Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses

rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam

pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA

utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma

dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai

wahana (vektor) kloning, antara lain adalah : a). plasmid mempunyai ukuran molekul yang

kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi; b). DNA nya berbentuk

sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia; c). mempunyai titik

ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang

secara otonomi; d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat

di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi; e).

mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih

memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et al., 1994).

Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap

kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu

memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat

pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel),

membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri

atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran

dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya

Restriksi

Enzim restriksi endonuklease (enzim restriksi) mengenali urutan nukleotida spesifik

dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut.

Enzim ini telah ditemukan lebih dari 30 tahun yang lalu sehubungan dengan fenomena

pemotongan yang spesifik terhadap bakteri inang dan modifikasi oleh virus bakteri. Bakteri

pada mulanya tahan terhadap infeksi virus karena bakteri memiliki sistem pertahanan dengan

merusak molekul DNA asing yang masuk ke dalam selnya. Enzim restriksi yang berhasil

dimurnikan pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII dari Escherichia coli, dan HindII dan

HindIII dari Haemophilis influenza. Enzim-enzim tersebut diketahui memotong

DNA pada urutan basa tertentu yang spesifik, yang menghasilkan fragmen-fragmen seukuran

gen yang dapat disambungkan kembali. Para peneliti dengan cepat segera mengetahui bahwa

enzim restriksi merupakan alat biologis baru yang dapat digunakan untuk mempelajari

organisasi, fungsi, dan ekspresi gen.

Enzim restriksi melindungi bakteri dari infeksi virus. Enzim ini berperan dalam sistem

imun pada mikroorganisme. Jika bakteri E. coli yang tidak memiliki enzim restriksi diinfeksi

virus, maka sebagian besar partikel virus mampu menyebabkan infeksi. Namun, jika bakteri

E. coli memiliki enzim restriksi, kemungkinan infeksi virus akan menurun.

Enzim restriksi biasanya terdapat dalam kombinasi dengan enzim pemodifikasi lain

yang melindungi DNA-nya sendiri dari pemotongan, misalnya DNA-metil transferase

(dnmt). Dnmt akan memetilasi basa DNA pada tiap untai sehingga sekuen yang dikenali oleh

enzim restriksi tidak akan terpotong.

Secara umum, enzim restriksi dapat dibedakan ke dalam 3 tipe, berdasarkan pada

komposisi sub unit, posisi pemotongan, spesifisitas sekuen DNA, dan perlu tidaknya

kofaktor. Enzim-enzim tipe I merupakan enzim yang kompleks, multisubunit, kombinasi

antara restriksi dan pemodifikasi yang memotong DNA pada area random yang jauh dari sisi

pengenalan. Enzim tipe I secara biokimia mungkin banyak berfungsi di dalam sel, tetapi

mereka kurang menguntungkan untuk digunakan dalam percobaan di laboratorium. Enzim

tipe II memotong DNA pada posisi tertentu yang dekat atau berada di antara sekuen yang

dikenalnya. Enzim tipe II menghasilkan fragmen-fragmen tertentu dengan pola pita-pita yang

spesifik pada gel agarosa. Enzim tipe inilah yang dipakai untuk berbagai percobaan dalam

analisis DNA dan kloning gen. Enzim tipe III juga merupakan kombinasi restriksi dan enzim

pemodifikasi. Enzim ini memotong DNA di luar sekuen yang dikenal dan memerlukan 2

sekuen yang sama pada orientasi yang berlawanan pada untai DNA yang sama untuk dapat

memotong. Enzim-enzim ini jarang menghasilkan potongan yang sempurna.

Ada beberapa faktor kunci yang harus diperhatikan untuk melakukan pemotongan

dengan enzim restriksi (enzyme digestion). Di antaranya adalah: gunakan jumlah DNA,

enzim, dan buffer yang benar dalam volume reaksi total yang sesuai. Satu unit enzim restriksi

akan memotong 1 ug DNA secara sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam. Rasio enzim :

DNA : volume reaksi ini dapat digunakan sebagai pedoman dalam menentukan reaksi.

Meskipun demikian, sebagian besar peneliti mengikuti pedoman umum reaksi digesti di mana

10 kali over-digesti direkomendasikan untuk mengatasi

variasi dalam sumber, jumlah dan kemurnian DNA. DNA harus terbebas dari kontaminan

seperti fenol, kloroform, alkohol, EDTA, deterjen (SDS) atau garam yang berlebih. Metilasi

DNA dapat mengakibatkan penghambatan digesti dengan enzim tertentu. DNA plasmid

superkoil dan DNA yang terikat gel agarose pada umumnya memerlukan lebih dari 1 unit/ug

untuk dapat terpotong sempurna.

Enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. Oleh karena itu, sebaiknya

disimpan pada suhu -20°C untuk sebagian besar enzim. Beberapa enzim perlu disimpan pada

-70°C. Enzim ini harus tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer dan harus

selalu menjadi komponen yang ditambahkan terakhir pada campuran reaksi. Selain stabilitas,

harga enzim restriksi pun mahal. Campur reaksi dengan baik dengan cara pemipetan atau

menggoyang tabung reaksi. Sentrifus dengan cepat selama beberapa detik jika ada cairan

yang menempel di dinding tabung.

Untuk menghentikan reaksi enzim, dapat dilakukan penambahan stopper reagent yang

mengandung SDS-EDTA.

Pemetaan Plasmid

Menurut Brown (1991) dan Glick and Pasternak (1994), dalam menyusun peta

restriksi harus dilakukan suatu rangkaian digesti restriksi. Jumlah dan ukuran fragmen yang

dihasilkan oleh tiap-tiap endonuklease restriksi harus ditentukan dengan elektroforesis gel,

kemudian dibandingkan dengan ukuran marka. Hasil yang didapat harus didukung oleh hasil

rangkaian digesti ganda, yaitu DNA dipotong dengan dua enzim restriksi secara bersamaan.

Pembandingan hasil digesti tunggal dan digesti ganda akan memungkinkan pemetaan banyak

tempat restriksi.

Daftar pustaka

Brock, T. D., Michael T. Madigan, john M. Martinko and Paker. 1994. Biology of microorganisms. Prentice Hall.

Brown, T.A. 1991. Pengantar Kloning Gena (terjemahan). Yayasan Essentia Medica.

Glick, B.R. and J.J. Pasternak. 1994. Molekuler Biotechnology, Principles and applications of Recombinan DNA. ASM Press. Washinton D.C

Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan

Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB