UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ANALISIS...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ANALISIS KANDUNGAN GELATIN BABI DAN

GELATIN SAPI PADA CANGKANG KAPSUL KERAS

YANG MENGANDUNG VITAMIN A MENGGUNAKAN

REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION

SKRIPSI

FATHIYAH

NIM: 1111102000022

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

JULI 2015

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ANALISIS KANDUNGAN GELATIN BABI DAN

GELATIN SAPI PADA CANGKANG KAPSUL KERAS

YANG MENGANDUNG VITAMIN A MENGGUNAKAN

REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION

Skripsi Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

FATHIYAH

NIM: 1111102000022

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

JULI 2015

v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Nama : Fathiyah

Program Studi : Farmasi

Judul : Analisis Kandungan Gelatin Babi dan Gelatin Sapi pada

Cangkang Kapsul Keras yang Mengandung Vitamin A

Menggunakan Real-Time Polymerase Chain Reaction

Vitamin A termasuk salah satu vitamin yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat

Indonesia. Salah satu bentuk sediaan vitamin A yang beredar di Indonesia adalah

kapsul keras. Bahan utama untuk membuat cangkang kapsul keras adalah gelatin.

Sumber gelatin yang digunakan adalah gelatin sapi dan gelatin babi. Penggunaan

gelatin babi menimbulkan kekhawatiran konsumen tentang kehalalan. Penelitian

ini bertujuan untuk menganalisis ada atau tidaknya kandungan gelatin babi dan

gelatin sapi pada 5 sampel produk cangkang kapsul keras menggunakan Real-

Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). DNA gelatin pada cangkang kapsul

keras diisolasi menggunakan kit komersial. Isolat DNA yang didapat

diamplifikasi menggunakan RT-PCR sebanyak 65 siklus. Hasil kurva amplifikasi

menggunakan primer sapi menunjukkan bahwa semua kontrol positif DNA sapi

dan sampel E dapat teramplifikasi. Sedangkan hasil kurva amplifikasi

menggunakan primer babi menunjukkan bahwa kontrol sampel positif DNA babi,

serta sampel A, sampel C, dan sampel E mengalami amplifikasi. Dengan

demikian, dari 5 sampel yang diuji, terdapat 2 sampel cangkang kapsul keras yang

berasal dari gelatin babi, 1 sampel yang berasal dari gelatin sapi dan gelatin babi,

dan 2 sampel yang belum teridentifikasi.

Kata Kunci : gelatin, cangkang kapsul keras, kit komersial, Real-Time Polymerase

Chain Reaction (RT-PCR)

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Fathiyah

Major : Pharmacy

Title : Analysis of Porcine and Bovine Gelatin in Hard Shell Capsule

Containing Vitamin A Using Real-Time Polymerase Chain

Reaction

Vitamin A is a vitamin which is widely consumed by Indonesian people. One of

vitamin A dosage form in Indonesia is hard capsules. The material component of

hard shell capsule is gelatin. The sources of gelatin that used were bovine and

porcine gelatins. The used of porcine gelatin raised consumer’s attention about the

halal. The aims of this study were to analyze the presence of bovine and porcine

gelatin in 5 samples of hard shell capsule by using Real-Time Polymerase Chain

Reaction (RT-PCR). DNA of gelatin in hard shell capsules were isolated by using

commercial kit. The isolated DNA were amplified by using RT-PCR in 65 cycles.

The beef primer amplification curve showed that all of positive control beef DNA

and sample E can be amplified. While the pork primer amplification curve

showed that all of positive control pork DNA, sample A, sample C, and sample E

can be amplified. It can be concluded from 5 samples of hard shell capsule that

there were 2 samples which derived from porcine gelatin, 1 sample derived from

bovine and porcine gelatin, and 2 samples were not identified yet.

Keyword : gelatin, hard shell capsule, commercial kit, Real-Time Polymerase

Chain Reaction (RT-PCR)

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur bagi kehadirat Allah SWT yang senantiasa

mencurahkan segala rahmat-Nya kepada kita semua, khususnya penulis, dalam

menyelesaikan skripsi yang berjudul “Analisis Kandungan Gelatin Babi dan

Gelatin Sapi pada Cangkang Kapsul Keras yang Mengandung Vitamin A

Menggunakan Real-Time Polymerase Chain Reaction”. Shalawat dan salam

senantiasa terlimpah kepada junjungan Nabi Muhammad saw., teladan bagi umat

manusia dalam menjalani kehidupan.

Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat menempuh ujian

akhir guna mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S. Far) pada Program Studi

Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri

(UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. Selesainya penelitian dan penyususnan skripsi

ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh sebab itu, dalam kesempatan ini

perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan terimakasih yang tulus dan

sebesar-besarnya kepada:

1. Bapak Dr. Arief Sumantri, SKM, M.Kes., selaku Dekan Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta.

2. Bapak Yardi, M. Si., Ph.D. Apt., selaku Ketua Prodi Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN)

Syarif Hidayatullah Jakarta dan Pembimbing Akademik Farmasi 2011 A.

3. Ibu Zilhadia, M.Si. Apt., selaku Pembimbing I dan Ibu Ofa Suzanti Betha, M.

Si., Apt. selaku Pembimbing II yang sangat baik telah memberikan ilmu,

nasehat, waktu, tenaga, pikiran, dukungan, serta kesabaran dalam

membimbing selama proses penelitian sampai penulisan skripsi, sehingga

penulis dapat menjadi lebih baik.

4. Kedua orang tua, ayahanda tercinta Ahmad Farid Yahya dan ibunda tercinta

Intan Assegaf, yang selalu ikhlas memberikan dukungan moral, material,

nasehat, serta doa yang tiada pernah putus di setiap waktu dan selalu

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

mendengarkan segala keluh kesah penulis hingga penulis dapat menyelesaikan

studi di Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Kakak-kakak tersayang Mohamad Wildan Yahya, Zakiyah Yahya, dan Zainal

Abidin Yahya, yang selalu memberikan dukungan, nasehat, dan semangat

kepada penulis hingga penulis dapat menyelesaikan studi di Farmasi FKIK

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Juga kepada 2 keponakan tersayang, Nur

Karimah Shahab dan Ahmad Zain Shahab yang selalu memberikan keceriaan

bagi penulis.

6. Ahmad Arif Yahya yang selalu memberikan doa, dukungan, semangat,

motivasi, dan waktu untuk mendengarkan keluh kesah penulis. Serta

memberikan keceriaan bagi penulis disetiap waktu.

7. Bapak dan Ibu staf pengajar, serta karyawan yang telah memberikan ilmu

pengetahuan, bimbingan, dan bantuan selama penulis menempuh pendidikan

di Farmasi FKIK UIN Jakarta.

8. Teman-teman Farmasi 2011 “Effervesent” yang telah menemani dan

memberikan kenangan tak terlupakan selama penulis menempuh pendidikan

di Farmasi FKIK UIN Jakarta, khususnya Farmasi 2011 AC yang telah

bersama-sama menjalani proses kuliah dalam 1 kelas selama 3.5 tahun.

9. Kak Rahmadi, Kak Liken, Kak Eris, Kak Lisna, Kak Tiwi, Mbak Rani, Kak

Walid, dan Kak Yaenap yang telah banyak membantu penulis melakukan

penelitian di laboratorium.

10. Teman-teman seperjuangan PCR, Rian Hidayat, yang telah meluangkan

waktunya untuk bekerja sama, berdiskusi, memberikan masukan, pikiran,

beribet-ribet ria bersama, dan membantu penulis dalam mengerjakan

penelitian sampai penyelesaian skripsi ini. Serta Kak Ifah, Kak Yanti, dan Kak

Sulaiman yang selalu memberikan masukan, waktu untuk berdiskusi ditengah

kesibukannya, dan semua bantuan berharga bagi penulis selama sebelum

memulai skripsi sampai selesainya skipsi ini.

11. Tim Roche Indonesia, Bapak Deka dan Mbak Helen, yang telah memberikan

masukan dan bantuan selama penulis melakukan penelitian. Serta Mbak Ayu

dari BPPT, yang telah meluangkan waktu untuk membantu penulis dalam

melakukan penelitian.

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

12. Sahabat tersayang, Qurry, Santi, dan Dana yang telah memberikan warna bagi

penulis selama kuliah di Farmasi FKIK UIN Jakarta. Terimakasih atas

dukungan, semangat, doa, perhatian, dan persahabatan yang kalian berikan.

Serta Fitri, Herlina, Ghina, Henny, Diyah, Cobi, Nana, Athiyyah, dan Rhesa

yang telah membantu dan menemani saat penelitian. Semua kenangan

bersama kalian tak akan terlupakan.

13. Dan kepada semua pihak yang telah membantu penulis selama ini yang tidak

dapat disebutkan namanya satu persatu.

Semoga semua bantuan yang telah diberikan mendapatkan balasan dari

Allah SWT. Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari

sempurna. Oleh karena itu, saran dan kritik yang bersifat membangun akan

penulis nantikan. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu

pengetahuan selanjutnya.

Jakarta, 8 Juli 2015

Penulis

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL i

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ii

LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING iii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI iv

ABSTRAK v

ABSTRACT vi

KATA PENGANTAR vii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI x

DAFTAR ISI xi

DAFTAR TABEL xiii

DAFTAR GAMBAR xiv

DAFTAR LAMPIRAN xv

DAFTAR SINGKATAN xvi

DAFTAR ISTILAH xvii

BAB I. PENDAHULUAN 1

1.1. Latar Belakang 1

1.2. Rumusan Masalah 3

1.3. Hipotesis 4

1.4. Tujuan Penelitian 4

1.5. Manfaat Penelitian 4

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 5

2.1. Vitamin A 5

2.2. Kapsul 6

2.2.1. Jenis Kapsul 7

2.2.2. Komponen Pembuatan Kapsul 9

2.2.3. Cara Penyimpanan Kapsul 10

2.3. Gelatin 10

2.3.1. Komposisi dan Struktur Kimia 11

2.3.2. Tipe Gelatin 13

2.3.3. Stabilitas 14

2.3.4. Karakteristik Kimia dan Fisika Gelatin 15

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.3.5. Pengaruh Sifat Kimia dan Fisik 15

2.3.6. Aplikasi Penggunaan Gelatin 17

2.4. Deoxyribunucleic Acid (DNA) 18

2.5. Isolasi DNA 19

2.6. Spektrofotometer UV untuk Pemeriksaan DNA 21

2.7. Polymerase Chain Reaction (PCR) 21

2.7.1. Komponen PCR 22

2.7.2. Tahapan PCR 24

2.7.3. Real-Time PCR 27

BAB III. METODE PENELITIAN 29

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian 29

3.2. Alat dan Bahan 29

2.1.1. Alat 29

2.1.2. Bahan 29

3.3. Tahapan Penelitian 30

3.4. Prosedur Kerja 31

3.4.1. Pembuatan Cangkang Kapsul Simulasi

Menggunakan Gelatin Babi dan Gelatin Sapi 31

3.4.2. Pengumpulan Sampel 31

3.4.3. Identifikasi Gelatin pada Cangkang Kapsul

Keras Sampel 32

3.4.4. Isolasi DNA Kontrol dan Sampel 32

3.4.5. Pemeriksaan Kadar dan Kemurnian Isolat

DNA Menggunakan Spektrofotometer UV 34

3.4.6. Pemeriksaan Spesifisitas Primer dan Probe 35

3.4.7. Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time

PCR 35

3.4.8. Analisis Data 36

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 38

4.1. Analisis Lembar Cangkang Kapsul Keras Simulasi 38

4.2. Proses Identifikasi Gelatin pada Cangkang Kapsul

Keras Sampel 39

4.3. Proses Isolasi DNA 40

4.4. Analisis Hasil Isolat DNA 42

4.5. Amplifikasi Menggunakan Real-Time PCR 44

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN 49

5.1. Kesimpulan 49

5.2. Saran 49

DAFTAR PUSTAKA 50

LAMPIRAN 55

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1. Rekomendasi Asupan Vitamin A 6

Tabel 2.2. Kandungan Asam Amino Dalam Gelatin 12

Tabel 3.1. Urutan Basa Primer dan TaqMan Probe 30

Tabel 3.2. Formulasi Lembar Cangkang Kapsul Keras 31

Tabel 3.3. Identitas Sampel yang berasal dari Produsen yang Berbeda 32

Tabel 3.4. Pengaturan Program Amplifikasi pada LightCycler® 480

Real-Time PCR 36

Tabel 4.1. Hasil Kemurnian dan Kadar Isolat DNA yang Diperoleh 43

Tabel 6. Spesifikasi High Pure PCR Template Preparation Kit 56

Tabel 7. Campuran Pereaksi PCR Mix untuk Setiap Isolat DNA 59

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Cangkang Kapsul Keras 7

Gambar 2.2. Berbagai Ukuran Kapsul Keras 8

Gambar 2.3. Asam Amino-Asam Amino Penyusun Gelatin 12

Gambar 2.4. Struktur Triple-Helix Gelatin 13

Gambar 2.5. Pengaruh Pemanasan atau Pendinginan Terhadap Struktur

Gelatin 16

Gambar 2.6. Struktur dan Komponen Penyusun DNA 18

Gambar 2.7. Spektrofotometri UV untuk Pemeriksaan DNA 21

Gambar 2.8. Tahapan Proses PCR 25

Gambar 2.9. Kerja Fluorescent Dye dan Quencher pada Real-Time PCR 28

Gambar 2.10. Bentuk Kurva Real-Time PCR 28

Gambar 4.1. Lembar Cangkang Kapsul Keras Simulasi (a) Sapi dan (b)

Babi 38

Gambar 4.2. Hasil Pengujian Sumber Bahan Baku Cangkang Kapsul 39

Gambar 4.3. Reaksi yang Terjadi pada Proses Identifikasi Gelatin 40

Gambar 4.4. Hasil Amplifikasi Isolat DNA sampel menggunakan Primer Sapi 45

Gambar 4.5. Hasil Amplifikasi Isolat DNA sampel menggunakan Primer Babi 47

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Alur Kerja 55

Lampiran 2. Spesifikasi Kit Isolasi DNA 56

Lampiran 3. Uji Spesifikasi Primer Sapi Menggunakan BLAST NCBI 57

Lampiran 4. Uji Spesifikasi Primer Babi Menggunakan BLAST NCBI 58

Lampiran 5. Campuran Reaksi PCR Mix untuk Amplifikasi DNA 59

Lampiran 6. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer dan Probe 60

Lampiran 7. Perhitungan Tm (Temperature Melting) Primer 61

Lampiran 8. Gambar Peralatan yang Digunakan dalam Penelitian 62

xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR SINGKATAN

BB : Binding Buffer

BHQ-1 : Black Hole Quencher-1

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

BLASTn : Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool

Cp : Crossing Point

dATP : Deoxyadenosine Triphosphate

dCTP : Deoxycytidine Triphosphate

dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate

DNA : Deoxyribonucleic Acid

dNTP : Deoxynucleotide Triphosphate

dTTP : Deoxythymidine Triphosphate

EB : Elution Buffer

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

FAM : Fluorescein Amidite

IRB : Inhibitor Removal Buffer

mtDNA : DNA Mitokondria

NCBI : National Center for Biotechnology Information

NTC : No Template Control

RNA : Ribonucleic Acid

RT-PCR : Real-Time Polymerase Chain Reaction

TLB : Tissue Lysis Buffer

Tm : Temperature Melting

WB : Washing Buffer

xvii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISTILAH

BLAST : Program untuk menganalisis kesejajaran sekuen query (DNA atau

protein) dengan sekuen DNA atau protein pada database di NCBI.

Blastn : Salah satu variasi dari program BLAST untuk menganalisis

kesejajaran nukleotida query dengan nukleotida pada database di

NCBI

Cp : Fraksi jumlah siklus dimana tingkat amplifikasi yang tercermin

dari adanya flouresensi mencapai threshold (ambang)

Threshold : Garis penanda siklus awal dari reaksi PCR, yaitu saat sinyal

fluoresensi berada pada tingkat terendah

NCBI : Suatu institusi milik United States National Library of Medicine

yang berperan sebagai sumber informasi perkembangan biologi

molekuler.

Query : Sekuen yang dimasukkan ke dalam program BLAST untuk

diketahui kesejajarannya

Tm : Temperatur dimana 50% untai ganda DNA terpisah

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Vitamin A merupakan nutrien esensial yang bersifat larut lemak yang

dibutuhkan oleh tubuh manusia Vitamin ini berfungsi untuk sistem

penglihatan, pertumbuhan dan perkembangan, dan menjaga integritas sel

epitel, fungsi imun, dan reproduksi (WHO, 2001). Vitamin A biasa

dikonsumsi oleh anak-anak, dewasa, dan lansia untuk menjaga kesehatan mata

dan memperkuat sistem kekebalan tubuh (Karnadi, 2014). Selain itu, vitamin

A juga dikonsumsi oleh ibu hamil untuk perkembangan embrio (Hornstra et.

al, 2005).

Penggunaan vitamin A di Indonesia terus meningkat. Cakupan pemberian

vitamin A ini meningkat dari 71,5 persen pada tahun 2007 menjadi 75,5

persen pada tahun 2013 (Karnadi, 2014). Hal ini disebabkan karena terdapat

banyak kasus defisiensi vitamin A yang terjadi, seperti kebutaan dan kematian

ibu hamil. Setiap tahunnya, terdapat 250.000 – 500.000 anak yang mengalami

kebutaan akibat kekurangan vitamin A di Indonesia. Selain itu, terdapat 9352

ibu yang meninggal di Indonesia pada tahun 2013 (Tempo, 2014).

Salah satu bentuk sediaan vitamin A yang beredar di Indonesia adalah

kapsul. Kapsul adalah bentuk sediaan padat, dimana ia berisi satu bahan obat

atau lebih dan/atau bahan inert lainnya yang dimasukkan ke dalam cangkang

atau wadah kecil. Bahan utama untuk membuat cangkang kapsul keras adalah

gelatin (Rabadiya, 2013; Ansel, 2008).

Gelatin merupakan protein yang diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen,

yaitu komponen protein utama pada kulit, tulang, kulit jangat, dan jaringan

penghubung dari tubuh binatang. Gelatin digolongkan sebagai turunan protein,

karena didapat dari proses hidrolisis dan tidak terdapat di alam (Domb et. al,

1997). Kebutuhan dunia terhadap gelatin sangat besar. Laporan terakhir

menunjukkan bahwa produksi gelatin dunia setiap tahunnya adalah sekitar

326.000 ton (Shyni et. al., 2013).

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Gelatin dapat dimanfaatkan diberbagai sektor industri, yaitu sektor industri

makanan, farmasi, dan fotografi. Dalam industri makanan, gelatin dapat

digunakan sebagai gelling agent pada gummy, penstabil pada marshmallow,

pencegah kristalisasi gula pada manisan, pemberi bentuk dan pengikat pada

daging, emulgator pada produk susu, dan lain-lain. Dalam industri farmasi,

gelatin digunakan sebagai komponen pada cangkang kapsul keras dan kapsul

lunak, granulasi, penyalut tablet, dan enkapsulasi. Penggunaan gelatin pada

berbagai sediaan farmasi diperkirakan sebesar 17% dari konsumsi gelatin di

dunia (Gelatin Manufacturers Institute of America, 2012).

Gelatin yang digunakan dapat berasal dari berbagai sumber, yaitu kulit

babi 44%, kulit sapi 28%, tulang sapi 27%, dan lainnya (misal gelatin ikan)

1% (Shyni et. al., 2013). Kulit babi memegang persentase paling besar karena

bahan baku babi lebih banyak dan harganya lebih murah jika dibandingkan

dengan sapi (Aisyah et. al, 2014).

Penggunaan gelatin yang berasal dari babi dan sapi sebagai bahan baku ini

menimbulkan masalah bagi seorang muslim yang merupakan agama mayoritas

yang banyak dianut oleh penduduk di dunia, yaitu 22.43%. Mayoritas

penduduk di Indonesia pun beragama Islam, yaitu dengan jumlah 1.6 Milyar

penduduk pada tahun 2010 (Riaz dan Caundry, 2004; Republika, 2014).

Agama Islam menjelaskan dalam Alqur’an dan Hadits bahwa salah satu

sumber makanan yang diharamkan adalah babi dan turunannya. Surat

Alqur’an yang menjelaskan tentang hal tersebut diantaranya QS. Al-Baqarah :

173 dan QS. Al-Maidah : 3.

Telah banyak metode yang digunakan untuk menganalisis kandungan

gelatin dalam rangka mendeteksi kehalalan, misalnya dengan Mass

Spectrometry (Zhang et. al., 2009), Fourier Transform Infrared (FTIR)

Spectroscopic (Al-Saidi et. al, 2012), dan Sodium Dodecyl Sulphate-

Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) yang dikombinasi dengan

PCA (Azira et. al, 2012). Kekurangan dari metode-metode tersebut adalah

analisisnya yang masih didasarkan pada protein, dimana protein bersifat tidak

stabil terhadap pemanasan dan pH yang ekstrem. Seiring berjalannya waktu,

berkembang metode untuk menganalisis kandungan gelatin pada tingkat

3


DNA, dimana DNA bersifat lebih stabil daripada protein (Cai et. al., 2011).

DNA yang akan diuji tersebut dapat diisolasi menggunakan metode kit

komersial. Metode ini dianggap lebih baik daripada metode konvensional,

karena dapat meminimalisir hilangnya DNA, lebih cepat, dan lebih aman

(Rochea, 2008).

Analisis tingkat DNA dapat dilakukan menggunakan Polymerase Chain

Reaction (PCR). Salah satu tipe PCR yang dapat digunakan untuk mendeteksi

kehalalan gelatin dalam suatu produk adalah dengan menggunakan Real-Time

Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) (Demirhan et. al, 2012). Analisis

menggunakan Real-Time PCR atau quantitative PCR (qPCR) ini didasarkan

pada kombinasi PCR tradisional yang mengunakan pendeteksi “end-point”

dengan teknologi pendeteksi fluoresen untuk mencatat akumulasi amplifikasi

dalam suatu waktu pada setiap siklus amplifikasi. Deteksi amplifikasi selama

fase eksponensial awal PCR ini memungkinkan kuantifikasi jumlah gen (atau

transkrip) ketika konsentrasi template awal proporsional. (Smith dan Osborn,

2008). Metode RT-PCR ini juga dapat mendeteksi campuran gelatin babi dan

gelatin sapi dengan level kontaminasi 1% (Cai et. al., 2011).

Berdasarkan uraian tersebut, maka dilakukan penelitian untuk

menganalisis kandungan gelatin babi dan gelatin sapi dalam cangkang kapsul

keras pada produk vitamin yang mengandung vitamin A yang beredar di

Indonesia menggunakan metode Real-Time PCR.

1.2. Rumusan Masalah

1. Belum diketahuinya efektivitas metode kit komersial untuk

mengisolasi DNA gelatin babi dan gelatin sapi pada cangkang kapsul

keras yang mengandung vitamin A.

2. Belum diketahuinya efektivitas Real-Time PCR untuk mengamplifikasi

DNA gelatin babi dan gelatin sapi pada cangkang kapsul keras yang

mengandung vitamin A yang terisolasi menggunakan metode kit

komersial.

4


1.3. Hipotesis

1. DNA pada cangkang kapsul vitamin A dapat terisolasi dengan baik

menggunakan metode kit komersial

2. DNA yang diisolasi menggunakan metode kit komersial dapat

teramplifikasi dengan baik menggunakan Real-Time PCR.

1.4. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk menganalisis ada atau tidaknya

kandungan gelatin babi dan gelatin sapi pada cangkang kapsul keras dari

produk vitamin yang mengandung vitamin A yang beredar di Indonesia.

1.5. Manfaat Penelitian

1. Mengetahui kondisi optimal yang digunakan untuk mengisolasi

menggunakan metode kit komersial dan mengamplifikasi DNA pada

cangkang kapsul keras menggunakan Real-Time Polymerase Chain

Reaction.

2. Memperoleh informasi kehalalan mengenai beberapa sediaan kapsul

yang beredar di Indonesia.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Vitamin A

Vitamin A merupakan nutrien esensial yang bersifat larut lemak yang

dibutuhkan dalam jumlah kecil oleh tubuh manusia normal yang berfungsi

untuk sistem penglihatan; pertumbuhan dan perkembangan; dan menjaga

integritas sel epitel, fungsi imun, dan reproduksi. Vitamin A biasanya

disediakan dalam bentuk retinol (khususnya retinyl ester), asam retinoat, dan

pro-vitamin A carotenoid yang merupakan prekursor retinol (WHO, 2001;

Otten et. al., 2006). Vitamin A dibutuhkan pula untuk perkembangan embrio

normal. Asam retinoat adalah retinoid yang secara signifikan mempengaruhi

proses embriogenesis. Ia mengatur proses apoptosis, proliferasi, dan

differensiasi. Vitamin A disalurkan dari ibu hamil ke janinnya melalui

plasenta (Hornstra et. al., 2005).

Vitamin A banyak ditemukan di produk hewani, seperti susu, daging, hati,

dan minyak hati ikan, dan kuning telur. Pro-vitamin A karotenoid ditemukan

dalam sayuran hijau (seperti bayam), sayuran kuning (seperti labu dan wortel),

buah-buahan kuning atau oren (seperti mangga dan pepaya) (WHO, 2001).

Kekurangan vitamin A didefinisikan sebagai konsentrasi vitamin A

jaringan yang rendah dan tidak cukup untuk menimbulkan efek yang

menyehatkan bagi tubuh, meskipun tidak ada bukti xeroftalmia (WHO, 2001).

Asupan vitamin A untuk laki-laki dan perempuan berbeda. Rekomendasi

asupan vitamin A sesuai tingkatan umur dapat dilihat pada tabel 2.1.

6


Tabel 2.1. Rekomendasi Asupan Vitamin A (Sumber : Otten et. al., 2006)

Asupan (µl/hari)

Perkiraan Kebutuhan Rata-Rata

Laki-Laki Wanita

Berdasarkan Umur

1 – 3 tahun 210 210

4 – 8 tahun 275 275

9 – 13 tahun 445 420

14 – 18 tahun 630 485

19 – 30 tahun 625 500

31 – 50 tahun 625 500

51 – 70 tahun 625 500

Lebih dari 70 tahun 625 500

Ibu Hamil

Kurang dari 18 tahun 530

19 – 50 tahun 550

Ibu Menyusui

Kurang dari 18 tahun 885

19 – 50 tahun 900

2.2. Kapsul

Dalam dunia farmasi, kapsul digunakan untuk mendeskripsikan bentuk

sediaan padat, dimana ia berisi satu bahan obat atau lebih dan/atau bahan inert

lainnya yang dimasukkan ke dalam cangkang atau wadah kecil yang

umumnya dibuat dari gelatin yang sesuai (Rabadiya, 2013; Ansel, 2008).

Kebanyakan kapsul yang diedarkan di pasaran adalah kapsul yang dapat

ditelan oleh pasien untuk keuntungan dalam pengobatan. Kapsul juga dapat

dibuat untuk disisipkan ke dalam rektum, sehingga obat dilepaskan dan

diabsorpsi di tempat tersebut (Ansel, 2008).

Kapsul digunakan sebagai pelindung sediaan antibiotik, multivitamin dan

mineral, suplemen, dan sebagainya. Selain sebagai pelindung, kapsul juga

berguna untuk menutup rasa dan bau yang tidak menyenangkan dari obat,

memudahkan administrasi obat karena mudah ditelan dengan bantuan air, dan

cepat dicerna oleh saluran gastrointestinal (Rabadiya, 2013).

7


2.2.1. Jenis Kapsul

Berdasarkan elastisitas dan komponen pembentuknya, kapsul

dibagi menjadi 2 kategori, yaitu cangkang kapsul keras dan cangkang

kapsul lunak (Rabadiya, 2013).

a. Cangkang Kapsul Keras

Kapsul keras terdiri atas 2 cangkang, yaitu badan kapsul dan

tutup kapsul.

Gambar 2.1. Cangkang Kapsul Keras

(Sumber: www.snailpharma.com)

Tutup kapsul yang sesuai akan menutup badan kapsul dengan

rapat. Bahan dasar cangkang kapsul keras terbuat dari campuran

gelatin, gula, dan air. Ia bersifat jernih dan tidak berasa (Rabadiya,

2013). Selain itu, titanium oksida juga dapat ditambahkan untuk

membuat cangkang menjadi tidak transparan dan tidak tembus

cahaya (Ansel, 2008).

Pembuatan cangkang kapsul dilakukan dengan cara

mencelupkan cetakan logam ke dalam larutan gelatin panas pada

suhu kamar, kemudian gel akan membentuk sebuah film. Ia

dibiarkan kering, lalu dipotong memanjang dan dirapikan sesuai

dengan panjangnya. Proses ini dapat dilakukan menggunakan

mesin (Rabadiya, 2013; Ansel, 2008).

Ukuran kapsul keras bervariasi. Ia berkisar antara ukuran 000

(paling besar) dan 5 (paling kecil). Secara umum, kapsul keras

digunakan untuk mengenkapsulasi antara 65 mg sampai 1 gram

(Rabadiya, 2013).

Cangkang kapsul gelatin dapat dibuat dengan berbagai ukuran,

bervariasi baik panjang maupun diameternya. Pemilihan ukuran

tergantung pada berapa banyak isi bahan yang akan dimasukkan ke

tutup badan

8


dalam kapsul dan dibandingkan dengan kapasitas isi dari cangkang

kapsul. Karena kepadatan dan penekanan dari serbuk atau

campuran serbuk akan menentukan berapa jumlah yang dapat

ditampung dalam kapsul dan karena tiap bahan mempunyai sifat

tersendiri, maka tidak ada pengaturan yang ketat untuk

menentukan ukuran kapsul yang tepat (Ansel, 2008).

Gambar 2.2. Berbagai Ukuran Kapsul Keras

(Sumber: Rabadiya, 2013)

b. Cangkang Kapsul Lunak

Kapsul lunak terdiri atas 1 cangkang yang tertutup rapat.

Kapsul lunak dapat dibentuk menjadi beberapa bentuk, di

antaranya oval dan bulat.

Kapsul lunak biasanya digunakan untuk mengenkapsulasi

formulasi higroskopis dan/atau obat yang sensitif terhadap air,

dimana formulasi gelatin standar dimodifikasi agar mengandung

sedikit air dan kering dengan cepat, sehingga produk stabil selama

proses pembuatan (Rabadiya, 2013).

Cangkang kapsul gelatin lunak dapat dibuat dengan cara proses

lempeng menggunakan seperangkat cetakan untuk membentuk

kapsul atau dengan cara die process yang lebih efisien dan

produktif. Yang dimaksud dengan proses lempeng yaitu selembar

gelatin hangat ditempatkan pada permukaan cetakan bagian bawah,

dan obat yang cair dituangkan kedalamnya. Kemudian selembar

gelatin lainnya ditempatkan diatasnya dan ditekan untuk

penyegelan. Sedangkan pembuatan dengan die process yaitu cairan

gelatin yang dituangkan dari tangki yang terletak diatas, dibentuk

menjadi dua buah pita yang berurutan oleh mesin rotary die.

9


Dalam waktu yang bersamaan bahan obat yang akan diisikan dan

diukur, dimasukkan diantaraa kedua pita secara tepat, ketika itu

dies membentuk kantung dari pita gelatin. Kemudian kantung-

kantung gelatin yang telah terisi, disegel dengan tekanan dan panas

(Ansel, 2008).

2.2.2. Komponen Pembuatan Kapsul

Bahan baku dalam pembuatan kapsul adalah gelatin, air, pewarna,

dan bahan penolong seperti pengawet dan surfaktan (Rabadiya, 2013;

Bhatt, 2007).

a. Gelatin

Gelatin merupakan komponen utama dari kapsul. Hal ini

disebabkan karena kemampuan larutan untuk membentuk gel atau

bentuk yang padat pada suhu ruang, dimana memungkinkan

terjadinya pembentukan lapisan homogen secara cepat. Gelatin

yang digunakan harus memiliki sifat:

- Tidak toksik, dapat secara luas digunakan sebagai bahan

makanan dan dapat diterima.

- Dapat larut dalam cairan biologis pada suhu tubuh.

- Dapat membentuk lapisan film yang kuat dan fleksibel.

- Lapisan gelatin homogen.

b. Pewarna

Pewarna terutama digunakan sebagai identitas sebuah produk.

Pewarna yang dapat digunakan untuk kapsul terbagi menjadi 2

jenis, yaitu pigmen larut air (contohnya eritrosin, indigo carmine,

dan quinolone yellow) dan pigmen tidak larut (contohnya iron

oxide- black dan titanium dioksida).

c. Bahan Penolong

Bahan penolong yang biasa ditambahkan adalah pengawet dan

surfaktan. Pengawet digunakan untuk mengurangi pertumbuhan

bakteri sampai. Pengawet yang biasanya digunakan adalah sulfur

dioksida, golongan paraben, dan asam benzoat. Sedangkan

10


surfaktan digunakan untuk wetting agent. Surfaktan yang biasa

digunakan adalah natrium lauril sulfat 0.15% b/b (Bhatt, 2007).

2.2.3. Cara Penyimpanan Kapsul

Meskipun terlihat keras, cangkang kapsul keras sebenarnya

mengandung air dengan kadar 10-15%. Bila disimpan di tempat yang

lembab, cangkang kapsul akan menjadi lunak dan lengket satu sama

lain, serta sukar dibuka. Sebaliknya bila disimpan di tempat yang

terlalu kering, kapsul akan kehilangan kandungan airnya sehingga

rapuh dan mudah pecah. Oleh karena itu, kapsul sebaiknya disimpan di

dalam tempat atau ruangan dengan kondisi:

- Tidak terlalu lembab atau dingin dan kering.

- Terbuat dari botol gelas, tertutup rapat, dan diberi bahan pengering

(silika gel).

- Terbuat dari wadah botol plastik, tertutup rapat, dan diberi bahan

pengering.

- Terbuat dari aluminium foil dalam blister atau strip (Syamsuni,

2006).

2.3. Gelatin

Gelatin merupakan protein yang diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen,

yaitu komponen protein utama pada kulit, tulang, kulit jangat, dan jaringan

penghubung dari tubuh binatang (Domb et.al, 1997). Ketika kolagen

diperlakukan dengan asam atau basa dan diikuti dengan panas, struktur fibrosa

kolagen dipecah ireversibel menghasilkan gelatin. Gelatin dihasilkan melalui

ikatan cross-linking (ikatan silang-sambung) diantara rantai polipetida pada

kolagen (Zhou dan Regenstein, 2004).

Gelatin diklasifikasikan sebagai turunan protein. Hal ini disebabkan

karena ia diperoleh dari kolagen dengan mengontrol hidrolisis parsial dan

tidak terdapat di alam (Domb et.al, 1997). Gelatin tidak dapat diturunkan dari

tanduk, kuku, dan bagian non-kolagen lainnya dari binatang vertebrata. Tidak

ada tumbuhan yang menghasilkan gelatin dan tidak terdapat hubungan kimia

antara gelatin dengan bahan lainnya yang disebut sebagai gelatin nabati,

11


seperti ekstrak rumput laut. Sumber alternatif lainnya adalah unggas dan ikan.

Mineral (pada tulang), lemak, albuminoid (pada kulit) akan dihilangkan secara

kimia dan perlakuan fisika untuk mendapatkan kolagen murni (Gelatin

Manufacturers Institute of America, 2012).

Hidrolisat gelatin atau yang biasanya disebut protein cair, adalah produk

yang diperoleh dengan hidrolisis yang lebih sempurna dari kolagen dan

dipertimbangkan sebagai fraksi gelatin dengan berat molekul yang lebih kecil.

Lem binatang ini pertama kali digunakan pada 4000 SM pada zaman Mesir

kuno. Pada abad berikutnya, lem dan ekstrak gelatin mentah dengan sifat

organoleptik yang buruk dipreparasi dengan merebus tulang dan lapisan kulit

jangat, serta membiarkan larutan tersebut dingin dan menjadi gel. Pada abad

ke-17, produksi gelatin secara komersial pertama kali dimulai. Pada awal abad

19, metode produksi komersial secara berangsur-angsur dikembangkan untuk

memperoleh ekstrak kolagen dengan berat molekul yang tinggi dengan

kualitas yang baik dari karakteristik gel gelatin. (Domb et. al., 1997)

2.3.1. Komposisi dan Struktur Kimia

Gelatin tersusun atas berbagai bahan kimia. Gelatin tersusun atas

karbon (50.5%), hidrogen (6.8%), nitrogen (17%), dan oksigen

(25.2%) (Gelatin Manufacturers Institute of America, 2012). Penyusun

utama gelatin adalah molekul polipeptida kompleks dari komposisi

asam amino yang sama seperti kolagen, yang memiliki distribusi

rentang berat molekul yang luas.

Pada kolagen, 18 asam amino yang berbeda tersusun menjadi

rantai yang panjang. Berdasarkan hasil analisis, asam amino yang

menyusun gelatin tersusun atas 0.2% tirosin sampai 30.5% glisin.

Lima asam amino utama yang menyusunnya adalah glisin 26.4-30.5%;

prolin 14.8-18%; hidroksiprolin 13.3-14.5%; asam glutamat 11.1-

11.7%; dan alanin 8.6-11.3%. Selain ke-5 asam amino tersebut, asam

amino penyusun lainnya adalah arginin, asam aspartat, lisin, serin,

leusin, valin, fenilalanin, treonin, isoleusin, hidroksilisin, histidin,

metionin, dan tirosin (Domb et. al., 1997).

12


Gambar 2.3. Asam Amino-Asam Amino Penyusun Gelatin

(Sumber: www.pbgelatins.com)

Kandungan berbagai asam amino setiap gram dari 100 gram

gelatin kering dapat dilihat pada tabel 2.2.

Tabel 2.2. Kandungan Asam Amino Dalam Gelatin (Sumber: Gelatin Manufacturers Institute of America, 2012)

Rantai penyusun gelatin berbentuk seperti batang (rod-like) dengan

struktur triple-helix yang tersusun atas 2 rantai identik (disebut α1) dan

1 rantai yang sedikit berbeda (disebut α2). Struktur gelatin dapat

diamati dengan mikrsokop elektron. Struktur gel ini merupakan

kombinasi dari hubungan rantai dalam yang halus dan kasar, dimana

perbandingannya tergantung pada suhu selama interaksi antar polimer

dan antara polimer-pelarut membentuk ikatan hidrogen. Rigiditas gel

tergantung pada konsentrasi gelatin. Kristalit yang ditunjukkan dengan

X-ray diffraction pattern dipercaya menjadi penghubung antara rantai

polipeptida.

http://www.pbgelatins.com/

13


Gambar 2.4. Struktur Triple-Helix Gelatin

(Sumber: www.worldwidewounds.com)

Rantai tersebut dapat diputus dan dirusak dengan cara hidrolisis.

Berat molekul gelatin memiliki rentang dari 25.000-250.000.

Distribusi berat molekul diketahui dari presipitasi fraksional dengan

etanol atau 2-propoanol dan dari mencampurkannya dengan molekul

detergen anionik. Hasilnya diisolasi dan disebut dengan fraksi gelatin

(Domb et.al, 1997).

2.3.2. Tipe Gelatin

Berdasarkan proses pembuatannya, gelatin digolongkan menjadi 2

tipe, yaitu:

a. Gelatin Tipe A (Asam)

Gelatin tipe A diproduksi dengan memproses bahan baku kolagen

secara asam. Kebanyakan gelatin tipe A dibuat dari kulit babi.

Proses ini meliputi manyamak kulit, mencuci pengotor, dan

pengembangan selama 10-30 jam dalam 1-5% hidroklorida, fosfor,

dan asam sulfur. Kemudian tahap 4 sampai 5 kali ekstraksi yang

dilakukan pada suhu 55-65oC untuk ekstraksi pertama dan 95-

100oC untuk ekstraksi terakhir. Setiap ekstraksi dilakukan selama

4-5 jam. Kemudian lemak dihilangkan, larutan gelatin disaring,

dan dideionisasi. Larutan kental didinginkan, ditekan menjadi

lapisan tipis, dan dikeringkan pada suhu 30-60oC.

b. Gelatin Tipe B (Basa)

Tipe B diproduksi dengan proses basa atau dengan kapur.

Gelatin tipe B terbuat dari tulang dan kulit sapi, serta kulit babi.

Tulang berukuran 0.5-4 cm dengan lemak kurang dari 3% diproses

http://www.worldwidewounds.com/

14


pada suhu dingin, lalu ditambahkan asam hidroklorida selama 4-14

hari untuk menghilangkan kandungan mineralnya. Selanjutnya,

demineralisasi dicuci dan dipindahkan ke tangki besar untuk

disimpan dalam lime slurry. Pada proses liming selama 3-16

minggu, terjadi beberapa deaminasi kolagen. Proses ini merupakan

proses utama yang menghasilkan isoelektrik yang rendah pada

gelatin tipe B. Setelah dicuci selama 15-30 jam untuk

menghilangkan lime, ia diasamkan pada pH 5-7. Kemudian proses

dilanjutkan sesuai dengan tahapan pembuatan gelatin tipe A

(Domb et.al., 1997).

Suhu, pH, dan jumlah ekstraksi bervariasi tergantung pasa

kebutuhan produk, tipe peralatan yang digunakan, waktu

pengoperasian, dan aspek ekonomi. Prosedur ekstraksi harus dikontrol

karena akan mempengaruhi kualitas dan kuantitas gelatin yang

dihasilkan (Gelatin Manufacturers Institute of America, 2012).

Selama proses pembuatan, kebersihan merupakan hal yang penting

untuk mencegah kontaminasi bakteri atau enzim proteolitik. Peralatan

yang digunakan selama pembuatan gelatin sebaiknya terbuat dari

stainless steel (Domb et.al., 1997).

2.3.3. Stabilitas

Gelatin kering disimpan dalam wadah kedap udara pada suhu

ruangan memiliki waktu simpan bertahun-tahun. Meskipun begitu, ia

terdekomposisi diatas suhu 100oC. Untuk pembakaran yang sempurna,

suhu yang diperlukan adalah 500oC. Ketika gelatin kering dipanaskan

pada udara yang relatif kelembabannya tinggi (sekitar 60% rh) dan

pada suhu yang sedang (diatas 45oC), secara berangsur-angsur ia akan

kehilangan kemampuan untuk mengembang dan melarut.

Bentuk larutan atau gel dari gelatin sangat rentan terhadap

pertumbuhan mikroba dan rusak oleh enzim proteolisis. Stabilitas pH

dan elektrolit gelatin akan turun dengan kenaikan suhu yang

disebabkan oleh hidrolisis (Domb et.al., 1997).

15


2.3.4. Karakteristik Kimia dan Fisika Gelatin

Gelatin memiliki bentuk yang kuat, seragam, jernih, dan fleksibel,

dimana dapat mengembang dan menyerap air (Domb et.al., 1997).

Gelatin komersial diproduksi pada berbagai rentang ukuran mesh,

mulai dari granul kasar sampai serbuk halus. Gelatin ini bersifat rapuh

dan berwarna kuning pucat. Gelatin kering komersial memiliki 9-13%

kelembaban dan tidak memiliki rasa, serta tidak berbau dengan berat

jenis antara 1.3-1.4 (Domb et.al., 1997; Gelatin Manufacturers

Institute of America, 2012).

Kebanyakan sifat fisika dan kimia gelatin diukur dalam bentuk

larutan dengan parameter sumber kolagen, metode pembuatan, kondisi

dan konsentrasi selama ekstraksi, suhu, pH, dan kemurnian bahan

kimia alami dan aditif (Domb et.al., 1997).

Kolagen dapat dipertimbangkan sebagai gelatin anhidrat.

Perubahan hidrolitik kolagen menjadi gelatin menghasilkan berat

molekul yang bervariasi, dimana masing-masing merupakan fragmen

dari rantai kolagen. Oleh sebab itu, gelatin merupakan campuran fraksi

yang terdiri atas asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida

menjadi polimer yang berat molekulnya bervarasi dari 15.000-400.000.

Larutan gelatin bersifat amfoter. Ia dapat bereaksi dengan

penambahan asam maupun basa. Dalam suasana asam, gelatin

bermuatan positif dan berubah menjadi kation. Begitu pula sebaliknya.

pH pada titik intermediet, dimana muatan totalnya adalah 0 dan tidak

terdapat pergerakan, dikenal sebagai titik isoelektrik. Gelatin tipe A

memiliki rentang isoelektrik yang luas, yaitu 7-9. Sedangkan gelatin

tipe B memiliki rentang isoelektrik dari 4.7-5.4 (Gelatin

Manufacturers Institute of America, 2012).

2.3.5. Pengaruh Sifat Kimia dan Fisik

a. Pembentukan Gel

Ketika larutan gelatin dengan konsentrasi yang besar (lebih dari

0.5%) didinginkan pada suhu 35-40oC, akan terjadi kenaikan

viskositas dan kemudian membentuk gel. Proses pembentukan gel

16


ini terjadi melalui tahap, yaitu (1) penyusunan ulang dari rantai

molekul, struktur heliks, atau lekukan kolagen; (2) penggabungan 2

atau 3 bagian membentuk kristalit; dan (3) stabilisasi struktur

dengan ikatan hidrogen rantai dalam pada area heliks. Perubahan

suhu gelatin ditentukan oleh titik beku atau titik leleh. Gelatin

komersial meleleh pada suhu 23-30oC dan membeku pada suhu 2-

5oC.

b. Solubilitas

Gelatin larut dalam air dan berbagai polihidrat alkohol, seperti

gliserin dan propilenglikol. Gelatin juga larut dalam pelarut dengan

kepolaran yang tinggi, seperti asam asetat, trifluoroetanol, dan

formamida. Gelatin praktis tidak larut dalam pelarut yang memiliki

kepolaran rendah, seperti aseton, karbon tetraklorida, etanol, eter,

benzene, dimetilformamida, dan kebanyakan pelarut nonpolar

(Domb et.al., 1997).

Gelatin larut dalam air hangat dan apabila didinginkan dibawah

suhu 30oC, larutan koloid ini akan membetuk gel dengan sifat

tiksotropik dan reversibel menjadi cair kembali apabila dipanaskan.

pH larutan atau gel gelatin akan berbeda tergantung tipenya yaitu

tipe A pH 3.8 – 5.5, sedangkan tipe B pH 5.0 – 7.5 (Rabadiya,

2013).

Gambar 2.5. Pengaruh Pemanasan atau Pendinginan terhadap

Struktur Gelatin (Sumber: www.nitta-gelatin.co.jp)

http://www.nitta-gelatin.co.jp/

17


c. Koaservasi

Merupakan fenomena penggabungan dengan koloid, dimana

partikel terdispersi terpisah dari larutan membentuk larutan fase 2.

Larutan gelatin membentuk koaservat dengan penambahan garam,

seperti natrium sulfat, khususnya pada pH dibawah titik isoionik.

Selain itu, larutan gelatin juga membentuk koaservat dengan

penambahan polimer atau makromolekul yang muatannya

berlawanan, seperti akasia. Sifat ini bermanfaat dalam

mikroenkapsulasi (Domb et.al., 1997).

d. Pengembangan

Sifat ini penting dalam disolusi kapsul farmaseutik. Komposisi

elektrolit dan pH mempengaruhi sifat pengembangan gelatin. Pada

pH yang lebih rendah dari titik isoelektrik, anion berperan

mengatur pengembangan, dan sebaliknya pada pH yang lebih

tinggi dari titik isoelektrik, kation berpern dalam mengatur

pengembangan. Pada kondisi 90% rh dan 20oC selama 24 jam,

pengembangan lapisan penyalut akan sangat berkurang (Domb

et.al., 1997).

2.3.6. Aplikasi Penggunaan Gelatin

Penggunaan gelatin didasarkan pada kombinasi berbagai sifat;

dapat atau tidaknya kembali menjadi bentuk transisi gel-menjadi-sol

dari larutannya; viskositas larutan hangatnya; kemampuan untuk

bertindak sebagai koloid pelindung; permeabilitas terhadap air, dan

ketidaklarutannya dalam air dingin, tetapi larut sempurna dalam air

panas. Gelatin juga merupakan protein yang bergizi. Sifat ini

dimanfaatkan dalam industri pangan, farmaseutik, dan industri

fotografi (Domb et.al., 1997).

Dalam industri pangan, gelatin digunakan sebagai gelatin dapat

digunakan sebagai gelling agent pada gummy, penstabil pada

marshmallow, pencegah kristalisasi gula pada manisan, pemberi

bentuk dan pengikat pada daging, dan emulgator pada produk susu.

18


Selain itu, gelatin juga digunakan sebagai koloid pelindung,

pembentuk lapisan film, pengental, dan agen perekat.

Dalam industri farmaseutik, penggunaan gelatin diperkirakan

sebesar 17% dari konsumsi gelatin di seluruh dunia. Penggunaan

gelatin ini telah dikenal sejak awal abad 19, yaitu sebagai komponen

pada cangkang kapsul keras dan kapsul lunak, granulasi, penyalut

tablet, dan enkapsulasi. Tidak hanya pada industri pangan dan farmasi,

gelatin juga dapat bermanfaat pada bidang fotografi yaitu sebagai

pelapis zat warna film (Gelatin Manufacturers Institute of America,

2012).

2.4. Deoxyribunucleic Acid (DNA)

Terdapat 2 jenis asam nukleat, yaitu asam deoksiribonukleat (DNA) dan

asam ribonukleat (RNA). DNA merupakan materi genetik yang diwarisi

organism dari induk atau orang tuanya. Suatu molekul DNA sangat panjang

dan umumnya terdiri atas ribuan gen. DNA dapat mengarahkan replikasinya

sendiri. DNA juga dapat mengarahkan sintesis RNA dan mengontrol sintesis

protein melalui RNA. Ketika sel bereproduksi dengan cara membelah, DNA

akan disalin dan diteruskan dari 1 generasi sel ke generasi sel berikutnya.

Informasi yang terkode dalam struktur DNA memprogram semua aktivitas sel

tersebut.

Gambar 2.6. Struktur dan Komponen Penyusun DNA (Sumber : serendip.brynmawr.edu)

DNA terdiri atas 2 untai polimer dari monomer nukleotida (basa) yang

membentuk struktur double helix. Masing-masing nukleotida terdiri atas 3

bagian, yaitu basa nitrogen (purin dan pirimidin), gula pentosa, dan gugus

fosfat. Antara nukleotida tersebut dihubungkan dengan ikatan kovalen yang

19


disebut ikatan fosfodiester, yaitu ikatan antara fosfat dengan gula pentosa

(Campbell, 2002).

Salah satu jenis DNA yang pada makhluk hidup adalah DNA mitokondria

(mtDNA), yaitu DNA rantai ganda yang berbentuk sirkuler yang tersimpan

dalam matriks mitokondria (Bandelt et. al., 2006). Ukuran mtDNA relatif

sangat kecil dibandingkan dengan ukuran DNA nukleus. Namun, mtDNA

mempunyai jumlah kopi yang tinggi, yaitu sekitar 1.000-10.000 kopi. Oleh

sebab itu, mtDNA dapat digunakan untuk analisis sampel dengan jumlah

DNA yang sangat tebatas (Hartati et. al., 2004)

2.5.Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan tahapan penting dalam proses bioteknologi.

Prinsip isolasi DNA adalah memisahkan DNA dari komponen-komponen sel

lain. Isolasi DNA dari organisme eukariotik dilakukan melalui 3 tahap utama,

yaitu proses penghancuran membran sel (lisis), pemisahan DNA dari protein

sel dengan cara pengendapan, dan purifikasi DNA (Muladno, 2010).

Pertama adalah tahap proses penghancuran membran sel (lisis). Semua

protokol isolasi dimulai dengan proses melisiskan sel. Proses ini dapat

dilakukan dengan menggunakan bahan denaturasi kuat, seperti detergen ionik,

garam guanidium, atau fenol-kloroform. Reagen ini akan melisiskan sel

bersamaan dengan mendenaturasikan protein (Greene dan Rao, 1998).

Membran terlebih dahulu dilisiskan dengan senyawa kimia yang dapat

mempengaruhui dinding sel, seperti lisozim, EDTA, dan SDS (Muladno,

2010). Kerja lisozim dalam melisiskan dinding sel adalah dengan memotong

senyawa polimer yang ada pada dinding sel. Kerja EDTA adalah dengan

mengikat ion magnesium yang bertugas menjaga struktur dinding sel dan juga

menghambat enzim lain yang akan memotong DNA. Sedangkan kerja SDS

(Sodium Dodecyl Sulphate) adalah dengan menghilangkan lipid pada dinding

sel. Pada tahap preparasi, pelisisan dilakukan pada suasana alkali (pH 12).

Pada keadaan ini, molekul DNA akan terfragmentasi dan terdenaturasi. Proses

pelisisan juga dapat dilakukan menggunakan metode fisika, misalnya dengan

20


kekuatan mekanik. Namun metode kimia lebih banyak digunakan (Sudjadi,

2008).

Kedua adalah tahap pemisahan DNA dari protein sel dengan cara

pengendapan. Protein pada sel dihancurkan dengan bantuan enzim proteinase

K. Enzim ini dapat memecahkan protein histon, sehingga DNA pun terurai.

Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan fenol (untuk mengikat

protein dan sebagian kecil RNA) dan kloroform (untuk membersihkan protein

dan polisakarida dari larutan). Umumnya ditambahkan dengan perbandingan

1:1. Kemudian dilakukan sentifugasi kembali untuk mengendapkan molekul

yang berat, kemudian DNA yang berada pada supernatan dipisahkan

(Muladno, 2010).

Ketiga adalah tahap purifikasi DNA. DNA yang telah dibersihkan dari

protein masih tercampur dengan RNA. Cara baku untuk menghilangkan

protein adalah dengan penambahan fenol atau campuran

fenol:kloroform:isoamil alkohol (50:49:1). Larutan organik ini akan

mengendapkan protein yang akan menggumpal pada batas antara fase air dan

fase organik. Isoamil alkohol berfungsi mencegah terjadinya emulsi.

Sedangkan untuk menghilangkan molekul RNA dari larutan, dapat digunakan

enzim RNAse yang akan mendegradasi molekul RNA (Sudjadi, 2008).

Dengan hilangnya protein dan RNA, maka DNA dapat diisolasi secara

utuh. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan

dengan cara presipitasi menggunakan etanol absolut dan larutan garam.

Dengan adanya larutan garam (kation monovalen seperti Na+), pada suhu -

20oC etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan baik, sehingga mudah

dipisahkan dengan cara sentrifugasi (Muladno, 2010).

Setelah semua tahapan isolasi dilakukan, perlu dilakukan penilaian

terhadap kemurnian DNA yang dihasilkan. Penilaian dapat dilakukan salah

satunya dengan menggunakan spektroskopi UV dan fluorometri. Untuk

memperkirakan kemurnian asam nukleat, digunakanlah rasio absorbansi pada

260 nm terhadap 280 nm (rasio A260/A280) atau rasio absorbansi pada 260 nm

terhadap 230 nm (rasio A260/A230) (Greene dan Rao, 1998; Kulkarni dan

21


Pfeifer, 2015). Jika rasio berkisar antara 1.8 sampai 2.0, artinya asam nukleat

yang diperoleh relatif murni (Greene dan Rao, 1998).

Selain menggunakan spektroskopi UV dan fluorometri, metode lain yang

dapat digunakan adalah elektroforesis agarosa. Metode ini dapat memastikan

adanya berat molekul DNA. Adanya noda (smear) pada hasil elektroforesis

menandakan bahwa sampel terdegradasi atau terkontaminasi (Kulkarni dan

Pfeifer, 2015).

2.6. Spektrofotometer UV untuk Pemeriksaan DNA

Spektrofotometer UV dapat digunakan untuk menghitung kadar dan

kemurnian asam nukleat. Spektrofotometer ini dapat mengukur yang sangat

kecil, yaitu sekitar 0.2-2 µl tanpa harus mengencerkan sampel terlebih dahulu.

Spektrum atau panjang gelombang yang dapat digunakan berkisar dari 220-

750 nm. Alat ini tidak membutuhkan kuvet dan peralatan sampel lainnya, serta

dapat dibersihkan dengan cepat. Pengukuran yang dilakukan oleh alat ini

sangat cepat, yaitu hanya beberapa detik. Namun, kontaminan dalam sampel

asam nukleat dapat mempengaruhi akurasi yang dihasilkan (Kennedy dan

Oswald, 2011).

Gambar 2.7. Spektrofotometer UV untuk Pemeriksaan DNA (Sumber: www.labtech.ie dan www.promarchive.com)

2.7. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan alat yang dapat melakukan

amplifikasi DNA yang dipilih pada daerah tertentu genom dengan bantuan

sekurangnya sepasang sekuens nukleotidanya (primer) yang telah diketahui

(Alberts et. al., 1989). PCR merupakan teknik analisis biologi molekular baru

untuk mereplikasi DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme

http://www.labtech.ie/

http://www.promarchive.com/

22


hidup. Teknik PCR ini membutuhkan jumlah molekul DNA yang sedikit

untuk kemudian diamplifikasi beberapa kali dalam fase eksponensial. Dengan

lebih banyak DNA yang tersedia, analisis yang dilakukan menjdi lebih mudah.

PCR biasanya digunakan dalam laboratorium medic dan biologi untuk tujuan

deteksi penyakit keturunan, diagnosis penyakit infeksi, identifikasi sidik jari

genetic, kloning gen, paternity testing, dan komputasi DNA (Rahman, et. al.,

2013).

Teknik ini dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1983. PCR dapat

menganalisis sampel dengan volume 10-200 µl dalam tabung reaksi kecil

(volume 0.2-0.5 ml) dalam thermal cycler. Di dalam thermal cycler, terjadi

reaksi pemanasan dan pendinginan kepada tabung untuk memperoleh suhu

yang dibutuhkan pada setiap langkah selama reaksi.

PCR digunakan untuk mengamplifikasi untai DNA yang pendek dan

bagian yang teridentifikasi, yaitu dapat berupa gen tunggal atau hanya bagian

dari gen. Berbeda dengan organism hidup, proses PCR dapat menyalin

fragmen DNA yang pendek, biasanya sampai 10 kb (kilo base pairs).

Beberapa metode tertentu dapat menyalin fragmen sampai ukuran 40 kb,

dimana ukuran tersebut lebih kecil daripada kromosom DNA pada sel eukariot

(Rahman et. al., 2013).

2.7.1. Komponen PCR

Beberapa komponen penting yang dibutuhkan dalam PCR adalah

DNA template, primer, enzim Taq Polymerase, deoxyribonucleaside

triphosphate (dNTP’s), dan dapar PCR.

a. DNA template atau cDNA

DNA template mengandung daerah fragmen DNA yang akan

diamplifikasi (Rahman et. al., 2013). Fungsi DNA template adalah

sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang

sama. DNA template dapat berupa DNA kromosom atau fragmen

DNA apapun yang mengandung fragmen DNA target yang dituju.

b. Primer

Primer dibutuhkan untuk menentukan awal dan akhir daerah

(batas) yang akan diamplifikasi dari fragmen DNA. Primer

23


merupakan untai DNA buatan yang terdiri atas tidak lebih dari 50

nukleotida (biasanya 18-25 bp) yang komplementer dengan urutan

nukleotida DNA template. Ia akan menempel ke DNA template

pada titik awal dan akhir, tepatnya ditempat DNA polymerase

terikat dan mulai mensintesis untai DNA baru. Selain itu, primer

menyediakan gugus hidroksi (OH-) pada ujung 3’ yang diperlukan

untuk proses pemanjangan DNA. (Rahman et. al., 2013; Handoyo

dan Rudiretna, 2000)

Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan rutan DNA

yang telah diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju. Data

urutan DNA atau protein bisa didapatkan dari data GenBank.

Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang dituju belum

diketahui, maka perancangan primer dapat didasarkan pada hasil

analisis homologi dari urutan DNA atau protein yang telah

diketahui mempunyai kekerabatan yang dekat.

Dalam perancangan primer, kriteria yang harus dipenuhi

adalah: (1) Panjang basa berkisar antara 18-30 basa. Jika terlalu

pendek dapat menyebabkan mispriming; (2) Komposisi primer

tersusun atas kandungan G+C (% jumlah G dan C) yang sama atau

lebih besar dari kandungan G+C DNA target. Hal ini disebabkan

karena primer dengan % G+C yang rendah diperkirakan tidak akan

mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif pada tempat

yang dituju; (3) Melting Point (Tm, temperatur dimana 50% untai

ganda DNA terpisah) yang dipilih akan berpengaruh dalam

pemilihan suhu annealing proses PCR. Penentuan Tm berkaitan

dengan komposis primer dan panjang primer. Perhitungan Tm

dilakukan dengan rumus [2(A+T)+4(C+G)]. Sebaiknya Tm primer

berkisar antara 50 – 65oC; (4) Interaksi primer-primer harus

dihindari, seperti cross-homology atau self-homology.

c. Enzim Taq polymerase

Taq polymerase dibutuhkan sebagai katalisator untuk reaksi

polimerisasi DNA yang diperlukan untuk tahap pemanjangan

24


DNA. Enzim ini diisolasi dari bakteri termofilik atau

hipertermofilik, sehingga bersifat termolabil sampai suhu 95oC.

Aktivitas Taq polymerase tergantung dari jenisnya dan asal bakteri

tersebut diisolasi. (Handoyo dan Rudiretna, 2000)

d. Nukleotida atau deoxyribonucleaside triphosphate (dNTP)

Nukleotida merupakan bahan dasar untuk membentuk DNA

baru yang bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan

dalam proses pemanjanan DNA (Rahman et. al., 2013). Ia terdiri

atas dATP, dTTP, dGTP, dan dCTP. dNTP akan menempel pada

gugus –OH pada ujung 3’ dari primer, kemudian membentuk untai

baru yang komplementer dengan untai DNA template.

e. Dapar dan MgCl2

Dapar dibutuhkan untuk menjaga pH medium tetap berada

pada pH yang sesuai agar proses PCR dapat berlangsung dan

menstabilkan enzim DNA polimerase. Sedangkan MgCl2 yang

menyediakan ion Mg2+

bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi

untuk menstimulasi aktivitas DNA polymerase. Dengan adanya

MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer dengan DNA

template yang membentuk kompleks larut dengan dNTP.

Umumnya dapar PCR sudah mengandung senyawa MgCl2 yang

diperlukan. Namun, lebih disarakan agar dapat PCR dan MgCl2

dipisahkan (Handoyo dan Rudiretna, 2000).

2.7.2. Tahapan PCR

Tahapan PCR melibatkan 5 tahap, yaitu (1) pradenaturasi DNA

template; (2) denaturasi DNA template; (3) penempelan primer pada

DNA template (annealing); (4) pemanjangan primer (extension), dan

(5) pemantapan (post-extension). Tahap (2) sampai (4) merupakan

tahapan berulang (siklus), dimana pada setiap siklus terjadi duplikasi

jumlah DNA. Tahapan PCR biasanya terdiri atas 20-35 siklus.

Penggunaan jumlah siklus yang terlalu banyak dapat meningkatkan

jumlah produk yang non target.

25


Gambar 2.8. Tahapan Proses PCR

(Sumber: www.flmnh.ufl.edu)

1. Pemisahan atau Denaturasi

Pada tahap ini, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua

untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang

tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa

yang komplemen. Enzim Taq polymerase diaktifkan pada tahap ini

(Rahman et. al., 2013). Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu

90-95oC selama 3 menit untuk meyakinkan bahwa molekul DNA

target yang ingin dilipatgandakan jumlahnya benar-benar telah

terdenaturasi menjadi untai tunggal. Untuk denaturasi berikutnya,

waktu yang diperlukan hanya 30 detik pada suhu 95oC atau 15

detik pada suhu 97oC.

Suhu denaturasi dipengaruhi oleh sekuen DNA target. Jika

DNA target kaya akan G-C maka diperlukan suhu yang lebih

tinggi. Hal ini disebabkan karena ikatan hidrogen pada G-C lebih

banyak dibandingkan ikatan A-T. Selain itu, suhu denaturasi juga

tidak boleh terlalu tinggi dan waktu denaturasi yang terlalu lama,

karena dapat mengakibatkan hilangnya atau berkurangnya aktivitas

enzim Taq polymerase (Sambrook et. al., 1989).

2. Penempelan (Annealing)

Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50-60oC. Dengan

terjadinya penurunan suhu, primer dapat menempel pada untai

http://www.google.com/url?sa=i&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0CAcQjB0&url=http%3A%2F%2Fwww.flmnh.ufl.edu%2Fcowries%2Famplify.html&ei=bgjGVJ32Dovz8QXokILACw&psig=AFQjCNFCm0NYa2cFqYJZBeYnx4QqMhHTHw&ust=1422350830369804

26


DNA tunggal (Rahman et. al., 2013). Primer akan menuju daerah

yang spesifik, dimana daerah tersebut memiliki komplemen dengan

primernya. Pada proses penempelan ini, ikatan hidrogen akan

terbentuk. Selanjutnya enzim Taq polymerase akan berikatan,

sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan

tidak akan putus kembali. Spesifisitas PCR sangat tergantung pada

suhu melting (Tm) primer. Temperatur penempelan yang digunakan

biasanya 5oC di bawah Tm (Sambrook et. al., 1989). Jika suhu yang

digunakan pada tahap penempelan ini tidak tepat, primer tidak

akan mengikat di DNA template atau terikat di bagian yang salah.

Waktu yang dibutuhkan untuk tahap ini adalah sekitar 1-2 menit

(Rahman, et. al., 2013).

3. Pemanjangan atau polimerasi (Extention)

Primer yang telah menempel pada DNA template akan

mengalami pemanjangan pada sisi 3' nya dengan penambahan

dNTP yang komplemen dengan template oleh DNA polimerase.

Umumnya reaksi pemanjangan (extension) atau polimerasi, terjadi

pada suhu 72-78oC. Hal ini disebaban karena suhu tersebut

merupakan suhu optimum untuk Taq polymerase. Kecepatan

penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72-78oC

diperkirakan antara 35 sampai 100 nukleotida per detik,

bergantung pada dapar, pH, konsentrasi garam, dan molekul DNA

target. Dengan demikian, untuk produk PCR sepanjang 2000

pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap

pemanjangan primer ini.

Jumlah siklus yang dibutuhkan untuk amplifikasi tergantung pada

jumlah salisan DNA template yang ada pada saat mulai reaksi dan

efisiensi pemanjangan dan amplifikasi primer. Produk DNA pada

siklus amplifikasi pertama akan menjadi cetakan pada siklus

berikutnya. Dibutuhkan sedikitnya 25 siklus untuk memperoleh tingkat

amplifikasi sekuens target yang diterima (Sambrook et. al., 1989).

Secara teori, hubungan kuantitatif antara jumlah awal sekuens target

27


(Xo) dan jumlah produk PCR setiap siklus (Xn) ketika fase

eksponensial adalah Xn = Xo (1+E)n

., dimana E adalah nilai antara 0

(tidak ada amplifikasi) atau 1 (setiap amplikon tereplikasi setiap

siklus) (Vaerman, et. al., 2004).

2.7.3. Real-Time PCR

Real-Time PCR juga dikenal sebagai quantitative real time

polymerase chain reaction (Q-PCR/qPCR) atau kinetic polymerase

chain reaction. Real-Time PCR adalah suatu metoda analisis yang

dikembangkan dari reaksi PCR. RT-PCR adalah suatu teknik

pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi sekaligus

mengkuantifikasi jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi

tersebut, yang bersifat sensitif, spesifik, dan reprodusibel untuk asam

nukleat (Vaerman et. al., 2004; Arya et. al., 2005).

Pada PCR konvensional, pengamatan hasil amplifikasi DNA

dilakukan menggunakan elektroforesis gel agarosa pada end-point

amplifikasi DNA tersebut. Sedangkan analisis menggunakan Real-

Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat

reaksi berlangsung. Keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati

pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari

probe (penanda). Pada Real-Time PCR pengamatan hasil tidak lagi

membutuhkan tahap elektroforesis. (Pranawaty et.al., 2012)

Konsentrasi awal sekuens target ditunjukkan sebagai fraksi jumlah

siklus (CT atau Cycle Theshold). Nilai ini dibutuhkan untuk

memperoleh adanya awal amplifikasi. Real-Time PCR tidak

terpengaruh terhadap berbagai variasi komponen dalam reaksi dan

kurang sensitif terhadap perbedaan efisiensi amplifikasi.

Kemampuan untuk menghitung amplifikasi DNA selama fase

eksponensial dihasilkan dengan mengembangkan ketelitian

menghitung sekuens target. Terdapat beberapa metode untuk

menegaskan spesifisitas produk amplifikasi, yaitu dengan melting

temperatures, probe oligonukleotida yang dilabelkan dengan

fluoresensi, metode TaqMan, hibridisasi probe.

28


Metode TaqMan menggunakan oligonukleotida yang menempel ke

sekuens internal dalam fragmen DNA yang diamplifikasi. Biasanya

oligonukleotida, yang terdiri atas 20-24 basa, dilabelkan dengan

fluorescent group pada ujung 5’ dan quencher group pada akhir 3’,

dimana mereka dibatasi oleh PO2, NH2, atau blocked base. Label

oligonukleotida tersebut ditambahkan bersama dengan primer untuk

mengamati perubahan amplifikasi sekuens target (Sambrook et. al.,

1989).

Gambar 2.9. Kerja Fluorescent Dye dan Quencher pada Real-Time

PCR (Sumber : www.isu.edu)

Hasil peningkatan fluorescent digambarkan melalui kurva

amplifikasi yang menunjukkan tiga fasa yaitu fasa awal, fasa

eksponensial atau puncak dan fasa plateau atau stabil (Vaerman,

2004).

Gambar 2.10. Bentuk Kurva Real-Time PCR

(Sumber: Arya et. al., 2005)


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisis Obat dan Pangan

Halal, Laboratorium Penelitian 2, dan Laboratorium Kimia Obat pada

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta dan Laboratorium Teknologi Gen, Balai Pengkajian

Bioteknologi-BPPT Serpong, Tangerang. Waktu pelaksanaan penelitian

dilakukan pada bulan Februari 2015 hingga Juni 2015.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah spatula, plastic

wrap, aluminium foil, termometer, api bunsen, mikropipet 0.5-10 µl; 2-

20 µl; 20-200 µl; dan 100-1000 µl [Bio-rad], mikropipet tip 10 µl; 200

µl; dan 1000 µl [Bio-rad], Tabung mikrosentrifugasi [Bio-rad], High

Pure Filter Tube [Roche], Collection Tube [Roche], Setrifugator

[Eppendorf Centrifuge 5417 R-Ogawa Seiki], Vortex [VM-300],

wadah cetakan, lemari pendingin, timbangan analitik, Waterbath

[Eyela], Moisture Balance Analyzer [Wiggen], satu set alat Real-Time

PCR [LightCycler® 480.0-Roche], dan Spektrofotometer UV [Bio

Drop]. Alat gelas yang digunakan yaitu beaker glass, erlenmeyer,

batang pengaduk, gelas ukur, pipet tetes, cawan penguap, tabung

reaksi, dan kaca arloji.

3.2.2. Bahan

Bahan yang diperlukan pada penelitian ini adalah Gelatin Sapi

[Sigma-Aldrich], Gelatin Babi [Sigma-Aldrich], sorbitol, pewarna

tartrazine, 5 sampel kapsul yang mengandung vitamin A dengan

produsen yang berbeda, satu set High Pure PCR Template Preparation

30


Kit (meliputi: Tissue Lysis Buffer, Proteinase K, Binding Buffer,

Inhibitor Removal Buffer, Wash Buffer, dan Elution Buffer) [Roche],

Aquabidest [Roche], Aquadest, Isopropanol [Merck], Etanol Absolut

[Merck], LC 480 TaqMan Probe Master (yang terdiri atas: FastStart

Taq DNA Polymerase, buffer, dNTP mix, MgCl2 6.4 mM) [Roche],

dan primer-probe dengan urutan basa seperti yang tertera dalam tabel

3.1.

Tabel 3.1. Urutan Basa Primer dan TaqMan Probe (Sumber : Tanabe et. al.., 2007)

Nama Primer Urutan Basa

Babi

Forward 5'-ATCTTGCAAATCCTAACAGGCCTG -3'

Reverse 5'-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3'

Probe 5'-(FAM)-CACAACAACAGCTTTCTCATCAGTTAC-(BHQ1)-3'

Sapi

Forward 5'-CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3'

Reverse 5'-CTACGTCTGAGGAAATTCCTGTTG-3'

Probe 5'-(FAM)-CATCATAGCAATTGCC-(BHQ1)-3'

3.3. Tahapan Penelitian

a. Pembuatan Cangkang Kapsul Simulasi Menggunakan Gelatin Babi dan

Gelatin Sapi

b. Pengumpulan Sampel

c. Identifikasi Gelatin pada Cangkang Kapsul Keras Sampel

d. Isolasi DNA Kontrol dan Sampel

e. Pemeriksaan Kadar dan Kemurnian Isolat DNA

f. Pemeriksaan Spesifisitas Primer dan Probe

g. Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR

h. Analisis Hasil

31


3.4. Prosedur Kerja

3.4.1. Pembuatan Lembar Cangkang Kapsul Simulasi Menggunakan Gelatin

Sapi dan Gelatin Babi (Widyaninggar et. al., 2012)

Tabel 3.2. Formulasi Lembar Cangkang Kapsul Keras

Bahan Jumlah

Gelatin 30%

Sorbitol 5%

Pewarna 0.05%

Aquadest Ad 100%

Sebanyak 9 gram gelatin sapi ditimbang dan dibasahi dengan 9 ml

air panas sambil diaduk perlahan sampai homogen. Kemudian

sebanyak 1.5 gram sorbitol dan 0.0015 gram pewarna ditambahkan,

lalu dicukupkan sampai 30 ml aquadest. Larutan dipanaskan dan

diaduk sampai semua gelatin larut dan larutan menjadi jernih. Larutan

tersebut kemudian dituang ke cetakan menjadi sebuah lapisan tipis.

Campuran diletakkan di dalam desikator untuk menjaga

kelembabannya. Pembuatan cangkang kapsul dari gelatin babi sama

dengan perlakuan seperti diatas.

3.4.2. Pengumpulan Sampel

Pengumpulan sampel dilakukan secara acak dengan mendata

produk vitamin yang mengandung vitamin A yang berbentuk cangkang

kapsul keras yang beredar di Indonesia berdasarkan ISO 2013/2014.

Diperoleh sebanyak 14 produsen produk vitamin yang mengandung

vitamin A yang berbentuk cangkang kapsul keras. Kemudian lima

produk vitamin yang berasal dari produsen yang berbeda diambil

secara acak. Pengambilan sampel ini dilakukan pada tanggal 08-20

April 2015. Masing-masing sampel diberi identitas seperti yang

terlihat dalam tabel 3.3.

32


Tabel 3.3. Identitas Sampel yang berasal dari Produsen yang Berbeda

No. Sampel Identitas

1 Produsen E A

2 Produsen I B

3 Produsen N C

4 Produsen Ei D

5 Produsen V E

3.4.3. Identifikasi Gelatin pada Cangkang Kapsul Keras Sampel (Anonim,

2013)

Larutan uji yang digunakan untuk uji identifikasi gelatin terdiri

atas larutan gelatin sebagai kontrol positif; air, larutan koloid HPMC,

dan larutan koloid natrium alginat sebagai kontrol negatif; dan larutan

cangkang kapsul sampel. Larutan gelatin dan larutan cangkang kapsul

sampel disiapkan dengan cara meleburkan gelatin dan cangkang kapsul

tersebut pada air hangat. Larutan koloid HPMC disiapkan dengan cara

melarutkan 0.1 gram serbuk HPMC dalam 10 ml aquadest panas

(90oC). Sedangkan larutan koloid natrium alginat disiapkan dengan

cara melarutkan 0.1 gram serbuk natrium alginat dalam 10 ml

aquadest.

Proses identifikasi dilakukan dengan cara mengambil sebanyak 2

ml masing-masing larutan uji, lalu menambahkannya dengan 0.05 ml

larutan CuSO4 0.7 M dan dihomogenkan. Kemudian sebanyak 0.5 ml

larutan NaOH 2 M ditambahkan kedalamnya. Jika timbul warna violet,

artinya sampel mengandung gelatin.

3.4.4. Isolasi dan Purifikasi DNA Kontol dan Sampel

a. Preparasi Daging Sapi dan Daging Babi (Rochea, 2008;

Erwanto et.al., 2012)

Sebanyak 50 mg daging sapi dan daging babi segar

dicincang halus dengan pisau steril. Masing-masing daging

tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifugasi.

Kemudian ke dalam tube tersebut ditambahkan 200 µl Tissue

33


Lysis Buffer dan 40 µl larutan Proteinase K. Campuran tersebut

divortex selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu 57oC selama

21 jam dalam waterbath. Selanjutnya larutan preparasi tersebut

siap untuk proses ekstraksi dan isolasi DNA.

b. Preparasi Gelatin, Simulasi Cangkang Kapsul, dan Sampel

(Rochea, 2008; Izzah dengan modifikasi, 2014)

Sebanyak 100 mg gelatin sapi dan gelatin babi, cangkang

kapsul simulasi sapi dan simulasi babi, serta cangkang kapsul

sampel kosong ditimbang dan ditambahkan air hangat

sebanyak 200 µl dan dimasukkan ke dalam tabung

mikrosentrifugasi. Kemudian ke dalam tube tersebut

ditambahkan 250 µl Tissue Lysis Buffer dan 50µl larutan

Proteinase K. Masing-masing campuran tersebut divortex

selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu 57oC selama 21 jam

dalam waterbath. Selanjutnya khusus pada larutan sampel,

dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm selama 30 menit karena

terbentuk endapan putih. Selanjutnya larutan preparasi tersebut

siap untuk proses ekstraksi dan isolasi DNA.

c. Isolasi DNA (Rochea, 2008; Izzah dengan modifikasi, 2014)

Larutan preparasi daging, gelatin, kapsul simulasi , dan

kapsul sampel yang didapatkan kemudian ditambahkan

sebanyak 200 µl untuk larutan preparasi daging dan sebanyak

230 µl larutan Binding Buffer. Campuran tersebut divortex

segera selama 20 detik dan diinkubasi pada suhu 70oC selama

10 menit dalam waterbath. Kemudian ke dalam tube tersebut

ditambahkan 150 µl isopropanol dan dihomogenkan dengan

vortex selama 20 detik. Campuran dipipet dan dimasukkan ke

dalam Filter Tube yang telah dipasangkan Collecting Tube.

Kemudian tube ditutup dan disentrifugasi dengan kecepatan

8000 rpm selama 1 menit.

Filter Tube dilepaskan dari Collection Tube dan cairan

yang melewati filter dibuang bersama dengan Collection Tube.

34


Filter Tube dipasangkan kembali dengan Collection Tube yang

baru. Kemudian 500 µl Inhibitor Removal Buffer ditambahkan

melalui penyangga atas Filter Tube dan disentrifugasi kembali

dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Filter Tube

dipasangkan kembali dengan Collection Tube yang baru.

Kemudian 500µl Washing Buffer ditambahkan dan

disentrifugasi dengan kecepatan 8000rpm selama 1 menit.

Pencucian dengan Washing Buffer dilakukan 2 kali.

Selanjutnya, Filter Tube dilepaskan dari Collection Tube dan

cairan yang melewati filter dibuang. Filter Tube dipasangkan

kembali dengan Collection Tube dan disentrifugasi kembali

selama 10 detik dengan kecepatan 12000 rpm agar semua

Washing Buffer terbuang dengan sempurna.

Setelah disentrifugasi, Collection Tube dipisahkan dengan

Filter Tube dan dibuang. Kemudian Filter Tube dipasangkan

dengan tabung mikrosentrifugasi steril. Ke dalam filter yang

berisi DNA daging sapi, daging babi, gelatin sapi, gelatin babi,

kapsul simulasi, dan kapsul sampel, masing-masing

ditambahkan 150 µl Elution Buffer hangat (70oC). Filter Tube

dan tabung mikrosentrifugasi yang telah ditambahkan Elution

Buffer disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1

menit. Filter Tube dilepaskan dari tabung sentrifugasi yang

telah berisi isolat DNA. Tabung mikrosentrifugasi tersebut

disimpan pada suhu 4 oC untuk dianalisis selanjutnya.

3.4.5. Pemeriksaan Kadar dan Kemurnian Isolat DNA Menggunakan

Spektrofotometer UV (Biodropb, 2012)

Alat dinyalakan dan panel Nucleid Acid dipilih untuk menentukan

konsentrasi dan kemurnian DNA. Sample port dibersihkan dengan tisu

steril. Sebanyak 2 µl Elution Buffer dituangkan di atas sample port dan

dianalisis sebagai blanko. Sample port kembali dibersihkan

menggunakan tisu steril. Identitas sampel dimasukkan pada kolom

Sample ID. Kemudian sebanyak 2 µl masing-masing DNA sampel

35


dituangkan di atas sample port secara bergantian. Kemudian tombol

Measure ditekan. DNA dianalisis pada panjang gelombang 260 nm

dan 280 nm. Hasil instrumentasi yang akan didapat adalah data

konsentrasi DNA dengan satuan ng/µl dan data kemurnian DNA

dengan perbandingan rasio A260 dan A280.

3.4.6. Pemeriksaan Spesifisitas Primer dan Probe (NCBI)

Uji spesifisitas primer dan probe dilakukan dengan melakukan

BLAST melalui database NCBI. Pada halaman “BLAST”, dipilih

menu “Nucleid Acid”. Kemudian pada kolom “Enter Query Sequence”

dimasukkan urutan basa primer yang akan diuji. Tombol “BLAST”

diklik. Data hasil pengujian yang didapat berupa daftar spesies yang

memiliki kemiripan 99-100% dengan urutan basa primer yang diuji.

3.4.7. Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR (Rocheb, 2005;

Rochec; Izzah dengan modifikasi, 2014)

Larutan primer dan probe disiapkan dengan konsentrasi 10 µM dari

larutan induk dengan konsentrasi 100 µM dan disimpan dalam sebuah

tube. Selanjutnya dalam tube berukuran 1,5 ml, sebanyak 15 µl PCR

Mix disiapkan dengan cara mencampurkan larutan yang terdiri atas:

1,4 µl aquabidest; 1,6 µl primer forward 10µM; 1,6 µl primer reverse

10 µM; 0,4 µl probe 10 µM; dan 10 µl LightCycler® 480 Probe

Master (enzim Taq DNA Polymerase, dNTP mix, dapar, dan 6.4 mM

MgCl2). Campuran dihomogenkan menggunakan micropipette dengan

cara up and down. Kemudian, sebanyak 5 µl isolat DNA yang akan

diuji dipipet ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan dan

ditambahkan sebanyak 15 µl PCR Mix yang telah dibuat. Multiwell

plate yang berisi campuran DNA yang akan diuji dan PCR Mix

tersebut ditutup dengan sealing foil yang akan mengeliminasi

penguapan pada suhu tinggi, kemudian diletakkan pada alat Real-Time

PCR. Semua proses pencampuran sampai pemipetan ke dalam

multiwall plate dilakukan pada tempat yang gelap. Tahap tersebut

dilakukan untuk masing-masing DNA daging babi, daging sapi, gelatin

36


sapi, gelatin babi, kapsul simulasi, dan kapsul sampel yang akan

diamplifikasi.

Program LightCycler® 480 Real-Time PCR yang akan digunakan

untuk mengamplifikasi DNA diatur dengan pengaturan seperti yang

tertera dalam tabel 3.4.

Tabel 3.4. Pengaturan Program Amplifikasi pada LightCycler® 480

Real-Time PCR

Jumlah Siklus Suhu (oC) Waktu

Pre Incubation 1 95 10 menit

Amplification 65 95 10 detik

60 1 menit

72 1 detik

Cooling 1 40 10 detik

3.4.8. Analisis Data

Analisis kandungan babi dan kandungan sapi pada cangkang

kapsul keras yang mengandung vitamin A dilakukan dengan melihat

hasil amplifikasi DNA pada Real-Time PCR. Jika DNA pada sampel

tertentu dengan primer babi dapat teramplifikasi, maka dapat

disimpulkan bahwa gelatin pada cangkang kapsul keras tersebut

berasal dari babi. Begitu juga sebaliknya, jika DNA pada sampel

tertentu dengan primer sapi dapat teramplifikasi, maka dapat

disimpulkan bahwa gelatin pada cangkang kapsul keras tersebut

berasal dari sapi.

Kurva amplifikasi dihasilkan dengan memplotkan jumlah siklus

secara horizontal dan nilai flouresen secara vertikal. Kurva ini

dihasilkan secara otomatis oleh RT-PCR. Dari kurva tersebut,

kemudian dilihat nilai Cp (Crossing Point) dari setiap isolat DNA yang

diuji. Adanya nilai Cp menunjukkan bahwa isolat DNA tersebut dapat

37


teramplifikasi. Cp adalah fraksi jumlah siklus dimana tingkat

amplifikasi yang tercermin dari adanya flouresensi mencapai threshold

(ambang). Tingkat ambang flouresensi diatur pada posisi yang sama

untuk semua reaksi yang sedang diamati (Vaerman et. al, 2004).


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Analisis Lembar Cangkang Kapsul Keras Simulasi

Cangkang kapsul simulasi dibuat dengan bahan utama gelatin, yaitu

gelatin sapi dan gelatin babi secara terpisah. Gelatin yang digunakan sebanyak

30%. Persentase gelatin ini sesuai dengan standar gelatin yang digunakan

dalam pembuatan cangkang kapsul keras, yaitu 30% (Gelatin Manufacturers

Institute of America, 2012). Sebagai plasticizer, digunakanlah bahan yang

berasal dari golongan gula, yaitu sorbitol. Bahan ini digunakan untuk

membuat cangkang kapsul keras tidak terlalu kaku dan dapat diambil dari

cetakan. Sorbitol yang digunakan adalah sebanyak 5%. Hal ini sesuai dengan

kadar yang ditentukan dalam Handbook of Pharmaceutical Excipients 6th

Edition untuk penggunaan sorbitol sebagai plasticizer untuk gelatin.

(a) (b)

Gambar 4.1. Lembar Cangkang Kapsul Keras Simulasi (a) Sapi dan (b) Babi

Lembaran cangkang kapsul keras simulasi yang dihasilkan berupa lapisan

tipis, berwarna kuning, dan dapat digulung. Berdasarkan gambar 4.1, terlihat

bahwa lembar cangkang kapsul simulasi sapi yang dihasilkan berwarna

kuning pucat dan lembar cangkang kapsul simulasi babi yang dihasilkan

berwarna kuning terang. Perbedaan warna ini disebabkan karena warna asal

dari gelatin sapi (berwarna kuning pucat) dan gelatin babi (berwarna putih)

yang digunakan.

Evaluasi yang dilakukan terhadap lembar cangkang kapsul keras simulasi

yang dibuat adalah mengukur kadar airnya menggunakan moisture balance

analyzer. Kadar air yang didapat adalah berkisar antara 10.6-15% untuk

39


cangkang kapsul keras simulasi sapi dan untuk cangkang kapsul keras

simulasi babi. Nilai ini memenuhi syarat sebuah cangkang kapsul keras, yaitu

10-15% (Anonim, 1995).

4.2. Proses Identifikasi Gelatin pada Cangkang Kapsul Keras Sampel

Sebelum dilakukan proses isolasi dan amplifikasi pada cangkang kapsul

dari produk yang beredar di Indonesia, terlebih dahulu dilakukan identifikasi

gelatin pada setiap cangkang kapsul sampel tersebut. Hal ini dilakukan untuk

memastikan bahwa cangkang kapsul yang akan diuji berasal dari gelatin.

Pengujian sumber bahan baku dilakukan dengan cara menambahkan

CuSO4 dan NaOH ke dalam larutan sampel (Anonim, 2013). Pengujian ini

disebut juga uji biuret, yaitu pengujian kandungan protein pada suatu sampel.

Uji ini dapat digunakan untuk uji identifikasi gelatin, karena pada dasarnya

gelatin adalah turunan protein yang diperoleh dari kolagen (Shyni et. al.,

2013). Artinya, gelatin juga mengandung ikatan peptida.

Gambar 4.2. Hasil Pengujian Sumber Bahan Baku Cangkang Kapsul

(1) Kontrol Positif; (2) Kontrol Negatif (A. Air, B. Na Alginat, C. HPMC); dan

(3)Sampel (A, B, C, D, E)

Larutan yang diuji terdiri atas larutan gelatin sebagai kontrol positif; air,

larutan koloid HPMC, dan larutan koloid natrium alginat sebagai kontrol

negatif; dan larutan cangkang kapsul sampel. HPMC dan natrium alginat

digunakan sebagai kontrol negatif, karena kedua bahan tersebut dapat

digunakan sebagai bahan baku cangkang kapsul keras pula (Al-Tabakha,

2010; Natalia, 2011). Pada air, larutan koloid HPMC, dan larutan koloid

40


natrium alginat tidak muncul warna violet. Sedangkan pada larutan gelatin dan

kelima larutan cangkang kapsul sampel muncul warna violet. Namun karena

cangkang kapsul sampel memiliki warna yang berbeda-beda, perubahan warna

violet agak sulit diamati. Berdasarkan proses identifikasi tersebut, dapat

disimpulkan bahwa kelima cangkang kapsul pada produk yang ingin diuji

berasal dari gelatin.

Uji biuret hanya dapat dilakukan untuk menguji sampel yang mengandung

lebih dari 2 ikatan peptida (Das, 2010). Gelatin mengandung lebih dari 2

ikatan peptida, sehingga uji ini dapat dilakukan untuk mengidentifikasi

gelatin. Setelah ditambahkan CuSO4 dan NaOH, larutan gelatin, dan larutan

cangkang kapsul sampel akan membentuk senyawa Cu kompleks yang

melibatkan nitrogen dari ikatan peptida dan oksigen dari air. Senyawa Cu

kompleks tersebut akan membentuk warna violet pada larutan (Das, 2010).

Fungsi NaOH pada proses uji tersebut adalah membuat suasana menjadi basa,

sehingga gugus amida pada larutan gelatin dan larutan sampel akan bersifat

nukleofilik dan dapat berikatan dengan ion Cu.

Gambar 4.3. Reaksi yang Terjadi pada Proses Identifikasi Gelatin (Sumber: people.uwplatt.edu)

4.3. Proses Isolasi DNA

Proses isolasi dibutuhkan untuk mendapatkan DNA dari setiap sampel

yang ingin diamplifikasi pada RT-PCR. Prinsip isolasi terdiri atas 3 tahap,

yaitu proses penghancuran membran sel (lisis), pemisahan DNA dari protein

sel dengan cara pengendapan, dan purifikasi DNA (Muladno, 2010).

Pada penelitian ini, isolasi dilakukan dengan menggunakan High Pure

PCR Template Preparation Kit yang diproduksi oleh Roche. Metode tersebut

dipilih karena memiliki beberapa keuntungan. Pertama, meminimalisir

41


hilangnya DNA pada proses isolasi. Kedua, meminimalisir waktu (jika

dibandingkan dengan cara manual yang harus menyiapkan berbagai reagen

terlebih dahulu). Ketiga, mengeliminasi penggunaan senyawa organik yang

berbahaya (seperti fenol dan kloroform) (Rochea, 2008).

Prinsip isolasi menggunakan High Pure PCR Template Preparation Kit

adalah melisiskan sel dengan bantuan chaotropic salt, kemudian mengikatkan

asam nukleat sel dengan silika yang ada pada filter tube dan mengelusinya

kembali dengan low salt elution (Rochea, 2008).

Proses isolasi dimulai dengan melisiskan membran sel. Proses

penghancuran membran sel ini dilakukan oleh Tissue Lysis Buffer (TLB). TLB

ini mengandung Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) yang dapat

mengikat ion magnesium (yang bertugas menjaga struktur dinding sel) dan

juga menghambat enzim lain yang akan memotong DNA (Sudjadi, 2008).

Setelah sel lisis, protein pada sel dihancurkan dengan bantuan enzim

proteinase K. Enzim ini dapat memecahkan protein histon, sehingga DNA pun

terurai (Muladno, 2010). Selanjutnya reagen lainnya ditambahkan secara

berturut-turut, yaitu Binding Buffer (BB) yang dapat membuat DNA

(bermuatan negatif) sehingga dapat teradsorpsi oleh silika dioksida

(bermuatan positif) yang terdapat pada filter tube; isopropanol yang berguna

untuk proses pemurnian DNA; Inhibitor Removal Buffer (IRB) yang berguna

untuk menghilangkan berbagai pengotor yang dapat menghambat proses PCR;

Washing Buffer (WB) yang berguna untuk mencuci chaotropic salt dan

pengotor lainnya; dan Elution Buffer (EB) yang berguna untuk mengelusi

DNA yang terikat pada silika (Roched, 2007). Masing-masing reagen

ditambahkan bersamaan dengan penggantian collection tube dan disusul

dengan proses setrifugasi.

Proses isolasi cangkang kapsul sampel dilakukan sama dengan proses

isolasi gelatin dan simulasi cangkang kapsul. Namun karena setelah inkubasi

21 jam terbentuk endapan putih, maka dilakukan proses sentrifugasi dengan

kecepatan 10.000 rpm selama 30 menit. Sentrifugasi dilakukan untuk

memastikan larutan sampel sudah terpisah secara sempurna dengan endapan

putih tersebut. Diperkirakan endapan putih yang berasal dari cangkang kapsul

42


sampel tersebut adalah TiO2. Hal ini disebabkan karena endapan tersebut

berwarna putih dan tidak larut air. Selain itu jika dilihat cangkang kapsul

sampel yang bersifat opaque (tidak transparan), dapat disimpulkan bahwa ada

penambahan opacifier. Salah satu opacifier yang sering digunakan adalah

TiO2 (Bhatt, 2007). Endapan tersebut harus dihilangkan terlebih dahulu karena

dapat menghambat proses PCR (Wan et.al., 2009).

Isolat DNA dari daging babi, daging sapi, gelatin sapi, gelatin babi,

simulasi cangkang kapsul sapi, simulasi cangkang kapsul babi, dan cangkang

kapsul sampel yang telah didapatkan kemudian dianalisis menggunakan

spektrofotometer UV.

4.4. Analisis Hasil Isolat DNA

Proses analisis hasil isolat DNA dilakukan menggunakan spektrofotometer

UV Biodrop. Kelebihan dari alat ini adalah dapat menganalisis isolat DNA

dengan volume yang sangat kecil, yaitu 2 µl (Biodropa, 2012). Hal ini sangat

berguna, dimana hasil isolat DNA yang didapatkan tidak banyak.

Prinsip kerja spektrofotometer UV adalah penyerapan cahaya atau energi

radiasi oleh suatu larutan. Jumlah cahaya atau energi radiasi yang diserap

memungkinkan pengukuran jumlah zat penyerap dalam larutan secara

kuantitatif (Triyati, 1985). Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang

260 dan 280, dimana DNA akan terabsorpsi kuat pada panjang gelombang 260

nm dan protein pada panjang gelombang 280 nm.

Kuantitas (kadar) dan kualitas (kemurnian) DNA yang diekstraksi dari

sampel dipengaruhi oleh berbagai faktor, seperti teknik sampling, ukuran

sampel, substansi penghalang, tingkat kerusakan, dan panjang fragmen DNA.

Faktor-faktor tersebut tergantung pada sampel itu sendiri, proses pembuatan

makanan, dan parameter fisik dan kimia dari metode ekstraksi (Branquinho et.

al., 2012).

Analisis hasil isolat DNA ini meliputi pemeriksaan kemurnian dan kadar

DNA. Data yang didapatkan dari pemeriksaan isolat DNA menggunakan

spektrofotometer UV dapat dilihat pada tabel 4.1.

43


Tabel 4.1. Hasil Kemurnian dan Kadar Isolat DNA yang Diperoleh

No. Isolat Kemurnian

(A260/A280) Kadar (ng/µl)

1 Daging Sapi 2.003 75.88

2 Daging Babi 1.882 59.74

3 Gelatin Sapi 1.695 48.77

4 Gelatin Babi 1.519 11.78

5 Simulasi Cangkang Kapsul

Keras Sapi 2.006 3.988

6 Simulasi Cangkang Kapsul

Keras Babi 1.31 4.224

7 Sampel A 1.589 2.693

8 Sampel B 1.843 4.372

9 Sampel C 1.854 4.342

10 Sampel D 1.725 2.617

11 Sampel E 1.697 2.435

Isolat DNA dikatakan murni atau bebas dari protein jika kemurniannya

berkisar antara 1.8-2.0 (Greene dan Rao, 1998). Jika kemurnian isolat DNA

lebih kecil dari 1.8 artinya isolat terkontaminasi oleh protein, sedangkan jika

kemurnian isolat DNA lebih dari 2 artinya senyawa guanidine-HCl yang

digunakan pada saat proses isolasi masih ada (Pranawaty et.al., 2012;

Branquinho et. al., 2012). Hasil kemurnian yang diperoleh dari setiap isolat

DNA kontrol adalah 2.003 untuk daging sapi; 1.882 untuk daging babi; 1.695

untuk gelatin sapi; 1.519 untuk gelatin babi; 2.006 untuk simulasi cangkang

kapsul sapi; dan 1.31 untuk simulasi cangkang kapsul babi. Sedangkan

kemurnian dari setiap isolat DNA sampel adalah 1.589 untuk sampel A; 1.843

untuk sampel B; 1.854 untuk sampel C; 1.725 untuk sampel D; dan 1.697

untuk sampel E. Isolat sampel A dan isolat sampel E dapat dikatakan murni,

karena memiliki kemurnian dalam rentang 1.8-2.0. Meskipun begitu, isolat

DNA yang memiliki kemurnian diatas 1.0 masih dapat diterima dan dapat

dilanjutkan ke proses amplifikasi pada RT-PCR (Kusumadewi et.al., 2012).

44


Hasil kadar yang diperoleh dari setiap isolat DNA kontrol adalah 75.88

ng/µl untuk daging sapi; 59,74 ng/µl untuk daging babi; 48.77 ng/µl untuk

gelatin sapi; 11.78 ng/µl untuk gelatin babi; 3.988 ng/µl untuk simulasi

cangkang kapsul sapi; dan 4.224 ng/µl untuk simulasi cangkang kapsul babi.

Sedangkan kadar dari setiap isolat DNA sampel adalah 2.693 ng/µl untuk

sampel A; 4.372 ng/µl untuk sampel B; 4.342 ng/µl untuk sampel C; 2.617

ng/µl untuk sampel D; dan 2.435 ng/µl untuk sampel E. Kadar simulasi

cangkang kapsul dan kadar sampel berkisar antara 2.0-4.5 ng/µl atau lebih

kecil jika dibandingkan dengan kadar gelatin dan daging. Hal ini disebabkan

karena pada simulasi cangkang kapsul dan sampel, gelatin yang digunakan

sebagai bahan baku telah mengalami berbagai proses yang dapat

menyebabkan degradasi DNA yang ada, seperti pemanasan pada suhu tinggi

(Demirhan et. al, 2012). Selain itu jika dibandingkan dengan DNA pada

daging yang belum mengalami proses pengolahan, kadar DNA pada gelatin

akan berjumlah lebih sedikit. Hal ini disebabkan karena gelatin telah

mengalami proses lebih lanjut dari bahan asalnya (kolagen) yang dapat

menyebabkan degradasi DNA (Puspitaningrum, 2014). Namun dengan jumlah

kadar tersebut, semua isolat DNA tetap dapat dilanjutkan untuk proses

amplifikasi menggunakan RT-PCR. Hal ini disebabkan karena RT-PCR cukup

sensitif dan dapat mendeteksi sampai dengan kadar 1 pg/ml (Cai et. al., 2011).

4.5. Amplifikasi Menggunakan Real-Time PCR

Isolat DNA yang didapat kemudian diamplifikasi menggunakan RT-PCR.

Proses amplifikasi DNA ini membutuhkan beberapa komponen, yaitu probe

dan sepasang primer; isolat DNA sebagai DNA template yang akan

diamplifikasi; enzim Taq Polymerase, buffer, MgCl2 dan dNTP (yang

terkandung dalam LC 480 Probe Master). Primer yang digunakan

diidentifikasi secara in silico dengan bantuan website BLAST NCBI.

Berdasarkan hasil BLAST, primer sapi yang digunakan spesifik hanya untuk

sapi (Bos taurus) (Lampiran 3). Sedangkan untuk primer babi, terdapat

beberapa spesies yang memiliki urutan pasang basa yang mirip, yaitu babi

(Sus scrofa), nyamuk (Phlebotomus perniciosus), dan landak afrika (Atherurus

45


africanus) (Lampiran 4). Namun jika dilihat dari spesies dan lokasi adanya

spesies tersebut, yang mungkin diambil bagian tubuhnya dan dijadikan sumber

gelatin hanya babi (Sus scrofa). Sehingga, primer tersebut dapat digunakan

untuk mendeteksi kandungan babi pada sampel.

Proses amplifikasi DNA dalam penelitian ini dilakukan dengan metode

Hydrolysis Probe. Prinsip kerja metode ini adalah berdasarkan flouresen yang

dihasilkan oleh reporter (FAM) yang sebelumnya diredam oleh quencher

(BHQ1). Metode Hydrolysis Probe ini dilakukan dalam 3 tahap, yaitu Pre-

Incubation yang berguna untuk mengaktivasi enzim polimerase yang

terkandung dalam LC 480 Probe Master, Amplifikasi dari DNA target yang

terdiri atas 3 proses (denaturation, annealing, extention), dan Cooling untuk

mengembalikan kondisi alat seperti semula. Masing-masing tahapan

membutuhkan suhu dan waktu yang berbeda-beda sesuai kondisi optimalnya.

Sebelum melakukan amplifikasi pada RT-PCR, harus disiapkan terlebih

dahulu PCR mix yang terdiri atas primer forward, primer reverse, probe, dan

LC 480 Probe Master sebanyak 15 µl untuk setiap isolat DNA yang ingin

diamplifikasi (perhitungan pembuatan PCR mix tertera pada Lampiran 5).

Gambar 4.4. Hasil Amplifikasi Isolat DNA sampel menggunakan Primer Sapi.

Keterangan: db = daging babi, gb = gelatin babi, sb = simulasi cangkang kapsul babi,

ds=daging sapi, gs = gelatin sapi, dan ss = simulasi cangkang kapsul sapi

46


Amplifikasi pada isolat DNA sampel menggunakan primer sapi dilakukan

sebanyak 65 siklus. Jumlah siklus yang digunakan cukup banyak, karena

kadar isolat DNA sampel kecil. Hal ini sesuai dengan pernyataan bahwa

semakin sedikit jumlah DNA yang akan diamplifikasi, maka siklus yang

dibutuhkan akan semakin banyak untuk mencapai Cp (Rochec, 2008).

Berdasarkan gambar 4.4, terlihat bahwa daging sapi, gelatin sapi, dan

simulasi cangkang kapsul sapi dapat teramplifikasi dengan nilai Cp untuk

daging sapi 13.87; gelatin sapi 29.64; dan simulasi cangkang kapsul sapi

30.97. Nilai Cp daging lebih kecil daripada gelatin dan simulasi cangkang

kapsul sapi disebabkan karena kadar daging yang lebih besar, yaitu 75.88. Hal

ini sesuai dengan penyataan bahwa semakin besar kadar DNA, maka semakin

kecil nilai Cp yang didapat. Begitu juga sebaliknya, semakin kecil kadar

DNA, maka semakin besar nilai Cp yang didapat (Rochec, 2008). Sedangkan

untuk cangkang kapsul sampel, dapat terlihat bahwa sampel E mengalami

amplifikasi dengan nilai Cp 57.82. Artinya, cangkang kapsul pada sampel E

mengandung gelatin sapi. Nilai Cp yang sangat tinggi pada sampel E dapat

disebabkan karena gelatin yang digunakan untuk formulasi cangkang kapsul

tersebut sedikit. Namun pada proses amplifikasi menggunakan primer sapi

tersebut, terjadi kenaikan positif untuk daging babi dengan nilai Cp 33.01. Hal

ini dapat disebabkan karena proses pengerjaan yang kurang baik, sehingga

terjadi kontaminasi.

Selanjutnya, amplifikasi pada isolat DNA sampel dilakukan menggunakan

primer babi sebanyak 65 siklus. Sama halnya dengan amplifikasi dengan

primer sapi, jumlah siklus yang digunakan cukup banyak karena kadar isolat

DNA sampel kecil.

47


Gambar 4.5. Hasil Amplifikasi Isolat DNA sampel menggunakan Primer Babi.

Keterangan: db = daging babi, gb = gelatin babi, sb = simulasi cangkang kapsul babi, ds =

daging sapi, gs = gelatin sapi, dan ss = simulasi cangkang kapsul sapi

Berdasarkan gambar 4.5, terlihat bahwa daging babi, gelatin babi, dan

simulasi cangkang kapsul babi dapat teramplifikasi dengan nilai Cp untuk

daging babi 13.57, gelatin babi 40.08, dan simulasi cangkang kapsul babi

43.51. Nilai Cp daging lebih kecil daripada simulasi cangkang kapsul

disebabkan karena nilai kadar daging yang lebih besar, yaitu 59.74. Hal ini

sesuai dengan penyataan bahwa semakin besar kadar DNA, maka semakin

kecil nilai Cp yang didapat. Begitu juga sebaliknya, semakin kecil kadar

DNA, maka semakin besar nilai Cp yang didapat (Rochec, 2008). Untuk

cangkang kapsul sampel, terlihat bahwa sampel B, sampel C, dan sampel E

dapat teramplifikasi dengan nilai Cp untuk sampel B 53.79, sampel C 31.72,

dan sampel E 50.83. Artinya, cangkang kapsul pada sampel C, sampel E, dan

sampel B mengandung gelatin babi.

Sampel A dan sampel D tidak mengalami amplifikasi menggunakan

primer sapi maupun primer babi. Artinya cangkang kapsul pada kedua sampel

tersebut tidak mengandung gelatin sapi ataupun gelatin babi, melainkan

48


berasal dari sumber gelatin lainnya seperti ikan atau unggas (Gelatin

Manufacturers Institute of America, 2012). Sedangkan untuk sampel E, ia

mengalami amplifikasi menggunakan primer sapi dan primer babi. Maka

dapat diartikan bahwa cangkang kapsul pada sampel E tersebut berasal dari

campuran gelatin sapi dan gelatin babi dengan komposisi gelatin babi lebih

banyak daripada gelatin sapi (dilihat dari nilai Cp). Hal ini dapat dilakukan

oleh suatu produsen dengan tujuan untuk mendapatkan kualitas cangkang

yang bagus dengan harga yang murah.

Amplifikasi menggunakan primer babi menghasilkan kurva yang kurang

baik (tidak sigmoid). Hal ini dapat disebabkan karena probe babi yang

digunakan sudah lama, sehingga kondisinya kurang bagus. Selain itu,

amplifikasi DNA sampel juga menghasilkan kurva yang kurang baik. Hal ini

dapat disebabkan karena DNA pada sampel tersebut sudah terfragmentasi

akibat proses pembuatan cangkang kapsul. Jika fragmentasi DNA terjadi,

jumlah produk amplifikasi dan efisiensi amplifikasi akan menurun. Dengan

kondisi DNA yang terfragmentasi, DNA templat yang akan dituju oleh primer

menjadi terbatas. Akibatnya proses amplifikasi akan semakin sulit (Edward

et.al., 1996).


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

1. DNA pada cangkang kapsul keras vitamin A dapat terisolasi dengan baik

menggunakan metode kit komersial. Kisaran kemurnian isolat DNA dan

kadar isolat DNA yang didapat masing-masing adalah 1.589 – 1.854 dan

2.435 – 4.372 ng/µl.

2. Kurva amplifikasi menggunakan primer sapi menunjukkan hasil positif

untuk daging sapi, gelatin sapi, simulasi cangkang kapsul sapi, dan sampel

E dengan nilai Cp secara berturut-turut adalah 13.87; 29.64; 30.97; dan

57.82. Namun terjadi hasil positif pada daging babi yang diduga

disebabkan oleh kontaminasi. Kurva amplifikasi menggunakan primer

babi menunjukkan hasil positif untuk daging babi, gelatin babi, simulasi

cangkang kapsul babi, sampel B, sampel C, dan sampel E dengan nilai Cp

secara berturut-turut adalah 13.57; 40.08; 43.51; 53.79; 31.72; dan 50.83.

3. Cangkang kapsul pada sampel B dan sampel C mengandung gelatin babi,

serta cangkang kapsul pada sampel E mengandung gelatin sapi dan gelatin

babi. Sedangkan untuk cangkang kapsul pada sampel A dan sampel D

belum teridentifikasi.

5.2. Saran

1. Perlu dilakukan proses optimasi isolasi cangkang kapsul keras lebih lanjut

untuk mendapatkan kemurnian yang ideal dan kadar yang lebih banyak.

2. Perlu dilakukan pencarian primer babi yang lebih spesifik yang benar-

benar hanya dapat mendeteksi spesies babi.

3. Perlu dilakukan proses optimasi amplifikasi menggunakan RT-PCR untuk

isolat DNA dari cangkang kapsul keras lebih lanjut agar mendapatkan

kurva amplifikasi yang lebih baik.


DAFTAR PUSTAKA

Abraham J. Domb, Joseph Kost, dan David M. Wiseman. 1997.Handbook of

Biodegradable Polymers. Netherlands: Harwood Academic Publishers

Al-Saidi, et. al... 2012. Fourier Transform Infrared (FTIR) Spectroscopic Study of

Extracted Gelatin from Shaari (Lithrinus Microdon) Skin: Effects of

Extraction Conditions. International Food Research Journal 19 (3): 1167-1173

Alberts et.al.. 1989. Molecular Biology of the Cell, Volume 1. New York:

Garland Publishing Inc.

Al-Tabakha, Moawia M..2010. HPMC Capsules: Current Status and Future

Prospects.UAE : J Pharm Pharmaceut Sci 13(3) : 428 - 442

Agustin, Agnes Triasih.2013.Gelatin Ikan: Sumber, Komposisi Kimia dan Potensi

Pemanfaatannya.Manado: Jurnal Media Teknologi Hasil Perikanan Vol 1 (2):

44-46

Aisyah et.al.. 2014. Poultry as an Alternative Source of Gelatin. Malaysia:

Health and The Environment Journal Vol 5 (1) : 27-49

Anonim.1995.Farmakope Indonesia Edisi 4. Jakarta : Departemen Kesehatan RI

Anonim.2013.US Pharmacopeial Convention – Revision Edition. USA : US

Pharmacopeial Convention Inc.

Ansel, Howard C..2008. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi Edisi 4. Jakarta: UI

Press

Arya et.al..2005. Basic Principles of Real-Time Quantitative PCR.London: Food

Drug Ltd. Vol 5(2) : 209–219

Atto.2008.ATTO Printgraph AE-6933 Operation Manual. Tokyo : ATTO Corp.

Azira et.al..2012. Differentiation of Bovine and Porcine Gelatins in Processed

Products Via Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

(SDS-PAGE) and Principal Component Analysis (PCA) Techniques. International Food Research Journal 19 (3): 1175-1180

Bandelt, Hans-Jürgen, Martin Richards, dan Vincent Macaulay.2006. Human

Mitochondrial DNA and The Evolution of Homo sapiens.Berlin : Springer

Bhatt, Bhawna. 2007. Pharmaceutical Technology : Capsules.India: Delhi

Institute of Pharmaceutical Science and Research

51


Biodropa. 2012. BioDrop™ μLITE dsDNA Application Note dari dari

http://www.biodrop.co.uk yang diakses pada 21 Januari 2015 pada pukul

20.36

BioDropb. 2012. Quick Start Guide dari http://www.biodrop.co.uk yang diakses

pada 28 Januari 2015 pada pukul 18.12

Biorad. 2012. Sub-Cell®

GT Agarose Gel Electrophoresis Systems : Instruction

Manual.Bio-Rad Laboratories, Inc.

Branquinho et. al..2012. Use of Real-Time PCR to Evaluate Two DNA Extraction

Methods from Food.Brazil: Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 32(1): 112-

118

Cai, H. et.al.. 2012. Realtime PCR Assays for Detection and Quantitation of

Porcine and Bovine DNA in Gelatin Mixtures and Gelatin Capsules. USA :

Journal of Food Composition and Analysis 25 : 83–87

Campbell, Neil A.. 2008. Biologi. Jakarta : Erlangga

Das, Debajyoti.2010.Biochemistry.Kalkota: Bimal Kumar of Academic Publishers

Demirhan Y, Ulca P, dan Senyuva HZ. 2012. Detection of Porcine DNA in

Gelatine and Gelatine-Containing Processed Food Products-Halal/Kosher

Authentication. NCBI Vol. 90 (3) : 686 – 689

Edward, M.G., Ann Bickel, dan Paul Weihs.1996.Effect of Highly Fragmented

DNA on PCR. USA : Oxford University Press Nucleid Acids Research Vol. 24

(24)

Erwanto et.al..2012. Pig Species Identification in Meatballs Using Polymerase

Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism for Halal

Aunthentication. Yogyakarta : International Food Research Journal 19 (3):

901-906

Gelatin Manufacturers Institute of America. 2012. Gelatin Handbook.

Massachusetts: Atlantic Gelatin / Kraft Foods Global Inc.

Greene, James J.dan Venigalla B. Rao. 1998. Recombinant DNA Principles and

Methodologies. New York: Marcel Dekker Inc.

Handoyo, Darmo dan Ari Rudiretna.2000.Prinsip Umum dan Pelaksanaan

Polymerase Chain Reaction (PCR).Surabaya: Unitas Vol 9 (1) : 17 – 29

Hartati, Yeni W., Maksum, Iman P..2010.Amplifikasi 0,4 kb Daerah D-Loop DNA

Mitokondria dari Sel Epitel Rongga Mulut untuk Keperluan Forensik.

Bandung : FMIPA-Universitas Padjajaran

http://www.biodrop.co.uk/

http://www.biodrop.co.uk/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Demirhan%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22098822

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ulca%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22098822

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Senyuva%20HZ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22098822

52


Hornstra, Gerard, et.al..2005. The Impact of Maternal Nutrition on the Offspring.

Switzerland: Karger

Izzah, Afifah Nurul.2014.Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode

Hydrolisis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Babi dengan

Menggunakan Real-Time PCR. Skripsi. Program Studi Farmasi. Fakultas

Kedokteran dan Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta.

Karnadi, Annisa.2014.Bulan Vitamin A. http://duniasehat.net/. Diakses pada

tanggal 28 April 2015

Kennedy, Suzanne dan Nick Oswald.2011. PCR Troubleshooting and

Optimization: The Essential Guide.UK: Caister Academic Press

Kulkarni, Shashikant dan John Pfeifer. 2015.Clinical Genomics: A Guide to

Clinical Next Generation Sequencing. USA: Academic Press

Kusumadewi, Arlene, Soekry Erfan Kusuma, Ahmad Yudianto.2012. Analisis

DNA Jaringan Lunak Manusia yang Terpapar Formalin dalam Interval

Waktu 1 Bulan Selama 6 Bulan pada Lokus D13S317 dengan Metode STR-

PCR.Suravaya: JBP Vol. 14 (2) : 115-121

Melia, Colin David.1983. Some Physical Properties of Gelatin Films in Relation

to Hard Capsule Production.Inggris: University of Nottingham

Muladno. 2010.Teknologi Rekayasa Genetika Edisi ke-2. Bogor : IPB Press

Natalia, D.. 2011. Pembuatan Cangkang Kapsul Alginat yang Mengandung

Pewarna Ponceau 4R dan Pengujian Sifat-Sifat Fisiknya.Medan : Universitas

Sumatera Utara

Otten, Jennifer J., et.al..2006. Dietary Reference Intakes: The Essential Guide to

Nutrient Requirements. USA: The National Academies Press

Pranawaty, Rina Novita, Ibnu Dwi Buwono, dan Evi Liviawaty. 2012. Aplikasi

Polymerase Chain Reaction (PCR) konvensional dan Real-Time PCR untuk

Deteksi White Spot Syndrome Virus pada Kepiting.Jurnal Perikanan dan

Kelautan Vol. 3 (4) : 61 – 74

Puspitaningrum, Yanti.2014.Deteksi DNA Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Pada

Simulasi Gummy Vitamin C Menggunakan Real-Time Polymerase Chain

Reaction untuk Analisis Kehalalan. Skripsi. Program Studi Farmasi. Fakultas

Kedokteran dan Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta.

Rabadiya, Bhavisha. 2013. A Review: Capsule Shell Material from Gelatin to Non

Animal Origin.IJPRBS Vol. 2(3) : 42 – 71

http://duniasehat.net/

53


Rahman et. al... 2013. Polymerase Chain Reaction (PCR): A Short Review.

Dhaka: AKMMC J Vol. 4(1) : 30-36

Republika.2014. Hari Ini, Islam Jadi Agama Terbesar di Dunia.

www.republika.co.id. Diakses pada tanggal 13 Januari 2014.

Riaz, Mian N.dan Muhammad M. Chaudry. 2004.Halal Food Production. USA:

CRC Press

Rizal, Subahar.2014. Pengaruh Pemberian Vitamin A Dosis Rendah terhadap

Respon Imun Sitokin Proinflamasi dan Antiinflamasi pada Ibu Hamil

Terinfeksi Ascaris Lumbricoides. http://fk.ui.ac.id/. Diakses pada tanggal 28

April 2015

Rochea.2008. High Pure PCR Template Preparation Kit : Rapidly Purify

Genomic DNA for Diverse Applications. Jerman : Roche Diagnostics GmbH

Rocheb.2005.LightCycler

® 480 Probes Master. Jerman : Roche Diagnostics

GmbH

Rochec.2008. LightCycler

® 480 Instrument Operator’s Manual : Software

Version 1.5. Jerman : Roche Diagnostics GmbH

Roched.2007. Nucleic Acid Isolation and Purification 3

rd Edition. Jerman : Roche

Diagnostics GmbH

Rowe, Raymond C., et. al.. 2009. Handbook of Pharmaceutical Excipients 6th

Edition. London : Pharmaceutical Press

Sambrook et. al.. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual Edisi 3. New

York: Cold Spring Harbour Lab. Press

Smith, Cindy J. dan A. Mark Osborn.2008. Advantages and Limitations of

Quantitative PCR (Q-PCR)-Based Approaches in Microbial Ecology.

Federation of European Microbiological Societies : Blackwell Publishing Ltd.

67 : 6 – 20

Shyni et.al.. 2013. Isolation and Characterization of Gelatin from The Skins of

Skipjack Tuna (Katsuwonus pelamis), Dog Shark (Scoliodon sorrakowah),

and Rohu (Labeo rohita). India: Elsevier Food Hydrocolloids 39 : 68-76

Syamsuni. 2006.Farmasetika Dasar dan Hitungan Farmasi.Jakarta: EGC

Tanabe, et.al.2007. A Real-Time Quantitative PCR Detection Method for Pork,

Chicken, Beef, Mutton, and Horseflesh in Foods. Jepang: Biosci. Biotechnol.

Biochem., 71 (12) : 3131–3135.

http://www.republika.co.id/

http://fk.ui.ac.id/

54


Tempo.2014.Tiap 1 Jam 1 Ibu Meninggal di Indonesia. http://www.tempo.co/.

Diakses pada tanggal 28 April 2015

Triyati, Etty.1985. Spektrofotometer Ultra-Violet dan Sinar Tampak Serta

Aplikasinya dalam Oseanologi.Jakarta: Pusat Penelitian Ekologi Laut,

Lembaga Oseanologi Nasional – LIPI Vol. 10 (1) : 39-47

Vaerman, J.L., P. Saussoy, I. Ingargiola. 2004. Evaluation of Real-Time PCR

Data. Belgium : Cliniques Saint Luc, Bruxelles

Wan, Weijie, John T.W. Yeow, dan Michele I. Van Dyke.2009.Effect of Silver

and Titanium Dioxide Nanoparticles on PCR Efficiency.Canada : 9th

IEEE

Conference on Nanotechnology : 458 - 461

WHO.2001.Human Vitamin and Mineral Requirements.Thailand: Food and

Nutrition Division

Widyaninggar, Amalia, et.al..2012. Differentiation Between Porcine and Bovine

Gelatin in Commercial Capsule Shells Based on Amino Acid Profiles and

Principal Component Analysis.Yogyakarta: Indonesian J. Pharm. Vol. 23 (2) :

96 – 101

Zhang, et.al..2009. Mass Spectrometric Detection of Marker Peptides in Tryptic

Digests of Gelatin: A New Method to Differentiate Between Bovine and

Porcine Gelatin.Elsevier: Food Hydrocolloids 23 : 2001–2007

Zhou, P. dan Regenstein, J. M. 2005. Effects of Alkaline and Acid Pretreatments

on Alaska Pollock Skin Gelatin Extraction. Journal of Food Science, 70(6):

C392–C396

http://www.tempo.co/


Lampiran 1. Alur Penelitian

spesifik

Evaluasi Simulasi

Cangkang Kapsul

Keras

Preparasi Isolasi

DNA dari Simulasi

Cangkang Kapsul

Keras

Mengumpulkan

Kapsul Keras

sebagai Sampel

Preparasi Isolasi DNA

dari Daging Babi,

Daging Sapi, Gelatin

Babi, dan Gelatin Sapi

Preparasi Isolasi

DNA dari Cangkang

Kapsul Keras

Sampel

Isolasi DNA

Pemeriksaan Kadar dan Kemurnian Isolat DNA Menggunakan

Spektrofotometer UV

Memenuhi Persyaratan

Amplifikasi DNA

Menggunakan Real-

Time PCR

Ya

Tidak

Analisis Data

Identifikasi Gelatin

pada Cangkang

Kapsul

Membuat Simulasi

Cangkang Kapsul

Keras

Pemeriksaan

Spesifisitas

Primer dan Probe

56


Lampiran 2. Spesifikasi Kit Isolasi DNA (Rochea, 2012)

Tabel 6. Spesifikasi High Pure PCR Template Preparation Kit

No. Nama Kandungan

1 Tissue Lysis Buffer 4M urea, 200 mM Tris, 20 mM NaCl,

200nM EDTA pH 7.4

2

Binding Buffer 6M guanidine-HCl, 10 mM urea, 10

mM Tris-HCl, 20% Triton X-100 (v/v).

pH 4.4

3 Proteinase K Proteinase K (rekombinan, PCR grade)

4 Inhibitor Removal

Buffer

5M guanidine-HCl, 20 mM Tris-HCl,

36% etanol absolut. pH 6.6

5 Washing Buffer 20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, 80%

etanol absolute (v/v). pH 7.5

6 Elution Buffer 10 mM Tris-HCl, pH 8.5

7 High Pure Filter Tube Berbahan polipropilen dengan filter

yang terbuat dari kapas fiber glass.

8 Collection Tube Berbahan polipropilen.

57


Lampiran 3. Uji Spesifikasi Primer Sapi Menggunakan BLAST NCBI

CCCGATTCTTCGCTTTCCATTTTATCCTTCCATTTATCATCATAGCA

ATTGCCATAGTCCACCTACTATTCCTCCACGAAACAGGCTCCAACA

ACCCAACAGGAATTTCCTCAGACGTAG

58


Lampiran 4. Uji Spesifikasi Primer Babi Menggunakan BLAST NCBI

a. Sus scrofa

ATCTTGCAAATCCTAACAGGCCTGTTCTTAGCAATACATTACACATCA

GACACAACAACAGCTTTCTCATCAGTTACACACATTTGTCGAGACGTA

AATTACGGATGAGTTATTCGCTATCTACATGCAAACG

b. Phlebotomus perniciosus

TCTTGCAAATCCTAACAGGCCTGTTCTTAGCAATACATTACACATCAG

ACACAACAACAGCTTTCTCATCAGTTACACACATTTGTCGAGACGTAA

ATTACGGATGAGTTATTCGCTATCTACATGCAAACG

c. Atherurus africanus

ATCTTGCAAATCCTAACAGGCCTGTTCTTAGCAATACATTACACATCA

GACACAACAACAGCTTTCTCATCAGTTACACACATTTGTCGAGACGTA

AATTACGGATGAGTTATTCGCTATCTACATGCAAACG

59


Lampiran 5. Campuran Reaksi PCR Mix untuk Proses Amplifikasi DNA

Tabel 7. Campuran Pereaksi PCR Mix untuk Setiap Isolat DNA

Konsentrasi

dalam PCR Mix

(µM)

Konsentrasi

Larutan Induk

(µM)

Volume yang

digunakan

(µl)

ddH2O - - 1.4

Primer Forward 0.8 10 1.6

Primer Reverse 0.8 10 1.6

Probe 0.2 10 0.4

LC 480 Probe

Master - - 10.0

DNA Template - - 5.0

Total Volume PCR Mix 20

60


Lampiran 6. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer dan Probe

a. Pembuatan larutan primer dengan konsentrasi 10 µM dari larutan induk

100µM

Maka, sebanyak 3 µl dari larutan induk 100 µM pada masing-masing

primer diambil dan di add 27 µl ddH2O (PCR water grade)

b. Pembuatan larutan primer dengan konsentrasi 0.8 µM dari larutan primer

10µM untuk setiap isolat DNA

Maka, sebanyak 1.6 µl dari masing-masing larutan primer 10 µM diambil

dan ditambahkan ke PCR mix.

c. Pembuatan larutan probe dengan konsentrasi 10 µM dari larutan induk

100µM

Maka, sebanyak 1 µl dari larutan induk probe 100 µM diambil dan di add

9 µl ddH2O (PCR water grade)

d. Pembuatan larutan probe dengan konsetrasi 0.2 µM dari larutan probe 10

µM untuk setiap isolat DNA

Maka, sebanyak 0.4 µl dari larutan probe 10 µM diambil dan ditambahkan

ke PCR mix.

61


Lampiran 7. Perhitungan Tm (Temperature Melting) Primer

a. Primer Sapi

- Primer forward = 2oC (2+8) + 4

oC (2+8)

= 60oC

- Primer reverse = 2oC (5+8) + 4

oC (6+5)

= 70oC

b. Primer Babi

- Primer forward = 2oC (7+6) + 4

oC (4+7)

= 70oC

- Primer reverse = 2oC (8+7) + 4

oC (6+3)

= 66oC

( ) ( )

62


Lampiran 8. Gambar Peralatan yang Digunakan dalam Penelitian

Satu Set Alat Real-Time PCR Moisture Balance Analyzer

Satu Set High Pure PCR Template

Preparation Kit Spektrofotometri UV (Biodrop)

Multiplate Well dan Sealing Foil LC 480 Probe Master

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ANALISIS...

Documents

Transcript of UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ANALISIS...