BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Populasi mikroorganisme yang ada dialam sekitar kita ini sangatlah besar dan cukup kompleks. Beratus spesies mikroba menguasai setiap bagian tubuh kita. Mereka terdapat dalam jumlah yang cukup besar. Sebagai contoh, sekali kita bersin dapat menebarkan beribu-ribu mikroorganisme. Satu gram tinja dapat mengandung jutaan bakteri. Alam sekitar kita, baik itu tanah, air maupun udara juga dihuni oleh kumpulan mikroorganisme. Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik unuk memisahkan populasi campuran yang rumit ini, atau yang biasanya dikenal dengan istilah biakan murni. Biakan murni ini terdiri dari satu populasi sel yang semuanya barasal dari suatu sel induk (Pelczar, 1986).Sebelum membahas lebih jauh lagi tentang mikroba dan bakteri, ada baiknya apabila kita mengetahui terlebih dahulu apa itu mikroba, Mikroba adalah organisme berukuran mikroskopis yang antara lain terdiri dari bakteri, fungi dan virus (Waluyo, 2009). Bakteri merupakan mikroba prokariotik yang rata-rata selnya berukuran 0,5-1 x 2-5 m, berbentuk elips, bola, batang atau spiral (Pelczar dan Chan, 2005). Menurut Gandjar (2006), fungi adalah organisme eukariotik, bersifat heterotrof, dinding selnya mengandung kitin, tidak berfotosintesis, mensekresikan enzim ekstraseluler ke lingkungan dan memperoleh nutrien dengan cara absorpsi. Berdasarkan penampakannya, fungi dikelompokkan ke dalam kapang (mold), khamir (yeast), dan cendawan (mushroom). Cendawan merupakan fungi yang berukuran makroskopis, sedangkan kapang dan yeast adalah fungi yang berukuran mikroskopis. Menurut Rachmawan (2001), rata-rata sel kapang berukuran 1-5 x 5-30 m dan yeast berukuran 1-5 x 1-10 m. Kapang adalah fungi multiseluler berfilamen dengan susunan hifa yang menyerupai benang (Brock et al., 2006). Yeast merupakan fungi uniselular. Pada yeast tertentu yang bersifat patogenik seperti Candida sp., mengalami dua fase (dimorfisme) dalam siklus hidupnya, yaitu fase yeast (membentuk sel tunggal) dan fase miselium untuk penetrasi ke jaringan inangnya (Bambang, 2009). Selain berinteraksi intraspesies, mikroba tersebut juga berinteraksi secara interspesies dengan manusia, tumbuhan, dan hewan. Dalam interaksinya dengan manusia, mikroba tersebut ada yang bersifat menguntungkan dan merugikan. Contohnya bakteri patogen Escherichia coli dan kelompok bakteri Coliform dapat menyebabkan diare, kolera, dan penyakit saluran pencernaan lainnya (Waluyo, 2009). Kapang dan khamir menyebabkan penyakit karena menghasilkan racun (mikotoksin) dan menginfeksi permukaan tubuh seperti kulit, kuku, dan rambut (mikosis superfisial), serta menyerang jaringan dalam tubuh melalui peredaran darah (mikosis sistemik) (Gandjar, 2006). Salah satu upaya untuk melawan mikroba tersebut adalah dengan menggunakan mikroba lain yang mempunyai sifat antagonis (antimikroba) sebagai pengganggu atau penghambat metabolisme mikroba lainnya. Mikroba antagonis yang memiliki kemampuan antimikroba tersebut dapat menghasilkan senyawa antimikroba. Senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh mikroba pada umumnya merupakan metabolit sekunder yang tidak digunakan untuk proses pertumbuhan (Schlegel, 1993), tetapi untuk pertahanan diri dan kompetisi dengan mikroba lain dalam mendapatkan nutrisi, habitat, oksigen, cahaya dan lain-lain (Baker dan Cook, 1974). Senyawa antimikroba tersebut dapat digolongkan sebagai antibakteri atau antifungi (Pelczar dan Chan, 2005). Beberapa senyawa antimikroba adalah fenol, formaldehida, (Dwidjoseputro, 2003), antibiotik, asam, dan toksin Mikroba yang memiliki kemampuan antimikroba dan menghasilkan senyawa antimikroba adalah bakteri, aktinomycetes, dan kapang (Radji, 2005; Tortora et al., 2002). Aktinomycetes dan kelompok bakteri, seperti kelompok bakteri asam laktat dan bakteri Gram positif telah banyak diteliti dan dikenal sebagai sumber berbagai senyawa antimikroba (Hoover and Chen 2003). Kapang tanah yang mempunyai aktivitas antimikroba adalah genus Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces, Trichoderma (Gandjar, 2006), dan Fusarium (Nemec et al., 1963). Aspergillus menghasilkan senyawa antimikroba mevionin dan aspersilin (Gandjar, 2006). Penicillium sp. menghasilkan penisilin untuk menghambat sintesis peptidoglikan dinding sel bakteri.Trichoderma sp. menghasilkan senyawa antimikroba yaitu enzim 1,3 glukanase dan khitinase yang dapat menghancurkan dinding hifa dari beberapa fungi serta isocyanide (isocyanocyclopent enylidene) propionic acid yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri E. coli. Genus-genus kapang tanah lainnya yang mampu menghasilkan senyawa antimikroba masih belum banyak diteliti. Sehingga, skrining isolat-isolat kapang tanah baru terutama dari berbagai daerah di Indonesia masih harus terus dilakukan untuk mengetahui potensinya sebagai agen antimikroba. Dalam penelitian Kuswytasari et al. (2011), telah berhasil diisolasi dan dipurifikasi isolat kapang tanah dari Wonorejo Surabaya. Isolat tersebut telah menjadi koleksi Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Jurusan Biologi ITS. Wonorejo Surabaya merupakan salah satu kawasan mangrove di Indonesia dan termasuk ke dalam kawasan Pantai Timur Surabaya dengan jenis substrat berlumpur. Pada substrat berlumpur terdapat seresah daun dan hewan asosiasi mangrove yang mati dan merupakan sumber bahan organik pada suatu habitat. Bahan organik dibutuhkan kapang tanah untuk melangsungkan metabolismenya. Oleh karena itu, tanah Wonorejo Surabaya berpotensi sebagai substrat alami yang baik untuk pertumbuhan kapang tanah. Sebagai perbandingan, Gandjar (2006) melaporkan bahwa pada daerah hutan mangrove di Jakarta terdapat kapang tanah genus Aspergillus, Paecilomyces, Penicillium, dan Trichoderma yang memiliki sifat antimikroba terhadap bakteri Salmonella typhii, Staphylococcus aureus, dan yeast Candida albicans. Namun potensi isolat-isolat kapang tanah Wonorejo Surabaya khususnya sebagai antimikroba belum diketahui, sehingga pada penelitian ini dilakukan uji kemampuan antimikroba. Kemampuan antimikroba yang dihasilkan oleh kapang tanah Wonorejo Surabaya

dapat dideteksi menggunakan modifikasi uji antagonisme dual culture. Uji dual culture dilakukan dengan cara menumbuhkan dua kultur mikroba yang berbeda dalam satu medium biakan padat. Kemudian dalam tenggang waktu tertentu (masa inkubasi) di antara dua kultur mikroba tersebut terbentuk zona bening (Maldonado et, al., 2010; Khoirunnisya, 2009; Highley, 1997 dan Brian, et, al., 1946). Misalnya modifikasi dual culture untuk kapang A dan bakteri B. Bakteri B dalam jumlah sel tertentu ditanam terlebih dahulu pada medium agar padat dengan metode usap (swap). Kemudian di atas medium padat tersebut diinokulasikan 1 koloni kapang A. Setelah masa inkubasi tertentu, bila ada sekresi senyawa antimikroba, maka akan terbentuk zona bening di sekeliling koloni kapang A sebagai indikasi penghambatan pertumbuhan bakteri B. Dan sebaliknya apabila tidak terbentuk zona bening di sekeliling koloni kapang A, maka mengindikasikan bahwa tidak adanya kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri B.Dalam dunia industri khususnya industri kimia dan farmasi, baik farmasi obat ataupun farmasi vaksin, peran mikrobiologi tidaklah kecil. Mikrobiologi berperan penting dalam menghasilkan produk yang berkualitas. Baik itu dalam proses pra-uji, selama pengujian dan paska pengujian, karena mikrobiologi berpengaruh dalam kondisi lingkungan tempat uji, alat uji, medium uji, sample uji dan operator uji. Produk yang berkualitas tidak akan lepas dari faktor sterilitas dan faktor ini sangat erat kaitannya dengan masalah mikrobiologi.

Mikrobiologi adalah salah satu ilmu yang mempelajari tentang ruang lingkup mikroorganisme yang merupakan makhluk hidup dengan bentuk dan komposisi organ hidupnya sangat kecil dan sederhana, sehingga hampir sebagian besar diperlukan alat bantu untuk melihatnya misalkan mikroskop atau kaca pembesar. Contoh dari mikroorganisme sendiri yaitu bakteri, virus, jamur dan sebagainya.

Disamping sebagai salah satu faktor yang dikategorikan bisa berpotensi mengganggu atau merusak proses dan hasil suatu produk, baik sebagai kontaminan atau mempengaruhi dalam proses reaksi, misalnya reaksi fermentasi bakteri juga bisa dimanfaatkan dalam proses industri itu sendiri salah satunya adalah dalam proses validasi simulasi produksi dimana bakteri bisa digunakan untuk menguji kualitas kesuburan dari medium validasi tersebut.

Bakteri banyak terdapat di lingkungan baik itu di dalam tanah, air, udara, makanan dan sebagainya, begitupun juga di dalam lingkungan industri. Seiring perkembangan ilmu pengetahuan dan industri maka orang-orang mulai sadar akan perlunya penyimpanan dan pengawetan bakteri untuk kepentingan ilmu pengetahuan dan industri itu sendiri, salah satu contohnya adalah Bacillus sp banyak terdapat di udara atau tanah lalu Enterobacter banyak tedapat pada air biasanya bisa digunakan dalam pengujian kualitas air dan sebagainya

Di dalam dunia industri dikenal istilah ruang berkelas artinya suatu ruangan yang berfungsi dalam proses produksi ataupun pengujian produk yang dalam konstruksi diatur dengan persyaratan tertentu baik tekanan udara, kelembaban, temperatur, jumlah mikroba dan jumlah partikelnya. Ruang berkelas ini diberi pengkategorian yang berbeda berdasarkan tingkat persyaratannya, semakin rendah tingkatannya semakin besar nilai toleransinya artinya semakin besar peluang kontaminasi bakterinya. Maka ruangan tersebut selalu diperlakukan secara khusus artinya berbeda dengan kondisi lingkungan biasa, akan tetapi tidak menutup kemungkinan adanya resistensi terhadap desinfektan dan modifikasi dari bakteri akibat menyesuaikan diri dengan kondisi lingkungannya.

Akibat adanya modifikasi bakteri tersebut maka perlu adanya dokumentasi terhadap bakteri untuk dijadikan bahan penelitian lebih lanjut dan untuk kepentingan industri itu sendiri, diantaranya bisa dijadikan indikator kesuburan medium uji yang dipakai di industri dan dipakai sebagai kontrol positif untuk pengujian terhadap sterilitas produk. Berdasarkan materi di atas maka dilakukan penelitian terhadap proses dokumentasi bakteri dengan menggunakan metode Liofilisasi melalui beberapa tahapan pengujian, sehingga didapatkan jenis bakteri yang murni dan dapat dipergunakan dalam jangka waktu yang lama.Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatanMikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro,1998).

Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas (Hadiutomo, 1990). Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo, 1990).

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004).

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.Macam-macam pewarnaan :

1. Pewarnaan negatif

- Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang

- Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta

2. Pewarnaan sedehana

- Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin)

- Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel

3. Pewarnaan diferensial

- menggunakan lebih dari satu macam zat warna

- Tujuan untuk membedakan antar bakteri

- Contoh: Pw. Gram, Pw. Bakteri Tahan Asam

4. Pewarnaan khusus

- Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri kapsul, spora, flagel dll

Cara pewarnaan negatif

- Sediaan hapus teteskan emersi lihat dimikroskop

Untuk mempelajari morfologi, struktur, sifat-sifat bakteri dalam membantu mengidentifikasinya, kuman perlu diwarnai.

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853 1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990).

Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasma sewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro,1998).

Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro,1998).

Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro,1998)

Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo,1991).

Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali setelah pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol. Fiksasi digunakan untuk :

1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai

2. Melekatkan bakteri pada glass objek

3. Mematikan bakteri

Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo (Lay,1994).

Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentuk yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus), buah anggur ( stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay,1994).

Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam (Lay,1994).Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif (Lay,1994)

Ciri-ciri gram negatif:

- Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer

- Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat dalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam laktat.

- Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

- Tidak resisten terhadap gangguan fisik

Ciri-ciri bakteri gram positif:

- Struktur dindingnya tebal

- Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal

- Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin

- Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal

- Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit

- Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu

a. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu

b. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan

c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam

d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan gram untuk :

- Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar

- Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme

- Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa