)

Kapang endofit dapat memproduksi senyawa bioaktif, baik yang sama

dengan inangnya maupun tidak sama akan tetapi memiliki aktivitas biologi yang

serupa (Strobel, dkk., 2004). Hal ini terjadi kemungkinan karena adanya transfer

genetik antara tanaman inang dengan kapang endofit, sehingga zat-zat yang

8

bermanfaat di tanaman inang juga dapat dihasilkan oleh kapang endofitnya

(Syarmalina, dkk., 2007). Kapang endofit mempunyai hubungan yang kompleks

dengan tanaman inangnya. Hubungan simbiosis mutualisme ditandai dengan

hubungan yang saling menguntungkan antara mikroba endofit dan tumbuhan

inangnya. Hubungan simbiosis mutualisme antara mikroba endofit dengan

tanaman inangnya diuraikan sebagai keseimbangan di bawah kondisi lingkungan,

fisiologis dan genetiknya (Selim K., dkk., 2012). Kapang endofit mengeluarkan

senyawa metabolit sekunder yang merupakan senyawa bioaktif dan dapat

berfungsi meningkatkan ketahanan tanaman inangnya dari serangan patogen

(Selim K., dkk., 2012).

2.3.1 Kapang Endofit Penghasil Antibakteri

Isolat fungi endofit sebanyak 26 isolat pada bagian daun, batang, dan buah

dari tanaman Camptotheca acuminata, 50% diantaranya mempunyai aktivitas

antibakteri terhadap bakteri Pseudomonas solanacearum dan Ralstonia

solanacearum. Isolat XSJ02 memberikan aktivitas terbesar terhadap bakteri

patogen dengan diameter zona hambat sebesar lebih dari 20 mm (Ding, dkk.,

2010).

Phomopsichalasin, merupakan metabolit yang diisolasi dari mikroba

endofit Phomopsis spp. berhasiat sebagai antibakteri terhadap B. subtilis,

Salmonella enterica, dan S. aureus (Horn WS., dkk., 1995 dalam Radji, 2005).

Jenis endofit lainnya menghasilkan antibiotik berspektrum luas adalah mikroba

endofit yang diisolasi dari tanaman Grevillea pteridifolia. Endofit ini

menghasilkan metabolit kakadumycin. Aktifitas antibakterinya dapat menghambat

pertumbuhan Bacillus anthracis, dan Mycobacterium tuberculosis yang

multiresisten terhadap berbagai obat antituberkulosis dan juga berkhasiat sebagai

antimalaria (Castillo UJ., dkk., 2003 dalam Radji, 2005).

2.4 Mikroorganisme

Mikroorganisme atau mikroba adalah organisme hidup yang berukuran

sangat kecil. Mikroorganisme ada yang tersusun atas satu sel (uniseluler) dan ada

yang tersusun atas beberapa sel (multiseluler). Mikroorganisme uniseluler hanya

9

tersusun atas satu sel, namun dapat menunjukkan semua karakteristik organisme

hidup, yaitu bermetabolisme, bereproduksi, berdiferensiasi, melakukan

komunikasi, melakukan pergerakan, dan berevolusi (Pratiwi, 2008).

Organisme yang termasuk ke dalam golongan mikroorganisme adalah

bakteri, archae, fungi (kapang dan khamir), protozoa, dan virus. Virus, bakteri,

dan archae termasuk ke dalam golongan prokariot, sedangkan fungi dan protozoa

termasuk ke dalam golongan eukariotik (Pratiwi, 2008).

2.4.1 Bakteri

Bakteri merupakan sel prokariot yang khas, uniseluler dan tidak

mengandung struktur yang membatasi membran di dalam sitoplasmanya.

Reproduksi utama dengan pembelahan biner sederhana yaitu suatu proses

aseksual. Morfologi bakteri terdiri dari tiga bentuk, yaitu sferis (kokus), batang

(basil), dan spiral. Ukuran bakteri bervariasi tetapi pada umumnya berdiameter

sekitar 0,5-1,0 µm dan panjang 1.5-2,5 µm (Pelczar & Chan, 2008).

Gambar 2.4 Struktur sel bakteri

(Sumber : Tortora, 2010)

Bakteri dibagi menjadi dua golongan yaitu bakteri Gram positif dan Gram

negatif (Pelczar & Chan, 2008).

10

Tabel 2.2 Ciri-ciri Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif

Ciri

Perbedaan Relatif

Gram Positif Gram Negatif

Struktur dinding sel Tebal (15-80 nm)

Berlapis tunggal (mono)

Tipis (10-15 nm)

Berlapis tiga (multi)

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah

(1-4%).

Peptidoglikan ada sebagai

lapisan tunggal; komponen

utama lebih dari 50% berat

kering pada beberapa sel

bakteri.

Ada asam tekoat

Kandungan lipid

tinggi (11-22%).

Peptidoglikan ada di

dalam lapisan kaku

sebelah dalam;

jumlahnya sedikit,

merupakan sekitar

10% berat kering.

Tidak ada asam tekoat

Kerentanan terhadap

penisilin

Lebih rentan Kurang rentan

Persyaratan nutrisi Relatif rumit pada banyak

spesies

Relatif sederhana

Resistensi terhadap

gangguan fisik

Lebih resisten Kurang resisten

(Sumber: Pelczar & Chan, 2008)

2.4.2 Kapang

Kapang merupakan fungi yang berfilamen dan multiseluler. Identifikasi

kapang didasarkan pada penampakan fisik (morfologi), termasuk karakteristik

koloni dan spora reproduktif (Pratiwi, 2008). Tubuh kapang (thallus) dibedakan

menjadi dua bagian yaitu miselium dan spora. Miselium merupakan kumpulan

beberapa filamen yang disebut hifa. Bagian dari hifa yang berfungsi untuk

mendapatkan nutrisi disebut hifa vegetatif. Sedangkan bagian hifa yang berfungsi

sebagai alat reproduksi disebut hifa reproduktif atau hifa udara (aerial hypha),

karena pemanjangannya mencapai bagian atas permukaan media tempat fungi

ditumbuhkan (Pratiwi, 2008).

Kapang bereproduksi baik secara aseksual dengan pembelahan,

pembentukan tunas atau spora, maupun secara seksual dengan peleburan inti dari

kedua induknya (Pratiwi, 2008). Morfologi hifa ada tiga macam, antara lain

sebagai berikut (Pratiwi, 2008):

11

a. Aseptat (coenocytic hypha), yaitu hifa yang tidak memiliki dinding sekat

(septa).

b. Septat hifa (hifa bersekat) dengan sel-sel uninukleat. Septa membagi hifa

menjadi ruang-ruang yang berisi 1 inti, dan pada tiap sekat terdapat pori-

pori yang memungkinkan perpindahan inti dan sitoplasma dari satu ruang

ke ruang lainnya.

c. Septa dengan ruang-ruang yang berisi lebih dari 1 inti (multinukleat).

Gambar 2.5 Tipe-tipe Hifa

(Sumber : Pelczar & Chan, 2008)

Kapang memerlukan kondisi kelembapan yang tinggi, persediaan bahan

organik, dan oksigen untuk pertumbuhannya. Kapang tumbuh dengan baik pada

kondisi lingkungan yang mengandung banyak gula dengan tekanan osmotik tinggi

dan kondisi asam yang tidak menguntungkan bagi pertumbuhan bakteri. Kapang

merupakan organisme aerob sejati dan tumbuh dalam kisaran temperatur antara

22-30°C (Pratiwi, 2008).

Dilihat dari kondisi lingkungan tempat hidup dan karakteristik nutrisinya,

kapang berbeda dengan bakteri. Kapang lebih tahan terhadap tekanan osmotik

sehingga dapat tumbuh dengan baik pada kadar gula dan garam yang tinggi; dapat

hidup pada substansi dengan kondisi kelembapan yang sangat rendah; dan dapat

memetabolisme karbohidrat kompleks seperti lignin sehingga dapat tumbuh pada

substrat-substrat seperti dinding kamar mandi, sepatu kulit, dan sampah kertas

(Pratiwi, 2008).

12

2.5 Antimikroba

Antimikroba merupakan obat pembasmi mikroba, khususnya mikroba

yang merugikan manusia. Obat yang digunakan untuk membasmi mikroba

penyebab infeksi pada manusia harus memiliki toksisitas selektif setinggi

mungkin bagi mikroba dan relatif tidak toksik bagi hospesnya (Setiabudy, 2007).

Senyawa antimikroba didefinisikan sebagai senyawa biologi atau kimia yang

dapat menghambat pertumbuhan dan aktivitas mikroba.

Mekanisme kerja antimikroba sebagai berikut (Pelczar & Chan, 2008) :

1. Merusak dinding sel

Bakteri mempunyai suatu lapisan luar yang disebut dinding sel. Dinding

sel berfungsi untuk mempertahankan bentuk dan menahan sel, dinding sel bakteri

tersusun atas peptidoglikan yang merupakan polimer kompleks yang terdiri atas

rangkaian asam N-asetil glukosamin dan asam N-asetilmuramat yang tersusun

secara bergantian. Keberadaan lapisan peptidoglikan ini menyebabkan dinding sel

bersifat kaku dan kuat sehingga mampu menahan tekanan osmotik dalam sel.

Struktur dinding sel dapat dirusak dengan cara menghambat

pembentukannya atau mengubahnya setelah selesai dibentuk. Bahan antimikroba

pada konsentrasi rendah akan menghambat pembentukan ikatan glikosida

sehingga pembentukan dinding sel yang baru akan terganggu. Konsentrasi tinggi

pada bahan antimikroba akan menyebabkan ikatan glikosida menjadi terganggu

dan pembentukan dinding sel terhenti.

2. Merubah permeabilitas sel

Sitoplasma dibatasi oleh selaput yang disebut membran sel yang

mempunyai permeabilitas selektif, membran ini tersusun atas fosfolipid dan

protein. Membran sel berfungsi untuk mengatur keluar masuknya zat-zat tertentu

dalam sel. Terganggunya fungsi membran sel oleh adanya bahan antimikroba,

menyebabkan permeabilitas sel bakteri akan mengalami perubahan, sehingga akan

mengakibatkan terhambatnya pertumbuhan sel atau kematian sel.

13

3. Merubah protein dan asam nukleat

Kelangsungan hidup sel sangat tergantung pada molekul-molekul protein

dan asam nukleat. Gangguan apapun yang terjadi pada pembentukan atau fungsi

zat-zat tersebut dapat mengakibatkan kerusakan total pada sel. Bahan antimikroba

yang dapat mendenaturasi protein dan asam nukleat dapat merusak sel tanpa dapat

diperbaiki lebih lanjut.

4. Menghambat kerja enzim

Badan sel pada mikroba mengandung protein yang membantu

kelangsungan proses-proses metabolisme. Zat kimia telah diketahui dapat

menggangu reaksi biokimia misalnya logam berat, golongan tembaga, perak, air

raksa dan senyawa logam berat lain, umumnya efektif sebagai bahan antimikroba

pada konsentrasi relatif rendah. Kerja enzim yang terhambat akan menyebabkan

proses metabolisme terganggu, sehingga aktifitas sel bakteri juga akan terganggu

dan dapat menyebabkan sel bakteri menjadi hancur dan mati.

5. Menghambat sintesis DNA, RNA dan protein

DNA, RNA dan protein memegang peranan penting dalam proses

kehidupan normal sel, beberapa bahan antimikroba dalam bentuk antibiotik dapat

menghambat proses sintesis protein. Keberadaan DNA, RNA dan protein jika

mengalami gangguan atau hambatan pada pembentukan atau fungsi zat tersebut

maka dapat mengakibatkan kerusakan sel sehingga proses kehidupan sel

terganggu.

2.6 Uji Aktivitas Antimikroba

Metode yang dapat digunakan untuk mengetahui adanya aktivitas

antimikroba dalam suatu sampel terbagi menjadi dua kelompok, yaitu metode

difusi dan dilusi (Tortora, 2010). Metode difusi dapat digunakan untuk menguji

aktivitas antimikroba secara kualitatif sedangkan metode dilusi dapat digunakan

secara kualitatif untuk menentukan konsentrasi terendah suatu zat antimikroba

yang dapat menghambat dan membunuh mikroba uji.

14

2.6.1 Metode Difusi

Metode ini dikenal juga sebagai metode Kirby Bauer. Cawan petri yang

berisi media agar diinokulasikan sejumlah mikroba uji dengan jumlah yang

standar. Kertas cakram diresapi sampel uji dengan konsentrasi yang diketahui

ditempatkan di atas media agar yang telah berisi organisme uji yang telah padat.

Sampel akan berdifusi dari kertas cakram menuju media agar dan semakin jauh

sampel dapat berdifusi dari kertas cakram, maka konsentrasi sampel dapat

diturunkan. Sampel yang efektif aktivitasnya terhadap mikroorganisme uji dapat

dilihat dengan adanya zona hambat di sekitar kertas cakram setelah diinkubasi.

Diameter zona hambat selanjutnya diukur dengan menggunakan jangka sorong,

semakin besar diameter zona hambatnya maka semakin sensitif sebagai antibiotik.

Metode difusi paling sering digunakan karena sederhana dan murah (Tortora,

2010).

2.6.2 Metode Dilusi

Metode dilusi sering digunakan untuk menentukan Konsentrasi Hambat

Minimum (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) dari obat

antimikroba. Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair (makrodilusi

dan mikrodilusi) dan dilusi padat. Metode dilusi cair dan padat dapat digunakan

untuk mengukur aktivitas antimikroba secara in vitro terhadap bakteri dan fungi.

Nilai KHM dicatat sebagai konsentrasi terendah dari agen antimikroba yang dapat

menghambat pertumbuhan mikroba dan biasanya ditunjukkan dalam satuan

µg/mL atau mg/L (Balouiri, dkk., 2016).

a. Metode Dilusi Cair

Mikrodilusi dan makrodilusi cair merupakan salah satu metode untuk

menentukan kepekaan antimikroba yang paling utama. Prosedur ini dilakukan

dengan membuat konsentrasi menurun dari agen antimikroba dalam media cair

yang kemudian diinokulasikan bakteri uji dengan volume minimum yaitu 2 mL

(makrodilusi) atau dengan volume yang lebih rendah menggunakan microplate

96-well (Balouiri, dkk., 2016).

Dasar pengamatannya adalah dengan melihat tumbuh atau tidaknya

mikroba di dalam media. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM selanjutnya

15

dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen

antimikroba, dan diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat

jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai KBM (Pratiwi, 2008). Menentukan

KHM dan KBM penting untuk dilakukan karena untuk menghindari penggunaan

antibiotik yang berlebihan atau keliru dan kemungkinan terjadinya reaksi

toksisitas yang lebih besar dari dosis yang diperlukan (Tortora, 2010).

b. Metode Dilusi Padat

Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media

padat. Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang

diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji (Pratiwi, 2008).

2.7 Karakterisasi Mikroba

Mikroba mempunyai karakterisasi yang berbeda antara jenis satu dengan

yang lainnya. Karakterisasi pada mikroba berfungsi untuk mengetahui karakter

masing-masing dari mikroba yang digunakan baik bakteri maupun kapang.

2.7.1 Karakterisasi Bakteri

Karakterisasi dapat dilakukan dengan cara pewarnaan (Sardiani, dkk.,

2015). Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi pewarnaan sederhana dan

pewarnaan diferensial. Pewarnaan sederhana menggunakan larutan alkohol

tunggal sebagai basis pewarna pada bakteri. Zat warna diaplikasikan dengan cara

dioleskan pada bakteri yang sudah diletakkan di atas kaca objek lalu difiksasi dan

dibilas kemudian dikeringkan dan dilihat morfologinya di bawah mikroskop. Zat

kimia yang ditambahkan pada larutan untuk mengintensifkan warna disebut

mordant. Fungsi mordant adalah untuk meningkatkan afinitas pewarnaan pada

spesimen biologi sehingga membuatnya lebih tebal dan lebih mudah untuk

diidentifikasi setelah dilakukan pewarnaan. Pewarna untuk identifikasi dengan

teknik pewarnaan sederhana yang biasanya digunakan di laboratorium adalah

metilen biru, carbolfuchsin, kristal violet, dan safranin (Tortora, 2010).

Pewarnaan diferensial menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba

atau bagian-bagian sel mikroba. Pewarnaan diferensial biasanya digunakan satu

16

atau lebih zat warna (Tortora, 2010). Pewarnaan Gram merupakan salah satu

teknik pewarnaan yang paling berguna karena bakteri dapat terklasifikasi menjadi

dua kelompok besar, yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif (Tortora,

2010). Pewarnaan Gram dikembangkan pada tahun 1884 oleh seorang

bakteriologis Denmark bernama Christian Gram. Olesan bakteri yang terfiksasi

ditambahkan larutan-larutan berikut: kristal violet, larutan lugol, alkohol (bahan

pemucat), dan safranin (Pelczar & Chan, 2008).

Gambar 2.6 Prosedur Pewarnaan Gram

(Sumber: Tortora, 2010)

Bakteri Gram positif akan berwarna ungu tua setelah pewarnaan Gram

karena mempertahankan zat warna dari kristal violet sedangkan pada bakteri

Gram negatif, terjadi kehilangan warna kristal violet ketika dicuci dengan alkohol,

dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin, tampak

bewarna merah (Pelczar & Chan, 2008).

2.7.2 Karakterisasi Kapang

Identifikasi fungi, khususnya kapang, dapat dilakukan sampai genus

berdasarkan sifat-sifat morfologinya akan tetapi untuk identifikasi sampai ke

tingkat spesiesnya, sering kali diperlukan data fisiologi dan/atau biokimianya

(Gandjar, 1999; Gandjar, 2006).

Pengamatan morfologi secara makroskopik pada kapang meliputi: warna

dan permukaan koloni (granular, seperti tepung; menggulung; licin; ada tidaknya

tetes-tetes eksudat), ada tidaknya garis-garis radial dari pusat koloni ke arah tepi

17

koloni, dan ada tidaknya lingkaran-lingkaran konsentris (Gandjar, 1999; Gandjar,

2006). Pengamatan mikroskopik kapang meliputi: ada tidaknya septum, bentuk

hifa (spiral, bernodul, atau mempunyai rizhoid), warna hifa (hialin, transparan,

atau gelap), ada tidaknya konidia, dan bentuk konidia (bulat, lonjong, berantai,

atau tidak beraturan) (Gandjar, 1999; Gandjar, 2006).

2.8 Bakteri Uji

Bakteri uji pada penelitian meliputi perwakilan dari bakteri Gram positif

dan Gram negatif. Bakteri uji tersebut adalah S. aureus ATCC 25923, dan B.

subtilis ATCC 6633 yang merupakan bakteri Gram positif dan P. aeruginosa

ATCC 27853 yang merupakan bakteri Gram negatif.

2.8.1 Staphylococcus aureus

Nama Staphylococcus aureus berasal dari bahasa Yunani, yaitu staphyle

yang berarti kumpulan anggur dan cocci yang berarti bulat. Sedangkan nama

aureus berasal dari bahasa Latin yang berarti emas (Freeman, dkk., 2005). S.

aureus merupakan bakteri Gram positif berbentuk bulat berdiameter 0,5-1,5 μm,

tersusun dalam kelompok-kelompok yang tidak teratur seperti buah anggur,

anaerob fakultatif, tidak membentuk spora, dan tidak bergerak (non-motil). S.

aureus merupakan patogen utama pada peningkatan kasus karena kenaikan

resistensi antibiotik. Bakteri ini mempunyai warna emas ketika ditumbuhkan pada

media padat (Harris, dkk., 2002).

S. aureus umumnya tumbuh pada membran mukus (seperti pada vagina

yang terasosiasi saat menstruasi) atau pada luka, dan dapat menyebabkan infeksi

kulit, endokarditis, septikemia, lepuh kulit, dan keracunan makanan (Jawetz,

2013; Arthur, 2010).

2.8.2 Bacillus subtilis

B. subtilis adalah bakteri Gram positif, termasuk dalam genus Bacillus,

berbentuk batang dan memproduksi endospora. Bakteri ini merupakan spesies

basil yang dapat bergerak, menghasilkan enzim katalase, dan bersifat aerob

obligat. B. subtilis dapat menyebabkan penyakit bagi pasien yang

18

immunocompromise berat (Saha, dkk., 2014). Bakteri ini dapat tumbuh pada agar

darah membentuk zona hemolisis dan dapat mencemari botol transfusi darah

sehingga melisiskan sel darah (Singelton, dkk., 1981).

2.8.3 Pseudomonas aeruginosa

P. aeruginosa merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang dengan

flagela pada kedua kutubnya, termasuk bakteri aerob obligat. Bakteri ini terdapat

dimana-mana dan tersebar luas di dalam atau pada tumbuhan, tanah, dan air.

Tumbuh dengan cepat walaupun pada air suling atau air saluran (leding)

(misalnya pada pembuangan wastafel, aerator kran, bunga potong) (Arthur, 2010).

P. aeruginosa bertanggung jawab untuk 10-15% dari infeksi nosokomial

di seluruh dunia. Infeksi ini sulit untuk diobati karena resistensi alami dari spesies,

serta kemampuan yang luar biasa dalam memperoleh mekanisme lebih lanjut dari

ketahanan terhadap beberapa kelompok agen antimikroba (Strateva & Yordanov,

2009). Bakteri ini sering menyebabkan infeksi nosokomial dengan pneumonia

pada fibrosis kistik, luka bakar, dan pasien neutropenik, infeksi mata dan telinga

(Arthur, 2010).

2.9 Antibiotik Pembanding

2.9.1 Kloramfenikol

Kloramfenikol memiliki rumus kimia C11H12Cl2N2O5 dengan bobot

molekul 323,13. Kloramfenikol berupa serbuk hablur halus berbentuk jarum atau

lempeng memanjang; putih hingga putih kelabu atau putih kekuningan; larutan

praktis netral terhadap lakmus P; stabil dalam larutan netral atau larutan agak

asam. Kloramfenikol sukar larut dalam air; mudah larut dalam etanol, dalam

propilen glikol, dalam aseton dan dalam etil asetat (Depkes RI, 1995).

Gambar 2.7 Struktur Kloramfenikol

(Sumber: Sweetman, 2009)

19

Kloramfenikol pada awalnya diproduksi oleh Streptomyces venezuelae pada

tahun 1947, namun saat ini dapat diperoleh dengan cara sintetis (Sweetman,

2009). Kloramfenikol merupakan antibiotik dengan spektrum luas dan bekerja

dengan menghambat sintesis protein bakteri dengan cara berikatan pada ribososn

50S sehingga menghambat pembentukan rantai peptida. Kloramfenikol bersifat

bakteriostatik terhadap mikroorganisme yang peka seperti riketsia, klamidia,

mikoplasma, dan beberapa strain bakteri Gram positif dan Gram negatif

(Sukandar, 2008).

2.9.2 Siprofloksasin Hidroklorida

Siprofloksasin HCl mempunyai rumus kimia C17H18FN3O3.HCl.H2O dengan

bobot molekul 385,8. Siprofloksasin berupa serbuk kristal berwarna kekuningan

dan sedikit higroskopik. Larut dalam air; sangat sukar larut dalam alkohol

terdehidrasi; praktis tidak larut dalam aseton, dalam diklorometan, dan dalam etil

asetat; sukar larut dalam metanol (Sweetman, 2009).

Gambar 2.8 Struktur Siprofloksasin Hidroklorida

(Sumber: Islam S.M., dkk, 2012)

Siprofloksasin merupakan antibiotik berspektrum luas dan secara kimia

termasuk antibiotik golongan quinolon. Siprofloksasin digunakan secara luas

untuk mengobati infeksi saluran kemih, infeksi saluran napas bagian bawah, diare

yang disebabkan oleh bakteri, infeksi kulit dan jaringan, gonorrhea pada bedah

profilaksis (Islam S.M., dkk, 2012). Siprofloksasin bekerja dengan cara

menghambat DNA gyrase sehingga sintesa DNA bakteri terganggu (Sukandar,

2008).


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari hingga September 2017 di

Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia, Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat-alat yang digunakan diantaranya Laminar Air Flow Cabinet

(Minihelix II), inkubator (Memmert), incubator shacker, autoklaf (All American),

hot plate (Thermo Scientific), spektrofotometer UV-Vis, timbangan analitik

(AND), mikroskop cahaya (Motic), microplate, dan jangka sorong (Tricle Brand).

Alat-alat gelas yang digunakan diantaranya kaca penutup, kaca objek, batang

pengaduk, cawan petri (Anumbra), labu erlenmeyer, beaker glass, tabung reaksi

(Pyrex), gelar ukur, botol vial, batang L, corong pisah, dan labu ukur. Alat-alat

lainnya yaitu bunsen, mikropipet dan tip (Bio Rad), pH indikator, magnetic

stirrer, pinset, gunting, tisu, kapas, kasa, kertas saring, tali, aluminium foil, plastic

wrap, dan kertas perkamen.

3.2.2 Bahan

a. Sampel Tanaman

Sampel tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah lumut hati M.

emarginata yang diambil pada tanggal 2 Februari 2017 di kawasan Curug

Cigamea, Jl. Curug Cigamea, Gn. Sari, Pamijahan, Bogor, Jawa Barat.

b. Media Pertumbuhan Mikroba

Potato Dextrose Agar (PDA) (Merck), Potato Dextrose Yeast (PDY),

Nutrient Agar (NA) (Merck), Mueller-Hinton Agar (MHA) (Merck), Mueller-

Hinton Broth (MHB) (Merck).

21

c. Bahan Untuk Sterilisasi Permukaan

Air, etanol 70%, natrium hipoklorit (NaOCl) 5,25% (Bayclin®), dan

aquades steril.

d. Bahan untuk Karakterisasi Bakteri

NaCl 0,9%, larutan kristal violet, lugol, alkohol 96%, dan larutan safranin.

e. Antibiotik Pembanding

Cakram antibiotik kloramfenikol (Oxoid), antibiotik siprofloksasin, dan

antibiotik kloramfenikol.

f. Bakteri Uji

Bakteri Gram positif : S. aureus ATCC 25923

B. subtilis ATCC 6633

Bakteri Gram negatif : P. aeruginosa ATCC 27853

g. Bahan untuk Uji Mikrodilusi Cair

Dimetil Sulfoksida (DMSO), p-iodonitrotetrazolium (INT), NaCl 0,9%,

dan aquades steril.

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Pembuatan Media Pertumbuhan

a. Pembuatan Media Potato Dextrose Agar (PDA)

Berdasarkan prosedur yang tertera pada kemasan, media PDA dibuat

dengan cara sebanyak 39 gram PDA dilarutkan dalam 1000 mL aquades. Media

dihomogenkan dengan magnetic stirrer sampai mendidih di atas hot plate. Media

tersebut kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C, tekanan 1 atm

selama 15 menit. Media dituang ke dalam cawan petri steril sebanyak ±10 mL

dan ke dalam tabung reaksi steril sebanyak ±5 mL untuk membuat agar miring.

https://www.google.co.id/search?biw=1366&bih=662&q=bacillus+subtilis&spell=1&sa=X&ved=0ahUKEwjbrq-viMLSAhUHpY8KHRtiD78QvwUIFigA

22

b. Pembuatan Nutrient Agar (NA)

Berdasarkan prosedur yang tertera pada kemasan media NA (Merck)

dibuat dengan cara sebanyak 20 gram NA dilarutkan dalam 1000 mL aquades.

Media dihomogenkan dengan magnetic stirrer sampai mendidih di atas hot plate.

Media tersebut kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C, tekanan

1 atm selama 15 menit. Media dituang ke dalam cawan petri steril sebanyak ±10

mL dan ke dalam tabung reaksi steril sebanyak ±5 mL untuk membuat agar

miring.

c. Pembuatan Media Mueller-Hinton Agar (MHA)

Sebanyak 38 gram MHA dilarutkan dalam 1000 mL aquades. Media



selama 15 menit. Media dituang ke dalam cawan petri steril sebanyak ±10 mL

dan dibiarkan hingga memadat (Pratiwi, 2015).

d. Pembuatan Media Potato Dextrose Yeast (PDY)

Potato Dextrose Yeast (PDY) mengandung PDB, ekstrak yeast (2 g/L),

dan CaCO3 (kalsium karbonat) pada pH 6 (Kumala, S., dkk., 2007). PDB dibuat

dengan cara 200 gram kentang yang diiris halus dan direbus dalam 1000 mL

aquades lalu disaring ekstraknya, kemudian ditambahkan dekstrosa 20 gram dan

ekstrak yeast sebanyak 2 (Ahmad dkk., 2013). Media tersebut disterilisasi dalam

autoklaf pada suhu 121°C, tekanan 1 atm selama 15 menit (Jauhari, 2010).

e. Pembuatan Media Mueller-Hinton Broth (MHB)

Sebanyak 21 gram MHB dilarutkan dalam 1000 mL aquades. Media



selama 15 menit.

23

3.3.2 Isolasi Kapang Endofit

Isolasi sampel lumut hati menggunakan metode yang dilakukan oleh

Hulikere, dkk., (2016) dengan modifikasi. Lumut hati yang digunakan yaitu lumut

yang masih segar, tidak layu atau tidak menguning, dan bebas dari kontaminasi

(tidak ada bercak hitam atau jamur yang menempel).

Lumut hati dicuci dengan air mengalir selama 30 menit kemudian

disterilisasi permukaan dengan cara direndam di dalam etanol 70% selama 1

menit, NaOCl 5,25% selama 2 menit, dan direndam kembali dalam etanol 70%

selama 30 detik. Sampel lumut hati kemudian dibilas dengan aquades steril

selama 1 menit sebanyak 3 kali bilasan untuk menghilangkan sisa-sisa dari bahan

sterilisasi permukaan. Lumut hati yang telah disterilisasi permukaannya

diletakkan di atas kertas saring steril dan dibiarkan hingga mengering selanjutnya

dipotong dengan ukuran ±1x1 cm menggunakan gunting steril.

Potongan sampel diletakkan pada cawan petri yang berisi media PDA.

Aquades pada bilasan terakhir dicelupkan batang L dan ditempelkan pada media

PDA yang lainnya, perlakuan ini dilakukan sebagai kontrol. Perlakuan kontrol

berfungsi untuk mengetahui dan menentukan apakah kapang yang tumbuh

merupakan kapang endofit atau bukan. Perlakuan pada kontrol bila tumbuh

kapang di permukaan media maka kapang yang tumbuh bukanlah kapang endofit,

sedangkan apabila pada media PDA kontrol tidak tumbuh kapang, maka kapang

yang tumbuh adalah kapang endofit (Ariyono, 2014).

Pengerjaan dilakukan di dalam Laminar Air Flow Cabinet (LAFC). Media

yang telah diinokulasi potongan sampel dan media kontrol diinkubasi selama 14

hari pada suhu ruang. Isolat kapang endofit yang menunjukan sifat morfologi

kapang dipindahkan ke media PDA baru sampai didapatkan isolat murni (Kumala,

dkk., 2014).

3.3.3 Pemurnian Kapang Endofit

Kapang endofit yang telah tumbuh pada media isolasi PDA, kemudian

secara bertahap dimurnikan satu persatu. Masing-masing isolat kapang endofit

yang diperoleh dipindahkan ke dalam cawan petri yang berisi media PDA dan

dilakukan secara duplo untuk working culture dan stock culture. Pemurnian ini

24

bertujuan untuk memisahkan isolat kapang endofit dengan morfologi yang

berbeda untuk dijadikan isolat tersendiri. Pengamatan morfologi dilakukan

kembali setelah inkubasi selama 5-7 hari pada suhu ruang. Pemurnian isolat

dengan cara memisahkan dengan isolat lain, ditanaman berulang-ulang hingga

didapatkan isolat tunggal (Kumala, dkk., 2014).

3.3.4 Karakterisasi Kapang Endofit

Karakterisasi kapang endofit dilakukan secara makroskopik (visual) dan

mikroskopik. Pengamatan secara makroskopik dilakukan berdasarkan kriteria,

yaitu warna dan permukaan koloni (granular, seperti tepung; menggulung; licin;

ada tidaknya tetes-tetes eksudat), ada tidaknya garis-garis radial dari pusat koloni

ke arah tepi koloni, dan ada tidaknya lingkaran-lingkaran konsentris (Gandjar,

1999; Gandjar, 2006). Pengamatan secara mikroskopik dilakukan dengan

pembuatan preparat (metode slide culture). Kertas saring diletakkan pada dasar

cawan petri kemudian kaca objek dan kaca penutup diletakkan di atas kertas

saring. Cawan petri disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15

menit lalu kaca objek ditetesi media PDA steril. Miselium kapang endofit diambil

dengan menggunakan jarum ose dan diletakan di atas kaca objek yang sudah

ditetesi media. Kaca objek ditutup menggunakan kaca penutup secara perlahan-

lahan dan kertas saring ditetesi aquades steril kemudian diinkubasi pada suhu

ruang selama 5-7 hari. Morfologi kapang diamati dengan menggunakan

mikroskop (Kumala, dkk., 2014). Pengamatan mikroskopik meliputi sekat hifa

(bersekat atau tidak bersekat), pertumbuhan hifa (bercabang atau tidak

bercabang), bentuk dan ornamentasi spora (Ariyono, 2014).

3.3.5 Skrining Aktivitas Antibakteri Kapang Endofit

Skrining kapang endofit yang berpotensi sebagai antibakteri dilakukan

dengan metode difusi agar padat (Diffusion Agar Plate Method). Sebanyak 100

µL dari masing-masing suspensi bakteri uji dimasukkan ke dalam cawan petri

yang berisi media MHA. Suspensi bakteri lalu disebarkan dengan menggunakan

batang L (Karteek, dkk., 2012; Kumala, dkk., 2014).

25

Isolat murni kapang endofit yang berumur 14 hari diambil dengan sedotan

steril berdiameter 6 mm dan dipindahkan secara aseptis ke dalam media MHA

yang telah ditanami bakteri uji lalu diinkubasi pada suhu 37° C selama 18-24 jam.

Aktivitas antibakteri kapang endofit dapat dilihat dengan adanya zona hambat

yang terbentuk. Isolat yang menghasilkan zona hambat dipilih sebagai isolat

untuk pengujian selanjutnya yaitu fermentasi dan pengujian aktivitas antibakteri

(Santos, dkk., 2015).

3.3.6 Fermentasi dan Ekstraksi Kapang Endofit

Isolat kapang endofit yang aktif antibakteri ditumbuhkan dalam media

PDA selama 7 hari. Diambil sebanyak 5 potong isolat menggunakan sedotan steril

dengan ukuran ±1x1 cm. Potongan kapang tersebut dimasukkan ke dalam media

PDY sebanyak 50 mL dalam Erlenmeyer 250 mL. Fermentasi dilakukan dengan

metode goyang (shacking) selama 14 hari dengan kecepatan 130 rpm pada suhu

28° C (Kumala, dkk., 2015).

Hasil fermentasi berupa supernatan dan biomassa dipisahkan dengan cara

disaring menggunakan kertas saring dan corong buchner vakum (Guo, 2008).

Bagian biomassa berupa massa padat dihancurkan dan diekstraksi menggunakan

pelarut metanol dengan metode maserasi selama 7 hari. Bagian supernatan

diekstraksi dengan metode partisi cair-cair menggunakan pelarut n-heksan dan etil

asetat secara bertingkat. Hasil ekstraksi dipekatkan menggunakan rotary

evaporator vaccum sampai diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kemudian digunakan

untuk uji aktivitas antibakteri (Kumala, 2014).

3.3.7 Uji Aktivitas Antibakteri

a. Peremajaan Bakteri Uji

Bakteri uji diinokulasikan satu ose ke dalam media NA miring, kemudian

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Pengerjaan dilakukan dalam kondisi

steril di dalam Laminar Air Flow Cabinet (LAFC) (Jauhari, 2010).

26

b. Karakterisasi Bakteri Uji

Karakterisasi bakteri uji dilakukan dengan pewarnaan Gram untuk

mengetahui morfologi dan kemurnian bakteri (Sardiani, dkk., 2015). Pewarnaan

Gram dilakukan dengan cara diambil satu ose isolat bakteri lalu disebarkan di atas

kaca objek yang sudah ditetesi NaCl 0,9% dan dilewatkan di atas nyala api bunsen

(fiksasi). Preparat ditetesi pewarna primer dengan larutan kristal violet selama 1

menit, warna dibuang dengan dicuci dengan aquades. Tahap selanjutnya ditetesi

lugol dan dibiarkan selama 1 menit lalu dicuci dengan aquades. Preparat

dilunturkan dengan alkohol 96% selama 10-20 detik dan alkohol dibuang.

Preparat dicuci dengan aquades dan diberi pewarna tandingan dengan larutan

safranin selama 15 detik. Warna kemudian dibuang dan dicuci dengan aquades,

dikeringkan lalu diamati morfologi sel, serta warnanya di bawah mikroskop

(Kumala, 2014).

c. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji

Bakteri uji yang telah diremajakan diambil dengan kawat ose steril lalu

disuspensikan ke dalam tabung yang berisi 5 mL larutan NaCl 0,9% steril hingga

diperoleh kekeruhan yang sama dengan standar kekeruhan Mc. Farland III (109

CFU/mL). Suspensi bakteri diencerkan dengan cara diambil sebanyak 1 mL dan

dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 mL fisiologis 0,9% steril.

Pengenceran suspensi bakteri dilakukan sampai diperoleh standar kekeruhan

bakteri 106

CFU/mL (Husniyah, 2016).

d. Uji Aktivitas Antibakteri

Sebanyak 100 µL dari masing-masing suspensi bakteri uji dimasukkan ke

dalam cawan petri yang berisi media MHA. Suspensi bakteri disebarkan dengan

menggunakan batang L (Karteek, dkk 2012; Kumala, 2014). Pengujian aktivitas

antibakteri dilakukan dengan metode Kirby-Bauer atau metode difusi cakram.

Larutan uji yaitu ekstrak kapang endofit diserapkan sebanyak 30 μl pada kertas

cakram steril berukuran diameter 6 mm dengan konsentrasi 200 μg/mL (Mewari,

2008; Komala, dkk., 2010; Zakiyah, dkk., 2015;). Setiap kertas cakram steril yang

ditetesi ekstrak didiamkan hingga mengering dari pelarut yang digunakan.

27

Kontrol positif yang digunakan yaitu cakram antibiotik kloramfenikol.

Kontrol negatif yang digunakan yaitu masing-masing pelarut ekstrak. Cakram

diletakkan secara aseptis di atas media yang telah ditanami bakteri uji dan

diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam, lalu dilakukan pengukuran zona

hambat di sekitar cakram menggunakan jangka sorong (Zakiyah, dkk., 2015).

Pembacaan zona hambat yang terbentuk dikategorikan menjadi 3, yaitu zona

hambat total dimana zona hambat yang terbentuk di sekitar terlihat jernih; zona

hambat parsial bila pada zona hambat tersebut terlihat masih terdapat beberapa

pertumbuhan koloni baru; dan zona hambat nol bila tidak ada zona hambat yang

terbentuk di sekitar cakram.

3.3.8 Uji Sensitivitas Antibiotik

Uji sensitivitas antibiotik dilakukan dengan metode difusi cakram untuk

menentukan antibiotik pembanding yang paling sensitif terhadap bakteri uji yaitu

B. subtilis dan P. aeruginosa. Uji sensitivitas antibiotik dilakukan dengan

membandingkan aktivitas antibakteri dari dua antibiotik yaitu Siprofloksasin dan

Kloramfenikol dengan melihat zona hambat yang terbentuk. Kedua antibiotik

tersebut merupakan antibiotik berspektrum luas yang dapat menghambat

pertumbuhan bakteri baik Gram positif maupun Gram negatif (DiPiro. J.T., 2009).

Antibiotik yang diujikan berupa serbuk tanpa adanya bahan eksipien.

Dibuat larutan siprofloksasin dengan konsentrasi 500 µg/mL dan kloramfenikol

dengan konsentrasi 1000 µg/mL. Pelarut yang digunakan adalah DMSO 10%

(Valgas, dkk., 2007). Larutan antibiotik siprofloksasin kemudian diserapkan pada

kertas cakram sebanyak 10 µL, sedangkan antibiotik kloramfenikol diserapkan

sebanyak 30 µL. Konsentrasi akhir antibiotik pada cakram yaitu 5 µg/cakram

untuk antibiotik siprofloksasin dan 30 µg/cakram untuk antibiotik kloramfenikol.

Konsentrasi tersebut setara dengan konsentrasi cakram antibiotik siprofloksasin

dan kloramfenikol standar (Vineetha N., dkk., 2015).

Kontrol negatif menggunakan pelarut DMSO 10%. Kertas cakram tersebut

selanjutnya diletakkan secara aseptis di atas permukaan media MHA yang sudah

berisi bakteri uji. kultur diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37° C. Antibiotik

dengan zona hambat terbesar selanjutnya digunakan sebagai antibiotik

28

pembanding pada uji penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dengan

metode mikrodilusi cair.

3.3.9 Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)

KHM dilakukan pada ekstrak yang menghasilkan zona hambat terbesar

pada uji dengan difusi cakram yaitu fraksi ekstrak etil asetat isolat MEB1.

Penentuan KHM ini menggunakan metode mikrodilusi cair yang telah

direkomendasikan oleh National Committee for Clinical Laboratory Standards

(NCCLS). Metode Mikrodilusi cair menggunakan alat microplate 96-well yang

mempunyai 96 sumur pelat mikro (8 baris dan 12 kolom).

Bakteri uji yaitu B. subtilis dan P. aeruginosa yang telah diremajakan

selama 24 jam diambil dengan kawat ose steril lalu disuspensikan ke dalam

tabung yang berisi 5 mL larutan NaCl 0,9% steril dan divortex hingga homogen

lalu diukur absorbansinya menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis pada

panjang gelombang 625 nm. Nilai absorbansi 0,08-0,12 setara dengan 0,5

McFarland (1-2x 108 CFU/mL) sebagai standar. Suspensi bakteri yang telah

menunjukkan nilai absorbansi 0,08-0,12 kemudian diencerkan hingga diperoleh

konsentrasi 106 CFU/mL (Balouri, dkk., 2016).

Penentuan KHM dengan metode mikrodilusi cair terdiri dari ekstrak uji,

kontrol sterilitas, kontrol negatif, dan kontrol pertumbuhan. Kontrol sterilitas

berisi 200 µL media MHB. Kontrol negatif berisi media MHB, suspensi bakteri

uji, dan pelarut ekstrak (DMSO 10%). Kontrol pertumbuhan berisi media MHB

dan suspensi bakteri uji. Ekstrak uji yang digunakan yaitu fraksi ekstrak etil

asetat dari isolat MEB1. Ekstrak selanjutnya dibuat larutan dengan konsentrasi

800 µg/mL dalam DMSO 10%. Sebanyak 100 µL media MHB dimasukkan ke

dalam setiap sumur, untuk kontrol sterilitas media MHB yang ditambahkan yaitu

200 µL. Dimasukkan larutan ekstrak sebanyak 100 µL ke dalam sumur kolom ke-

12 yang telah berisi 100 µL media MHB. Dilakukan pengenceran bertingkat ke

arah kolom hingga diperoleh seri pengenceran sampel dengan 8 nilai konsentrasi

berbeda di setiap sumur. Sumur yang berisi konsentrasi terendah kemudian

dibuang larutannya sebanyak 100 µL untuk menyamakan volume di setiap sumur.

Dimasukkan 100 µL pelarut DMSO 10% pada sumur kontrol pelarut lalu

29

dihomogenkan dan diambil 100 µL untuk menyamakan volumenya. Sebanyak 100

µL suspensi bakteri uji ditambahkan ke dalam setiap sumur kecuali pada kontrol

sterilitas lalu dihomogenkan. Rentang konsentrasi akhir ekstrak adalah 1,563-200

µg/mL.

Pengujian dilakukan triplo untuk tiap sampel. Sampel uji dalam microplate

96-well kemudian diinkubasi pada suhu 37° C selama 24 jam. Pengujian yang

sama juga dilakukan pada antibiotik pembanding yaitu siprofloksasin dengan

rentang konsentrasi akhir yaitu 0,063-8 µg/mL. Penentuan nilai KHM dilakukan

secara visual dengan menambahkan larutan p-iodonitrotetrazolium (INT)

sebanyak 20 µL (0,6 mg/mL) ke dalam setiap sumur kemudian diinkubasi selama

30 menit (Wesseler, 2005 dan Klancnik A., dkk, 2010). Adanya pertumbuhan

bakteri akan ditunjukkan oleh perubahan warna menjadi ungu setelah

penambahan INT. Nilai KHM merupakan konsentrasi terkecil dari suatu senyawa

antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan suatu mikroba. KHM ditandai

dengan sumur dengan konsentrasi terkecil yang tidak dapat berubah warna

menjadi ungu setelah penambahan larutan p-iodonitrotetrazolium (INT).


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman bertujuan untuk memastikan kebenaran tanaman

yang digunakan pada penelitian. Hasil determinasi tanaman lumut hati dilakukan

di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Herbarium Bogoriense,

Cibinong, Bogor, Jawa Barat menunjukan bahwa sampel yang digunakan adalah

lumut hati Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees. Hasil determinasi

dapat dilihat pada lampiran 1.

4.2 Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit

Sampel lumut yang digunakan yaitu lumut yang masih segar, tidak layu

atau tidak menguning, dan bebas dari kontaminasi (tidak ada bercak hitam atau

jamur yang menempel). Bagian talus dari lumut hati digunakan dalam penelitian

ini dikarenakan permukaannya yang rata sehingga lebih mudah untuk dilakukan

sterilisasi permukaan.

Sampel dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran yang

menempel pada permukaan sampel. Sampel disterilisasi permukaannya dengan

menggunakan etanol 70% dan NaOCl 5,25% (Hulikere, dkk., 2016). Etanol 70%

merupakan agen antimikroba yang dapat merusak mikroba pada bagian

permukaan sampel dengan cara mendenaturasi protein, melarutkan lipid dari

membran mikroba. Konsentrasi optimal etanol yaitu 70-80% dan etanol murni

memiliki aktivitas antimikroba lebih rendah dibandingkan etanol yang terlarut

dalam air. Hal ini disebabkan karena pada proses denaturasi protein diperlukan

adanya air. Natrium hipoklorit (NaOCl) merupakan senyawa kimia golongan

halogen yang dapat melepaskan klor dan dapat mengoksidasi protein sehingga

mampu merusak membran sel dan terjadi inaktivasi enzim mikroba (Pratiwi,

2008). NaOCl dengan konsentrasi 2-10% berfungsi sebagai oksidan kuat dan

merupakan bahan sterilisasi permukaan yang umum digunakan (Zhang, dkk.,

2006). Etanol 70% dan NaOCl 5,25% digunakan untuk dekontaminasi permukaan

31

lumut, setelah proses dekontaminasi selanjutnya sampel dibilas dengan aquades

steril untuk menghilangkan sisa etanol dan NaOCl yang masih menempel pada

permukaan sampel.

Potongan sampel diletakkan di atas media PDA steril dan pada aquades

bilasan terakhir dicelupkan batang L steril lalu ditempelkan pada PDA yang

lainnya, perlakuan ini dilakukan sebagai kontrol. Perlakuan kontrol berfungsi

untuk mengetahui dan menentukan apakah kapang yang tumbuh merupakan

kapang endofit atau bukan. Apabila pada kontrol tumbuh kapang di permukaan

media maka kapang yang tumbuh bukanlah kapang endofit, sedangkan apabila

pada media PDA kontrol tidak tumbuh kapang, maka kapang yang tumbuh adalah

kapang endofit (Ariyono, 2014). Media PDA merupakan media pertumbuhan

yang umum digunakan untuk isolasi dan pemurnian kapang endofit karena media

tersebut kaya akan nutrisi dan bersifat selektif terhadap kapang endofit sehingga

memungkinkan mempercepat pertumbuhan kapang endofit (Ariyono, dkk., 2014).

Bagan kerja proses isolasi kapang endofit dapat dilihat pada lampiran 3.

Gambar 4.1 Posisi Penanaman Talus M. emarginata

(Sumber: Koleksi pribadi, 2017)

Berdasarkan hasil isolasi, didapatkan 6 isolat kapang endofit yang tumbuh

di sekitar tanaman inang. Hasil isolasi kapang endofit dapat dilihat pada lampiran

12.

32

Tabel 4.1 Daftar Isolat Kapang Endofit M. emarginata

Sampel Cawan Talus Hasil Kode Isolat

ME

A 1 √ MEA1

2 √ MEA2

3 X -

B 1 √ MEB1

2 X -

3 X -

C 1 √ MEC1

2 √ MEC2

3 √ MEC3

Keterangan:

ME : Marchantia emarginata

√ : Tumbuh

X : Tidak tumbuh

Isolat-isolat kapang endofit yang telah tumbuh tersebut kemudian

dilakukan pemurnian pada media PDA hingga diperoleh isolat murni. Isolat

kapang endofit diinokulasikan pada tabung reaksi dan cawan petri yang digunakan

sebagai stock culture dan working culture.

4.3 Karakterisasi Kapang Endofit

Karakterisasi isolat kapang endofit dilakukan secara makroskopik dan

mikroskopik. Karakterisasi secara makroskopik dilakukan berdasarkan kriteria:

warna dan permukaan koloni (granular, seperti tepung; menggulung; licin; ada

tidaknya tetes-tetes eksudat), ada tidaknya garis-garis radial dari pusat koloni ke

arah tepi koloni, dan ada tidaknya lingkaran-lingkaran konsentris (Gandjar, 1999;

Gandjar, 2006). Karakterisasi mikroskopik dilakukan dengan mengamati sekat

hifa (bersekat atau tidak bersekat), pertumbuhan hifa (bercabang atau tidak

bercabang), bentuk dan ornamentasi spora di bawah mikroskop (Ariyono, 2014).

Bagan kerja karakterisasi kapang endofit dapat diihat pada lampiran 4.

33

1. Isolat MEA1

Karakterisasi makroskopik meliputi, permukaan koloni berwana hitam

keabu-abuan dengan tepi berwarna putih, terdapat tetesan eksudat hitam, warna

sebalik hitam keabu-abuan dengan bintik hitam, tepi berwarna putih, terdapat

lingkaran-lingkaran konsentris, permukaan tepi tidak rata, dan berdiameter koloni

fungi 6,7 cm pada hari ke-7. Karakterisasi mikroskopik meliputi, memiliki septat

pada hifa, pertumbuhan hifa bercabang dan berhialin, terdapat konidia berbentuk

bulan sabit (makrokonidia) dan lonjong (mikrokonidia).

(a)

(b)

(c)

Keterangan :

a : mikrokonidia

b : septat

c : cabang hifa

d : makrokonidia

Gambar 4.2 Isolat MEA1 secara makroskopik dan mikroskopik

(a) Isolat MEA1 tampak depan

(b) Isolat MEA1 tampak sebalik

(c) Isolat MEA1 pada mikroskop cahaya perbesaran 400 kali

34

2. Isolat MEA2

Karakterisasi makroskopik meliputi, permukaan berwarna abu-abu dengan

bagian tengah berwarna hijau, warna sebalik hijau kehitaman dengan tepi putih,

tepi koloni rata, tekstur hifa seperti bulu, tebal, dan berdiameter 8,2 cm pada hari

ke-7. Karakteristik mikroskopik meliputi, hifa berseptat dan bercabang, hifa hilain

berwarna hijau, dan terdapat konidia berbentuk lonjong.

(a)

(b)

(c)

Keterangan :

a : konidia

b : septat

c : cabang hifa

Gambar 4.3 Isolat MEA2 secara makroskopik dan mikroskopik

(a) Isolat MEA2 tampak depan

(b) Isolat MEA2 tampak sebalik

(c) Isolat MEA2 pada mikroskop cahaya perbesaran 400 kali

35

3. Isolat MEB1

Karakterisasi makroskopik meliputi, koloni berwarna abu-abu, permukaan

menggunung, tepi tidak rata, warna sebalik hitam krem (tengah) dengan warna

hitam menjalar, dan berdiameter 9 cm pada hari ke-7. Karakterisasi mikroskopik

meliputi, hifa berseptat, pertumbuhan hifa bercabang, hifa hialin dan berwarna

hijau kehitaman, terdapat konidia berbentuk tidak beraturan.

(a)

(b)

(c)

Keterangan :

a : konidia

b : septat

c : cabang hifa

Gambar 4.4 Isolat MEB1 secara makroskopik dan mikroskopik

(a) Isolat MEB1 tampak depan

(b) Isolat MEB1 tampak sebalik

(c) Isolat MEB1 pada mikroskop cahaya perbesaran 400 kali

36

4. Isolat MEC1

Karakterisasi makroskopik meliputi, koloni berwarna kehitaman dengan

tepi berwarna putih, berbintik hitam, permukaan halus dan tipis, tepi tidak rata,

terdapat lingkaran-lingkaran konsentris, warna sebalik berwarna krem kehitaman.

Diameter koloni 6,3 cm pada hari ke-7. Karakterisasi mikroskopik meliputi, hifa

berseptat dan bercabang, hifa hialin hijau, dan terdapat konidia berbentuk bulan

sabit (makrokonidia) dan lonjong (mikrokonidia).

(a)

(b)

(c)

Keterangan :

a : mikrokonidia

b : septat

c : cabang hifa

d: makrokonidia

Gambar 4.5 Isolat MEC1 secara makroskopik dan mikroskopik

(a) Isolat MEC1 tampak depan

(b) Isolat MEC1 tampak sebalik

(c) Isolat MEC1 pada mikroskop cahaya perbesaran 400 kali

37

5. Isolat MEC2

Karakteristik makroskopik meliputi, koloni berwarna abu-abu dan hitam

kehijauan, permukaan rata dan tipis, terdapat tetes-tetes eksudat hitam, dengan

tepi berwarna putih, terdapat lingkaran-lingkaran konsentris, warna sebalik abu-

abu kehitaman, berbintik hitam, dan tepi tidak rata berwarna putih. Diameter

koloni 6 cm pada hari ke-7. Karakterisasi mikroskopik meliputi, hifa berseptat dan

bercabang, hifa hialin serta terdapat konidia berbentuk lonjong.

(a)

(b)

(c)

Keterangan :

a : konidia

b : septat

c : cabang hifa





38

6. Isolat MEC3

Karakterisasi makroskopik meliputi, koloni berwarna putih, tekstur hifa

seperti bulu, terdapat garis-garis radial, tepi rata, warna sebalik putih, dan

berdiameter 7,5 cm pada hari ke-7. Karakterisasi mikroskopik meliputi, hifa

berseptat dan bercabang, hifa hialin, dan terdapat konidia berbentuk bulat.

(a)

(b)

(c)

Keterangan :

a : konidia

b : septat

c : cabang hifa





Berdasarkan hasil karakterisasi isolat kapang endofit secara makroskopik

dan mikroskopik menunjukkan bahwa keenam isolat kapang endofit yang

39

didapatkan adalah berbeda. Perbedaan tersebut dapat dilihat dari segi

makroskopik dan mikroskopik isolat. Isolat MEA1 dan MEC1 terdapat kemiripan

secara mikroskopik, yaitu adanya makrokonidia berbentuk bulan sabit namun

berbeda secara makroskopiknya. Isolat MEA2 dan MEC2 mempunyai kemiripan

secara mikroskopik, namun berbeda secara makroskopiknya. Isolat yang

menunjukkan perbedaan paling mencolok adalah isolat MEB1 dan MEC3, dimana

isolat tersebut terlihat sangat berbeda baik secara makroskopik dan

mikroskopiknya dengan isolat-isolat kapang endofit lain yang didapatkan dalam

penelitian ini.

4.4 Skrining Aktivitas Antibakteri Kapang Endofit

Skrining aktivitas antibakteri pada kapang endofit digunakan untuk

menseleksi isolat kapang endofit yang berpotensi sebagai antibakteri dengan

melihat zona hambat yang terbentuk di sekitar isolat. Skrining aktivitas antibakteri

dilakukan dengan metode difusi agar padat (Diffusion Agar Plate Method).

Bakteri uji yang digunakan adalah S. aureus, B. subtilis dan P. aeruginosa.

Bakteri-bakteri tersebut merupakan perwakilan dari bakteri Gram positif dan

Gram negatif.

Tabel 4.2 Hasil Skrining Isolat Kapang Endofit terhadap Bakteri Uji

Diameter zona hambat (mm)

Isolat S. aureus B. subtilis P. aeruginosa

MEA1 - 8,3 7,6

MEA2 6,5 8,2 7,5

MEB1 - 8,6 7,5

MEC1 - - 6,5

MEC2 - - 6,5

MEC3 - - 6,7

Berdasarkan hasil skrining aktivitas antibakteri kapang endofit lumut hati

M. emarginata diperoleh 6 isolat kapang endofit yang aktif sebagai antibakteri

yang ditandai dengan terbentuknya zona hambat di sekitar isolat. Isolat MEA1

dan MEB1 menghasilkan zona hambat terhadap bakteri B. subtilis dan P.

aeruginosa. Isolat MEA2 menghasilkan zona hambat terhadap ketiga bakteri uji

40

yaitu S. aureus, B. subtilis, dan P. aeruginosa. Isolat MEC1, MEC2, dan MEC3

menghasilkan zona hambat pada bakteri P. aeruginosa.

Kapang endofit yang berpotensi sebagai antibakteri kemudian dilanjutkan

pada tahap selanjutnya yaitu fermentasi dan ekstraksi. Hasil ekstraksi dari kapang

endofit tersebut akan diuji aktivitas antibakterinya terhadap beberapa bakteri uji.

Bagan kerja skrining aktivitas antibakteri kapang endofit dapat dilihat pada

lampiran 5.

4.5 Fermentasi dan Ekstraksi Kapang Endofit

Fermentasi kapang endofit dilakukan menggunakan media Potato

Dextrose Yeast (PDY) terhadap 6 isolat kapang endofit yang aktif antibakteri.

Media fermentasi yang baik harus menyediakan semua nutrisi yang dibutuhkan

oleh kapang untuk memperoleh energi, pertumbuhan, dan bahan pembentuk sel.

Media PDY merupakan media yang baik untuk fermentasi kapang endofit, karena

di dalamnya mengandung karbon yang berasal dari ekstrak kentang dan dekstrosa,

dan ekstrak yeast sebagai sumber nitrogen. Didapatkan media fermentasi PDY

dengan pH 6 dimana pada pH tersebut merupakan pH optimum untuk

pertumbuhan kapang endofit dalam memproduksi metabolit sekunder (Sarles,

dkk., 1956 dalam Ahmad, dkk., 2013).

Fermentasi kapang endofit dilakukan dengan metode goyang (shacking)

selama 14 hari dengan kecepatan 130 rpm pada suhu 28° C (Kumala, dkk., 2015).

Fermentasi metode goyang (shacking) digunakan pada penelitian ini karena

metode tersebut dipengaruhi oleh aerasi dan pengadukan (agitasi). Aerasi sangat

berkaitan dengan ketersediaan oksigen bagi kapang endofit. Ketersediaan oksigen

termasuk ke dalam salah satu faktor yang mempengaruhi pertumbuhan kapang

endofit. Adanya penggoyangan media dimana molekul H2O mengalami

pengocokan akan berpengaruh pada peningkatan oksigen di udara sehingga kadar

oksigen dapat meningkat (Stainer, 1982 dalam Ahmad, dkk., 2013). Pengadukan

(agitasi) bertujuan meningkatkan pertukaran panas sehingga distribusi suhu

menjadi homogen di seluruh bagian substrat (Kumala, 2014). Hasil fermentasi

kapang endofit dapat dilihat pada lampiran 14.

41

Proses ekstraksi dilakukan untuk menarik senyawa-senyawa metabolit

sekunder kapang endofit yang telah difermentasi. Hasil fermentasi berupa

biomassa yang mengandung metabolit intraseluler dan supernatan yang

mengandung metabolit ekstraseluler (Gandjar, 2006). Biomassa dan supernatan

dipisahkan dengan cara disaring dengan menggunakan kertas saring dan corong

buchner (Guo, 2008). Bagian biomassa berupa massa padat diekstraksi

menggunakan pelarut metanol dengan metode maserasi. Bagian supernatan

berupa cairan diekstraksi dengan metode partisi cair-cair menggunakan pelarut n-

heksan dan etil asetat. Hasil ekstraksi dipekatkan menggunakan rotary evaporator

vaccum sampai diperoleh ekstrak kental. Bagan kerja fermentasi dan ekstraksi

kapang endofit dapat dilihat pada lampiran 7.

Tabel 4.3 Perolehan Bobot Ekstrak Hasil Fermentasi Kapang Endofit

Kode Isolat Bobot Ekstrak Fermentasi (mg)

metanol etil asetat n-heksan

MEA1 274,3 27 267,9

MEA2 82,2 23,3 67,3

MEB1 394,3 57,7 10

MEC1 566 126,9 52,6

MEC2 524,1 116,8 9,2

MEC3 188,1 12,8 5,9

4.6 Karakterisasi Bakteri Uji

Karakterisasi bakteri dilakukan untuk mengetahui kemurnian dan

morfologi bakteri uji. Karakterisasi bakteri uji dilakukan dengan pewarnaan

Gram. Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang paling

berguna karena bakteri dapat terklasifikasi menjadi dua kelompok besar, yaitu

bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif (Tortora, 2010).

Teknik pewarnaan Gram dilakukan dengan mengambil satu ose bakteri uji

dan diletakkan di atas objek gelas yang sudah ditetesi larutan NaCl 0,9% lalu

dilewatkan di atas api bunsen (fiksasi). Proses fiksasi berfungsi untuk mematikan

dan menempelkan bakteri pada objek gelas sedangkan NaCl 0,9% berfungsi untuk

mempertahankan tonisitas sel bakteri agar tidak lisis. Preparat ditetesi larutan

kristal violet, lugol, alkohol 96%, dan safranin. Kristal violet berfungsi sebagai

pewarna primer sehingga membentuk warna ungu. Mordant berfungsi untuk

42

meningkatkan afinitas pewarnaan pada spesimen biologi sehingga membuat

warna lebih tajam dan lebih mudah untuk diidentifikasi. Alkohol 96% sebagai

decolorization agent (bahan pemucat/peluntur warna) yang pada spesies bakteri

tertentu dapat menghilangkan warna ungu dari sel (Tortora, 2010). Larutan

safranin berfungsi sebagai pewarna tandingan.

Tabel 4.4 Hasil Karakterisasi Bakteri Uji dengan Pewarnaan Gram

Bakteri Morfologi Gambar

S. aureus

- Bentuk bulat

bergerombol seperti

anggur.

- Berwarna ungu

- Bakteri Gram positif.

B. subtilis

- Bentuk batang

- Berwarna ungu

- Bakteri Gram positif.

P. aeruginosa - Bentuk batang,

- Berwarna merah

- Bakteri Gram negatif.

Bakteri Gram positif akan berwarna ungu tua setelah pewarnaan Gram

karena mempertahankan zat warna dari kristal violet. Bakteri Gram negatif terjadi

kehilangan warna kristal violet ketika dicuci dengan alkohol 96% sehingga akan

berwarna merah setelah diberi pewarna tandingan dengan safranin (Pelczar &

Chan, 2008). Perbedaan warna antara bakteri Gram positif dan Gram negatif

disebabkan oleh adanya perbedaan komposisi dan struktur dari dinding selnya.

Bakteri Gram negatif mengandung lipid, lemak atau substansi seperti lemak

43

dalam persentase yang lebih tinggi dibandingkan dengan Gram positif. Dinding

sel bakteri Gram negatif juga lebih tipis dan ketika penambahan alkohol akan

menyebabkan terekstrasinya lipid sehingga memperbesar daya permeabilitas

dinding sel Gram negatif. Kompleks kristal violet-lugol pada dinding sel Gram

negatif dapat terekstraksi dan terjadi kehilangan warna dari pewarna tersebut

(Pelczar & Chan, 2006).

Berbeda dengan bakteri Gram positif yang mempunyai kandungan lipid

yang lebih rendah daripada Gram negatif. Dinding sel Gram positif akan

terdehidrasi selama perlakuan dengan alkohol dan ukuran pori-pori akan mengecil

sehingga permeabilitas berkurang dan kompleks kristal violet-lugol tidak dapat

terekstraksi (Pelczar & Chan, 2006). S. aureus dan B. subtilis dapat

mempertahankan warna ungu dan merupakan bakteri Gram positif, sedangkan P.

aeruginosa kehilangan warna ungu dan berwarna merah setelah diteteskan

safranin sehingga disebut bakteri Gram negatif.

4.7 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit

Tiga fraksi ekstrak dari 6 isolat kapang endofit diujikan aktivitas

antibakterinya secara kualitatif dengan metode difusi cakram (Kirby-Bauer)

terhadap bakteri S. aureus, B. subtilis, dan P. aeruginosa. Tiga fraksi ekstrak

tersebut yaitu fraksi ekstrak metanol, etil asetat, dan n-heksan.

Pengujian dilakukan pada konsentrasi 200 µg/mL ekstrak dari kapang

endofit yang diserapkan ke dalam kertas cakram steril dan didiamkan hingga

mengering. Pengeringan bertujuan agar senyawa metabolit sekunder terserap

secara merata dan pelarut ekstrak yang digunakan dapat menguap. Data

dinyatakan tidak valid apabila kertas cakram kurang kering saat diletakkan di atas

bakteri uji. Hal tersebut dikhawatirkan zona hambat yang terbentuk bukan berasal

dari ekstrak melainkan dari pelarut ekstrak yang bersifat toksik. Dilakukan

pengujian pada kontrol negatif dimana cakram hanya berisi pelarut ekstrak.

Tujuannya adalah untuk mengetahui apakah pelarut tersebut sudah menguap

secara sempurna atau tidak. Kontrol positif yang digunakan yaitu cakram

antibiotik kloramfenikol. Dilakukan pengukuran zona hambat di sekitar cakram

menggunakan jangka sorong (Zakiyah, dkk., 2015).

44

Tabel 4.5 Hasil Uji Aktivitas Ekstrak Kapang Endofit

Isolat Rata-rata diameter zona hambat (mm)

Ekstrak uji S. aureus B. subtilis P. aeruginosa

MEA1 Metanol - - -

Etil asetat - - -

n-heksan - - -

MEA2 Metanol - - -

Etil asetat - - -

n-heksan - - -

MEB1 Metanol X - -

Etil asetat - 8,2 8,5

n-heksan - - -

MEC1 Metanol - - -

Etil asetat - - -

n-heksan - - -

MEC2 Metanol X - -

Etil asetat - - -

n-heksan - - -

MEC3 Metanol X - -

Etil asetat - - 8,2

n-heksan - - -

Kloramfenikol 26 25,1 16,4

Kontrol (-) - - -

Keterangan :

- : tidak ada aktivitas antibakteri

X : tidak diujikan aktivitas antibakteri

Berdasarkan hasil uji aktivitas antibakteri fraksi ekstrak kapang endofit M.

emarginata diperoleh 2 isolat kapang endofit pada fraksi ekstrak etil asetat yang

menghasilkan zona hambat. Isolat MEC3 menghasilkan zona hambat sebesar 8,2

mm terhadap P. aeruginosa. Isolat MEB1 menghasilkan zona hambat sebesar 8,2

mm terhadap bakteri B. subtilis dan 8,5 mm terhadap bakteri P. aeruginosa. Bobot

yang diperoleh dari fraksi ekstrak etil asetat pada isolat MEB1 mencukupi untuk

dilanjutkan untuk menentukan KHM nya.

Berdasarkan hasil skrining dan uji aktivitas antibakteri terdapat 4 isolat

kapang endofit, yaitu isolat MEA1, MEA2, MEC1, dan MEC2 yang tidak

menunjukkan zona hambat pada uji aktivitas antibakteri, sementara pada hasil

skrining terdapat zona hambat. Adanya perbedaan hasil tersebut dapat disebabkan

45

karena rendahnya kadar senyawa metabolit sekunder yang dapat ditarik oleh

pelarut yang digunakan. Fraksi ekstrak metanol pada isolat MEB1, MEC2, dan

MEC3 tidak dilakukan uji aktivitas antibakteri pada penelitian ini, dikarenakan

ekstrak yang terbentuk masih berupa cairan kental sehingga sulit untuk ditentukan

konsentrasi ekstrak saat pengujian aktivitas antibakteri.

4.8 Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)

Penentuan KHM dilakukan pada fraksi ekstrak etil asetat isolat MEB1

terhadap bakteri B. subtilis dan P. aeruginosa. Penentuan KHM menggunakan

metode mikrodilusi cair dikarenakan metode ini membutuhkan sampel dan reagen

yang sedikit, sensitivitas tinggi, dan memberikan hasil kuantitatif yang

menunjukkan jumlah zat antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan

mikroba uji (Balouiri, dkk., 2016 dan Jawetz, dkk., 2013). Metode mikrodilusi

cair menggunakan alat microplate 96-well yang mempunyai 96 sumur pelat mikro

(8 baris dan 12 kolom).

Mueller-Hinton Broth (MHB) merupakan media yang direkomendasikan

oleh National Comittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) untuk

menentukan KHM dengan metode mikrodilusi cair. Media MHB mengandung

kation divalen (Ca++

dan Mg++

) yang baik untuk pertumbuhan bakteri uji.

Dilakukan uji sensitivitas antibiotik pembanding untuk mengetahui antibiotik

yang paling sensitif terhadap bakteri uji yaitu B. Subtilis dan P. aeruginosa.

Antibiotik yang diuji adalah siprofloksasin dan kloramfenikol yang

berbentuk serbuk tanpa adanya eksipien. Hasil uji sensitivitas antibiotik

siprofloksasin terhadap B. subtilis menghasilkan zona hambat sebesar 36,6 mm

sedangkan untuk antibiotik kloramfenikol zona hambat yang dihasilkan adalah

23,8 mm. Antibiotik siprofloksasin menghasilkan zona hambat terhadap bakteri P.

aeruginosa sebesar 33,6 mm dan pada antibiotik kloramfenikol zona hambat yang

dihasilkan adalah 23 mm.

Antibiotik Siprofloksasin digunakan sebagai antibiotik pembanding pada

uji mikrodilusi cair dikarenakan KHM yang rendah (WHO, 2003) dan lebih

sensitif terhadap bakteri uji yang digunakan dibandingkan dengan kloramfenikol.

KHM siprofloksasin terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 yaitu 0,25-1 µg/mL,

46

sedangkan KHM kloramfenikol pada bakteri tersebut yaitu >64 µg/mL (WHO,

2003). KHM kloramfenikol terhadap bakteri B. subtilis adalah 50±4,55 µg/mL

(Saha, dkk., 2014).

(a)

(b)

Gambar 4.8 Hasil Uji Sensitivitas Antibiotik Pembanding. (a) B. subtilis

(b) P. aeruginosa

Dibuat suspensi bakteri uji ke dalam larutan NaCl 0,9%. Larutan NaCl

0,9% berfungsi sebagai larutan isotonis untuk menjaga tonisitas pada sel bakteri

agar tidak lisis. Suspensi bakteri diukur absorbansinya dengan alat

spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 625 nm. Nilai absorbansi

0,08-0,12 setara dengan 0,5 McFarland (1-2x 108 CFU/mL) sebagai standar.

Suspensi bakteri yang telah menunjukkan nilai absorbansi 0,08-0,12 diencerkan

hingga diperoleh konsentrasi 106 CFU/mL (Balouri, dkk., 2016). Nilai absorbansi

yang dihasilkan pada suspensi B. subtilis dan P. aeruginosa sebesar 0,112 dan

0,0845. Pengukuran jumlah koloni bakteri dengan menggunakan spektrofotometer

UV-Vis memiliki kelebihan yaitu cepat dan mudah. Sejumlah cahaya akan diserap

oleh koloni bakteri dalam suatu medium cair dimana hasil yang diperoleh berupa

absorbansi yang berbanding lurus dengan jumlah koloni dalam medium tersebut.

Nilai absorbansi yang tinggi menandakan bahwa konsentrasi bakteri dalam

medium tersebut juga tinggi. Nilai panjang gelombang menjadi salah satu faktor

yang mempengaruhi dalam pengukuran jumlah koloni bakteri dengan

menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Sinar UV pada panjang gelombang

47

tertentu dapat digunakan sebagai desinfektan untuk beberapa alat di laboratorium

(Kim, S., dkk, 2013). Diketahui bahwa pada panjang gelombang 405 dan 470 nm

dapat memberikan efek bakterisidal terhadap bakteri S. aureus, P. aeruginosa dan

Propionibacterium acnes (Guffey, J.S, dkk., 2006 dalam Kim, S., dkk., 2013).

Panjang gelombang 625 nm diketahui tidak memberikan efek bakterisidal

sehingga cocok untuk digunakan dalam pengukuran jumlah koloni bakteri dalam

suatu medium cair (Kim, S., dkk., 2013).

Penentuan KHM dengan metode mikrodilusi cair terdiri dari ekstrak uji,

kontrol sterilitas, kontrol negatif, dan kontrol pertumbuhan. Tujuan dari kontrol

sterilitas yaitu untuk menjamin bahwa media dan pelat mikro dalam keadaan steril

tanpa adanya kontaminasi. Kontrol negatif berfungsi untuk mengetahui bahwa

pelarut ekstrak yang digunakan tidak memiliki efek antimikroba. Kontrol

pertumbuhan digunakan untuk mengetahui bahwa bakteri uji dapat tumbuh pada

kondisi dan perlakuan uji. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan ekstrak uji

dan antibiotik siprofloksasin adalah Dimetil Sulfoksida (DMSO) 10% (Valgas,

dkk., 2007). Dimetil sulfoksida berupa cairan tak berwarna yang merupakan

senyawa sulfur organik dengan formula (CH3)2SO yang dapat melarutkan

senyawa polar dan non polar (Hassan. S., 2014).

Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) merupakan konsentrasi terkecil

dari suatu senyawa antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba

uji. Pengamatan untuk menentukan KHM dapat dilakukan secara visual dengan

menambahkan reagen p-iodonitrotetrazolium (INT) (Balouiri, dkk., 2016;

Klancnik, dkk., 2010; dan Wesseler, 2005). KHM ditetapkan pada sumur dengan

konsentrasi terendah yang tidak memberikan warna ungu setelah ditambahkan

INT. Adanya perubahan warna dari kuning menjadi ungu mengindikasikan bahwa

di dalam sumur tersebut masih terdapat bakteri. p-iodonitrotetrazolium (INT)

merupakan senyawa yang dapat tereduksi oleh adanya enzim dehidrogenase pada

bakteri menjadi formazan yang dapat memberikan warna ungu (Wesseler, 2005).

Tabel 4.6 Hasil KHM Fraksi Ekstrak Etil Asetat Isolat MEB1

Bakteri Uji Nilai KHM

Ekstrak uji Siprofloksasin

B. subtilis ATCC 6633 200 µg/mL 0,125 µg/mL

P. aeruginosa ATCC 27853 200 µg/mL 0,25 µg/mL

48

Dari hasil pengujian dengan metode mikrodilusi cair fraksi ekstrak etil

asetat isolat MEB1 mempunyai efek menghambat pertumbuhan bakteri B. subtilis

dan P. aeruginosa dengan KHM sebesar 200 µg/mL. KHM tersebut menunjukkan

aktvitas antibakteri dari fraksi etil asetat isolat MEB1 cukup kuat dikarenakan

berada pada rentang 100-500 µg/mL. Menurut Holezt F.B., dkk (2002) aktivitas

antibakteri dibedakan menjadi 4 yaitu, aktivitas antibakteri sangat kuat jika KHM

kurang dari 100 μg/ml, aktivitas antibakteri cukup kuat jika KHM 100-500 μg/ml,

aktivitas antibakteri yang lemah jika KHM 500-1000 μg/ml, dan tidak memiliki

aktivitas antibakteri jika KHM lebih dari 1000 μg/ml. Pengujian KHM pada

antibiotik pembanding yang digunakan yaitu siprofloksasin memiliki efek

hambatan yang lebih tinggi terhadap bakteri B. subtilis daripada bakteri P.

aeruginosa. Nilai KHM antibiotik siprofloksasin terhadap bakteri Bacillus subtilis

sebesar 0,125 µg/mL, sedangkan nilai KHM terhadap bakteri Pseudomonas

aeruginosa sebesar 0,25 µg/mL.


BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan sebagai berikut :

1. Diperoleh 6 isolat kapang endofit dari lumut hati M. emarginata Reinw.,

Blume & Nees yang aktif sebagai antibakteri pada uji skrining aktivitas

antibakteri terhadap S. aureus, B. subtilis dan P. aeruginosa.

2. Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak kapang endofit menujukkan bahwa

pada fraksi ekstrak etil asetat isolat MEC3 dapat menghambat bakteri P.

aeruginosa dan isolat MEB1 dapat menghambat bakteri B. subtilis dan P.

aeruginosa.

3. KHM dari fraksi ekstrak etil asetat isolat MEB1 sebesar 200 µg/mL

terhadap bakteri B. subtilis dan P. aeruginosa.

5.2 Saran

1. Melakukan penelitian lebih lanjut tentang identififikasi isolat kapang

endofit yang diperoleh.

2. Melakukan penelitian lebih lanjut tentang isolasi senyawa aktif antibakteri

pada isolat kapang endofit.

3. Melakukan pengujian aktivitas antibakteri pada bakteri lainnya selain

bakteri yang diujikan dalam penelitian ini.

50

DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, dkk.. 2013. “Pengaruh pH, Penggoyangan Media, dan Penambahan

Serbuk Gergaji terhadap Pertumbuhan Jamur Xylaria sp.”. Jurnal Silvikultur

Tropika 4(2): 57-61. ISSN 2086-8227.

Ariyono, dkk.. 2014. “Keanekaragaman Jamur Endofit Daun Kangkung Darat

(Ipomoea reptans Poir) pada Lahan Pertanian Organik dan Konvensional”.

Jurnal HPT 2 (1): 19-28. ISSN 2338-4336.

Arthur, G. 2010. Mircrobiology and Immunology. Bacteriology; Medical

Microbiology. University of South Carolina School Medicine.

Asakawa, Y.. 2008. “Liverworts-Potential Source of Medicinal Compound”.

Current Pharmaceutical Design 14(29): 3067-3088.

Asakawa, Y., dkk.. 2009. “Bryophytes: Bio- and Chemical Diversity, Bioactivity

and Chemosystematics”. Heterocycles 77 (1): 99 – 150.

Asakawa, Y., Ludwiczuk, A., dan Nagashima, F.. 2013. “Chemical Constituents

of Bryophytes”. New York: Springer-Verlag Wien.

Balouiri. M., 2016. “Methods for in Vitro Evaluating Antimicrobial Activity: A

Review”. Elsevier. Journal of Pharmaceutical Analysis (6): 71–79.

Carter GR, Wise DJ. 2004. Veterinary Bacteriology and Micology. USA: Lowa

State Press. Lowa.

Coyle, Marie B.. 2005. Manual of Antimicrobial Susceptibility Testing.

Wachington DC: American Society for Microbiology.

Dewi, Amalia Khrisna. 2013. “Isolasi, Identifikasi dan Uji Sensitivitas

Staphylococcus aureus terhadap Amoxicillin dari Sampel Susu Kambing

Peranakan Ettawa (PE) Penderita Mastitis Di Wilayah Girimulyo,

Kulonprogo, Yogyakarta”. Jurnal Sains Veteriner 31(2): 138-150. ISSN 0126

– 0421.

Ding, T. dkk., 2010. “Evaluation of Antimicrobial Activity of Endophytic Fungi

from Camptotheca acuminata (nyssaceae)”. Genetics and Molecular

Research 9(4): 2104–2112.

DiPiro. J.T.. 2009. Pharmacoteraphy Handbook 7th

edition. Mc. Graw Hill. New

51

York.

Freeman-Cook, Lisa., Freeman-Cook, Kevin. 2005. Deadly Diseases and

Epidemics Staphylococcus aureus Infection. Amerika: Chelsea House

Publishers.

Gandjar. 1999. Pengenalan Kapang Tropik Umum. Jakarta: Yayasan Obor

Indonesia.

Gandjar, I., dan Sjamsuridzal, W.. 2006. Mikologi: Dasar dan Terapan. Jakarta:

Yayasan Obor Indonesia.

Gibson, JM.. 1996. Mikrobiologi dan Patologi Modern untuk Perawat. Jakarta:

EGC.

Goffinet, B., dan Shaw, A. J.. 2009. Bryophyte Biology, 2nd

ed.. New York:

Cambridge University Press.

Harris, L.G., Foster, S.J. & Richards, R.G.. 2002. “An Introduction to

Staphylococcus aureus, and Techniques for Identifying and Quantifying S.

aureus Adhesisn in Relation to Adhesion to Biomaterials: Review”. European

Cells and Materials 4: 39–60. ISSN 1473-2262. doi 10.22203/eCM.v004a04.

Hassan, S.. 2014. “The Antibacterial Activity of Dimethyl Sulfoxide (DMSO) with

and without of some Ligand Complexes of the Transitional Metal Ions of

Ethyl Coumarin against Bacteria Isolate from Burn and Wound Infection”.

Journal of Natural Sciences Research 4(19): 106-111. ISSN 2225-0921.

Holetz, F.B., dkk.. 2002. “Screening of some Plants Used in Brazilian Folk

Medicine or the Treatment of Infections Disease”. Mem Inst Oswaldo Cruz,

Rio de Janeiro 97 (7): 1027 1031.

Huang, W.J. dkk.. 2010. “Marchantin A, a Cyclic Bis (Bibenzyl Ether), Isolated

from the Liverwort Marchantia emarginata Subsp. Tosana Induces Apoptosis

in Human MCF-7 Breast Cancer Cells”. Cancer Letters 291(1): 108–119.

Hulikere dkk.. 2016. “Antiangiogenic, Wound Healing and Antioxidant Activity of

Cladosporium cladosporioides (Endophytic Fungus) Isolated from Seaweed

(Sargassum wightii)”. Mycology 7(4): 2013-211. ISSN 2150-1203.

Husniyah, Wida. 2016. “Fraksinasi dan Uji aktivitas Antibakteri Isolat Kapang

Endofit dari Daun Tanaman Iler (Coleus artropurpureus Benth.) terhadap

Bakteri Stahpylococccus aureus dan Pseudomonas aeruginosa”. Skripsi.

52

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. Jakarta : UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta

Ilyas, M.. 2006. “Isolasi dan Identifikasi Kapang pada Relung Rizosfir Tanaman

di Kawasan Cagar Alam Gunung Mutis, Nusa Tenggara Timur”.

Biodiversitas 7(83): 216–220.

Islam S.M., dkk.. 2012. “Validation and Application of a Simple HPLC Method

for the Comparative in Vitro Dissolution Study of Some Multisource

Ciprofloxacin Tablets”. IJPI’s Journal of Analitical Chemistry 2(8): 1-12.

ISSN 2229 – 6867.

Jauhari, Lendra Tantowi. 2010. “Seleksi dan Identifikasi Kapang Endofit

Penghasil Antimikroba Penghambat Mikroba Patogen”. skripsi. Fakultas

Sains dan Teknologi. Jakarta: UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Jawetz, dkk.. 2013. Medical Microbiology 26th ed. USA: The McGraw-Hill

Companies, Inc.

Kalyanaraman, Rajagopal. 2012. “Diversity of endophytic fungi in some tropical

medicinal plants – A report”. African Journal of Microbiology Research

6(12): 2822–2827.

Karteek, dkk.. 2012. “Evaluation of Antibacterial Activity of Herbs”.

International Research Journal of Pharmacy 3(8): 230-232. ISSN 2230-

8407.

Kim S., dkk.. 2013. “In Vitro Bactericidal Effects of 625, 525, and 425 nm

Wavelength (Red, Green, and Blue) Light-Emitting Diode Irradiation”.

Photomedicine and Laser surgery 31(11): 554-562.

Klancnik, dkk.. 2010. “Evaluation of Diffusion and Dilution Methods to

Determine the Antibacterial Activity of Plant Extracts” Journal of

Microbiology Methods (81): 121-126. doi : 10.1016/j.mimet.2010.02.004.

Komala, I., dkk.. 2010. “Cytotoxic, Radical Scavenging and Antimicobial

Activities of Sesquitepenoids from the Tahitian Liverwort Mastigophora

diclados (Brid.) Nees (Marstigophoraceae)”. J Nat Med 64:417-422. doi:

10.1007/s11418-010-0423-8.

Kumala, S., dkk.. 2007. “Cytotoxic Secondary Metabolites from Fermentation

Broth of Brucea javanica Endophytic Fungus 1.2.11”. Research Journal

53

Microbiology 2 (8): 625-631. ISSN 1816-4935.

Kumala, S.. 2008. “Penapisan Kapang Endofit Ranting Kayu Meranti Merah

(Shorea Balangeran Korth.) sebagai Penghasil Enzim Xilanase”. Jurnal Ilmu

Kefarmasian Indonesia 6(1) : 1-6. ISSN 1693-1831.

Kumala, S.. 2014. Mikroba Endofit: Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang

Farmasi. Jakarta: ISFI.

Kumala, S. & Pratiwi, A.A.. 2014. “Efek Antimikroba dari Kapang Endofit

Ranting Tanaman Biduri”. Jurnal Farmasi Indonesia 7(2): 111-120.

Kumala, S., dkk. 2015. “Antimicrobial Activity of Secondary Metabolites

Produced by Endophytic Fungi Isolated from Stems of Jati Tree (Tectona

grandis L.F)”. International Journal of Pharmaceutical Science and

Research 6(6): 2349-2353. doi: 10.13040/Ijpsr.0975-8232.6(6).2349-53.

Kumar, Surinder. 2012. Texbook of Microbiology. New Delhi: Jaype Brothers

Medical Publishers (P) Ltd.

Li, H. dkk.. 2005. “Screening for Endophytic Fungi with Antitumor and

Antifungal Activities from Chinese Medicinal Plants”. World Journal of

Microbiology and Biotechnology 21(8–9): 1515–1519.

Ludwiczuk, A., dkk.. 2008. “Volatile Components from Selected Mexican,

Ecuadorian, Greek, German, and Japanese Liverworts”. Natural Product

Communication 3(2): 133- 140.

Ludwiczuk, A., dkk.. 2009. “Volatile Components from Selected Tahitian

liverworts”. Natural Product Communication 0(0) : 1-3.

Mewari. 2008. “Antimicrobial Activity of Extract of Marchantia polymorpha”.

Pharmaceutical Biology 46 (10-11): 819-822.

Pelczar, Michael, J. dan ECS Chan. 2008. Dasar-dasar Mikrobiologi Jilid I.

Jakarta: UI Press.

Mundir, M.I., dkk.. 2013. “Inventarisasi Lumut Terestrial di Kawasan Wisata Air

Terjun Irenggolo”. Prosiding Seminar Nasional X Pendidikan Biologi FKIP

UNS, pp.1–4.

Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: EGC.

Pratiwi, Brasti Eka. 2015. “Isolasi dan Skrining Fitokimia Bakteri Endofit dari

Daun Rambutan (Nephelium lappaceum L.) yang Berpotensi sebagai

54

Antibakteri”. Skripsi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. Jakarta :

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Petrini, O.. dkk., 1992. “Ecology, Metabolite Production, and Substrate

Utilization in Endophytic Fungi”. Natural toxins 1(3): 185–196.

Radji, M.. 2005. “Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam

Pengembangan Obat Herbal”. Majalah Ilmu Kefarmasian 2(3): 113–126.

ISSN 1693-9883.

Rustanti, Mirna. 2007. “Isolasi dan Seleksi Kapang Endofit Penghasil

Antimikroba pada Akar Tanaman Sesoot (Garcinia picrorrhiza Miq.)”.

Skripsi. Sarjana Farmasi. Depok: FMIPA Universitas Indonesia

Sabovljevi , M,. dkk.. 2014. “All Aspects of Plant Biology Bryophyte

Conservation Biology : In Vitro Approach to the ex Situ Conservation of

Bryophytes from Europe”. Plant Biosystems 148 (4): 857–68. doi:

10.1080/11263504.2014.949328.

Saha, dkk.. 2014. “Screening Antimicrobial Susceptibility of Gentamicin,

Vancomycin, Azithromycin, Chloramphenicol and Cefotaxime Against

Selected Gram Positive and Gram Negative Bacteria”. International Journal

of Pharma Research and Health Sciences 2(4): 324-331.

Santos, dkk.. 2015. “Antibacterial Activity of Endophytic Fungi from Leaves of

Indigofera suffruticosa Miller (Fabaceae)”. Frontier of Microbiology.

5(350): 1-7. doi: 10.3389/fmicb.2015.00350.

Sardiani, dkk.. 2015. “Potensi Tunikata Rhopalaea sp. sebagai Sumber Inokulum

Bakteri Endosimbion Penghasil Antibakteri”. Jurnal Alam dan Lingkungan.

6(11). Makassar: Universitas Hasanuddin.

Selim, K. dkk.. 2012. “Biology of Endophytic Fungi”. Current Research in

Environmental and Applied Mycology 2(1): 31–82.

Setiabudy, R. 2007. Farmakologi dan Terapi Edisi 5. Departemen Farmakologi

dan Terapeutik. Jakarta: Balai Penerbit FKUI.

Sharman O.P. 2014. Series on Diversity of Microbes and Cryptogams Bryophyta.

New Delhi: McGraw Hill Education.

Simpson, Michael G. 2006. Plant Systematics. London: Elsevier Academic Press.

Singelton P, dan Diana S. 1981. Introduction to Bacteria: For Student in the

55

Biological Science. New York.

Siregar, E., dkk. 2013. “The Liverwort Genus Marchantia (Marchantiaceae) of

Mount Sibayak North Sumatra, Indonesia”. Biotropia 20(2): 73-80. doi:

10.11598/btb.2013.20.2.3.

Siregar, Etti Sartina. 2015. “The Liverworts (Marchantiophyta) of mount Sibayak

North Sumatra”. Tesis. Bogor : Institut Pertanian Bogor.

Strateva, T. & Yordanov, D.. 2009. “Pseudomonas aeruginosa - A Phenomenon

of Bacterial Resistance”. Journal of Medical Microbiology 58(9): 1133-

1148.

Strobel, G. dkk.. 2004. “Natural Products from Endophytic Microorganisms”.

Journal of Natural Products 67(2): 257–268.

Sukandar, E. Y., dkk.. 2008. ISO Farmakoterapi. Jakarta: Ikatan Sarjana Farmasi

Indonesia.

Sulistyowati. 2014. “Keanekaragaman Marchantiophyta Epifit Zona Montana di

Kawasan Gunung Ungaran, Jawa Tengah”. Bioma 16(1): 26-33. ISSN 1410-

8801

Sweetman, Sean. C.. 2009. Martindale: The Complete Drug Reference Thirty

Sixth Edition. London: Pharmaceutical Press.

Syarmalina, dkk.. 2007. “Uji Sitotoksik Hasil Fermentasi Kapang Endofit Buah

Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa) terhadap Sel MCF-7”. Jurnal Ilmu

Kefarmasian Indonesia 5(1): 23-30. ISSN 1693-1831.

Tan, R.X. & Zou, W.X.. 2001. “Endophytes: a Rich Source of Functional

Metabolites”. Natural Product Reports 18(March): 448–459.

Tortora G.J., Funke B.R., Case C.L.. 2010. Microbiology, an Introduction. 10th

edition. USA: Addison Wesley Longman Inc.

Valgas, C., dkk.. 200. “Screening Methods to Determine Antibacterial Activity of

Natural Products”. Brazilian Journal of Microbiology 38: 369-380. ISSN 1517-

8382.

Vineetha, N., dkk.. 2015. “Preparation, Standardization of Antibiotic Discs and

Study of Resistance Pattern for First-Line Antibiotics in Isolates from

Clinical Samples”. International Journal of Applied Research 1(11): 624-

631. ISSN Print: 2394-7500.

56

WHO. 2003. Global Salm-Surv : A global Salmonella surveillance and laboratory

support project of the World Health Organization 4th

edition.

Wesseler A., dkk.. 2015. “A Novel colorimetric Broth Microdilution Method to

Determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of Antibiotics and

Essential Oils Against Helicobacter pylori”. Pharmazie 60: 498-504.

Windadri, F.I., 2007. “Lumut (Musci) di Kawasan Cagar Alam Kakenauwe dan

Suaka”. 8: 197–203.

Windadri, F.I., 2013. “Keaneragaman Jenis Lumut di Kepulauan Raja Ampat,

Papua Barat”. 16: 75-84.

Zakiyah, alfida, dkk.. 2015. “Aktivitas Antibakteri Kapang Endofit dari Tanaman

Kina (Cinchona calisaya Wedd.)”. Al-kauniyah Jurnal Biologi 8(2): 51-58.

Zhang, Tao, dkk.. 2013. “Diversity and Cold Adaptation of Culturable Endophytic

Fungi”. FEMS Microbiology Lett 341: 52–61. doi:10.1111/1574-

6968.12090.

57

LAMPIRAN

Lampiran 1. Determinasi Tanaman

58

Lampiran 2. Alur Penelitian

Sampling Tanaman Lumut Hati

Marchantia Emarginata Reinw, Blume &

Nees

Sterilisasi Permukaan

Isolasi Kapang Endofit

Pemurnian Kapang Endofit

Karakterisasi Kapang Endofit

Skrining Aktivitas Antibakteri

Kapang Endofit

Fermentasi dan Ekstraksi

Kapang Endofit

Peremajaan

Bakteri Uji

Identifikasi

Bakteri Uji

Pembuatan

Suspensi Bakteri

Uji

Uji Aktivitas

Antibakteri

Uji Aktivitas Antibakteri

Determinasi

Penentuan

Konsentrasi Hambat

Minimum (KHM)

Uji

Sensitivitas

Antibiotik

59

Lampiran 3. Bagan Kerja Isolasi Kapang Endofit

Air mengalir

selama 30’

Etanol 70%

(1 menit)

NaOCl 5,25%

(2 menit)

Etanol 70%

(30 detik)

Aquades steril (1 menit) Dikeringkan di atas kertas saring

steril, dipotong dan diletakkan di

atas media PDA.

Aquades bilasan terakhir sebagai

kontrol. Dicelupkan batang L lalu

diratakan di atas media PDA

Diinkubasi selama 14 hari

pada suhu 28° C

60

Lampiran 4. Bagan Kerja Pemurnian Kapang Endofit

Lampiran 5. Bagan Kerja Karakterisasi Kapang Endofit

Isolat murni

Kapang endofit

yang telah tumbuh

Working culture Stock culture

Isolat murni

Karakterisasi makroskopik :

- Warna

- Permukaan

- Lingkaran-lingkaran

konsentris

- Garis-garis radial

Media PDA

Diinkubasi 5-7 hari

pada suhu 28° C

Diamati :

- sekat hifa

- pertumbuhan hifa

- Konidia

61

100 µL Suspensi

bakteri 106

Media MHA Diratakan dengan

batang L

Isolat murni diambil

dengan sedotan

steril

Diinkubasi selama 24

jam pada suhu 37° C

Dilihat ada tidaknya

zona hambat

Lampiran 6. Bagan Kerja Skrining Aktivitas Antibakteri

62

Lampiran 7. Bagan Kerja Fermentasi dan Ekstraksi Kapang Endofit

Media PDY Isolat murni

diambil dengan

sedotan steril

Dimasukkan

ke dalam

media PDY

Fermentasi

goyang dengan

kecepatan 130

rpm selama 14

hari pada suhu

28° C

Supernatan

dipartisi:

- n-heksan

- Etil asetat

Biomassa

dimaserasi :

- Metanol

Dipekatkan dengan

rotary evaporator

vaccumm

63

Lampiran 8. Bagan Kerja Karakteristisasi Bakteri Uji

Lampiran 9. Bagan Kerja Pembuatan Suspensi Bakteri Uji

Bakteri uji setelah

diremajakan Dimasukkan ke

dalam NaCl 0,9%

Diambil

satu ose Divortex

hingga

homogen

9 mL NaCl

0,9%

106 10

7 10

8

64

Lampiran 10. Bagan Kerja Uji Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit

Ekstrak kapang

endofit.

- Ekstrak metanol

- Ekstrak etil asetat

- Ekstrak n-heksan

100 µL Suspensi

bakteri 106

Diratakan dengan

batang L

Media MHA

Ekstrak diserapkan pada

cakram steril sebanyak

30µL (200 ppm) dan

dikeringkan

Cakram diletakkan

di atas media Diinkubasi selama 18-24

jam pada suhu 37° C.

Dilihat zona hambat yang

terbentuk

65

Lampiran 11. Bagan Kerja Penentuan Nilai KHM

66

Lampiran 12. Hasil Isolasi Kapang Endofit

Tampak depan Tampak sebalik

(Cawan A)


(Cawan B)


(Cawan C)

67


(Kontrol Sterilisasi Permukaan)

68

Lampiran 13. Hasil Skrining Isolat Kapang Endofit

A. Skrining terhadap Bakteri S. aureus

Isolat MEA2

B. Skrining terhadap Bakteri B. subtilis

69

C. Skrining terhadap Bakteri P. aeruginosa

70

Lampiran 14. Hasil Fermentasi Isolat Kapang Endofit

Fermentasi MEA1 14 hari

Fermentasi MEA2 14 hari

Fermentasi MEB1 14 hari

Fermentasi MEC1 14 hari

Fermentasi MEC2 14 hari Fermentasi MEC3 14 hari

71

Lampiran 15. Hasil Ekstraksi Isolat Kapang Endofit

Isolat Fraksi Ekstrak

Metanol Etil asetat n-heksan

MEA1

Organoleptis :

Berwarna coklat,

kental, berbau khas.

Organoleptis :

Berwarna coklat,


Organoleptis :

Berwarna kuning,


MEA2

Organoleptis :

Berwarna orange,


Organoleptis :

Berwarna coklat,


Organoleptis :

Berwarna kuning,


MEB1

Organoleptis :

Berwarna coklat

kehitaman, kental,

berbau khas.

Organoleptis :

Berwarna coklat

kehitaman, kental,

berbau khas.

Organoleptis :

Berwarna orange,


72

MEC1

Organoleptis :

Berwarna coklat,


Organoleptis :

Berwarna coklat,

kristal, berbau khas.

Organoleptis :

Berwarna kuning,


MEC2

Organoleptis :

Berwarna coklat,


Organoleptis :

Berwarna coklat,

kristal, berbau khas.

Organoleptis :

Berwarna kuning,


MEC3

Organoleptis :

Berwarna orange,


Organoleptis :

Berwarna coklat

kehitaman, kental,

berbau khas.

Organoleptis :

Berwarna kuning,


73

Lampiran 16. Hasil Uji Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit

1. S. aureus

Ekstrak Hasil

Metanol

Etil Asetat

N-heksan

74

2. B. subtilis

Ekstrak Hasil

Metanol

Etil Asetat

N-heksan

MEB1

75

3. P. aeruginosa

Ekstrak Hasil

Metanol

Etil Asetat

N-heksan

MEB1

MEC3

K-

MEB1

MEC1 MEC3

K+

76

Lampiran 17. Hasil Penentuan KHM

1. B. subtilis

2. P. aeruginosa

Keterangan :

KP : Kontrol pertumbuhan

K(-) : Kontrol negatif

KS : Kontrol sterilitas (media)

KHM : Konsentrasi Hambat Minimum

77

Lampiran 18. Sertifitat ATCC Bakteri Uji

80

Lampiran 19. Sertifikat Analisis Siprofloksasin

81

Lampiran 20. Sertifikat Analisis Kloramfenikol

82

Lampiran 21. Sertifikat Analisis p-iodonitrotetrazolium

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA UJI AKTIVITAS...

Documents

Transcript of UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA UJI AKTIVITAS...