TINJAUAN PUSTAKA

Aktivitas Reproduksi Domba Siklus Estrus

Siklus estrus domba berkisar antara 14-19 hari (Jainudeen et al. 2000).

Domba garut yang dipelihara secara intensif mempunyai siklus estrus antara

17-20 hari sedangkan yang dipelihara secara tradisional adalah 14-30 hari

(Hastono & Masbulan 2001).

Siklus estrus terdiri dari dua fase yaitu fase folikuler dan luteal. Fase

folikuler terbagi menjadi proestrus dan estrus sedangkan fase luteal terbagi

menjadi metesrus dan diestrus. Fase folikeluler paling dominan ditandai dengan

produksi hormon estrogen oleh folikel sedangkan fase luteal didominasi oleh

pertumbuhan korpus luteum yang ditandai dengan diproduksinya progesteron

(Senger 1999).

Masa Kebuntingan

Kebuntingan adalah serangkaian proses fisiologis yang dimulai dari

terjadinya fertilisasi dan diakhiri dengan kelahiran (Jainudeen & Hafez 2000).

Lama kebuntingan pada domba bervariasi bergantung pada bangsanya yaitu

berkisar antara 144 – 153 hari (Johnson & Everitt 2000; Senger 1999) dengan

rata-rata 148 hari.

Fertilisasi

Pembentukan suatu individu baru dimulai dari penggabungan antara

spermatozoa dan ovum yang dikenal dengan fertilisasi yang terjadi di dalam

oviduk. Fertilisasi diakhiri dengan terbentuknya satu sel kompleks yang disebut

embrio. Embrio akan mengalami pembelahan sel sampai terbentuk suatu jaringan

yang berbeda disebut dengan blastosis. Blastosis memiliki dua populasi sel yang

berbeda, yaitu inner cell mass (ICM) dan selapis sel trofektoderm yang

6

mengelilingi ICM. Embrio akan tumbuh dari perkembangan ICM sedangkan

plasenta dan membran ekstraembrionik tumbuh dari trofektoderm. Interaksi

antara blastosis dan epitel endometrium induk merupakan awal terjadinya

implantasi (Senger 1999: Dey et al. 2004).

Konseptus memasuki uterus pada hari ke-4, blastosit terbentuk pada hari

ke-6 dan menetas dari zona pelusida pada hari ke 8-9 (Gambar 1). Blastosit

berkembang dari bentuk sperikal menjadi tubuler pada hari ke-11 kemudian

mengalami elongasi berbentuk filamen antara hari ke-12 dan 16. Elongasi dari

blastosit menandakan terjadinya implantasi yang melibatkan proses aposisi dan

penempelan (hari 12-15) serta mengalami adesi secara ketat pada hari ke-16

(Spencer et al. 2004).

Pembentukan trofektoderm yang diikuti dengan perkembangan lebih lanjut

menjadi trofoblas merupakan tahapan yang penting untuk dimulainya implantasi

dan terjadinya kebuntingan. Sebelum embrio menempel pada dinding uterus,

embrio akan mengalami tiga tahapan penting yaitu : perkembangan awal embrio,

preimplantasi yang meliputi perkembangan embrio lebih lanjut serta terjadinya

membran ekstraembrionik, dan terbentuknya fetus (telah mempunyai bentuk yang

definitif spesies tertentu) serta plasenta (Senger 1999).

Implantasi Implantasi pada ruminansia (sapi, domba, kambing) terjadi pada tahap

blastosis. Waktu terjadinya implantasi berbeda-beda pada setiap spesies yaitu

pada babi hari ke-13, sapi hari ke-20, domba hari ke-16 dan kambing hari ke-19

(Dey et al. 2004; Spencer & Bazer 2004). Implantasi merupakan proses yang

sangat rumit dan melibatkan interaksi yang sangat dekat antara blastosit dan

penerimaan uterus terhadap embrio. Tempat terjadinya implantasi terletak pada

area karunkular (Johnson & Everitt 2000; Dey et al. 2004; Lee & DeMayo 2004).

Blastosis berkembang dari embrio tahap awal, morula, sebagai hasil dari

penyatuan dan mengisi blastocoele yang dikelilingi oleh selapis sel embrio atau

trofektoderm (Gambar 2). Trofektoderm terlibat dalam adhesi dengan epitel

endometrium sehingga terjadi implantasi. Penerimaan uterus yang terjadi pada

periode yang terbatas didefinisikan sebagai waktu dimana lingkungan uterus

7

sangat kondusif untuk menerima blastosis dan implantasi. Interaksi dua arah

antara blastosis dan epitel endometrium induk memicu terjadinya implantasi,

suatu proses dimana pembuluh darah embrio berkomunikasi dengan sirkulasi

darah induk untuk meneguhkan fungsi plasenta dan kebuntingan. Sirkulasi induk

mempunyai barier khusus yang dapat menyeleksi dengan jalan menembus

plasenta untuk melindungi dan memberi makan embrio (Dey et al. 2004;

Wodzicka-Tomaszewka et al. 1991).

Plasentasi pada ruminansia seperti sapi dan domba adalah superfisial, yang

dikenal sebagai kotiledon sinepiteliokhorial (Wooding 1992). Sinepiteliokhorial

adalah sinsisium feto-maternal yang merupakan fusi sel binukleat trofoblas dan

sel epitel uterus. Sedang kotiledon merupakan struktur kasar dari plasenta dan

vili trofoblas yang membentuk kripta karunkel induk. Fusi seluruhnya atau

sebagian kotiledon fetus dengan karunkel induk disebut plasentom yang

merupakan tempat utama terjadinya pertukaran nutrien dan gas dalam plasenta

(Green et al. 1998; Xie et al. 1996).

Domba dengan tipe plasenta sinepiteliochorial akan mengalami pre-

implantasi pada hari ke 8-15 diikuti dengan pemanjangan periode aposisi dan

penempelan. Menurut Spencer et al. (2004), pada domba implantasi dan plasentasi

dimulai pada hari ke 15-16 tetapi prosesnya akan terus berlanjut sampai hari ke

50-60 usia kebuntingan. Keberhasilan implantasi dapat dideteksi paling lambat 14

hari setelah ovulasi atau sekitar hari ke 5-15 (Wilcox et al. 1999;

Johnson & Everitt 2000; Aplin & Kimber 2004).

Sejak terjadinya fertilisasi sampai implantasi, aktivitas ini juga

dipengaruhi oleh aktivitas hormonal terutama progesteron dan estrogen

(Gambar 1). Estradiol mencapai konsentrasi 10 pg/ml pada saat puncak estrus

yang merupakan saat yang paling baik untuk perkawinan, yang konsentrasinya

berfluktuasi sampai terjadi implantasi. Sementara konsentrasi progesteron sejak

terjadinya fertilisasi sampai terbentuk blastosis pada hari ke-8 mengalai

peningkatan konsentrasi sampai mencapai 10 ng/ml. Konsentrasi ini tetap

bertahan sampai terjadinya implantasi. Keberhasilan implantasi dan kebuntingan

didukung oleh adanya interaksi antara progesteron dan estrogen yang disekresikan

oleh ovarium (Spencer et al. 2004; Wen-ge Ma et al. 2003).

8

Penanda Kebuntingan

Saat yang paling kritis dalam siklus reproduksi ternak ditentukan oleh

kemampuan induk untuk menerima sinyal yang dikirimkan oleh konseptus untuk

menghalangi terjadinya luteolisis dan mempertahankan kebuntingan yang disebut

dengan maternal recognition of pregnancy atau MRP (Senger 1999;

Geisert & Malayer 2000) . Pada ruminansia sinyal penanda kebuntingan yang

utama adalah interferon tau (Johnson & Everitt 2000; Spencer & Bazer 2004).

Gambar 2 Tahapan awal kebuntingan domba. Fertilisasi terjadi di dalam tuba Fallopii dan tahap morula memasuki uterus pada hari ke-4. Blastosis dibentuk pada hari ke-6 dan ditetaskan dari ZP pada hari ke 8-9. Berkembang dari bentuk spherical menjadi tubular pada hari ke-11, perpanjangan ke filamenus pada hari ke 12-15. Perpanjangan blastosis menandakan dimulainya implantasi yang melibatkan aposisi dan penempelan secara cepat pada hari ke 12-15 dan pelekatan secara kuat pada hari ke-16 (Spencer et al. 2004).

Posi

si U

teru

s

Pert

umgu

han

dan

Perk

emba

ngan

bl

asto

sis

Masuk keuterus

Pemanjangan Aposisi Adhesi

Kornua uteri

Lumen uteri

Terlepas dari ZP

Uterotubal

Oviduk

Hari Sesudah Perkawinan

Prog

este

ron

(ng/

ml)

Progesteron

Gambar 2 Tahapan awal kebuntingan domba (Spencer et al. 2004). Keterangan : A. Fertilisasi terjadi di dalam tuba Fallopii dan tahap morula

memasuki uterus pada hari ke-4. B. Blastosis dibentuk pada hari ke-6 dan ditetaskan dari ZP pada

hari ke 8-9. Berkembang dari bentuk spherical menjadi tubular pada hari ke-11, perpanjangan ke filamenus pada hari ke 12-15.

C. Perpanjangan blastosis menandakan dimulainya implantasi yang melibatkan aposisi dan penempelan secara cepat pada hari ke 12-15 dan pelekatan secara kuat pada hari ke-16

A

B

C

9

Penanda kebuntingan berbeda-beda sesuai dengan bangsanya akan tetapi

mempunyai fungsi yang sama yaitu mencegah terjadinya luteolisis agar tidak

terjadi abortus. Pada primata (CG); manusia (HCG) maupun kuda (PMSG)

sekresinya berupa choriogonadotrophin. Domba maupun sapi disekresikan

interferon-tau maupun early pregnancy factor yang berfungsi untuk menekan

peningkatan reseptor oksitosin, sedangkan pada babi disekresikan estrogen untuk

menekan sekresi prostaglandin. Substansi penand akebuntingan ini akan menurun

konsentrasinya atau bahkan menghilang pada saat implantasi telah terjadi

bersamaan dengan mulai terbentuknya plasenta.

Pada saat implantasi sempurna, akan diikuti dengan plasentasi yaitu proses

terbentuknya plasenta (chorion, alantois dan amnion). Plasenta berfungsi sebagai

pelindung konseptus dengan jalan mensekresikan cairan plasenta. Sekresi

plasenta berupa steroid (progesteron dan estrogen), laktogen plasenta

(Devlin 2002) serta PAG (Green et al. 1998, Xie et al. 1996). Substansi yang

disekresikan oleh plasenta akan bertahan sampai kebuntingan berakhir.

Sekresi Plasenta Progesteron

Progesteron merupakan hormon penjaga kebuntingan. Keberadaan

progesteron di dalam uterus akan menstimulir dan menjaga fungsi uterus sehingga

dapat dipergunakan untuk tempat perkembangan embrio dini, implantasi,

plasentasi serta keberhasilan perkembangan fetus dan plasenta sampai akhir masa

kebuntingan (Spencer et al. 2004).

Pada ternak domba, sudah dapat dinyatakan bunting jika konsentrasi

progesteron dalam darah minimal 2,5 ng/ml (Boscos et al. 2003) sedangkan

peneliti lainnya menyatakan bahwa konsentrasi tertinggi progesteron pada fase

luteal pada 2-4 ng/ml dibandingkan dengan saat estrus pada 1,5-0,8 ng/ml

(Ranilla et al. 1994). Peningkatan yang drastis dari 2-4 ng/ml menjadi 12-20

ng/ml terjadi pada kebuntingan hari ke 60-125 (Edqvist & Stabenfeldt 1980),

karena plasenta dan atau konseptus sudah memproduksi progesteron. Hal yang

10

sama terlihat level progesteron meningkat dengan konsentrasi tertinggi 16 ng/ml

(Johnson & Everitt 2000).

Korpus luteum domba memproduksi progesteron dalam jumlah yang

relatif rendah pada 50 hari pertama kebuntingan, tetapi setelah melewati masa ini

plasenta merespon terhadap lueteinizing hormon maupun prolaktin, untuk

mempersiapkan diri sebagai sumber utama progesteron sampai kebuntingan

berakhir. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi progesteron baru terukur

setelah hari ke-60 (Schoenecker et al. 2004).

Apabila plasenta telah berfungsi dengan sempurna maka meskipun

dilakukan ovariektomi produksi hormon yang menjaga kebuntingan tetap

disekresikan karena fungsinya telah digantikan oleh plasenta (Gambar 3). Domba

apabila dilakukan ovariektomi setelah hari ke-50 tidak akan menyebabkan

terjadinya abortus (Senger 1999; Johnson & Everitt 2000).

Estrogen

Aktivitas utama estrogen adalah menunjukkan tanda berahi saat estrus,

meningkatkan ukuran uterus, aliran darah uterus, meningkatkan ekspresi reseptor

progesteron terhadap oksitosin, mendorong perkembangan organ fetus,

menstimulir produksi protein hepar induk serta meningkatkan massa jaringan

mammae dan adipose (Hirako et al. 2003; Senger 1999; Johnson & Everitt 2000).

Estrogen merupakan hormon yang selain diproduksi oleh ovarium juga

diproduksi oleh kotiledon fetus bersama-sama dengan karunkula induk

(Teng et al. 2002). Salah satu produk deteksi kebuntingan (DEEA Gestdect®)

dengan memanfaatkan ikatan fenol yang terikat pada gugus estrogen dalam urin,

mempunyai mempunyai akurasi pada domba dan sapi berturut-turut 60-70 % dan

90 % (Samsudewa et al. 2005). Hal ini menunjukan bahwa estrogen terukur

dalam urin domba bunting maupun tidak bunting.

11

Pregnancy-Associated Glycoprotein (PAG)

Pregnancy-Associated Glycoprotein (PAG) merupakan glikoprotein asam

(pI 4.4-5.4), sebagai anggota famili aspartik proteinase yang memperlihatkan

sekuen yang paling dekat dengan pepsin (Green et al. 2000). Pregnancy-

associated glycoprotein disintesa oleh sel mono- dan binukleat trofoblas (Gambar

3). Sel binukleik (SBN) fetus merupakan sel unik pada ruminansia, sumber utama

protein plasenta seperti laktogen plasenta dan hormon steroid yang

bertanggungjawab terhadap keberhasilan kebuntingan (Atkinson et al. 1993).

Selanjutnya SBN migrasi melalui apical tight junction epitelium chorion,

melintasi microvillar junction fetomaternal, kemudian fusi ke dalam sinsisium

uterus. Sinsisium berhubungan erat dengan sirkulasi darah induk, pada fusi lebih

lanjut granula SBN dilepas oleh proses eksositosis ke dalam sinsisium. Adanya

perpindahan produk plasenta sepanjang kebuntingan kemungkinan erat kaitannya

Usia kebuntingan (hari)

Gambar 3 Pola hormon dalam plasma darah domba saat bunting. Garis panah menunjukkan saat dimana ovariektomi (Johnson & Everitt 2000).

0 50 100 150 200

12

dengan keberhasilan proses metabolisme dan atau imunologi antara induk dan

fetus (Wooding 1992). Perubahan pada sistem ini akan menurunkan kapasitas

konseptus dalam memproduksi sinyal biologis yang berkaitan dengan kebuntingan

yang diperlukan untuk perkembangan dan pertumbuhan fetus

(Regnault et al. 1999).

Pada domba, sel-sel ini berdiferensiasi dari sel mononukleik trofektoderm

sesaat sebelum kontak antara epitel uterus dengan plasenta yang umumnya terjadi

pada hari ke-13 (Green et al. 2000) atau ke 14-15 kebuntingan

(Dunlap et al. 2005).

Mekanisme Sintesis Protein Ovine Pregnancy-Associated Glycoprotein (ovPAG)

Asam amino bereaksi dengan ATP membentuk kompleks AMP dan

pirofosfat. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim aminoacyl-tRNA synthetase dengan

adanya Mg2+. Enzim yang dipergunakan berbeda untuk setiap asam amino . Pada

pemisahan fosfat grup dari ATP akan melepas banyak energi yang tersimpan

dalam kompleks asam amino AMP. Kompleks asam amino AMP-enzim disebut

asam amino teraktivasi sementara pirofosfat dihidrolisis menjadi dua organik

fosfat ( Zubay 1993; Champe et al. 2008).

Kompleks asam amino AMP-enzim berikatan dengan tempat pengikatan

asam amino ( AA binding site) dari spesifik tRNAnya sementara COOH berikatan

dengan OH. Katalisator dari reaksi ini adalah enzim yang sama yaitu yang

menghasilkan tRNA-amino acid complex disebut sebagai charged tRNA.

Sementara AMP dan enzim dilepaskan yang dapat dipergunakan untuk

mengaktivasi dan mengikat molekul tRNA lainnya. Selanjutnya kompleks asam

amino-tRNA bergerak menuju ribosom sebagai tempat sintesa protein. Aktivasi

ribosom oleh mRNA memerlukan Mg2+ pada konsentrasi yang sesuai.

Sel trofoblas menyimpan protein ini dalam granula (Gambar 4) dan

melepaskannya ke dalam organisme induk setelah terjadinya fusi dengan sel epitel

endometrium induk (Dunlap et al. 2006). Molekul mRNA terletak pada sel mono-

maupun binukleat trofoblas. Dengan memanfaatkan antibodi monoklonal

terdeteksi bahwa sel binukleat trofoblas mempunyai epitop terhadap karbohidrat

13

(Garbayo et al. 2008), selanjutnya melalui proses glikolisasi terbentuk PAG

(Klisch et al. 2008). Pregnancy-Associated Glycoprotein dilepaskan dari sel

trofoblas dan terikat pada reseptor sel permukaan spesifik pada sel target induk.

Embrio memulai transkripsi gen spesifik di dalam massa sel bagian dalam

blastosis, mRNA yang mengatur sintesis PAG di dalam trofoblas. Selanjutnya

PAG akan mendorong respon induk melalui reseptor pada endometrium

(Lambert et al. 2005). Variasi derajat glikosilasi pada PAG berbeda-beda

tergantung dari kadar karbohidrat yang berkaitan dengan usia kebuntingan, yang

merupakan faktor penting pada saat menentukan waktu paruhnya dalam plasma

induk (Klisch et al. 2005; Sousa et al. 2006).

Gambar 4 Sel binukleat, kontribusinya terhadap plasenta ruminansia yang definitif dan karakteristik endokrinnya (Wooding 1992) Keterangan : (a) Bagian plasenta matang yang memperlihatkan vili kotiledon fetus memasuki kripta karunkel induk

(b) Domba dan kambing, sinsisium feto-maternal dibentuk sebagai hasil migrasi sel binukleat (tahap 1 dan 2) dan fusi (tahap 3 dan 4)

14

Pregnancy-Associated Glycoprotein, awalnya dikenal sebagai antigen

plasenta yang ditemukan pada serum induk sapi sesaat setelah implantasi

(Zoli et al. 1992, Sousa et al. 2006). Perkembangan lebih lanjut PAG telah

berhasil dipurifikasi dari plasenta domba; kambing; sapi; babi; kerbau; zebu, dan

bison (El Amiri et al. 2004; Garbayo et al. 1998; Zoli et al. 1991;

Szafranska et al. 2003; Sousa et al. 2002; Kiewisz et al. 2008). Berat molekul

PAG berbeda pada beberapa spesies yaitu domba pada 55-66 kDa

(El Amiri et al. 2004) bahkan mempunyai berat molekul lebih tinggi pada 70 kDa

(Xie et al. 1996); kambing pada 55; 59, dan 62 kDa (Garbayo et al. 1998); sapi

pada 67 kDa (Zoli et al. 1992); babi pada 35-72 kDa (Szafranska et al. 2003);

kerbau pada 59,5-75,8 kDa pada pertengahan kebuntingan dan 57,8-73,3 kDa

pada akhir kebuntingan (Szafranska et al. 2003); zebu pada 51-69 kDa

(Sousa et al. 2002), dan bison pada 50;55;60;67, dan 71 (Kiewisz et al. 2009). Profil PAG domba garut belum ditemukan oleh karena itu, sebagai

pembanding dipilih domba Merino. Konsentrasi ovPAG pada domba Merino

mulai terukur pada minggu ketiga yang terlihat setara konsentrasinya pada

minggu ke-23 atau dua minggu setelah melahirkan (Gambar 5). Setelah minggu

ke-3 , konsentrasinya terus meningkat secara signifikan dan mencapai puncak

pertama pada minggu ke-9. Kemudian mengalami penurunan sampai minggu ke-

13, tetapi konsentrasinya masih lebih tinggi dari minggu ke-3 maupun minggu

ke-23. Selanjutnya konsentrasi ovPAG meningkat kembali dan mencapai puncak

kedua pada minggu ke-17. Mulai minggu ke 17-21 konsentrasinya terlihat sama

dan tetap bertahan sampai seminggu setelah melahirkan kemudian menurun dan

mencapai konsentrasi basal sekitar tiga minggu setelah partus (Ranilla et al. 1994)

dibandingkan dengan sapi pada hari ke 80-90 (Haugejorden et al. 2006). Peneliti

ini menemukan bahwa waktu paruh ovPAG dalam plasma adalah 4,5 hari setelah

partus dibandingkan sapi selama 9 hari.

Berdasarkan fluktuasi konsentrasi ovPAG sepanjang usia kebuntingan

maka pada domba mengikuti pola sekresi dua fluktuasi (Szafranska et al. 2006)

yaitu meningkat (300 – 400 ng/ml) di sepanjang dua bulan awal kebuntingan

yaitu ketika sel chorion secara intensif berproliferasi serta terbentuknya plasenta.

Pada pertengahan kebuntingan terjadi penurunan sampai < 100 ng/ml, kemudian

15

meningkat sampai akhir masa kebuntingan yaitu 300 ng/ml pada Merino dan 600

ng/ml pada Churra (Ranilla et al. 1994).

Pregnancy-Associated Glycoprotein dikenal sebagai antigen spesifik yang

disekresikan oleh plasenta sehingga keberadaannya dalam serum dapat

dipergunakan sebagai metode serologis untuk menguji kebuntingan dini pada sapi

dimulai dari 28 hari setelah dikawinkan (Zoli et al. 1992). Pada domba,

konsentrasi ovPAG dapat didiagnosa pada hari ke-22 setelah IB menggunakan

metode RIA (Karen et al. 2003), sedangkan peneliti lain menemukan bahwa

analisis PAG dapat dilakukan pada saat usia kebuntingan dimulai pada minggu ke-

4 setelah IB menggunakan heterologous (anti-caPAG(55+59) antisera

(Ledezma-Torres et al. 2006). Waktu pengukuran yang lebih cepat pada akhirnya

ditemukan oleh Green et al. (2000) menggunakan metode ribonuclease

protection assay pada hai ke-13 setelah dikawinkan.

Gambar 5 Konsentrasi rata-rata ovPAG dalam plasama (± SEM) selama

kebuntingan dan postpartus pada domba (Ranilla et al. 1994) Keterangan : (A) Churra (B) Merino

16

Green et al. (2000) melaporkan berdasarkan ekspresi gen pada cDNA

menggunakan analisis filogenetik dengan metode ribonuclease protection assay

(RPA) terdapat 9 ovPAG yang muncul sepanjang lapisan luar epitel. Pada saat

terbentuknya PAG, sekuen DNA mengalami perubahan pada tiga kodon dari CAG

AAT CTC menjadi GAG CCT GTC (Hughes et al. 2003). Ekspresi gen ini erat

kaitannya dengan pembentukan granul dari sel binukleat sehingga dapat

dimanfaatkan sebagai dasar deteksi kebuntingan. Teknik ini sangat sensitif dan

spesifik sehingga dapat mendeteksi keberadaan ovPAG sepanjang usia

kebuntingan (Gambar 6). Prinsip teknik RPA adalah mendeteksi keberadaan

mRNA dengan cara melabel cDNA menggunakan bahan radio aktif. Tangan DNA

yang sekuennya tidak homolog akan gagal berhibridasi dengan mRNA, dengan

pemberian RNAse akan didapat satu sekuen gel yang terdiri dari RNA yang

terlindungi dan tidak. Adanya pita protein yang terlindungi menunjukkan adanya

mRNA yang diidentifikasi berdasarkan ukurannya. Meskipun teknik ini dapat

mendeteksi keberadaan mRNA secara spesifik dan sensitif tetapi selama proses

dapat terjadi denaturasi RNA serta kemungkian terjadinya kontaminasi terhadap

bahan radioaktif yang dipergunakan.

Berdasarkan ekspresi ovPAG (Gambar 5), ovPAG-2 terdeteksi paling cepat yaitu

pada hari ke-13 (Green et al. 2000) atau hari ke-14 sebagai PAG tunggal. Pada

hari ke-16, dapat terdeteksi ovPAG-1; ovPAG-5 dan ovPAG-7 (Green et al. 2000)

serta pada hari ke-17, selain ovPAG-1 juga ditemukan ovPAG-10 dan ovPAG-11

(Garbayo et al. 2008). Setelah kebuntingan hari ke-88 semua ovPAG dapat

terdeteksi. Metode ini memberikan gambaran bahwa ovPAG dapat dideteksi

sebelum memasuki siklus berahi terutama pada ovPAG-1; ovPAG-2; ovPAG-5;

ovPAG-7; ovPAG-10 dan ovPAG-11. Dengan demikian dimungkinkan untuk

melakukan isolasi ovPAG pada semua fase kebuntingan.

Selain bertambahnya usia kebuntingan, konsentrasi PAG dipengaruhi juga

oleh jumlah maupun jenis kelamin fetus. Induk domba dan kambing yang

mengandung 2 fetus mempunyai konsentrasi PAG lebih tinggi dari yang

mengandung fetus satu. Perbedaannya, pada domba konsentrasi PAG meningkat

dimulai dari minggu ke-12 sampai lahir sedangkan pada kambing konsentrasi

PAG meningkat secara nyata pada saat implantasi seperti yang terjadi pada sapi

17

dimulai dari minggu ke-12 sampai lahir sedangkan pada kambing konsentrasi

PAG meningkat secara nyata pada saat implantasi seperti yang terjadi pada sapi

(Ranilla et al. 1994; González et al. 2004; Ledezma-Torres et al. 2006). Induk

yang mengandung fetus jantan mempunyai konsentrasi PAG akan lebih tinggi

pada 3 minggu terakhir masa kebuntingan dibandingkan dengan yang

mengandung fetus betina (Ranilla et al. 1994 ). Sedangkan peneliti lain

mengungkapkan bahwa jenis kelamin tidak mempengaruhi konsentrasi ovPAG

tetapi dipengaruhi oleh total berat fetus saat dilahirkan (Vandaele et al. 2003;

Bertolini et al. 2006).

Konsentrasi ovPAG diukur dengan menggunakan semi-purified ovPAG

sebagai standar, tracer maupun imunogen untuk memproduksi antibodi pada

kelinci. Antisera R780 (campuran α-ovPAG(57+59kDa)) dan R805 (campuran α-

ovPAG5(58+61kDa) pada metode RIA merupakan antisera homolog yang sesuai

untuk mengukur konsentrasi ovPAG dalam plasma dari hari ke-18 setelah

inseminasi (El Amiri et al. 2007). Konsentrasi PAG dalam air susu maupun

plasma darah pada sapi (boPAG) maupun kambing (caPAG) menunjukan

Gambar 6 Diagram ekspresi ovPAG sepanjang usia kebuntingan (Green et al. 2000)

ovPAG-9

ovPAG-8

ovPAG-7

ovPAG-6

ovPAG-5

ovPAG-3

ovPAG-2

ovPAG-1

13 16 25 88 100 130 Usia Kebuntingan (hari)

18

peningkatan setelah hari ke-28 dan peningkatan konsentrasi secara cepat terjadi

menjelang melahirkan (Gajewski et al. 2008).

Konsentrasi ovPAG dimungkinkan untuk diukur dengan jalan

memproduksi anti-ovPAG. Molekul PAG yang diuji terhadap protein lain

(caPAG maupun ovPAG) memberikan hasil yang spesifik (Perényi et al. 2002;

Green et al. 2000). Perkiraan waktu paruh ovPAG dalam plasma adalah 9 dan 4.5

hari pada sapi dan domba, sedangkan konsentrasi basal baru tercapai pada hari ke

80-90 pada sapi dan hari ke 17-21 domba (Haugejorden et al. 2006).

Isolasi ovPAG

Isolasi ovPAG meliputi pemisahan dan karakterisasi protein. Pemisahan

protein dapat dilakukan menggunakan metode sentrifugasi, presipitasi garam dan

kolom kromatografi. Kolom kromatografi terdiri dari filtrasi gel dan pertukaran

ion (Nelson & Cox 2000; Abbas et al. 2007; Lodish et al. 2000).

Filtrasi Gel

Filtrasi gel merupakan metode yang umum dilakukan untuk menyeleksi

protein berdasarkan ukuran dan bentuk protein (Nelson & Cox 2000;

Lodish et al. 2000). Protein dengan berat molekul besar akan tertahan pada

lapisan serabut yang membentuk gel sedangkan protein yang akan diisolasi akan

lepas dan tertampung dalam fraksi yang dielusi dari kolom (Gambar 7).

Kromatografi Pertukaran Anion

Kromatografi pertukaran ion (Nelson & Cox 2000; Lodish et al. 2000).

bergantung pada interaksi muatan-muatan ion antara protein dalam sampel

(protein terikat pada molekul ovPAG) dengan muatan imobil dalam resin dari

kolom yang dipilih. Ada dua jenis kromatografi pertukaran ion yaitu kation dan

anion yang ditentukan dari karakter protein atau enzim juga pH bufer yang

digunakan untuk melarutkan enzim. Kekuatan ikatan ion larutan dan total

konsentrasi garam merupakan faktor penentu agar kromatografi pertukaran ion

dapat bekerja dengan baik. Kromatografi pertukaran anion (KPA) ditandai dengan

19

adanya interaksi antara muatan negatif protein sampel dan muatan positif resin

yang dipergunakan sedangkan kromatografi pertukaran kation bekerja sebaliknya.

Gambar 8 Proses Kromatografi Pertukaran Anion (Lodish et al. 2000)

Gambar 7 Proses Filtrasi Gel (Lodish et al. 2000)

20

Kromatografi pertukaran anion seperti DEAE (diethylaminoethyl)

mempunyai muatan positif sehingga akan mengikat ion bermuatan negatif. Grup

pertukaran anion akan terikat secara kovalen pada matriks selulosa atau sephadex

(modifikasi serbuk). Protein dapat dielusi dengan konsentrasi garam bertingkat

yang memungkinkan ion untuk berkompetisi pada fase ini. Oleh karena itu,

seluruh hasil elusi (fraksi) harus didialis untuk menghilangkan garam yang

terkandung di dalamnya.

Resin diethylaminoethane merupakan salah satu resin yang umum

dipergunakan sebagai kolom kromatografi pertukaran anion. Matrik resin dalam

kolom DEAE dapat mengikat 10 sampai 100 mg protein per ml dan mempunyai

kemampuan untuk meningkatkan kemampuan dan memisahkan fragmen protein

dari ’slurry’ pembuka. Bufer yang dipergunakan mempunyai pH antara 7-10 dan

larutan yang dipergunakan sebagai ’runnning gradient’ adalah 1 M NaCl. Garam

dalam larutan berkompetisi untuk mengikatan muatan imobil dalam matrik dan

melepas protein dari tempat ikatan pada konsentrasi yang telah dikondisikan.

Variasi konsentrasi garam diperlukan untuk memisahkan muatan protein yang

diisolasi dari protein kontaminan (Gambar 8).

Elektroforesis Gel pada Monogel Sodium Dedocyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

Protein yang ada dalam fraksi terikat dengan SDS dalam ikatan yang telah

didenaturasi. Selama elektroforesis komplek protein-SDS melewati PAGE.

Protein yang lebih kecil akan lebih mudah melewati pori dan cepat dibandingkan

dengan yang lebih besar. Protein terpisahkan dalam gel berdasarkan ukurannya

sepanjang melewati gel. Pita protein yang terbentuk diwarnai dengan Commassie

Brilliant Blue (El Amiri et al. 2004).

Sodium dedocyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

berfungsi untuk menghilangkan protein yang mengkontaminasi enzim yang

dipergunakan untuk purifikasi protein. Protein yang akan dipurifikasi ditambah

mercaptoethanol kemudian dipanaskan dengan tujuan untuk memotong ikatan

disulfid dan denaturasi protein. Sedangkan SDS sebagai suatu deterjen untuk

menyamakan muatan listrik (SDS mengikat stoichiometrically, 1 SDS per 1.4

asam amino). Ketika protein dialirkan ke dalam gel kemudian aliran listrik

21

tersambung, protein akan bermigrasi melalui pori-pori di dalam gel poliakrilamid.

Gel akan memisahkan protein berdasarkan kemampuan protein untuk bergerak

yang setara dengan nilai logaritmik berat molekulnya (Stryer 1995;

Champe et al. 2008).

Pewarnaan Commassie Brilliant Blue

Commassie Brilliant Blue (CBB) merupakan pewarnaan anion yang umum

dipergunakan untuk pewarnaan protein. Struktur CBB adalah non-polar sehingga

biasanya digunakan dalam campuran metanol 40 % dan asam asetat 7 %.

Protein dalam gel difiksir oleh asam asetat dan secara simultan diwarnai.

Zat warna yang berlebih dihilangkan dengan larutan yang sama tanpa ditambah

CBB. Protein terdeteksi dengan terbentuknya pita biru, akan tetapi karena SDS

bersifat anion juga maka untuk menghindari intervensinya pada saat pewarnaan

maka volume larutan harus benar-benar merendam gel.

Pita protein yang terlihat pada monogel diukur jaraknya untuk menentukan

migrasi relatifnya. Selanjutnya berdasarkan berat molekul standar (Broad Range

Standard®) dapat ditentukan persamaan regresinya dan dari migrasi relatif yang

diperoleh dapat ditentukan estimasi berat molekul protein yang diuji.

Pengukuran Konsentrasi Protein

Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay merupakan metode deteksi

kolorimetri dan penghitungan total protein, yang dimodifikasi dari metode Lowry.

Prinsip utamanya adalah reduksi Cu2+ menjadi Cu1+ oleh protein dalam medium

alkalin oleh asam bichinconinic. Tahap awal, dikenal sebagai reaksi biuret yaitu

peptida yang mengandung beberapa asam amino berikatan dengan ion Cu1+

membentuk warna biru. Tahap kedua adalah reaksi perubahan warna

menggunakan BCA. Warna kuning terbentuk dari pengikatan dua molekul BCA

dengan satu ion Cu1+ (Pierce ®). Warna yang terbentuk diukur absorbansinya

pada panjang gelombang 590 nm.

22

Antibodi Poliklonal

Antigen adalah molekul yang bereaksi dengan antibodi sedangkan

imunogen merupakan molekul yang dapat memberikan respon imum. Keduanya

mempunyai makna yang sama. Substansi yang mempunyai kemampuan untuk

menghasilkan respon imun yang spesifik, seperti protein. Antigen baru akan

dikenali oleh limfosit B maupun T apabila epitopnya dikenali. Epitop merupakan

sisi aktif antigen yang dapat berikatan dengan reseptor sel B maupun T

(Goldsby et al. 2000) .

Respon imun yang dihasilkan bergantung dosis dan rute penyuntikan

antigen atau imunogen. Respon imun merupakan upaya inang untuk

mempertahankan diri yang prosesnya terdiri atas 1) pengenalan, organisme asing

dikenali oleh sel imun spesifik, 2) aktivasi, mengaktivasi sel imun untuk

memproduksi respon spesifik seperti antibodi, 3) respon, yang secara spesifik

merusak organisme (Goldsby et al. 2000; Lordish et al. 2000 ). Respon imun

primer adalah IgM, antigen reseptor pada sel B, sedangkan IgG adalah respon

imun IgG yang melintas plasenta. Respon imun primer berjalan lambat sekitar

7-10 hari tergantung kemunian dan dosis Ag serta rute penyuntikannya. Ig M

levelnya lebih cepat turun dibadingkan dengan IgG.

Apabila hewan diberi booster dengan antigen yang sama setelah respon

primer, respon imun yang terbentuk cepat (3-5 hari) dan mempunyai level respon

imun yang lebih tinggi dari respon primer. Selama respon sekunder, IgM yang

diproduksi sama dengan setelah kontak dengan Ag (Gambar 9). Sementara, IgG

lebih besar diproduksi dan levelnya tertahan jauh lebih lama dari respon primer

(Abbas et al. 2007; Goldsby et al. 2000).

Pada produksi antibodi diperlukan adjuvant untuk meningkatkan respon

imun terhadap aktivitas sel imunogen. Adjuvant merupakan campuran mineral

oil, linoloid dan mikrobakteria yang telah dilemahkan (Freud’s adjuvant) yang

menstimulasi pembentukan granuloma lokal agar pembentukan antibodi berjalan

dengan baik. Apabila hewan disuntik antigen yang telah ditambah adjuvant

maka normalnya limfosit B akan menghasilkan satu tipe antibodi yang mengenali

determinan spesifik atau epitop molekul antigen, disebut antibodi monoklonal.

23

Akan tetapi karena secara alami antigen mempunyai beberapa epitop sehingga

apabila antigen disuntikkan pada hewan maka akan menstimulasi beberapa klonal

limfosit yang berbeda dan masing-masing akan menghasilkan antibodi yang

berbeda. Campuran antibodi yang dapat mengenali beberapa epitop pada antigen

yang sama disebut antibodi poliklonal (Goldsby et al. 2000; Abbas et al. 2007).

Kekuatan interaksi antigen dan antibodi bergantung dari seberapa dekat

kecocokan antara antigen dan antibodi. Total kekuatan interaksi nonkovalen

antara tempat terikatnya antigen (single antigen-binding site) pada antibodi

dengan suatu epitop tersebut afinitas antibodi. Semakin tinggi afinitas antibodi,

kemampuan antibodi untuk mengikat semakin kuat dan ikatannya bertahan lama,

sebaliknya semakin rendah afinitas ikatan antibodi dan epitop makin lemah dan

ikatannya mudah lepas. Reaksi silang (cross-reactivity ) terjadi apabila antigen

yang sama muncul pada tipe sel atau jaringan yang berbeda, munculnya epitop

yang identik pada permukaan dua antigen yang tidak identik, dua antigen

memiliki dua epitop sama tetapi tidak identik sehingga bisa terjadi salah satu

epitop akan mengikat lebih kuat daripada epitop lainnya, dua bahan yang berbeda

secara kimiawi seperti protein dan karbohidrat tetapi mempunyai epitop yang

sama atau bisa juga terjadi dua antibodi yang satu memiliki epitop A sedangkan

yang satunya memiliki epitop A dan B (Huebner 2004).

Prosedur pembuatan antibodi poliklonal sangat sederhana dibandingkan

dengan antibodi monoklonal meskipun demikian antibodi yang dihasilkan sangat

bermanfaat. Kelebihan antibodi poliklonal selain metode produksi yang sederhana

juga dapat mengikat semua antigen yang menjadi target reaksi. Sedangkan

kelemahan antibodi poliklonal yang utama adalah karena antibodinya dapat

bereaksi dengan semua epitop yang ada pada antigen yang direaksikan maka akan

mendapatkan reaksi silang yang tinggi. Oleh karena itu hal yang harus

diperhatikan saat memproduksi antibodi poliklonal, isolat yang akan

diimunisasikan harus dalam keadaan yang murni (Abbas et al. 2007).

24

Determinasi Rabbit anti-ovPAG menggunakan Metode Western Blot

Western Blot (WB) merupakan teknik analisis untuk mendeteksi protein

spesifik yang terkandung dalam ekstrak atau jaringan. Dimulai dengan

elektroforesis untuk memisahkan protein yang kemudian ditransfer ke dalam

membran, umumnya digunakan membran nitroselulose (Gambar 10). Prinsipnya

adalah protein dideteksi menggunakan antibodi spesifik (monoklonal maupun

poliklonal) terhadap protein target (Lodish et al. 2000; Majewska et al. 2005;

Bella et al. 2009).

Gambar 9 Perbedaan respon primer dan sekunder antigen yang disuntikkan (humoral response). Hewan disuntik antigen akan memproduksi antibodi primer serum pada konsentrasi rendah dan waktu yang singkat dengan puncak pada hari ke 10-17 . Imunisasi kedua dengan antigen yang sama akan menghasilkan respon imun yang lebih besar dengan puncak yang diperoleh dalam waktu lebih singkat hari ke 2-7 dan lebih lama bertahan (bulanan sampai tahunan daripada antibodi primer (Goldsby et al. 2000)

Hari

Lev

el A

ntib

odi S

erum

Respon Anti-A Kedua Respon Anti-B

Primer

Respon Anti-A Primer

Gambar 9 Perbedaan respon primer dan sekunder antigen yang disuntikkan (Goldsby et al. 2000) Keterangan : A. Antigen A disuntikan, akan diproduksi antibodi primer anti-A pada

konsentrasi rendah dan waktu yang singkat dengan puncak pada hari ke 10-17 .

B. Antigen A + Antigen B, akan menghasilkan respon imun yang lebih besar dengan puncak yang diperoleh dalam waktu lebih lama bertahan (bulanan sampai tahunan daripada antibodi primer (anti-A), imun respon antibodi primer anti-B lebih singkat hari ke 2-7

A B

25

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Enzyme Linked Immunosorbent Assay secara umum dikenal sebagai

ELISA atau EIA. Prinsip dasarnya sama dengan Radio immuno assay (RIA)

tetapi pada ELISA digunakan enzim sedangkan pada RIA menggunakan bahan

radioaktif yang dilabel. Enzim yang dikonjugasikan pada antibodi bereaksi

dengan substrat untuk menghasilkan reaksi warna sehingga disebut sebagai

chromogen substrat. Beberapa enzim yang umum dipakai pada ELISA antara lain

alkalin fosfatase dan horseradish peroxidase (Crowther 2001;

O’Connor et al. 2003; Goldsby et al. 2000).

Keunggulan metode ELISA dibandingkan dengan metode RIA selain

memiliki sensitifitas yang sama juga waktu pengukuran cepat karena diperlukan

kira-kira 15 menit untuk 100 sampel; aman karena tidak memerlukan substansi

radioaktif; relatif murah, hasil yang diperoleh setara meskipun material yang

Gambar 10 Prosedur Metode Western Blot (Lodish et al. 2000)

26

dipergunakan berbeda (serum, plasma, urine maupun feses), peralatan yang

diperlukan sederhana terutama untuk membaca hasil menggunakan

spektrofotometer (O’Connor et al. 2003; Munro et al. 1991).

Ada bermacam-macam tipe ELISA yang dikembangkan berdasarkan

deteksi kualitatif dan kuantitatif terhadap antigen dan antibodi yang

dikandungnya (Goldsby et al. 2000, Crowther 2001, Pier et al. 2004). Ada tiga

metode yang mendasari semua metode ELISA yaitu Direct ELISA; Indirect

ELISA dan Sandwich ELISA.

Direct ELISA

Teknik Direct ELISA merupakan teknik ELISA yang paling sederhana.

Antigen diencerkan dalam bufer karbonat-bikarbonat atau phosphate buffer saline

(PBS). Bufer yang digunakan tidak mengandung protein lain yang dapat

berkompetisi dengan antigen target yang akan ditempelkan pada fase solid

lempeng ELISA. Setelah diikunbasi, antigen yang tidak terikat pada fase solid

dicuci menggunakan bufer. Antibodi spesifik terhadap antigen (Ab1), dilabel

dengan enzim (konjugasi), ditambahkan dan diinkubasi. Antibodi terkonjugasi

(Ab2) diencerkan dalam bufer yang mengandung substansi yang dapat

menghambat penyerapan protein secara pasif. Substansi yang ditambahkan untuk

berkompetisi dengan pori-pori dalam fase solid yang tidak terisi antigen disebut

dengan bufer penahan atau blocking buffer. Selama inkubasi antibodi akan

berikatan dengan antigen. Antibodi yang tidak berikatan dengan antigen

dihilangkan dengan cara dicuci menggunakan bufer. Kemudin ditambahkan

substrat atau chromogen antispesies. Reaksi ini bertujuan untuk mengembangkan

reaksi warna melalui proses katalisis enzim.

Interaksi antara antigen dan antibodi yang dideteksi dengan menggunakan

konjugat (enzim yang dikonjugasikan ke antibodi), antara lain horseradish

peroxidase dan substrat disebut chromogen karena mempunyai kemampuan untuk

menyerap warna antara lain benzidin akan menimbulkan warna biru. Reaksi

dihentikan apabila sudah terjadi perubahan warna dari biru menjadi kuning

dengan menambahkan larutan yang menghambat reaksi. Perubahan warna yang

27

terjadi diukur menggunakan spektrofotometer (ELISA Reader, Biorad®) pada

panjang gelombang 450 nm (O’Connor et al. 2003; Crowther 2001 ).

Indirect ELISA

Tahap awal teknik ini sama dengan Direct ELISA, hanya Ab1 yang

ditambahkan adalah antibodi yang tidak dilabel enzim. Antibodi diencerkan

menggunakan bufer penghambat untuk menjaga adanya penempelan nonspesifik

dari protein antiserum. Diinkubasi dan dicuci untuk menghilangkan kelebihan

antibodi yang tidak terikat agar didapatkan ikatan yang spesifik. Antibodi yang

telah dilabel (Ab2 atau konjugat) berupa antibodi antispesies yang telah

diencerkan dalam bufer, selanjutnya diinkubasi dan dicuci untuk mendapatkan

ikatan yang spesifik. Substrat ditambahkan untuk mengikat konjugat dan setelah

terjadi perubahan warna, reaksi dihentikan. Selanjutnya warna yang terjadi dibaca

pada spektrofometer (O’Connor et al. 2003; Crowther 2001) .

Sandwich ELISA

Teknik ini dibagi menjadi dua yaitu Direct Sandwich dan Indirect

Sandwich ELISA (Crowther 2001, Harlow & Lane 1988).

Direct Sandwich ELISA

Prinsip utamanya adalah memaksimalkan aktivitas antibodi (Ab1) yang

ditempelkan pada fase solid lempeng ELISA untuk menangkap antigen.

Kemudian antigen dideteksi menggunakan serum spesifik yang telah dilabel

enzim (Ab2), diinkubasi dan dicuci. Antibodi yang menangkap antigen (capture

antibody) dan antibodi yang mendeteksi (detecting antibody) bisa sama atau dari

hewan berbeda dari spesies yang sama atau berbeda spesies. Setelah ditambahkan

konjugat (Ab3 ), diinkubasi, konjugat bebas dicuci. Penambahan substrat sampai

terjadi perubahan warna kemudian reaksi dihentikan dan diukur kuantitas

28

warnanya menggunakan spektrofotometer. Antigen yang dipergunakan paling

tidak harus memiliki dua epitop (Crowther 2001; Harlow & Lane 1988).

Indirect Sandwich ELISA

Prinsip utamanya sama hanya antibodi untuk mendeteksi antigen tidak

dilabel enzim. Setelah antigen berikatan dengan antibodi (Ab1) pada fase solid

lempeng ELISA, ditambahkan antibodi (Ab2) yang berasal dari spesies yang

berbeda dengan Ab1. Selama inkubasi terjadi ikatan Ag-Ab, antibodi bebas

dicuci. Konjugat antispesies (Ab3) ditambahkan yang dapat mengikat serum yang

berasal dari spesies yang sama dengan Ab2 tetapi tidak dapat bereaksi dengan

antibodi fase solid ELISA. Penambahan substrat sampai terjadi perubahan warna

kemudian reaksi dihentikan dan diukur kuantitas warnanya menggunakan

spektrofotometer (Crowther 2001; Harlow & Lane 1988).

Uji Validasi

Ada beberapa uji validasi asai untuk mengukur yaitu paralelisme, efisiensi

ekstraksi contoh maupun presisi asai. Uji paralelisme dilakukan dengan menguji

respon konsentrasi terhadap standar. Konsentrasi diuji dengan membandingkan

faktor pengencerannya. Apabila hasil yang diperoleh paralel terhadap standar

maka pengenceran yang akan dilakukan dapat dipergunakan untuk mengukur

konsentrasi antigen atau antibodi sampel. Efisiensi ekstraksi dilakukan dengan

melakukan pelabelan radioaktif, dilakukan sebelum proses ekstraksi sampel

ekskreta. Presisi ditentukan dengan menghitung nilai kontrol kualitas tinggi dan

rendah pada satu asai (intra-assay coefficient of variant) dan pada beberapa asai

(inter-assay coefficient of variant) yang telah dilakukan. Apabila asai menunjukan

nilai koefisien variasi ≤ 15% maka asai tersebut dinyatakan memiliki nilai presisi

yang baik (Maheswari 2007).