Tpc, Mpn, Uji Bonterey

TPC, MPN, Uji Bonterey

”TPC, MPN, UJI

BONTEREY”

Disusun Oleh :

KELOMPOK

SEKOLAH MENENGAH KEJURUAN NEGERI 13 BANDUNG

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA DAN TEKNIK KOMPUTER

JARINGAN

Jl. Soekarno-Hatta Km. 10 Telp/Fax. (022) 7318960 – 40286

E-mail : [email protected]

…..MAKALAH MIKROBIOLOGI

mailto:[email protected]


2008



Kata Pengantar

Puji serta syukur kami panjatkan atas rahmat dan karunia-Nya sehingga

kami dapat menyelesaikan makalah ini dengan penuh rasa tanggung jawab dan

tepat waktu dalam pengumpulannya.

Tujuan disusunnya makalah ini adalah untuk memenuhi salah satu tugas

mata pelajaran mikrobiologi, khususnya mengenai masalah pembelajaran

praktikum di semester 5 ini, mengenai TPC, MPN, dan Uji Bonterey dalam

metode analisa yang dilakukan, serta untuk menambah pengetahuan mengenai

Ilmu biologi/mikrobiologi.

Kami juga ingin mengucapkan terima kasih kepada semua pihak-pihak

yang telah membantu kami dalam penyusunan makalah ini.

Semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi kami khususnya selaku

penyusun dan bagi siapa saja yang telah membacanya pada umumnya. Akhir kata

tiada gading yang tak retak, demikian pula dengan makalah ini yang masih jauh

dari sempurna. Tak lupa kritik dan saran sangat kami harapkan demi

penyempurnaan di masa yang akan datang.

Bandung, Agustus 2009

Penyusun



Daftar Isi

Kata Pengantar …………………………………………………………….. i

Daftar Isi ………………………………………………………………….... ii

BAB I PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang ……………………………………………………. 1

1.2 Tujuan ……………………………………………………….……. 1

BAB II PEMBAHASAN

2.1. Perhitungan Mikroba dengan TPC ………………………………...

5

2.1.1 Pengenalan dasar Praktikum TPC……………………………. 9

2.1.2 Praktikum TPC (Angka Lempeng Total)…………………….. 11

2.2 Analisis Metode MPN ……………………………………………. 15

2.2.1 Analisis koliform metode MPN……………………………… 15

2.2.2 Praktikum MPN secara umum……………………………….. 18

2.2.3 Pengujian Escherichia coli…………………………………… 21

2.2.4 Analisis kualitas dan sanitasi air……………………………... 23

2.3 Uji Bonterey ……………………………………………………….. 26

2.3.1 Fermentasi karbohidrat………………………………………. 27

2.3.2 Uji IMVIC……………………………………………………. 33

2.3.3 Penggunaan citrat…………………………………………….. 44

BAB III PENUTUP

3.1. Kesimpulan ……………………………………………………….. 47

3.2. Saran ..........……………………………………………………….. 47

Daftar Pustaka ………………………………………………………........ 48

LAMPIRAN ......………………………………………………………… 49



BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk

berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Terdapat berbagai macam cara untuk

menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara

yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan

secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan

(preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung

(counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk

mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja

(viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada

cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran,

perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN metode), dan kalorimeter (cara

kekeruhan atau turbidimetri).

Tujuan dari analisa ini adalah agar siswa/pratikan mampu melakukan uji

bakteriologis terhadap air minum dengan metode MPN (Most Probable Number).

Pengujian bakteri koliform yang berasal dari cemaran tinja (faecal koliform)

secara serentak dengan uji penegasan yang menggunakan media BGLB, maka

dilakukan juga hal yang sama yaitu 1 ose kultur yang positif dari LST Broth atau

LB, dipindahkan ke dalam tabung EC medium yang baru. Semua tabung MC

medium yang telah diinokulasikan oleh kultur dari LST-Broth, kemudian

diinkubasikan pada suhu 45,5°C selama 24 jam dan hasil pembentukan gas

dicatat. Kerapatan bakteri faecal koliform diperkirakan dengan tabel MPN.

Diferensiasi bakteri koliform dapat diarahkan ke dalam reaksi IMVIC.

Berbagai macam uji mokrobiologis dapat dilakukan terhadap bahan pangan,

meliputi uji kuantitatif mikroba untuk menentukan daya tahan suatu makanan, uji

kualitatif bakteri patogen untuk menentukan tingkat keamanan dan uji indikator

untuk menentukan tingkat sanitasi makanan tersebut. Pengujian yang dilakukan



terhadap tiap bahan pangan tidak sama tergantung berbagai faktor, seperti jenis

dan komposisi bahan pangan, cara pengepakan dan penyimpanan serta

komsumsinya, kelompok konsumen dan berbagai faktor lainnya

a) Total Plate Count (TPC)

TPC (Total Plate Count) atau ALT (Angka Lempeng Total) dan sering

disebut juga sebagai PLT (Perhitungan Lempeng Total), digunakan dan dipakai

untuk uji cemaran mikro di Industri baik, itu industri makanan, kosmetik terutama

untuk bahan-bahan sampel yang berwujud padat dan cair, baik sampel alami atau

pun yang ada di dalam kemasan dari suatu produk.

Secara umum tujuan untuk dilakukan TPC ini adalah untuk menentukan

total mikroba yang ada pada suatu sampel (baik padat ataupun cair) dengan

metode pengenceran serial dan cawan tuang, dimana pengenceran serial ini

merupakan proses pengenceran yang dilakukan dalam beberapa tahap kali

pengencerannya, sedangkan setelah dilakukan proses pengenceran, maka akan

dituangkan ke dalam cawan petri untuk dilakukan proses analisa lebih lanjut, yaitu

tahap inkubasi dan proses perhitungan jumlah mikroba.

Penghitungan jumlah mikroorganisme dengan cara viable count atau disebut

juga sebagai standar plate count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel

mikroorganisme yang hidup di dalam suspensi, akan tumbuh menjadi 1 (satu)

koloni setelah diinkubasikan di dalam media biakan dan lingkungan yang sesuai.

Setelah masa inkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan

perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut.

Penghitungan jumlah mikroorganisme hidup (viable count) adalah jumlah

minimum mikroorganisme. Hal ini disebabkan oleh koloni yang tumbuh pada

lempengan agar merupakan gambaran mikroorganisme yang dapat tumbuh dan

berbiak di dalam media dan suhu inkubasi tertentu. Sebagai contoh, sampel tanah

mungkin mengandung bakteri yang bersifat aerobik dan anaerobik. Jika suspensi

yang berasal dari sampel tanah ini ditumbuhkan dalam keadaan aerob, maka

hanya mikroorganisme yang bersifat aerob dan aerob fakultatif saja yang dapat

tumbuh, sedangkan mikroorganisme anaerob tidak dapat tumbuh. Bila media



biakan tidak mengandung biotin, maka hanyalah mikroorganisme yang tidak

memerlukan biotin saja yang dapat tumbuh, sedangkan mikoorganisme yang

memerlukan biotin sebagai faktor pertumbuhan tidak dapat tumbuh. Berdasarkan

hal tersebut, media biakan dan lingkungan pertumbuhan dapat diatur sehingga

hanya mikroorganisme tertentu saja yang dapat tumbuh. Metode seleksi ini lazim

digunakan untuk mengisolasikan mikroba patogen di dalam air, makanan, dan

spesimen penyakit-penyakit tertentu.

b) Most Probable Number (MPN)

Metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas mikrobiologi air

dalam praktikum digunakan kelompok koliform sebagai indikator. Kelompok

koliform mencakup bakteri yang bersifat aerobik dan anaerobik fakultatif, batang

Gram negatif, dan tidak membentuk spora.

Metode MPN ini digunakan untuk menguji kualitas air yang dianalisis di

dalam suatu langkah pengerjaan metode analisa, dengan proses perhitungan total

bakteri yang melibatkan bakteri Esherichia coli, sampel yang digunakan adalah

sampel air yang diujikan, dan apabila terdapat bakteri E.coli di dalam sampel air

tersebut, maka dapat dinyatakan bahwa sampel air tersebut telah terkontaminasi

oleh bakteri E.coli, yang berasal dari kotoran, baik itu kotoran yang berasal dari

kotoran manusia, maupun hewan.

Pada dasarnya MPN ini didasarkan pada ada tidaknya bakteri Escherichia

coli dalam suatu sampel air yang kita analisa. Apabila tedapat bakteri Escherichia

coli. Dan jenis koliform lainnya maka dapat disimpulkan bahwa air tersebut telah

terkontaminasi oleh bakteri E.coli yang mungkin saja berasal dari kotoran-kotoran

yang dikeluarkan oleh manusia atau pun hewan dari hasil pencernaan yang

dilakukan oleh tubuhnya.

c) Uji Bonterey

Secara garis besar dan umum, uji bonterey dapat diartikan sebagai proses

uji ada tidaknya aktivitas yang ditimbulkan oleh suatu mikroba melalui



penguraian suatu zat oleh aktivitas mikroba/bakteri yang dikenal dengan nama

reaksi fermentasi dari suatu sampel.

Terdapat beberapa uji biokimiawi dan mikrobiologi yang diperlukan untuk

proses identifikasi suatu mikroorganisme, baik yang dikenal maupun yang tidak

dikenal, diantaranya adalah :

1) Uji IMVIC ( Indol – Methyl-red – Voges-Praskuaer – Citrate).

2) Uji Fermentasi Karbohidrat

3) Uji Oksidase dan uji katalase

4) Hidrolisis urea

Proses pengujian yang dilakukan ini pada dasarnya adalah untuk

menganalisis ada tidak aktivitas mikroba di dalamnya. Hal ini yang menunjukna

layak tidaknya suatu bahan, baik itu makanan atau minuman, bahkan bahan-bahan

yang lain untuk dapat diproduksi dan dipasarkan, karena tidak semua bahan-bahan

yang telah terdapat di masyarakat berkualitas baik.

Uji-uji yang dilakukan didasarkan pada metode analisa dasar

mikroorganisme melalui kegiatan praktikum mikrobiologi dan analisa terhadap

suatu bahan, baik dengan menggunakan alat-alat instrumen maupun dengan

menggunakan alat-alat analisa seadanya dengan proses pengerjaan yang aseptis

sebelumnya. Metode dasar yang digunakan ini umumnya sama halnya dengan

praktikum uji dari suatu bahan di lab-lab klinis, dengan mengetengahkan

pengadaan mikroba dalam lingkungan masyarakat.

1.2 Tujuan

1. Mampu memenuhi salah satu tugas mata pelajaran mikrobiologi, yakni

pembuatan makalah tentang TPC (Total Plate Count), MPN (Most

Probable Number), dan Uji Bonterey (Uji Identifikasi Mikroba), tepat

waktu dalam pengumpulannya.

2. Pemahaman tentang pola pengajaran di dalam praktikum dengan referensi

yang tepat, dalam pelaksanaannya



BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Perhitungan Mikroba dengan TPC

Dalam proses penentuan pertumbuhan dari suatu mikroba, yaitu baik dalam

pembuatan kurva prtumbuhan atau pun dalam penyajian yang lain, sebelumnya

dilakukan dahulu proses perhitungan. Cara perhitungan yang paling umum

dilakukan didalam metode praktikum mikrobiologi ini adalah dengan cara proses

pengenceran. Proses analisa yang dilakukan tentu saja dengan metode pengerjaan

yang aseptis, karena yang dibutuhkan hanyalah pertumbuhan dari suatu mikroba,

dari dalam sampel yang kita preparasikan untuk kegiatan praktikum bukan dari

luar bahan yang kita siapkan.

Metode Pengencerannya :

Dengan pengenceran, disiapkan beberapa buah tabung yang berisi aqua-des

steril sebanyak 9 mL. Kepada masing-masing tabung kemudian ditambahkan 1

mL sampel yang mau diperiksa secara bertahap, yaitu :

a) 1 mL sampel ke dalam tabung pertama, hingga konsentrasi larutan di

dalam tabung pertama menjadi 10-1.

b) 1 mL dari tabung pertama dimasukan ke dalam tabung kedua, hingga

konsentrasi larutan di dalam tabung kedua menjadi 10-2.

Dan seterusnya sampai mencapai larutan dengan konsentrasi terendah, hal

ini dimaksudakan untuk proses pengenceran dari suatu sampel, sehingga nanti

tidak akan menyulitkan di dalam proses pengamatan mikroba dari sampel yang

sedang kita analisis. Karena pada dasarnya sampel yang kita analisis ini, belum

tentu memiliki jumlah mikroba yang sedikit pada awalnya, tetapi hampir

dipastikan dan diyakini, bahwa pada awal preparasinya, suatu sampel akan

membawa jumlah mikroba yang cenderung memiliki jumlah yang banyak, apalagi



jika sampel yang kita bawa dari bahan alami, yaitu jenis sampel terbuka, berbeda

dengan sampel tertutup, karena hal ini pasti dibedakan tergantung dari jenis

sampel yang sedang kita analisis.

Dari tiap-tiap tabung kemudian diambil 1 mL larutan dan ditanamkan ke

dalam cawan petri berisi media pdat. Pertumbuhan koloni yang timbul pada tiap-

tiap cawan, dihitung. Di dalam cawan petri ini harus diperhitungkan faktor

kerapatan pertumbuhan koloni. Karena kalau pertumbuhan terlalu rapat, biasanya

sulit untuk dipertanggung-jawabkan hasil yang telah di dapat. Juga untuk

pertumbuhan yang terlalu jarang, sehingga diperlukan adanya pemilihan cawan

yang ditumbuhi koloni yang paling tinggi kemungkinannya untuk dihitung. Dan

hal yang perlu dicatat pengenceran ini dilakukan untuk mempermudah proses

pengamatannya juga, karena semakin encer sampel suatu larutannya, maka

kemungkinan untuk tumbuhnya pun semakin besar, dan mikroba yang tampak

pun akan semakin sedikit.

Dari gambaran di bawah ini terlihat jelas bahwa cawan yang paling

memungkinkan untuk dihitung adalah cawan yang diisi pengenceran 10-3

(1/1.000) yang menghasilkan jumlah koloni 159 sel. Sehingga perhitungan

menjadi :

159 x 103 = 1,59 x 105 sel/mL

dimana,

159 = jumlah koloni pada cawan tersebut.

103 = pengencaran yang dihitung.

Cara pemgenceran berikutnya lebih diperjelas, sehingga pertumbuhan koloni

mana yang dapat dipergunakan untuk perhitugan dan mana yang tidak digunakan,

juga dengan jelas akan menjadi nampak. Proses yang dilakukan secara aseptis ini

bertujuan agar semua mikroba yang kita analisis, kerena bisa saja apabila analisis

dan proses pengerjaannya tidak dilakukan dengan langkah pengerjaan yang

aseptis, mikroba yang akan tercampurkan akan terambil dari mana saja, di luar

dari sampel yang kita ujikan.



(Gambar. Cara perhitungan jumlah mikroba dengan pengenceran)

adapun metode yang lain dan dapat digunakan :

Gambar. cara perhitungan dengan pengenceran sederhana



Untuk menentukan jumlah bakteri dapat digunakan beberapa cara pengerjaan :

1) Jumlah bakteri secara keseluruhan (total cell count). Pada cara ini

dihitung semua bakteri baik yang hidup maupun yang mati.

2) Jumlah bakteri yang hidup (viable count). Cara ini hanya

menggambarkan jumlah sel yang hidup, sehingga lebih tepat bila

dibandingkan teknik pada total cell Count.

Perhitungan bakteri secara keseluruhan.

a. Menghitung Langsung secara Mikroskopik

Pada cara ini dihitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil.

Untuk ini digunakan kaca obyek khusus yang bergaris (Petroff-Hauser) berbentuk

bujur sangkar. Jumlah cairan yang terdapat antara kaca obyek dan kaca penutup

mempunyai volume tertentu, sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur

sangkar juga tertentu.

Pembesaran yang digunakan untuk melihat bakteri membatasi volume cairan

yang sedang diperiksa. Hanya cairan yang mengandung bakteri dalam jumlah

tinggi yang dapat menggunakan cara seperti ini. Selain menghitung secara

langsung dengan mata, dapat pula digunakan alat penghitung elektronik Coulter

Counter. Dengan alat ini dihitung semua benda yang memiliki ukuran diameter

30 µm, sehingga cairan yang akan dihitung jumlah bakterinya haruslah benar-

benar hanya mengandung bakteri.

b. Menghitung dengan cara kekeruhan

Cara ini menggunakan spektrofotometer atau nefelometer. Dasar teknik ini

adalah banyaknya cahaya yang diabsorpsi sebanding dengan banyaknya sel

bakteri pada batas-batas tertentu. Cara ini dilakukan untuk mengaplikasikan

segala macam keterampilan yang dimiliki dalam metoda penghitungan jumlah

mikroba yang hidup di dalam suatu sampel yang sedang kita analisis, tetapi juga

haruslah hati-hati di dalam proses pengerjaannya, alangkah lebih bermanfaatnya

jika dilakukan di dalam tahap pengerjaan yang baik.



2.1.1 Pengenalan dasar praktikum TPC (Total Plate Count)

Kegiatan praktikum TPC ini bertujuan untuk menentukan total mikroba yang

ada pada suatu sampel (baik sampel yang padat maupun yang cair) dengan metode

pengenceran serial dan cawan tuang. Dimana pengenceran serial ini dimaksudkan

agar proses pengamatan lebih mudah, karena koloninya lebih sedikit dalam cawan

petri yang diamati. Juga hal ini bertujuan untuk memenuhi syarat perhitungan

dalam data statistik yang telah ditetapkan secara pasti.

Dimana syarat perhitungannya adalah :

Jumlah koloni yang masuk ke dalam perhitungan adalah koloni dengan jumlah

anatara 30 – 300 koloni mikroba dari sampel. Hal ini dimaksudkan agar

sesuatu dengan data statistik.

a. Jenis-jenis sampel untuk TPC

1) Sampel cairan (co : sirup, susu, macam minuman)

2) Sampel serbuk (co : susu bubuk)

3) Sampel kental (co : kecap)

4) Sampel padat (co : biskuit)

5) Sampel beku (co : daging beku)

Cat : pada sampel padat preparasi yang dilakukan adalah darus ditimbang terlebih

dahulu, baru dilakukan proses pelarutan dengan bantuan pemanasan.

b. Pelarut yang digunakan

1) Air steril

2) Peptone water (Pw)

3) Buffered Peptone Water (Bpw)

4) Buffered Distilled Water (BDw)

5) Phosphat Buffered Distilled Water (PBDw)

Cat : hal yang harus dilakukan adalah gunakan pelarut baik yang dapat melarutkan

sampel, tetapi apabila sampel tidak dapat larut baik, maka cukup dilarutkan

menjadi suspensinya saja.



c. Pengencer dan media yang digunakan

1) Pengencernya adalah air steril sebanyak 9 mL di dalam tabung-tabung

reaksi yang dipersiapkan untuk proses pengenceran.

Cat : Jumlah pengencer ini dipengaruhi oleh asal atau jenis sampel ada 2 macam asal

sampel, yaitu :

a) Sampel yang kontaminasinya besar yaitu bahan-bahan alami, dan berasal

dari tempat terbuka, contoh : gorengan, buah-buahan di pinggir jalan,

makanan terbuka. Pengenceran yang dilakukan dari 100 s/d 10-7 atau lebih.

b) Sampel yang kontaminasi sedikit, berasal dari bahan-bahan yang sudah

dikemas dan pastinya tertutup.contoh : makanan dalam kemasan dan ber-

merk, frutang, air aqua. Pengenceran dilakukan sampai 10-4 atau 10-5.

2) Media yang digunakan adalah media PCA (Plate Count Agar)

Tahapan pembuatannya :

1. Menghitung kebutuhan massa

2. Menimbang massa media padat

3. Melarutkan (bantuan pemanasan)

4. Mengecek pH media dalam larutan

5. Mengukur kebutuhan media

6. Membungkus media dalam larutan

7. Sterilisasi media.

d. Preparasi sampel untuk TPC

Preparasi yang dilakukan baik sampel padat maupun cair adalah dengan

alat-alat yang steril tentunya.

Preparasi untuk sampel cair

1) Mensterilkan seluruh permukaan kemasan dari bahan atau sampel dengan

menggunakan kapas beralkohol di lap.

2) Melakukan sampling secara aseptis dengan wadah steril.

3) Mesterilkan wadah atau kemasan.

4) Menghomogenkan sampel (supaya mikroba rata di semua sampel bahannya)

5) Memipet secara aseptis.

6) Melakukan tahapan pengerjaan selanjutnya.

Preparasi untuk sampel padat (berlaku juga untuk yang kental)



1) Menyediakan kertas alumunium foil untuk sampling.

2) Membungkus sampel atau bahan padat dengan kertas AF.

3) Melakukan sampling secara aseptis.

4) Mensterilkan wadah atau kemasan yang diperlukan.

5) Menghomogenkan atau menghaluskan secara aseptis yaitu dengan cara

blender atau menumbuknya).

6) Menimbang secara aseptis sampel yang telah dipreparasikan.

7) Melarutkan secara aseptis (dekat api, dan jika perlu lakukan proes

pemanasan).

8) Memipet sampel secara aseptis.

9) Melakukan langkah pengerjaan analisis praktikum selanjutnya.

Catatan penting :

Pada langkah pengerjaan praktikum TPC hal yang paling utama dilaksanakan

adalah melakukan semua pekerjaan secara aseptis dan menyelesaikan semua

metode pemipetan dari botol sampel ke tabung-tabung, dan ke dalam cawan petri

setelah itu daru menambahakan 15 mL PCA suhu 45ºC - 50ºC.

2.1.2 Praktikum TPC (Angka Lempeng Total)

Prinsip Pengerjaan

Pertumbuhan mikroorganisme aerob dan anaerob (psikrofilik, mesofilik dan

termofilik) setelah contoh diinkubasikan dalam media agar pada suhu 35°C ± 1°C

selama 24 jam 48 jam ± 1 jam mikroorganisme ditumbuhkan pada suatu media

agar, maka mikroorganisme tersebut akan tumbuh dan berkembang biak dengan

membentuk koloni yang dapat langsung dihitung. Penentuan Angka Lempeng

Total dapat dilakukan dengan dua cara. Pertama, metoda cawan agar tuang/pour

plate yaitu dengan menanamkan contoh ke dalam cawan Petri terlebih dahulu

kemudian ditambahkan media agar. Kedua, metode cawan agar sebar/spread plate

yaitu dengan menuangkan terlebih dahulu media agar ke dalam cawan petri

kemudian contoh diratakan pada permukaan agar dengan menggunakan batang

gelas bengkok.

Alat dan Bahan



1. Peralatan

a) Timbangan dengan ketelitian 0,0001 g;

b) Autoclave;

c) Inkubator 35 °C ± 1°C

d) Anaerobic jar;

e) Cawan petri 15 mm x 90 mm;

f) Botol pengencer 20ml;

g) Alat penghitung koloni;

h) Blender beserta Jar yang dapat disterilisasi atau stomacher;

i) Batang gelas bengkok diameter 3 mm–4 mm, dengan panjang tangkai 15

cm-20cm;

j) Pipet gelas atau pipetor : 0,1 ml, 1 ml, 5 ml dan 10 ml.

2. Bahan

a) Sampel susu murni

b) PCA (Plate Count Agar) dalam tabung sebanyak 20 mL.

c) Larutan pengencer

Prosedur

HARI PERTAMA :

Metoda cawan agar tuang/pour plate method

a) Pipet 1ml dari setiap pengenceran 10-1,10-2, dst dan masukkan ke dalam

cawan Petri steril. Lakukan secara duplo untuk setiap pengenceran.

b) Tambahkan 12 ml - 15 ml PCA yang sudah didinginkan dalam waterbath

hingga mencapai suhu 45°C ± 1°C ke dalam masing-masing cawan yang

sudah berisi contoh. Supaya contoh dan media PCA tercampur sempurna

lakukan pemutaran cawan ke depan ke belakang dan ke kiri-ke kanan.

CATATAN : Untuk pengujian bakteri termofilik, penambahan media PCA kedalam cawan sebanyak 40 ml - 50 ml.



c) Setelah agar menjadi padat, untuk penentuan mikroorganisme aerob

inkubasi cawan-cawan tersebut dalam posisi terbalik dalam inkubator

selama 48 jam ±2 jam pada suhu 22°C ±1°C (psikrofilik); 35°C

(mesofilik); 45°C (termofilik).

d) Untuk penentuan mikroorganisme anaerob, inkubasi cawan-cawan

tersebut dalam posisi terbalik dalam anaerobik jar dan masukkan kedalam

inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 22 °C ±1°C (psikrofilik); 35°C


Metoda cawan agar sebar /spread plate method

a) Tuang 12 ml – 15 ml PCA ke dalam cawan-cawan petri steril dan

dinginkan. Pipet 0,1 ml dari setiap pengenceran (10-1,10-2, dst) ke dalam

cawan petri yang telah berisi media PCA diatas dan ratakan dengan

menggunakan batang gelas bengkok. Lakukan secara duplo untuk setiap

pengenceran.

b) Setelah contoh meresap kedalam agar (diamkan sekurang-kurangnya 1

jam); Untuk penentuan mikroorganisme aerob inkubasi cawan-cawan

tersebut dalam posisi terbalik dalam inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada

suhu 22°C ±1°C (psikrofilik); 35°C (mesofilik); 45°C (termofilik). Untuk

penentuan mikroorganisme anaerob, inkubasi cawan-cawan tersebut

dalam posisi terbalik dalam anaerobik jar dan masukkan kedalam

inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 22°C ± 1°C (psikrofilik); 35°C


c) Lakukan kontrol tanpa contoh dengan mencampur larutan pengencer

dengan PCAmedia PCA.

HARI KEDUA :

1. Menghitung jumlah koloni pada lempengan agar. Gunakan lempengan

agar yang mempunyai 30 – 300 koloni. Bila tidak ada lempengan yang

mempunyai kisaran jumlah koloni tersebut, gunakan lempengan agar yang

mempunyai koloni sekitar 300. Dan apabila tidak terdapat jumlah koloni



yang ditetapkan sebelumnya, maka hal yang harus dilakukan adalah

melakukan pengulangan dalam proses pengambilan sampel dan kemudian

berlanjut dengan penambahan proses pengenceran, misal asalnya proses

pengenceran hanya sampai tahap 10-4 akan menjadi 10-6, jadi ditambahkan

agar tidak terlalu menyulitkan dalam proses pengamatannya nanti.

2. Menentukan jumlah mikroorganisme hidup dengan cara mengalikan

jumlah koloni dengan faktor pengenceran. Dan langkah terakhir yang

perlu untuk dilakukan adalah melaporkan hasil pengamatan dan

perhitungan yang telah dilakukan dalam pengerjaan analisis mikrobiologi.

Format Laporan Total Plate Count

Pengenceran

sampel

Volume* yang

digunakan

Jumlah koloni CFU/mL

10-2

10-3

10-4

*Volume suspensi yang dimasukan ke dalam cawan.

(a) penghitungan jumlah hidup, lazimnya dilakukan dengan cara memasukkan volume suspensi tertentu

dalam cawan Petri. Lempengan agar diinkubasikan, kemudian dihitung jumlah koloni yang tumbuh setelah

masa inkubasi. Bila kandungan mikroorganisme dalam sampel terlampau banyak, artinya berkisar dalam

jumlah yang tinggi, maka sampel harus diencerkan.



2.2 Analisis Metode MPN (Most Probable Number)

Berbagai mikroba patogen seringkali ditularkan melalui air yang tercemar

sehingga dapat menimbulkan penyakit pada manusia maupun hewan. Mikroba ini

bisanya terdapat dalam saluran pencernaan dan mencemari air melalui tinja.

Selain itu air yang tercemar dapat pula menyebabkan penyakit kulit dan mata, atau

pun berbagai jenis penyakit-penyakit pada organ-organ tubuh yang lainnya.

Mikroba asal tinja ini yang sering menyebabkan penyakit yang ditularkan

melalui air (water-bone disease) mencakup Salmonella typi, Shigella spp,

Salmonella paratyphi, dan Vibrio cholerae. Disentri yang disebabkan oleh

Campylobacter jejuni dan Escherichia coli dapat pula ditularkan melalui air.

Bakteri, virus dan protozoa dapat juga mencemari air melalui tinja sehingga

menimbulkan penyakit. Virus yang dapat mencemari air melalui tinja adalah virus

hepatitis A dan polio.

Keragaman mikroba yang dapat menimbulkan penyakit ini menyebabkan

para ahli mencari indikator untuk menunjukkan adanya mikroba patogen sehingga

dapat diketahui kualitas mikrobiologi atau sanitasi air. Sehingga indikator banyak

digunakan kelompok koliform, meskipun dapat digunakan indikator lainnya.

Analisis mikrobiologi yang lengkap ditulis di dalam “Standard Methods for the

Examination of Water and Wastewater” (American Public Health Asociation).

2.2.1 Analisis Koliform Dengan MPN

Metode MPN ini merupakan uji deretan tabung yang menyuburkan

pertumbuhan koliform sehingga diperoleh nilai untuk menduga jumlah koliform

dalam sampel yang sedang diujikan atau dianalisis. Jumlah koliform ini bukan

penghitungan yang tepat namun merupakan angka yang mendekati jumlah dalam

keadaan yang sebenarnya. Uji ini diawali dengan memasukkan 10 mL cairan dari

sampel ke dalam Lauryl tryptose broth. Uji awal ini disebut uji duga (pre-

sumptive test). Dalam uji duga, setiap tabung yang menghasilkan gas dalam masa

inkubasi diduga mengandung bakteri koliform. Uji dinyatakan positif, bila terlihat

gas dalam tabung Durham.



Koliform memfermentasikan laktosa dengan pembentukan asam dan gas dalam

waktu 48 jam pada suhu 35ºC. kelompok koliform dipilahkan menjadi koliform

asal tinja dan bukan-tinja (misalnya tanah). Koliform asal tinja mampu

menghasilkan gas di dalam kaldu E.C dalam waktu 24 jam, pada suhu 44,5 ºC.

indikator ini dimaksudkan untuk mengecek antara sanitasi dari suatu bahan yang

umumnya adalah air yang digunakan sebagai sampel.

Tabung yang memperlihatkan pembentukan gas diuji lebih lanjut dengan uji

peneguhan dan bila diperlukan dilakukan uji koliform asal-tinja. Uji peneguhan

dilakukan untuk meneguhkan bahwa gas yang terbentuk disebabkan oleh kuman

koliform dan bukan disebabkan oleh kerja sama beberapa spesies sehingga

menghasilkan gas. Uji koliform asal-tinja dilakukan apabila ingin diketahui bahwa

kuman koliform yang diperoleh termasuk koliform yang diperoleh termasuk

koliform asal-tinja. Untuk uji peneguhan digunakan Brilliant Green Bile Lactose

Broth (BGBL) yang diinokulasikan dengan satu mata ose media, yang

memperlihatkan hasil positif pada uji duga. Kaldu BGBL diinkubasikan pada

suhu 35ºC selam 48 jam.

Untuk koliform asal-tinja, inokulasi dilakukan pada media E.coli yang

diinkubasi pada suhu 44.5ºC selam 24 jam. Pembentukkan gas di dalam tabung

menunjukkan hasil yang positif. Media dan suhu inkubasi menyuburkan kuman

yang diseleksi, baik dalam uji peneguhan maupun uji koliform asal-tinja. Uji

positif ini menghasilkan angka indeks angka ini disesuaikan dengan tabel MPN

untuk menentukan jumlah koliform dalam sampel.

Apabila diperlukan dapat dilakukan uji lengkap dengan menggunakan media

yang menunjukkan hasil positif pada uji peneguhan. Proses pengujian pada

metode MPN (Most Probable Number) ini tidak lain hanyalah untuk

menunjukkan adanya indikasi dan tanda-tanda dari suatu sampel apakah di

dalamnya mengandung/memiliki mikroba yang dapat merugikan bagi pihak

penggunanya. Di samping Uji peneguhan, adapun Uji Lengkap, Uji Koliform

tinja, dan yang paling awal dilakukan adalah Uji Pendugaan. Beberapa uji ini

digunakan sebagai langkah awal untuk melakukan analisa koliform pada suatu

sampel air, apakah tercemar atau pun tidak oleh E.coli.



Cara pengerjaan uji lengkap terlihat pada gambar di bawah ini.

Gambar. Metode MPN

Tahapan uji duga, uji peneguhan dan uji lengkap pada uji MPN. Indeks MPN ditentukan

dari tabung yang menunjukkan hasil positif.

Metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas mikrobiologi air

dalam praktikum digunakan kelompok Koliform sebagai indikator. Kelompok

Koliform mencakup bakteri yang bersifat aerobik dan anaeorobik fakultatif,

batang gram negatif dan tidak membentuk spora. Koliform memfermentasikan

laktosa dengan pembentukkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35°C.

Dalam metode MPN digunakan medium cair, berbeda dengan metode cawan

yang menggunakan medium padat (Agar). Perhitungan dilakukan berdasarkan

jumlah tabung yang positif, yaitu yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi

pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung positif dapat dilihat dengan

timbulnya kekeruhan atau terbentuk gas dalam tabung durham.



2.2.2 Praktikum MPN secara umum :

a) Pengerjaan Analisis koliform dengan metode MPN

Bahan yang diperlukan :

Sampel air minum yang akan diuji

Lauryl Tryptose Broth (2x)

Brilliant Green Bile Lactose Broth (BLBG)

E.coli broth

Eosin methylene Blue agar (EMG)

Nutrient agar (agar miring)

Biakan Escherichia coli

Cara mengerjakan :

Hari pertama

1. Memipet 10 mL sampel air dalam 5 tabung lauryl tryptose broth

konsentrasi 2x.

2. Melakukan proses inokulasi lauryl tryptose broth dengan biakan E,coli.

Biakan ini merupakan control positif.

3. Menginkubasi deretan tabung ini pada suhu 35ºC selama 48 jam!

Hari kedua

1. Mengamati tabung lauryl tryptose broth 2x. media ini merupakan media

penyubur bagi kelompok koliform. Menyimpan tabung yang menunjukkan

hasil yang positif.

2. Menyediakan tabung kaldu BGBL dan tabung E.coli. kaldu BGBL

menyuburkan koliform, sedangkan kaldu E.coli serta suhu inkubasi

menyuburkan koliform asal-tinja.

3. Menginokulasi kaldu BGBL dan E.coli dengan 1 mata ose lauryl tryptose

broth yang menunjukkan hasil positif. Kemudian menyediakan kontrol

positif dengan menginokulasikan kedua media tersebut dengan E.coli.

4. Menginkubasi kaldu BGBL yaitu pada suhu 35ºC selama 48 jam.

Kemudian mengamati pembentukan gas!



5. Menginkubasi kaldu E.coli dalam penangas air tepatnya pada suhu 44.5ºC

selam 24 jam. Memperhatikan pembentukan gas yang muncul.

Hari ketiga

1. Dari tabung BGBL yang menunjukkan hasil positif, gores lempengan agar

EMB. Inkubasi pada suhu 35ºC selama 24 jam.

2. Membandingkan angka indeks yang diperoleh dari tabung BGBL dengan

tabel MPN untuk koliform!

3. Kemudian lakukan hal yang sama untuk tabung E.coli untuk koliform

asal-tinja.

Format laporan pengerjaan analisis air metode MPN

Tabung 1 2 3 4 5

Uji duga

Lauryl tryptose broth

24 jam

48 jam

Uji peneguhan

(BGBL broth)

24 jam

48 jam

Koliform asal-tinja

E.coli broth

24 jam

48 jam

Tuliskan hasil sebagai berikut :

(+) : pembentukan gas (-) : tidak ada pembentukan gas

(td): tidak diuji

Uji Lengkap

Jumlah koloform : MPN/100mL

Asal-tinja : MPN/100mL



Indeks MPN metode 5 tabung

Tabung yang

memperlihatkan gasMPN/100mL

Tabung yang

memperlihatkan gasMPN/100mL

0-0-0

0-0-1

0-1-0

0-2-0

1-0-0

1-0-1

1-1-0

1-1-1

1-2-0

2-0-0

2-0-1

2-1-0

2-1-1

2-2-0

2-3-0

3-0-0

3-0-1

3-1-0

3-1-1

3-2-0

3-2-1

4-0-0

4-0-1

4-1-0

4-1-1

4-1-2

<2

2

2

4

2

4

4

6

6

5

7

7

9

9

12

8

11

11

14

14

17

13

17

17

21

26

4-2-0

4-2-1

4-3-0

4-3-1

4-4-0

5-0-0

5-0-1

5-0-2

5-1-0

5-1-1

5-1-2

5-2-0

5-2-1

5-2-2

5-3-0

5-3-1

5-3-2

5-3-3

5-4-0

5-4-1

5-4-2

5-4-3

5-4-4

5-5-0

5-5-1

5-5-2

5-5-3

5-5-4

5-5-5

22

26

27

33

34

23

31

43

33

46

63

49

70

94

79

110

140

180

130

170

220

280

350

240

350

540

920

1.600

≥ 2.400



2.2.3 Pengujian Escherichia coli.

E. coli merupakan bakteri gram negatif, berbentuk batang, uji indole positif

dan mampu memfermentasi berbagai karbohidrat seperti glukosa, laktosa, manitol

dan arabinosa. Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan

mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasi

laktosa seperti E. coli dengan mikroba yang tidak memfermentasikan laktosa

seperti S. aureus; P. aeruginosa dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi

laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam,

sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya

eosin dan methylene blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun

demikian jika media ini digunakan pada tahap awal, karena kuman lain juga

tumbuh terutama P. aeruginosa dan Salmonella sp dapat menimbulkan keraguan.

Bagaimanapun media ini sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan

tersebut adalah E.coli.

Media MacConkey Agar mempunyai keistimewaan memilah bakteri enterik

gram negatif yang memfermentasi laktosa, karena media ini mengandung laktosa,

crystal violet dan neutral red bile salt. Kemampuan E. coli memfermentasi

laktosa menyebabkan penurunan pH, sehingga mempermudah absorpsi neutral

red untuk mengubah koloni menjadi merah bata dan bile/ empedu diendapkan.

Koloni lain (S. aureus; P. aeruginosa dan Salmonella), bila tumbuh tidak akan

berwarna karena tidak mampu memfermentasi laktosa. Mikroba lain yang dapat

tumbuh pada media ini antara lain Enterobacter; Proteus; Salmonella; Shigella,

Aerobacter; Enterococcus.

Media MacConkey Broth, walaupun tidak tercantum di FI-IV, sebenarnya media

ini bermanfaat sekali dalam memilah E. coli dari mikroba lain terutama S. aureus,

P. aeruginosa dan Salmonella. Adanya Oxgall dalam media berperanan dalam

menghambat bakteri gram positip lain seperti S. aureus. Kandungan laktosa

sangat penting untuk memilah E. coli dari mikroba lain yang tidak memfermentasi

laktosa, terutama P. aeruginosa dan Salmonella. Fermentasi laktosa oleh E. coli

menyebabkan pH turun. Kondisi asam akan menyebabkan bromo cresol purple

(media berwarna ungu) berubah menjadi kuning (media berwarna kuning) dan



adanya pembentukan gas yang dapat diamati pada tabung durham. Sedangkan

Salmonella dan P. aeruginosa tidak dapat mengubah warna media karena tidak

memfermentasi laktosa, sedangkan mikroba lain yang mampu memfermetasi

laktosa dan mempunyai ekspresi pada media seperti E. coli adalah Enterobacter

aerogenes. Adapun cara memilah E. aerogenes antara lain dengan reaksi indole.

E. coli mempunyai reaksi positif, sedang E. aerogenes bereaksi negatif. Dengan

sifat tersebut media ini sangat baik untuk memilah E. coli dari mikroba lain pada

tahap awal terutama P. aeroginosa; S. aureus dan Salmonella.

(Gambar. Bakteri Escherichia coli sebagai

penyebab kontaminasi utama dalam air minum)

Escherichia coli merupakan bakteri yang memiliki bentuk batang lurus, 1,1 –

1,5 µm x 2,0 – 6,0 µm, motil dengan flagelum peritrikus atau nonmotil.

Merupakan kelompok bakteri Gram negatif. Dapat tumbuh dengan mudah pada

medium nutrient sederhana. Dengan laktosa yang difermentasikan oleh sebagian

besar galur dengan produksi asam dan gas. Kandungan G+C DNA adalah 50

sampai dengan 51 mol %.

Escherichia coli merupakan penghuni normal saluran pencernaan manusia

dan hewan berdarah panas. Biasanya tidak patogenik. Anggota lain kelompok

koliform ialah Klebsiella pneumoniae, yang tersebar luas di alam; terdapat dalam

tanah, air dan padi-padian, dan juga dalam saluran pencernaan manusia dan

hewan. Dalam melakukan analisa untuk uji dari suatu cemaran yang dilakukan

dapat digunakan beberapa spesies atau kelompok bakteri telah dievaluasi untuk

menentukan sesuai tidaknya untuk organisme indikator. Di antara organisme-

organisme yang dipelajari, yang hampir memenuhi semua persyaratan suatu

organisme indikator yang ideal adalah Escherichia coli dan kelompok bakteri coli

lainnya yang dianggap sebagai indikator polusi tinja.



2.2.4 Analisis Kualitas dan Sanitasi Air

Istilah bakteri indikator sanitasi dikenal dalam bidang mikrobiologi pangan.

Bakteri indikator sanitasi adalah bakteri yang keberadaannya dalam pangan

menunjukkan bahwa air atau makanan tersebut pernah tercemar oleh kotoran

manusia yang mengingat banyaknya jumlah mikroorganisme ini, maka perlu

dilakukan suatu uji pemeriksaan terhadap bahan pangan tersebut agar aman

dikonsumsi. Bakteri-bakteri indikator sanitasi umumnya adalah bakteri yang

lazim terdapat dan hidup pada usus manusia sehingga dengan adanya bakteri

tersebut pada air atau makanan dapat menunjukkan bahwa dalam satu atau lebih

tahap pengolahan air atau makanan pernah mengalami kontak dengan kotoran

yang berasal dari usus manusia dan oleh sebab itu kemungkinan terdapat bakteri

patogen lain yang berbahaya. Ada tiga jenis bakteri yang dapat digunakan untuk

menunjukkan adanya masalah sanitasi, yaitu Escherichia coli, kelompok

Streptococcus (Enterococcus) fecal, dan Clostridium perfringens.

Pengadaan air bersih untuk kepentingan rumah tangga diantaranya adalah

untuk air minum, air mandi, dan keperluan sehari-hari. Keadaan air ini haruslah

memenuhi peryaratan yang sudah ditentukan sesuai dengan peraturan

internasional dari WHO dan APHA ataupun peraturan nasional setempat. Dalam

hal ini kualitas air bersih di Indonesia harus memenuhi persyaratan yang tertuang

di dalam peraturan Menteri Kesehatan RI No. 173/Men. Kes/Per/VIII/77 dimana

setiap komponen yang diperkenankan berada di dalamnya harus sesuai.

Kualitas Air Berdasarkan Nilai IPB (Indeks Pencemar Biologis)Nilai IPB Kalitas air

0 – 8

9 – 20

21 – 60

60 – 100

Bersih, jernih

Tercemar ringan

Tercemar sedang

Tercemar berat

Perhitungan mikroba untuk keperluan nilai IPB harus dilakukan secara

langsung, misalnya dengan menggunakan ruang penghitung (counting chamber),

jadi tidak melalui cara yang tidak langsung. Pemeriksaaan air secara

mikrobiologis untuk coli dilakukan tiga tahap pengerjaan yaitu Tes presumtif (tes

perkiraan), Tes konfirmatif (tes penentuan), Tes lengkap.



Jika dikaji lebih lanjut, suatu badan air, disini misalnya kolam ikan, dimasuki

buangan organik, misalnya yang berasal dari manusia dan kegiatan di dalam

rumahnya akan menyebabkan terjadinya gejolak kehidupan berbentuk siklus yang

dinamakan Siklus Biologis dinamis

Yaitu :

1) Manusia menghasilkan buangan berbebtuk urin, tinja, dan sampah ke

dalam perairan (kolam ikan misalnya).

2) Oleh bakteri buangan tersebut akan diuraikan menjadi ion-ion tertentu

yang sesuai dengan benda asalnya.

3) Hasil uraian akan digunakan oleh bakteri itu sendiri dan mikroalge untuk

pertumbuhan biomassa-sel, juga akan merupakan sumber nutrient untuk

tanaman air (misalnya kangkung, eceng, genjer, dsb).

4) Akibat dari adanya biomassa-mikroalge, proses fotosintesis akan terjadi

dengan menghasilkan oksigen yang dibutuhkan oleh bakteri menguraikan/

mengoksidasikan buangan.

5) Juga biomassa-mikroalge merupakan makanan utama dari Zooplankton,

zooplankton merupakan sumber utama makanan ikan/hewan kecil, serta

ikan/hewan air kecil merupakan sumber utama makanan ikan besar, serta

akhirnya ikan merupakan suber protein, lemak, dan karbohidrat bagi

manusia.

6) Juga tanaman air, akhirnya akan merupakan sumber karbohidrat, lemak,

vitamin dan protein bagi manusia.

Secara umum pengukuran coli hanya dilakukan sampai Tes Presumtif

(perkiraan) saja, yang hasilnya dicocokan dengan table JPT analisa dari badan

statistik. Berdasarkan kepada hasil tes perkiraan, maka jumlah bakteri Coli

sudah dapat ditentukan berdasarkan tabel tadi (Jumlah Perkiraan Terdekat)

atau dengan MPN (Most Probable Number) per 100 mL.

Dengan adanya siklus biologis ini kita dapat memperkirakan berbagai

kemungkinan yang dapat dilakukan secara lengkap.



(Gambar. Siklus Biologis-dinamis di dalam perairan)

Mikroorganisme sebagai indikator kualitas air

Pada pemeriksaan mikrobiologis yang rutin terhadap air untuk menentukan aman

tidaknya untuk diminum, tidaklah cukup jika mendasarkan uji-uji yang digunakan

hanya terdapat adanya (terisolasinya) mikroorganisme patogenik karena alasan

sebagai berikut :

1) Kemungkinan besar patogen masuk ke dalam air secara sporadis.

2) Bila terdapat dalam jumlah amat sedikit, maka sifat patogen tidak

terdeteksi.

3) Hail pemeriksaan laboratorium dapat dikethaui setelah 24 jam atau lebih.

Ciri mikroorganisme indikator

1) Terdapat di alam tercemar.

2) Terdapat dalam air bila ada patogen.

3) Jumlah mikroorganisme indikator berkolerasi dengan kadar polusi

4) Memiliki kemampuan bertahan hidup lebih besar dari yang patogen.

5) Mempunyai sifat seragam dan mantap



2.3 UJI BONTEREY

UJI UNTUK IDENTIFIKASI MIKROBA

Mikroorganisme tumbuh dan berkembang biak dengan menggunakan berbagai

bahan yang terdapat di berbagai lingkungan, baik lingkungan yang lembab, basah,

maupun lingkungan yang kering, sehingga mikroorganisme ini dapat hidup di

berbagai jenis lingkungan, tetapi tentu saja tergantung dari jenis mikroorganisme

tersebut. Zat hara yang terdapat di lingkungan sekelilingnya ini terdiri dari

molekul-molekul sederhana seperti H2S dan NH4+, atau terdapat senyawa atau

molekul-molekul organik yang kompleks seperti protein dan polisakarida.

Mikroba mengoksidasikan zat hara ini untuk memperoleh energi dan senyawa

pemula untuk sintesis dinding sel, membran dan flagela.

Penggunaan zat hara ini tergantung dari aktivitas metabolisme mikroba.

Metabokisme seringkali menghasilkan hasil sampingan yang dapat digunakan

untuk identifikasi suatu mikroorganisme.

Pembahasan dari suatu analisis ini dimaksudkan untuk mengetahui berbagai

macam identifikasi yang dilakukan untuk mengetahui jenisnya ini. Hal ini

mencakup berbagai uji untuk mengetahui aktivitas metabolisme suatu

mikroorganisme. Pengamatan aktivitas metabolisme ini diketahui dari

kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan dan menguraikan molekul yang

kompleks seperti zat pati, lemak, protein dan asam nukleat. Selain itu pengamatan

ini juga dilakukan pada molekul-molekul yang sederhana seperti asam amino dan

sakarida. Hasil dari berbagai uji ini digunakan untuk pencirian dan identifikasi

suatu mikroorganisme.

Berbgai macam identifikasi yang dilakukan baik itu secara langsung

terhadap bakterinya maupun dalam keadaan tidak langsung, akan memeberikan

hasil yang berbeda tentunya. Dari berbagai uji-uji identifikasi tersebut akan dapat

memudahkan ketercapaian suatu analisa dengan mengetengahkan tentang

pentingnya, bahkan kerugian yang ditimbulkan oleh suatu mikroorganisme ini.

Pada dasarnya kita tentu tahu bahwa mikroba ada yang bersifat patogen dan ada

yang tidak, sehingga kita harus mampu untuk mengenali dan memilih mana saja

bakteri yang diidentifikasikan patogen.



2.3.1 FERMENTASI KARBOHIDRAT

Kemampuan memfermentasikan berbagai karbohidrat dan produk fermentasi

yang dihasilkan merupakan ciri yang sangat berguna dalam identifikasi dari suatu

mikroorganisme.

Hasil akhir fermentasi karbohidrat ditentukan oleh sifat mikroba, media

biakan yang digunakan, serta faktor lingkungan, antara lain suhu dan pH. Media

fermentasi harus mengandung senyawa yang dapat dioksidasikan dan

difermentasikan oleh mikroorganisme. Glukosa termasuk senyawa yang paling

sering dan penting untuk digunakan oleh mikroorganisme dalam proses

fermentasi.

Untuk menentukan adanya fermentasi, di laboratorium digunakan media kaldu

karbohidrat dan media MR-VP. Pembentukan asam dapat diketahui dengan

menanamkan indikator ke dalam suatu media. Kaldu karbohidrat digunakan untuk

uji pembentukan asam dan gas. Pembentukan gas dapat ditentukan dengan

menggunakan tabung Smith atau tabung Durham. Tabung Smith digunakan bila

jumlah dan macam gas yang dihasilkan harus ditentukan. Sedangkan tabung

Durham ini digunakan bila tidak diketahui macam dan jumlah gas yang

dihasilkan. Bila terbentuk gas, maka gas masuk ke dalam tabung Durham dan

mendesak cairan dalam tabung ini; gas ini terlihat sebagai gelembung udara yang

terperangkap dalam tabung Durham.

Kaldu karbohidrat ini mengandung 0,5 – 1 % karbohidrat. Karbohidrat yang

sering dipakai adalah glukosa, laktosa, manitol, maltosa, dan sukrosa. Selain

karbohidrat ke dalam media ditambahkan juga beef extract dan peptone sebagai

sumber nitrogen, vitamin dan mineral. Untuk mengetahui pembentukan asam, ke

dalam media ditambahkan indikator. Bila dalam proses fermentasi, bakteri atau

mikroba ditumbuhkan dalam biakan dalam cair yang mengandung glukosa, maka

hasil proses fermentasi dapat berupa asam. Asam yang dihasilkan akan

menurunkan pH media biakan yang telah dibuat. Indikator yang sering digunakan

adalah merah fenol dan bromcresol purple. Bila dalam media biakan ditambahkan

indikator pH seperti misalnya brom-cresol-purple atau merah fenol, maka



pembentukan asam ini ditandai oleh perubahan warna menjadi kuning. Pada pH >

7.0, merah fenol berwarna merah sedangkan bromocresol purple berwarna ungu.

Gambar. Reaksi Fermentasi Karbohidrat

(a) Tabung control, (b) Fermentasi Asam laktat,

(c) Fermentasi asam campuran, (d) Fermentasi

alkohol

Pada pengamatan di atas kita dapat mengetahui hal yang paling mendasar dari

reaksi fermentasi kabohidrat di dalam tabung Durham. Perbandingan yang

diperoleh antara salah satu tabung yang dicampur atau diisi dengan asam akan

menyebabkan berawarna kuning, sehingga akan terlihat reaksi fermentasi

karbohidrat secara jelas di pandangan dalam membedakan dari warna.

Proses selanjutnya :

Setelah diperoleh koloni-koloni dalam keadaan terpisah dalam lempeng

pembiakan, maka tindakan selanjutnya ialah mengadakan pemeriksaan sifat-sifat

biokimia yang penting untuk menunjang diagnosis yang ingin ditegakkan. Selain

itu isolasi dalam keadaan murni pada koloni itu digunakan untuk mengetahui

reaksi fermentasi terhadap jenis-jenis gula yang termasuk golongan

monosakarida, disakarida, dan polisakarida. Caranya adalah sebagai berikut.



1) Jenis-jenis gula tersebut dimasukkan ke dalam medium pembiakan cair

atau padat. Medium yang dipakai tergantung pada kebutuhan hidup tiap

jenis organisme yang diteliti.

2) Untuk mengetahui ada tidaknya fermentasi terhadap gula tersebut, maka

ke dalam medium tersebut ditambahkan indikator yang dapat

menunjukkan perubahan pH ke arah asam atau basa.

3) Jenis-jenis gula yang dipakai ditetapkan dalam satu deret (dinamakan

deret aneka gula), dan letaknya dalam deret pada tiap kali pemeriksaan

tidak berubah, sehingga hasil dari tiap deret dapat dinyatakan dalam satu

formula tetap untuk tiap jenis organisme untuk laboratorium itu.

Misalnya bila suatu laboratorium menggunakan deret aneka gula dengan

urutan glukosa, laktosa, maltosa, dan sakarosa, maka bila deret ini

ditanam dengan Salmonella typhi, hasil yang diperoleh dalam bentuk

formula adalah (+ – + –) yang berarti bahwa fermentasi terjadi pada

tabung-tabung glukosa dan maltosa, sedang laktosa dan sakarosa tidak

difermentasi.

4) Ke dalam tabung-tabung (dalam medium cair) dimasukkan pula tabung

kecil yang letaknya terbalik (tabung Durham) untuk mengetahui apakah

dalam proses fermentasi itu terbentuk gas atau tidak. Bila gas terbentuk,

sebagian gas itu akan berkumpul dalam tabung Durham, sehingga

tampak rongga kosong. Bila hal ini terjadi pada medium padat dalam

tabung, mengakibatkan medium retak atau terdorong ke atas.

Gambar 14.1

Struktur antigenik Salmonella typhi.



5) Cara menanam organisme ke dalam medium gula ini dilakukan sekaligus

untuk satu deret. Dengan menggunakan jarum sebagian koloni diambil

dan disentuhkan secara beruntun ke dalam medium gula tersebut.

6) Pengeraman dilakukan dalam suhu yang sesuai, untuk bakteri patogen

umumnya pada suhu 37oC.

7) Reaksi positif diperlihatkan oleh perubahan indikator, yang dinyatakan

dengan tanda + (positif) dan bila indikator tidak berubah berarti tidak

terjadi fermentasi, yang dinyatakan dengan tanda – (negatif).

Perlu diperhatikan dalam hal penggunaan indikator, bahwa pemilihannya

harus disesuaikan dengan keadaan pH medium pembiakan yang berubah akibat

fermentasi. Bila fermentasi mengakibatkan terbentuknya asam, pH medium akan

lebih rendah dari pH semula, dan penurunan ini tergantung pada jumlah asam

yang terbentuk dan jenis bakteri yang mengadakan fermentasi. Bila Ph turun

sampai 6,0 dan indikator yang dipakai merah fenol (phenol red), akan tampak

bahwa medium yang tadinya merah berubah menjadi kuning. Tetapi bila dipakai

indikator merah metil (methyl red), maka pada pH 6,0 indikator ini belum

memperlihatkan perubahan yang nyata. Baru pada pH yang jauh lebih asam,

merah metil tampak merah, sehingga bagi bakteri yang tidak membentuk asam

sebanyak ini, hasilnya dapat dibaca negatif, walaupun ada fermentasi. Karena

jenis gula dalam reaksi fermentasi ini banyak, maka untuk menghindarkan

kekeliruan tiap jenis gula diberi sandi warna, biasanya pada tutup tabung,

misalnya kuning untuk glukosa, ungu untuk laktosa, merah untuk maltosa, dan

biru untuk sakarosa. Selain reaksi deret aneka gula, masih dilakukan reaksi-reaksi

biokimia lainnya, baik untuk keperluan khusus atau untuk keperluan diferensiasi.

Untuk bakteri golongan koliform ditambahkan suatu deret khusus untuk

diferensiasi, yaitu deret IMViC. Singkatan ini berasal dari huruf I dari indol, M

dari metilmerah, Vi dari Voges – Prauskauer dan C dari “citrate” (sitrat). Maksud

dari pemeriksaan ini adalah untuk mengadakan diferensiasi jenis-jenis bakteri dari

golongan koliform, yang penting artinya dalam pemeriksaan air.



1. Uji fermentasi karbohidrat


Biakan : Escherichia Coli

Staphylococcus aureus

Micrococcus luteus

Saccharomyces cerevisiae

Media : Kaldu karbohidrat,

Glukosal, sukrosa, laktosa, maltosa, dan manitol yang

mengandung indikator BCP (brom-cresol-purple). Selain BCP

dapat digunakan PR (phenol-red) sebagai indikator pH yang

digunakan.

Cara mengerjakan :

Hari pertama

1. Menandai tabung kaldu karbohidrat dengan : Jenis karbohidrat, nama

pembuat, biakan yang diinokulasikan, biakan yang digunakan untuk deret

karbohidrat pertama adalah E.Coli, deret kedua aureus, ketiga M.Luteus.

deret ke kempat S.cerevisiae dan deret kelima sebagai kontrol

2. Menginokulasikan deret karbohidrat pertama dengan E,coli, deret kedua

dengan S.aureus, deret ketiga dengan M.luteus dan deret keempat dengan

S.cerevisiae dan deret kelima sebagai kontrol. Dan melakukan inkulasi

dengan proses yang hati-hati sehingga tidak menimbulkan gelembung-

gelembung gas dalam tabung Durham.

3. Menginkubasikan kelima deret tabung di dalam incubator 35ºC selam 24

jam.

Hari kedua

1. Memeriksakan adanya fermentasi karbohidrat dengan melihat

pembentukan asam dan pembentukan gas. Pembentukan asam terlihat

sebagai perubahan warna kaldu karbohidrat menjadi kuning. Pembentukan

gas terlihat di dalam tabung Durham. Memperhatikan bahwa di dalam



tabung kontrol tidak terjadi pembentukan gas. Pembentukan gas di dalam

tabung kontrol dapat terjadi bila sewaktu diinokulasi tabung yang berisi

kaldu dikocok terlalu keras atau bila digunakan kaldu yang disimpan di

dalam lemari es. Kemudian daya larut oksigen berkurang di dalam kaldu

yang dingin, namun sewaktu diinkubasikan pada suhu 37ºC Oksigen dapat

terperangkap di dalam tabung Durham.

2. Melaporkan hasil reaksi di dalam tabung yang berisi kaldu karbohidrat.

Contoh format laporan untuk uji Fermentasi karbohidrat

Karbohidrat

Organisme Glukosa Laktosa Sukrosa Maltosa Manitol

E.coli

S.aureus

M.luteus

S.cerevisiae

Beri tanda hasil reaksi sebagai berikut :

A : Pembentukan asam

B : Pembentukan gas

AG : Pembentukan asam dan gas

B : Pembentukan baa

- : Tidak ada pertumbuhan

Dalam kaitannya dengan karbohidrat, ada beberapa cara uji yang dapat

dilakukan secara kualitatif untuk mengetahui karbohidrat untuk difermentasikan.

1) Uji Fehling, Barfoed, Benedict (ada tidaknya monosakarida).

2) Uji Antron (penentuan adanya gula dalam darah).

3) Uji Mollisch (karbohidrat secara umum).

4) Uji Selliwanof (penentuan fruktosa dalam sampel).

5) Uji Tauber (ada tidaknya pentosa dalam sampel).

6) Uji Iodin (ada tidaknya glikogen atau Eritrodekstrin).

7) Fenil-Hidrazin (untuk menentukan gugus karbonil lepas).



2.3.2 Uji IMVIC

Banyak dilakukan untuk membedakan Enterobacter aerogenes dan Esherichia

coli dilakukan uji IMVIC yang terdiri dalri proses uji-uji :

Uji Indol

Uji Methyl Red

Uji Voges Proskauer

Uji Citrat

Kedua mikroorganisme tersebut akan memberikan hasil sebagai berikut :

I M Vi C

E.coli

A.aerogenes

+

-

+

-

-

+

-

+

1. Pemeriksaan Indol dan Uji Indol

Pemeriksaan Indol merupakan uji identifikasi yang didasarkan pada

penggunaan asam amino, baik sebagai media maupun sampel, atau standar. Asam

amino adalah molekul organik yang mengandung kelompok asam (COOH),

amino (NH2), dan R. Gugus R merupakan ciri khusus dan membedakan asam

amino yang satu dengan yang lainnya.

Miroorganisme menggunakan asam amino sebagai pembuka protein,

komponen sel dan kadangkala sebagai sumber energi. Asam amino ini

dimodifikasi dengan berbagai cara sewaktu metabolisme. Dalam praktikum ini

diperlihatkan berbagai cara mikroorhanisme memodifikasikan suatu asam amino.

Modifikasi asam amino dapat digunakan untuk pencirian, karena produk yang

dihasilkan akibat modifikasi asam amino dapat digunakan dalam identifikasi

mikroorganisme.

Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat

pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh

mikroorganisme akibat penguraian protein. Bakteri tertentu seperti misalnya

Escherichia coli mampu menggunakan triptofan sebagai sumber karbon.

E.coli menghasilkan enzim triptofanase yang mengkatalisasikan penguraian

gugus indol dari triptofan. Dalam media biakan, indol menumpuk sebagai produk



buangan, sedangkan bagian lainnya dari molekul triptofan (asam piruvat dan

NH4+) dapat digunakan untuk memnuhi kebutuhan zat hara mikroorganisme.

Gambar. Struktur kimiawi asam amino

Pembentukkan indol dari triptofan oleh mikroorganisme dapat diketahui

dengan menumbuhkannya di dalam media biakan yang kaya dengan triptofan.

Triptofan biasanya diberikan dalam bentuk triptom suatu polipeptida yang kaya

dengan residu triptofan. Penumpukan indol dalam suatu media biakan dapat

diketahui dengan penambahan berbagai reagens. Reagens bereaksi dengan indol

dan menghasilkan senyawa yang tidak larut dalam air dan berwarna merah pada

permukaan medium.

Adapun proses hidrolisis triptofan dan uji indol, pada uji ini digunakan media

semi-padat yang kaya akan triptofan. Untuk melihat adanya indol dapat digunakan

beberapa reagens yaitu Kovacs, Gore, Ehrlich, dan Ehrlich-Bohme. Semua

reagens tersebut mengandung para-dimetil-aminobenzaldehida. Dalam praktikum

digunakan reagens Ehrlich-Bohme yang terdiri reagens A dan B.

Media untuk melihat pembentukan indol yang digunakan di laboratorium ini

bersifat semi-padat, oleh karena itu dapat digunakan juga untuk melihat

pergerakan bakteri. Jika bakteri bergerak akan terlihat pertumbuhan di sekitar

tusukan dan juga pada permukaan media. Media indol diinokulasikan dengan

menusukkan jarum ke dalam media semi-padat

Gambar. Cara menginolusikan biakan semi-padat



Pemeriksaan dimaksudkan untuk mengetahui apakah dalam proses

pertumbuhannya bakteri dapat membentuk indol dari triptofan. Adanya

pembentukan indol dapat diketahui dengan reagens Ehrlich atau Kovacs, yang

mengakibatkan medium berwarna merah. Cara pengerjaannya adalah sebagai

berikut.

1. Medium pembiakan cair yang telah ditanam dieramkan selama 24 sampai

48 jam.

2. Reagens Ehrlich yang disediakan terdiri dari:

a. Para-dimetil-amino-benzaldehida = 9 g

b. Etil-alkohol = 190 ml

c. Asam klorida (pekat) = 40 ml

3. Ke dalam biakan ditambahkan 1 ml eter atau silol, dikocok, sehingga

tersebar rata di seluruh cairan, kemudian didiamkan sampai semua eter

atau silol berkumpul di permukaan.

4. Reagens diteteskan perlahan-lahan melalui dinding tabung sebanyak

kirakira 0,5 ml. Bila indol positif maka tampak cincin merah terbentuk di

batas cairan medium dan eter atau silol.

Indol dibentuk dari asam triptofan sebagai hasil aktivitas hidrolisis beberapa

spesies bakteri. Dalam hal ini yang perlu diperhatikan dalam medium pembiakan

hanya digunakan pepton yang mengandung asam amino. Indol adalah zat yang

dapat menguapkan dan dapat diperiksa adanya dengan penambahan

pdimetilaminobenzaldehida, atau dengan sepotong kertas yang diimpregnasi

dengan asam oksalat, kemudian diselipkan antara mulut tabung dan tutup kapas.

Penggunaan eter atau silol dimaksudkan untuk mengekstraksi indol dari medium,

karena indol dapat larut dalam eter atau silol, sehingga bila jumlah indol sedikit

dapat dikumpulkan ke permukaan medium dan bereaksi dengan reagens di

permukaan medium berupa cincin merah.

Uji indol ini dilakukan pada dasarnya adalah dengan menginokulasikan

biakan yang akan diujikan untuk melakukan teknik analisis mengidentifikasikan

suatu mikroba.



2. UJI METHYL RED

Pada kaldu gula yang berisi tabung Durham, dapat diketahui kemampuan

mikroorganisme untuk memfermentasikan karbohidrat, tetapi hasil produksi

fermentasi tidak diketahui. Dalam praktikum digunakan media MR – VP untuk

mengetahui fermentasi asam campuran atau fermentasi butana-diol.

Uji Methyl red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam

campuran. Beberapa bakteri memfermentasikan glukosa dan menghasilkan

berbagai produk yang bersifat asam sehingga akan menurunkan pH media

pertumbuhannya menjadi 5.0 atau lebih rendah. Penambahan indikator pH

“Methyl red” dapat menunjukkan adanya perubahan pH menjadi asam. Methyl red

berwarna merah pada lingkungan dengan pH 4.4 dan berwarna kuning dalam

lingkungan dengan pH 6.2.

GAMBAR. Keterikatan antara pembentukan asam dan waktu inkubasi sewaktu proses fermentasi campuran mikroorgansime menghasilkan berbagai asam, sehingga menurunkan pH medium menjasi 5.0 atau menjadi lebih rendah.

Fermentasi asam campuran ditentukan dengan cara menumbuhkan

mikroorganisme dalam kaldu yang mengandung glukosa, dan setelah masa

inkubasi menambahkan reagens methyl red ke dalam kaldu. Apabila terjadi

fermentasi asam campuran maka kaldu biakan berubah menjadi kuning setelah

penambahan reagens methyl red. Uji ini sangat berguna dalam identifikasi

kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan.



Pengujian dengan metil merah dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri

dapat membentuk asam sedemikian banyaknya sehingga dapat mengubah

indikator metil merah menjadi merah. Beberapa jenis bakteri dapat membentuk

asam tetapi tidak cukup banyak untuk dapat mengubah indikator dan penurunan

pH sampai 5,0, pada umumnya sudah menghambat kelanjutan hidup

mikroorganisme. Sedang bakteri seperti Escherichia coli dapat memberikan hasil

pengujian positif karena dapat menurunkan hasil pengujian positif dan dapat

menurunkan pH sampai di bawah 4,5. Sebaliknya Klebsiella aerogenes

mengadakan dekarboksilasi dan kondensasi asam piruvat untuk membentuk

asetilmetilkarbinol, sehingga pH meningkat, dan bila ditambahkan metil merah

warnanya menjadi kuning, yang berarti hasil pengujian negatif. Pengujian

seharusnya jangan dilakukan sebelum biakan berumur dua hari pada suhu 37ºC

atau tiga hari pada suhu 30ºC. Reaksi ini tidak dapat dipercepat dengan

meningkatkan kadar glukosa dalam medium.

GambarBakteri Escherichia coli.

Pada dasarnya pengerjaan praktikum Uji Methyl Red ini digunakan untuk

mengetahui perbedaan dan menggolongkan, serta memisahkan dua bakteri yang

tergolong mikroba yang patogen, yakni antara Escherichia coli dan bakteri

patogen Enterobacter aerogenes. Dengan menggunakan reagens methyl red yang

dapat mengidentifikasikan kedua bakteri tersebut untuk dapat digunakan dalam

tahapan proses pengerjaan analisa selanjutnya, terutama dalam hal identifikasi

mikroba patogen dari suatu bahan atau sampel.



Proses pengerjan Uji Methyl-red



Biakan Enterobacter aerogenes

Kaldu MR – VP (Methyl Red – Voges Proskauer)

Reagens Methyl Red

Cara mengerjakan :

Hari pertama

1. Menandai tabung kaldu MR – VP dengan biakan bakteri yang digunakan.

2. Menginokulasi kaldu MR – VP dengan biakan bakteri.

3. Menginkubasikan dalam suhu 35ºC selam 5 x 24 jam.

Hari kedua

1. Menambahkan 5 tetes reagens methyl red ke dalam tabung MR – VP.

2. Melaporkan hasilnya.

Uji bersifat positif apabila kaldu berwarna merah setelah penambahan

reagens methyl red.

Uji bersifat negatif apabila kaldu MR – VP berubah menjadi kuning atau

jingga setelah penambahan reagens.

Format Laporan Uji Methyl-Red

MikroorganismePerubahan warna setelah

penambahan reagens

Esherichia coli

Enterobacter aerogenes



3. Uji Voges-Proskauer

Uji ini digunakan dan dilakukan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang

melaksanakan fermentasi 2.3-butanadiol. Bila bakteri memfermentasikan

karbohidrat menjadi 2.3 butanadiol sebagai produk utama, akan terjadi

penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Penambahan 40% KOH

dan 5% larutan alpha-naphtol dalam ethanol dapat menentukan adanya asetoin

(asetilmetilkarbinol), suatu senyawa pemuka dalam sintesis 2.3-butanadiol. Pada

penambahan KOH, adanya asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna kaldu

menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas dengan penambahan larutan

alpha-naphtol. Perubahan warna biakan lebih jelas terlihat pada bagian yang

berhubungan dengan udara, karena sebagian 2.3-butanadiol dioksidasikan kembali

menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi. Berdasarkan hal ini tabung

yang berisi tabung dikocok sehingga berbuih, kemudian dibuka tutup tabungnya

dan dimiringkan di atas meja kerja.

Uji Vorges-Proskauer ini sebenarnya merupakan uji tidak langsung untuk

mngetahui adanya 2.3-butanadiol dan selalu didapatkan secara serentak, sehingga

uji VP absah untuk menentukan adanya 2.3-butanadiol.

Cara melakukan pengujian ini adalah sebagai berikut.

1. Reagens-reagens yang diperlukan terdiri dari:

a. larutan alfa-naftol 5% dalam alkohol absolut,

b. larutan KOH 40% yang mengandung 3% kreatin.

2. Dengan pipet 1 ml biakan umur 24 jam dimasukkan ke dalam tabung

Wasserman.

3. Ke dalam tabung ini ditambahkan 0,6 ml larutan alfa-naftol.

4. Selanjutnya ditambahkan 0,2 ml larutan KOH-kreatin.

5. Setelah dikocok campuran itu didiamkan selama 10–30 menit. Bila di

dalam biakan itu terbentuk asetilmetilkarbinol, akan timbul warna merah

pada permukaan medium, dan warna ini akan meluas sampai ke seluruh

campuran.



Penanaman dalam medium pembiakan sitrat (Simmons Citrate Medium)

dimaksudkan untuk mengetahui apakah senyawa sitrat dapat dipakai sebagai satu-

satunya sumber karbon bagi organisme. Dalam medium ini digunakan

natriumsitrat sebagai sumber karbon. Bila natriumsitrat ini dapat diuraikan maka

amonium hidrogenfosfat turut teruraikan dan akan melepaskan NH3 sehingga

menyebabkan medium menjadi alkalis, dan indikator bromtimolbiru berubah dari

hijau menjadi biru. Penanaman dilakukan dengan jarum; penanaman berlebihan

dapat menghasilkan positif palsu.

Proses Pengerjaan Uji Voges-Proskauer

Cara mengerjakani :

Hari pertama

1. Menandai kaldu MR – VP dengan biakan bakteri yang digunakan.

2. Menginokulasi kaldu MR – VP dengan biakan bakteri.

3. Menginkubasikan dalam 35ºC selama 24 – 48 jam.

Hari kedua

1. Menambahkan 10 tetes larutan 40% KOH dan 15 tetes larutan alpha-

naphtol dalam kaldu MR – VP. Kemudian mengocok tabung sehingga

dengan baik meningkatkan aerasi sehingga terjadi peningkatan oksidasi

2.3-butanadiol menjadi asetoin dan memperjelas hasil reaksi uji ini. Hasil

reaksi dapat terlihat paling lambat setelah 30 menit.

2. Melaporkan hasil pengujian yang telah dilakukan. Uji ini bersifat positif

apabila kaldu berwarna merah dalam waktu 30 menit setelah penambahan

reagens. Uji yang bersifat negatif ini apabila kaldu MR – VP tidak

memperlihatkan perubahan warna setelah penambahan reagens.

Format laporan Uji Vorges-Proskauer

Mikroorganisme Perubahan warna setelah penambahan reagens

Esherichia coli

Enterobacter aerogenes



Uji Pembentukan Oksidase

Pengujian ini dikorelasikan dengan adanya sitokrom dalam kadar yang tinggi,

yang dapat dipakai untuk mengenal bakteri tertentu yang termasuk dalam genus

Pseudomonas dan Neisseria. Oksidasi dari p-aminodimetilanilina menjadi warna

merah tua sampai hitam, dapat dipakai sebagai ukuran aktivitas sitokrom.

Cara pengujiannya adalah sebagai berikut.

a. Biakan ditanam pada lempeng agar bulyon.

b. Pengeraman dilakukan pada suhu30oC sampai timbul pertumbuhan.

c. Permukaan lempeng pembiakan itu disiram dengan p-

aminodimetilanilina.

Bila koloni-koloni segera menjadi berwarna merah tua, menunjukkan bahwa

organisme itu diduga mengandung sitokrom-C. Dalam hal ini perlu diperhatikan

bahwa semua koloni dapat menjadi merah tua dengan reagens oksidase, bila

dibiarkan berada dalam cahaya. Karena itu pengujian harus segera diperiksa

setelah reagens diberikan. Cara lain untuk menguji oksidase, adalah menggunakan

potongan kecil kertas saring yang dicelupkan ke dalam satu persen tetrametil-p-

fenilendiamin dihidroklorida (atau kosalat). Kertas saring yang berwarna biru

tidak boleh dipakai. Dengan ose platina yang bersih dikerok sedikit biakan muda,

dan digosokkan di atas kertas saring. Tes oksidase positif menghasilkan warna

biru dalam waktu 10 detik. Ose yang kotor menghasilkan positif palsu dan biakan

tua tidak dapat dipercaya untuk pengujian ini. Karena telurit menghambat

oksidase.

Pada dasarnya uji ini berfungsi untuk menentukan adanya oksidase sitokrom

yang ditemukan pada mikroorganisme tertentu. Uji ini berguna dalam identifikasi

mikroorganisme patogen seperti misalnya Neisseria gonorhoea dan Pseudomonas

aerogenusa. Kedua bakteri ini memberikan hasil positif dalam uji oksidase. Di

dalammya terdapat perubahan warna yang disebabkan oksidase sitokrom

mengoksidasikan oksidase larutan reagens. Reagens yang dioksidasikan berwarna

hitam,namun jika ada reduksi tidak terjadi perubahan warna.



Uji Katalase

Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian H2O2 (Hidrogen

Peroksida) menjadi air dan O2 (Oksigen). Hidrogen Peroksida bersifat toksik

terhadap sel karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel. Hidrogen

peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga mikroorganisme yang

tumbuh dalam lingkungan aerob harus menguraikan bahan toksik tersebut.

Katalase adalah salah satu enzim yang digunakan mikroorganisme untuk

menguraikan Hidrogen peroksida, enzim lainya yang dapat menguraikan

Hidrogen peroksida adalah peroksidase. Pada penguraian hidrogen peroskidase

oleh peroksidase tidak dihasilkan oksigen.

Uji katalse berguna dalam identifikasi kelompok bakteri/mikroba tertentu.

Pada bakteri berbentuk kokus, uji katalase digunakan untuk membedakan

Staphylococcus dan Streptococcus. Kelompok Streptococcus ini bersifat katalase-

negatif sedangkan Staphylococcus ini bersifat katalase-positif. Penentuan adanya

katalase diuji dengan larutan 3% H2O2 pada koloni terpisah. Pada bakteri yang

bersifat katalase-positif terlihat pembentukan gelembung udara sekitar koloni.

4. UJI CITRAT

Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan

sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Untuk uji ini dapat

digunakan medium sitrat – koser berupa medium cair atau medium sitrat –

Simmon berupa medium padat. Simmon’s sitrate agar merupakan medium sintetik

dengan Na sitrat sebagai satu-satunya umber karbon, NH4+ sebagai sumber N dan

brom thymol blue sebagai indikator pH, sedangkan medium sitrat – Koser tidak

mengandung indikator. Apabila mikroorganisme mampu menggunakan sitrat,

maka asam akan dihilangkan dari medium biakan, sehingga menyebabkan

peningkatan pH dan mengubah warna medium dari hijau menjadi biru. Perubahan

dari warna hijau menjadi biru ini menunjukkan bahwa mikroorganisme mampu

menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Sedangkan pada



medium sitrat – Koser kemampuan menggunakan sitrat dilakukan dan

ditunjukkan oleh kekeruhan yang menandakan adanya pertumbuhan.

Proses Pengerjaan Uji Citrat



Biakan aerogenes

Biakan vulgaris

Biakan Pseudomonas aeruginosa

Media biakan Simmons citrate agar.

Cara mengerjakan :

Hari pertama

1. Menandai tabung Simmon’s citrate agar dengan nama, tanggal, dan nama

mikroorganisme yang akan diujikan.

2. Menginokulasi tabung agar dengan inokulum yang tiptis. Inokulum yang

tebal kadangkala menyebabkan mikroorganisme seakan-akan dapat

tumbuh dalam simmon’s citrate agar, sehingga hasil yang tidak benar.

3. Menginkubasi di suhu 35ºC selam 48 jam.

Hari kedua

1. Memperhatikan atau mengamati perubahan warna dengan melihat

pertubuhan dan perubahan warna dari warna hijau ke warna biru.

2. Melaporkan hail pengujian yang telah dilakukan

Format Laporan Uji Citrat

MikroorganismeWarna setelah

masa inkubasi

Kesimpulan hasil

pengujian

E.coli

E.aerogenes

P.vulgaris

P.aeroginusa



2.3.3 PENGGUNAAN CITRAT

Uji untuk melihat penggunaan sitrat, hidrolisis urea dan likuifikasi gelatin

sangat berguna dalam pencirian mikroorganisme. Penggunaan sitrat merupakan

salah satu uji dari deretan Uji IMVIC yang digunakan dalam pencirian bakteri

koliform. Hidrolisis urea sering kali digunakan untuk membedakan Salmonella

dari Proteus yang merupakan kuman patogen pada saluran urinaria, namun dapat

pula ditemukan dalam spesimen sebagai kuman non-patogen. Hidrolisis gelatin

sering digunakan dalam membedakan spesies tertentu Pseudomonas dan

mikroorganisme dalam saluran pencernaan.

Hidrolisis Gelatin

Gelatin adalah protein yang diperoleh pada waktu merebus tulang, tulang

rawan atau tenunan ikat hewani lainnya. Protein ini bila didinginkan membentuk

“gel”. Beberapa mikroorganisme tertenu mampu menguraikan molekul sehingga

asam amino yang dihasilkan dapat digunakan sebagai zat hara. Hidrolisis gelatin

oleh mikroorganisme tersebut dikatalisasikan oleh eksoenzim yang disebut

gelatinase. Gelatin yang telah dicerna tidak mampu membentuk gel dan cenderung

bersifat cair. Kemampuan untuk mencernakan gelatin dapat digunakan dalam

pencirian mikroorganisme. Sebagai contoh, serratia marcescens dapat dibedakan

dari Klebsiella pneumonia atau Escherichia coli bedasarkan kemampuan

mencernakan gelatin. Hidrolisis gelatin dapat pula digunakan untuk mengetahui

sifat patogen galur mikroorganisme karena sering kali dikaitkan dengan produksi

enzim untuk menguraikan bahan pengikat tenunan untuk memudahkan

penyebaran mikroorganisme.

Dalam Laboratorium, pencairan gelatin diuji dengan cara menusukkan

mikroorganisme yang akan diuji ke dalam media semi-padat yang mengandung

nutrient broth dan gelatin. Media ini diinkubasikan dan diamati kemampuan

mikroorganisme mencairkan gelatin. Pada suhu 35ºC, gelatin dapat mencair

apabila diinokulasikan dengan mikroorganisme yang mampu mapun tidak mampu

mencairkan gelatin. Berdasarkan hal tersebut, gelatin harus dimasukkan ke dalam

lemari es selam 30 menit untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme



mencairkan gelatin. Apabila mikroorganisme mampu mencerna gelatin, maka

media semi-padat gelatin tetap bersifat cair setelah dikeluarkan dari lemari es.

Sebaliknya bila mikroorganisme tidak mampu mencerna gelatin, maka media

semi-padat gelatin membeku kembali, setelah dikeluarkan dari lemari es.

Proses pengerjaan Hidrolisis Gelatin


Biakan E.coli

Biakan B.subtillis

Biakan S.marcescens

Media biakan gelatin

Cara mengerjakan :

Hari pertama

1. Menandai tabung gelatin dengan nama, tanggal pembuatan,

mikroorganisme yang akan diujikan.

2. Media diinokulasikan dengan cara menusukkan mikroorganisme yang

akan diujikan sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan.

3. Menginkubasikan pada suhu 35ºC selam 24 jam.

Hari kedua

1. Mengamati pertumbuhan dalam media gelatin, kemudian masukkan

tabung ke dalam lemari es selama 30 menit.

2. Mengamati pencairan gelatin setelah dikelauarkan dari lemari es.

Pencairan gelatin dapat dilihat dengan memiringkan tabung. Apabila

gelatin tetap dalam keadaan cair, maka mikroorganisme mampu

mencernakan atau menghidrolisiskan gelatin. Beberapa mikroorganisme

mampu mencernakan gelatin namun memerlukan waktu yang relatif lama.

Ini berarti bahwa medium gelatin harus diinkubasikan kembali selama 1

minggu sebelum dapat dinyatakan pengujian bersifat negatif. Laporkan.



Uji Pencairan Gelatin

a) Medium pembiakan tegak dari gelatin nutrisi, tiogikolat gelatin medium,

dieramkan selama 7 hari pada suhu kamar, kemudian diperhatikan apakah

terjadi pencairan gelatin. Untuk organisme yang tumbuh lambat pada suhu

gelatin menjadi cair, diikutsertakan tabung kontrol dengan gelatin yang

tidak ditanam, dan setelah pengeraman kedua tabung diletakkan dalam

lemari es semalaman. Tabung kontrol harus membeku.

b) Medium agar gelatin ditanam dan dieramkan semalam pada suhu 37oC.

Kemudian lempeng pembiakan itu disiram dengan larutan jenuh

ammonium sulfat. Organisme yang menghasilkan gelatinase akan

memperlihatkan lingkaran di sekitar koloni.

Hidrolisis Urea

Beberapa mikroorganisme mampu menghasilkan enzim urease yang

menguraikan urea menjadi ammonium dan CO2. aktivitas enzim urease ini dapat

diamati dengan menumbuhkan mikroorganisme dalam media biakan yang

mengandung urea dan indikator pH (biasanya phenol-red). Apabila

dihidrolisiskan, NH4+ terakumulasi dlam media menjadi basa. Perubahan warna

dari merah-jingga menjadi merah-ungu merupakan petunjuk terjadinya hidrolisis

urea. Urea bersifat stabil, sehingga media urea tidak dapat disterilkan dengan

autoclave. Sterilisasi dilakukan dengan cara filtrasi (penyaringan).

Genus Proteus dapat dibedakan dari beberapa bakteri Gram negatif lain

karena kesanggupannya menghasilkan banyak enzim urease. Bila dalam biakan

terdapat urease, urea dihidrolisis, sehingga terbentuk amonia yang mengubah

warna indikator dari kuning menjadi merah.

Reaksi Hidrolisis urea



BAB III

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

Dalam kehidupan yang kita jalani ini alangkah baiknya kita dapat melakukan

suatu kegiatan yang bermanfaat dan berguna bagi orang lain kelak. Pastinya

dengan menggunakan metode yang tepat dan benar. Dengan pembelajaran

mikrobiologi ini kami dapat memahami tentang arti pentingnya sebuah usaha

yang baik dan terarah. Dengan metode TPC, MPN, dan Uji Bonterey yang telah

difahami dan dipelajari, maka kita akan dapat membantu khalayak luas dan ramai,

khususnya masyarakat disekitar kita ataupun keluarga kita, dan umumnya adalah

seluruh umat manusia ini, tentunya dalam perihal kaitannya dengan masalah

mikroorganisme. Dengan usaha dan niat yang baik serta ilmu pengetahuan yang

telah diperoleh maka dapat meningkatkan kefahaman dan wawasan tentang

kegiatan praktikum yang akan dilakukan di semester 5 ini.

3.2 Saran

Memberikan pengetahuan serta wawasan kepada masyarakat atau siswa

tentang pembelajaran yang terdapat di semester 5 ini, dalam suatu pokok

pembahasan yang dapat digunakan atau dimanfaatkan sebagai pegangan dalam

pengerjaan praktikum mikrobiologi. Serta menyampaikan bahwa TPC, MPN, dan

Uji Bonterey ini merupakan jenis praktikum terapan yang dapat diaplikasikan di

dalam kehidupan nyata dan merealisasikannya dalam dunia ini.



DAFTAR PUSTAKA

Bibiana. Praktikum Mikrobiologi. Bandung.

Sumber : www.google.com

www.wikipedia.com

SNI (Standar Nasional Indonesia) dan BSN (Badan Standar Nasional) tentang

mikroorganisme. 2008.


http://www.wikipedia.com/

http://www.google.com/


LAMPIRAN

Lampiran pekerjaan :

Dimas Seto Prasetyo :

Mencari bahan, mengetik, editing, konsep makalah, print.

Hanifa Handayani :

Mencari bahan, mengetik, print, dan jilid.


Tpc, Mpn, Uji Bonterey

Documents

Transcript of Tpc, Mpn, Uji Bonterey